KR20120092938A - Dna aptamer specifically binding to alpha-fetoprotein and its use - Google Patents
Dna aptamer specifically binding to alpha-fetoprotein and its use Download PDFInfo
- Publication number
- KR20120092938A KR20120092938A KR1020110012878A KR20110012878A KR20120092938A KR 20120092938 A KR20120092938 A KR 20120092938A KR 1020110012878 A KR1020110012878 A KR 1020110012878A KR 20110012878 A KR20110012878 A KR 20110012878A KR 20120092938 A KR20120092938 A KR 20120092938A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- afp
- dna
- dna aptamer
- aptamer
- binding
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/205—Aptamer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
Abstract
Description
본 발명은 알파태아단백질(AFP, Alpha-fetoprotein)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 AFP에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(aptamer), 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 AFP(Alpha-fetoprotein) 검출용 키트, 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 간암 또는 생식세포종양의 진단 또는 예후판단용 조성물, 상기 DNA 앱타머가 기판상에 고정된 간암 또는 생식세포종양의 진단 또는 예후판단용 마이크로어레이, 간암 또는 생식세포종양의 진단 또는 예후판단에 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 생물학적 시료로부터 상기 DNA 앱타머와 AFP(Alpha-fetoprotein)와의 결합반응을 통해 AFP를 검출하는 방법 및 AFP가 포함된 시료로부터 AFP(Alpha-fetoprotein)를 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to DNA aptamers specifically binding to alpha-fetoprotein (AFP) and uses thereof. More specifically, the present invention is a DNA aptamer (aptamer) that specifically binds to AFP, AFP (Alpha-fetoprotein) detection kit comprising the DNA aptamer as an active ingredient, the DNA aptamer as an active ingredient A composition for diagnosis or prognosis of liver cancer or germ cell tumor comprising, a microarray for diagnosis or prognosis of liver cancer or germ cell tumor with the DNA aptamer immobilized on a substrate, for diagnosis or prognosis of liver cancer or germ cell tumor Method for detecting AFP through the combined reaction of the DNA aptamer with the alpha-fetoprotein (AFP) from the biological sample of the patient and separating and purifying the alpha-fetoprotein (AFP) from the sample containing AFP to provide information It is about.
전 세계적으로 간암은 발병률이 네 번째로 높은 암 질환이며, 매우 높은 사망률을 나타낸다. 현재 간암은 국내 암 질환 발생 순위 중 3위에 랭크되어 있으며, 이로 인한 사망률은 2위에 랭크되어 있다. 이 처럼 간암은 국내에서 흔히 발병되는 질환일 뿐만 아니라, 질환 발생 시 사망으로 직결되는 위험한 질환이다. 2007년 기준 국내 간암 환자는 전체 161,920명의 암환자 중 14,924명을 차지하고 있을 정도로 발생률이 높으며, 연간 인구 10만 명당 22.7명이 간암으로 사망할 정도로 국민건강을 위협하고 있다. 국립암센터의 주요 암의 생존율 통계에 따르면 간암 발병 후 5년 내 생존율은 18.9％로 주요 암 중에서도 생존율이 매우 낮은 암에 속하며, 간암 1기 발견 시 생존율은 50％로 높아지지만, 재발률이 40-80％ 정도로 예후가 불량하여, 초기 진단 및 재발 진단을 통한 질환 관리가 절실하다. 간암의 주요 발병 원인 인자는 HBV (Hepatitis B Virus : B형 간염 바이러스), HCV (Hepatitis C virus : C형 간염바이러스), Aflatoxin인 것으로 알려져 있으며, 알코올 섭취 및 흡연으로 인한 다양한 종류의 화학 물질 흡수, 비만, 경구 피임약 복용, 음용수에 의한 비소 섭취 등의 환경적 인자 등에 의해서도 발병하는 것으로 알려져 있다. 간암은 조기에 혈관 침습을 일으켜 성장 속도가 빠르며, 간암 환자의 약 73-85％는 간 경변 등의 합병증을 동반하고 있어 치료가 매우 어렵다. 뿐만 아니라 간암은 초기 단계에선 특이적인 자각증상이 없이 진행되기 때문에 자각 증상이 발견된다면 이미 병이 많이 진행된 상태로 치료가 어려운 경우가 많다. 현재 간암에 대한 가장 좋은 치료방법은 간 이식과 수술적 절제술 방법이 있다. 하지만 간 이식 방법은 생존율이 매우 높은 편이지만 공여자를 구하기 어렵다는 단점이 있으며, 수술적 간 절제 방법은 긴 생존 기간을 유지할 수 있지만 수술 대상이 될 수 있는 환자가 20％ 이내로 매우 제한적으로 시행될 수 있는 치료 방법으로 알려져 있다. 따라서 간암에 대처하는 최선의 방법은 조기 발견을 통한 화학적 치료 방법 및 간단한 수술적 방법을 이용한 치료가 가장 바람직한 것으로 알려져 있다. 이에 현재 우리나라에서는 간암을 조기 진단하기 위하여 침습적 방법인 간 조직 검사, 비침습적 방법인 영상 및 혈청학적인 검사 등 다양한 검사방법이 활용되고 있다. 현재 혈청학적인 검사를 통한 간암 조기 진단을 위해 간암 마커인 AFP (Alpha-fetoprotein : 알파 태아 단백질)를 이용하고 있다. AFP는 태아의 간조직이나 소화기관에서 만들어지는 혈청 단백질로 출생 후 급격히 감소하여 혈액 내 10 ng/㎖ 정도의 농도로 존재하는 단백질이다. 하지만 간염, 간경변증, 간 종양, 간 내 전이된 암 등등 다양한 간 질환의 발생 시 혈액 내 AFP 수치가 급격히 증가하여 간암 진단 마커로 활용되고 있다. 특히, 혈액 내 AFP 농도가 16-20 ng/㎖ 이상으로 증가하는 경우, 이를 이용한 간 이상에 대한 탐지 정도는 60-62.4％ 이상의 민감도를 가지고 간의 이상을 확인할 수 있으며, 89.4-90.6％ 이상의 특이도를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 특히 혈액 내 AFP 농도가 400-500 ng/ml 이상인 경우는 간암을 의심해야 한다. 이와 같은 특징 때문에 AFP 수치 변화는 간암 치료 결과 및 예후 판정에 활용하기 적합한 바이오 마커로 주목되고 있다. 현재 혈액 내 AFP 수치 측정은 AFP 항체를 이용한 효소결합 면역 흡착법 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 면역크로마토그래피법 (immunochromatographic assay)이 이용되고 있다. 하지만 이와 같은 기법들의 기반이 되는 AFP 항체는 동물 실험을 동반하기 때문에 자유로운 생산, 정제, 변형에 어려움이 있으며, 단백질로 주변 pH, 온도 등에 대한 안정성 확보에도 어려움이 있다. 뿐만 아니라, AFP 항체의 생산 생산에는 많은 시간과 비용이 요구될 뿐만 아니라, 배치간 변이(batch to batch variation)가 존재하여 순수한 AFP 항체만을 생산 확보하기 매우 어렵다는 단점을 가지고 있다. 이에 효율적으로 간암을 조기에 진단하기 위하여 간암 바이오 마커인 AFP를 특이적으로 탐지 할 수 있는 항체 대체 물질의 개발이 절실한 실정이다. Liver cancer is the fourth most common cancer disease in the world, with very high mortality. Currently, liver cancer is ranked 3rd among the incidences of cancer disease in Korea, and mortality due to this is ranked 2nd. As such, liver cancer is not only a disease commonly developed in Korea, but also a dangerous disease that leads directly to death when the disease occurs. As of 2007, the incidence rate of domestic liver cancer patients is 14,924 out of 161,920 cancer patients, and the national health threatens 22.7 deaths per 100,000 people per year. The survival rate of major cancers of the National Cancer Center shows that the survival rate within 5 years after the onset of liver cancer is 18.9%, which is one of the lowest survival rates among the major cancers. Prognosis is poor at about 80%, and disease management through early diagnosis and recurrence diagnosis is urgently needed. The main causes of liver cancer are known as Hepatitis B Virus (HBV), Hepatitis C Virus (HBV), Aflatoxin, and the absorption of various chemicals from alcohol consumption and smoking, It is also known to be caused by environmental factors such as obesity, taking oral contraceptives, and drinking arsenic by drinking water. Liver cancer causes rapid vascular invasion and grows rapidly. About 73-85% of liver cancer patients have complications such as cirrhosis of the liver, which is very difficult to treat. In addition, liver cancer progresses without specific subjective symptoms in the early stages, so if subjective symptoms are found, the disease is already advanced and often difficult to treat. Currently, the best treatment for liver cancer is liver transplantation and surgical resection. However, liver transplantation has a very high survival rate, but it is difficult to obtain a donor. Surgical liver resection method can maintain a long survival period, but it can be performed in a limited number of patients within 20%. Known as a treatment method. Therefore, the best way to cope with liver cancer is known to be the most desirable chemotherapy through early detection and treatment using simple surgical methods. In order to diagnose liver cancer early in Korea, various test methods such as invasive liver biopsy, non-invasive imaging and serological tests have been used. Currently, hepatic cancer marker AFP (Alpha-fetoprotein) is used for early diagnosis of liver cancer through serological tests. AFP is a serum protein produced in the liver and digestive system of the fetus and rapidly decreases after birth and is present at a concentration of about 10 ng / ml in the blood. However, when various liver diseases such as hepatitis, cirrhosis, liver tumor, metastasized cancer in the liver, etc. occur, blood AFP level increases rapidly and is used as a diagnostic marker of liver cancer. In particular, when the blood AFP concentration is increased to 16-20 ng / ㎖ or more, the detection degree for liver abnormalities using the same has a sensitivity of 60-62.4% or more, it can confirm the liver abnormalities, specificity of 89.4-90.6% or more It is known to have. Hepatic cancer should be suspected, especially if the AFP concentration in the blood is above 400-500 ng / ml. Because of these characteristics, AFP level changes are attracting attention as biomarkers suitable for use in liver cancer treatment results and prognosis. At present, blood AFP levels are measured by using Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) and immunochromatographic assay using AFP antibody. However, AFP antibodies, which are the basis of these techniques, are difficult to freely produce, purify, and modify because they accompany animal experiments, and also have difficulty securing stability with respect to ambient pH and temperature with proteins. In addition, the production and production of AFP antibody requires not only a lot of time and cost, but also has a disadvantage that it is very difficult to secure only the production of pure AFP antibody due to the batch to batch variation. In order to efficiently diagnose early liver cancer, there is an urgent need to develop an antibody replacement material capable of specifically detecting AFP, a liver cancer biomarker.
