KR20120104771A - Pharmaceutical composition for treating ischemic diseases comprising conditioned medium obtained by three-dimensional cell culture as active ingredient - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 3차원 세포배양으로 수득한 조건 배지를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 성체 줄기세포를 3차원 생물 반응기에서 배양 배지를 이용하여 3차원적으로 배양하여 수거한 조건 배지를 유효성분으로 포함하는, 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of ischemic diseases comprising the condition medium obtained by the three-dimensional cell culture as an active ingredient, more specifically, adult stem cells in three-dimensional bioreactor using a culture medium in a three-dimensional bioreactor The present invention relates to a pharmaceutical composition for treating ischemic disease, comprising the culture medium collected as an active ingredient.
줄기세포 치료제를 포함한 세포치료제(cell therapy product)는 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogeneic) 또는 이종(xenogeneic) 세포를 체외에서 증식 또는 선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위(최소한 이상의 조작: more-than-minimal manipulation)를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용하는 의약품으로 정의된다. 줄기세포 치료제는 이 중 특히 줄기세포를 사용하는 경우를 의미하며, 현재 대표적인 응용 분야는 신경질환, 심질환, 폐질환, 간질환, 암과 같이 손실된 세포의 회복과 재생이 필수적이면서도 자연스럽게는 잘 이루어지지 않는 경우에서 활발하게 개발이 진행되고 있다.Cell therapy products, including stem cell therapies, can be used to proliferate, select, or otherwise invigorate living autologous, allogeneic, or xenogeneic cells in vitro to restore cell and tissue function. It is defined as a drug used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions (more-than-minimal manipulation), such as altering the biological properties of the drug. Stem cell therapy refers to the use of stem cells, especially the current application field is the essential and naturally well-repaired recovery and regeneration of the lost cells such as neurological disease, heart disease, lung disease, liver disease, cancer In the case of not losing, development is actively progressing.
줄기세포는 다분화 잠재능을 가지고 있어서 손상된 조직에서 필요한 세포로의 분화를 유도할 수 있다는 점에서 세포치료에서 잠재력이 크지만, 현재 개발수준에서는 체내 이식 후 생존율이 높지 않아서 실제로 임상 적용에서 광범위하고 안정적으로 성공한 예를 찾기 어렵다. Stem cells have great potential in cell therapy in that they have differentiation potential and can induce differentiation from damaged tissues to necessary cells.However, at the present development level, the survival rate after transplantation in the body is not high. It is hard to find a successful example.
특히, 지방, 골수 또는 제대혈 유래 줄기세포치료제가 허혈성 질환 치료에 사용될 수 있고, 혈관을 재생시킬 수 있는 것으로 밝혀졌으나, 2차원 배양으로 허혈부위에 이식된 줄기세포의 대부분은 사멸되어 세포치료제의 치료효능이 크지 않은 문제점이 있어 왔다. 또한, 레만(Rehman J) 등은 지방 유래 줄기세포에서 혈관 재생에 관련된 인자가 분비된다는 것을 보고하였으나(Circulation 2004; 109(10): 1292-8), 이 방법에서도 역시 줄기세포가 단일 세포 형태로 허혈 부위에 이식되어 이식된 세포의 생존율이 극히 낮았다. 나아가, 나까가미(Nakagami H) 등은 지방 유래 줄기세포를 VEGF와 HGF로 처리한 후 마우스 하지 허혈 부위에 이식하는 내용을 보고하였다(Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005; 25(12): 2542-7). 그 결과 VEGF와 HGF로 처리하지 않고 이식된 지방 유래 줄기세포보다 혈관 재생 효과가 높았으나, VEGF, HGF 등의 성장인자는 농도에 따라서는 암을 유발할 가능성이 높아 임상 적용이 어려운 문제가 있었다.
In particular, fat, bone marrow or umbilical cord blood-derived stem cell therapy can be used to treat ischemic diseases, and it has been found that blood vessels can be regenerated. However, most of the stem cells transplanted into the ischemic site by two-dimensional culture are killed to treat cell therapy. There has been a problem that the efficacy is not great. Rehman J et al. Also reported that adipose derived stem cells secrete factors related to blood vessel regeneration (Circulation 2004; 109 (10): 1292-8). The survival rate of the cells transplanted to the ischemic site was extremely low. Furthermore, Nakagami H et al. Reported the transplantation of adipose-derived stem cells into VEGF and HGF and transplanted them into the lower limb ischemia (Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005; 25 (12): 2542-7). . As a result, the vascular regeneration effect was higher than that of the adipose-derived stem cells transplanted without VEGF and HGF treatment, but growth factors such as VEGF and HGF were likely to cause cancer depending on the concentration, which makes it difficult to apply clinically.
이에 줄기세포에 대한 대안으로, 상기 줄기세포의 조건 배지(conditioned media)가 주목을 받고 있다. 조건 배지라 함은 세포를 배양한 후의 세포 자체를 포함하지 않는 배지로서, 세포 성장에 필수적인 여러 가지 성분들(예컨대, 사이토카인, 성장인자 등)이 포함되어 있는 것으로 예측되는 배지이다. 조건 배지는 세포의 성장을 촉진시키기 위해 사용되거나, 특정 성분을 분리해내기 위해 사용되고 있으며, 이 밖에도 조건 배지 자체로 여러 가지 질환의 치료에 응용되고 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지를 이용하여 2차원 배양 접시에서 혈관내피전구세포를 배양한 후, 얻어진 조건 배지를 랫트의 허혈 부위에 주사하여 허혈을 치료하거나(Stefano Di Santo et al., PLos One, Vol. 4, Issue 5, e5643, 2009), 세포 배양 배지를 이용하여 2차원 배양 접시에서 돼지 지방 유래 줄기세포를 배양한 후, 얻은 조건 배지를 돼지 피부에 생성된 창상 부위에 주사하여 치료하거나(Fu, Xiaobing, Fang et al., Wound Repair and Regeneration, vol. 15, No. 4, pp. 540-548, 2007), 세포 배양 배지를 이용하여 2차원 배양 접시에서 인간 지방 유래 줄기세포를 배양한 후, 얻은 조건 배지를 피부 주름이 유발된 마우스 주름에 주사하여 치료한 결과가 보고된 바 있다(Won-Serk Kim et al., Journal of Dermatological Science, 48, 15-24, 2007). 하지만, 상기 연구들에 사용된 배지는 동물 유래 성분인 소 혈청과 안전성이 떨어지는 완충용액 및 지시약 성분들이 포함되어 있어 임상에 직접 적용하기 어려운 단점이 있다. 또한, 종래의 일반적인 세포배양법인 2차원 배양(배양 접시에서의 배양)의 경우 배지로 분비되는 성분들(예를 들어, 성장 인자 등)의 농도가 낮아 임상적용시 환부에 많은 부피의 조건 배지를 사용하여야 하는 문제가 있다.
As an alternative to stem cells, the conditioned media of the stem cells are attracting attention. Conditional medium is a medium which does not contain the cell itself after culturing the cell, and is a medium which is expected to contain various components (eg, cytokines, growth factors, etc.) essential for cell growth. Conditional medium is used to promote the growth of cells or to isolate specific components, and the conditional medium itself is applied to the treatment of various diseases. For example, after culturing the vascular endothelial progenitor cells in a two-dimensional culture dish using a cell culture medium, the resulting condition medium is injected into the ischemic site of the rat to treat ischemia (Stefano Di Santo et al., PLos One, Vol. 4,
이에 본 발명자들은 상기 문제를 해결하고자 연구하던 중, 세포 부착 지지체 및 성장인자가 포함되지 않은 배양 배지를 이용하여 성체 줄기세포를 세포 스페로이드(cell spheroid) 형태로 3차원 생물 반응기에서 배양하여 얻은 조건 배지가 안전성과 조건 배지 내 유용 성분의 함량이 높아 허혈성 질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the present inventors while studying to solve the above problems, the conditions obtained by culturing adult stem cells in a three-dimensional bioreactor in the form of cell spheroid (cell spheroid) using a culture medium containing no cell attachment support and growth factors The present invention was completed by confirming that the medium has high safety and high content of useful components in the medium, thereby effectively treating ischemic disease.
따라서, 본 발명의 목적은 허혈성 질환을 치료하는데 사용될 수 있는 조건 배지를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition comprising a conditioned medium that can be used to treat ischemic disease.
본 발명의 다른 목적은 창상 또는 당뇨성 족부 괴양을 치료하는데 사용될 수 있는 조건 배지를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising a conditioned medium that can be used to treat a wound or diabetic foot ulcer.
본 발명의 또 다른 목적은 탈모 또는 주름의 예방 또는 개선에 사용될 수 있는 조건 배지를 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
Still another object of the present invention is to provide a cosmetic composition comprising a conditioned medium which can be used for the prevention or improvement of hair loss or wrinkles.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 성체 줄기세포를 3차원 생물 반응기에서 배양 배지를 이용하여 3차원적으로 배양하여 수거한 조건 배지를 유효성분으로 포함하는, 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of ischemic disease, comprising as an active ingredient the conditioned medium obtained by culturing adult stem cells three-dimensionally using a culture medium in a three-dimensional bioreactor. do.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 성체 줄기세포를 3차원 생물 반응기에서 배양 배지를 이용하여 3차원적으로 배양하여 수거한 조건 배지를 유효성분으로 포함하는, 창상 및 당뇨성 족부 괴양 치료용 약학적 조성물을 제공한다. In order to achieve the above another object, the present invention comprises a condition medium collected by culturing adult stem cells three-dimensionally using a culture medium in a three-dimensional bioreactor, for the treatment of wounds and diabetic foot ulcers It provides a pharmaceutical composition.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 성체 줄기세포를 3차원 생물 반응기에서 배양 배지를 이용하여 3차원적으로 배양하여 수거한 조건 배지를 유효성분으로 포함하는, 탈모 및 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
In order to achieve the above another object, the present invention comprises a condition medium collected by culturing adult stem cells three-dimensionally using a culture medium in a three-dimensional bioreactor as an active ingredient, hair loss and wrinkle prevention or cosmetics for improvement To provide a composition.
