KR20120072671A - 형광 고분자 기반 실리카 나노입자의 제조방법 - Google Patents

형광 고분자 기반 실리카 나노입자의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 형광 고분자 기반 실리카 나노입자의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 형광 고분자 기반 실리카 나노입자에 관한 것으로, 보다 구체적으로, (a) 소수성 형광 고분자와 실리카 전구체를 유기용매, 계면활성제 및 물이 혼합된 용매에서 혼합하여 형광 고분자 코어 및 실리카 쉘 형태의 코어-쉘 나노입자를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 혼합액을 원심분리한 다음, 분말을 수득하고 세척하여 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자를 수득하는 단계를 포함하는 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자에 관한 것이다.
본 발명에 따른 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자의 제조방법은 코어 구조를 제조한 다음 쉘 구조를 코팅하는 종래 방법과 달리 형광 고분자와 실리카 전구체와의 혼합반응을 통해 단일 단계만으로 60~70nm의 균일한 크기를 가지는 코어-쉘 구조를 형성할 수 있으며, 제조된 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자는 세포독성이 없고, 광 안정성 및 세포 투과성이 우수할 뿐만 아니라 형광 고분자의 분자구조를 변화시킴으로써, 다양한 파장대의 나노입자를 제조할 수 있어 바이오 진단 및 분석분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

형광 고분자 기반 실리카 나노입자의 제조방법{Method for Preparing Fluorene Copolymer Based Silica Nanoparticles}
본 발명은 형광 고분자 기반 실리카 나노입자의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 형광 고분자 기반 실리카 나노입자에 관한 것으로, 보다 구체적으로, (a) 소수성 형광 고분자와 실리카 전구체를 유기용매, 계면활성제 및 물이 혼합된 용매에서 혼합하여 형광 고분자 코어 및 실리카 쉘 형태의 코어-쉘 나노입자를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 혼합액을 원심분리한 다음, 분말을 수득하고 세척하여 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자를 수득하는 단계를 포함하는 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자에 관한 것이다.
생명과학에 있어서 형광 기반 기술은 분자 생물학에서 질병 진단에 이르기까지 여러 가지 기초 생명 현상을 규명하는 데에 폭넓게 응용되고 있다. 특히, 형광 기반 기술에서는 형광 강도뿐 아니라, 여기광의 파장, 형광의 파장, 형광 수명 또는 형광 이방성을 포함하는 다양한 실험 변수(parameter)를 이용함으로써, 복수의 표적에 대한 신호를 다중화할 수 있고, 나노미터 수준의 해상도와 단일 분자 수준의 감도를 제공한다.
최근, 이중결합과 단일결합의 반복구조를 특징으로 하는 공액 고분자(conjugated polymer)는 최첨단 기능성 소재로 유기전자소재, 센서 신호 변환물질 등과 같은 고부가가치의 소재로서 각광받고 있다. π-공액 주쇄에서 기인한 반도체적 전기전도성 및 가시광 영역대의 흡수 및 발광 특성에 의해 이러한 고분자는 유기태양전지나 유기발광다이오드, 유기트랜지스터의 활성층으로 응용하기에 적합할 뿐만 아니라 소재의 유연성, 유기합성에 의한 구조 변형의 용이함, 대량 생산 가능성 등의 장점으로 인해 미래형 유기전자소재로 연구?개발되고 있으며, 공액 고분자에 수용성을 부여하고 바이오와의 접목을 통해 바이오 센서 및 바이오이미징에 응용하려는 연구가 최근 활발히 진행되고 있다.
바이오센서는 생화학 및 생물학적 종(species) 또는 반응에 의해 일어나는 신호를 전기적 또는 광학적 신호로 변환하는 소재로, 여러 과학 분야의 기반기술을 필요로 하는 미래형 융합기술의 결정체인 스마트 소재이다. 인류 건강에 대한 관심이 꾸준히 증대하여 유전 정보의 분석, 질병의 진단, 환경 검사에 대한 연구가 요구됨에 따라 이러한 센서 기술의 개발은 양적으로나 질적으로나 계속적으로 증가하고 있는 추세다. 그러나 기존의 공액 고분자의 경우, 공액 분자골격에서 기인한 소수성 특성으로 인해 수용액에서의 고분자 용해도가 감소하여 물성이 저하되므로 고분자 측쇄 끝에 이온 그룹을 도입하는 방법을 통해 고분자의 수용성을 증대시키는 방법이 일반적으로 이용되고 있다. 이러한 공액 고분자를 센서에 이용했을 때 얻는 최대 장점은 π 공액 구조의 주쇄를 통해 charge carrier, 광자 혹은 엑시톤의 이동이 가능하고 conjugation을 통해 표적 물질로 신호가 집적되어 높은 감지 신호를 낼 수 있는 특성(분자선 효과; Molecular wire effect)이다. 특히, 형광분광법의 높은 감도(흡광분광법의 백만 배)와 빠른 응답성으로 말미암아 공액 고분자의 형광 특성을 이용한 센서 개발은 최근 많은 주목을 받고 있다(우한영 et al ., KBCS).
