KR20120065718A - Novel bacteriophage with growth inhibition activity against cronobacter sakazakii - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A novel bacteriophage 2949-1(KCCM 11140P) is provided to ensure high suppression function to Cronobacter sakazakii. CONSTITUTION: A bacteriophage ESP 2949-1(KCCM 11140P) has Cronobacter sakazakii growth suppression function. A composition for inducing apoptosis of Cronobacter sakazakii contains the bacteriophage ESP 2949-1(KCCM 11140P) as an active ingredient. The composition is manufactured in the form of powder, granules, tablets, suspension, injection solution, cream, lotion, gel, or paste. A food composition contains the bacteriophage ESP 2949-1(KCCM 11140P).

Description

크로노박터 사카자키에 대해 생육 억제능을 나타내는 신규의 박테리오파지{Novel bacteriophage with growth inhibition activity against Cronobacter sakazakii}Novel bacteriophage with growth inhibition activity against Cronobacter sakazakii

본 발명은 신규의 박테리오파지에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 치사율이 높은 병원성 미생물인 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 생육 억제능을 나타내는 신규의 박테리오파지에 관한 것이다.
The present invention relates to a novel bacteriophage, and more particularly, to a novel bacteriophage that exhibits growth inhibitory activity against Cronobacter sakazakii , a highly pathogenic microorganism.

식품에 의해 기인되는 질병은 매년 전 세계적으로 매우 심각하고 주요한 사망의 원인 중 하나이다. GMP, HACCP 등 현대의 발전된 식품 제조 및 관리 기술을 도입하여도, 식중독 등의 식품 매개 질병은 계속하여 증가하고 있는 추세이다. Diseases caused by food are one of the most serious and leading causes of death worldwide each year. Even with the introduction of modern advanced food manufacturing and management technologies such as GMP and HACCP, foodborne diseases such as food poisoning continue to increase.

한국에서의 주된 식중독 세균으로는 병원성 이 콜라이 (E. coil), 노로바이러스 (norovirus), 살모넬라 (Salmonella), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 등이 있는데. 이들 병원성 세균을 제거하는 방법으로는 열처리나 화학적 살균소독제 등이 사용되어 왔다. 하지만, 식품에서는 그 효과가 크지 않고, 소비자는 가능하면 최소의 가공을 원하기 때문에, 새로운 천연 식품보존 및 살균제의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 이에 따라, 천연 항균제, 박테리오 파지, 엔도리신 (endolysin) 등이 새롭게 개발되고 있다. 그 중 박테리오파지 (bacteriophage)는 세균만을 감염시키는 선택성을 갖고, 식품 및 자연환경 속에 아주 많이 분포하고 있기 때문에 유력한 식중독 세균 제어 방법이 될 수 있다.A major food poisoning bacteria in Korea, there is such pathogenic E. coli (E. coil), norovirus (norovirus), Salmonella (Salmonella), Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus). As a method of removing these pathogenic bacteria, heat treatment, chemical disinfectant, and the like have been used. However, since the effect is not great in foods and consumers want the least possible processing, the development of new natural food preservation and disinfectant is required. Accordingly, natural antibacterial agents, bacteriophage, endorisin, and the like are newly developed. Among them, bacteriophage has a selectivity to infect only bacteria and is widely distributed in foods and the natural environment, and thus may be a potent method for controlling food poisoning bacteria.

박테리오파지는 세균에 감염하는 바이러스로,“세균 (Bacteria)”을 “먹는다 (Phage)"는 의미인데, 간단히 “파지”로도 불리고 있다. 파지는 세균의 약 1/10 크기를 갖는데, 전자현미경으로 관찰할 수밖에 없으나, 파지가 균을 용균시키면 세균 집락에 플라크로 불리는 투명한 반점이 형성되기 때문에 파지의 존재를 간접적으로나마 확인할 수 있다.Bacteriophage is a virus that infects bacteria, which means “pact” “bacteria,” also called “phage.” Phage is about one-tenth the size of a bacterium, observed by electron microscopy. Inevitably, the phage lysates the bacteria, so transparent spots called plaques are formed in the colonies, so the presence of phage can be indirectly confirmed.