본 발명에 따른 조건 배지는 2차원 배양법에 의해 얻어진 조건 배지에 비해 혈관생성 촉진 인자의 농도 및 함량이 매우 높아 허혈성 혈관 질환의 혈관 재생에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 종래 세포 배양 배지 또는 조건 배지에 사용되던 동물 유래 성분과 완충용액 및 지시약 성분들이 없어 임상에 안전하게 적용가능하며, 적은 양으로도 허혈성 혈관 질환 등에 효과적으로 사용될 수 있다.
The conditioned medium according to the present invention has a very high concentration and content of angiogenesis-promoting factors compared to the conditioned medium obtained by the two-dimensional culture method, and thus can be usefully used for revascularization of ischemic vascular disease. In addition, there are no animal-derived components, buffers, and indicator components used in conventional cell culture media or condition media, so they can be safely applied clinically, and can be effectively used in ischemic vascular diseases and the like even in small amounts.
도 1은 2차원 배양법 및 3차원 배양법에 따라 배양된 줄기세포의 여러 가지 혈관생성 촉진인자의 발현량(A, B) 및 상기 배양법에 따라 배양된 배지 중의 세포 농도(C) 및 혈관생성 촉진인자의 농도(D)를 나타낸 것이다.
도 2는 종래 배지 및 본 발명에서 제조한 CRM(clinically relevant medium) 배지에서의 배양에 따른 줄기세포의 수를 나타낸 그래프이다. 상기 도에서 medium은 종래 일반 배지를 나타내고, CRM은 본 발명의 배지를 나타내며, no serum은 혈청이 포함되어 있지 않은 것을 나타내고, human serum은 인간 혈청을 사용한 것을 나타내며, monolayer는 2차원 배양법에 의해 배양된 것을 의미하고, spheroid는 본 발명에 따른 3차원 배양법에 의해 배양된 것을 의미한다.
도 3은 종래 배지 및 본 발명에서 제조한 CRM 배지에서의 배양에 따른 혈관생성 촉진인자의 발현량을 나타낸 RT-PCR 결과이다. 상기 도에서 medium은 종래 일반 배지를 나타내고, CRM은 본 발명의 배지를 나타내며, no serum은 혈청이 포함되어 있지 않은 것을 나타내고, M-CM은 2차원 배양법에 의해 배양된 조건 배지를 의미하며, S-CM은 3차원 배양법에 따른 조건 배지를 의미한다.
도 4는 종래 배지 및 본 발명에서 제조한 CRM 배지에서의 배양에 따른 배지 중의 혈관생성 촉진인자(A: VEGF; B: FGF2; C: HGF)의 분비량을 나타낸 결과이다. 상기 도에서 medium은 종래 일반 배지를 나타내고, CRM은 본 발명의 배지를 나타내며, no serum은 혈청이 포함되어 있지 않은 것을 나타내고, M-CM은 2차원 배양법에 의해 배양된 조건 배지를 의미하며, S-CM은 3차원 배양법에 따른 조건 배지를 의미한다.
도 5는 각 실험군 주입 후, 레이져 도플러 이미징 기기를 이용한 혈류량 측정 결과(A) 및 이를 그래프화한 것(B)이다. 도에서 FM은 신선한 배지(fresh medium)를 나타내며, M-CM은 2차원 배양에 의한 조건 배지를 나타내고, S-CM은 3차원 배양에 의한 조건 배지를 나타내며, hADSC는 인간 지방 유래 줄기세포를 나타낸다.
도 6은 각 실험군 주입 후, 모세혈관에 대한 면역 염색을 통한 마우스 허혈 부위 조직의 혈관 밀도 조사 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다. 도에서 FM은 신선한 배지(fresh medium)를 나타내며, M-CM은 2차원 배양에 의한 조건 배지를 나타내고, S-CM은 3차원 배양에 의한 조건 배지를 나타내며, hADSC는 인간 지방 유래 줄기세포를 나타낸다. 그래프에서 **는 임의의 군에 대비하여 P<0.05인 경우를, *는 P<0.01인 경우를, 그리고 #은 P<0.01인 경우를 나타낸다.
도 7은 각 실험군 주입 후, 세동맥에 대한 면역 염색을 통한 마우스 허혈 부위 조직의 혈관 밀도 조사 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다. 도에서 FM은 신선한 배지(fresh medium)를 나타내며, M-CM은 2차원 배양에 의한 조건 배지를 나타내고, S-CM은 3차원 배양에 의한 조건 배지를 나타내며, hADSC는 인간 지방 유래 줄기세포를 나타낸다. 그래프에서 **는 임의의 군에 대비하여 P<0.05인 경우를, *는 P<0.01인 경우를, 그리고 #은 P<0.01인 경우를 나타낸다.
도 8은 각 실험군 주입 후, 캐스파아제(caspase)에 대한 면역 염색을 통한 마우스 허혈 부위 조직의 혈관 밀도 조사 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다. 도에서 FM은 신선한 배지(fresh medium)를 나타내며, M-CM은 2차원 배양에 의한 조건 배지를 나타내고, S-CM은 3차원 배양에 의한 조건 배지를 나타내며, hADSC는 인간 지방 유래 줄기세포를 나타낸다. 그래프에서 **는 임의의 군에 대비하여 P<0.05인 경우를, *는 P<0.01인 경우를, 그리고 #은 P<0.01인 경우를 나타낸다.
도 9는 본 발명에 따른 조건 배지 주사 후, 레이져 도플러 이미징 기기를 이용한 혈류량 측정 결과(A) 및 이를 그래프화한 것(B)이다. 도에서 CRM은 본 발명에 따른 조건 배지를 나타내며, medium은 종래 일반 배지를 나타내고, S-CM은 3차 배양을 통해 얻은 조건 배지를 나타내며, hADSC는 인간 지방 유래 줄기세포를 나타낸다.
도 10은 본 발명에 따른 조건 배지 주사 후, 모세혈관에 대한 면역 염색을 통한 마우스 허혈 부위 조직의 혈관 밀도 조사 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다. 도에서 CRM은 본 발명에 따른 조건 배지를 나타내며, medium은 종래 일반 배지를 나타내고, S-CM은 3차 배양을 통해 얻은 조건 배지를 나타내며, hADSC는 인간 지방 유래 줄기세포를 나타낸다.
도 11은 본 발명에 따른 조건 배지 주사 후, 세동맥에 대한 면역 염색을 통한 마우스 허혈 부위 조직의 혈관 밀도 조사 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다. 도에서 CRM은 본 발명에 따른 조건 배지를 나타내며, medium은 종래 일반 배지를 나타내고, S-CM은 3차 배양을 통해 얻은 조건 배지를 나타내며, hADSC는 인간 지방 유래 줄기세포를 나타낸다.
도 12는 본 발명에 따른 조건 배지 주사 후, 허혈 부위 조직의 괴사 및 섬유화를 나타낸 사진이다. 도에서 CRM은 본 발명에 따른 조건 배지를 나타내며, medium은 종래 일반 배지를 나타내고, S-CM은 3차 배양을 통해 얻은 조건 배지를 나타내며, hADSC는 인간 지방 유래 줄기세포를 나타낸다.
도 13은 본 발명에 따른 조건 배지 주사 후, 주기적으로 촬영한 하지 허혈 부위의 외형적 변화를 나타내는 사진 및 사지 회복, 발 괴사 및 사지 손실의 비율을 나타내는 표와 그래프이다.Figure 1 shows the expression levels (A, B) of various angiogenesis promoters of stem cells cultured according to the two-dimensional and three-dimensional culture method, the cell concentration (C) and the angiogenesis-promoting factors in the culture medium according to the culture method It shows concentration (D) of.
Figure 2 is a graph showing the number of stem cells according to the culture in the conventional medium and CRM (clinically relevant medium) medium prepared in the present invention. In the figure, medium represents a conventional general medium, CRM represents a medium of the present invention, no serum represents no serum, human serum represents human serum, and the monolayer is cultured by two-dimensional culture. Spheroid means cultured by the three-dimensional culture method according to the present invention.
Figure 3 is a RT-PCR results showing the expression level of the angiogenesis promoter according to the culture in the conventional medium and CRM medium prepared in the present invention. In the figure, medium represents a conventional general medium, CRM represents a medium of the present invention, no serum represents no serum, M-CM means a conditioned medium cultured by two-dimensional culture method, S -CM means a conditioned medium according to the three-dimensional culture method.
Figure 4 is a result showing the secretion amount of the angiogenesis promoting factors (A: VEGF; B: FGF2; C: HGF) in the culture medium according to the culture in the conventional medium and CRM medium prepared in the present invention. In the figure, medium represents a conventional general medium, CRM represents a medium of the present invention, no serum represents no serum, M-CM means a conditioned medium cultured by two-dimensional culture method, S -CM means a conditioned medium according to the three-dimensional culture method.
5 is a blood flow measurement result (A) and a graph (B) using the laser Doppler imaging device after each experimental group injection. In the figure, FM indicates fresh medium, M-CM indicates condition medium by two-dimensional culture, S-CM indicates condition medium by three-dimensional culture, and hADSC indicates stem cells derived from human adipose. .
Figure 6 is a photograph and a graph showing the results of the blood vessel density investigation of mouse ischemic site tissue through immunostaining for capillaries after injection of each experimental group. In the figure, FM indicates fresh medium, M-CM indicates condition medium by two-dimensional culture, S-CM indicates condition medium by three-dimensional culture, and hADSC indicates stem cells derived from human adipose. . In the graph, ** indicates a case where P <0.05 compared to any group, * indicates a case where P <0.01, and # indicates a case where P <0.01.
