KR20120098022A

KR20120098022A - 신장세포특이적인 펩타이드 및 폴리에스테르아민 중합체를 포함하는 유전자 전달체 및 이를 포함한 신장 섬유증 예방 또는 치료용 조성물.

Info

Publication number: KR20120098022A
Application number: KR1020110017687A
Authority: KR
Inventors: 조명행; 조종수; 서보승; 정현식
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 이연제약주식회사
Priority date: 2011-02-28
Filing date: 2011-02-28
Publication date: 2012-09-05
Also published as: KR101327181B1

Abstract

본 발명은 신장세포 특이적인 펩타이드 및 폴리에스테르아민 중합체를 포함하는 유전자 전달체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 비바이러스성 유전자 전달체인 신장세포 특이적 펩타이드-폴리에스테르아민은, 현저히 낮은 세포독성 및 높은 트랜스펙션 효율을 제공할 수 있어 효과적인 유전자 전달체로서 사용할 수 있다. 이러한 상기 유전자 전달체를 이용하는 경우, 치료 유전자인 간세포 성장인자 (Hepatocyte Growth Factor; HGF) 유전자를 목적하는 부위에 효율적으로 전달할 수 있고, 신장에서의 높은 발현효율을 나타내어 신장섬유화 (fibrosis)를 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 크레아티닌 농도와 요소농도를 크게 낮출 수 있기 때문에 신장섬유증 예방 및 치료에 효율적으로 활용될 수 있다.

Description

신장세포특이적인 펩타이드 및 폴리에스테르아민 중합체를 포함하는 유전자 전달체 및 이를 포함한 신장 섬유증 예방 또는 치료용 조성물.{Gene Delivery Complex Comprising Renal Cell-Specific Peptide and Polyester Amine and Composition Comprising The Same for Preventing or Treating of Renal Fibrosis.}

본 발명은 신장세포특이적인 펩타이드 및 폴리에스테르아민 중합체를 포함하는 유전자 전달체 및 이들을 이용한 신장 섬유증 예방 또는 치료용 유전자 치료제에 관한 것이다.

유전자 치료 (gene therapy)는 치료 유전자를 환자의 체내로 도입시켜 결손 유전자를 교정하거나 세포에 새로운 기능을 추가하여 암, 감염성 질환, 유전질환 등을 치료하거나 예방하는 방법을 말한다. 유전자치료는 일반적인 약물에 의한 치료에 비해서, 우수한 선택성을 가질 수 있고, 일반적인 치료법으로는 얻기 힘든 질병의 치료율 및 치료 속도를 가질 수 있다. 유전자치료는 질병의 증상을 치료하는 것이 아니라, 질병의 원인을 치료하고 제거하는 방식이기 때문이다.

이처럼 질병 치료를 목적으로 인체에 투여하기 위하여 제조된 유전물질 또는 유전물질을 이입한 세포로 구성된 의약품을 ‘유전자 치료제’라 한다. 유전자치료제는 지난 50년간 괄목할 만한 성장을 이룬 분자생물학 및 재조합 DNA기술에 기반을 두고 있으며 1970년 최초의 유전자 치료제 임상허가를 시작으로 본격적인 개발에 돌입하였다.

유전자 치료를 효과적으로 하기 위해서는 치료 유전자를 원하는 표적세포로 전달하여 높은 발현 효율을 얻을 수 있도록 하는 유전자 전달 기술을 개발하는 것이 필요하다. 유전자 전달을 위한 전달체 (vector)는 독성이 낮거나 없어야 하며, 유전자를 선택적이고 효과적으로 원하는 세포에 전달할 수 있어야 한다.

이러한 유전자 전달체는 크게 바이러스성과 비바이러스성으로 나눌 수 있는데, 레트로 바이러스(RV; Retro Virus), 아데노 바이러스(AV; Adeno Virus), 아데노 부속 바이러스 (AAV; Adeno Associated Virus) 들로 구성되는 바이러스성 유전자 전달체는 발현율 및 지속성 면에서 매우 우수하나, 면역반응에 의한 안전성이 문제점으로 지적되고 있다.

상기와 같은 바이러스성 벡터의 안전성 문제를 극복하기 위하여, 전통적인 바이러스성 벡터에 대한 대안으로서 다양한 양 이온성 중합체를 유전자 전달체로 이용하는 비바이러스성 벡터가 개발되어 왔다.