파지는 용균 사이클만 반복하는 용균 (virulent) 파지, 용원 사이클만 반복하는 약독성 (temperate) 파지로 분류되는데, 약독성 파지 (temperate phage)는 숙주 세균의 유전체에 삽입되어 파지의 모양은 사라지지만 숙주세균이 파괴되지도 않는다. 이러한 상태는 숙주 세균이 좋은 환경 조건에 있는 한 계속되는데, 숙주 세균의 환경이 악화되면, 숙주 세균의 유전자에 있던 파지 유전자는 파지 입자를 만든 후, 용균 사이클로 변환되어 숙주세균을 용균시키고 숙주세포 밖으로 탈출한다. 파지는 세균에 비해 증식 속도가 훨씬 우세하기 때문에, 최초 발견 당시부터 세균의 증식을 억제할 수 있는 중요 후보 중 하나로 고려되었으나, 페니실린 및 스트렙토마이신으로 대표되는 화학요법제의 개발로 인해 그 활용이 제한되었다.Phage are classified as virulent phages that repeat only the lytic cycle and temperate phages that repeat only the lysis cycle. Temperate phages are inserted into the genome of the host bacterium and the phages disappear. Germs are not destroyed. This condition continues as long as the host bacterium is in good environmental conditions. When the host bacterium deteriorates, the phage genes in the host bacterium gene produce phage particles, which are then converted into lysis cycles to lyse the host bacteria and out of the host cell. To escape. Phage is considered to be one of the important candidates for suppressing bacterial growth since its initial discovery, because its rate of growth is much superior to that of bacteria, but its use is limited due to the development of chemotherapeutic agents represented by penicillin and streptomycin. It became.

그러나, 화학요법제의 남용 및 그에 따른 항생제 내성 균주의 출현 등으로 인해 1980년도 이후 파지의 활용성은 다시 주목받았는데, 실제적으로 살모넬라 (Salmonella), 캠필로박터 (Campylobacter), 스타필로코쿠스 아우레우스 (S. aureus) 및 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii) 등의 제어를 위하여 박테리오파지가 활용되었다. 더 나아가 최근에는 미국 FDA에서 닭고기 등의 즉석섭취 식품에 대해 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 파지의 실용화가 승인 (www.ebifoodsafety.com)되었고, 이 콜라이 (E. coli) 와 살모넬라 (Salmonella) 제어용 파지 제품이 승인되어 활용되고 있는 실정이다.
However, due to the advent of chemotherapeutic agents antibiotic resistant strains abuse and hence the received noted advantage of phage after 1980 Castle again, practically Salmonella (Salmonella), Campylobacter (Campylobacter), Staphylococcus aureus (S aureus ) and Cronobacter sakazakii ) Bacteriophage was used for the control of the lamp. Furthermore, recently, the US FDA has listed Listeria monocytogenes ( Listeria) for ready-to-eat foods such as chicken. monocytogenes ) phage was approved (www.ebifoodsafety.com), E. coli (E. coli) and the situation is being utilized Salmonella (Salmonella) control phage products are approved.

한편, 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)는 영?유아에게 치명적인 영향을 주는 급성 기회 감염균으로 주로 생후 1개월 이내의 신생아, 조산아, 저체중아 및 유아에게서 수막염 (neonatal meningitis), 패혈증 (bacteremia), 신생아 괴사성 장염 (necrotizing enterocolitis) 등의 병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 매우 드물게 감염되기는 하지만, 일단 감염되면 치사율이 33-80% 이상에 이르기 때문에 매우 치명적인 세균으로 간주된다. On the other hand, Cronobacter sakazakii ) is an acute opportunistic infectious bacterium that has a lethal effect on infants and young children. It is known to cause illness. Although very rarely infected, it is considered a very deadly bacterium because once infected, mortality can reach 33-80% or more.

