KR20120085510A - Ｈｓｐ90 억제제를 포함하는 간질환 치료용 조성물 및 Ｈｓｐ90과 ＨＢＶ 코어 단백질간의 상호작용 억제를 통한 간질환 치료제 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본원은 Hsp90 억제제를 포함하는 간질환 치료제 및 Hsp90과 코어 단백질 간의 상호작용 억제를 통한 간질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다. 본원의 치료제는 특히 B형 간염 바이러스 감염에 의해 야기될 수 있는 간질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

Ｈｓｐ90 억제제를 포함하는 간질환 치료용 조성물 및 Ｈｓｐ90과 ＨＢＶ 코어 단백질간의 상호작용 억제를 통한 간질환 치료제 스크리닝 방법 {Composition for treating liver diseases comprising a Hsp90 inhibitor and Method for screening an agent for treating liver diseases through inhibition of Hsp90 and Core protein interaction}

본 발명은 간질환 치료제 및 그 스크리닝 분야에 관한 것이다.

세계적으로 약 3억 5천만 명이 B형 간염바이러스 (Hepatitis B Virus, HBV)에 감염된 것으로 추정되며, 이 중 5 내지 10%는 평생 만성 B형 간염으로 고생하는데, 만성간염은 간세포암 (Hepatocellular Carcinoma, HCC)의 주요 원인이다 (Ahn et al., 2005; Montalto, G. et al., 2002). 간세포암은 우리나라에서 4번째로 발병률이 높은 암이나 (국가암정보센터, 2003년-2005년 분석자료) 간암 특이적 치료법은 답보상태이다. 간암의 주 치료법은 간절제술, 간동맥 화학색전술, 항암화학요법, 방사선치료, 및 간이식술 등을 들 수 있으나, 간세포에서만 특이적으로 작용할 수 있는 항암제는 전무한 상태이다 (국가암정보센터). 간암세포에 특이적으로 작용할 수 있는 항암제의 개발을 위해서는 분자생물학적 수준에서의 간암 기전에 대한 이해를 기본으로 하는 치료 방법의 개발이 우선되어야 한다.

만성간암을 일으키는 HBV는 유전체가 부분적으로 이중가닥인 3.2 kb의 원형 DNA 바이러스로, 유전체에는 4개의 겹친 해독틀이 존재하며, 이로부터 표면 단백질 (HBs), 코어단백질 (HBc), 중합효소 (HBV pol), 및 X 단백질 (HBx)이 발현된다 (Seeger, C. et al., 2000). 코어단백질은 HBV pol, 프리게놈 RNA (pgRNA) 및 기타 다른 단백질의 패키징에 관여하며, HBV 라이프사이클에서 중요한 역활을 하는 것으로 알려져 있다 (ibid.). 바이러스의 생성에는 코어단백질과 바이러스 게놈 및 기타 단백질의 어샘블리가 필요하기 때문에, 코어단백질의 어샘블리는 HBV 복제에 있어 중요한 단계이다.

코어 단백질은 코어 어샘블리에 필요한 N-말단 부위와 바이러스 복제를 조절하는 C 말단으로 이루어진 두 개의 영역을 갖는 183-185개 아미노산으로 구성되어 있다 (ibid .). 코어단백질은 바이러스의 캡시드를 형성하며, 캡시드는 패키지된 바이러스와 숙주 인자 (host factor)의 보호에 필수적인 역활을 한다. 따라서 효과적인 간질환 치료제의 개발을 위해서는 코어단백질과 상호작용하여 이의 캡시드 형성에 영향을 미치는 표적 및 이를 표적으로 하는 약물의 개발이 절실하지만, 코어단백질과 상호작용하여 HBV 캡시드 형성에 영향을 미치는 단백질에 관한 자세한 기전 및 이를 기본으로 하는 치료 방법의 개발과 관련해서는 알려진 바가 없다.

본 발명은 숙주 단백질 Hsp90 과 이와 상호작용하는 단백질을 표적으로 하여 간염 바이러스의 생성을 억제할 수 있는 간질환 치료 물질 및 그 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본원은 Hsp90 억제제를 유효성분으로 포함하는 간염바이러스 감염으로 인한 간질환 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본원은 상기 Hsp90 억제제는 Hsp90의 발현 및/또는 활성을 억제하는 물질로, 상기 물질은 저분자화합물, 항체, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 및 폴리펩타이드를 포함하는 것인, 간염바이러스 감염으로 인한 간질환 치료용 조성물을 제공한다.

본원은 또한 Hsp90 및 HBV 코어 단백질을 제공하는 단계; 상기 Hsp90와 HBV 코어 단백질과의 상호작용을 선택적으로 억제할 수 있을 것으로 기대되는 시험물질과 상기 단백질을 접촉시키는 단계; 및 상기 Hsp90와 HBV 코어 단백질과의 상호작용을 검출하는 단계로, 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질과 접촉된 경우 Hsp90와 HBV 코어 단백질의 상호작용이 감소된 경우, 상기 시험물질을 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는 Hsp90과 HBV 코어단백질긴의 상호작용을 선택적으로 억제하는 간질환 치료 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본원은 또한 Hsp90 단백질은 전장 또는 표 1의 서열을 기준으로 적어도 잔기 520 내지 615를 포함하며, 상기 HBV 코어 단백질은 전장 또는 표 1의 서열을 기준으로 적어도 잔기 1 내지 149 또는 잔기 111 내지 130을 포함하는, 간질환 치료 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본원은 또한 상기 Hsp90 및 HBV 코어단백질은 이를 발현하는 세포의 형태로 제공되는, 간질환 치료 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본원은 또한 상기 세포는 HepG2, Huh7, Hep3B 또는 PLC/PRF/5인 것인, 간질환 치료 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본원은 또한 상기 Hsp90 및 HBV 코어 단백질의 상호작용은 세포외 HBV 핵산 농도로 측정되는 것인, 간질환 치료 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