Figure 7 is a photograph and graph showing the results of the blood vessel density investigation of mouse ischemic site tissue by immunostaining for arterioles after each experimental group injection. In the figure, FM indicates fresh medium, M-CM indicates condition medium by two-dimensional culture, S-CM indicates condition medium by three-dimensional culture, and hADSC indicates stem cells derived from human adipose. . In the graph, ** indicates a case where P <0.05 compared to any group, * indicates a case where P <0.01, and # indicates a case where P <0.01.
Figure 8 is a photograph and graph showing the results of the blood vessel density investigation of mouse ischemic site tissue through the immunostaining for caspase (caspase) after each experimental group injection. In the figure, FM indicates fresh medium, M-CM indicates condition medium by two-dimensional culture, S-CM indicates condition medium by three-dimensional culture, and hADSC indicates stem cells derived from human adipose. . In the graph, ** indicates a case where P <0.05 compared to any group, * indicates a case where P <0.01, and # indicates a case where P <0.01.
9 is a blood flow measurement result (A) using a laser Doppler imaging device and a graph (B) after the condition medium injection according to the present invention. In Figure CRM represents a condition medium according to the present invention, medium represents a conventional general medium, S-CM represents a condition medium obtained through tertiary culture, hADSC represents a stem cell derived from human adipose.
Figure 10 is a photograph and graph showing the results of the blood vessel density investigation of mouse ischemic site tissue through immunostaining for capillaries after the condition medium injection according to the present invention. In Figure CRM represents a condition medium according to the present invention, medium represents a conventional general medium, S-CM represents a condition medium obtained through tertiary culture, hADSC represents a stem cell derived from human adipose.
Figure 11 is a photograph and graph showing the results of the blood vessel density investigation of mouse ischemic site tissue by immunostaining for arterioles after injection of the condition medium according to the present invention. In Figure CRM represents a condition medium according to the present invention, medium represents a conventional general medium, S-CM represents a condition medium obtained through tertiary culture, hADSC represents a stem cell derived from human adipose.
12 is a photograph showing necrosis and fibrosis of ischemic site tissue after injection of the condition medium according to the present invention. In Figure CRM represents a condition medium according to the present invention, medium represents a conventional general medium, S-CM represents a condition medium obtained through tertiary culture, hADSC represents a stem cell derived from human adipose.
Figure 13 is a table and graph showing the change in limb recovery, foot necrosis and limb loss and photographs showing the external changes of the lower limb ischemia site periodically taken after the condition medium injection according to the present invention.
이하 본 발명에 사용된 용어를 정의한다.Hereinafter, terms used in the present invention are defined.
본 발명에 사용된 용어 "조건 배지(conditioned media, 조정 배지라고도 함)"는 세포를 배양하여 얻은 세포 자체를 포함하지 않는 배지로서, 세포 성장에 필수적인 여러 가지 성분들(예컨대, 성장 인자, 사이토카인 등)이 포함되어 있는 것으로 예측되는 배지이다. 배양하는 세포 및 배양 방식에 따라 조건 배지의 구성은 달라질 수 있으며, 본 발명에 사용한 조건 배지는 성체 줄기세포, 바람직하게는 지방 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 및 골수 유래 줄기세포를 배양하기에 적합한 배지이다. 상기 조건 배지는 성체 줄기세포를 배양 배지에서 배양한 후, 원심분리나 여과 등의 방법을 통해 얻어질 수 있다. As used herein, the term “conditioned media (also referred to as conditioned media) is a medium that does not include the cells themselves obtained by culturing the cells, and includes various components necessary for cell growth (eg, growth factors, cytokines). And the like). The composition of the conditioned medium may vary depending on the cells to be cultured and the culture method, and the conditioned medium used in the present invention is suitable for culturing adult stem cells, preferably fat-derived stem cells, umbilical cord stem cells and bone marrow-derived stem cells. It is a badge. The condition medium may be obtained by culturing adult stem cells in a culture medium, and then centrifugation or filtration.
본 발명에 사용된 용어 "2차 배양"은 줄기세포 배양에 통상적으로 사용되던 방식으로서 배양 접시(페트리 디쉬) 상에서 줄기세포를 배양하는 것으로서 단일층(monolayer culture)으로도 불린다. 반면, "3차 배양"은 배양 접시가 아닌 배양 배지가 담긴 플라스크에서 적절한 교반하에 배양하는 것으로서, 스피너 배양(spinner culture)으로도 불린다.
The term "secondary culture" as used herein refers to culturing stem cells on a culture dish (petri dish) in a manner conventionally used for stem cell culture, also referred to as monolayer culture. On the other hand, "tertiary culture" refers to culturing under appropriate agitation in a flask containing a culture medium rather than a culture dish, also called spinner culture.
본 발명은 성체 줄기세포를 3차원 생물 반응기에서 배양 배지를 이용하여 3차원적으로 배양하여 수거한 조건 배지를 유효성분으로 포함하는, 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다. The present invention provides a pharmaceutical composition for treating ischemic disease, comprising, as an active ingredient, a condition medium obtained by culturing adult stem cells three-dimensionally using a culture medium in a three-dimensional bioreactor.
상기 성체 줄기세포는 전술한 바와 같이, 지방 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 및 골수 유래 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지는 않으며, 당업계에 알려진 줄기세포가 모두 사용될 수 있다
The adult stem cells, as described above, may be adipose derived stem cells, umbilical cord blood derived stem cells and bone marrow derived stem cells, but is not limited thereto, all stem cells known in the art can be used.
본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 조건 배지는 성체 줄기세포를 3차원 배양하여 얻는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 3차원 스피너 플라스크(spinner flask) 생물 반응기 배양 방식을 이용하여 줄기세포를 세포 스페로이드(speroid) 형태로 제조한 후 상기 줄기세포를 제거하여 조건 배지를 얻는다. 본 발명에 따른 3차원 배양의 경우, 시험관 내 세포 생존율을 크게 증가시킬 수 있으며, 세포당 혈관생성 인자의 분비량을 향상시킬 수 있으므로, 적은 양으로도 뛰어난 효과를 달성할 수 있다. 게다가, 종래에 사용되던 2차원 배양법들과는 달리 3차원 배양방법은 대량 배양 공정에 적합한 방법이기 때문에 임상 적용하기에 필수적인 공정요소인 세포양의 증대까지 달성할 수 있는 추가적인 이점이 있다.
Conditional medium, which is an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, is characterized by obtaining adult stem cells by three-dimensional culture. In one embodiment of the present invention, stem cells are prepared in the form of cell spheroids using a three-dimensional spinner flask bioreactor culture method, and then the stem cells are removed to obtain a conditioned medium. In the case of the three-dimensional culture according to the present invention, it is possible to greatly increase the in vitro cell viability, and to improve the amount of angiogenesis factor per cell, it is possible to achieve an excellent effect in a small amount. In addition, unlike the two-dimensional culture method used in the prior art, since the three-dimensional culture method is a suitable method for mass culture process, there is an additional advantage that can be achieved to increase the amount of cells which is an essential process element for clinical application.
한편, 본 발명의 3차원 배양 방법은 세포 부착 지지체 및 성장인자가 제공되지 않은 상태로 수행될 수 있다. 세포 부착 지지체는 여러 가지 요건을 요구하는 까다로운 구성으로서, 즉, 복잡한 3차원 모양 안으로 재현성 있는 조작이 가능해야 하고, 세포를 접종할 때 공간적으로 일정하게 분포되어야 하고, 시험관내 배양에서 확산 제한이 최소화될 수 있도록 매우 다공성인 구조로 이루어져야 하며, 화학적, 구조적, 기계적 성질을 갖추어야 하고, 조직세포가 생체 내에 이식될 경우 오랜 기간 생체적합성을 가지도록 생분해를 조절할 수 있어야 하는 등의 여러 가지 조건을 갖추어야 한다. 따라서, 본 발명은 세포 부착 지지체를 사용하지 않음으로서 보다 간단하고 편리하게 배양할 수 있는 장점이 있다. On the other hand, the three-dimensional culture method of the present invention can be carried out without a cell attachment support and growth factor provided. Cell attachment scaffolds are demanding configurations that require a variety of requirements, that is, they must be capable of reproducible manipulation into complex three-dimensional shapes, must be spatially uniformly distributed upon inoculation of cells, and minimize diffusion restrictions in in vitro culture. It must be composed of a very porous structure, have chemical, structural and mechanical properties, and have various conditions such that biodegradation can be controlled to be biocompatible for a long time when tissue cells are transplanted in vivo. . Therefore, the present invention has the advantage that it can be cultured more simply and conveniently by not using the cell attachment support.
또한, 종래 줄기세포 배양시 사용되는 성장 인자는 농도에 따라 암을 유발할 가능성이 있으나, 본 발명은 상기 성장 인자를 전혀 사용하지 않음으로서 안전성이 높은 장점이 있다. 상기 성장인자의 예로는 혈관내피성장인자(VEGF), 염기섬유아세포성장인자(bFGF) 또는 간세포 성장인자(HGF)을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
In addition, the growth factor used in conventional stem cell culture may cause cancer depending on the concentration, but the present invention has the advantage of high safety by not using the growth factor at all. Examples of the growth factor include, but are not limited to, vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), or hepatocyte growth factor (HGF).
본 발명에 따른 3차원 배양은 저산소 조건(hypoxia) 하에서 수행될 수 있으나, 정상산소 조건(normoxia) 하에서도 3차원 배양으로 동등한 수준의 결과를 얻을 수 있으므로, 정상산소 조건하에서 수행하여도 무방하다.
Three-dimensional culture according to the present invention can be carried out under hypoxia conditions (hypoxia), but even under normal oxygen conditions (normoxia) can be performed under normal oxygen conditions, since the same level of results can be obtained by three-dimensional culture.