크로노박터 (Cronobacter)는 원래 엔테로박터 사카자키 (Enterobacter sakazakii)로 명명되어 오다가 이버슨 (Iversen) 등에 의하여 크로노박터 (Cronobacter)로 개명하도록 제안되었다. 국제기구인 International Commission for Microbiological Specification for Food (ICMSF)에서는 크로노박터 (Cronobacter)를 “Severe hazard for restricted population, life threatening or substantial chronic sequelae or long duration”, 즉 한정된 사람들에게 매우 위험하며 만성 혹은 장기간 생명을 위협한다고 보고하였으며, FAO/WHO는 영유아용 분말식품에 대한 위해 조사를 하도록 권고하고 있다. Cronobacter was originally named Enterobacter sakazakii and was proposed to be renamed Cronobacter by Iversen et al. The International Commission for Microbiological Specification for Food (ICMSF) has identified Cronobacter as “Severe hazard for restricted population, life threatening or substantial chronic sequelae or long duration,” which is very dangerous for a limited number of people and can lead to chronic or long-term life. FAO / WHO recommends a risk investigation for infant food powders.

그러나, 크로노박터 (Cronobacter)는 건조, 열, 자외선, 삼투압, 저영양 상태 및 살균소독제 등에 저항성을 보이기 때문에, 억제 및 제어가 생각보다 만만하지는 않다. However, Cronobacter is resistant to drying, heat, ultraviolet light, osmotic pressure, low nutrient status, and disinfectant, etc., so that inhibition and control are not as satisfactory.

따라서, 대안의 개발이 요구되고 있는데, 최근 그 활용이 새롭게 주목받고 있는 박테리오파지도 유력한 하나의 대안이 될 수 있다. Therefore, the development of alternatives is required, and bacteriophages, which are recently attracting new attention, may be a viable alternative.

이에 본 발명은 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 생육 억제능을 보이는 새로운 박테리오파지를 분리하여 제공하는데 그 목적이 있다.
Thus, the present invention Chronobacter Sakazaki ( Cronobacter sakazakii ) is to provide a new bacteriophage showing growth inhibition ability to isolate.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 생육 억제능을 나타내는 박테리오파지 ESP 2949-1 (KCCM 11140P)를 분리하여 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a bacteriophage ESP 2949-1 (KCCM 11140P) which shows growth inhibition ability against Cronobacter sakazakii .

본 발명자들은 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 생육 억제능을 나타내는 신규의 박테리오파지 ESP 2949-1를 분리하고, 2010년 12월 7일 한국미생물보존센터 (KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM 11140P를 부여받았는데, 본 발명의 신규 박테리오파지 ESP 2949-1 (KCCM 11140P)는 투과전자현미경을 통한 형태학적 특성의 분석 결과, 미오비리대 (Myoviridae) 과 (family)에 속하는 것으로 확인되었다.The inventors of the present invention in Cronobacter sakazakii ) was isolated to a novel bacteriophage ESP 2949-1 showing growth inhibition, and deposited with the Korea Microorganism Conservation Center (KCCM) on December 7, 2010, the accession number KCCM 11140P, the novel bacteriophage ESP 2949 of the present invention -1 (KCCM 11140P) was identified as belonging to the Myoviridae and family by the analysis of morphological characteristics through transmission electron microscopy.

한편, 본 발명은 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 생육 억제능을 나타내는 박테리오파지 ESP 2949-1 (KCCM 11140P)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii) 사멸용 조성물을 제공한다. On the other hand, the present invention Cronobacter (Sakazaki) sakazakii) in the chronometer bakteo sakajaki to the bacteriophage ESP 2949-1 (KCCM 11140P) that indicates the growth inhibitory ability against, it characterized in that it contains as an active ingredient (Cronobacter sakazakii ) provides a composition for killing.