양 이온성 중합체는 유전자와 결합하여 ‘양 이온성 중합체-유전자’복합체를 형성하여 진핵세포의 트랜스펙션을 유도하게 된다. 그 구체적인 메커니즘은 중합체-유전자 복합체 표면의 양전하와 세포 표면의 음전하가 전기적 상호작용에 의하여 복합체가 세포 표면에 결합한 후 엔도좀으로부터 세포질로 유전자가 방출되는 과정을 거친다. 이러한 양 이온성 중합체의 구체적인 예로는, 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리아미도아민 (polyamidoamine), 폴리L-리신, 폴리아미노에스테르, 폴리프로필렌이민과 같은 양 이온성 단일중합체 및 폴리에틸렌글리콜 (PEG)-블록-폴리L-리신 및 PEG-PEI와 같이 양 이온성 블록 공중합체 등을 들 수 있다.

상기 중합체들은 치료 유전자 (예, DNA)를 나노 크기 입자로 응축시키고, 치료 유전자가 분해되지 않도록 이를 보호할 뿐만 아니라, 바람직하지 않은 상호 작용으로부터 치료 유전자를 보호하고, 세포질 및 핵 내로의 세포 내 전달을 강화시킬 수 있다는 장점이 있다. 그 중에서도, 폴리에틸렌이민 (PEI)은 최근 유전자 치료 연구 분야에서 가장 광범위하게 사용되고 있는 비바이러스성 벡터라 할 수 있다. 폴리에틸렌이민 (PEI)은 치료 유전자 (예, DNA)를 효과적으로 압축하여 콜로이드 입자로 만들며, 엔도좀에서 PEI/DNA 복합체를 신속하게 방출시킨다는 장점이 있다고 알려져 있다.

이처럼 다수의 양이온성 중합체들은 혈청 농도가 낮은 환경인 in vitro에서는 높은 유전자 전달 효율을 나타내어 유전자 전달체로서 우수할 것으로 생각되기 쉽지만, 불행하게도 in vitro에서의 트랜스펙션을 혈청이 존재하는 환경인 생체 내 이용에 직접 적용하는 것은 매우 어렵다. 이는 양 이온성 중합체-유전자 복합체의 트랜스펙션이 생체 내의 혈청에 존재하는 각종 인자에 의하여 심각하게 저해되어 생체 내에서 유전자의 세포 내로의 유입이 원활하지 않게 되기 때문이다.

유전자 전달체로서 가장 광범위하게 연구되고 있는 폴리에틸렌이민 (PEI) 역시 in vivo에서 트랜스펙션 효율이 현저히 떨어지며, 또한 높은 세포 독성 및 낮은 혈액 적합성으로 인해 생체 내에서의 유전자의 낮은 발현 효율 등의 문제점을 갖고 있다. 따라서 유전자 치료 시 양 이온성 중합체의 in vivo 적용에 있어서, 낮은 세포 독성 및 혈청 존재 중에서도 트랜스펙션 효율이 저하되지 않는 유전자 전달체의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기의 문제점에 착안하여 본 발명자들은 생체적합성이 높고 낮은 세포독성 및 혈청 존재 중에서도 트랜스펙션 효율이 저하되지 않는 유전자 전달체를 제조하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 특정 서열의 펩타이드가 결합한 ‘펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체’가 신장섬유증 치료의 유용함을 확인하고 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명은 신장세포특이적인 펩타이드 및 폴리에스테르아민 중합체를 포함하는 유전자 전달체를 제공한다.