본 발명에 따른 조성물 내 유효성분인 조건 배지는 임상학적으로 위험성 요인이 있는 성분들을 함유하지 않는 것을 특징으로 한다. 상기 성분들의 예로는 소 혈청, 완충용액, 지시약, 및 이로부터 유래한 성분을 들 수 있다. 상기 소 혈청은 본 발명의 조건 배지에 포함되지 않거나, 인간 혈청으로 대체되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 완충용액은 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES)일 수 있으며, 상기 지시약은 페놀 레드일 수 있다. 본 발명의 조건 배지는 소 혈청 성분을 포함하지 않음으로써 인간의 질환에 안전하게 사용될 수 있으며, 안전성이 낮은 완충용액, 지시약 등의 성분을 포함하지 않음으로써 임상에 안전하게 적용할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 조건 배지를 얻기 위해 사용되는 배양 배지는 성체 줄기 세포 배양을 위해 통상적으로 사용되는 배지, 예를 들어 α-최소 필수 배지(MEM)로부터 상기 위험성 있는 성분(소혈청, 완충용액, 지시약, 성장인자 등)을 제거하고, 필요에 따라 소혈청을 인간 혈청으로 대체한 배지일 수 있으며, 상기 성분 외 기타 성분을 적절히 조정한 배지일 수 있다. Conditional medium, which is an active ingredient in the composition according to the present invention, is characterized by containing no clinically dangerous components. Examples of such components include bovine serum, buffers, indicators, and components derived therefrom. The bovine serum is not included in the condition medium of the present invention, or preferably replaced with human serum. In addition, the buffer solution may be 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), and the indicator may be phenol red. The condition medium of the present invention can be safely used in human diseases by not containing bovine serum components, and can be safely applied to the clinic by not including components such as low safety buffers and indicators. The culture medium used to obtain the condition medium according to the present invention is a medium used for culturing adult stem cells, for example, α-minimum essential medium (MEM) from the dangerous components (bovine serum, buffer solution, Indicator, growth factor, and the like), and may be a medium in which bovine serum is replaced with human serum, if necessary, or a medium in which other components other than the above ingredients are appropriately adjusted.
바람직하게는, 상기 본 발명에 따른 조건 배지를 얻기 위해 사용되는 배양 배지는 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린, 아르기닌, 히스티딘, 알라닌, 아미노아세트산, 프롤린, 세린, N-아세틸-L-시스테인 등과 같은 아미노산류; Na+, K+, Mg2+, Cl-, 아세테이트-, 말레이트- 등과 같은 전해질류; 및 레티놀 팔미테이트, 에르고칼시페롤, 토코페롤 아세테이트, 아스코브산, 염화티아민, 인산리보플라빈나트륨, 니코틴산, 염화피리독신, 덱스판테놀 등과 같은 비타민류를 포함할 수 있다. Preferably, the culture medium used to obtain the conditioned medium according to the present invention is isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, valine, arginine, histidine, alanine, aminoacetic acid, proline, serine, N- Amino acids such as acetyl-L-cysteine and the like; Na +, K +, Mg 2+ , Cl -, acetate -, maleate - electrolytes, such as and the like; And vitamins such as retinol palmitate, ergocalciferol, tocopherol acetate, ascorbic acid, thiamine chloride, riboflavin sodium phosphate, nicotinic acid, pyridoxine chloride, dexpanthenol and the like.
보다 바람직하게는, 상기 본 발명에 따른 조건 배지를 얻기 위해 사용되는 배양 배지는 상기 아미노산류 중 이소류신, 류신, 리신, 트레오닌, 발린, 아르기닌, 히스티딘, 알라닌, 아미노아세트산, 프롤린 및 세린을 0.1% 내지 0.9% (w/v)의 범위로 함유하고, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, N-아세틸-L-시스테인을 0.01% 내지 0.09% (w/v)의 범위로 함유하며; 상기 전해질류 중에서 Na+, K+, Cl-, 아세테이트-, 및 말레이트-를 20 내지 70 mM의 범위로 함유하고, Mg2+를 2 내지 7 mM의 범위로 함유하며; 비타민 중에서 레티놀 팔미테이트, 에르고칼시페롤 및 토코페롤 아세테이트를 0.1 내지 5000 IU의 범위로 함유하고, 아스코브산, 염화티아민, 인산리보플라빈나트륨, 니코틴산, 염화피리독신 및 덱스판테놀을 0.1% 내지 20% (w/v)의 범위로 포함할 수 있다. More preferably, the culture medium used to obtain the condition medium according to the present invention is 0.1% to isoleucine, leucine, lysine, threonine, valine, arginine, histidine, alanine, aminoacetic acid, proline and serine among the amino acids. In the range of 0.9% (w / v) and in the range of 0.01% to 0.09% (w / v) of methionine, phenylalanine, tryptophan, N-acetyl-L-cysteine; The electrolyte flow from the Na +, K +, Cl - , acetate -, and maleate-containing in the range of 20 to 70 mM, and containing Mg 2+ in the range of 2 to 7 mM; Retinol palmitate, ergocalciferol and tocopherol acetate in the vitamin range from 0.1 to 5000 IU, and ascorbic acid, thiamine chloride, sodium riboflavin sodium, nicotinic acid, pyridoxine chloride and dexpanthenol (w / w) / v).
가장 바람직하게는, 상기 본 발명에 따른 조건 배지를 얻기 위해 사용되는 배양 배지는 10% 인간 혈청을 포함하는 표 3의 조성을 가진 배지일 수 있다. 상기 배지 성분은 당해 기술분야의 숙련자라면 용이하게 조정할 수 있다.
Most preferably, the culture medium used to obtain the condition medium according to the present invention may be a medium having a composition of Table 3 containing 10% human serum. The medium component can be easily adjusted by those skilled in the art.
본 발명에 따른 조건 배지를 포함하는 약학적 조성물은 허혈성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 상기 허혈성 질환의 예로는 허혈성 뇌질환, 허혈성 신질환, 허혈성 폐질환, 사지의 허혈성 질환, 버거스병, 하지동맥 폐색증, 뇌졸중, 뇌경색, 허혈성 심근증, 심근경색증, 허혈성 심부전 또는 폐색성 동맥경화증 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. Pharmaceutical compositions comprising the conditioned medium according to the present invention can be usefully used for the treatment of ischemic diseases. Examples of the ischemic disease include ischemic brain disease, ischemic kidney disease, ischemic lung disease, limb ischemic disease, Burgers disease, lower limb artery occlusion, stroke, cerebral infarction, ischemic cardiomyopathy, myocardial infarction, ischemic heart failure or obstructive atherosclerosis. However, it is not limited thereto.
상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 허혈성 질환의 허혈조직 부위에 주입하여 사용될 수 있다.
The pharmaceutical composition according to the present invention may be used by injecting into an ischemic tissue site of an ischemic disease.
또한, 본 발명에 따른 조건 배지를 포함하는 약학적 조성물은 창상 및 당뇨성 족부 괴양을 치료하는데 사용될 수 있다. In addition, pharmaceutical compositions comprising the conditioned medium according to the invention can be used to treat wounds and diabetic foot ulcers.
나아가, 본 발명에 따른 조건 배지를 포함하는 조성물은 탈모 및 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.
Furthermore, the composition containing the condition medium according to the present invention can be used as a cosmetic composition for preventing or improving hair loss and wrinkles.
본 발명에 따른 조건 배지를 포함하는 약학적 조성물 또는 화장료 조성물은 당해 기술분야의 숙련자에게 알려진 통상의 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 조성물에 사용되는 조건 배지는 조건 배지 자체 또는 그 농축물 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 조건 배지를 포함하는 약학적 조성물은 비경구 경로, 바람직하게는 정맥내 주사를 통해 주입될 수 있으며, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 비경구 경로, 바람직하게는 피부 도포를 통해 적용될 수 있다.
Pharmaceutical compositions or cosmetic compositions comprising the conditioned medium according to the present invention may comprise conventional carriers or excipients known to those skilled in the art. In addition, the conditioned medium used in the composition of the present invention may be used in the form of the conditioned medium itself or its concentrate. The pharmaceutical composition comprising the conditioned medium according to the invention can be injected via the parenteral route, preferably by intravenous injection, and the cosmetic composition according to the invention can be applied via the parenteral route, preferably by skin application. have.
이하의 실시예를 통하여 본 발명의 특정 구체예를 설명한다. Specific embodiments of the present invention will be described through the following examples.
이하에 기재하는 구체예는 예시적인 목적으로 기술된 것일 뿐이며, 본 발명의 범위는 오직 특허청구범위에 의하여만 한정된다.
The embodiments described below are only described for illustrative purposes, and the scope of the present invention is limited only by the claims.
실시예 1: 지방 유래 줄기세포의 2차원 배양 및 3차원 배양의 비교분석Example 1 Comparative Analysis of Two-Dimensional and Three-Dimensional Cultures of Adipose-derived Stem Cells
<1-1> 지방 유래 줄기 세포의 2차원 배양<1-1> Two-Dimensional Culture of Adipose-derived Stem Cells
인간 지방 조직을 추출하여, 포스페이트-완충 식염수(phosphate-buffered saline: PBS)로 세척 후에 잘게 조각을 내었다. 지방 조직의 조각을 콜라게나아제 타입 1 용액에서 37℃, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 조직에서 분리된 세포를 α-최소 필수 배지(minimal essential medium)에서 배양하였다. 이때, 정상산소 조건(normoxia; 20% O2, 10% 혈청, 다른 언급이 없는 경우 이하 같음)과 저산소 조건(hypoxia; 1% O2, 0% 혈청, 다른 언급이 없는 경우 이하 같음)으로 나누어 배양하였다. Human adipose tissue was extracted and chopped after washing with phosphate-buffered saline (PBS). Pieces of adipose tissue were incubated for 1 hour at 37 ° C. in
<1-2> 지방 유래 줄기 세포의 3차원 배양<1-2> Three-Dimensional Culture of Adipose-derived Stem Cells
지방 유래 줄기 세포를 α-최소 필수 배지가 들어 있는 3차원 스피너 플라스크(spinner flask)에서 세포 부착 지지체 및 다른 성장인자를 첨가하지 않고 정상산소 조건하에서 3일간 3차원 배양하였다. 배양 후, 상기 지방 유래 줄기 세포를 주사전자현미경(SEM)을 통하여, 그리고 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)(H & E) 염색 후 광학 현미경을 통하여 관찰한 결과, 세포 스페로이드(speroid)가 형성되었음을 확인할 수 있었다.