본 발명에 의한 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii) 사멸용 제제는 통상적인 미생물 제제 제조방법으로 제제화할 수 있다. 인체에 투여하는 경우는 약제학적으로 허용하는 범위 내에서, 가축 또는 어류에 투여하는 경우는 수의학에서 허용하는 범위 내에서, 제제화하고, 그에 따라 투여경로를 정할 수 있다. Cronobacter according to the present invention ( Cronobacter sakazakii ) killing formulation can be formulated by a conventional method for producing a microbial formulation. In the case of administration to a human body, it can be formulated within the pharmaceutically acceptable range, and in the case of administration to livestock or fish within the range allowed by veterinary medicine, the route of administration can be determined accordingly.

상기 본 발명의 미생물 제제는 유효성분인 본 발명의 박테리오파지 ESP 2949-1 (KCCM 11140P) 외에 활성 유지 등의 필요에 따라, 담체, 기타 보조제 등을 포함할 수 있는데, 상기 담체는 생리식염수, 증류수, 사료, 박테리아용 배지 (예, Luria broth등) 등이 될 수 있으며, 보조제는 pH 교정 등의 목적으로 완충액 등을 첨가하여 사용할 수 있다.The microbial agent of the present invention may include carriers, other auxiliaries, and the like, as required, such as active maintenance, in addition to the bacteriophage ESP 2949-1 (KCCM 11140P) of the present invention as an active ingredient, and the carrier may include physiological saline, distilled water, Feed, bacteria medium (eg, Luria broth, etc.) may be used, and the adjuvant may be used by adding a buffer or the like for the purpose of pH correction.

또한, 본 발명의 미생물 제제는 분말제, 과립제, 정제 등의 고체상 제제, 현탁제 또는 주사액제 등의 액상 제제 및 크림, 로션, 젤, 페이스트 등의 반 고체상 제제 등으로 제형화될 수 있다.In addition, the microbial preparation of the present invention may be formulated into solid preparations such as powders, granules and tablets, liquid preparations such as suspensions or injections, and semisolid preparations such as creams, lotions, gels, and pastes.

본 발명의 미생물 제제는 경구, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 경피, 비측 내, 흡입 또는 직장 등의 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.The microbial agent of the present invention can be administered in a conventional manner via oral, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, transdermal, nasal, inhalation or rectal routes.

본 발명의 미생물 제제 투여량은 투여 대상에서 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)의 사멸 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 제형의 종류 및 투여대상의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 경로, 투여 시간 및 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.The microbial agent dosage of the present invention means the amount required to achieve the killing effect of Cronobacter sakazakii in the subject to be administered. Thus, it can be adjusted according to various factors including the type of disease, the severity of the disease, the type of formulation and the age, weight, general health state, sex and diet of the subject, the route of administration, the time and duration of administration, and the drug used concurrently. have.

한편, 본 발명은 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 생육 억제능을 나타내는 박테리오파지 ESP 2949-1 (KCCM 11140P)을 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물을 제공한다. 이때, 상기 식품은 일 예로 분유일 수 있다. On the other hand, the present invention Cronobacter (Sakazaki) It provides a food composition comprising a bacteriophage ESP 2949-1 (KCCM 11140P) that indicates the growth inhibitory ability against sakazakii). In this case, the food may be, for example, powdered milk.

