JP6112961B2 - Novel bacteriophage exhibiting lytic properties against Salmonella and compositions containing the same - Google Patents
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Description
本発明は、サルモネラ属菌に属する少なくともSalmonella Enteritidis、Salmonella Typhimurium、Salmonella Gallinarum、Salmonella Pullorum、Salmonella InfentisおよびSalmonella Thompsonに対して溶菌活性を示すバクテリオファージ、及びバクテリオファージ組成物に関する。 The present invention relates to a bacteriophage exhibiting lytic activity against at least Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Gallinarum, Salmonella Pullorum, Salmonella Infentis and Salmonella Thompson belonging to the genus Salmonella, and a bacteriophage composition.
サルモネラ属菌は、グラム陰性の通性嫌気性桿菌で、腸内細菌科に属し、一般に周毛性鞭毛によって運動性を有する。サルモネラ属菌は、2000種類以上の血清型に細分されており、ヒトに対して食中毒を起こし、家禽、ブタ、及びウシなどにもサルモネラ症を引き起こすサルモネラ属菌としてSalmonella Enteritidis、及びSalmonella Typhimurium；家禽に特異的なサルモネラ属菌としてSalmonella Gallinarum、及びSalmonella Pullorumなどが知られている。また、近年では鶏肉から頻繁に検出されるSalmonella Infentisやサルモネラ食中毒の原因菌として常に上位に位置するSalmonella Thompsonが問題視されている（以下、Salmonellaを、その頭文字をとって単に「S.」と標記する場合がある。）。 Salmonella is a Gram-negative facultative anaerobic gonococcus belonging to the family Enterobacteriaceae and generally having motility through periflagellate flagella. Salmonella is subdivided into more than 2000 serotypes. Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium as poultry, causing food poisoning to humans and causing salmonellosis in poultry, pigs, and cattle. Salmonella Gallinarum, Salmonella Pullorum, and the like are known as specific Salmonella species. Also, in recent years, Salmonella Infentis frequently detected in chicken and Salmonella Thompson, which is always at the top as a causative agent of Salmonella food poisoning, has been regarded as a problem (hereinafter Salmonella is simply referred to as "S." In some cases).
日本では、サルモネラ属菌を原因とした食中毒が、1990年代から急増しており、年間平均約3000〜4000人もの人が感染している。日本国厚生労働省の食中毒統計でもサルモネラ属菌を原因とした食中毒は毎年2〜3位を保持しており、その感染予防対策は非常に困難である。 In Japan, food poisoning caused by Salmonella has increased rapidly since the 1990s, and an average of about 3000 to 4000 people are infected annually. According to the food poisoning statistics of the Japanese Ministry of Health, Labor and Welfare, food poisoning caused by Salmonella spp. Keeps 2-3rd every year, and it is very difficult to prevent infection.
こうしたサルモネラ食中毒事例の中で、原因食品が特定できたものの約50％が鶏卵による食中毒である。鶏卵のサルモネラ汚染経路としては、大きく分けて二つあり、一つは卵内の汚染、もう一つは卵殻の汚染である。前者の汚染は飼料などを通じて、鶏の卵巣内にサルモネラ属菌が定着したことが原因である。後者の汚染は、鶏の総排泄口付近あるいは環境に付着したサルモネラ属菌が原因である。したがって、サルモネラ汚染を防ぐためには、鶏のサルモネラ感染を予防し、養鶏場の環境を清浄化する必要がある。そのため、日本国農林水産省からは「鶏卵のサルモネラ総合対策指針」が出され、それにしたがって養鶏場ではサルモネラ対策が行われている。具体的には(1)飼料を加熱あるいは有機酸処理をしてサルモネラフリー化する、(2)生菌製剤あるいはオリゴ糖を用いて、鶏の腸内菌叢を強化する、(3)鶏に抗生物質を投与する、(4)消毒薬を用いて養鶏場等の環境のサルモネラ汚染を除去する、などの対策を行っている。しかし、これら全ての対策を実行するには、非常にコストがかかる上、養鶏場の消毒にホルマリン燻蒸のような人体にも影響の大きい薬剤が用いられる場合も多く、安全性にも大きな問題がある。また、抗生物質の投与は、耐性菌の出現が問題となっており、ヨーロッパでは2006年から抗生物質の飼料への添加が全面的に禁止されている。これらの問題は養鶏場に限らず、様々な家畜分野においても起こっている。このような背景から、低コストで安全で且つ確実なサルモネラ除去方法の確立が求められている。 Of these Salmonella food poisoning cases, about 50% of the foods that could identify the causative food were chicken egg food poisoning. There are two main ways of salmonella contamination of chicken eggs: contamination in eggs and contamination in eggshells. The former contamination is caused by colonization of Salmonella in the ovaries of chickens through feed. The latter contamination is caused by Salmonella spp. Near the total excretion opening of the chicken or in the environment. Therefore, in order to prevent Salmonella contamination, it is necessary to prevent chicken Salmonella infection and to clean the poultry farm environment. For this reason, the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries of Japan issued the “Guideline for Salmonella Comprehensive Countermeasures for Chicken Eggs”, and the chicken farms are taking countermeasures against salmonella accordingly. Specifically, (1) feed or heat treatment with organic acid to make Salmonella free, (2) use live bacterial preparations or oligosaccharides to strengthen the intestinal flora of chickens, (3) Measures such as administering antibiotics and (4) removing salmonella contamination in the poultry farm and other environments using disinfectants. However, in order to implement all these measures, it is very expensive, and there are many cases where chemicals that have a great influence on the human body, such as formalin fumigation, are used for disinfection of poultry farms. is there. In addition, antibiotics have become a problem due to the emergence of resistant bacteria, and since 2006, the addition of antibiotics to feed has been completely prohibited. These problems occur not only in poultry farms but also in various livestock fields. Against this background, there is a demand for the establishment of a safe and reliable method for removing Salmonella at low cost.