Hsp90의 활성 및/또는 발현을 억제하여 HBV 생성을 억제할 수 있어, 간염 바이러스 감염으로 인한 질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 Hsp90과 HBV 코어 단백질 간의 결합을 보여주는 결과이다. (A) HBV 코어단백질을 발현하는 인간 간암세포주인 Huh7에서 항-HBV core Ab와 항-Hsp90 Ab로 수행한 공동면역침전 결과; (B) HBV 코어단백질 Cp140 이량체/캡시드와 Hsp90의 인비트로 결합 후 항-HBV core Ab와 항-Hsp90 Ab를 이용해 공동면역침전으로 결합을 확인한 결과 (코어단백질 이량체; 윗패널, 캡시드; 아래패널); (C) His-태킹된 Hsp90 및 Ni-NTA 아가로스 컬럼을 이용한 코어단백질 Cp140 이량체 (윗패널)/캡시드(아래패널)와 결합 분석후, 항-HBV core Ab와 항-Hsp90 Ab를 이용해 면역블랏으로 확인한 결과로, 각 레인은 다음과 같다: 레인1, 정제된 Cp149; 레인 2, 정제된 Hsp90; 레인 3. Ni-NTA 아가로스 단독; 레인 4, 아가로스에 고정된 Hsp90; 레인 5, 컬럼통과물질(flow through); 레인 6-8, 50mM 이미다졸 세척물 (아가로스에 결합하지 않은 단백질을 보여주기 위함); 레인 9, 500mM 이미다졸 용출물.
도 2는 Hsp90이 HBV 코어단백질과의 상호작용을 통해 HBV 캡시드로 편입되는 것을 보여주는 결과이다. (A) HSP90과 Cp149 이량체를 혼합 후, 캡시드 어셈블리는 슈크로스 밀도구배 분획 분석 및 항-HBV core Ab와 항-Hsp90 Ab를 이용한 면역블랏 결과; (B) A)의 슈크로스농도 구배 분획 3 및 8 (각각 레인 3 및 4)에 대한 닷블롯 (윗패널), 비변성 0.9% 아가로스젤 전기영동 (중간패널) 및 변성 15% SDS PAGE 분석 후 항-HBV core Ab와 항-Hsp90 Ab를 이용한 면역블랏 결과; (C)는 Hsp90이 캡시드 안으로 혼입되었음을 보여주는 항-HBV core Ab와 항-Hsp90 Ab를 이용한 닷 블랏 결과.
도 3은 Hsp90이 HBV 코어단백질 어셈블리를 촉진함을 보여주는 결과이다. 도 3a는 Cp149 이량체 (A) 및 이의 점돌연변이체 (C61A) (B)를 어셈블리 조건 (Hsp90, p23, 0.5mM ATP-γ-S, 및 2μM GA)에서 반응한 후 0.9% 아가로스젤 전기영동분석 후 항-HBV 코어 항체를 이용한 면역블랏 결과로 코어, 총 Cp149 이량체 및 C61A는 15% SDS PAGE로 분석하였다. 도 3b는 (C) Cp149 이량체와 음성대조군 (BSA 윗패널), ATP-활성화 Hsp90 (중간패널) 및 GA-불활성화 Hsp90 (아래패널)과의 캡시드 형성을 슈크로스 밀도구배 분획 분석 및 항-Hsp90 Ab를 이용한 면역블랏 결과로, 선그래프는 각 패널의 분획의 밴드 패턴을 나타낸 것이고, 막대그래프는 분획 7 내지 10에서 형성된 캡시드의 양을 나타낸다. 도 3b의 (D)는 캡시드 형성을 인비트로에서 시간경과에 따라 면역블랏으로 관찰한 결과로, Cp149와 음성대조군 (BSA, 윗패널), ATP-활성화 Hsp90 (중간패널) 및 Hsp90(N190△) (아래패널)과의 캡시드 형성을 보여주고, 선그래프 밴드 강도를 나타낸다. 강도는 BSA 와 Cp149 이량체를 15분간 반응한 결과를 표준으로 이값을 1로 하여 사용하였다. 실험은 3회 반복하였고, 에러바는 3회 실험 결과의 표준편차이다.
도 4는 Hsp90이 광범위한 온도에 걸쳐 HBV 코어 어셈블리를 촉진함을 보여주는 결과이다. (A)는 Cp149 이량체를 BSA (대조군 단백질; 왼쪽 패널)와 30℃에서 30분간 배양한 후, 30분간 온도를 바꾸어가면 배양하였다. ATP-γ-S(0.5mM)를 Hsp90에 30℃에서 추가하고 30분간 반응하였고(중간 패널), GA(2μM)를 Hsp90 에 추가하고 30℃에서 30분간 반응하였다 (오른쪽 패널). 각 혼합물을 Cp149 이량체와 도면에 표시된 다양한 온도에서 30분간 반응하였다. 대조군(C)은 Cp149 이량체만을 30℃에서 30분간 반응시킨 것이다. 생성된 캡시드의 양은 상기 혼합물을 15% SDS-PAGE에서 전기영동 한 후 항-HBV 코어 항체를 사용한 면역블롯으로 검출하였다. 아래의 그래프는 면역블롯 젤 사진의 밴드 강도를 정량하여 그래프로 나타낸 것으로, 대조군의 값을 1로 하였다. (B) Huh7 세포를 pCMV/Flag-core로 전달이입한 후, 30, 35, 37, 40. 및 43℃에서 2시간 동안, GA 처리 없이 (왼쪽 패널) 또는 4μM GA를 추가 (오른쪽 패널)한 후 배양하였다. 캡시드는 0.9% 아가로스 젤에 전기영동 후 항-FLAG M2 항체를 사용하여 면역블랏을 하였다. Hsp90, 베타엑틴 및 HBV 코어 단백질 발현은 15% SDS-PAGE에 전기영동 한 후 면역 분석하였다. 아래 그래프는 젤 사진의 각 밴드의 강도를 나타낸 것으로 왼쪽 패널에 기재된 37℃에서 배양된 시료의 밴드 강도를 1로 하고, 다른 값은 이것을 기준으로 표시하였다. 실험은 3회 반복하였고, 에러바는 3회 실험 결과의 표준편차이다.
도 5는 Hsp90이 계면활성제 처리조건에서 HBV 캡시드 분해(dissociation)를 억제함을 보여준다. 도 5a는 Cp149 이량체를 37℃에서 30분간 배양하여 캡시드를 형성한 후 여기에 (0-3M) 우레아를 추가한 후, BSA, ATP-활성화 Hsp90, 또는 GA로 처리된 Hsp90과 37℃에서 30분간 배양한 후, 0.9% 아가로스젤에서 전기영동 한 후 항-HBV 코어 항체 (윗 패널)로 면역블랏하고, 코마시블루로 염색(아래 패널) 한 결과이다. 도 5b는 (B) 캡시드를 BSA, ATP-활성화 Hsp90, 또는 GA로 처리된 Hsp90의 존재 중에서 상이한 농도의 SDS (0-0.5%)로 37℃에서 30분간 처리 한 후, 즉시 0.9% 아가로스젤 전기영동으로 분석한 결과이다. 코마시블루로 염색하여 캡시드 및 변성 캡시드를 정량하였다. 도 5a 및 5b에서 아래 그래프는 젤 상의 밴드 강도를 나타낸 것으로 C (계면활성제로 처리되지 않은 캡시드의 양)의 강도를 1로 하고, 다른 값은 이것과 대비하여 표시하였다. 실험은 3회 반복하였고, 에러바는 3회 실험 결과의 표준편차이다. 도 5c는 캡시드 전자 현미경 사진으로, C는 세제 미처리 시료, D는 3M의 우레아에서 GA로 불활성화된 Hsp90 또는 ATP-활성화 Hsp90로 처리된 캡시드 사진이고, E는 D와 동일한 조건에서 0.05% SDS로 처리된 경우 캡시드의 사진이다. 화살표는 계면활성제(SDS 또는 우레아)에 의해 분해된 캡시드를 나타낸다.
도 6은 Hsp90의 하향 발현과 억제가 HepG2.2.15에서 세포외 HBV DNA의 양을 감소시킨다는 것을 보여준다. (A) HepG2.2.15 세포를 GA 또는 3TC로 처리한 후, shRNA-Hsp90로 24시간 동안 전달이입 후, 세포를 융해하여 0.9% 비변성(native) 아가로스젤 전기영동으로 분석하여 HBV 캡시드 (윗패널) 및 15% SDS-PAGE로 분석하여 HBV 코어 단백질 (아래 패널)을 분석한 결과이다. (B) HBV 캡시드 밴드의 강도를 소프트웨어 (ImageMaster 2D Elite 4.01)로 분석 한 결과 (흑색 막대) 및 세포배양 배지의 HBV DNA를 정량 PCR로 분석한 결과 (회색 막대)(ABI 7300, Applied Biosystems)이다. (C) 세포 융해물을 15% SDS-PAGE에 전기영동후 항-Hsp90 항체 및 항-HBV 코어 항체를 사용한 면역블랏 분석 결과이다. 베타-엑틴을 대조군으로 사용하였으며, 실험은 3회 반복하였고, 에러바는 3회 실험 결과의 표준편차이다. NCshRNA: shRNA의 음성대조군 (pLK0.1-scramble vector).
도 7은 Hsp90 과 HBV 코어 단백질간의 결합부위를 보여주는 면역블랏 분석 결과이다. 도 7a는 일련의 Hsp90 결손 변이체 (왼쪽 패널)와 Cp149 이량체를 4℃에서 1시간 배양한 후 혼합물을 항-HBV 코어 항체 및 항-His 항체로 공동면역침전 후 동일한 항체로 면역블랏 분석한 결과(오른쪽 패널)이다. 도 7b는 일련의 Cp149 결손 변이체 (왼편 패널) 및 점돌연변이체 (C61A)과 Hsp90을 4℃에서 1시간 배양한 후 혼합물을 항-HBV 코어 항체 및 항-His 항체로 공동면역침전 후 동일한 항체로 면역블랏 분석한 결과(오른쪽 패널)이다. 인풋은 8% 총 단백질 혼합물이고, 대조군으로 사용되었다. IgG는 음성 대조군이다. 흰색 화살표: 관심 단백질. 흑색 화살표: 중쇄 및 경쇄. IP: 면역침전(Immunoprecipitation), IB:면연블랏(immmuno lot).

HBV 캡시드 어셈블리는 HBV 복제 및 HBV 형성에 필수적이다. 캡시드 어셈블리 과정에서 열충격단백질 및 단백질 카이나제와 같은 숙주 인자도 HBV pol/pgRNA 복합체와 함께 HBV 캡시드 안으로 패키징되어 HBV 복제를 가능하게 한다 (Bartenschlager and Schaller, 1992; Hirsch et al., 1990; Hu et al., 2004; Hu et al., 1997; Kann and Gerlich, 1994; Nassal, 1999). 숙주 인자 중 하나인 Hsp90은 HBV pol(polymerase)와 상호작용을 통해 폴리머라제의 프라이밍과 HBV pol/pgRNA 복합체 형성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 그러나 Hsp90과 HBV 코어 단백질간의 관계 및 캡시드 어셈블리에 미치는 영향에 대하여는 알려진 바가 없다.

본원에서는 숙주 인자인 Hsp90이 HBV 코어 단백질과의 상호작용을 통해 간염 바이러스의 캡시드 어셈블리를 촉매하고 그 분해를 억제하여, 궁극적으로 HBV 형성 및 생산을 촉진하며, 캡시드를 안정화시킴을 규명하였다. 나아가 이를 근거로 Hsp90의 억제 및 발현의 하향 조절이 HBV 생산 억제로 이어질 수 있음을 규명하였다. 따라서 본 발명에 따른 Hsp90을 표적으로 하는 물질은 HBV의 복제를 근본적으로 막아 간염바이러스로 인해 초래되는 각종 질환의 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있다. 이러한 관점에서 본 발명은 Hsp90 및/또는 이와 상호작용하는 단백질을 표적으로 하는 간염 바이러스 감염으로 인한 간질환 치료 시스템 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

한 양태에서 본원은 Hsp90 억제제를 포함하는 간염 바이러스로 인한 간질환 치료용 조성물을 제공한다. Heat Shock Protein 90 (Hsp90)은 90kDa의 샤파론 단백질로, N-말단의 ATP-결합 영역, 중간 영역 및 C-말단의 이량체화 영역으로 구성되어 있다 (Terasawa et al. 2005). Hsp90 기능은 ATP 의존적이며, 카이나제, 전사인자와 같은 세포내 다른 단백질과의 상호 작용을 통해 단백질 접힘(folding)에 관여한다 (Cho et al., 2000a, b; Hu et al., 2004).

본원에서 사용된 용어 "간질환"이란 바이러스 감염에 의한 급성 및 만성 간질환, 예를 들면 간염, 지방간, 간경변, 간암을 모두 포함하는 개념이다. 한 구현예에서, 간질환이란 B형 간염바이러스 감염에 의해 초래된 것이다.

본원에서 사용된 용어 "치료" 이란 질환, 또는 질환으로 인한 증상 또는 상태의 억제, 제거, 경감, 완화, 개선, 및/또는 예방을 포함하는 개념이다.