한편, 형광의 나노입자는 생물학적 영상기술, 센서 기술, 마이크로어레이, 및 광학적 컴퓨팅과 같은 생물 공학적 적용 및 정보 적용의 지시약 및 광자 공급원으로서 대단한 장래성을 가진다. 이러한 적용은 특히 고차원의 구조로 배열되거나 생물학적 거대분자에 결합될 수 있으며, 크기-조절된 밝은 단순분산 나노입자를 필요로 한다. 형광 나노 물질 중에서 특히, 실리카 나노 입자 안에는 다양한 형광 염료를 넣어서 원하는 빛을 내도록 만들 수 있기 때문에 실리카를 암진단이나 약물전달에 사용하기 위한 연구가 세계적으로 활발하게 진행되고 있다. 그러나, 의료용으로 쓸 수 있을 만큼의 작은 크기로 균일하게 만드는 것이 어려워 큰 진전을 이루지 못하였으며, 특히 진단용 형광물질이나 치료용 약물을 담아 암 조직에 보내려면 나노입자 크기가 100㎚ 이하가 적당하지만 실리카를 나노입자로 만들면 서로 뭉쳐 200~300㎚ 정도로 커지는 문제점이 있었다.
실리카를 이용한 코어-쉘(core-shell) 나노구조를 제조하기 위해서는 emulsion droplet의 응집을 방지하기 위해 높은 교반 속도 없이도 emulsion system의 안정성을 유지하는 자기주형법(self-templating method)을 이용할 수 있으며, 자기주형법을 이용한 단일 단계의 O/W emulsion system을 통해 코어-쉘 입자를 제조하는 방법에 대해서는 이미 개시되어 있으나, 코어-쉘 나노입자의 크기가 마이크로미터 수준이며, 균일도가 높지 않다는 문제점이 있다(Qing Zhang et al ., European Polymer Journal , 44:3957, 2008; Bok Yeop Ahn et al., Chem. Commun., 189, 2006).
이에, 본 발명자들은 100nm 이하의 균일한 크기를 가지는 형광 나노입자를 개발하고자 예의 노력한 결과, 단일 단계의 역마이셀(reverse micelle) 방법을 이용하여 형광 고분자를 코어로 실리카 층이 코팅되어 있는 코어-쉘 나노입자를 제조할 경우, 60~70nm의 균일한 크기를 가지며, 광안정성 및 세포투과성이 우수하고, 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 균일한 크기를 가지는 형광 나노입자의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 형광 나노입자를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 소수성 형광 고분자와 실리카 전구체를 유기용매, 계면활성제 및 물이 혼합된 용매에서 혼합하여 형광 고분자 코어 및 실리카 쉘 형태의 코어-쉘 나노입자를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 혼합액을 원심분리한 다음, 분말을 수득하고 세척하여 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자를 수득하는 단계를 포함하는 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 제조되고, 60~70nm의 균일한 크기를 가지는 단순 분산(monodisperse) 구형인 것을 특징으로 하는 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 메톡시-4-(2-에틸헥실록시)벤젠(Methoxy-4-(2-ethylhexyloxy)benzene)과 9,9-디옥틸-2,7-디브로모플루오렌(9,9-dioctyl-2,7-dibromofluorene)을 유기용매에 혼합한 후 가열 및 교반하여 혼합물을 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 혼합물에 염기를 첨가하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 혼합물을 재결정화시키고, 정제하여 형광 고분자 PDDF를 수득하는 단계를 포함하는 형광 고분자 PDDF의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 형광 고분자 PDDF(Poly[di(2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy))-2,7-(9,9- dioctylfluorene)])를 제공한다.