또한, 본 발명은 신장세포특이적인 펩타이드 및 폴리에스테르아민 중합체를 포함하는 유전자 전달체에 치료 유전자가 결합된 신장섬유증 예방 또는 치료용 유전자 전달 복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 전달 복합체를 유효성분으로 포함하는 신장섬유증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 비바이러스성 유전자 전달체인 신장세포특이적 펩타이드-폴리에스테르아민은, 현저히 낮은 세포 독성 및 높은 트랜스펙션 효율을 제공할 수 있어 효과적인 유전자 전달체로서 사용할 수 있다. 이러한 상기 유전자 전달체를 이용하는 경우 치료 유전자인 간세포 성장인자 (Hepatocyte Growth Factor; 이하 HGF) 유전자를 목적하는 부위에 효율적으로 전달할 수 있고, 신장에서의 높은 발현효율을 나타내어 신장섬유화 (fibrosis)를 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 크레아티닌 농도와 요소농도를 크게 낮출 수 있기 때문에 신장섬유증 예방 및 치료에 효율적으로 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 폴리에스테르아민 (PEA) 중합체의 합성과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2는 폴리에스테르아민 (PEA) 중합체의 ¹H NMR 스펙트럼 분석을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 신장세포특이적인 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체의 합성과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 신장세포특이적인 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체의 NMR 분석을 나타낸 것이다.
도 5는 공중합체의 아민 그룹과 DNA의 인산기 그룹의 비율에 따라 형성된 본 발명의 신장세포특이적인 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체/DNA 복합체를 전기영동을 통하여 확인한 사진이다.
도 6은 본 발명의 신장세포특이적인 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체의 농도에 따른 세포독성을 측정한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 신장세포특이적인 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체/DNA 복합체의 신장세포에서의 유전자 발현을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 신장세포특이적인 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체/DNA 복합체의 in vivo에서의 조직별 DNA 유전자 발현을 나타낸 그래프이다.
도 9는 마우스 (왼쪽)과 랫 (rat, 오른쪽)을 이용하여 생체 내 신장섬유화 동물 모델을 나타낸 사진이다.
도 10은 신장섬유화 모델에 본 발명의 신장세포특이적 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체/GFP 복합체를 처리하여 GFP유전자 발현 정도를 확인한 사진으로, M은 마우스를 R은 랫 (rat)을 나타낸 것이다.
도 11은 신장섬유화 모델에 본 발명의 신장세포특이적 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체/HGF 복합체를 처리한 후 혈청 내 크레아틴 농도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 신장섬유화 모델에 본 발명의 신장세포특이적 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체/HGF 복합체를 처리한 혈청 내 요소 농도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 13은 신장섬유화 모델에 본 발명의 신장세포특이적 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체/HGF 복합체를 처리한 후 H&E 염색을 통해 신장조직 병리를 분석한 것이다 (PEP-PEA/GFP: 신장세포특이적 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체/GFP 복합체, UUO: 신장섬유화 모델, PEA/HGF: 폴리에스테르아민/ HGF 복합체, PEP-PEA/HGF: 신장세포특이적 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체/HGF 복합체).
도 14는 신장섬유화 모델에 본 발명의 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체/HGF 복합체를 처리한 후 씨리어스 레드 (sirius red) 염색을 통해 조직 내 생성되는 콜라겐을 평가한 결과를 분석한 것이다 (PEP-PEA/GFP: 신장세포특이적 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체/GFP 복합체, UUO: 신장섬유화 모델, PEA/HGF: 폴리에스테르아민/ HGF 복합체, PEP-PEA/HGF: 신장세포특이적 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체/HGF 복합체).

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에서 ‘신장세포 특이적인 펩타이드’란 신장세포가 갖는 수용체 특이적으로 인식할 수 있는 펩타이드를 의미한다. 본 발명의 일 구체 예에서는 HOOC-ELRGDRAHW-NH₂일 수 있다.

상기 폴리에스테르아민 (polyester amine, PEA) 중합체는 분자량이 작은 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine, PEI)과 글리세롤 디메타크릴레이트 (glycerol dimethacrylate, GDM)를 공중합체 시킴으로써 합성될 수 있다 (도 1 ).

본 발명의 유전자 전달체는 신장세포특이적인 펩타이드의 카르복실 그룹과 폴리에스테르아민 중합체의 아민 그룹을 아마이드 결합으로 반응시켜 제조될 수 있다 (도 3).

본 발명은 또한 신장세포특이적인 펩타이드 및 폴리에스테르아민 중합체를 포함하는 유전자 전달체에 치료 유전자가 결합된 신장섬유증 예방 또는 치료용 유전자 전달 복합체를 제공한다.

상기 신장세포특이적인 펩타이드는 신장세포에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 의미하며, 바람직하게는 HOOC-ELRGDRAHW-NH₂일 수 있다.

본 발명의 신장섬유증 예방 또는 치료용 유전자 전달 복합체는 신장섬유증 예방 또는 치료의 용도로 사용될 수 있는 유전자 치료제를 의미한다.

상기 유전자 전달 복합체는 본 발명의 유전자 전달체에 치료 유전자가 결합된 복합체이다.

상기 치료 유전자는 HGF 유전자일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 인공서열 DNA를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이러한 인공 서열 DNA는 총 3679개의 염기서열로 구성된 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 상기 유전자 전달 복합체를 유효성분으로 포함하는 신장섬유증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 신장섬유증 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다.

본 발명의 신장섬유증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 본 발명의 유전자 전달 복합체와 약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써 제조할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 주사제에서 통상적으로 사용되는 어떠한 기재라도 가능하다. 적합한 담체의 예로 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유 및 옥수수유 같은 식물성유, 젤라틴 및 에틸올레이트 같은 주사제용 유기 에스테르가 있다. 본 발명의 신장섬유증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 신장섬유증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화할 수 있다. 또한, 주사제는 통상의 방법으로 삼투압 조절제, pH 조절제, 참기름이나 콩기름 같은 식물성 기름, 또는 레시틴, 비이온성 계면활성제 같은 계면활성제를 상기한 기재에 첨가하여 용액, 현탁액 또는 콜로이드 용액 등으로 제조할 수 있다. 이러한 주사제는 분말형, 동결건조형 등으로 제조하여 사용하기 전에 용해하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 신장섬유증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 비경구적으로, 예를 들면 피하, 근육 (transmuscular) 또는 경피 (transdermal) 주사로 간편하게 투여될 수 있다. 상기 조성물의 직접 전달은 주사에 의한 피하, 복강 내, 정맥 내, 종양 내 또는 근육 내로 이루어지거나 또는 조직의 간극으로 전달될 수 있으며, 고체상인 경우에는 유전자 치료 바로 전에 필요하면 미리 멸균한 기재에 용해하여 사용하거나, 액상인 경우 별도의 처리 없이 그대로 사용할 수 있다.