앱타머는 짧은 길이의 올리고머로 안정된 삼차구조 형성을 통하여 표적 물질과 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 특징을 가지고 있다. 또한 화학적 합성 기법을 이용하여, 단시간, 저비용으로 대량 생산이 가능하며 배치간 변이(batch to batch variation)가 거의 없어 생산적인 측면에서 탁월한 장점을 갖고 있다. 뿐만 아니라, 주변의 pH와 온도에 매우 안정성이 높아 최근 표적 물질의 탐지 및 질환 진단 센서 개발 등 환경, 의료 등 다양한 분야에서의 활용 가능성이 높이 평가되고 있다. Aptamers are short-length oligomers that form specific tertiary structures with high affinity to specific targets. In addition, by using a chemical synthesis technique, it is possible to mass-produce in a short time and low cost, and there is almost no batch to batch variation, which has excellent advantages in terms of productivity. In addition, it is highly stable to the surrounding pH and temperature, and recently, the possibility of use in various fields, such as the detection of target substances and the development of disease diagnosis sensors, is widely appreciated.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.
본 발명자들은 간암 또는 생식세포종양의 진단을 위한 AFP에 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 앱타머(aptamer)를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 간암 또는 생식세포종양 진단 마커 단백질인 AFP(Alpha-fetoprotein)에 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 앱타머들을 합성하고 선별하는데 성공하였고, 이들 앱타머가 항체 기반의 간암 진단 방법을 대체할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. The present inventors have tried to develop a DNA aptamer that can specifically bind to AFP for the diagnosis of liver cancer or germ cell tumor. As a result, we have successfully synthesized and screened DNA aptamers that can specifically bind to alpha-fetoprotein (AFP), a liver cancer or germ cell tumor diagnostic marker protein, and these aptamers can replace antibody-based methods for diagnosing liver cancer. The present invention was completed by experimentally confirming that the present invention.
따라서, 본 발명의 목적은 AFP(Alpha-fetoprotein)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(aptamer)를 제공하는 것에 있다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a DNA aptamer that specifically binds to AFP (Alpha-fetoprotein).
본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 AFP(Alpha-fetoprotein) 검출용 키트를 제공하는 것에 있다. Another object of the present invention is to provide an AFP (Alpha-fetoprotein) detection kit comprising the DNA aptamer as an active ingredient.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 간암 또는 생식세포종양의 진단 또는 예후판단용 조성물을 제공하는 것에 있다. Still another object of the present invention is to provide a composition for diagnosis or prognosis of liver cancer or germ cell tumor comprising the DNA aptamer as an active ingredient.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 DNA 앱타머가 기판상에 고정된 간암 또는 생식세포종양의 진단 또는 예후판단용 마이크로어레이를 제공하는 것에 있다. Still another object of the present invention is to provide a microarray for diagnosis or prognosis of liver cancer or germ cell tumor in which the DNA aptamer is immobilized on a substrate.
본 발명의 또 다른 목적은 간암 또는 생식세포종양의 진단 또는 예후판단에 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 생물학적 시료로부터 상기 DNA 앱타머와 AFP(Alpha-fetoprotein)와의 결합반응을 통해 AFP를 검출하는 방법을 제공한다. Another object of the present invention is to detect AFP through a binding reaction between the DNA aptamer and AFP (alpha-fetoprotein) from a biological sample of a patient to provide information necessary for diagnosis or prognosis of liver cancer or germ cell tumor. To provide.
본 발명의 또 다른 목적은 AFP가 포함된 시료로부터 AFP(Alpha-fetoprotein)를 분리 및 정제하는 방법을 제공한다. Still another object of the present invention is to provide a method for separating and purifying Alpha-fetoprotein (AFP) from a sample containing AFP.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
The objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 AFP(Alpha-fetoprotein)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(aptamer)를 제공한다. According to one aspect of the invention, the invention provides a DNA aptamer (aptamer) that specifically binds to Alpha-fetoprotein (AFP).
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 DNA 앱타머는 서열목록 제1서열 내지 제18서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the DNA aptamer is an oligonucleotide having a nucleotide sequence having at least 90% identity with the base sequence disclosed in any one of SEQ ID NO: 1 to 18.
본 발명의 보다 바람직한 구현예에 의하면, 상기 DNA 앱타머는 서열목록 제1서열 내지 제18서열 중 어느 하나에 기재된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. According to a more preferred embodiment of the present invention, the DNA aptamer is an oligonucleotide having a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to 18.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 AFP(Alpha-fetoprotein) 검출용 키트(Kit)를 제공한다. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a kit for detecting AFP (Alpha-fetoprotein) comprising the DNA aptamer as an active ingredient.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 DNA 앱타머(aptamer)를 유효성분으로 포함하는 간암 또는 생식세포종양의 진단 또는 예후판단용 조성물을 제공한다. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for diagnosis or prognosis of liver cancer or germ cell tumor comprising the DNA aptamer as an active ingredient.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 DNA 앱타머가 기판상에 고정된 것을 특징으로 하는 간암 또는 생식세포종양의 진단 또는 예후 판단용 마이크로어레이를 제공한다. According to another aspect of the invention, the present invention provides a microarray for diagnosis or prognosis of liver cancer or germ cell tumor, characterized in that the DNA aptamer is fixed on the substrate.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 간암 또는 생식세포종양의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 생물학적 시료로부터 상기 DNA 앱타머와 AFP(Alpha-fetoprotein)와의 결합 반응을 통해 AFP를 검출하는 방법을 제공한다. According to another aspect of the present invention, the present invention provides AFP through a binding reaction between the DNA aptamer and alpha-fetoprotein (AFP) from a biological sample of a patient to provide information necessary for diagnosis of liver cancer or germ cell tumor. It provides a method for detecting.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 AFP가 포함된 시료로부터 AFP(Alpha-fetoprotein)를 분리 및 정제하는 방법을 제공한다: (a) 상기 DNA 앱타머가 결합된 지지체에 AFP가 포함된 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 DNA 앱타머에 결합된 AFP를 분리하는 단계. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for isolating and purifying Alpha-fetoprotein (AFP) from a sample containing AFP comprising the following steps: (a) The DNA aptamer is bound Contacting a sample including AFP with a support; And (b) isolating AFP bound to the DNA aptamer.
이하에서 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명한다. Hereinafter, the content of the present invention will be described in more detail.
DNA 앱타머DNA Aptamer
본 발명은 간암 마커 단백질인 AFP(Alpha-fetoprotein)에 특이적으로 결합하는 DNA 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. The present invention relates to DNA oligonucleotides that specifically bind to alpha-fetoprotein (AFP), a liver cancer marker protein.
본 명세서에서 용어 "DNA 앱타머(aptamer)"는 특정 분자에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산 분자를 의미한다. 본 명세서에서 "DNA 앱타머"는 "DNA 올리고뉴클레오타이드"와 혼용하여 사용한다. As used herein, the term "DNA aptamer" refers to a DNA nucleic acid molecule capable of binding to a particular molecule with high affinity and specificity. As used herein, "DNA aptamer" is used interchangeably with "DNA oligonucleotide."
본 명세서에서 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 길이가 약 200개 미만을 갖는 뉴클레오타이드 중합체를 지칭하며, 이에는 DNA 및 RNA가 포함될 수 있으며, 바람직하게는 DNA 핵산 분자이다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 올리고뉴클레오타이드 중합체의 합성 전에 또는 후에 추가될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 합성 후에, 예를 들어 표지와의 결합에 의해 추가로 변형시킬 수 있다. As used herein, the term “oligonucleotide” generally refers to a nucleotide polymer having less than about 200 lengths, which may include DNA and RNA, and is preferably a DNA nucleic acid molecule. The nucleotides can be deoxyribonucleotides, ribonucleotides, modified nucleotides or bases and / or analogs thereof, or any substrate that can be introduced into the polymer by DNA or RNA polymerase or by a synthetic reaction. If modifications to the nucleotide structure are present, such modifications may be added before or after the synthesis of the oligonucleotide polymer. The nucleotide sequence may be terminated by a non-nucleotide component. Oligonucleotides can be further modified after synthesis, for example by binding to a label.
본 발명의 DNA 앱타머(aptamer)는 전형적으로는 타겟 분자의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당 분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드, 세포 표면상의 마커분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 타겟 분자가 될 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX 방법으로 공지된 생체내 또는 시험관내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허 5,582,981, WO 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973 (1994), Mannironi et al.,Biochemistry 36:9726 (1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610 (1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34:656-665 (1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국특허 5,756,291에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로써 삽입된다. DNA aptamers of the invention can typically be obtained by in vitro selection methods for binding of target molecules. Methods of selecting aptamers that specifically bind to a target molecule are known in the art. For example, organic molecules, nucleotides, amino acids, polypeptides, marker molecules on the cell surface, ions, metals, salts, polysaccharides can be suitable target molecules that separate aptamers that can specifically bind to each ligand. . The selection of aptamers can use in vivo or in vitro selection techniques known by the SELEX method (Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; and Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990 ). Specific methods for the selection and preparation of aptamers are described in US Pat. No. 5,582,981, WO 00/20040, US Pat. No. 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33: 973 (1994), Mannironi et al., Biochemistry 36: 9726 (1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 3606-3610 (1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34: 656-665 (1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 and US Pat. No. 5,756,291, supra. Are incorporated herein by reference.
본 발명의 DNA 앱타머는 바람직하게는 서열목록 제 1 서열 내지 제 18 서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. 한편, 본 발명의 서열목록 제1서열 내지 제18서열의 DNA 앱타머는 본 명세서 도 3a 내지 도 3e에 도시된 2차 구조를 형성할 것으로 추정된다. The DNA aptamer of the present invention is preferably an oligonucleotide having a nucleotide sequence disclosed in any one of SEQ ID NO: 1 to 18 sequences. On the other hand, the DNA aptamer of SEQ ID NO: 1 to 18 of the present invention is assumed to form a secondary structure shown in Figures 3a to 3e herein.
또한, 본 발명의 DNA 앱타머는 AFP에 결합하는 특성을 유지하면서, 상기 서열목록 제1서열 내지 제18서열 중 어느 하나의 염기서열과 실질적인 동일성을 나타내는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘(Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981) Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994))을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90％의 동일성, 보다 바람직하게는 최소 95％의 동일성, 가장 바람직하게는 최소 98％의 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
In addition, the DNA aptamer of the present invention is interpreted to include an oligonucleotide having a nucleotide sequence showing substantial identity with any one of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to 18, while maintaining the binding property to AFP. . The substantial identity above aligns the nucleotide sequence of the present invention with any other sequence to the maximum correspondence, and the algorithms commonly used in the art (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981) ) Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73: 237-44 (1988) Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989); Corpet et al., Nuc.Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Comp.Appl. BioSci. 8: 155-65 (1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24: 307-31 (1994)), when analyzing aligned sequences, at least 90% identity, more preferably at least 95% Means a nucleotide sequence that exhibits identicality, most preferably at least 98% identity.