본 발명에 따른 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자의 제조방법은 코어 구조를 제조한 다음 쉘 구조를 코팅하는 종래 방법과 달리 형광 고분자와 실리카 전구체와의 혼합반응을 통해 단일 단계만으로 60~70nm의 균일한 크기를 가지는 코어-쉘 구조를 형성할 수 있으며, 제조된 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자는 세포독성이 없고, 광 안정성 및 세포 투과성이 우수할 뿐만 아니라 형광 고분자의 분자구조를 변화시킴으로써, 다양한 파장대의 나노입자를 제조할 수 있어 바이오 진단 및 분석분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 PDDF의 구조 및 PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자의 제조방법을 간략하게 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자의 SEM(a, b) 및 TEM(c, d) 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 다양한 농도의 PDDF 용액에 따라 제조된 PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자의 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는 PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자의 공초점 형광 이미지(a); 명시야 이미지(b) 및 중첩된(superimposed) 이미지(c)를 나타낸 것이다.
도 5는 PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자(black lines), PDDF 나노입자(grey lines) 및 PDDF(dash lines)의 방출 스펙트라를 나타낸 것이다.
도 6은 PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자의 광표백(photobleaching)을 측정한 그래프를 나타낸 것이다.
도 7은 물(black) 및 에탄올(grey)에서 실리카로 코팅되지 않은 PDDF 나노입자(a) 및 PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자(b)의 방출 스펙트라를 나타낸 것이다.
도 8은 Cy3로 컨쥬게이트 된 타겟 DNA와 혼성화된 PNA(a), 형광이 표지되지 않은 타겟 DNA와 혼성화된 PNA의 음전하와 양전하를 띄는 PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자가 정전기적으로 결합한 PNA-DNA(b) 및 PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자의 농도에 따른 PNA-DNA의 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 9는 APTMS로 개질된 PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자의 세포 생존률(a), DETA로 개질된 PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자의 세포 생존률(b) 및 APTMS 또는 DETA로 개질된 PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자를 함유하는 HeLa 세포의 형광 이미지(c)를 나타낸 것이다.
본 발명은 일 관점에서, (a) 소수성 형광 고분자와 실리카 전구체를 유기용매, 계면활성제 및 물이 혼합된 용매에서 혼합하여 형광 고분자 코어 및 실리카 쉘 형태의 코어-쉘 나노입자를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 혼합액을 원심분리한 다음, 분말을 수득하고 세척하여 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자를 수득하는 단계를 포함하는 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 역마이셀(reverse micelles) 방법이란 나노크기의 물방울을 반응장으로 이용하여 입도분포가 조밀한 입자를 응집시키지 않고 독립적으로 분산시킨 상태로 제조하는 방법을 말한다.
본 발명에 있어서, 상기 소수성 형광 고분자는 PDDF(Poly[di(2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy))-2,7-(9,9- dioctylfluorene)]), PFO(polyfluorene), PFPV(poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-2,7-(9,9- dioctylfluorene)]) 및 MEHPPV(poly(2-methoxy-5-(2′-ethylhexyloxy)-1,4-phenylene vinylene))로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 실리카 전구체는 TEOS(tetraethoxysilane), TMOS(Tetramethylorthosilicate), TEES(triethoxy(ethyl)silane) 및 BTSE(1,2-bis(triethoxysilyl)ethane)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유기용매는 사이클로헥산올(cyclohexanol), 헥산올(hexanol), 사이클로헥산(cyclohexane), 톨루엔(Tolune) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 계면활성제는 TritonX-100, PVP(polyvinylpyrrolidone), CTABCl 및 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 NH4OH를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 (a) 단계 이후에 알코올을 첨가한 다음, 다시 혼합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자는 60~70nm의 균일한 크기를 가지는 단순 분산(monodisperse) 구형인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 제조방법에 의해 제조되고, 60~70nm의 균일한 크기를 가지는 단순 분산(monodisperse) 구형인 것을 특징으로 하는 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 소수성 형광 고분자는 PDDF, PFO, PFPV 및 MEHPPV로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 메톡시-4-(2-에틸헥실록시)벤젠(Methoxy-4-(2-ethylhexyloxy)benzene)과 9,9-디옥틸-2,7-디브로모플루오렌(9,9-dioctyl-2,7-dibromofluorene)을 유기용매에 혼합한 후 가열 및 교반하여 혼합물을 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 혼합물에 염기를 첨가하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 혼합물을 재결정화시키고, 정제하여 형광 고분자 PDDF를 수득하는 단계를 포함하는 형광 고분자 PDDF의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 유기용매는 테트라히드로퓨란(Tetrahydrofuran), 클로로포름(Chloroform), 벤젠(Benzene), 디메틸포름알데히드(Dimethylformamide) 및 디메틸술폭사이드(Dimethyl sulfoxide)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 염기는 포타슘 터셔리 부톡사이드(potassium tert-butoxide), 알루미늄 트리이소프로폭사이드(aluminium triisopropoxide), 실리콘 테트라에톡사이드(silicon tetraethoxide) 및 티타늄 테트라이소프로폭사이드(titanium tetraisopropoxide)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 형광 고분자 PDDF(Poly[di(2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy))-2,7-(9,9-dioctylfluorene)])에 관한 것이다.