박테리오파지 ESP 2949-1 (KCCM 11140P)는 대상 식품의 상태에 따라 액상, 반 고체상 또는 고체상 등의 제형으로 식품에 첨가될 수 있는데, 항 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)의 효과 유지 등을 위해 필요에 따라, 담체 및 기타 보조제 등을 포함할 수 있다. 담체는 생리식염수, 증류수, 사료, 박테리아용 배지 (예, Luria broth 등) 등이 될 수 있으며, 보조제는 pH 교정 등의 목적으로 완충액 등을 첨가하여 사용할 수 있다.
Bacteriophage ESP 2949-1 (KCCM 11140P) may be added to foods in the form of liquid, semi-solid, or solid forms, depending on the condition of the subject food.Anti-Chronobacter Sakazaki sakazakii ) may include a carrier and other auxiliaries and the like as necessary to maintain the effect of. The carrier may be physiological saline, distilled water, feed, bacterial medium (eg, Luria broth, etc.), and the auxiliary agent may be used by adding a buffer solution for the purpose of pH correction.

본 발명에서 새롭게 분리한 신규의 박테리오파지 2949-1 (KCCM 11140P)는 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 높은 생육 억제능을 나타내기 때문에, 의약품이나 동물 의약품으로 제조되어 활용될 수 있고, 분유 등의 식품에 첨가하여 사용될 수도 있다.
The novel bacteriophage 2949-1 (KCCM 11140P) newly isolated from the present invention is Cronobacter. sakazakii ), because it exhibits a high growth inhibitory ability, can be prepared and used as a medicine or animal medicine, and may be used in addition to foods such as milk powder.

도 1은 본 발명의 박테리오파지 ESP 2949-1의 플라크 형태를 보여준다.
도 2는 본 발명의 박테리오파지 ESP 2949-1의 투과전자현미경 사진이다. 우측 하단의 스케일 바는 100 nm이다.
도 3a는 본 발명 박테리오파지 ESP 2949-1에 의한 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)의 생육 억제 상태를 보여주는 그래프이다.
도 3b는 조제분유에서 본 발명 ESP 2949-1에 의한 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)의 생육 억제 상태를 보여주는 그래프이다. 1 shows the plaque morphology of bacteriophage ESP 2949-1 of the present invention.
2 is a transmission electron micrograph of the bacteriophage ESP 2949-1 of the present invention. The scale bar at the bottom right is 100 nm.
Figure 3a is a graph showing the growth inhibition state of Cronobacter sakazakii by the bacteriophage ESP 2949-1 of the present invention.
Figure 3b is a graph showing the growth inhibition state of Cronobacter sakazakii by the present invention ESP 2949-1 in formula.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 들어 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
Hereinafter, the content of the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the scope of the present invention is not limited only to the following examples, and includes modifications of equivalent technical ideas.

실시예Example 1: 박테리오파지  1: bacteriophage ESPESP 2949-1의 분리 Isolation of 2949-1

경기도에 소재한 하수 종말 처리장으로부터 오수 시료를 채취하여 박테리오파지의 분리를 위한 시료로 사용하였다. 분리에 사용된 균주는 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii) ATCC 29544이고, 루리아 베르타니 브로스 (Luria Bertani broth)에 10mM CaCl2를 첨가-LBC broth-하여 배양한 후 실험에 사용하였다. 채취한 오수 시료를 와트만지 (watman paper) No3로 여과 한 후 1% 클로로포름 (chloroform)을 첨가하고, 격렬하게 흔든 (vortexing) 후 8000rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. Sewage samples were collected from sewage treatment plants in Gyeonggi-do and used as samples for the separation of bacteriophages. The strain used for isolation was Cronobacter sakazakii ) ATCC 29544, 10 mM CaCl 2 was added to Luria Bertani broth and cultured by addition-LBC broth. The collected sewage samples were filtered through watman paper No3, 1% chloroform was added, and vigorously shaken (vortexing), followed by centrifugation at 8000 rpm for 10 minutes.