Adipose-derived stem cells were cultured three-dimensionally for three days under normal oxygen conditions without addition of cell attachment support and other growth factors in a three-dimensional spinner flask containing α-minimum essential medium. After incubation, the adipose-derived stem cells were observed by scanning electron microscopy (SEM) and by light microscopy after hematoxylin and eosin (H & E) staining. ) Was formed.
<1-3> 성장인자 및 세포 농도의 비교분석<1-3> Comparative analysis of growth factor and cell concentration
상기 실시예 <1-1> 및 <1-2>의 배양 방법상의 차이에 따른 세포내 및 배양 배지 중의 유용 성분의 함량을 비교하기 위하여, RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR을 통하여 저산소 조건에서 발현되는 HIF-1α(hypoxia-inducible factor)와 여러 가지 혈관생성인자, 즉 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor:섬유아세포 기본 성장인자, 세포 생존율 향상 및 혈관 재생에 관여), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor: 혈관내피 성장인자, 세포사 감소 및 혈관 재생에 관여) 및 HGF(hepatocyte growth factor: 간세포 성장인자, 세포사 감소 및 혈관 재생에 관여)의 발현량을 비교하였다. In order to compare the contents of the useful components in the intracellular and culture medium according to the difference in the culture method of Examples <1-1> and <1-2>, RT-PCR was performed. RT-PCR and hypoxia-inducible factor (HIF-1α) expressed in hypoxic conditions and various angiogenesis factors, ie, basic fibroblast growth factor (bFGF), which are involved in fibroblast basic growth factor, improved cell viability and vascular regeneration) The expression levels of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), vascular endothelial growth factor, cell death and vascular regeneration) and HGF (hepatocyte growth factor, cell death and vascular regeneration) were compared.
구체적으로, RT-PCR을 위해서 수거된 세포와 조직들을 세포 용해 용액 (Trizol solution)으로 처리하거나 잘게 부순 후 분쇄기를 이용하여 완전히 용액 상태로 제작하였다. 여기에 클로로포름 0.2 mL을 처리하여 15초간 뒤섞은 뒤 15분 동안 상온에서 방치하였다. 12,000rpm으로 15분간 4℃에 원심분리한 뒤 투명한 층만 뽑아 80% 이소프로판올을 동량 처리하였다. 4℃에서 10분 동안 방치한 후 다시 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 여기에 1ml의 75% 에탄올에 넣어 4℃, 3분 정도 방치한 후, 다시 원심분리하여 상등액을 제거한 뒤 공기 중에 10분간 건조하였다. Specifically, the cells and tissues collected for RT-PCR were treated with a trilysis solution (Trizol solution) or crushed and then prepared in a completely solution state using a grinder. The mixture was treated with 0.2 mL of chloroform, mixed for 15 seconds, and left at room temperature for 15 minutes. After centrifugation at 4 ° C. for 15 minutes at 12,000 rpm, only the transparent layer was extracted and the same amount of 80% isopropanol was treated. After standing at 4 ° C. for 10 minutes, the supernatant was removed by centrifugation again. The mixture was placed in 1 ml of 75% ethanol, and left at 4 ° C. for 3 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and dried in air for 10 minutes.
RNA 1㎕에 RNA 완충용액 7㎕와 이차 증류수 2㎕를 넣고 1% 아가로스젤에 적재하여 비특이 결합용 프라이머 1㎕ 처리 후 Super Script Ⅱ 역전사효소(Reverse Transcriptase) 등의 처리를 거쳐 RNA를 정량하여 cDNA를 제작하였다. 이후 하기 표 1의 센스 프라이머 0.5㎕ 및 안티센스 프라이머 0.5㎕(서열번호 1 내지 10), 2x 완충용액 I 12.5㎕, 증류수 6.75㎕, dNTP 혼합용액 4㎕와 표지인자텍 0.25㎕를 혼합하여 제작된 샘플들의 cDNA 0.5㎕ 씩 사용하여 RT-PCR을 94℃ 5분간 / 94℃ 30초간 / 60℃ 45초간 / 72℃ 45초간 과정을 거쳐 실시하였다. 상기 RT-PCR 산물을 전기영동하여 발현량을 비교하였다. 7 μl of RNA buffer solution and 2 μl of secondary distilled water were added to 1 μl of RNA, loaded on 1% agarose gel, and then treated with 1 μl of nonspecific binding primer followed by Super Script Ⅱ Reverse Transcriptase. CDNA was prepared. Thereafter, 0.5 μl of the sense primer and 0.5 μl of the antisense primer (SEQ ID NOs. 1 to 10), 2 × buffer solution I 12.5 μl, distilled water 6.75 μl, dNTP
상기 RT-PCR 결과를 도 1의 (A)에 나타내었다. 도 1의 결과에서 보는 바와 같이, 정상산소 조건하에서 2차원 배양된 세포에서는 HIF-1α가 전혀 발현되지 않은 반면, 저산소 조건하에서 2차원 배양된 세포와 정상산소 조건하에서 3차원 배양된 스페로이드 세포에서는 HIF-1α가 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, HIF-1α 의 발현은 정상산소 조건하에서 3차원 배양한 경우가 저산소 조건하에서 2차원 배양한 경우에 비해 높게 나타났다. The RT-PCR results are shown in Figure 1 (A). As shown in the results of FIG. 1, HIF-1α was not expressed at all in two-dimensional cultured cells under normal oxygen conditions, while in two-dimensional cultured cells under hypoxic conditions and in three-dimensional cultured spheroid cells under normal oxygen conditions. It was confirmed that HIF-1α is expressed. In particular, the expression of HIF-1α was higher in three-dimensional culture under normal oxygen condition than in two-dimensional culture under hypoxic condition.
외부의 추가적인 자극이 없이도(예: 유전자 전달, 단백질 전달 등) 세포 스페로이드는 구조 상 스페로이드 내부에 저산소(hypoxia) 조건이 형성되어 저산소 조건에서 생존율을 유지시키기 위한 인자(HIF-1α)가 발현되는 것으로 판단되었다. Even without external stimuli (e.g., gene transfer, protein delivery, etc.), cellular spheroids form a hypoxia condition inside the spheroid, resulting in expression of a factor (HIF-1α) to maintain viability in hypoxic conditions. It was judged to be.
또한, 상기 결과와 유사하게 여러 가지 혈관생성인자, 즉 bFGF, VEGF 및 HGF의 경우에도 2차원 배양에 비해 3차원 배양이 발현량이 더 높은 것으로 나타났으며, 특히 저산소 조건하에서의 2차원 배양에 비해서도 정상산소 조건하에서의 3차원 배양이 혈관생성인자의 발현에 유리한 것으로 확인되었다.
In addition, similar to the above results, various angiogenesis factors, ie, bFGF, VEGF, and HGF, showed higher expression in three-dimensional cultures than two-dimensional cultures, and in particular, compared to two-dimensional cultures under hypoxic conditions. Three-dimensional culture under oxygen conditions was found to be beneficial for the expression of angiogenesis factors.
상기 결과를 ELISA 분석을 통해 재확인하였다. ELISA 분석은 각종 인자에 대해 특이적 결합하는 항체를 이용하는 분석법으로, 각각의 항체와 결합되는 혈관생성인자의 양에 따라 분석 용액의 흡광도가 달라짐을 토대로 혈관생성인자의 농도를 계산 가능하게 한다. ELISA 분석을 위하여, VEGF, FGF2, HGF ELISA 듀오 세트 키트(duo set kit)를 사용하여, 96 웰 플레이트에 각 혈관생성인자에 상응하는 항체를 상온에서 12-16시간 코팅하였다. 이후 상온에서 수거된 배지 내의 VEGF, FGF2, HGF와 항체의 반응을 유도하였으며, 4시간 정도의 반응 후, 각각의 항체와 특이적으로 반응하는 2차 발색 시약을 처리함으로써 수거된 배지 내 혈관생성인자의 양을 계산할 수 있었다.The results were reconfirmed by ELISA analysis. The ELISA assay is an assay using an antibody that specifically binds to various factors, and the concentration of angiogenesis factors can be calculated based on the absorbance of the assay solution depending on the amount of angiogenesis factor bound to each antibody. For ELISA analysis, using a VEGF, FGF2, HGF ELISA duo set kit, 96-well plates were coated with antibodies corresponding to each angiogenesis factor at room temperature for 12-16 hours. After inducing the reaction of the antibody with VEGF, FGF2, HGF in the medium collected at room temperature, after 4 hours of reaction, the angiogenesis factor in the collected media by treating the secondary color development reagent that specifically reacts with each antibody Could calculate the amount of.
ELISA 분석 결과를 도 1의 (B)에 나타내었다. 도 1(B)에서 보는 바와 같이, 2차원 배양에 비해 3차원 배양으로 얻은 세포에서 혈관생성인자, 즉 bFGF, VEGF 및 HGF의 발현량이 월등히 높은 것으로 나타났다.
ELISA analysis results are shown in Figure 1 (B). As shown in FIG. 1 (B), the expression levels of angiogenesis factors, ie, bFGF, VEGF and HGF, were significantly higher in cells obtained by three-dimensional culture than in two-dimensional culture.
한편, 실시예 <1-1>의 2차원 배양 및 실시예 <1-3>의 3차원 배양으로 인한 세포 농도 차이를 살펴보기 위하여, 트립신 처리를 통해 세포를 단일 세포로 만들고 혈구계(hemocytometer)를 이용하여 세포 개수를 측정하였다. 측정 결과, 도 1의 (C)에서 보는 바와 같이, 3차원 배양이 2차원 배양에 비해 세포 성장 속도가 높아 배지 중의 세포의 농도가 훨씬 높은 것으로 나타났다.