본 발명은 일 양태에서, 형광 기반 바이오분석에 적용할 수 있는 형광 코어-쉘 나노입자를 제조하기 위하여 역마이셀 방법을 이용하여 poly(p-phenylenevinylene)s(PPVs)의 유도체인 형광 고분자 Poly[di(2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy))-2,7-(9,9-dioctylfluorene)] (PDDF)를 제조하였다.
본 발명은 다른 양태에서, 상기 제조된 형광 고분자 PDDF를 함유한 용액과 실리카 전구체 TEOS를 혼합하여 실리카 쉘로 코팅된 PDDF가 코어인 코어-쉘 구조의 나노입자를 제조하였으며, 상기 제조된 코어-쉘의 구조 및 크기를 SEM, TEM 및 공초점 현미경을 이용하여 확인하였다. 그 결과, 상기 제조된 PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자는 60~70nm의 균일한 크기를 가지며, 10nm 두께의 실리카 층을 가지는 것을 확인하였다.
본 발명은 또 다른 양태에서, 실리카 코팅 전과 후의 광학 특성의 변화를 측정하기 위해, PDDF, 실리카로 코팅되지 않은 PDDF 나노입자 및 PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자의 방출 피크를 비교하였다. 그 결과, 각각의 형광 방출 피크는 형광 방출 피크의 형태 및 세기에서는 차이점을 나타내지 않았으며, 방출 최대값(emission maxima)이 PDDF가 녹아있는 용액은 554nm, 실리카로 코팅되지 않은 PPDF의 나노입자는 604nm인 반면, PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자의 방출 최대값은 584nm인 것을 확인하였다.
본 발명은 또 다른 양태에서, 상기 제조된 PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자의 생물학적 분석을 위한 물질로서의 사용 가능성을 확인하기 위하여, 상기 제조된 PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자의 광 안정성을 확인하였다. 그 결과, 상기 제조된 PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자는 상당한 광안정성을 가지는 Alexa488 및 Cy5 형광단(fluorophores)과 비교하여 유사한 광안정성을 나타내는 것을 확인하였으며, 서로 극성이 다른 에탄올과 물에 대하여 실리카로 코팅되지 않은 PDDF는 극성이 다른 용매의 분자와 상호작용하여 들뜬 상태의 에너지가 변함으로써, 에탄올과 물에서 서로 다른 모양의 피크를 나타내는 반면, PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자는 PDDF와 용매의 직접적인 상호작용으로부터 형광 특성을 보호하여 에탄올과 물에서의 피크 모양이 유사한 것을 확인하였다.
본 발명은 또 다른 양태에서, 바이오이미징 물질로서 코어-쉘 나노입자의 사용 가능성을 확인하기 위해, 상기 제조된 PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자의 세포 투과성(cell permeability) 및 세포독성(cytotoxicity)을 확인하였다. 그 결과, 세포 침투를 용이하게 하기 위해, PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자의 표면이 물에 대한 분산성을 높이는 APTMS로 개질된 경우, 세포 투과성이 우수하고 세포독성이 없는 것을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Poly[ di (2- methoxy -5-(2- ethylhexyloxy ))-2,7-(9,9- dioctylfluorene )] ( PDDF )의 제조
형광 기반 바이오분석에 적용할 수 있는 형광 나노입자를 제조하기 위하여 poly(p-phenylenevinylene)s(PPVs)의 유도체인 형광 고분자 Poly[di(2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy))-2,7-(9,9-dioctylfluorene)](PDDF)를 제조하였다. PDDF를 제조하기 위하여, 두 개의 모노머 Methoxy-4-(2-ethylhexyloxy)benzene, 4-Dibromo-2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)xylene을 연속적으로 각각 제조하였다 (P. P. Bhavin et al ., Macromolecules , 27:8883, 2004).