상등액을 채취하고, 이를 0.22 μm 막 필터 (membrane filter)로 제균한 후 제균액을 5× LBC 브로스에 1:4로 혼합하고, 37℃에서 200 rpm으로 24시간 배양하였다. 배양액을 8000 rpm으로 10분 동안 원심 분리한 후, 상등액을 0.22 μm 막 필터 (membrane filter)로 제균하여 제균액을 수득하고, 파지 분리를 위해 4℃에 보관하면서 플라크 어세이 (plaque assay)를 수행하였다. The supernatant was harvested, sterilized with a 0.22 μm membrane filter, and then the sterilized solution was mixed 1: 5 in 5 × LBC broth and incubated at 37 ° C. at 200 rpm for 24 hours. After centrifugation of the culture solution at 8000 rpm for 10 minutes, the supernatant was sterilized with a 0.22 μm membrane filter to obtain a disinfectant solution, and a plaque assay was performed while storing at 4 ° C. for phage separation. It was.

제균액과 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii) ATCC 29544 배양액을 1:1로 혼합하고, 37℃에서 배양한 후 LBC 소프트 아가 (soft agar)에 분주하였다. LBC 아가에 분주한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하면서 박테리오파지에 의한 플라크 형성 유무를 확인하였다. Eradication solution and Cronobacter sakazakii ) ATCC 29544 cultures were mixed 1: 1, incubated at 37 ° C. and aliquoted into LBC soft agar. After dispensing in LBC agar and incubated for 24 hours at 37 ℃ was confirmed whether plaque formation by bacteriophage.

형성된 플라크는 형태, 크기, 혼탁 정도 등을 비교하여 분리하였으며, 플라크를 투스-피킹 (tooth-picking)하고, SM 버퍼에 현탁한 후 10진 희석하여 플라크 어세이를 수행하고, 싱글 플라크를 분리하였다. 확인된 싱글 플라크로부터 플레이트 용해물 (plate lysate), 액체 용해물 (liquid lysate)을 추출하고, 플라크를 통해 파지의 양을 확인한 후 이를 실험에 사용하였다. 플라크 어세이를 수행한 결과 투명한 원형의 플라크를 확인하였다.
The formed plaques were separated by comparing the shape, size, degree of turbidity, etc., the plaques were tooth-picked, suspended in SM buffer, and diluted to 10 to carry out a plaque assay, and single plaques were separated. . Plate lysate and liquid lysate were extracted from the identified single plaque, and the amount of phage was checked through the plaque, and then used for the experiment. As a result of the plaque assay, a clear circular plaque was confirmed.

실시예Example 2: 분리된 박테리오파지  2: isolated bacteriophages ESPESP 2949-1의 형태학적 특성 Morphological Properties of 2949-1

실시예 1에서 분리된 박테리오파지를 2% 우라닐 아세테이트 (uranyl acetate)를 이용해 음성 염색 (negative staining)을 한 후 투과전자현미경을 이용하여 형태학적인 특성을 확인하였다. 투과전자현미경을 통한 형태학적 특성 분석 결과, 미오비리대 과 (Myoviridae family)에 속하는 것으로 확인되었다.
The bacteriophage isolated in Example 1 was negative stained with 2% uranyl acetate and then morphological characteristics were confirmed using a transmission electron microscope. Morphological characteristics analysis by transmission electron microscopy revealed that it belongs to the Myoviridae family.

실시예Example 3: 분리된 박테리오파지  3: isolated bacteriophages ESPESP 2949-1의 숙주 감수성 Host Susceptibility of 2949-1

본 발명자들이 확보하고 있는 다양한 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii) 분리주들을 대상으로 하여, 본 발명에서 새롭게 분리한 박테리오파지 ESP 2949-1와 본 발명자들이 이미 보유하고 있는 다른 병원성 파지에 의한 숙주 감수성을 비교 및 분석하였다. We compared and analyzed the host susceptibility of the bacteriophage ESP 2949-1 newly isolated from the present invention and other pathogenic phages that the present inventors already possessed in various Cronobacter sakazakii isolates secured by the present inventors. It was.