AFP(Alpha-fetoprotein) 에 특이적 결합Specific binding to alpha-fetoprotein (AFP)
인간 "AFP(Alpha-fetoprotein)"은 AFP 유전자에 의해 인코딩된 단백질로서, 태아기 동안에 난황낭(yolk sac) 또는 간에서 생성되는 주요한 혈청 단백질이다. 인간의 태아기 동안에 AFP는 가장 높은 수준으로 유지되고, 출생 이후 점차로 감소하다가 생후 8 내지 12 개월에서 성인에서 측정 가능한 낮은 수준까지로 감소된다. AFP는 간암세포, 정소(testis) 또는 난소(ovary)에서의 생식세포종양(germ cell tumor), 또는 간에서의 전이성 암세포로부터 생성되는 데, 이러한 질병이 존재하는 경우 임산부 또는 태아가 아니더라도 조직이나 혈액에서 높은 수준으로 나타나므로, 간암, 또는 생식세포종양에 대한 진단 마커 단백질로 이용된다. 하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 AFP 결합 DNA 앱타머는 AFP에 특이적으로 결합하므로, AFP의 검출 또는 분리 정제에 이용될 수 있으며, AFP의 수준을 측정함으로써 간암 또는 생식세포종양의 진단 또는 예후 판단에 응용될 수 있다.
Human "Alpha-fetoprotein" (AFP) is a protein encoded by the AFP gene and is the major serum protein produced in yolk sac or liver during the prenatal period. During the prenatal period of humans, AFP remains at the highest level and gradually decreases after birth and then decreases to a measurable low level in adults at 8-12 months of age. AFP results from germ cell tumors in liver cancer cells, testis or ovary, or metastatic cancer cells in the liver, where such diseases, tissue or blood, if not pregnant or unborn It appears at high levels in, and is used as a diagnostic marker protein for liver cancer or germ cell tumors. As demonstrated in one specific example of the present invention, since the AFP binding DNA aptamer of the present invention specifically binds to AFP, it can be used for detection or isolation and purification of AFP, and by measuring the level of AFP, It can be applied to the diagnosis or prognosis of germ cell tumors.
AFP의 검출Detection of AFP
본 발명의 DNA 앱타머는 AFP(Alpha-fetoprotein)와 특이적으로 결합하는 특성을 이용하여 AFP를 검출할 수 있다. 본 발명의 AFP 검출은 DNA 앱타머와 AFP의 복합체를 검출하는 방법에 기초한다. 복합체의 검출을 용이하게 하기 위해 본 발명의 DNA 앱타머가 형광물질, 예를 들어 플루오레세인(fulorescein), Cy3 또는 Cy5; 방사성물질, 또는 화학물질, 예를 들어 비오틴(biotin)으로 표지되거나 1차 아민(primary amine)으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. The DNA aptamer of the present invention can detect AFP using a property that specifically binds to alpha-fetoprotein (AFP). AFP detection of the present invention is based on a method for detecting a complex of DNA aptamer and AFP. In order to facilitate the detection of complexes, the DNA aptamers of the present invention may be selected from fluorescent materials such as fluorescein, Cy3 or Cy5; Radioactive materials, or chemicals, for example nucleotides labeled with biotin or modified with primary amines.
본 발명에서 본 발명의 DNA 앱타머가 고정화된 기판(substrate)을 포함하는 마이크로어레이(microarray)를 사용하여 AFP를 검출할 수 있다. 본 명세서에서 용어"마이크로 어레이"는 기판의 특정의 영역에 유전 물질이 고밀도로 부착된 어레이(배열)를 의미한다. 본 명세서에서 용어 마이크로어레이의 "기판"은 적합한 견고성 또는 반-견고성을 갖는 지지체를 의미하며, 예컨대, 유리, 막(membrane), 슬라이드, 필터, 칩, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 DNA 앱타머는 상기 기판상에 배열되고 고정화된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, DNA 올리고뉴클레오타이드는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 유리 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 DNA 올리고뉴클레오타이드는 링커 (예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기판에 결합될 수 있다. In the present invention, AFP can be detected using a microarray including a substrate on which the DNA aptamer of the present invention is immobilized. As used herein, the term "micro array" refers to an array (array) in which a dielectric material is densely attached to a specific region of a substrate. As used herein, the term "substrate" of a microarray means a support having suitable firmness or semi-rigidity, for example glass, membranes, slides, filters, chips, wafers, fibers, magnetic beads or nonmagnetic beads. , Gels, tubing, plates, polymers, microparticles, and capillaries. The DNA aptamer of the invention is arranged and immobilized on the substrate. This immobilization is carried out by chemical bonding methods or by covalent binding methods such as UV. For example, DNA oligonucleotides can be bound to glass surfaces modified to include epoxy compounds or aldehyde groups, and can also be bound by UV at the polylysine coating surface. In addition, the DNA oligonucleotide may be bound to the substrate via a linker (eg, ethylene glycol oligomer and diamine).
본 발명의 DNA 앱타머는 예를 들어, 비오티닐화(biotinylated)화될 수 있고, 이는 스트랩트아비딘(streptavidin)이 코팅된 기판상에 성공적으로 결합될 수 있다. 기판상에 고정화된 본 발명의 DNA 앱타머는 AFP와 결합하여 이를 포획할 수 있다. The DNA aptamers of the invention can be biotinylated, for example, which can be successfully bound onto streptavidin-coated substrates. The DNA aptamer of the present invention immobilized on a substrate can bind to and capture AFP.
본 발명에서 AFP(Alpha-fetoprotein) 검출용 조성물은 키트(Kit)의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에서 키트는 서열목록 제 1 서열 내지 제 18 서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열 또는 이 서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함한다. 본 발명에서의 키트는 시료 중의 AFP 검출에 키트를 사용하기 위한 설명서 또는 라벨을 추가로 포함할 수 있다.
In the present invention, the composition for detecting AFP (Alpha-fetoprotein) may be provided in the form of a kit. In the present invention, the kit includes a DNA oligonucleotide having a nucleotide sequence disclosed in any one of SEQ ID NO: 1 to 18 sequences or a nucleotide sequence having at least 90% identity with the sequence as an active ingredient. Kits in the present invention may further comprise instructions or labels for using the kit for detecting AFP in a sample.
간암 또는 생식세포종양의 진단 또는 예후판단Diagnosis or prognosis of liver cancer or germ cell tumor
AFP의 검출 및 분석은 간암 또는 생식세포종양의 스크리닝, 진단, 또는 예후 판단에 유용한 정보를 제공할 수 있다. 구체적으로, 간암 세포 또는 생식세포종양 세포는 AFP를 과다 생성함으로써, 조직 또는 혈액 등에서 AFP의 수준이 정상 대비 높은 수준으로 증가하게 되므로, AFP의 수준을 측정함으로써, 간암 또는 생식세포종양의 진단 또는 예후 판단에 응용할 수 있다. Detection and analysis of AFP may provide useful information for screening, diagnosing, or prognosticing liver cancer or germ cell tumors. Specifically, since liver cancer cells or germ cell tumor cells produce AFP excessively, the level of AFP in tissues or blood increases to a higher level than normal, and thus, by measuring the level of AFP, the diagnosis or prognosis of liver cancer or germ cell tumor Applicable to judgment.
또한, 본 발명은 간암 또는 생식세포종양의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 생물학적 시료로부터 본 발명의 DNA 앱타머와 AFP와의 결합 반응을 통해 AFP를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 용어"생물학적 시료"는 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포, 조직, 및 기타 다른 조직 및 체액을 포함할 수 있으며, 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등도 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
The present invention also provides a method for detecting AFP through a binding reaction of the DNA aptamer of the present invention with AFP from a biological sample of a patient to provide information necessary for the diagnosis of liver cancer or germ cell tumor. The term "biological sample" may include blood, saliva, tear fluid, urine, synovial fluid, mucus, cells, tissues, and other tissues and body fluids, including cell culture supernatants, ruptured eukaryotic cells and bacterial expression systems, etc. However, the present invention is not limited thereto.
AFP의 분리 및 정제Isolation and Purification of AFP
본 발명의 DNA 앱타머의 AFP의 특이적 결합 특성을 이용하면, DNA 앱타머를 AFP의 분리 및 정제에 응용할 수 있다. 본 발명에서 AFP의 분리 및 정제는 DNA 앱타머와 AFP의 결합 복합체를 형성시킨 후, 이 복합체로부터 AFP를 분리시켜 회수하는 결합 분석(binding assay) 방법에 기초하여 이루어진다. 이러한 결합 분석 방법의 예는 당업계에 잘 공지되어 있다. 본 발명의 DNA 앱타머 분자는 비드(bead) 또는 레진(resin)과 같은 지지체에 결합될 수 있으며, 결합된 DNA 앱타머는 리간드인 AFP를 포획(capture)할 수 있다. DNA 앱타머의 지지체로의 결합은 예를 들어, DNA 앱타머를 비오티닐화(biotinylated)화시키고, 지지체의 표면을 스트랩트아비딘(streptavidin)으로 코팅하여, DNA 앱타머를 지지체상에 용이하게 결합시킬 수 있다. 한편, 지지체로서 비드를 사용하는 경우, 상기 AFP가 결합되어 포획된 DNA 앱타머 비드를 용이하게 회수하기 위해서 자성 비드(magnetic bead)를 사용할 수 있다.
By utilizing the specific binding properties of AFP of the DNA aptamer of the present invention, DNA aptamers can be applied to the separation and purification of AFP. In the present invention, the separation and purification of AFP is based on a binding assay method of forming a binding complex of DNA aptamer and AFP, and then separating and recovering AFP from the complex. Examples of such binding assay methods are well known in the art. The DNA aptamer molecule of the present invention can be bound to a support such as beads or resins, and the bound DNA aptamer can capture the ligand AFP. Binding of the DNA aptamer to the support may, for example, biotinylated the DNA aptamer and coat the surface of the support with streptavidin to facilitate binding of the DNA aptamer onto the support. You can. On the other hand, when a bead is used as a support, magnetic beads may be used to easily recover the DNA aptamer beads captured by the AFP.