환류 온도에서 가열하면서, 상기 제조된 1,4-Dibromo-2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)xylene 2g과 9,9-Dioctyl-2,7-dibromofluorene(Sigma Aldrich Chemical) 1.26g을 질소분위기에서 교반(stirring)하여 100ml THF(Tetrahydrofuran)에 녹이고, THF에 녹인 1.0mol potassium tert-butoxide 20ml를 1시간 동안 한 방울씩 첨가하였다(20ml/h). 환류 온도에서 16시간 동안 가열 후, 메탄올로부터 재결정화 시키고, hexane으로 정제하였다. 제조된 고분자를 환산 압력(reduced pressure)에서 건조시켜 0.5g의 PDDF를 수득하였다. PDDF의 광루미네선스(photoluminescence)는 554nm로 측정되었다.
형광 고분자 PDDF를 코어로 하는 실리카 나노입자
(1)PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자의 제조
형광 고분자 PDDF를 코어로 가지는 실리카 나노입자를 제조하기 위해, 역마이셀(reverse-micelle) 방법을 이용하였다(도 1). 0.037mol 사이클로헥산올(cyclohexanol) 3.75ml, 0.012mol 헥산올(hexanol) 1.25ml, TritonX-100(Sigma Aldrich) 0.85ml 및 증류수 0.25ml를 혼합하여 5분 동안 교반한 다음, 600rpm으로 교반하면서, 0.24mmol TEOS(tetraethoxysilane, Sigma Aldrich) 0.05ml, PDDF를 함유한 고분자 용액(1mg/ml in toluene) 0.025ml 및 0.85mmol NH4OH(Sigma Aldrich) 0.03ml를 첨가하여 20시간 동안 교반하였다. 그 다음, 상기 혼합액에 100% 알코올(Sigma Aldrich) 13ml를 첨가하고 다시 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 상기 혼합액을 3000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 불투명한 빨간색 파우더를 수득 한 다음, 에탄올로 세척을 3번 반복한 후, 에탄올에 다시 녹여 PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자를 제조하였다.
상기 제조된 코어-쉘 나노입자의 크기 및 균일성을 확인하기 위해 주사전자현미경(SEM, FEI Sirion)을 이용하여 확인하였다. 제조된 나노입자는 에탄올에 분산시키고, 상기 현탁액의 한 방울을 슬라이드 조각 위에 떨어트린 다음, 양면테이프를 이용하여 시료대 위에 고정시켰다.
또한, 200kV의 가속전압에서 FEI(Tecnai G2F30S-Twin) 투과 전자 현미경(TEM)을 이용하여 코어-쉘 입자의 형태 및 마이크로구조를 확인하였다. 이 때, 샘플은 실온에서 24시간 동안 건조시켜 사용하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 코어-쉘 나노입자는 60~70nm의 매우 균일한 크기를 가지는 단순 분산(monodisperse) 구형인 것을 확인하였으며, 코어 나노입자의 크기보다 작은 10nm 두께의 실리카 층으로 이루어진 코어-쉘 구조임를 확인하였다.
또한, 형광 고분자 용액의 함량에 따라 제조된 코어-쉘 나노입자의 SEM 이미지를 확인한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 코어-쉘 나노입자의 사이즈는 형광 고분자의 함량이 증가할수록 코어-쉘 나노입자의 사이즈도 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 코어-쉘 나노입자의 사이즈는 전구체 용액에서 고분자 농도를 조절함으로써 코어-쉘 나노입자의 사이즈를 조절할 수 있으며, 형광 세기는 코어-쉘 나노입자의 사이즈가 증가하는 것에 비례하여 형광 세기도 증가하였다. 특히, 0.025ml 고분자 농도로 제조된 코어-쉘 나노입자의 경우, 고분자를 함유하지 않은 실리카 나노입자의 크기와 거의 동일하게 나타났으며, 양자점(QD), 금 및 자성 나노입자와 같은 크기 의존적인 다기능성 프로브로서 적용하기 위해 유용하게 이용될 수 있다.
각각의 형광 나노입자의 형태 및 사이즈를 구별하기 위하여, 공초점 현미경(confocal laser scanning setup, ZWISS LSM510 META)을 이용하여 글라스 위에 분산된 각각의 형광 나노입자를 이미징하였다. 형광소스(fluorescence excitation source)로는 488nm의 단일 여기(single excitation)를 이용하였으며, 형광 이미지를 얻기 위해서는 형광 스캐너 400PMT 및 70% power로 셋팅된 Genefix 4200A(Molecular Devices)를 이용하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 각각의 형광 나노입자의 형태와 사이즈를 확인할 수 있었다.