우선 -80℃에서 보관하던 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii) 분리주들을 DFI 아가에 평판 획선한 후 37℃에서 24시간 배양하고, 초록색 단독 집락을 취해 TSB에 접종한 후 배양하고, 이를 LBC 브로스에 접종한 후 재배양하였다. 이 후, 병원성 파지들에 의한 호스트 감수성을 스팟 어세이 (spot assay)를 통해 확인하였다. (표 1) First, Cronobacter was stored at -80 ℃ sakazakii ) isolates were plated in DFI agar and incubated at 37 ° C. for 24 hours, inoculated with TSB, inoculated with TSB, and incubated with LBC broth. Thereafter, host susceptibility by pathogenic phages was confirmed through a spot assay. Table 1

　 호스트＼파지Host @ Phage ES-IES-I ES-2ES-2 ESSI-2ESSI-2 EI-1EI-1 KCES-3KCES-3 KCES-4KCES-4 ESP 2949-1ESP 2949-1 KYU10KYU10 XX XX XX XX XX XX OO KYU12KYU12 XX XX XX XX XX XX OO KYU18KYU18 XX XX XX XX XX XX OO KYU19KYU19 XX XX XX XX XX XX OO KYU26KYU26 XX XX XX XX XX XX OO KYU35KYU35 XX XX XX XX XX XX OO KYU39KYU39 XX OO OO OO XX XX OO KYU53KYU53 XX XX XX XX XX XX OO KYU57KYU57 XX XX XX XX XX XX OO KYU64KYU64 XX XX XX XX XX XX OO KYU70KYU70 XX XX XX XX XX XX OO KYU79KYU79 XX XX XX XX XX XX OO KYU80KYU80 XX XX XX XX XX XX OO KYU81KYU81 XX XX XX XX XX XX OO KYU89KYU89 XX XX XX XX XX XX OO KYU91KYU91 XX OO OO OO XX XX OO KYU96KYU96 XX XX XX XX XX XX OO KYU111KYU111 XX XX XX XX XX XX OO KYU114KYU114 XX XX XX XX XX XX OO KYU115KYU115 XX XX XX XX XX XX OO KYU116KYU116 XX XX XX XX XX XX OO KYU117KYU117 XX XX XX XX XX XX OO KYU123KYU123 XX XX XX XX XX XX OO

다양한 식품으로부터 분리된 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)들에 대한 호스트 감수성을 비교한 결과, 기존에 보유하고 있던 병원성 파지인 ES-I, ES-2, ESSI-2, EI-1, KCES3, KCES4들은 분리주들의 용해 (lysis)를 유발하지 못하였으나, 새롭게 분리된 ESP 2949-1은 이들 분리주들을 감염시켜 용해시킨 후 플라크를 형성시키는 것으로 확인되었다. Cronobacter isolated from various foods Sakazakii's host susceptibility results showed that existing pathogenic phages, ES-I, ES-2, ESSI-2, EI-1, KCES3, and KCES4, did not cause lysis of isolates. However, newly isolated ESP 2949-1 was found to infect and dissolve these isolates and form plaques.

이는 기존의 병원성 파지들이 감염시키지 못했던 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)를 본 발명의 파지 ESP 2949-1이 감염시켜 사멸시킬 수 있는 것을 의미한다.
This means that the phage ESP 2949-1 of the present invention can infect and kill Cronobacter sakazakii , which the existing pathogenic phages did not infect.

실시예Example 4:  4: 크로노박터Chronobacter 사카자키Sakazaki ( ( CronobacterCronobacter sakazakiisakazakii )의 생육 억제 효과 확인Growth inhibitory effect of

본 발명에서 새롭게 분리된 박테리오파지 ESP 2949-1이 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)의 생육을 억제하는지 확인하고자 하였다.In the present invention, it was determined whether the newly isolated bacteriophage ESP 2949-1 inhibited the growth of Cronobacter sakazakii .