본 발명의 신장섬유증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 환자에 적용함에 있어 유효성분을 기준으로 환자의 질환 부위에 국부적으로 0.01 내지 100mg의 용량으로 투여할 수 있다. 그러나 활성성분의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시 예를 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시 예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시 예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[실시 예]

실시 예 1. 폴리에스테르아민 ( PEA ) 중합체 합성.

분지 폴리에틸렌이민 (PEI, 1.2와 25 kDa), 글리세롤 디메타크릴레이트 (GDM) (Mn = 228.25 Da), 그리고 메탄올 등 시약은 Sigma사 (St Louis, MO, USA)에서 구매하여 사용하였다.

글리세롤 디메타크릴레이트 및 폴리에틸렌이민를 무수 메탄올에 개별적으로 용해시키고, 세 가지 상이한 화학양론적 GDM: PEI 비율 (표 1 참조)로 글리세롤 디메타크릴레이트 용액을 폴리에틸렌이민 용액에 서서히 가하여 혼합하였다.

구분	반응물(중량%)		공급비 GMD:PEI (Mol/Mol)	PEI(a)의 조성(Mol%)	공중합체 수율(%)	분자량(b)
구분	GDM	PEI	공급비 GMD:PEI (Mol/Mol)	PEI(a)의 조성(Mol%)	공중합체 수율(%)	분자량(b)
GDM/PEI-1.2 (1:1)	228.25	1200	1:1	56.78	37.72	7,630
GDM/PEI-1.2 (1:2)	228.25	1200	1:2	55.55	67.30	7,690
GDM/PEI-1.2 (1:4)	228.25	1200	1:4	68.44	55.74	7,700
a: ¹H NMR 측정값 ,b:GPC 측정값

이어서 반응 혼합물을 60℃에서 24시간 동안 정속 교반하면서 가열하였다. 반응 혼합물을 4℃에서 24시간 동안 스펙트라/포 (Spectra/Por) 멤브레인 (molecular mass cutoff 3.5kDa Spectrum Medical Industries, Inc., California)을 이용하여 증류수로 투석하였다. 최종적으로 중합체를 친액화시키고 0℃에서 보관하였다.

상기 반응은 승온(60℃) 하에서 수행하여 가교도를 높임으로써 합성된 중합체의 분자량을 크게 하였다. 폴리에틸렌이민의 아민기의 친핵성 성질로 인하여 글리세롤 디메타크릴레이트 말단기와 반응하였다 (도 1).

실시 예 2. 폴리에스테르아민 ( PEA ) 중합체의 확인 및 특성

합성된 폴리에스테르아민의 조성을 ¹H NMR 분광법으로 확인하였다. 도 2에 GDM/PEI-1.2 (1:1)의 대표적인 ¹H NMR 스펙트럼을 나타내었다. 폴리에스테르아민의 조성은 반응물의 화학양론적 공급비에 따라 가변적임을 알 수 있었다. 또한, 폴리에스테르아민은 DMSO 또는 물과 같은 고도의 극성인 용매에 가용성이나, THF와 같은 몇몇 유기 용매에서는 불용성임이 밝혀졌다.

PEA의 분자량 감소를 측정하여 중합체 분해 정도를 추산하였다. PBS (0.1g/ml)에 용해시킨 중합체를 진탕 배양기 (37℃, 100rpm)에서 배양하고, 다양한 시간 간격으로 시료를 채취하였다. 이어서, 동결 건조된 시료에 대해 겔침투크로마토그래피 (gel permeation chromatography)를 실시하여 분자량을 측정하였다.

일반적으로 단량체 구조, 용매 선택 및 반응 온도가 중합체의 평균 분자량에 영향을 미쳤고, 이들의 범위는 2,000 내지 50,000이었다. 그러나 합성된 폴리에스테르아민의 평균 분자량 분포는 그다지 넓지 않은 것으로 밝혀졌고 (다분산도 (polydispersity indices) 2.0에 근접함), 이는 반응물 공급비를 단순히 변화시키는 것으로는 분자량의 조절이 어려움을 시사한다 (상기 표 1 참조).