(2) PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자의 광학특성
실리카 코팅 전후의 PDDF 광학 특성의 변화를 측정하기 위해, 코어-쉘 나노입자의 형광 방출 피크와 PDDF가 녹아있는 용액 및 실리카가 코팅되어 있지 않은 PDDF 나노입자의 형광 방출 피크를 비교하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 코어-쉘 나노입자는 PDDF가 녹아있는 용액 및 계면활성제를 이용한 에멀젼 방법에 의해 제조된 실리카로 코팅되지 않은 PDDF 나노입자와 비교하여 형광 방출 피크의 형태 및 세기에서는 차이점을 나타내지 않았으며, 방출 최대값(emission maxima)이 PDDF가 녹아있는 용액은 554nm, 실리카로 코팅되지 않은 PPDF의 나노입자는 604nm인 반면, PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자의 방출 최대값은 584nm인 것을 확인하였다. 이러한 방출 최대값의 차이는 고분자 체인의 응집력에 의한 것으로, 코어 구조가 형광 고분자 체인 사이에서 증가된 π-π stacking으로 인해 π 전자가 delocalization되었기 때문이다(G. Mark et al ., Proc . R. Soc . A, 465:2751, 2009; B. J. Schwartz et al ., Annu . Rev . Phys . Chem ., 54:141, 2003; R. Traiphol et al ., Macromolecules , 39:1165, 2006).
(3) PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자의 광안정성
생물학적 분석을 위한 조영제의 주요 문제점은 대부분의 유기염료의 광안정성이 광표백 현상에 의해 비교적 짧은 시간에 감소된다는 점이다.
따라서, 코어-쉘 나노입자의 광표백(photobleaching) 현상을 확인하기 위하여, 광안정성 연구에서 주로 사용되는 다른 유기 염료인 상당한 광안정성을 가지는 Alexa488 및 Cy5 형광단(fluorophores)과 비교하여 형광 방출 세기의 변화를 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 코어-쉘 나노입자는 상당한 광안정성을 가지는 Alexa488 및 Cy5 형광단(fluorophores)과 비교하여 유사한 광안정성을 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 일반적으로 유기 염료의 광표백은 염료와 유기 용매 사이의 상호작용에 의한 것으로, 주위의 용매에 의한 형광 고분자의 형광 특성을 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 코어-쉘 나노입자에 함유된 형광 고분자는 용매와의 직접적인 상호작용으로부터 형광 특성을 보호하여 에탄올과 물에서의 피크 모양이 유사한 반면, 실리카로 코팅되지 않은 고분자는 서로 다른 극성용매 분자와 상호작용하여 들뜬 상태의 에너지가 변함으로써, 에탄올과 물에서 서로 다른 모양의 피크를 나타내었다.
따라서, 형광 고분자를 감싸고 있는 실리카 층은 인접한 형광 고분자의 분자 사이를 분리하고, 에너지 변화 및 퀀칭(quenching)을 억제하여 형광 특성을 유지한다.
(4) PNA-DNA와의 정전기적 결합을 이용한 PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자의 DNA 검출
특이적 결합을 위한 표지자(indicator)로서 코어-쉘 나노입자의 사용 가능성을 확인하기 위해, PNA로 개질된 글라스 칩을 제조하였다.
PNA 칩을 제조하기 위하여, 글라스를 1% 3-aminopropyltriethoxysilane(ATPS) 및 1M succininc anhydride로 처리하여, 아민기로 개질시킨 다음 링커로서, EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)/NHS(N-hydroxysuccinimide)를 이용하여 인플루엔자 바이러스(H5N1)의 Hemagglutinin partial region인 타겟 DNA(TTA CCA AAT AAG ACG AGT, H5N1, Bioneer Co.)와 특이적으로 결합할 수 있는 PNA(NH2-O-AAT GGT TTA TTC TGC TCA, H5N1, PanageneCo.)를 아민기로 개질시킨 글라스 표면에 결합시켜 PNA로 개질된 글라스 칩을 제조하였다.