먼저, 본 발명에서 분리된 ESP 2949-1을 LBC 브로스에 접종한 후 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii) ATCC 29544를 접종하고, 37℃에서 200 rpm으로 배양하면서 시간마다 흡광도를 측정하여 생육 정도를 관찰하였다. First, the ESP 2949-1 isolated in the present invention was inoculated into LBC broth and then Cronobacter Sakazaki ( Cronobacter sakazakii ) ATCC 29544 was inoculated, and the degree of growth was observed by measuring the absorbance every hour while incubating at 37 rpm at 200 rpm.

그 결과 (도 3a), 시간이 흐름에 따라 본 발명의 박테리오파지 ESP 2949-1을 접종하지 않은 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)의 경우, 흡광도 값이 지속적으로 증가하나, 박테리오파지 ESP 2949-1와 함께 배양하였을 경우, 흡광도 값이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. As a result (Fig. 3a), Chrono bakteo sakajaki not inoculated with bacteriophage ESP 2949-1 of the present invention with time (Cronobacter In the case of sakazakii ), the absorbance value was continuously increased, but when incubated with bacteriophage ESP 2949-1, the absorbance value was confirmed to decrease.

또한, 실제 식품 모델에서도 본 발명의 박테리오파지 ESP 2949-1이 활성을 유지하는지 확인하고자 하였다. 이를 위해 권장 제조 방법에 따라 분유를 조제한 후, 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii) ATCC 29544를 약 3 log CFU/mL로 접종하였다. 그리고, 박테리오파지 ESP 2949-1를 약 6 log PFU/mL로 접종한 후, 시간이 지남에 따라 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)의 생육 정도를 관찰하였다. In addition, the actual food model was to determine whether the bacteriophage ESP 2949-1 of the present invention to maintain the activity. To do this, formulated milk powder according to the recommended method of manufacture, and then chronobacter sakazaki (Cronobacter sakazakii) ATCC 29544 was inoculated at about 3 log CFU / mL. And, after inoculating the bacteriophage ESP 2949-1 at about 6 log PFU / mL, over time, Chronobacter Sakazaki (Cronobacter sakazakii), The degree of growth was observed.

그 결과 (도 3b), 본 발명의 박테리오파지 ESP 2949-1을 감염시키지 않았을 경우, 시간이 지남에 따라 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)가 계속 증가하는 양상을 나타내었으나, ESP 2949-1 함께 배양하였을 경우에는 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)가 증가하지 않는 양상을 나타내었다.As a result (FIG. 3B), if not infected with the bacteriophage ESP 2949-1 of the present invention, over time, Cronobacter sakazakii ) showed a continuous increase, but when incubated with ESP 2949-1, Cronobacter sakazakii ) does not increase.

한국미생물보존센터(국외)Korea Microorganism Conservation Center (overseas) KCCM11140PKCCM11140P 2010120720101207

Claims (4)

크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 생육 억제능을 나타내는 박테리오파지 ESP 2949-1 (KCCM 11140P)
 Cronobacter sakazakii ) bacteriophage ESP 2949-1 (KCCM 11140P) showing growth inhibition ability
크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 생육 억제능을 나타내는 박테리오파지 ESP 2949-1 (KCCM 11140P)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii) 사멸용 조성물
Cronobacter sakazakii) in the chronometer bakteo sakajaki to the bacteriophage ESP 2949-1 (KCCM 11140P) that indicates the growth inhibitory ability against, it characterized in that it contains as an active ingredient (Cronobacter sakazakii ) killing composition
크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 생육 억제능을 나타내는 박테리오파지 ESP 2949-1 (KCCM 11140P)을 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물
Cronobacter sakazakii ) containing a bacteriophage ESP 2949-1 (KCCM 11140P) showing growth inhibition ability
제3항에 있어서,
상기 식품은,
분유인 것을 특징으로 하는 식품 조성물 The method of claim 3,
The food,
Food composition, characterized in that it is milk powder
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