Meanwhile, in order to examine the difference in cell concentration due to the two-dimensional culture of Example <1-1> and the three-dimensional culture of Example <1-3>, cells were made into single cells by trypsin treatment and a hemocytometer The number of cells was measured using. As a result of the measurement, as shown in (C) of FIG. 1, the three-dimensional culture showed a higher cell growth rate than the two-dimensional culture, and the concentration of cells in the medium was much higher.
나아가, 2차원 배양 및 3차원 배양으로 인한 배지 중에 분비된 혈관생성인자의 농도의 살펴보기 위하여, 상기 기술한 ELISA 분석에 의해 배지 중에 분비된 혈관생성인자의 농도를 측정하였다. 측정 결과를 도 1의 (D)에 나타내었다. 도 1(D)에서 보는 바와 같이, 2차원 배양에 비해 3차원 배양으로 얻은 세포 배양액에서 혈관생성인자, 즉 bFGF, VEGF 및 HGF의 분비량이 월등히 높은 것으로 나타났다.
Furthermore, in order to examine the concentration of angiogenic factors secreted in the medium due to the two-dimensional culture and the three-dimensional culture, the concentration of the angiogenic factors secreted in the medium was measured by the above-described ELISA analysis. The measurement results are shown in FIG. 1 (D). As shown in Figure 1 (D), the secretion of angiogenesis factors, that is, bFGF, VEGF and HGF in the cell culture obtained in the three-dimensional culture compared to the two-dimensional culture was found to be significantly higher.
상기 결과를 종합하여 볼 때, 3차원 스피너 플라스크를 이용하여 인간지방 유래줄기세포를 스페로이드 형태로 배양할 경우 2차원 세포 배양법에 비해 혈관생성인자의 농도가 월등히 높은 조건 배지를 생성할 수 있음을 확인하였다.
Taken together, the results suggest that when culturing human adipose-derived stem cells using a three-dimensional spinner flask in the form of a spheroid, it is possible to produce a condition medium with a significantly higher concentration of angiogenesis factors than a two-dimensional cell culture method. Confirmed.
실시예 2: 인간혈청포함 조건 배지와 일반 세포배양 조건 배지의 특성비교Example 2: Comparison of Characteristics of Human Serum Containing Medium and Normal Cell Culture Conditioning Medium
통상적으로 사용되는 세포배양 배지(α-최소 필수 배지(minimal essential medium)의 경우에는 소 혈청, 완충용액, 지시약 등의 성분이 포함되어 있어, 이로부터 조건 배지를 제조하는 경우 임상에 직접 적용하기 어려운 문제가 있다. 따라서, 본 실시예에서는 상기 성분들이 대체 또는 제거된 배양 배지를 설계하여 이로부터 조건 배지를 제조하였다. Commonly used cell culture medium (α-minimal essential medium) contains components such as bovine serum, buffer solution, and indicators, which are difficult to apply directly to the clinic when preparing a condition medium from them. Therefore, in this example, a culture medium in which the above components were replaced or removed was designed to prepare a condition medium therefrom.
통상적인 세포배양배지(α-최소 필수 배지(minimal essential medium) 및 본 실시예에 사용한 세포배양배지의 조성을 각각 표 2 및 3에 나타내었다. 표 2의 배양배지의 경우 10% 우태아혈청을 포함한다. 한편, 표 3의 배양배지의 경우 10% 인간 혈청을 포함하며, 이를 CRM (clinically relevant medium)이라 명명하였다. The composition of a conventional cell culture medium (α-minimal essential medium) and the cell culture medium used in this example are shown in Tables 2 and 3. The culture medium of Table 2 contains 10% fetal bovine serum. Meanwhile, the culture medium of Table 3 contained 10% human serum, which was named CRM (clinically relevant medium).
상기 표 2 및 3의 배지를 기준으로, 일반배지, 일반배지(무혈청), CRM 및 CRM(무혈청) 배지를 각각 제조하고, 2차원 및 3차원 배양법을 조합하여 배양하였다. Based on the medium of Tables 2 and 3, the normal medium, normal medium (serum-free), CRM and CRM (serum-free) medium were prepared, respectively, and cultured by combining two-dimensional and three-dimensional culture methods.
배양 후, 세포 수 측정 및 세포 및 배양배지 중의 HIF-1α 인자 및 혈관생성인자의 발현(분비)량 측정을 수행하였다. 세포 수는 실시예 <1-3>에 기술된 혈구계(hemotocytometer) 측정 방법에 의해 측정하였고, 세포 중의 HIF-1α 인자 및 혈관생성인자의 발현량은 실시예 <1-3>에 기술된 RT-PCR에 의해 측정하였으며, 배양배지 중의 분비량은 실시예 <1-3>에 기술된 ELISA에 의해 측정하였다.
After the culture, cell number measurement and expression (secretion) amount of HIF-1α factor and angiogenesis factor in cells and culture medium were measured. The cell number was measured by the hematocytometer measuring method described in Example <1-3>, and the expression level of HIF-1α factor and angiogenesis factor in the cells was RT described in Example <1-3>. -PCR was measured and the secretion amount in the culture medium was measured by ELISA described in Example <1-3>.
세포 수 측정결과를 도 2에 나타내었다. 도 2의 결과에서 보는 바와 같이, 인간지방유래줄기세포(hADSC)의 증식은 소혈청 혹은 인간혈청을 포함한 경우에서 전형적인 세포 증식을 보인 반면, 위와 같은 혈청을 포함하지 않은 경우에는 세포 증식이 일어나지 않는 것으로 나타났다. 또한, 소혈청을 사용한 경우와 인간혈청을 사용한 경우의 실험군 간의 통계학적 차이는 없었다.
The cell number measurement results are shown in FIG. 2. As shown in the results of FIG. 2, the proliferation of human adipose derived stem cells (hADSC) shows typical cell proliferation in the case of containing bovine serum or human serum, whereas cell proliferation does not occur in the absence of the above serum. Appeared. In addition, there was no statistical difference between the experimental group using the bovine serum and the human serum.
HIF-1α 인자 및 혈관생성인자를 암호화하는 유전자의 발현량 측정 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 보는 바와 같이, 소혈청과 인간혈청을 포함한 배지를 사용한 경우 상기 유전자들의 발현이 높게 나타난 반면, 위와 같은 혈청을 포함하지 않는 배지를 사용한 경우에는 상기 유전자들의 발현이 크게 감소한 것으로 나타났다. 또한, 같은 배지를 사용하더라고 3차원 스페로이드 배양을 한 경우가 2차원 세포 배양법에 비해 혈관생성인자 유전자의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다.
Figure 3 shows the result of measuring the expression level of the gene encoding the HIF-1α factor and angiogenesis factor. As shown in FIG. 3, the expression of the genes was high when the medium containing bovine serum and human serum was used, whereas the expression of the genes was significantly decreased when the medium without the serum was used. In addition, even when the same medium was used, it was confirmed that the expression of angiogenesis factor gene was increased in the case of three-dimensional spheroid culture compared to the two-dimensional cell culture method.
배지 중으로 분비되는 혈관생성인자의 농도 측정 결과를 도 4의 A~C에 나타내었다. 도 4에서 보는 바와 같이, CRM을 사용할 경우, 일반 배지를 사용한 것과 통계학적 차이를 보이지 않았으나, CRM을 사용한 3차원 스페로이드 배양의 경우, 일반 배지를 사용하거나 CRM을 사용한 2차원 세포 배양에 비해 혈관생성인자의 분비가 증가함을 확인하였다.
Results of measuring the concentration of angiogenic factors secreted in the medium are shown in Figs. As shown in Figure 4, when using the CRM, there was no statistical difference between using the normal medium, but in the three-dimensional spheroid culture using the CRM, compared to the two-dimensional cell culture using the normal medium or CRM It was confirmed that the secretion of the production factor is increased.
실시예 3: 배양법을 달리하여 얻은 조건 배지의 생체 내 이식 및 특성 확인Example 3 In Vivo Transplantation and Characterization of Conditional Media Obtained by Different Culture Methods
<3-1> 마우스 허혈 모델 유도Induction of Mouse Ischemia Model
마우스 하지 허혈 모델을 유도하였다. 마우스 하지 허혈 모델은 문헌[Cho SW, Moon SH, Lee SH et al. Circulation. 2007, 116:2409-2419]에 개시된 방법대로 제조하였다. 마우스 하지 허혈 모델 유도를 위하여 4주령, 평균 체중 20 g의 암컷 면역 결핍 마우스를 사용하였다. 상기 마우스를 럼푼 (10mg/kg)과 케타민 (100mg/kg)을 1:9의 비율로 혼합하여 마취시켰다. 피부 절개 후, 6-0 수술용 봉합사를 사용하여 고동맥과 이하 지류 혈관들의 상단과 하단을 묶어 제거하였다. 외부 장골 동맥의 시작 지점을 6-0 수술용 봉합사를 이용하여 묶고, 복재와 슬와 동맥으로 분리되는 하단 혈관 역시 6-0 수술용 봉합사를 이용하여 묶었다. 상하단의 묶음으로 혈류의 흐름을 차단한 후 사이에 존재하는 고동맥을 모두 제거하였다. 실험에 사용된 마우스들은 모두 "실험동물의 관리와 사용에 대한 지침(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)" (국립보건연구원(NIH) 공개번호 85-23, 1996년 개정)에 따라 관리하였다.
Mouse lower limb ischemia model was induced. Mouse lower limb ischemia models are described by Cho SW, Moon SH, Lee SH et al. Circulation . 2007, 116: 2409-2419. Four week-old, average body weight 20 g female immunodeficiency mice were used to induce a mouse lower limb ischemia model. The mice were anesthetized by mixing rumoon (10 mg / kg) and ketamine (100 mg / kg) in a 1: 9 ratio. After skin incision, 6-0 surgical sutures were used to tie off the top and bottom of the arterial and lower tributary vessels. The starting point of the external iliac artery was tied using 6-0 surgical sutures, and the lower vessels separated by the saphenous and knee arteries were also tied using 6-0 surgical sutures. The upper and lower bundles blocked the flow of blood and removed all the arteries in between. All mice used in the experiments were managed in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publication No. 85-23, revised 1996). It was.