코어-쉘 나노입자의 표면은 PNA와 타겟 DNA의 혼성화에 의해 음전하를 띄는 PNA-DNA 표면과 정전기적 결합을 하기 위해 trimethoxy-silylpropyl-diethylenetriamine(DETA)로 개질시켜 표면 전하(charge)가 -30.6mV에서 48.4mV가 되게 하였다.
상기 PNA로 개질된 글라스 칩은 1nM의 Cy3와 컨쥬게이트된 타겟 DNA(in 1×PBST)를 함유하는 용액 및 형광이 표지 되지 않은 1nM의 타겟 DNA(in 1×PBST)를 함유하는 용액과 각각 37℃에서 1시간 동안 약하게 쉐이킹(shaking)하여 타겟 DNA와 혼성화시킨 다음, PBST(Phosphate Buffered Saline Tween-20) 및 PBS(phosphate buffered saline)로 글라스 칩을 세척하였다. 그리고, 형광이 표지 되지 않은 타겟 DNA와 혼성화된 글라스 칩 위에 상기 양전하를 띄는 코어-쉘 나노입자를 함유하는 용액(100μg/ml)을 떨어뜨리고, 실온에서 30분간 incubation하였다. 그 다음, PBST 및 PBS로 세척하고, 400 PMT 및 70% power로 셋팅된 형광 스캐너 Genefix 4200A(Molecular Devices)를 이용하여 상기 Cy3이 컨쥬게이트된 타겟 DNA와 혼성화된 PNA 및 형광이 표지되어 있지 않은 DNA와 혼성화된 PNA에 코어-쉘 나노입자를 결합시킨 PNA-DNA의 형광 이미지를 얻었다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, Cy3이 컨쥬게이트된 타겟 DNA와 혼성화된 PNA의 형광 세기에 비해, 코어-쉘 나노입자가 결합된 PNA-타겟 DNA의 형광 세기는 PNA에 대한 타겟 DNA의 특이적 결합 및 혼성화된 PNA-타겟 DNA의 음전하와 양전하를 띄는 코어-쉘 나노입자의 정전기적 결합에 의해 더 강하게 나타나는 것을 확인하였다.
또한, 혼성화된 PNA-타겟 DNA 표면에 대해 0.5ng/ml의 코어-쉘 나노입자만으로도 검출이 가능한 것을 확인하였다.
이는, 나노입자의 복잡한 표면처리 및 타겟 분자의 컨쥬게이션 없이도 민감도가 우수한 표지자(indicator)로서 사용 가능한 것을 의미한다.
(5) PDDF와 SiO2 의 코어-쉘 나노입자의 세포 투과성(cell permeability) 및 세포독성(cytotoxicity) 측정
바이오이미징 물질로서 코어-쉘 나노입자의 사용 가능성을 확인하기 위해, 세포 투과성(cell permeability) 및 세포독성(cytotoxicity)을 확인하였다.
코어-쉘 나노입자의 독성은 water-soluble tetrazolium salt(WST-1) assay(H. Yamawaki et al ., Am . J. Physiol . Cell Physiol ., 290:C1495, 2006)를 이용하여 세포 생존률을 측정하였으며, in vitro 세포 이미지를 위해, 세포흡수(uptake)를 위한 분산성(dispersibility)을 제공하는 알킬 사슬(alkyl chain)의 길이가 서로 다른 두 종류의 silane으로 APTMS(3-aminopropyltrimethoxysilane) 및 DETA(Diethylenetriamine)를 silane coupling chemistry를 이용하여 코어-쉘 나노입자 표면에 기능화시켰다. 세포로는 HeLa 세포(ATCC, Manassas, VA, USA)를 이용하였으며, HeLa 세포는 37℃, 95% air, 5% CO2 조건의 humidified incubator에서 각 well마다 2×103개의 세포로 DMEM(Gibco, USA)에서 24시간 동안 배양한 다음, APTMS 및 DETA로 표면이 개질된 코어-쉘 나노입자를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 추가 배양하였다. 그 다음, 반응하지 않은 코어-쉘 나노입자를 제거하기 위해 500ml DPBS(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)로 세 번 세척하였다. 도립 암시야 현미경(Nikon)을 이용하여 코어-쉘 나노입자로 처리된 HeLa 세포의 광산란(Light scattering) 이미지를 얻었다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, DETA 또는 APTMS로 개질된 코어-쉘 나노입자를 첨가한 후 48시간 후의 세포 생존률은 APTMS로 개질된 코어-쉘 나노입자의 세포 생존률이 DETA로 개질된 코어-쉘 나노입자보다 잘 유지되었으며, 코어-쉘 나노입자의 농도가 1mg/ml까지도 세포 생존률이 잘 유지되어 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다. 또한, APTMS로 개질된 코어-쉘 나노입자를 HeLa 세포와 incubation할 때, 코어-쉘 나노입자는 세포 내 핵 주위에서 관찰되었으며, 이는, 본 발명에 따른 코어-쉘 나노입자가 바이오이미징 물질로서 사용가능하다는 것을 의미한다.