본 발명은 AFP(Alpha-fetoprotein)에 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 앱타머와 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 앱타머는 간암 또는 생식세포종양의 마커 단백질인 AFP와 특이적으로 결합하는 특성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 DNA 앱타머는 AFP의 검출 용도 뿐만 아니라, AFP의 수준을 측정함으로써, 간암 및 생식세포종양의 진단 또는 예후 판단 용도로 사용될 수 있다. 본 발명의 DNA 앱타머는 간암 진단에 활용되고 있는 AFP 결합 항체를 대체할 수 있으며, 간암을 보다 신속하고 경제적으로 진단할 수 있을 것으로 기대된다.
The present invention relates to a DNA aptamer capable of specifically binding to alpha-fetoprotein (AFP) and its use. The DNA aptamer of the present invention has the property of specifically binding to AFP, a marker protein of liver cancer or germ cell tumor. Therefore, the DNA aptamer of the present invention can be used not only for detecting AFP but also for diagnosing or prognosticting liver cancer and germ cell tumor by measuring the level of AFP. DNA aptamer of the present invention can replace the AFP binding antibody that is utilized in the diagnosis of liver cancer, it is expected that it is possible to diagnose liver cancer more quickly and economically.
도 1은 랜덤 DNA 앱타머를 PCR 및 비대칭 PCR 기법을 이용하여 증폭한 후, 스트렙트아비딘 비드를 이용하여 ssDNA만을 선택적으로 회수한 결과와 회수된 ssDNA에 S1 nuclease를 처리한 결과를 아가로스 젤 전기영동을 통하여 확인한 결과이다. 레인 1: 100 bp DNA 마커이고, 레인 2: DNA 앱타머를 PCR 및 비대칭 PCR 기법을 이용하여 증폭한 후, 스트렙트아비딘 비드를 이용하여 ssDNA만을 선택적으로 회수한 결과이며, 레인 3: 스트렙트아비딘 비드를 이용하여 회수한 ssDNA에 S1 nuclease를 처리한 결과이다.
도 2는 AFP 결합 DNA 앱타머 제작을 위한 SELEX 과정에서 각 라운드에서 회수된 AFP 결합 DNA 앱타머가 회수된 양을 나타낸 결과이다.
도 3a 내지 도 3e는 AFP 결합 DNA 앱타머 제작을 위한 SELEX 과정에서 선별된 18개의 AFP 결합 DNA 앱타머 후보군 AFP-1 내지 AFP-18의 2차 구조를 나타낸 도면이다.
도 4는 카르복실기를 가지고 있는 센서 칩 CM5 표면에 AFP를 고정하는 단계를 나타낸 도면이다.
도 5은 도트 블로팅(Dot blotting) 기법을 기반으로 AFP 결합 DNA 앱타머가 AFP와 AFP 항체 간의 결합을 방해하는 것을 확인한 결과로 AFP, AFP 항체, 및 AFP 항체에 특이적으로 결합하는 퍼옥시다아제(peroxidase)가 결합되어 있는 쥐 IgG 항체를 이용하여 분석한 결과이다. 도트(점) 1-18은 AFP 결합 DNA 앱타머인 AFP-1 부터 AFP-18 까지의 160 pmol을 AFP 1.25 ng과 반응시킨 후, PVDF 멤브레인(membrane)에 각각 스포팅(spotting)한 후, 이를 AFP 항체, AFP 항체에 특이적으로 결합하는 퍼옥시다아제(peroxidase)가 결합되어 있는 쥐 IgG 항체를 이용하여 분석한 결과이며, 도트(점) 19는 AFP 10 ng을 PVDF 멤브레인에 스포팅한 후 AFP 항체, AFP 항체에 특이적으로 결합하는 퍼옥시다아제가 결합되어 있는 쥐 IgG 항체를 이용하여 분석한 결과이며, 도트(점) 20은 AFP 항체 10 ng을 PVDF 멤브레인에 스포팅한 후 AFP 항체에 특이적으로 결합하는 퍼옥시다아제가 결합되어 있는 쥐 IgG 항체를 이용하여 분석한 결과이며, 점 21은 퍼옥시다아제가 결합되어 있는 쥐 IgG 항체를 직접 PVDF 멤브레인에 스포팅한 후 직접 분석한 결과이다.
도 6는 AFP 결합 DNA 앱타머를 이용하여 ELISA 기법을 기반으로 AFP를 탐지하는 방법에 대한 모식도로서, 패널 [1]은 AFP의 탐지를 위해 AFP 결합 DNA 앱타머를 이용한 ELISA 법의 모식도를 나타내며, 패널 [2]는 기존 항체를 이용하여 AFP 를 탐지하는 ELISA 법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 7는 AFP 결합 앱타머를 이용한 간암 진단 키트(kit)의 모식도를 나타낸 도면이다. 패널 [1]은 AFP에 특이적으로 결합하는 앱타머를 내장한 키트(kit) 모식도를 나타내며, 패널 [2]는 간암으로 의심되는 시료를 AFP 결합 앱타머를 내장하고 있는 간암 진단 키트(kit)와 반응하였을 때, 샘플과 AFP 결합 앱타머의 결합에 의해 간암을 진단하는 시스템에 대한 모식도를 나타낸다. Figure 1 shows the result of amplifying random DNA aptamers using PCR and asymmetric PCR techniques, and selectively recovering only ssDNA using streptavidin beads and treating the recovered ssDNA with S1 nuclease. This is the result confirmed through yeongdong. Lane 1: 100 bp DNA marker, lane 2: DNA aptamer was amplified using PCR and asymmetric PCR techniques, and then ssDNA was selectively recovered using streptavidin beads, lane 3: streptavidin This is the result of S1 nuclease treatment on ssDNA recovered using beads.
Figure 2 is the result showing the amount of AFP binding DNA aptamer recovered in each round in the SELEX process for the production of AFP binding DNA aptamer.
3A to 3E are diagrams illustrating secondary structures of 18 AFP binding DNA aptamer candidate groups AFP-1 to AFP-18 selected during SELEX for AFP binding DNA aptamer preparation.
4 is a view showing a step of fixing the AFP on the surface of the sensor chip CM5 having a carboxyl group.
5 is a peroxidase that specifically binds to AFP, AFP antibodies, and AFP antibodies as a result of confirming that AFP binding DNA aptamers interfere with the binding between AFP and AFP antibodies based on dot blotting technique. ) Is analyzed using a mouse IgG antibody bound. Dots 1-18 react with 160 pmol of AFP binding DNA aptamers AFP-1 to AFP-18 with 1.25 ng of AFP, followed by spotting on PVDF membranes, respectively. The result was analyzed by using a murine IgG antibody with peroxidase that specifically binds to antibody or AFP antibody.
6 is a schematic diagram of a method for detecting AFP based on an ELISA technique using an AFP binding DNA aptamer. Panel [1] shows a schematic diagram of an ELISA method using an AFP binding DNA aptamer for detection of AFP. Panel [2] shows a schematic diagram of the ELISA method for detecting AFP using existing antibodies.
7 is a diagram showing a schematic diagram of a liver cancer diagnosis kit using an AFP binding aptamer. Panel [1] shows a schematic of a kit containing an aptamer that specifically binds to AFP, and panel [2] shows a liver cancer diagnostic kit containing a AFP binding aptamer for suspected liver cancer. When reacted with, the schematic diagram of a system for diagnosing liver cancer by binding a sample to an AFP binding aptamer is shown.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
실시예Example
실시예Example 1: One: DNADNA 앱타머의Of app tamer 제작 making
1-1. PCR 기법을 활용한 랜덤 DNA 라이브러리 증폭 1-1. Random DNA Library Amplification Using PCR Technique
AFP(Alpha-fetoprotein)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제작하기 위40개의 랜덤 서열을 dA : dG : dC : dT = 1.5 : 1.15 : 1.25 : 1 비율로 포함하고 있는 100bp의 주형 DNA (5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGAT TGCACTTACTATCT-3'; 서열목록 제19서열)와 이를 증폭할 수 있는 프라이머(primer) 한 쌍을 바이오니어(bioneer, Korea)으로부터 주문하여 제작하였다[정방향 프라이머: 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3'(서열목록 제20서열), 비오티닐화된(biotinylated) 역방향 프라이머: 5'-비오틴-AGATTGCACTTACTATCT-3'(서열목록 제21서열)]. 임의의 DNA 라이브러리는 PCR(Biorad, USA) 기법을 이용하여 증폭하였으며, PCR에 의한 100 bp DNA 라이브러리의 증폭을 위한 반응 조성은 주형 DNA 1-2㎕, 10X PCR 완충용액 5㎕, 각 2.5 mM dNTP 혼합물 4㎕, 25 μM 정방향 프라이머 2㎕, 25μM 비오티닐화된 역방향 프라이머 2㎕, Ex Taq 중합효소(Takara, Japan) 0.3㎕(1unit/㎕)와 34.7 - 35.7㎕의 물로 이루어져 있다. PCR 반응 조건은 우선 94℃에서 5분간 변성시키고, 94℃에서 30초, 52℃에서 30 초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 30주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 4㎕를 취하여, 2％ 아가로스 겔을 이용하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지를 확인하였다. 나머지 DNA는 PCR 정제 키트(Qiagen, USA)을 이용하여 증폭된 dsDNA만을 회수하였다.
100 bp template DNA containing 40 random sequences in the ratio dA: dG: dC: dT = 1.5: 1.15: 1.25: 1 to prepare DNA aptamers that specifically bind to alpha-fetoprotein (AFP) (5 '-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGAT TGCACTTACTATCT-3' (SEQ ID NO: 19) and a pair of primers capable of amplifying the same were prepared by ordering from bioneer (Korea) [forward primer: 5'- GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3 '(SEQ ID NO: 20), biotinylated reverse primer: 5'-Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3' (SEQ ID NO: 21)]. Any DNA library was amplified using PCR (Biorad, USA) technique. The reaction composition for amplification of 100 bp DNA library by PCR was 1-2 μl of template DNA, 5 μl of 10X PCR buffer, and 2.5 mM dNTP each. 4 μl of the mixture, 2 μl of 25 μM forward primer, 2 μl of 25 μM biotinylated reverse primer, 0.3 μl (1 unit / μl) of Ex Taq polymerase (Takara, Japan) and 34.7-35.7 μl of water. PCR reaction conditions were first denatured at 94 ° C. for 5 minutes, repeated 30 cycles for 30 seconds at 94 ° C., 30 seconds at 52 ° C., and 30 seconds at 72 ° C., and then further extended at 72 ° C. for 5 minutes. Was used. 4 μl was taken after the PCR reaction, and 2% agarose gel was used to confirm that a band of the correct size appeared. The remaining DNA was recovered only amplified dsDNA using a PCR purification kit (Qiagen, USA).