상기에서 얻은 중합체를 10mg/ml 농도로 CDCl 3에 용해시켜 ¹H NMR 시료를 제조하였다. 어벤스 (Avance) 500분 광계 (Bruker, Germany)를 이용하여 NMR 스펙트럼을 기록하였다. 중합체의 분자량은 컬럼 (GPCusing Sodex OHpack SB-803 HQ column; Phenomenox, USA)을 이용하여 컬럼 온도 25℃ 및 유속 0.5mL/min에서 측정하였다. 아세트산 암모늄 (0.5M, pH 5.5)을 이동상으로 이용하였다.

약물/유전자 전달 시스템의 생분해도는 적용 직후 담체 분자가 붕괴되는 것을 의미하는 것이 아니라, 유기체에서의 장기간 독성을 회피하기 위해 서서히 분해되는 것을 의미한다. 또한, 분해되지 않고 방출되지도 않은 담체의 축적이 세포독성을 야기시킨다. 폴리에스테르아민의 에스테르 결합 분해의 동력학을 분자량의 감소를 측정함으로써 조사하였다. 그 결과 폴리에스테르아민은 가수분해를 거쳐 각각 산 및 알코올을 형성함으로써 저분자량 비독성 부산물을 생성시켰다. GDM/PEI-1.2 (1:1)의 반감기는 9일 내지 10일인 것으로 밝혀졌고, 이는 조절된 방식으로 분해가 일어났음을 의미한다.

실시 예 3. 본 발명의 신장세포특이적인 펩타이드 - 폴리에스테르아민 공중합체의 합성.

본 발명의 신장세포특이적인 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체는 신장세포특이적인 펩타이드의 카르복실 그룹과 폴리에스테르아민의 아민 그룹을 아마이드 결합으로 반응시켜 합성하였다 (도 3). 펩타이드 제작 시, 히스타민을 추가하여 NMR에서 확인 가능한 구조로 제작하였다. 신장세포 특이적인 펩타이드는 애니젠(주)에서 구입하였다.

합성한 신장세포특이적인 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체를 도 4에서 나타내었다. NMR로 측정하여 신장세포특이적인 펩타이드가 폴리에스테르아민에 8.8 mol% 도입된 것을 확인하였다.

실시 예 4. 본 발명의 신장세포특이적인 펩타이드 - 폴리에스테르아민 공중합체/DNA 복합체 제조.

신장세포특이적인 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체/DNA 복합체는 고분자의 아민 그룹과 DNA의 인산기 그룹의 비율을 조절하여 정전기적 작용으로 복합체를 형성시켰고 전기영동을 통하여 확인하였다.

그 결과 하기 도 5에서 나타난 바와 같이, 낮은 중량비에서는 (weight ratio: 0.1 또는 0.5) 복합체가 제대로 형성이 되지 않지만 중량비를 1 정도로 올리면 복합체가 만들어지는 것을 확인하였다.

하기 실험 예에서는 본 발명의 신장세포특이적인 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체를 간단하게 ‘peptide-PEA’라 표기하였으며 본 발명의 신장세포특이적인 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체/DNA 복합체를 간단하게 ‘peptide-PEA/DNA 복합체’라 표기한다.

실험예 1. 신장세포에서 본 발명의 peptide - PEA 의 세포독성평가.

인간 신장 형질전환 세포 (human kidney transformed cells, 293T)를 10% 열-불활성화 FBS, 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배양 배지에 보존하였다. 세포를 5% CO₂를 함유한 37℃ 습윤 배양기에서 표준 조건하에 배양하였다.

peptide-PEA의 세포 생존력을 조사 키트 (Cell Titer 96R Aqueous One Solution Cell Proliferation Kit, Promega)로 조사하였다. 96 웰 프레이트에 0.2mL 배양 배지 중 초기 밀도 1×10⁴ (293T) 세포/웰로 적재된 세포를 24시간 배양한 후, 상기 공중합체를 농도별 (5, 10, 20, 50㎍/㎖)로 24시간 처리한 다음 MTS 에세이를 이용하여 293T 세포주에 대한 상기 공중합체의 세포독성을 조사하였다. 대조군으로는 폴리에틸렌이민 25K를 사용하였다.

그 결과 도 6에서 나타난 바와 같이, 신장세포특이적인 peptide-PEA의 농도가 커질수록 세포독성이 점차 나타나는 것을 알 수 있었다. 보통 비바이러스성 유전자 전달물질로 알려져 있는 PEI 25K의 경우, 농도가 커질수록 세포생존율이 급격히 떨어지나 본 발명의 peptide-PEA는 20㎍/ml의 높은 농도에서도 60%보다 높은 세포생존율을 나타냈다. 이를 통해 본 발명의 peptide-PEA가 대조구인 PEI 25K에 비해 월등히 높은 세포생존율을 가지는 것을 알 수 있었다.