<3-2> 조건 배지의 생체 내 이식<3-2> In Vivo Transplantation of Conditional Medium
일반 배지를 이용하여 2차원 세포 배양을 통해 수거한 조건 배지(M-CM) 및 일반 배지를 이용하여 3차원 스페로이드 배양을 통해 수거한 조건 배지(S-CM)를 다른 세포 이식용 지지체를 사용하지 않고, 7일간 200 μl 씩 허혈 부위에 매일 근육 주사하였다. 지방 유래 줄기세포를 배양하지 않은 일반 배지(α-MEM, FM(fresh medium)이라 함)와 트립신 처리하여 세포를 이식한 실험군, 인간지방 유래줄기세포(hADSC)를 직접 이식한 실험군 및 아무것도 이식하지 않은 실험군을 대조군으로 설정하였다. 각 실험군 및 대조군 당 10마리의 마우스를 사용하였다.
Conditional medium (M-CM) collected through two-dimensional cell culture using normal medium and conditional medium (S-CM) collected through three-dimensional spheroid culture using normal medium were used for the support for transplantation of other cells. Instead, 200 μl was injected daily into the ischemic site every day for 7 days. Experimental group transplanted with non-cultivated fat-derived stem cells (referred to as α-MEM, FM (fresh medium)) and trypsin treatment, experimental group transplanted with human adipose derived stem cells (hADSC), and none Experimental group was set as a control. Ten mice were used for each experimental and control group.
<3-3> 조건 배지 이식 후 혈류량 측정<3-3> Blood flow measurement after condition medium transplantation
실시예 <3-2>에서 제조된 각 조건 배지를 7일간 주사한 후 28일째에 레이져 도플러 이미징 기기(Moor Instruments, Devon, UK)를 이용하여 정기적으로 하지허혈 부위의 혈류량 증가를 확인하였다. 레이져 도플러 이미징 기기는 하지허혈 부위로 혈관이 생성됨에 따라 혈류의 유입으로 인해 상승된 온도 변화를 측정하는 방식으로 신생혈관의 개략적인 모양 및 혈류량을 측정할 수 있다. 상기와 같은 방식으로 매회 마우스를 마취하여 혈류량을 촬영하였다. 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보는 바와 같이, 일반 배지를 이용하여 3차원 스페로이드 배양을 한 뒤 수거한 조건 배지가 2차원 배양 배지에 비해 월등히 높은 혈류량의 증가를 보였다. 특히, 3차원 스페로이드 배양으로 얻은 조건 배지를 이식한 경우, 인간지방 유래줄기세포를 직접 이식한 경우에 비해서도 훨씬 효과가 뛰어난 것으로 나타났다.
After injecting each of the conditioned media prepared in Example <3-2> for 7 days, the blood flow of the lower limb ischemia was periodically confirmed using a laser Doppler imaging device (Moor Instruments, Devon, UK) on the 28th day. The laser Doppler imaging device can measure the approximate shape and blood flow of neovascularized blood vessels by measuring elevated temperature changes due to the inflow of blood flow as blood vessels are generated in the ischemic region of the lower limb. In the same manner as above, the mice were anesthetized each time to photograph blood flow. The results are shown in FIG. As shown in Figure 5, the condition medium collected after the three-dimensional spheroid culture using a normal medium showed a significantly higher blood flow increase than the two-dimensional culture medium. In particular, the transplantation of the conditioned medium obtained by the three-dimensional spheroid culture was shown to be much more effective than the direct transplantation of human fat-derived stem cells.
<3-4> 조건 배지 주사를 통한 허혈 부위의 신생혈관형성 및 조직괴사방지 효과 비교<3-4> Comparison of neovascularization and tissue necrosis prevention effect of ischemic site by conditional media injection
마우스 하지 허혈 모델 유도 후 3일과 28일째 허혈이 유도된 하지 근육 조직을 수거하여 동결박절용 고정 용액에 담근 후 동결 박절을 위해 냉동 보관하였다. 동결 박절은 10 ㎛로 영하 20℃에서 제작되었다. 동결 박절된 조직들을 4% 파라포름알데히드 용액에서 10분간 상온 고정시키고, 이후 영하 20℃에서 에탄올과 아세트산(2:1) 혼합 용액에서 2차 고정시켰다. 실험에 사용된 모든 형광 면역 염색에서 모세혈관과 세동맥을 염색하기 위해서 CD31 항체와 평활근 알파 액틴(smooth muscle(SM)-actin) 항체를 각각 사용하였다. 각 항체에 대응하는 형광 2차 표지로서 녹색(FITC) 이차 항체를 사용하였다. 허혈 조직 부위의 괴사를 확인하기 위하여 세포괴사인자(caspase-3) 항체를 사용하였으며, 형광 2차 표지로서 붉은색(Rhodamin) 이차 항체를 사용하였다. 상기 면역 염색이 종료된 후, 모든 샘플들을 DAPI 용액을 사용하여 덮었다. 실험에 사용된 염색 방법과 염색용 시료들은 문헌[Cho SW, Moon SH, Lee SH et al. Circulation., 2007, 116:2409-2419]에 개시된 내용에 기초하였다. At 3 and 28 days after induction of the lower limb ischemia model, ischemia-induced lower limb muscle tissues were collected, immersed in the fixation solution for cryoablation, and stored frozen for freeze dissection. Frozen leaf was prepared at minus 20 ° C. with 10 μm. Frozen tissues were fixed at room temperature for 10 minutes in a 4% paraformaldehyde solution, and then secondary fixed in a mixed solution of ethanol and acetic acid (2: 1) at
실험 결과, 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 모세혈관의 생성 및 세동맥의 생성이 일반배지를 사용하여 3차원 스페로이드 배양을 통해 수거한 조건 배지의 경우가 2차원 세포 배양을 통해 수거한 조건 배지에 비해 월등히 높게 나타났다. As a result of the experiment, as shown in Figure 6 and 7, the production of capillaries and the production of arterioles were collected by two-dimensional cell culture in the case of the condition medium collected through the three-dimensional spheroid culture using normal medium It was much higher than the medium.
또한, 도 8에서 보는 바와 같이, 상기와 같은 혈관 생성으로 인해 혈류가 증가됨에 따라 3차원 스페로이드 배양을 통해 수거한 조건 배지의 경우가 2차원 세포 배양을 통해 수거한 조건 배지에 비해 괴사가 현저히 저해되는 것으로 나타났다.In addition, as shown in Figure 8, as the blood flow increases due to the formation of blood vessels as described above, the case of the conditioned medium collected through the three-dimensional spheroid culture compared to the conditioned medium collected through the two-dimensional cell culture significantly Appeared to be inhibited.
특히, 모세혈관과 세동맥의 생성 및 괴사 저해 효과와 관련하여, 3차원 스페로이드 배양으로 얻은 조건 배지를 이식한 경우가 인간지방 유래줄기세포를 직접 이식한 경우에 비해서도 훨씬 효과가 뛰어난 것으로 나타났다.
In particular, in relation to the capillary and arteriole formation and necrosis inhibitory effects, the transplantation of the condition medium obtained by the three-dimensional spheroid culture was more effective than the direct transplantation of human adipose derived stem cells.
상기 결과들은 본 발명의 3차원 스페로이드 배양으로 얻은 조건 배지가 2차원 배양으로 얻은 조건 배지에 비해 허혈을 개선시키는 효과가 훨씬 뛰어남을 보여준다.
The results show that the conditioned medium obtained by the three-dimensional spheroid culture of the present invention has a much better effect of improving ischemia than the conditioned medium obtained by the two-dimensional culture.
실시예 4: 배양배지를 달리하여 얻은 조건 배지의 생체 내 이식 및 특성 확인Example 4 In Vivo Transplantation and Characterization of Conditional Media Obtained by Different Culture Medium
실시예 3의 결과를 바탕으로, 기존의 일반배지를 이용하여 3차원 스페로이드 배양을 통해 수거한 조건 배지(Medium-S-CM) 및 본 발명의 CRM 배지를 이용하여 3차원 스페로이드 배양을 통해 수거한 조건 배지(CRM-S-CM)의 효과를 하기와 같이 비교하였다.
Based on the results of Example 3, through the three-dimensional spheroid culture using the condition medium (Medium-S-CM) and CRM medium of the present invention collected through the three-dimensional spheroid culture using a conventional general medium The effect of harvested condition medium (CRM-S-CM) was compared as follows.
<4-1> 조건 배지 이식 후 혈류량 측정<4-1> Blood flow measurement after condition medium transplantation
일반 배지를 주사한 실험군(Medium), CRM을 주사한 실험군(CRM), 일반 배지를 이용하여 3차원 스페로이드 배양을 통해 수거한 조건 배지를 주사한 실험군(Medium-S-CM), CRM을 이용하여 3차원 스페로이드 배양을 통해 수거한 조건 배지를 주사한 실험군(CRM-S-CM), 인간 지방 유래 줄기세포를 이식한 실험군(hADSC), 및 아무것도 처리하지 않은 대조군(No treatment)을 대상으로, 실시예 <3-3>에 개시된 방법과 동일하게 레이져 도플러 이미징 기기를 이용하여 혈류량을 측정하였다. Experiment group injected with normal medium (Medium), experiment group injected with CRM (CRM), experimental group injected with condition medium collected through 3D spheroid culture using normal medium (Medium-S-CM), using CRM The experimental group (CRM-S-CM), the experimental group implanted with human adipose-derived stem cells (hADSC), and the control group treated with nothing (No treatment) were injected. In the same manner as described in Example <3-3>, blood flow was measured using a laser Doppler imaging device.
측정 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에서 보는 바와 같이, 3차원 스페로이드 배양을 통해 수거한 조건 배지를 주사한 군에서 높은 혈류량이 관찰되었으며, 본 발명의 CRM 배지는 일반 배지와 동등하거나 나은 결과를 나타내었다.