1-2. 비대칭(asymmetric) PCR 기법을 활용한 ssDNA 증폭 1-2. SsDNA amplification using asymmetric PCR
PCR 기법을 이용하여 증폭한 dsDNA 중 ssDNA만을 증폭하기 위하여 비대칭 PCR를 수행하였다. 비대칭 PCR 반응액의 조성은 상기 단계 1-1에서 획득한 주형 DNA 50㎕, 10X PCR 완충용액 10㎕, 10mM dNTP 혼합물 8㎕, 25μM 정방향 프라이머 10㎕, 25μM 비오티닐화된 역방향 프라이머 1㎕, Ex Taq 중합효소(Takara, Japan) 0.5㎕(1unit/㎕)와 20.5㎕의 물로 구성하였다. 비대칭 PCR 반응 조건은 우선 94℃에서 5분간 변성시키고, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간의 반응을 20주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 4㎕를 취하여, 2％ 아가로스젤을 이용하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였으며, 나머지 DNA는 PCR 정제 키트(Qiagen, USA)을 이용하여 DNA만을 회수하였다.
Asymmetric PCR was performed to amplify only ssDNA out of the amplified dsDNA using the PCR technique. The composition of the asymmetric PCR reaction solution was 50 μl of template DNA obtained in Step 1-1, 10 μl of 10X PCR buffer, 8 μl of 10 mM dNTP mixture, 10 μl of 25 μM forward primer, 1 μl of 25 μM biotinylated reverse primer, Ex. Taq polymerase (Takara, Japan) was composed of 0.5 μl (1 unit / μl) and 20.5 μl of water. The asymmetric PCR reaction conditions were first denatured at 94 ° C. for 5 minutes, repeated 20 cycles for 30 seconds at 94 ° C., 30 seconds at 52 ° C., and 30 seconds at 72 ° C., followed by further elongation at 72 ° C. for 5 minutes. Was used. After the PCR reaction, 4 μl was taken to confirm that the band of the correct size appeared using 2% agarose gel, and the rest of the DNA was recovered only using the PCR purification kit (Qiagen, USA).
1-3. ssDNA의 선별 및 회수 1-3. Screening and Recovery of ssDNA
비대칭 PCR을 이용하여 증폭한 PCR 산물 중 비오틴이 결합되어 있는 dsDNA 및 ssDNA를 제거하고 순수한 정방향의 ssDNA만을 확보하기 위하여, 상기 단계 1-2 에서 획득한 DNA 50㎕에 증류수 50㎕를 첨가한 후, 스트렙트아비딘(Pierce, USA) 50㎕를 첨가하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 반응액은 4℃, 13,000 rpm의 원심분리기를 이용하여 10분간 원심분리한 후, 상층액만을 회수하여 1/10 부피의 3M NaOAc(pH 4.5)와 2-3 부피의 100％ 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 동안 방치하였다. 반응 후에는 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 DNA만을 회수하였다. 회수한 DNA는 공기 중에서 말린 후, 50㎕의 증류수에 녹였다. 회수한 DNA 중 4㎕를 취하여 2％ 아가로스젤을 이용하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였다(도 1, 레인 2 참고). 나머지 DNA 중 2㎕를 취하여 S1 nuclease를 처리하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 2％ 아가로스젤을 이용하여 회수한 ssDNA가 완벽하게 제거되었음을 확인하였다(도 1, 레인 3 참고).
After removing the biotin-bound dsDNA and ssDNA from the PCR product amplified by asymmetric PCR and securing only pure forward ssDNA, 50 μl of distilled water was added to 50 μl of DNA obtained in Step 1-2. 50 μl of streptavidin (Pierce, USA) was added and reacted at 4 ° C. for 2 hours. After the reaction, the reaction solution was centrifuged for 10 minutes using a centrifugal separator at 4 ° C and 13,000 rpm, and then only the supernatant was recovered, and 1/10 volume of 3M NaOAc (pH 4.5) and 2-3 volumes of 100%. Ethanol was added and left at -70 ° C for 1 hour. After the reaction, only DNA was recovered by centrifugation at 13,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C. The recovered DNA was dried in air and dissolved in 50 µl of distilled water. 4 μl of the recovered DNA was taken to confirm that a band of the correct size appeared using a 2% agarose gel (see FIG. 1, lane 2). 2 μl of the remaining DNA was taken to treat the S1 nuclease, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The recovered ssDNA was completely removed using 2% agarose gel (see FIG. 1, lane 3).
실시예 2: SELEX 기법을 이용한 AFP(Alpha-fetoprotein)와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별 Example 2 DNA Aptamer Screening for Specific Binding to Alpha-fetoprotein (AFP) Using SELEX Technique
2-1. SELEX에 이용되는 각 용액의 조성 2-1. Composition of each solution used in SELEX
SELEX에 이용한 각 용액의 조성은 다음과 같았다. 즉, 2X 앱타머 선별 용액: 40mM Tris-HCl, 1M NaCl, 10mM imidazole, pH 7.9; 2X 필터 세척 용액: 40mM Tris-HCl, 1M NaCl, 120mM imidazole, pH 7.9; DNA 앱타머 용출 용액: 1X 앱타머 선별 용액.
The composition of each solution used in SELEX was as follows. Ie 2X aptamer selection solution: 40 mM Tris-HCl, 1M NaCl, 10 mM imidazole, pH 7.9; 2X filter wash solution: 40 mM Tris-HCl, 1M NaCl, 120 mM imidazole, pH 7.9; DNA Aptamer Elution Solution: 1 × Aptamer Screening Solution.
2-2. SELEX에 이용될 DNA 앱타머 구조 제작 2-2. Constructing DNA Aptamer Structures for SELEX
AFP(Alpha-fetoprotein)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 기 제작 확보한 ssDNA 40㎕에 증류수 60㎕를 첨가하고, 2X DNA 앱타머 선별 용액 100㎕을 첨가한 후 85℃에서 5분간 끓여 변성(Denaturation) 시킨 후, 상온에서 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성하였다.
In order to select DNA aptamers that specifically bind to AFP (alpha-fetoprotein), 60 μl of distilled water was added to 40 μl of ssDNA, and 100 μl of 2X DNA aptamer selection solution was added. After boiling for a minute to denaturate (Denaturation), and cooled slowly at room temperature to form a stable three-dimensional structure of the ssDNA aptamer.
2-3. 니트로셀룰로오스 여과( nitrocellulose filtration ) 기반의 SELEX 방법을 이용한 AFP ( Alpha - fetoprotein )에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 선별 2-3. Nitrocellulose filter (nitrocellulose DNA specifically binding to AFP ( alpha - fetoprotein ) using SELEX method based on filtration Aptamer Screening
AFP에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별에 사용된 AFP는 geneway사의 Human AFP antigen grade native protein을 이용하였다. 이 AFP를 1X PBS로 녹여 1.0μg/10μl(30.3 pmol)의 농도가 되도록 제조하였다. 이후 상기 단계 2-2에서 제조한 ssDNA 앱타머(303 pmol)와 혼합하여 전체 반응 부피를 210㎕로 맞춘 후 4℃에서 12시간 이상 반응시켰다. 이후, AFP와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머만을 특이적으로 선별하기 위하여 먼저, 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터(Nitrocellulose Membrane Filter) (0.45 ㎛ HA; Millipore, Billerica, MA)에 AFP와 ssDNA 앱타머 풀을 반응시킨 반응액을 투과시켰으며, 이후, 1X 세척완충액(washing buffer) (20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 60mM imidazole, pH 7.9) 3 ㎖을 이용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터를 세척하였다. 세척과정을 통하여 AFP와 결합하지 못한 ssDNA는 제거하였으며, 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터를 투과하지 못한 AFP와 결합한 DNA 앱타머는 별도로 회수하였다. 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터에 AFP와 결합한 DNA 앱타머의 회수를 위하여 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터를 50㎕ 증류수에 넣고 잘게 분쇄한 뒤 85℃에서 5분간 반응시켰고, 회수된 AFP와 결합된 DNA 앱타머에 동일 부피의 PCI (phenol:chloroform:isoamyl alcohol=25:24:1) 용액을 처리하여 AFP를 제거하였다. 이후, PCI 법을 통해 회수한 AFP가 제거된 DNA 앱타머는 회수 용액의 1/10 부피의 3M NaOAc (pH4.5)와 2-3배 부피의 100％ 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 반응시켰고, 이후 반응액을 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 AFP와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머만을 회수하였다. 회수한 DNA는 85℃에서 건조시킨 후, 50㎕의 증류수에 녹였다.
The AFP used for the selection of DNA aptamers that specifically bind to AFP was done using Geneway's Human AFP antigen grade native protein. This AFP was dissolved in 1 × PBS to prepare a concentration of 1.0 μg / 10 μl (30.3 pmol). Thereafter, the mixture was mixed with ssDNA aptamer (303 pmol) prepared in step 2-2 to adjust the total reaction volume to 210 μl and reacted at 4 ° C. for at least 12 hours. Then, in order to specifically select only DNA aptamers that specifically bind to AFP, first, AFP and ssDNA aptamer pools are reacted with a Nitrocellulose Membrane Filter (0.45 μm HA; Millipore, Billerica, Mass.). The reaction solution was allowed to permeate, and then the nitrocellulose membrane filter was washed with 3 ml of 1 × washing buffer (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 60 mM imidazole, pH 7.9). Through washing, ssDNA that did not bind to AFP was removed, and DNA aptamers that bound to AFP that did not penetrate the nitrocellulose membrane filter were recovered separately. To recover the DNA aptamer bound to the AFP in the nitrocellulose membrane filter, the nitrocellulose membrane filter was put in 50 µl of distilled water, finely pulverized, and reacted at 85 ° C. for 5 minutes. AFP was removed by treating with PCI (phenol: chloroform: isoamyl alcohol = 25: 24: 1) solution. Afterwards, the AFP-removed DNA aptamer recovered by PCI method was reacted at -70 ° C for 1 hour by adding 1/10 volume of 3M NaOAc (pH4.5) and 2-3 times volume of 100% ethanol. After that, the reaction solution was centrifuged at 13,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C. to recover only DNA aptamer specifically binding to AFP. The recovered DNA was dried at 85 ° C. and dissolved in 50 μl of distilled water.