본원은 Hsp90을 표적으로 하는 HBV 생산의 억제와 관련된 것으로, 이러한 기능을 갖는 공지의 다양한 Hsp90 억제제가 본원의 발명에 포함된다. 예를 들면 본원의 억제제는 Hsp90의 발현 (전사 및 번역) 및/또는 활성을 억제할 수 있는 물질로서, 저분자 화합물, 항체 및 폴리펩타이드를 포함하는 단백질, 및 RNA와 DNA를 포함하는 핵산분자 또는 이들의 임의의 조합을 모두 포함하는 것이다. 본원에서 “발현”이란 유전자의 전사 및 전사체의 단백질로의 발현을 의미하며, “활성”이란 발현된 단백질이 세포내에서 제 기능할 수 있도록 하는 생물학적 작용을 의미한다. 본원의 한 구현예에서 Hsp90 억제제는 저분자 화합물로, 예를 들면 젤다나마이신 (Geldanamycin, benzoquinone ansamycin)과 그 다양한 유도체 또는 유사체, 예를 들면, 17-Allylamino-17-demethoxygeldanamycin, BDGA (4,4-difluoro-4-bora-3α,4α-diaza-s-indacene-geldanamycin) 및 그 유도체 또는 유사체를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 젤다나마이신은 Hsp90의 ATP 결합 영역에 결합하여, ATP 결합을 방해하고, 다른 단백질과의 상호작용을 억제한다. 이러한 기전으로 작용하는 공지의 물질은 물론 다른 기전에 의한 Hsp90 억제제가 본원에 포함된다.

본원의 다른 구현예에서, Hsp90 억제제는 이를 코딩하는 유전자의 전사 및/또는 전사체의 단백질 합성을 특이적으로 억제할 수 있는 안티센스 올리고큐늘레오타이드, siRNA(small interfering RNA), shRNA (small hairpin RNA) 또는 miRNA (microRNA)이다. siRNA, shRNA 및 miRNA는 RNA 간섭 (interference) 작용을 통해, 예를 들면 짧은 길이의 간섭 RNA (siRNA)가 서열 특이적으로 전사체에 결합하여, RISC(RNA Induced Silencing Complex)를 형성하여, 전사된 RNA가 세포내에 단백질로 발현될 수 없도록 (silencing) 한다. siRNA, shRNA 또는 miRNA는 그 표적 서열에 상당히 상보적인 서열을 갖는다. 상당히 상보적 서열이란, 표적 유전자의 적어도 연속적인 15 베이스 길이의 서열과 적어도 약 70% 상보성, 적어도 약 80% 상보성, 적어도 약 90% 상보성, 또는 약 100% 상보성을 의미한다. 한 구현예에서는 본원의 실시예에서 Hsp90의 사일런싱에 사용된 siRNA가 포함될 수 있으나 이로 한정하는 것으로 아니며, 표적 핵산에 결합하여 사일런싱의 기능을 하는 한 다양한 유래의 Hsp90 유전자를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및/또는 miRNA가 사용될 수 있으며, 이들의 생물학적 동등체, 유도체 및 유사체도 포함하는 것이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 바와 같으며, 예를 들면 표적 단백질의 임의의 코딩 서열에 결합하여, 표적 단백질의 발현을 억제/감소시키는 짧은 합성 핵산이다. 안테센스 RNA는 표적 유전자 및 전달 방법에 따라 적절한 길이를 가질 수 있으며, 예를 들면 약 6, 8 또는 10 내지 40, 60 또는 100 뉴클레오타이드이다. 한 구현예에서 siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이 및/또는 miRNA은 인간 Hsp90 유전자 유래로 예를 들면 인간 유래 Hsp90 유전자는 NM_007355 (GI:20149593), NM_003299 (GI:4507676), NM_001017963(GI:153792589), 또는 NM_005348 (GI:154146190)(NCBI Accesion number)이나 이로 제한하는 것은 아니다. Hsp90 단백질 서열은 GI: 56204416.0 (Embl: AL139392.10) NP_03181(GI: 20149594.0) 또는 NP_005339.3 (GI:154146191.0)을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서 본원에 사용된 Hsp90 유전자 서열은 NM_007355 단백질 서열은 NP_03181이다.

본원의 다른 구현예에서, Hsp90 억제제는 이를 특이적으로 인식할 수 있는 항체이다. 본원에서 사용된 용어 항체는 완전한 항체, 항체분자의 항원결합 단편 및 이들과 기능적으로 동등한 항체 또는 단편을 포함하는 것이다. 또한 본 발명의 항체는 IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 또는 IgY 타입일 수 있으며, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2 클래스 또는 그 하부클래스일 수 있다. 본 발명의 항체는 모노클로날, 폴리클로날, 키메라, 단쇄, 이특이성, 유인원화 및 인간화된 항체 및 이의 활성 단편을 포함하는 것이다.

본원의 다른 구현예에서, Hsp90 억제제는 그 활성 및/또는 작용/기전을 간섭, 방해 및 또는 억제할 수 있는 폴리펩타이드이다. 본원에서 사용된 용어 폴리펩타이드는 천연 또는 합성의 아미노산의 중합체를 일컫는 것으로 이러한 작용을 갖는 한 특정 길이를 지칭하는 것은 아니며, 펩타이드, 올리고펩타이드를 포함한다. 한 구현예에서 상기 폴리펩타이드는 표 1에 기재된 서열을 기준으로 Hsp90의 잔기 520 내지 615의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩타이드로, 이러한 폴리펩타이드는 정상적 Hsp90과 경쟁적으로 HBV 코어 단백질에 결합하여 정상적 Hsp90의 작용을 방해하는 역활을 하는 경쟁적 억제자로서 기능할 수 있다. 폴리펩타이드는 자연적 또는 인위적으로 변형된 것 예를 들면 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등으로 변형된 것도 포함한다.

본원의 치료제는 상기 언급한 Hsp90 억제제 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 본원의 치료제는 간질환의 치료 또는 예방을 위하여 단독으로, 또는 수술, 약물치료 및 생물학적반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 본원의 치료제는 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.

본원의 치료제의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 공지된 Hsp90 억제제의 투여방법을 적용할 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우 피부에 붙이는 패치형, 코/호흡기를 통해 투여할 수 있으며, 신속한 치료효과를 얻기 위해서는 정맥내 주사에 의한 투여가 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며, 공지된 Hsp90 억제제의 투여량을 적용할 수 있다. Hsp90을 표적으로 하는 siRNA, miRNA, 안테센스 올리고뉴클레오타이드, shRNA 제제 및 폴리펩타이드를 포함한 단백질 제제의 경우 비경구 투여가 선호될 수 있으나 다른 경로 및 수단을 배제하는 것은 아니다. 전형적인 약물의 경우 투약단위체는, 예를 들어 약 0.01 mg 내지 100 mg를 포함하나 상기 범위의 이하 및 이상의 범위를 배제하는 것은 아니다. 일일 투여량은 약 1μg 내지 10g 일 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

다른 양태에서 본 발명은 Hsp90와 코어 단백질간의 상호작용을 억제하여 간질환을 치료할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법으로, 본 방법에 의해 선별된 물질은 특히 간염바이러스 감염으로 인한 간질환 억제제/치료제로서 유용하다. 상기 방법은 Hsp90 및 코어 단백질을 제공하는 단계; 상기 단백질을 Hsp90 및 코어 단백질간의 상호작용을 억제할 것으로 기대되는 시험물질과 접촉시키는 단계; 및 상기 시험물질과 접촉된 단백질과 접촉되지 않은 대조군에서의 Hsp90와 코어 단백질간의 상호작용 정도를 비교하는 단계를 포함하는 Hsp90 및 코어 단백질간의 상호작용을 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

B형 간염바이러스의 코어 단백질은 어셈블리에 필요한 N-말단 영역(아미노산 1-149; Cp149)과 바이러스 복제를 조절하는 C 말단(아미노산 150-183 또는 185)으로 이루어진 두 개 영역의 183-185개 아미노산으로 구성되어 있다 (Seeger et al., 2000). C-말단의 34개 잔기가 잘려나간 Cp149는 적정한 조건이 되면 인비트로 및 인비보에서 캡시드를 형성한다 (Kim et al., 2001).

본원의 스크리닝 방법에 사용될 수 있는 Hsp90은 앞서 언급한 바와 같으며, Hsp90 및 코어 단백질은 스크리닝을 하는 구체적 방법에 따라 다양한 숙주 유래의 것이 본 방법에 사용될 수 있으며, 전장 또는 잘린 형태의 것이 모두 포함된다. 한 구현예에서 Hsp90은 표 1에 기재된 서열을 기준으로 적어도 잔기 520 내지 615를 포함한다. 다른 구현에에서 Hsp90은 표 1에 기재된 서열을 기준으로 적어도 잔기 520 내지 615의 전부 또는 일부를 포함한다. 또한 동일한 숙주, 예를 들면 인간에서 유래된 것이라도 특정 개인, 지역, 환경 등에 따라 서열변이가 있을 수 있으며, 이러한 것은 물론 일부 서열이 변형(결실, 치환, 부가)되었으나, 기능적으로 동등한 변이체가 모두 본 발명에 사용될 수 있다. 한 구현예에서는 사람을 숙주로 하는 B형 간염바이러스 유래의 것이다. 예를 들면, B형 간염 바이러스 코어 단백질의 유전자는 GenBank Accession No HQ684848 서열에 포함된 C 단백질 코딩 유전자 (1814-2452), 및 이에 의해 코딩되는 단백질 서열(ADV 29803.1), GenBank Accession No AB537951.1 및 이에 의해 코딩되는 단백질 서열 (BAJ53082.1), 또는 GenBank: BAE79771.1 또는 BAD91266.1을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 한구현예에서, 코어 단백질은 표 1의 서열을 기준으로 적어도 111-130 잔기를 포함한다. 다른 구현예에서, 코어 단백질은 표 1의 서열을 기준으로 잔기 111-130의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서 코어 단백질은 전장 대신 표 1의 서열을 기준으로 적어도 잔기 1 내지 149를 포함하는 것이 사용될 수 있다.