실험예 2. 신장세포에서 본 발명의 peptide - PEA / DNA 복합체의 유전자 발현조사.

인간 신장 형질전환 세포 (human kidney transformed cells, 293T)를 24 웰 플레이트에 1×10⁵ 세포를 넣고 24시간 배양한 후 본 발명의 peptide-PEA/DNA 복합체를 4시간 처리한 후, 배지를 갈아주고 24시간 후에 세포를 lysis시켜 발광측정기 (luminometer)로 RLU (Relative Light Units) 값을 확인하고, BCA protein kit로 단백질 농도를 확인하여 RLU/mg protein 값을 계산하였다.

그 결과 도 7에서 나타난 바와 같이, 중량비 (weight ratio)가 증가할수록 peptide-PEA/DNA 복합체 그룹에서 유전자 발현효율이 점차 증가하는 것을 확인하였다. 그리고 중량비 5에서부터는 기존의 PEI 25K 보다, 중량비 10에서부터는 인지질계열의 리포펙타민보다 더 높은 유전자 전달효율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 폴리에스테르아민/DNA 그룹과 비교하여 peptide-PEA/DNA 복합체 그룹에서 더 높은 유전자 발현효율을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 본 발명의 peptide - PEA / DNA 복합체의 in vivo 에서의 DNA 유전자 발현조사.

합성된 peptide-PEA/DNA 복합체가 in vivo에서도 효율적으로 유전자 발현을 나타내는지 확인하기 위하여 리포터 유전자인 GFP 유전자 30㎍을 신장세포특이적인 펩타이드-폴리에스테르아민 공중합체 (peptide-PEA)와 복합체를 형성시켜 정맥주사로 실험동물에게 처리한 후 유전자 발현을 조사하였다.

실험동물은 유전자발현시험 평가용으로 5주령의 ICR 마우스와 SD 랫 (rat)을 3일간 순화시킨 후 건강하고 발육 양호한 동물을 사용하였다. 사육조건은 온도 24±3℃, 상대습도 50±20% 환기횟수 12~15회/시간, 조명 12시간 (인공조명, 오전 7시~오후 7시)으로 하였다. 모든 실험동물의 사육 및 실험은 서울대학교의 실험동물 관리지침에 따라 실시하였다. 순화시킨 마우스에 peptide-PEA/GFP 복합체 (GFP: 30㎍, 총 볼륨: 0.2mL)를 꼬리정맥을 통하여 투여하였고 48시간 후에 마우스를 희생시켰으며 신장, 간, 심장 및 뇌 등 주요장기에서의 발현효율을 확인하였다.

그 결과 도 8에서 나타난 바와 같이, peptide-PEA/GFP로 처리한 그룹이 신장세포특이적인 펩타이드와 결합 없이 단순히 폴리에스테르아민/GFP로 처리한 그룹과 비교하여 신장조직에서 더 많은 GFP 단백질 발현효율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 신장특이적인 펩타이드가 결합된 본 발명이 유전자 전달체가 in vivo에서도 효율적으로 작용함을 알 수 있었다.

실험예 4. 신장섬유화 모델 구축 및 신장섬유화 모델에서의 peptide - PEA / DNA 복합체의 DNA 유전자 발현조사.

실시 예 4-1: in vivo에서 신장섬유화 모델 (unilateral ureteral obstruction: UUO) 구축

in vivo에서의 신장섬유화 모델은 논문 [Kinter et al., Kidney International (1999) 55, 1327-334]을 참조하여 구축하였다. 마우스와 랫 (rat)을 마취시킨 후, 왼쪽 신장에서 나오는 뇨관을 결찰함으로써 신장기능을 억제하여 신장섬유화를 유발시켰다.

그 결과 도 9에서 보듯이 오른쪽 (마우스와 rat기준) 신장은 정상적인 것에 비하여 왼쪽 신장은 2주 만에 신장섬유화가 유발되어 신장조직이 육안으로 보기에도 정상조직에 비하여 비대해진 것을 확인할 수 있었다.

실시 예 4-2: 신장섬유화 모델에서의 peptide-PEA/DNA 복합체의 DNA 유전자 발현 조사.

합성된 본 발명의 peptide-PEA/DNA 복합체가 신장섬유화 모델에서도 효율적으로 유전자발현효율을 나타내는지 확인하기 위하여 리포터 유전자인 GFP유전자 50㎍을 peptide-PEA와 복합체를 형성시킨 후, 정맥주사로 신장섬유화 모델 동물에게 (마우스의 경우: GFP: 30㎍, 총 볼륨: 0.2mL; rat의 경우: GFP: 50㎍, 총 볼륨: 0.5mL) 꼬리정맥을 통하여 투여하였고 마우스와 랫 (rat)을 희생시켜 신장조직에서 GFP 발현 효율을 확인하였다.