2-4. Negative SELEX을 통한 비특이적 DNA 앱타머 제거 2-4. Nonspecific DNA Aptamer Removal with Negative SELEX
AFP가 아닌 니트로셀룰로오스 필터에 흡착하여 선별된 비특이적인 DNA 앱타머를 제거하기 위하여 SELEX 7회와 8회 사이에 AFP 없이 니트로셀룰로오스 필터에 DNA 앱타머 용액을 흘려주는 네가티브(negative) SELEX을 진행하였다. 1X 앱타머 선별 용액을 이용하여 활성화된 니트로셀룰로오스 필터에 상온에서 냉각시켜 구조가 형성된 ssDNA 앱타머를 반응시킨 후, 니트로셀룰로오스 필터에 결합하지 않고 통과되어 나온 DNA 앱타머 용액을 8회 SELEX에 이용하였다. 이후 SELEX는 총 10회까지 진행하였으며, SELEX의 결합 조건은 횟수가 증가할수록 ssDNA 앱타머와 AFP의 반응 시간을 줄였으며, 횟수가 거듭될수록 반응 조건을 엄격하게 하여 표적 물질인 AFP에 더욱 특이적으로 결합하는 앱타머를 얻고자 하였다.
In order to remove the nonspecific DNA aptamer selected by adsorption on a nitrocellulose filter other than AFP, a negative SELEX was performed in which a DNA aptamer solution was flowed into a nitrocellulose filter without AFP between 7 and 8 times of SELEX. After reacting the ssDNA aptamer formed by cooling the activated nitrocellulose filter at room temperature using a 1X aptamer selection solution, the DNA aptamer solution passed through without binding to the nitrocellulose filter was used for 8 times SELEX. . Afterwards, SELEX was carried out up to 10 times, and the binding conditions of SELEX decreased the reaction time between ssDNA aptamer and AFP as the number of times increased. We wanted to get aptamers to combine.
실시예 3: 나노 드롭(Nanodrop)을 이용한 각 라운드의 친화성 확인 Example 3: Confirmation of affinity of each round using Nanodrop
SELEX를 10회 까지 마친 후 SELEX 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA의 농도를 나노 드롭(Nano drop)을 이용하여 측정하였다. 나노 드롭(Nano drop)을 활용하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머 농도를 측정한 결과, 9 라운드의 농도가 215.6 ng/㎕로 가장 높았으며, 10 라운드의 농도는 189.1 ng/㎕로 9 라운드의 결과 보다 농도가 떨어지는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 AFP에 가장 특이적으로 결합하는 최적 앱타머 풀은 9 라운드 풀임을 확인할 수 있었다(도 2 참고).
After completing SELEX up to 10 times, the concentration of ssDNA eluted in each round was measured using Nano drop to quantitatively confirm SELEX progression and affinity of ssDNA aptamers eluted in each round. The concentration of ssDNA aptamers eluted in each round using nano drop was the highest in 9 rounds of 215.6 ng / μl and the 10 rounds of concentration of 189.1 ng / μl. It was confirmed that the concentration is lower than the result, through which it was confirmed that the optimal aptamer pool that binds most specifically to AFP is a 9-round pool (see FIG. 2).
실시예 4: 실시간(Real time) PCR 기법을 이용한 최적 라운드 확인Example 4: Optimal Round Confirmation Using Real Time PCR Technique
SELEX를 10회까지 마친 후 SELEX 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 DNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 PCR을 수행하였다. 먼저 초기 DNA 라이브러리와 네가티브(negative) SELEX 이후인 8 라운드, 9 라운드, 10 라운드에서 용리된 각각의 ssDNA 앱타머들을 PCR을 통하여 증폭하고, 비대칭 PCR을 진행하여 ssDNA를 확보하였다. 각 0, 8, 9, 10 라운드에서 확보된 ssDNA 앱타머는 동일한 농도로 준비하여 동일한 농도의 AFP와 4℃에서 12시간 이상 반응시켰다. 반응액은 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터(nitrocellulose membrane filter)에 투과시킨 후, 1X 세척 완충액(washing buffer) 3 ㎖을 이용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터를 세척하였다. 세척 과정을 통하여 AFP와 결합하지 못한 ssDNA는 제거하였으며, 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터를 투과하지 못한 AFP와 결합한 DNA 앱타머는 따로 회수하였다. 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터에 AFP와 결합한 DNA 앱타머의 회수를 위하여 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터는 50 ㎕의 증류수에 넣고 잘게 분쇄한 뒤 85℃에서 5분간 반응시켰으며, 회수된 AFP와 결합된 DNA 앱타머에 동일 부피의 PCI를 처리하여 AFP를 제거하였다. 이후, PCI 법을 통해 회수한 AFP가 제거된 DNA 앱타머는 회수 용액의 1/10 부피의 3M NaOAc (pH4.5)와 2-3배 부피의 100％ 에탄올을 첨가하여, -70℃에서 1시간 반응시켰고, 이후 반응액을 4℃에서 13,000 rpm으로 20 분간 원심 분리하여 AFP에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머만을 회수하였다. 회수된 DNA는 85℃에서 건조시킨 후, 50㎕의 증류수에 녹였다. 이를 통하여 획득된 각 ssDNA들은 각각 100, 10-1, 10-2로 희석하여 실시간 PCR의 주형 DNA로 사용하였다. 실시간 PCR은 Biorad사의 iQ SYBR Green Supermix(Bio-rad, USA)를 이용하였으며, 실시간 PCR 반응 조건은 먼저, 94℃에서 5분 변성 이후, 94℃에서 20초, 52℃에서 20초, 그리고 72℃에서 20초간 반응하는 과정을 40주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 연장시키는 반응 조건으로 반응을 진행하였다. 실시간 PCR 결과는 10-2로 희석된 샘플을 주형 DNA로 이용한 실험에서 결과를 획득할 수 있었다. 실시간 PCR 효율은 각 라운드별로 각각 71.66％, 72.4％, 56.45％였으며, 8 라운드와 10 라운드에서 획득한 ssDNA를 주형 DNA로 이용한 실시간 PCR 결과 효율은 71.66％, 56.45％로 9 라운드의 결과 보다 효율이 떨어지는 것으로 보아 더 이상 SELEX를 진행이 필요 없음을 확인할 수 있었다(표 1 참고). 이는 나노 드롭(Nano drop)을 이용하여 확인한 각 라운드별 회수 앱타머양 측정 결과와도 일치하는 결과임을 확인할 수 있었다. 나노 드롭(Nano drop) 결과 및 실시간 PCR 결과를 통하여 9 라운드의 앱타머 풀이 AFP와 결합 효율이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다. After completing SELEX up to 10 times, real-time PCR was performed to quantitatively confirm SELEX progress and affinity of the eluted DNA aptamer in each round. First, ssDNA aptamers eluted in
실시예Example 5: 5: AFPAFP 와 특이적으로 결합하는 Specifically combined with DNADNA 앱타머Aptamer 후보군의 Candidate 클로닝Cloning
나노 드롭(Nano drop)과 실시간 PCR를 통하여 AFP와 결합 효율이 가장 높은 것으로 판단된 9 라운드의 ssDNA 앱타머 풀에 대해 정방향 프라이머: 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3'(서열목록 제20서열)와 역방향 프라이머: 5'-비오틴-AGATTGCACTTACTATCT-3'(서열목록 제21서열)를 이용한 PCR 수행으로 dsDNA를 획득하였다. 이렇게 획득한 dsDNA는 QIAGEN의 PCR 클로닝 키트를 이용하여 클로닝을 수행하였다. 클로닝은 T-벡터 (50 ng/㎕) 1㎕와 PCR 산물 (20ng/㎕) 4㎕, 라이게이션 마스터 믹스 버퍼 5㎕를 섞어서 16℃에서 30분 동안 반응시키는 조건을 이용하였다. TA 클로닝한 라이게이터(ligater) 10㎕는 200㎕의 DH5α와 섞은 후 42℃에서 1분 30초 동안 열충격(heat shock)을 주고 얼음에 놓아두었다. 여기에 800㎕의 LB broth를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양한 후, 200㎕의 용액을 취하여 암피실린(ampicillin, 50㎍/ml), 카나마이신(kanamycin, 50㎍/ml), X-gal(50㎍/ml), IPTG(5㎍/ml)이 포함되어 있는 LB 배양 플레이트(LB plate)에 스프레딩하고, 37℃에서 15시간 동안 배양시킨 후, 40 개의 흰색 콜로니만을 선별하여 솔젠트(solgent, Korea)에 의뢰하여 앱타머의 염기서열을 결정하였으며, 서열 분석을 통하여 중복되지 않는 서열 18개의 AFP 결합 DNA 앱타머 18개를 확보할 수 있었다. 아래 표 2는 니트로셀룰로오스 여과(nitrocellulose filtration) 기반의 SELEX 방법을 활용하여 획득한 AFP 결합 DNA 앱타머 후보군 18개에 대한 서열을 나타낸 것이다. Forward primer: 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3 '(SEQ ID NO: 20) and reverse primer for 9 rounds of ssDNA aptamer pool determined to have the highest binding efficiency with AFP by nano drop and real-time PCR : DsDNA was obtained by PCR using 5′-Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3 ′ (SEQ ID NO: 21). The dsDNA thus obtained was cloned using QIAGEN's PCR cloning kit. Cloning was performed by mixing 1 μl of T-vector (50 ng / μl), 4 μl of PCR product (20 ng / μl), 5 μl of ligation master mix buffer, and reacting at 16 ° C. for 30 minutes. 10 μl of a TA cloned ligater was mixed with 200 μl of DH5α and subjected to a heat shock at 42 ° C. for 1 minute and 30 seconds and placed on ice. 800 μl of LB broth was added thereto, and then incubated at 37 ° C. for 1 hour. After incubation, 200 μl of solution was taken to contain ampicillin (ampicillin, 50 μg / ml), kanamycin (kanamycin, 50 μg / ml), X-gal (50 μg / ml), and IPTG (5 μg / ml). After spreading to the LB culture plate (LB plate), incubated for 15 hours at 37 ℃, only 40 white colonies were selected and asked to the solgent (solgent, Korea) to determine the nucleotide sequence of the aptamer, Through analysis, 18 non-overlapping sequences of 18 AFP binding DNA aptamers were obtained. Table 2 below shows the sequences for 18 candidate AFP binding DNA aptamer candidates obtained using the SELEX method based on nitrocellulose filtration.
실시예Example 6: 6: AFPAFP 결합 Combination DNADNA 앱타머의Of app tamer 구조 결정 Structure determination
AFP 결합 DNA 앱타머 후보군들의 구조는 Rensselear polytechnic institute에서 제공하는 DNA mfold 프로그램을 활용하여 이미지화 할 수 있었다(도 3a 내지 도 3e 참고).
The structure of AFP binding DNA aptamer candidate groups could be imaged using the DNA mfold program provided by Rensselear polytechnic institute (see FIGS. 3A to 3E).