다른 구현예에서 본원의 스크리닝 방법에는, 전장 Hsp90 및 전장 또는 1-149 잔기의 HBV 코어 단백질 (전장 서열은 예시적으로 표 1의 서열), Hsp90 단백질은 상기 잔기 520 내지 615의 전부 또는 일부를 포함하며 HBV 코어 단백질은 전장 또는 1-149 잔기, 또는 Hsp90 단백질은 전장, HBV 코어 단백질은 상기 언급한 잔기 111-130의 전부 또는 일부를 포함하며, 또는 Hsp90 단백질은 상기 잔기 520 내지 615의 전부 또는 일부를 포함, HBV 코어 단백질은 잔기 1 -149 또는 상기 언급한 잔기 111-130의 전부 또는 일부를 포함하는 형태로 사용될 수 있다.

상기 본원에 사용되는 Hsp90 및 코어 단백질은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 특히 스크리닝에 사용되는 단백질의 제조방법은 유전자 재조합 기술을 이용하는 것이다. 예를 들면 상기 단백질을 코딩하는 상응하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 원핵 또는 진핵세포 세포 예를 들면 곤충세포, 포유류 세포에 전달하여 과발현 시킨 후 정제하여 사용할 수 있다. 상기 플라스미드는 예를 들면 본원의 예시적 구현예에서 사용한 것과 같은 pET28b(Novagen)과 같은 벡터에 해당 유전자를 클로닝하여 세포주에 전달이입한 후, 발현된 단백질을 정제하여 사용할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

또는 스크리닝에 사용되는 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 적당한 숙주 세포에서 발현시켜 그 세포 파쇄물을 만들거나 상기 스크리닝 단백질의 mRNA를 시험관내에서 번역한 후 당업계에 공지된 단백질 분리 방법에 의해 스크리닝 단백질을 정제할 수 있다. 통상, 세포잔여물(cell debris) 등을 제거하기 위해 상기 세포 파쇄물 또는 시험관내 번역한 결과물을 원심분리한 후, 침전, 투석, 각종 컬럼 크로마토그라피 등을 적용한다. 이온교환 크로마토그라피, 겔-퍼미에이션 크로마토그라피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 친화성 컬럼 등은 컬럼 크로마토그라피의 예이다. 친화성 컬럼은, 예를 들어, 항-스크리닝 단백질 항체를 이용하여 만들 수 있다.

상기 정제된 단백질의 접촉은 시험관내에서 이들을 직접 사용하여 시험물질의 부재 또는 존재하에서 결합여부를 확인할 수 있다. 이 경우 단백질은 검출의 편이를 위해 다양한 표식물질, 예를 들면 단백질 태그, 바이오틴, 형광물질, 아세틸화, 방사선 동위원소와 같은 것으로 공지된 방법 또는 시중의 단백질 표지 키트를 사용하여 표지될 수 있으며, 표지된 물질에 적합한 검출기기를 사용하여 검출될 수 있다. 단백질-단백질 상호작용은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면 세포내 단백질의 결합/상호작용을 확인하는 이스트투하이브리드법, 콘포칼현미경법. 공동면역침전법, 표면플라즈마공명 (SPR) 및 스펙트로스코피법을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니며, 이러한 방법에 관한 비교 및 자세한 실험법에 관한 추가의 참고문헌은 Berggard et al., (2007) "Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions", PROTEOMICS Vol7: pp 2833 - 2842에 기재된 것을 참고할 수 있다.

한 구현예에서, Hsp90 및 코어 단백질은 이를 발현하는 세포의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들면 Hsp90 및 코어 단백질을 발현(Transient 또는 Stable 전달이입 또는 내인성 발현)하는 포유류 세포, 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, HepG2, Huh7, Hep3B, PLC/PRF/5, 293T 세포를 세포배양 플레이트에 배양한 후, 여기에 시험물질을 첨가한 후, 일정 시간 후에 세포로부터, 총 단백질을 추출하여, 예를 들면 공동면역침전법, 면역형광법을 통하여 Hsp90과 코어 단백질간의 상호작용 여부를 확인할 수 있다. 대조군(시험물질을 처리하지 않은 경우)와 비교하여,Hsp90과 코어 단백질간의 상호작용을 억제한 것을 간질환 치료제 후보물질로 선별할 수 있다.

본 방법에서 사용되는 단백질의 양, 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다. 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 Hsp90과 코어 단백질간의 상호작용의 감소를 가져오는 물질을 상호작용을 억제하는 물질로 선별한다. 대조군과 비교 약 99% 이하 감소, 약 95% 이하 감소, 약 90% 감소, 약 85% 감소, 약 80% 감소, 약 75% 감소, 약 70% 감소, 약 65% 이하 감소, 약 60% 이하 감소, 약 55% 감소, 약 50% 이하 감소, 약 45% 이하 감소, 약 40% 이하 감소, 약 30% 이하 감소, 약 20% 이하 감소를 의미하나, 이를 벋어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.

본 발명에서 상호작용은 단백질 간의 접촉/결합을 일컫는 것으로서, 공유 및 비공유 결합에 의한 상호작용을 모두 포함하는 것이다. 본 발명에서 "시험물질"은 Hsp90 단백질과 코어단백질과의 상호작용(결합)을 억제할 것으로 기대되는 물질을 의미하여, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자(예컨대, DNA, RNA, PNA 및 앱타머), 단백질, 당 및 지질 등을 포함하나 이로 한정하는 것은 아니다. 상기 시험물질은 2개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 6개, 10개, 12개, 20개 이하 또는 20개 초과 예컨대 50개 아미산 잔기를 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 단백질은 Hsp90 또는 코어단백질에 대한 항체를 포함할 수 있다.

간질환의 발생을 억제, 치료 및/또는 예방하는 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.

본 방법의 단백질 간 상호작용은 세포외에서 형성된 HBV 핵산의 양으로 결정할 수 있다. 상호작용을 세포내에서 실험하는 경우 시험물질이 처리되지 않은 대조군과 비교하여 HBV 핵산의 양을 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. Hsp90과 코어단백질이 상호작용하는 경우, 다음 단계의 에셈블리 작용이 방해되어 결국 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 결국 생성된 HBV 양이 감소하게되고 이러한 효과를 갖는 화합물은 당연히 간질환 치료제 후보물질로 선별할 수 있다. 상기 HBV 핵산의 양은 공지의 다양한 방법, 예를 들면 실시간 정량, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 이러한 방법은 본원에 기재된 문헌리스트에서 적절한 것을 참고할 수 있다.

또한 본 방법의 단백질간 상호작용은 생성된 HBV 입자 또는 HBV 캡시드를 이루는 특정 단백질의 농도를 측정하여 결정할 수 있다. 예를 들면 본원에 기재된 문헌리스트에서 적절한 것을 참고할 수 있다. 또한 예를 들면 HBV 바이러스에서 추출한 폴리머라제와 그에 특이적인 항체 간의 "항원-항체 복합체" 형성을 이용한 방법, 웨스턴블랏, ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbant Assay), 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 조직면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS (Fluorescent Activated Cell Sorter), 단백질 칩 등을 들 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여, 대조군에서의 HBV 단백질 발현량과 시험물질이 처리된 시험군에서의 발현량을 비교하여 그 양을 감소시킨 물질을 Hsp90과 코어 단백질간의 상호작용을 억제할 수 있는 후보물질로 선별한다. 이러한 물질은 간암, 특히 B형 간염바이러스 감염으로 인한 간질환 치료/억제제로서 유용할 수 있다.

다른 양태에서 본 발명은 Hsp90 및 코어 단백질을 발현하는 세포를 제공하는 단계; 상기 세포를 시험물질과 접촉시키는 단계; 및 상기 시험물질과 접촉된 세포와 접촉되지 않은 대조군에서 상호작용의 정도 및/또는 생산된 HBV의 양(핵산, 및 또는 단백질)을 측정하고 상호 비교하는 단계를 포함하는 간질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 언급한 바와 같이 Hsp90 및 코어 단백질의 상호작용을 억제하는 물질은 간질환 치료제의 유용한 후보 물질이 될 수 있다. 본 방법에 사용될 수 있는 세포주는 앞서 언급한 바와 같으며, 특히, 동물세포, 더욱 특히는 간세포주, 더더욱 특히는 HepG2, Huh7, Hep3B, PLC/PRF/5가 사용되나 이로 제한하는 것은 아니다. 상기 세포주를 앞서 언급한 바와 같이 Hsp90을 발현하는 플라스미드 및 코어 단백질을 발현하는 플라스미드, 또는 상기 단백질을 모두 발현하는 플라스미드로 트랜스펙션한 후, 일정 시간, 예를 들면 48시간 후에 세포 배지에서 HBV를 추출하여, HBV 핵산의 양을 검출하여, 후보 물질로 처리되지 않은 대조군과 비교한다. 대조군과 비교하여 HBV 핵산의 양을 감소시킨 화합물이 본 발명에서 표적으로하는 간질환을 치료할 수 있는 물질이다. 세포 추출물에서 HBV 핵산의 농도를 측정하는 방법은 앞서 언급한 바와 같으며, 또는 본 실시예에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 시험물질의 양은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다. 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 대조군과 비교 약 99% 이하 감소, 약 95% 이하 감소, 약 90% 감소, 약 85% 감소, 약 80% 감소, 약 75% 감소, 약 70% 감소, 약 65% 이하 감소, 약 60% 이하 감소, 약 55% 감소, 약 50% 이하 감소, 약 45% 이하 감소, 약 40% 이하 감소, 약 30% 이하 감소, 약 20% 이하 감소를 의미하나, 이를 벋어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.