The measurement results are shown in FIG. 9. As shown in Figure 9, high blood flow was observed in the group injected with the condition medium collected through the three-dimensional spheroid culture, CRM medium of the present invention showed the same or better results than the normal medium.
<4-2> 조건 배지 이식 후 허혈 부위의 신생혈관형성 및 조직괴사방지 효과 비교<4-2> Comparison of neovascularization and tissue necrosis prevention effects in ischemic areas after condition media transplantation
실시예 <4-1>의 실험군 및 대조군을 대상으로 실시예 <3-4>와 같은 방법으로 모세혈관 및 세동맥의 생성 효과와 괴사 저해 효과를 살펴보았다. In the experimental group and control group of Example <4-1>, the effects of capillary and arteriole formation and necrosis inhibition were examined in the same manner as in Example <3-4>.
실험 결과, 도 10 및 11에서 보는 바와 같이, 3차원 스페로이드 배양을 통해 수거한 조건 배지를 주사한 군이 그 외의 실험군 및 대조군에 비해 신생혈관형성 효과 및 조직괴사방지 효과가 뛰어난 것으로 나타났으며, 본 발명의 CRM 배지는 일반 배지와 동등한 수준의 결과를 나타내었다.
As a result of the experiment, as shown in Figure 10 and 11, the group injected with the conditioned medium collected through the three-dimensional spheroid culture showed that the neovascularization effect and tissue necrosis prevention effect is superior to the other experimental group and the control group. , CRM medium of the present invention showed the same level of results as the normal medium.
<4-3> 조건 배지 주사를 통한 허혈 부위의 근육 조직 괴사 방지<4-3> Prevention of muscle tissue necrosis at the ischemic site by conditional medium injection
실시예 <4-1>의 실험군 및 대조군을 대상으로 근육 조직의 괴사 저해 및 섬유화 저해를 H&E 와 마손 트리크롬(Masson's trichrome) 염색법으로 확인하였다. 각 조직을 파라포름알데하이드에 16 내지 18시간 동안 고정시킨 다음, 에탄올을 이용한 단계적 탈수 과정(dehydration)을 거친 후, 자일렌(xylene)으로 처리하였다. 이후 파라핀틀에 조직을 담근 뒤, 4 ㎛ 두께로 박절하고, 다시 자일렌에서 여분의 파라핀을 제거한 뒤 에탄올을 이용한 단계적 함수 과정을 거친 뒤 염색을 실시하였다. Necrosis inhibition and fibrosis inhibition of muscle tissue in the experimental group and control group of Example <4-1> were confirmed by H & E and Masson's trichrome staining method. Each tissue was fixed in paraformaldehyde for 16 to 18 hours, followed by a step dehydration using ethanol, and then treated with xylene. Subsequently, the tissue was immersed in a paraffin frame, and then sliced into 4 μm thick, and the excess paraffin was removed from xylene, followed by stepwise hydrolysis with ethanol, followed by staining.
염색 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에서 보는 바와 같이, 일반배지 혹은 CRM을 이용하여 스패로이드 배양을 한 뒤 수거된 조건 배지를 사용한 경우, 허혈 부위의 조직들이 정상 조직에 가까운 형태를 보였으며 섬유화 역시 거의 진행되지 않았음을 확인할 수 있었다.
The staining results are shown in FIG. 12. As shown in Figure 12, when using the culture medium collected after the culture of spheroid using normal medium or CRM, the tissues of the ischemic region showed a morphology close to the normal tissue, and the fibrosis was hardly progressed. Could.
<4-4> 조건 배지 이식에 따른 외형적 변화<4-4> Changes in Appearance Following Conditional Media Transplantation
한편, 허혈이 일어나면 조직이 괴사(foot necrosis)하여 마우스 족부가 손실(limb loss)되므로, 외형적 변화를 관찰하여 본 발명의 조건 배지의 효과를 확인하였다. 상기 측정 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에서 보는 바와 같이, CRM을 이용하여 3차원 스페로이드 배양을 통해 수거한 조건 배지를 사용하는 경우 마우스 족부 손실도가 다른 실험군들에 비해 큰 폭으로 감소함을 확인할 수 있었다. On the other hand, when ischemia occurs, the tissue necrosis (foot necrosis) and the mouse foot loss (limb loss), so the appearance change was observed to confirm the effect of the condition medium of the present invention. The measurement results are shown in FIG. 13. As shown in Figure 13, when using the condition medium collected through the three-dimensional spheroid culture using CRM it can be seen that the mouse foot loss is significantly reduced compared to the other experimental groups.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING ISCHEMIC DISEASES COMPRISING CONDITIONED MEDIUM OBTAINED BY THREE-DIMENSIONAL CELL CULTURE AS ACTIVE INGREDIENT <130> FPD201102-0006 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for HIF-1 alpha <400> 1 ccagttaggt tccttcgatc agt 23 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for HIF-1 alpha <400> 2 tttgaggact tgcgctttca 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for VEGF <400> 3 gcagaaggag gagggcagaa t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for VEGF <400> 4 acactccagg ccctcgtcat t 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for bFGF <400> 5 ctttggctgc tacttggagg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for bFGF <400> 6 gaagctttcc agcaaagtgg 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for HGF <400> 7 gttatcgtgg gaatggcaa 19 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for HGF <400> 8 atgatcctcc gcagatat 18 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for beta-actin <400> 9 gcactcttcc agccttcctt cc 22 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for beta-actin <400> 10 tcaccttcac cgttccagtt ttt 23 <110> SNU R & DB FOUNDATION <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING ISCHEMIC DISEASES COMPRISING CONDITIONED MEDIUM OBTAINED BY THREE-DIMENSIONAL CELL CULTURE AS ACTIVE INGREDIENT <130> FPD201102-0006 <160> 10 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for HIF-1 alpha <400> 1 ccagttaggt tccttcgatc agt 23 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for HIF-1 alpha <400> 2 tttgaggact tgcgctttca 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for VEGF <400> 3 gcagaaggag gagggcagaa t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for VEGF <400> 4 acactccagg ccctcgtcat t 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for bFGF <400> 5 ctttggctgc tacttggagg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for bFGF <400> 6 gaagctttcc agcaaagtgg 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for HGF <400> 7 gttatcgtgg gaatggcaa 19 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for HGF <400> 8 atgatcctcc gcagatat 18 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for beta-actin <400> 9 gcactcttcc agccttcctt cc 22 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for beta-actin <400> 10 tcaccttcac cgttccagtt ttt 23
Claims (13)
The adult stem cells are cultured in a three-dimensional bioreactor using a culture medium in a three-dimensional culture condition comprising a condition medium collected as an active ingredient, ischemic disease treatment pharmaceutical composition.
성체 줄기세포는 지방 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 및 골수 유래 줄기세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물.
The method of claim 1,
Adult stem cells are selected from adipose derived stem cells, umbilical cord blood derived stem cells and bone marrow derived stem cells, pharmaceutical composition for the treatment of ischemic disease.
상기 배양시 세포 부착 지지체 및 성장인자가 제공되지 않는 것을 특징으로 하는, 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물.
The method of claim 1,
When the culture is characterized in that the cell attachment support and growth factor is not provided, pharmaceutical composition for treating ischemic disease.
상기 성장인자가 혈관내피성장인자(VEGF), 염기섬유아세포성장인자(bFGF) 또는 간세포 성장인자(HGF)인 것을 특징으로 하는, 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물.
The method of claim 3, wherein
The growth factor is vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF) or hepatocyte growth factor (HGF), characterized in that the pharmaceutical composition for treating ischemic disease.
상기 성체 줄기세포가 배양시 스페로이드(speroid) 형태를 갖는 것을 특징으로 하는, 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물.
The method of claim 1,
The adult stem cell is characterized in that it has a spheroidal (speroid) form in culture, pharmaceutical composition for treating ischemic disease.
상기 성체 줄기세포가 저산소 조건에서 배양되는 것을 특징으로 하는, 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물.
The method of claim 1,
The adult stem cell is characterized in that the culture in hypoxic conditions, ischemic disease pharmaceutical composition for treatment.
상기 배양 배지가 소 혈청, 완충용액, 지시약, 및 이로부터 유래한 성분을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물.
The method of claim 1,
The culture medium does not contain bovine serum, buffers, indicators, and components derived therefrom, pharmaceutical composition for treating ischemic disease.
상기 완충용액이 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES) 완충용액인 것을 특징으로 하는, 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물.
The method of claim 7, wherein
The buffer solution is characterized in that 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffer, ischemic disease treatment pharmaceutical composition.
상기 지시약이 페놀 레드인 것을 특징으로 하는, 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물.
The method of claim 7, wherein
The indicator is phenol red, characterized in that the pharmaceutical composition for treating ischemic disease.
상기 허혈성 질환이 허혈성 뇌질환, 허혈성 신질환, 허혈성 폐질환, 사지의 허혈성 질환, 버거스병, 하지동맥 폐색증, 뇌졸중, 뇌경색, 허혈성 심근증, 심근경색증, 허혈성 심부전 및 폐색성 동맥경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물.
The method of claim 1,
The ischemic disease is selected from the group consisting of ischemic brain disease, ischemic kidney disease, ischemic lung disease, ischemic disease of the extremities, Burgers disease, lower limb artery occlusion, stroke, cerebral infarction, ischemic cardiomyopathy, myocardial infarction, ischemic heart failure and obstructive atherosclerosis Characterized in that, for the treatment of ischemic diseases.
상기 약학적 조성물이 허혈성 질환의 허혈조직 부위에 주입되는 것을 특징으로 하는, 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물.
11. The method according to any one of claims 1 to 10,
The pharmaceutical composition is characterized in that the injection into the ischemic tissue site of the ischemic disease, pharmaceutical composition for treating ischemic disease.
A pharmaceutical composition for treating wounds and diabetic foot ulcers, comprising, as an active ingredient, a condition medium obtained by culturing adult stem cells three-dimensionally using a culture medium in a three-dimensional bioreactor.
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