실시예 7: SPR을 이용한 AFP와 결합하는 앱타머 후보군의 친화도 테스트Example 7: Affinity Test of Aptamer Candidates with AFP Using SPR
7-1. AFP에 특이적으로 결합하는 앱타머 후보군들의 각 친화도를 정량하기 위한 AFP가 코팅된 센서 칩 제작 실험 7-1. AFP-coated sensor chip fabrication experiment to quantify each affinity of aptamer candidates that specifically bind to AFP
AFP와 상기 실시예 6에서 획득한 앱타머 후보군과의 친화도를 정량하기 위하여, 본 발명자들은 SPR 검출 시스템 기기인 BIAcore 3000(BIACORE)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR) 실험을 실시하였다. AFP와 앱타머 후보군과의 친화도를 정량하기 위하여 표면이 카르복실기로 코팅된 센서 칩 CM5(GE Healthcare)을 이용하였다. 센서 칩 CM5는 0.1M N-hydroxysuccinimide (NHS)와 0.4 M N-ethyl-N'-(dimethyl aminopropyl)carbodiimide(EDC) 혼합액을 5㎕/min의 속도로 10분 동안 칩에 흘려 활성화시켜 카르복실기를 반응성이 더 좋은 N-히드록시석신이미드 에스테르(N-hydroxysuccinimide ester)로 바꾸어주었다. NHS-에스테르(ester)로 활성화된 센서 칩 CM5의 표면에 AFP를 고정하기 위하여 10 mM 소디엄 아세테이트(sodium acetate)(pH 5.0) 완충액에 100 ㎍/㎖의 농도로 녹아 있는 AFP 용액을 5㎕/min의 속도로 10분 동안 처리하여 칩 표면을 AFP로 코팅하였다(도 4 참고). AFP가 고정된 센서 칩은 1M 에탄올아민 하이드로클로라이드(pH 8.5)를 5㎕/min의 속도로 10분 동안 칩에 흘려줌으로써 남아 있는 반응기를 불활성시켰다. 이를 통하여 다른 시약 및 DNA 앱타머가 칩 표면에 직접 결합하는 것을 방지하였으며, 각 실험 후 센서 칩은 10 mM EDTA로 재생시켰다. 속도 변수는 BIA 평가프로그램(BIACORE)으로 수득, 정량하였다.
In order to quantify the affinity between the AFP and the aptamer candidate group obtained in Example 6, the inventors conducted a surface plasmon resonance (SPR) experiment using BIAcore 3000 (BIACORE), an SPR detection system device. It was. In order to quantify the affinity between the AFP and the aptamer candidate group, a sensor chip CM5 (GE Healthcare) coated with a carboxyl group was used. The sensor chip CM5 is activated by flowing 0.1 M N-hydroxysuccinimide (NHS) and 0.4 M N-ethyl-N '-(dimethyl aminopropyl) carbodiimide (EDC) mixture into the chip for 10 minutes at a rate of 5 µl / min to activate the carboxyl group. The better N-hydroxysuccinimide ester. To fix AFP on the surface of the sensor chip CM5 activated with NHS-ester, 5 µl / ml of AFP solution dissolved in 100 mM / ml in 10 mM sodium acetate (pH 5.0) buffer was added. The chip surface was coated with AFP by treatment for 10 minutes at a rate of min (see FIG. 4). The AFP-fixed sensor chip deactivated the remaining reactor by flowing 1M ethanolamine hydrochloride (pH 8.5) into the chip for 10 minutes at a rate of 5 μl / min. This prevented other reagents and DNA aptamers from binding directly to the chip surface, and after each experiment the sensor chip was regenerated with 10 mM EDTA. Rate variables were obtained and quantified by the BIA Assessment Program (BIACORE).
7-2. AFP 결합 DNA 앱타머 후보군의 친화력 측정 7-2. Affinity Measurement of AFP Binding DNA Aptamer Candidates
AFP에 가장 높은 친화력을 가지는 앱타머를 선별하기 위하여 확보된 AFP 결합 DNA 앱타머 후보군은 HBS2P 버퍼(GE Healthcare)에 각 1μM, 2μM, 3μM의 농도로 녹여 준비하였다. 제작된 DNA 앱타머는 아무것도 결합시키지 않은 센서칩(채널 1), AFP가 고정된 센서칩(채널 2)에 DNA 앱타머 후보군을 다양한 농도(각 1μM, 2μM, 3μM)로 주입함으로써 AFP와 AFP 결합 DNA 앱타머 후보군간의 친화도를 정량화할수 있었다. 각 AFP에 결합하는 AFP 결합 DNA 앱타머 후보군의 해리상수 (Kd, dissociation) 수득 결과 AFP 결합 DNA 앱타머 후보군 중 AFP-4 앱타머의 해리상수가 8.87 X 10-11M으로 AFP에 대해 가장 높은 친화도 값을 가지고 있음을 확인 할 수 있었다(표 3 참고). AFP-binding DNA aptamer candidate groups secured to select aptamers having the highest affinity for AFP were prepared by dissolving at concentrations of 1 μM, 2 μM, and 3 μM in HBS2P buffer (GE Healthcare). The prepared DNA aptamer is injected into the AFP-AFP-binding DNA by injecting DNA aptamer candidate groups at various concentrations (1 μM, 2 μM, and 3 μM, respectively) into a sensor chip (channel 1) and an AFP-fixed sensor chip (channel 2). The affinity between the aptamer candidates could be quantified. Results of dissociation (Kd, dissociation) of AFP-binding DNA aptamer candidate groups that bind to each AFP resulted in the highest affinity for AFP with 8.87 X 10 -11 M of AFP-4 aptamer candidate groups It was confirmed that it has a value (see Table 3).
7-3. SPR 분석을 통한 AFP 항체와 AFP 간의 친화력 측정 7-3. Affinity measurement between AFP antibody and AFP by SPR analysis
AFP 항체와 AFP 결합 DNA 앱타머간의 친화력 차이를 확인하기 위하여 AFP가 코팅되어 있는 센서칩에 AFP 항체를 농도별로 반응시켰다. AFP 항체는 50nM, 20nM, 10nM, 5nM, 1nM, 0.5nM, 0.1nM의 농도로 준비되었으며, 아무것도 결합되지 않은 센서칩(채널 1)과 AFP가 고정된 센서칩(채널 2)에 20㎕/min의 속도로 2분 동안 주입하였다. 반응 결과 AFP에 대한 AFP 항체의 친화도를 정량화할 수 있었으며, AFP 항체와 AFP간의 결합력에 대한 해리상수(Kd, dissociation)는 1.15 X 10-9M으로 AFP 결합 DNA 앱타머 후보군 보다 높은 친화도 값을 가짐을 확인할 수 있었다.
In order to confirm the affinity difference between the AFP antibody and the AFP binding DNA aptamer, the AFP antibody was reacted by concentration on the AFP-coated sensor chip. AFP antibodies were prepared at concentrations of 50 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 0.5 nM and 0.1 nM, and 20 μl / min in the sensor chip (channel 1) and the AFP-fixed sensor chip (channel 2). It was injected for 2 minutes at the rate of. As a result of the reaction, the affinity of the AFP antibody to AFP was quantified, and the dissociation constant (Kd, dissociation) of the binding force between the AFP antibody and AFP was 1.15 X 10 -9 M, which was higher than that of the AFP-binding DNA aptamer candidate group. It could be confirmed that having.
실시예 8: AFP 결합 앱타머 후보군에 의한 AFP와 AFP 항체간의 결합 저해Example 8 Inhibition of Binding Between AFP and AFP Antibodies by AFP Binding Aptamer Candidates
AFP 결합 앱타머 후보군이 AFP와 AFP 항체간의 결합을 방해할 수 있는 지를 확인하기 위하여 본 발명자들은 도트 블로팅(dot blotting) 실험을 수행하였다. 이를 위하여 먼저 기 선별하여 확보된 18개의 AFP 결합 앱타머 후보군(150 pmol)과 AFP(1 ng)를 4℃에서 12 시간 이상 반응시켰다. 반응 후 AFP 결합 앱타머 후보군과 AFP 복합체를 메탄올로 활성화시킨 PVDF 멤브레인(membrane)에 스포팅(spotting)하였다. 이어서, PVDF 멤브레인을 PBS(pH 7.2)로 15분 동안 실온에서 세척하였으며, 이후 5％ 탈지유(skim milk)를 이용하여 비특이적인 반응이 일어날 수 있는 멤브레인을 블로킹하였다. 이후, 스포팅이 되어 있는 멤브레인은 AFP 항체, AFP 항체와 특이적으로 결합하는 퍼옥시다아제(peroxidase)가 결합되어 있는 쥐 IgG 항체 순으로 순차적으로 반응을 진행하였으며, 반응과 반응 사이에는 0.5％ Tween 20이 포함되어 있는 PBS를 이용하여, 멤브레인을 세척하였다. 반응이 끝난 멤브레인에서 시그널은 ECL kit (GE Healthcare)를 이용하여 확인하였다(도 5 참고). 이를 통하여 AFP 항체와 AFP 사이의 특이적인 결합 사이트에 결합하는 AFP-5, AFP-18 앱타머를 확인할 수 있었다. 이는 AFP와의 결합력이 높은 것과는 별개의 결과로 AFP 결합 앱타머가 AFP와 AFP 항체 사이의 특이적인 결합을 차단할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 5 참고).