본 발명은 달리 언급이 없는 한 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학, DNA 재조합기술, 및 면역학 분야의 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 또한 일반적인 기술에 관한 보다 자세한 설명은 다음의 책 및 문헌을 참조할 수 있다. 분자생물학 및 생화학에 관한 일반적인 방법에 관해서는 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (Hames and Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller and Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (Ausubel et al., eds.); 및 Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press)등을 참조할 수 있다. 또한 Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller and Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al., eds.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (Weir and Blackwell, eds., 1986); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley &Sons 1996); Non-viral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplitt &Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley &Sons 1998)을 참조할 수 있다. 세포배양 및 배지에 관한 일반적 기술에 관하여는 Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997), 148); Serum-free Media (Kitano, Biotechnology 17 (1991), 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991), 375); 및 Suspension Culture of Mammalian Cells (Birch et al., Bioprocess Technol. 19 (1990), 251)을 참조할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험재료 및 방법

세포배양 및 전달이입( transfection )

인간 간암세포주, Huh7 및 HepG2.2.15는 10% 소태아혈청(FBS, Invitrogen, USA)을 포함하는 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Welgene, Korea)에서 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포는 Fugene 6 (Roche, Germany)를 제조자의 지시대로 사용하여 전달이입하였다.

Cp149 , Cp149 점돌연변이 구축 및 p23 단백질의 발현 및 정제

Cp149 는 pET30a 벡터 (Novagen, USA)에 클로닝 한 후 이를 BL21(DE3)+ pLysS E. coli (Novagen)에 형질전환한 후, 종전에 기술된 바와 같이 단백질을 분리하였다 (Choi et al., 2005). 코어단백질 점돌연변이인 C61A (61 번째 시스테인 잔기가 알라닌 잔기로 치환)는 사이트디렉티드 돌연변이 프로토콜(Qiagen, Germany)을 사용하여 구축하였다. pCMV/Flag-core (Kang et al., 2008)를 주형으로 하여, 포워드 프라이머 (F) 5'-CAGGCAAGCTATTCTGGCTTGGGGTGAGTTGATG-3'와 리버스 프라이머 (R) 5'CATCAACTCACCCCAAGCCAGAATAGCTTGCCTG-3'를 사용하였다.

정제된 코어 단백질 이량체는 단백질을 안정하게 보관할 수 있는 100 mM glycine (pH 9.5)에 보관하였다. Cp149 어셈블리의 경우, 반응 완충액 (50 mM Hepes (pH 7.5), 5 mM MgCl₂, 15 mM NaCl, 및 10 mM CaCl₂)을 Cp149와 혼합하여 37℃에서 30분간 반응하였다 (Choi et al., 2005 참조). p23 단백질은 pET28b 벡터 (Novagen)에 클로닝 한 후 이를 BL21(DE3) + pLysS E. coli (Novagen)에 형질전환한 후, 종전에 기술된 바와 같이 단백질을 분리하였다 (ibid).

Cp149 결손 변이체 구축, 발현 및 정제

도 7b에 기재된 바와 같은 Cp149 결손 변이체는 pET30a vector (Novagen)에 클로닝 한 후, BL21(DE3) + pLysS E. coli (Novagen)으로 형질전환 한 후 발현 정제 하였다 (Choi et al., 2005). 결손 변이체는 pCMV/Flag-core (Kang et al., 2008) 를 주형으로 하여 하기와 같은 프라이머 세트(포워드-F, 리버스-R)를 사용하여 증폭하였다: Cp130 (1-130), F-5'-CGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG-3', R-5'-GCCGTCGACTAGGGAGGAGTGCGAATCC-3'; Cp111 (1-111), F-5'- CGGAATTCATGGACATTGACCGTATAAAG-3', R-5'-GCCGTCGACTATCCAAAAGTAAGGCAGG-3'.

Hsp90 및 Hsp90 결손 변이체 구축, 발현 및 정제

인간 Hsp90β는 종전에 기술된 바와 같이 pET28b 벡터 (Novagen)에 클로닝하였다 (Cho et al., 2000a). 인간 Hsp90 결손변이체는 pET28b (Cho et al., 2000a,b)에 직접 클로닝하여 사용하였으며, pET28b-Hsp90β를 주형으로하고 다음과 같은 프라이머 세트를 사용하여 PCR로 증폭한 후 이를 클로닝하였다: N190△(191-724), F-5'-GCGGTCGACCAGAGTACCTAGAAGAGAGG-3', R-5'-CCGCGGCCGCCTAATCGACTTCTTCC-3'; N327△(328-724), F-5'-ACGAATTCAGGGCATTGCTA-3', R-5'-CCGCGGCCGCCTAATCGACTTCTTCC-3'; N413△(414-724), F-5'-ACGAGCTCTTCTCTGAGCTG-3', R-5'-CCGCGGCCGCCTAATCGACTTCTTCC-3'; C520△(191-519), F-5'-GCGGTCGACCAGAGTACCTAGAAGAGAGG-3', R-5'-ACGCGGCCGC TTACTCGTCAATGGGCTCGGTC-3'; C616△(191-615), F-5' GCGGTCGACCAGAGTACCTAGAAGAGAGG-3', R-5'-ACGCGGCCGCTTAGGAGTTGTCCCGAAGTGC-3'. 이 구축물은 6개의 히스티딘 태그가 Hsp90의 N 말단에 추가되었으며 (Cho et al., 2000b), Hsp90 결손 돌연변이체는 2xYT (Yeast Extract Tryptone) 배지에서 E. coli BL21(DE3)세포를 사용하여 과발현하였다. 요약하면 1mM 아이소프로필-β-D-씨오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 세포 배양물에 추가하고, 추가로 22℃에서 20 시간 배양하여 단백질 발현을 유도하였다. 이어 세포를 융해완충액 (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 500 mM NaCl, 5% (v/v) 글리세롤)에서 융해한 후 18,000g에서 60분 원심분리하였다. 상층액을 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 아가로스 (Qiagen) 친화성 컬럼에 걸고, 단백질을 500mM 이미다졸을 포함하는 융해완충액으로 용출하였다.

HBV 코어 단백질과 Hsp90 의 공동면역침전

HBV 코어 단백질과 Hsp90의 공동면역침전 (Co-IP)을 위해, Huh7 세포를 pCMV/Flag-core로 전달이입하였다. 48시간 후에, 세포를 융해완충액에서 융해하고, 마우스 모노클로날 항-HBV 코어 항체 (Ab)(Santa Cruz, sc-23945)와 염소 폴리클로날 항-Hsp90 Ab(Santa Cruz, sc-1057)를 4℃에서 2시간 동안 첨가하여 공동면역침전하였다. 면역침전된 융해물을 15% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)-PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)에서 전기영동한 후, 마우스 모노클로날 항-FLAG M2 Ab (1:5000; Sigma, F3165) 및 염소 폴리클로날 항-Hsp90 Ab (1:1000; Santa Cruz, sc-1057)로 웨스턴블랏을 수행하였다. Cp149 이량체 또는 캡시드와 Hsp90과의 공동면역침전의 경우, 20μM의 Cp149 이량체 또는 캡시드를 20μM 의 Hsp90에 첨가한 후 시료를 30℃에서 1시간동안 반응시켰다. Cp149 이량체 (또는 캡시드)와 Hsp90은 상기 언급한 바와 같이 공동면역침전하였다. 웨스턴블랏은 래빗 폴리클로날 항-HBV 코어 Ab (1:4000; Dako, B0586) 및 염소 폴리클로날 항-Hsp90 Ab (1:1000; Santa Cruz, sc-1057)을 사용하여 수행하였다.

Hsp90 과 HBV 코어 단백질의 결합 분석

Hsp90와 HBV Cp149 이량체 및 캡시드와의 결합을 분석하기 위해 5μg의 His-tagged Hsp90를 100 ㎕의 Ni-NTA 아가로스와 4℃에서 1시간 동안 결합시켰다. Hsp90-Ni-NTA 복합체를 컬럼의 아랫부분을 잠근 상태에서 컬럼에 적하하고, 아래부분을 열어 액체가 빠지도록 하였다. 이어 5 μg의 각 Cp149 이량체 및 캡시드를 컬럼에 추가하였다. Ni-NTA 아가로스 커플된 단백질을 TN 완충액 (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl)으로 4회 세척하고, 500 mM 이미다졸을 포함하는 TN 완충액으로 용출하였다. 용출물은 15 % SDS-PAGE에서 전기영동한 후 염소 폴리클로날 항-Hsp90 Ab (1:1000; Santa Cruz, sc-1057)와 래빗 폴리클로날 항-HBV 코어 항체 (1:4000; Dako, B0586)를 사용하여 웨스턴블랏을 수행하였다.