한편, 코어-쉘 나노입자는 세포 내에서 높은 신호 대 백그라운드(signal to background) 비율의 형광을 나타낸 반면, 코어-쉘 나노입자의 첨가 없이 배양된 대조군 세포는 같은 파라미터 및 조건하에서 형광을 나타내지 않는 것을 확인하였다. 이러한 결과는, 100μg/ml의 코어-쉘 나노입자 용액으로도 충분히 세포 이미징이 가능하기 때문에, 코어-쉘 나노입자가 세포에 심각한 손상을 일으키지 않고 살아있는 세포를 장기간 이미징 할 수 있다는 것을 의미한다.
반면, APTMS와 비교하여 상대적으로 긴 탄화수소 체인을 가지고, 많은 수의 아민 그룹을 가지는 DETA로 개질된 코어-쉘 나노입자는 세포에서 APTMS로 개질된 코어-쉘 나노입자에 비해 약간의 세포독성을 나타냈으며, 세포 투과성 또한 낮은 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. 다음 단계를 포함하는 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자의 제조방법:
    (a) 소수성 형광 고분자와 실리카 전구체를 유기용매, 계면활성제 및 물이 혼합된 용매에서 혼합하여 형광 고분자 코어 및 실리카 쉘 형태의 코어-쉘 나노입자를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 혼합액을 원심분리한 다음, 분말을 수득하고 세척하여 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자를 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 소수성 형광 고분자는 PDDF, PFO, PFPV 및 MEHPPV로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 실리카 전구체는 TEOS, TMOS, TEES 및 BTSE로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 유기용매는 사이클로헥산올(cyclohexanol), 헥산올(hexanol), 사이클로헥산(cyclohexane), 톨루엔(Tolune) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 계면활성제는 TritonX-100, PVP, CTABCl 및 CTAB로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 NH4OH를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계 이후에 알코올을 첨가한 다음, 다시 혼합하는 것을 특징으로 하는 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자는 60~70nm의 균일한 크기를 가지는 단순 분산(monodisperse) 구형인 것을 특징으로 하는 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자의 제조방법.
  9. 제1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 의해 제조되고, 60~70nm의 균일한 크기를 가지는 단순 분산(monodisperse) 구형인 것을 특징으로 하는 형광 고분자와 실리카의 코어-쉘 나노입자.
  10. 제9항에 있어서, 상기 소수성 형광 고분자는 PDDF, PFO, PFPV 및 MEHPPV로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형광 고분자/실리카 코어-쉘 나노입자.
  11. 다음 단계를 포함하는 형광 고분자 PDDF의 제조방법:
    (a) 메톡시-4-(2-에틸헥실록시)벤젠(Methoxy-4-(2-ethylhexyloxy)benzene)과 9,9-디옥틸-2,7-디브로모플루오렌(9,9-dioctyl-2,7-dibromofluorene)을 유기용매에 혼합한 후 가열 및 교반하여 혼합물을 제조하는 단계;
    (b) 상기 (a) 혼합물에 염기를 첨가하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 혼합물을 재결정화시키고, 정제하여 형광 고분자 PDDF를 수득하는 단계.
  12. 제11항에 있어서, 상기 유기용매는 테트라히드로퓨란(Tetrahydrofuran), 클로로포름(Chloroform), 벤젠(Benzene), 디메틸포름알데히드(Dimethylformamide) 및 디메틸술폭사이드(Dimethyl sulfoxide)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형광 고분자 PDDF의 제조방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 염기는 포타슘 터셔리 부톡사이드(potassium tert-butoxide), 알루미늄 트리이소프로폭사이드(aluminium triisopropoxide), 실리콘 테트라에톡사이드(silicon tetraethoxide) 및 티타늄 테트라이소프로폭사이드(titanium tetraisopropoxide)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형광 고분자 PDDF의 제조방법.
  14. 형광 고분자 PDDF(Poly[di(2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy))-2,7-(9,9- dioctylfluorene)]).
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