그 결과 도 10에 나타난 바와 같이, 본 발명의 peptide-PEA/DNA 복합체로 처리한 신장섬유화 모델 동물은 오른쪽 신장조직에서 GFP 단백질 발현이 효율적으로 일어날 뿐만 아니라, 섬유화가 일어난 신장조직에서도 GFP 단백질 발현이 되는 것을 관찰하였다. 이를 통해 peptide-PEA가 DNA유전자를 신장조직에 효율적으로 전달함을 알 수 있었다.

실험예 5. 신장섬유화 모델에서의 peptide - PEA / HGF 복합체의 HGF 유전자 발현조사.

in vivo에서의 peptide-PEA/GFP의 GFP유전자 발현조사 결과를 토대로 신장섬유화 유발모델 (n=4)에서 치료효과가 있는 HGF 유전자를 peptide-PEA 고분자와 결합시켜 나노복합체 (peptide-PEA/HGF)를 형성한 후, 랫 (rat)의 꼬리정맥으로 주사하여 HGF 유전자 발현효율을 확인하였다. 신장섬유화 모델 동물인 랫 (rat)에서 peptide-PEA/HGF 복합체 (HGF: 50㎍, 총 볼륨: 0.5mL)를 섬유화 유발일로부터 3일 간격으로 꼬리 정맥을 통하여 세 번 투여하였고 3일 후에 랫 (rat)을 희생시켜 신장에서의 HGF 유전자 발현 효율을 확인하였다.

신장기능 검사로는 심장채혈을 하여 혈액을 수집한 후, 혈청 내 크레아티닌 (Creatinine)과 요소 (urea) 농도의 측정을 통해 신장섬유화의 진행 정도를 평가하였다. 대조군으로서는 sham control, HGF, PEA/HGF, peptide-PEA/HGF를 사용하였다.

그 결과 도 11 및 도 12에서 나타난 바와 같이, peptide-PEA/HGF로 처리한 그룹은 신장섬유화가 유발된 그룹 (UUO)에 비하여 크레아티닌의 농도 및 요소 농도가 훨씬 낮음을 확인할 수 있었다.

실험예 6. 신장섬유화 모델에서의 peptide - PEA / HGF 복합체의 투여 후 신장조직 병리 분석

신장섬유화 모델에서 peptide-PEA/HGF 복합체 투여 후, H&E 염색과 씨리어스 레드 (sirius red) 염색을 통하여 신장조직 병리를 분석하였다. Sham control, Vector control (PEP-PEA/GFP), HGF, PEA/HGF, PEP-PEA/HGF를 처리한 rat 신장조직을 각각 헤마톡실린 앤드 에오신 (H&E) 염색을 하여 확인을 하였다.

그 결과 도 13에서 나타난 바와 같이, HGF를 처리한 rat 신장조직을 각각 H&E염색을 하여 확인하였으며 UUO 시술로 인하여 모든 군에서 신장섬유증이 유발된 것이 관찰되었다. 요도관 폐쇄로 인하여 pelvis, papilla 부분이 medulla 및 cortex 지역으로 밀려듬에 따라 medulla 두께가 감소됨을 확인하였으나, PEA/HGF군과 peptide-PEA/HGF 투여 그룹은 대조군에 비하여 그 정도가 약함을 확인할 수 있었다. 신장섬유증 진행 정도 분석결과 대조군 대비 그 지수가 감소함을 확인할 수가 있었다. 이는 PEA/HGF와 peptide-PEA/HGF로 처리한 그룹에서 대조군인 UUO 그룹보다 섬유 형성이 훨씬 드물게 일어남을 암시한다.