슈크로스 밀도구배 분석 및 닷블랏 분석

37℃의 반응완충액 중에서 30분 동안 어셈블리 반응을 수행하였다. 어셈블리 후, 20℃에서 4시간 30분 동안 160,000 X g로 초원심분리(P55ST2 로터 CP-100α)(Hitachi Koki Co., Ltd, Tokyo, Japan)를 수행하여 슈크로스 밀도구배 분석을 수행하였으며, 50 mM Hepes (pH 7.5) 중에 10.50% (w/v) 슈크로스 밀도구배를 포함한다. 이어 분획을 수집하여 15% SDS-PAGE에서 전기영동을 수행한 후, 래빗 폴리클로날 항-HBV 코어 항체 (1:4000; Dako, B0586)와 염소 폴리클로날 항-Hsp90 Ab (1:1000; Santa Cruz, sc-1057)를 사용하여 웨스턴블랏을 수행하였다. 닷(dot)블랏은 Bio-Dot Microfiltration Apparatus manual (Bio-Rad Laboratories Inc., USA)에 따라 수행하였다.

비변성 아가로스 젤 전기영동을 이용한 HBV 캡시드 검출

HBV 캡시드 형성에 미치는 Hsp90의 영향을 규명하기 위하여, 20μM Cp149 이량체 및 20μM Hsp90을 20 mM Na₂MoO₄, 1 mM DTT, 0.01% NP-40, 및 0.5 mM 아데노신 5'-O-(3-씨오트리포스페이트) (ATP-γ-S)을 포함하는 반응 완충액 중에서, 37℃, 30분간 반응을 수행하였다(Sullivan et al., 1997 참조). 반응 후 0.9% 비변성 아가로스 젤에 전기영동으로 단백질을 분리하고, 래빗 폴리클로날 항-HBV 코어 항체 (1:4000; Dako, B0586)로 웨스턴블랏을 수행하였다(Kang et al., 2006 참조). 캡시드 밴드는 ImageMaster 2D Elite software 4.01 (Amersham Pharmacia Biotechnology)로 분석하였다.

Huh7 세포에서 Hsp90 억제제로의 처리 및 온도 변화

Hsp90 억제제, 젤다나마이신 (GA; 4 μM, A.G. Scientific, Inc., USA)를 Huh7 세포에 추가한 후, 세포를 코어 단백질을 발현하는 pCMV/Flag-core로 전달이입하였다. 이어 세포를 30, 35, 37, 40, 및 43℃ 온도의 CO₂ 인큐베이터에서 2시간 동안 두어 열충격을 주었다. 이어 세포를 융해완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 및 0.5% NP-40)에서 융해하고, 16,000Xg에서 15분동안 원심분리하여, 세포 파편을 제거하였다. 상층액을 0.9% 비변성 아가로스 젤에서 전기영동을 한 후 모노클로날 항-FLAG M2 Ab (1:5000; Sigma, F3165)로 웨스턴블랏을 수행하였다.

우레아 및 SDS 처리 후 HBV 캡시드 안정성 여부 검출

어셈블한 Cp149 및 Hsp90를 우레아 (0.3M) 또는 SDS (0.1%)에서 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 시료를 이어 0.9% 비변성 아가로스 젤에서 전기영동을 한 후 래빗 폴리클로날 항-HBV 코어 항체(1:4000; Dako, B0586)로 웨스턴블랏을 수행하였다.

우레아 및 SDS 처리 후 HBV 캡시드 와해의 검출을 위한 투과전자현미경

Cp149 인비보 어셈블리를 수행한 후 우레아 및 SDS 처리를 하였다. 네가티브 염색의 경우, 어셈블된 Cp149를 포함하는 10㎕의 용액을 카본코팅된 그리드에 적용한 후 1분 동안 두었다. 이어 그리드를 2% 우라닐 아세테이트로 1분간 염색하고 물로 세척하였다. JEM 1010 (JEOL, Tokyo, Japan)를 사용하여 80 kV에서 투과전자현미경 사진을 촬영하였다(NICEM (National Instrumentation Center for Environmental Management, Korea).

실시간 정량 PCR 를 이용한 HBV DNA 의 정량

HepG2.2.15 세포를 4μM GA 또는 85μM 라미부딘 (3TC) (HBV pol 억제제)로 처리하고 (Allen et al., 1998; Doong et al., 1991; Severini et al., 1995). shRNA-Hsp90 (Sigma, MISSION shRNA NM_007355)로 전달이입하였다. 음성 대조군의 경우 pLK0.1 플라즈미드를 사용하였다. 24시간 후에, 배지를 수집하여, 방출된 HBV 바이러스를 모았다. 페놀 추출 후, DNA는 에탄올로 침전하였다. 추출된 DNA와 실시간 PCR SYBR 그린반응 혼합물(Qiagen, USA)과 혼합하였다. 반응 혼합물은 가양성을 방지하기 위해 HotStar Taq 폴리머라제를 포함하고 있으며, 사용한 프라이머는 포워드 5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3′및 리버스 5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3′이었다. 상기 프라이머는 HBV 유전체의 379 내지 476 부위를 증폭하여 98bp 산물을 생성한다. PCR 조건은 95℃에서 15 분 후, 94℃에서 15초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 30초를 한 주기로 40회를 반복하였다. HBV 농도는 Guidotti et al., 1995에 기술된 pHBV 1.2 x를 5.28 x 10⁶ 카피/ml (cpm), 5.28 x 10⁵ cpm, 5.28 x 10⁴ cpm, 5.28 x 10³cpm, 5.28 x10² cpm과 같이 연속적으로 희석하여 이에 대한 표준농도 커브를 작성하여 이에 비교하였다.

실시예 1 Hsp90 과 HBV 코어 단백질 이량체와의 결합 및 결합 부위 확인

Hsp90와 HBV 코어 단백질과의 결합여부를 규명하기 위하여, 공동면역침전(co-IP) 분석을 수행하였다. 결과는 도 1의 A에 있으며, 두 단백질간의 결합을 나타낸다. 두 단백질 간의 결합 위치를 파악하기 위하여 정제된 단백질을 사용하여, co-IP 분석을 수행한 결과, Hsp90은 Cp149 이량체에 결합하며(도 1의 B 및 C 윗패널), 캡시드 표면에는 결합하지 않는 것으로 나타났다 (도 1의 B 및 C 아래 패널).

Hsp90과 HBV Cp149 상의 결합부위를 확인하기 위하여, 실험 재료 및 방법 부분에 기재된 바와 같은 각 단백질에서 일련의 결손 변이체를 제작하여 결합부위를 확인하였다. Hsp90 상의 결합부위 확인을 위해서는 이의 결손 변이체와 Cp149를 혼합하여 배양하고, Cp149 이량체 상의 결합부위 확인을 위해서는 이의 결손 변이체와 Hsp90을 혼합하여 배양하였다. 결과는 도 7a 및 7b에 있다. 잔기는 하기 표 1에 기재된 서열을 기준으로 한다. 도 7에서 보는 바와 같이 Hsp90의 520 내지 615 잔기와 Cp149 이량체의 111-130 잔기가 결합부위임을 확인하였다.

	서열
HSP90 Beta (인간)	1 mpeevhhgee evetfafqae iaqlmsliin tfysnkeifl relisnasda ldkiryeslt 61 dpskldsgke lkidiipnpq ertltlvdtg igmtkadlin nlgtiaksgt kafmealqag 121 adismigqfg vgfysaylva ekvvvitkhn ddeqyawess aggsftvrad hgepigrgtk 181 vilhlkedqt eyleerrvke vvkkhsqfig ypitlyleke rekeisddea eeekgekeee 241 dkddeekpki edvgsdeedd sgkdkkkktk kikekyidqe elnktkpiwt rnpdditqee 301 ygefyksltn dwedhlavkh fsvegqlefr allfiprrap fdlfenkkkk nniklyvrrv 361 fimdscdeli peylnfirgv vdsedlplni sremlqqski lkvirknivk kclelfsela 421 edkenykkfy eafsknlklg ihedstnrrr lsellryhts qsgdemtsls eyvsrmketq 481 ksiyyitges keqvansafv ervrkrgfev vymtepidey cvqqlkefdg kslvsvtkeg 541 lelpedeeek kkmeeskakf enlcklmkei ldkkvekvti snrlvsspcc ivtstygwta 601 nmerimkaqa lrdnstmgym makkhleinp dhpivetlrq kaeadkndka vkdlvvllfe 661 tallssgfsl edpqthsnri yrmiklglgi dedevaaeep naavpdeipp legdedasrm 721 eevd
HBV 코어 단백질 (인간)	1 mdidpykefg asvellsflp sdffpsirdl ldtasalyre alespehcsa hhtalrqail 61 cwgelmnlat wvgsnledpa srelvvsyvn vnmglklrqi lwfhiscltf gretvleylv 121 sfgvwirtpq ayrppnapil stlpettvvr rrgrsprrrt psprrrrsqs prrrrsqsre 181 sqc

상기 아미노산 서열은 단일문자 코드로 나타내었으며, 단일문자에 상응하는 아미노산은 당업계에 공지되어 있다.

실시예 2 Cp149 이량체와의 결합을 통한 Hsp90 의 HBV 로의 혼입

Hsp90을 Cp149 이량체와 혼합하여, 슈크로스 밀도 구배 분석을 한 결과, Hsp90 은 분획 8 내지 10에서 관찰 되었다. 어셈블리 반응 후에는 상기 분획에서 캡시드로 역시 관찰되었다 (도 2의 A). Hsp90을 BSA (대조군)과 혼합한 경우는 분획 2 내지 4에서 관찰이 되었다 (결과는 나타내지 않음). 분획 3 및 8 각각 두 개의 시료를 비변성 및 변성 조건에서 분석하여 Hsp90이 캡시드로 패키징되어 들어가는 것을 확인하였다. SDS-PAGE를 보면 Hsp90이 분획 3 및 8에 존재하고 있음을 알 수 있다 (도 2의 B, 레인 3 및 4, 아래 패널). 그러나, 닷블랏 및 비변성 아가로스젤 분석에서는 캡시드의 형성을 방해하지 않으며, 분획 3 및 8에서 Hsp90이 검출되지 않음을 알 수 있다 (도 2의 B, 윗 및 중간 패널). Hsp90이 캡시드의 안에 위치하고 있기 때문에 분획 8에서는 검출되지 않을 수 있다. 비변성 아가로스 젤 전기영동은 단지 캡시드만을 검출할 수 있기때문에, Cp149는 단지 분획 8에서만 검출가능하다 (도 2의 B, 중간 패널의 레인 4). 추가로 닷블랏 분석을 통해 Hsp90이 어셈블리 과정에서 캡시드 안으로 혼합되는 것을 보여주기 위해 Cp149 이량체 (도 2의 C)를 검출하였다. 상기 결과로부터 Cp149 이량체에의 결합을 통해 Hsp90이 캡시드로 패기징됨을 알 수 있다.