To determine whether AFP binding aptamer candidates could interfere with binding between AFP and AFP antibodies, we performed a dot blotting experiment. For this purpose, 18 AFP binding aptamer candidate groups (150 pmol) and AFP (1 ng), which were previously selected and secured, were reacted at 4 ° C. for at least 12 hours. After the reaction, the AFP binding aptamer candidate group and the AFP complex were spotted on a PVDF membrane activated with methanol. The PVDF membrane was then washed with PBS (pH 7.2) for 15 minutes at room temperature and then blocked with a 5% skim milk to block non-specific reactions. Subsequently, the spotted membrane was sequentially reacted with an AFP antibody and a murine IgG antibody with a peroxidase binding to the AFP antibody in that order, and 0.5
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that the specific technology is merely a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
<110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation <120> DNA Aptamer Specifically Binding to Alpha-fetoprotein and Its Use <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 1 tctggagcat ttcattttgt ttggtccact gtctagtcgg 40 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 2 attcgaccta acgctctcaa agcgcatatt cgcgatac 38 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer binding to AFP <400> 3 cagggttcaa cccaacatcc caacattttc ttttgtcggg 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 4 ccacgaaaat acgctgaatg gttgttaaaa gaactacgca 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 5 acatttctac ccacagggac tattcggcct ccgttgaccg 40 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 6 ctatggcctt caattccata aggcatcagt tcgtgtg 37 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 7 caatcgtact cgttctatag ctatggctag ctgcttgccg 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 8 tgtgtaacag gccccaaggc atgctcagca cgccacttgg 40 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 9 gatctgttcc tgacctcgcc gctatgtcga gtaatttcg 39 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 10 ttattaggat cgtaagaacc gtgcacccct ttttgtgcg 39 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 11 ctaaccaccg gtacgggcaa ctatgtttgc tttcgtcgca 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 12 ctctactccg actataaggc ggtgggtatt aaacctcctg 40 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 13 cttttgtaca ccgactcagt tcgtgtatca actttggtc 39 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 14 tctgtgcact cagtagttgt gctccataat catggctgca 40 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 15 cttcctacga ccgtttcaac gtggtgcccc caccaacagc g 41 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 16 ctctggtagt gttcaacttt tcatgcaatc tttatcggtg 40 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 17 ccgccagaag gtgccaaagc cggacaaacc tgcggaacga 40 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 18 gctaccgggc ctacgtccgg ttgccctcgc tccacttagt 40 <210> 19 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template DNA for selecting DNA aptamer binding to AFP <400> 19 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnagattgca cttactatct 100 <210> 20 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer <400> 20 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tt 42 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer <400> 21 agattgcact tactatct 18 <110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation <120> DNA Aptamer Specific Binding to Alpha-fetoprotein and Its Use <160> 21 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 1 tctggagcat ttcattttgt ttggtccact gtctagtcgg 40 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 2 attcgaccta acgctctcaa agcgcatatt cgcgatac 38 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Aptamer binding to AFP <400> 3 cagggttcaa cccaacatcc caacattttc ttttgtcggg 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 4 ccacgaaaat acgctgaatg gttgttaaaa gaactacgca 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 5 acatttctac ccacagggac tattcggcct ccgttgaccg 40 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 6 ctatggcctt caattccata aggcatcagt tcgtgtg 37 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 7 caatcgtact cgttctatag ctatggctag ctgcttgccg 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 8 tgtgtaacag gccccaaggc atgctcagca cgccacttgg 40 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 9 gatctgttcc tgacctcgcc gctatgtcga gtaatttcg 39 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 10 ttattaggat cgtaagaacc gtgcacccct ttttgtgcg 39 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 11 ctaaccaccg gtacgggcaa ctatgtttgc tttcgtcgca 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 12 ctctactccg actataaggc ggtgggtatt aaacctcctg 40 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 13 cttttgtaca ccgactcagt tcgtgtatca actttggtc 39 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 14 tctgtgcact cagtagttgt gctccataat catggctgca 40 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 15 cttcctacga ccgtttcaac gtggtgcccc caccaacagc g 41 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 16 ctctggtagt gttcaacttt tcatgcaatc tttatcggtg 40 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 17 ccgccagaag gtgccaaagc cggacaaacc tgcggaacga 40 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer binding to AFP <400> 18 gctaccgggc ctacgtccgg ttgccctcgc tccacttagt 40 <210> 19 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template DNA for selecting DNA aptamer binding to AFP <400> 19 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnagattgca cttactatct 100 <210> 20 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer <400> 20 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tt 42 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> PCR reverse primer <400> 21 agattgcact tactatct 18
Claims (8)
DNA aptamers that specifically bind to alpha-fetoprotein (AFP).
The DNA aptamer according to claim 1, wherein the DNA aptamer is an oligonucleotide having a nucleotide sequence having 90% or more identity with a nucleotide sequence disclosed in any one of SEQ ID NOs: 1 to 18.
The DNA aptamer according to claim 1, wherein the DNA aptamer is an oligonucleotide having a nucleotide sequence disclosed in any one of SEQ ID NOs: 1 to 18.
A kit for detecting AFP (Alpha-fetoprotein) comprising the DNA aptamer of any one of claims 1 to 3 as an active ingredient.
A composition for diagnosis or prognosis of liver cancer or germ cell tumor comprising the DNA aptamer of any one of claims 1 to 3 as an active ingredient.
4. The microarray for diagnosis or prognosis of liver cancer or germ cell tumor, wherein the DNA aptamer of any one of claims 1 to 3 is immobilized on a substrate.
AFP through the binding reaction of the DNA aptamer of any one of claims 1 to 3 with an alpha-fetoprotein (AFP) from a biological sample of a patient to provide information necessary for diagnosis or prognosis of liver cancer or germ cell tumor. How to detect.
(a) 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 DNA 앱타머가 결합된 지지체에 AFP가 포함된 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 DNA 앱타머에 결합된 AFP를 분리하는 단계. Method for isolating and purifying Alpha-fetoprotein (AFP) from a sample containing AFP comprising the following steps:
(a) contacting a sample containing AFP to a support to which the DNA aptamer of any one of claims 1 to 3 is bound; And
(b) separating the AFP bound to the DNA aptamer.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110012878A KR101513766B1 (en) | 2011-02-14 | 2011-02-14 | DNA Aptamer Specifically Binding to Alpha-fetoprotein and Its Use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110012878A KR101513766B1 (en) | 2011-02-14 | 2011-02-14 | DNA Aptamer Specifically Binding to Alpha-fetoprotein and Its Use |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20120092938A true KR20120092938A (en) | 2012-08-22 |
| KR101513766B1 KR101513766B1 (en) | 2015-04-20 |
Family
ID=46884716
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020110012878A KR101513766B1 (en) | 2011-02-14 | 2011-02-14 | DNA Aptamer Specifically Binding to Alpha-fetoprotein and Its Use |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101513766B1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101460450B1 (en) * | 2013-09-05 | 2014-11-12 | 충북대학교 산학협력단 | DNA aptamer specifically binding to cadmium and uses thereof |
| WO2015046737A1 (en) * | 2013-09-26 | 2015-04-02 | 충북대학교 산학협력단 | Dna aptamer specifically binding to virulence regulatory factor prfa protein of listeria and use thereof |
| CN107561286A (en) * | 2016-03-25 | 2018-01-09 | 张少华 | A kind of highly sensitive fetoprotein reagent |
| CN111551722A (en) * | 2020-05-27 | 2020-08-18 | 济南大学 | Preparation and application of magnetic sodium alginate composite material with dual functions of recognition and catalysis |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8198020B2 (en) | 2003-08-22 | 2012-06-12 | Potentia Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for enhancing phagocytosis or phagocyte activity |
-
2011
- 2011-02-14 KR KR1020110012878A patent/KR101513766B1/en active IP Right Grant
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101460450B1 (en) * | 2013-09-05 | 2014-11-12 | 충북대학교 산학협력단 | DNA aptamer specifically binding to cadmium and uses thereof |
| WO2015034250A1 (en) * | 2013-09-05 | 2015-03-12 | 충북대학교 산학협력단 | Dna aptamer specifically binding to cadmium and use thereof |
| WO2015046737A1 (en) * | 2013-09-26 | 2015-04-02 | 충북대학교 산학협력단 | Dna aptamer specifically binding to virulence regulatory factor prfa protein of listeria and use thereof |
| CN107561286A (en) * | 2016-03-25 | 2018-01-09 | 张少华 | A kind of highly sensitive fetoprotein reagent |
| CN107576801A (en) * | 2016-03-25 | 2018-01-12 | 张少华 | A kind of fetoprotein reagent based on nucleic acid aptamer fluorescence probe AFP5 |
| CN111551722A (en) * | 2020-05-27 | 2020-08-18 | 济南大学 | Preparation and application of magnetic sodium alginate composite material with dual functions of recognition and catalysis |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101513766B1 (en) | 2015-04-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7372927B2 (en) | Biomolecular probes and detection methods for detecting gene and protein expression | |
| US9487774B2 (en) | Compositions, methods, and kits for identifying candidate molecules from encoded chemical libraries | |
| JP6172640B2 (en) | Nucleic acid quantification method, detection probe, detection probe set, and nucleic acid detection method | |
| KR101535709B1 (en) | Method for Dectecting of Target Molecules Using PNA Aptamers | |
| JPWO2015045666A1 (en) | Fluid device, exosome analysis method, biomolecule analysis method, and biomolecule detection method | |
| CN109337909B (en) | Aptamer for detecting liver cancer drug-resistant cell strain and application thereof | |
| KR101513766B1 (en) | DNA Aptamer Specifically Binding to Alpha-fetoprotein and Its Use | |
| JP2009529857A (en) | Oligonucleotide microarray for pathogen identification | |
| KR101670135B1 (en) | DNA Aptamer Specifically Binding to LCN2 (Lipocalin 2) protein and Its Use | |
| KR20180052991A (en) | DNA Aptamer Specifically Binding to Surface of Living Cell of Salmonella typhimurium and Uses Thereof | |
| KR20170056126A (en) | DNA aptamer specifically binding to SPINK1 protein and Use thereof | |
| KR102403628B1 (en) | Method for Obtaining Profiles for Population of Target Molecules of a Sample | |
| KR101274118B1 (en) | DNA Aptamer Specifically Binding to Surface of Living Cell of Listeria monocytogenes and Uses Thereof | |
| KR101541221B1 (en) | DNA aptamer specifically binding to PrfA protein of Listeria monocytogenes and uses thereof | |
| KR101372362B1 (en) | DNA Aptamer Specifically Binding to Invasion Plasmid Antigen H Protein from Shigella sonnei and Its Use | |
| KR101347917B1 (en) | Selection method of aptamer capable of specifically binding to protective antigen of anthrax toxin | |
| KR101716054B1 (en) | DNA Aptamer Specifically Binding to Cystatin B protein and Uses Thereof | |
| KR101901025B1 (en) | DNA Aptamer Specifically Binding to HbA1c protein and Uses Thereof | |
| KR102498862B1 (en) | Method for analyzing exosomes in liquid biopsy sample | |
| KR102029803B1 (en) | DNA Aptamer Specifically Binding to Prathyroid Hormone and Uses Thereof | |
| KR102384471B1 (en) | Complex of LNA probe and graphene oxide and nucleic acid detection method using same | |
| US20220025430A1 (en) | Sequence based imaging | |
| KR101651212B1 (en) | DNA Aptamer Capable of Specifically Binding to Surface of Living Cell of Shigella sonnei and Uses Thereof | |
| KR20230057233A (en) | Method of Detecting Target RNA Molecule and Target Protein Simultaneously and Kit for the Same Method | |
| US9890418B1 (en) | Method of detecting nucleic acids with enhanced signal using dual-functional capture particles |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190510 Year of fee payment: 5 |
|
| R401 | Registration of restoration |