도 14에서는 신장섬유화 모델에서 peptide-PEA/HGF 투여 후, 씨리어스 레드 (sirius red) 염색을 통하여 조직 내 생성되는 콜라겐을 평가한 결과를 나타낸 것으로, peptide-PEA/HGF로 처리한 그룹에서 다른 대조 그룹보다 콜라겐 형성이 훨씬 드물게 일어남을 알 수 있다. 이를 통해 H&E 염색 결과와 유사한 결과를 보여주며 특히 peptide-PEA/HGF 그룹이 다른 군에 비해 확연한 섬유조직 감소를 확인할 수 있었다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION EYUN PHARM CO.,LTD. <120> Gene Delivery Complex Comprising Renal Cell-Specific Peptide and Polyester Amine and Composition Comprising The Same for Preventing or Treating of Renal Fibrosis. <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3679 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HGF-X7 gene <400> 1 atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60 ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120 gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180 accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240 ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300 ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360 aacaaagact acattagaaa ctgcatcatc ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420 tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480 aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540 tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600 tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660 tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720 tatttgtgga tcctgggtag gaaacacatt tgaatggtat ttactaagat actaaaatcc 780 ttggacttca ctctaatttt agtgccattt agaactcaag gtctcagtaa aagtagaaat 840 aaagcctgtt aacaaaacac aagctgaata ttaaaaatgt aactggattt tcaaagaaat 900 gtttactggt attacctgta gatgtatatt ctttattatg atcttttgtg taaagtctgg 960 cagacaaatg caatatctaa ttgttgagtc caatatcaca agcagtacaa aagtataaaa 1020 aagacttggc cttttctaat gtgttaaaat actttatgct ggtaataaca ctaagagtag 1080 ggcactagaa attttaagtg aagataatgt gttgcagtta ctgcactcaa tggcttacta 1140 ttataaacca aaactgggat cactaagctc cagtcagtca aaatgatcaa aattattgaa 1200 gagaataagc aattctgttc tttattagga cacagtagat acagactaca aagtggagtg 1260 tgcttaataa gaggtagcat ttgttaagtg tcaattactc tattatccct tggagcttct 1320 caaaataacc atataaggtg taagatgtta aaggttatgg ttacactcag tgcacaggta 1380 agctaatagg ctgagagaag ctaaattact tactggggtc tcacagtaag aaagtgagct 1440 gaagtttcag cccagattta actggattct gggctcttta ttcatgttac ttcatgaatc 1500 tgtttctcaa ttgtgcagaa aaaagggggc tatttataag aaaagcaata aacaaacaag 1560 taatgatctc aaataagtaa tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt 1620 tctcagttct gtcctaagtg gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga 1680 aattatgttt cagacaactt cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg 1740 ctcatctttc taacttgatg gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt 1800 caaacgtttt aaggacagat gaaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata 1860 taagataaag gatttttcta ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata 1920 ggcaaaaaaa agttgcatgc tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt 1980 gccttcgagc tatcggggta aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga 2040 agaaggggga ccctggtgtt tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat 2100 tcctcagtgt tcagaagttg aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat 2160 ggatcataca gaatcaggca agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca 2220 caaattcttg cctgaaagat atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc 2280 cgatggccag ccgaggccat ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg 2340 tgcaattaaa acatgcgctg acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac 2400 tgaatgcatc caaggtcaag gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg 2460 aattccatgt cagcgttggg attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa 2520 tttcaagtgc aaggacctac gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc 2580 ctggtgtttt accactgatc caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg 2640 tgatatgtca catggacaag attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt 2700 atcccaaaca agatctggac taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca 2760 tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc 2820 agatgatgat gctcatggac cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta 2880 ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc 2940 cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac 3000 aaacatagga tggatggtta gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt 3060 gataaaggag agttgggttc ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga 3120 ttatgaagct tggcttggaa ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca 3180 ggttctcaat gtttcccagc tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa 3240 gcttgccagg cctgctgtcc tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg 3300 atgcacaatt cctgaaaaga ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat 3360 caactatgat ggcctattac gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag 3420 ccagcatcat cgagggaagg tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa 3480 gattggatca ggaccatgtg agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa 3540 aatgagaatg gttcttggtg tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc 3600 tggtattttt gtccgagtag catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata 3660 taaggtacca cagtcatag 3679

Claims

신장세포특이적인 펩타이드 및 폴리에스테르아민 중합체를 포함하는 유전자 전달체.
제1항에 있어서,
상기 신장세포특이적인 펩타이드는 HOOC-ELRGDRAHW-NH₂인 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
제1항에 있어서,
상기 폴리에스테르아민 중합체는 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine)과 글리세롤 디메타크릴레이트 (glycerol dimethacrylate)의 공중합체인 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
제 1항에 있어서,
상기 전달체는 신장세포특이적인 펩타이드의 카르복실그룹과 폴리에스테르아민 중합체의 아민 그룹을 아마이드결합으로 반응시켜 제조된 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 유전자 전달체에 치료 유전자가 결합된 유전자 전달 복합체.
제5항에 있어서,
상기 치료 유전자는 간세포 성장인자(Hepatocyte Growth Factor; HGF) 유전자인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체.
제6항에 있어서,
상기 간세포 성장인자 유전자는 서열번호 1의 염기인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체.
제5항에 따른 유전자 전달 복합체를 포함하는 신장섬유증 예방 또는 치료용 조성물.