실시예 3 활성화된 Hsp90 에 의한 HBV 코어 단백질 어셈블리 촉진

HBV 코어 어셈블리는 각 서브유니트의 61번째 아미노산 간의 시스테인 다이설파이드 결합을 통한 Cp149 호모다이머를 형성으로 시작한다 (Nassal et al., 1992; Zheng et al., 1992). Hsp90 활성은 단백질 p23 결합 및 ATP를 필요로 하며, 이러한 활성은 클라이언트 단백질의 성숙을 촉진한다(Sullivan et al., 1997; Woo et al., 2009). 활성화된 Hsp90이 HBV 코어 어셈블리에 영향을 미치는지 여부를 규명하기 위하여, Cp149 이량체 또는 점돌연변이 (C61A) 코어 단백질과의 어셈블리 반응을 Hsp90의 존재 중에서 수행하였다. 도 3의 A에 나타난 바와 같이, 활성화된 Hsp90은 Cp149 이량체뿐만이 아니라 C61A의 형성을 촉진하였다; 그러나, C61A 캡시드는 Hsp90이 없거나, Hsp90이 GA처리로 인해 불활성화된 경우에는 형성되지 않았다 (도 3a의 B 참조). 추가로 슈크로스 밀도구배 분석을 통해 캡시드 형성이 ATP 활성화된 Hsp90의 존재 중에서는 증가하였으나, BSA 또는 GA에 의해 불활성화된 Hsp90에 의해서는 영향을 받지 않았다 (도 3b의 C). 활성화된 Hsp90에 의한 HBV 코어 어셈블리 활성을 재확인하기 위해, 활성화된 Hsp90, Hsp90 돌연변이(N190Δ- ATPase 부위 결손) 및 BSA (대조군)을 독립적으로 Cp149에 추가하고, 시간경과에 따른 캡시드 형성을 조사한 결과, 활성화된 Hsp90의 존재에서 캡시드 형성이 Hsp90 돌연변이체 또는 BSA와 비교하여 신속하게 진행되었음을 알 수 있다. Hsp90 결손 돌연변이체 (N190Δ)와 BSA의 경우는 120분에 포화되기까지 서서히 진행되었다 (도 3b의 D). 어셈블리 반응 후 15분째 Cp149 이량체의 강도를 1로 두고 이에 비교한 다른 밴드의 상대적 강도를 계산하여 그래프로 나타냈다. 동일한 양의 Cp149를 사용하였기때문에, 모든 시료에서 캡시드 형성은 120분에서 포화된 것이다(도 3b의 D. 오른쪽 그래프)

실시예 4 온도변화에 따른 활성화된 Hsp90 에 의한 HBV 캡시드 형성의 조절

도 3의 결과는 활성화된 Hsp90이 캡시드의 형성을 촉진한다는 것을 증명한다. Hsp90 활성은 온도에 의한 스트레스-단백질 응집을 억제하고, 폴딩되지 않은 단백질의 더이상의 폴딩지연을 방지하고 신속한 회복을 돕는 것으로 알려져 있다 (Freeman and Morimoto, 1996; Yonehara et al.,1996). HBV 코어 단백질로부터 HBV 캡시드 형성은 온도 의존적이다 (Hilmer et al., 2008). 따라서 활성화된 Hsp90의 온도 변화에 따른 HBV 캡시드 형성에 미치는 영향을 규명하기 위하여, (1) Cp149 이량체 및 BSA (대조군), (2) Cp149 이량체 및 활성화된 Hsp90, 및 (3) Cp149 이량체 및 GA 처리된 Hsp90의 존재하에서 일정 온도 범위에 걸친 캡시드 형성을 인비트로에서 조사하였다. 대조군의 경우 캡시드 형성은 37℃에서 가장 높았다 (도 4의 A, 왼쪽 패널). Cp149 이량체 및 활성화된 Hsp90을 사용한 경우, 캡시드 형성은 30℃ 부터 43℃까지의 넓은 온도 범위에서 피크를 나타냈으며, 양은 대조군과 비교하여 두 배였다 (도 4의 A, 중간 패널). 캡시드 어셈블리가 활성화된 Hsp90에 전적으로 의존하는지 여부를 규명하기 위해, Hsp90 및 Cp149 이량체에 GA를 추가하였다. GA로 처리된 경우, Hsp90의 효과가 사라졌고, Cp149 및 BSA를 사용한 경우와 동일한 결과를 얻었다(도 4의 A, 오른쪽 패널). 세포에서 Hsp90이 다양한 온도에서 HBV 캡시드 형성에 미치는 영향을 규명하기 위하여, pCMV/Flag-core를 Huh7으로 전달이입한 후, 세포를 GA로 처리하였다. 열충격을 가한 후, HBV 캡시드 양은 웨스턴 블랏으로 측정하였다. 정제된 단백질을 사용한 결과 (도 4의 A)와 대조적으로, GA로 처리되지 않은 세포에서의 캡시드 형성 정도는 온도와 상관없이 일정하였다 (도 4의 B, 왼쪽 패널). 이는 전달이입 후 48시간에 캡시드 형성이 포화되었기 때문이다. 하지만 GA 처리 후 열충격은 캡시드 형성에 영향을 미쳤는데, 캡시드 형성 정도가 37℃의 경우를 제외하고는 테스트한 모든 온도에서 GA 처리되지 않은 세포에서의 캡시드 형성과 비교하여 상대적으로 감소하였다. Hsp90만을 가지고 실험한 결과도 유사하였다(결과는 나타내지 않음). GA로 불활성화된 Hsp90은 온도 의존적인 캡시드 형성을 촉진시킬 수 없었으며, 이는 정제된 단백질을 사용한 실험과 유산한 패턴이다. 이러한 결과는 30℃ 내지 43℃의 범위에서 캡시드 형성을 안정화시킨다는 것을 증명한다.

실시예 5 활성화된 Hsp90 에 의한 계면활성제에 의한 HBV 캡시드 분해 억제

캡시드를 다양한 농도의 우레아 및 SDS로 37℃에서 30분간 처리하였다. 3M d우레아로 처리한 경우, 활성화된 Hsp90은 Hsp90이 없는 경우(도 5a의 A 왼쪽 패널) 및 GA로 처리된 Hsp90이 존재하는 경우(도 5a의 오른쪽 패널)와 비교하여 2.7배 높은 캡시드 농도를 유지하였다(도 5a의 A 중간 패널). 0.05% SDS 처리 후 캡시드 농도는 음성 대조군 (BSA)(도 5b, 왼쪽 패널) 및 GA 처리된 Hsp90의 존재시(도 5b, 오른쪽 패널)과 비교하여 활성화된 Hsp90 존재시 2.4배 더 높았다 (도 5b 중간패널). Hsp90에 의한 캡시드 분해에 대한 이러한 보호효과는 SDS의 농도가 0.1%를 초과한 경우 사라졌으며, 이 지점을 지나면 모든 캡시드가 분해되는 것으로 나타났다 (도 5b). 세제 처리에 반응한 HBV 캡시드 분해를 모니터링하기 위해 인비트로에서 조립되고 세제로 처리된 Cp149 이량체를 종전에 기술된 바와 같이 투과전자현미경으로 관찰하였다 (Astheimer et al.). 종전 보고에 의하면 Cp149 이량체는 크기가 약 30nm 인 것으로 나타났다(Newman et al., 2003). 본 실험의 TEM 결과에 의하면 활성화된 Hsp90의 존재 및 비처리 대조군의 경우 컴팩트한 평균 직경 30nm의 구형의 캡시드가 관찰되었다 (도 5c의 C, D 및 E, 각각 평균 직경, 30.5 nm, 30.75 nm, 및 30.87 nm). 그러나 GA 불활성화된 Hsp90의 존재시, 형성된 95%의 캡시드는 불규칙한 복합체로 또는 쭈글어드는 모양의 캡시드를 형성하였으며(도 5c의 D), 42%는 팽창하는 모양의 캡시드 였다 (도 5c의 E). 이러한 결과는 활성화된 Hsp90이 세제로 인한 HBV 캡시드 분해도를 감소시키는 것을 증명하는 것이다.

실시예 6 Hsp90 억제 및 하향 조절에 의한 세포외 HBV DNA 양의 감소

HepG2 세포 유래의 HepG2.2.15 세포는 HBV (Liu et al., 2009)를 생산한다. Hsp90 억제 및 하향 조절 후에 HBV DNA양을 측정하였다. 이를 위해 HepG2.2.15 세포를 GA로 처리한 후 shRNA-Hsp90로 전달이입하였다. 24시간 후에, 세포배양 배지에서 HBV DNA를 분리하여 실시간 정량 PCR (qRT-PCR)로 정량하였다. 처리되지 않은 HepG2.2.15 세포와 비교하여 GA 처리된 세포 및 shRNA-Hsp90 처리된 세포에서 형성된 세포내 캡시드 양은 각각 53% 및 49% 감소하였으며(도 6의 A, 레인 3 및 4), 세포외 HBV DNA 양 또한 감소하였다 (도 6의 B, 레인 3 및 4, 각각 50% 및 48% 감소). 이어서, HepG2.2.15 세포를 라미부딘(3TC)으로 24시간 처리하여 HBV 폴리머라제 (pol) 활성을 억제하였다. 세포외 HBV DNA는 83% 감소하였다 (도 6의 B, 레인 5). 그러나 캡시드 어셈블리에는 변화가 없었다 (도 6의 A, 레인 5). 이 결과는 3TC에 의한 폴리머라제 활성의 억제가 세포질에서 HBV DNA 합성을 억제하여 세포외 HBV DNA 농도를 감소시키지만 캡시드 어셈블리에는 영향을 미치지 않음을 나타내는 것이다. 나아가 HepG2.2.15 세포를 3TC 및 GA로 동시에 처리한 경우, 3TC 단독으로 처리한 경우와 비교하여 세포내 캡시드 및 세포외 HBV DNA의 양이 각각 62% 및 63% 감소하였다 (도 6의 B, 레인 6). 이러한 결과는, 폴리머라제 활성이 3TC에 의해 억제된다는 전제하에, Hsp90 억제에 의한 감소된 세포내 캡시드 농도가 세포외 HBV DNA 양에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. shRNA-Hsp90 전달이입된 시료를 제외하고, Hsp90 농도는 모든 시료에서 동일하였다. 베타-엑틴이 대조군으로 사용되었다 (도 6의 C). 이러한 결과는 Hsp90이 HBV 폴리머라제 활성뿐만아니라 캡시드 어셈블리를 통해 세포외 HBV DNA의 양에 영향을 미치는 호스트 인자임을 증명하는 것이다.

참조문헌

Ahn, S. H., Y. N. Park, et al. (2005). Long-term clinical and histological outcomes in patients with spontaneous hepatitis B surface antigen seroclearance." J Hepatol 42(2): 188-94.

Allen, M.I., Deslauriers, M., Andrews, C.W., Tipples, G.A., Walters, K.A., Tyrrell, D.L., Brown, N., Condreay, L.D.,

1998. Identification and characterization of mutations in hepatitis B virus resistant to lamivudine. Lamivudine Clinical Investigation Group. Hepatology 27, 1670-1677.

Astheimer, L.B., Buttemer, W.A., Wingfield, J.C., 1995. Seasonal and acute changes in adrenocortical responsiveness in an arctic-breeding bird. Horm Behav 29, 442-457.

Bartenschlager, R., Schaller, H., 1992. Hepadnaviral assembly is initiated by polymerase binding to the encapsidation signal in the viral RNA genome. EMBO J 11, 3413-3420.

Cho, G., Park, S.G., Jung, G., 2000a. Localization of HSP90 binding sites in the human hepatitis B virus polymerase. Biochem Biophys Res Commun 269, 191-196.

Cho, G., Suh, S.W., Jung, G., 2000b. HBV polymerase interacts independently with N-terminal and C-terminal fragments of Hsp90beta. Biochem Biophys Res Commun 274, 203-211.

Choi, Y., Gyoo Park, S., Yoo, J.H., Jung, G., 2005. Calcium ions affect the hepatitis B virus core assembly. Virology 332, 454-463.

Doong, S.L., Tsai, C.H., Schinazi, R.F., Liotta, D.C., Cheng, Y.C., 1991. Inhibition of the replication of hepatitis B virus in vitro by 2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine and related analogues. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 8495-8499.

Freeman, B.C., Morimoto, R.I., 1996. The human cytosolic molecular chaperones hsp90, hsp70 (hsc70) and hdj-1 have distinct roles in recognition of a non-native protein and protein refolding. EMBO J 15, 2969-2979.

Hilmer, J.K., Zlotnick, A., Bothner, B., 2008. Conformational equilibria and rates of localized motion within hepatitis B virus capsids. J Mol Biol 375, 581-594.

Hirsch, R.C., Lavine, J.E., Chang, L.J., Varmus, H.E., Ganem, D., 1990. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as wel as for reverse transcription. Nature 344, 552-555.

Hu, J., Toft, D.O., Seeger, C., 1997. Hepadnavirus assembly and reverse transcription require a multi-component chaperone complex which is incorporated into nucleocapsids. EMBO J 16, 59-68.

Hu, J., Flores, D., Toft, D., Wang, X., Nguyen, D., 2004. Requirement of heat shock protein 90 for human

hepatitis B virus reverse transcriptase function. J Virol 78, 13122-13131.

Kann, M., Gerlich, W.H., 1994. Effect of core protein phosphorylation by protein kinase C on encapsidation of RNA within core particles of hepatitis B virus. J Virol 68, 7993-8000.

Kang, H.Y., Lee, S., Park, S.G., Yu, J., Kim, Y., Jung, G., 2006. Phosphorylation of hepatitis B virus Cp at Ser87 facilitates core assembly. Biochem J 398, 311-317.

Kang, H., Yu, J., Jung, G., 2008. Phosphorylation of hepatitis B virus core C-terminally truncated protein (Cp149) by PKC increases capsid assembly and stability. Biochem J 416, 47-54.

Liu, K., Qian, L., Wang, J., Li, W., Deng, X., Chen, X., Sun, W., Wei, H., Qian, X., Jiang, Y., He,F., 2009. Two-dimensional blue native/SDS-PAGE analysis reveals heat shock protein chaperone machinery involved in hepatitis B virus production in HepG2.2.15 cells. Mol. Cell. Proteomics 8, 495.505.

Nassal, M., 1999. Hepatitis B virus replication: novel roles for virus-host interactions. Intervirology 42, 100-116.

Seeger, C., Mason, W.S., 2000. Hepatitis B virus biology. Microbiol Mol Biol Rev 64, 51-68.

Montalto, G., M. Cervello, et al. (2002). "Epidemiology, risk factors, and natural history of hepatocellular carcinoma." Ann N Y Acad Sci 963: 13-20.

Newman, M., Suk, F.M., Cajimat, M., Chua, P.K., Shih, C., 2003. Stability and morphology comparisons of selfassembled virus-like particles from wild-type and mutant human hepatitis B virus capsid proteins. J Virol

77, 12950-12960.

Severini, A., Liu, X.Y., Wilson, J.S., Tyrrell, D.L., 1995. Mechanism of inhibition of duck hepatitis B virus polymerase by (-)-beta-L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine. Antimicrob Agents Chemother 39, 1430-1435.

Sullivan, W., Stensgard, B., Caucutt, G., Bartha, B., McMahon, N., Alnemri, E.S., Litwack, G., Toft, D., 1997. Nucleotides and two functional states of hsp90. J Biol Chem 272, 8007-8012.

Terasawa, K., Minami, M., Minami, Y., 2005. Constantly updated knowledge of Hsp90. J Biochem 137, 443-447.

Woo, S.H., An, S., Lee, H.C., Jin, H.O., Seo, S.K., Yoo, D.H., Lee, K.H., Rhee, C.H., Choi, E.J., Hong, S.I., Park,I.C., 2009. A truncated form of p23 down-regulates telomerase activity via disruption of Hsp90 function. J

Biol Chem 284, 30871-30880.

Yonehara, M., Minami, Y., Kawata, Y., Nagai, J., Yahara, I., 1996. Heat-induced chaperone activity of HSP90. J Biol Chem 271, 2641-2645.

Claims (7)

1. Hsp90 억제제를 유효성분으로 포함하는 간염바이러스 감염으로 인한 간질환 치료용 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 Hsp90 억제제는 Hsp90의 발현 또는 활성을 억제하는 물질로, 상기 물질은 저분자화합물, 항체, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 및 폴리펩타이드를 포함하는 것인, 간염바이러스 감염으로 인한 간질환 치료용 조성물.
3. 다음의 단계를 포함하는 Hsp90과 HBV 코어 단백질간 상호작용을 선택적으로 억제하는 간질환 치료 물질 스크리닝 방법:
   Hsp90 및 HBV 코어 단백질을 제공하는 단계;
   상기 Hsp90와 HBV 코어 단백질과의 상호작용을 선택적으로 억제할 수 있을 것으로 기대되는 시험물질과 상기 단백질을 접촉시키는 단계; 및
   상기 Hsp90와 HBV 코어 단백질과의 상호작용을 검출하는 단계로, 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질과 접촉된 경우 Hsp90와 HBV 코어 단백질의 상호작용이 감소된 경우, 상기 시험물질을 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 간질환 치료 물질 스크리닝 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 Hsp90 단백질은 전장 또는 표 1의 서열을 기준으로 적어도 잔기 520 내지 615를 포함하며, 상기 HBV 코어 단백질은 전장 또는 표 1의 서열을 기준으로 잔기 1 내지 149 또는 적어도 잔기 111 내지 130을 포함하는, 간질환 치료 물질 스크리닝 방법.
5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 Hsp90 및 HBV 코어단백질은 이를 발현하는 세포의 형태로 제공되는, 간질환 치료 물질 스크리닝 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 세포는 HepG2, Huh7, Hep3B 또는 PLC/PRF/5인 것인, 간질환 치료 물질 스크리닝 방법
7. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 Hsp90 및 HBV 코어단백질의 상호작용은 세포외 HBV 핵산 농도로 측정되는 것인, 간질환 치료 물질 스크리닝 방법.

Images