その新たな防除方法として、バクテリオファージの利用が挙げられる。バクテリオファージは、特定の細菌内でのみ増殖し、細胞を破壊または溶菌するウイルスである。バクテリオファージは1915〜1917年に発見され、バクテリオファージを用いた細菌感染症の治療が活発に行われていたが、1940年代に抗生物質をはじめとする化学療法が始まり、ファージ療法は表舞台より消えていった。しかし、近年、抗生物質に対する耐性菌の出現が大きな問題となり、その使用が控えられるようになっている。その抗生物質に替わる方法としてバクテリオファージを用いた感染制御法が再び注目を集めている。 As a new control method, bacteriophage can be used. A bacteriophage is a virus that grows only in certain bacteria and destroys or lyses cells. Bacteriophage was discovered in 1915-1917, and bacteriophage was used to treat bacterial infections actively. In the 1940s, antibiotics and other chemotherapy began, and phage therapy began on the stage. It disappeared. However, in recent years, the emergence of antibiotic-resistant bacteria has become a major problem, and its use has been refrained. Infection control methods using bacteriophages are attracting attention again as an alternative to antibiotics.
バクテリオファージを用いた感染制御法としては、人に対して、抗生物質の代わりに投与して、感染症を治癒した例や、創傷部に塗布して回復した例など多くの実用例がある他、果物や農産物の殺菌目的での実用例がある。最近では、欧米でバクテリオファージ製剤が認可を受けている。例を挙げると、アメリカにおいてリステリア食中毒の予防を目的としたLMP-102（Intralytix社）およびListex P-100（EBI Food Safety社）が食品添加物製剤として認可されている。 There are many practical examples of infection control methods using bacteriophages, such as cases in which infection is cured by administering to humans instead of antibiotics, and cases where the infection is cured by application to wounds. There are practical examples for the purpose of sterilizing fruits and agricultural products. Recently, bacteriophage preparations have been approved in the West. For example, LMP-102 (Intralytix) and Listex P-100 (EBI Food Safety) have been approved as food additive preparations in the United States for the purpose of preventing Listeria food poisoning.
家畜衛生および食中毒の分野で問題となるサルモネラ属菌に対する感染防御方法も研究されており、特に家禽で問題となるサルモネラ属菌に対するバクテリオファージを用いた感染制御法も報告されている（特許文献１〜３等参照）。 Infection protection methods against Salmonella, which is a problem in the fields of animal health and food poisoning, have been studied, and an infection control method using a bacteriophage against Salmonella, which is particularly problematic in poultry, has also been reported (Patent Document 1). -3 etc.)
しかし、上記特許文献に記載されたバクテリオファージは、S. Enteritidis、S. Typhimurium、S. Gallinarum、またはS. Pullorumに対して溶菌作用を発揮するものであり、近年問題視されているS. InfentisやS. Thompson、およびその他のサルモネラ属菌については記載されていない。家畜衛生を維持し、食中毒を防止するためには、サルモネラ属菌のS. Enteritidis、S. Typhimurium、S. GallinarumおよびS. Pullorumだけでなく、S. Infentis、S. Thompsonおよびその他サルモネラ属菌も制御する必要がある。 However, the bacteriophage described in the above patent document exhibits a lytic action against S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Gallinarum, or S. Pullorum, and has been regarded as a problem in recent years. And S. Thompson and other Salmonella species are not described. To maintain livestock hygiene and prevent food poisoning, not only Salmonella sp. S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Gallinarum and S. Pullorum, but also S. Infentis, S. Thompson and other Salmonella spp. Need to control.
本発明は、以上のような技術的背景の下、サルモネラ属に属する少なくともS. Enteritidis、S. Typhimurium、S. Gallinrum、S. Pullorum、S. InfentisおよびS. Thompsonに対して溶菌活性を有するバクテリオファージ、及び当該バクテリオファージを含有し、上記溶菌活性を有する組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、当該バクテリオファージ、またはそれを含有するバクテリオファージ組成物の用途、具体的にはサルモネラ属菌を選択的かつ効果的に防除するための各種用途を提供することを目的とする。 The present invention, under the technical background as described above, is a bacteriobacterium having lytic activity against at least S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Gallinrum, S. Pullorum, S. Infentis and S. Thompson belonging to the genus Salmonella. It aims at providing the composition which contains a phage and the said bacteriophage, and has the said lytic activity. Another object of the present invention is to provide uses of the bacteriophage or a bacteriophage composition containing the bacteriophage, specifically, various uses for selectively and effectively controlling Salmonella spp. .
前述するように、サルモネラ属菌の中には、ヒトに対して食中毒を起こしたり、家禽、ブタ、及びウシ等の家畜（非ヒト動物）にサルモネラ症等の感染症を引き起こす菌が複数存在する。 As mentioned above, among Salmonella spp., There are several bacteria that cause food poisoning to humans and cause infections such as salmonellosis in domestic animals (non-human animals) such as poultry, pigs, and cattle. .
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討していたところ、自然界より新たに単離したバクテリオファージが、上記ヒトに食中毒を起こしたり、非ヒト動物に感染症を引き起こす複数のサルモネラ属菌に対して優れた溶菌活性を示すことを見出し、当該バクテリオファージを用いることでこれらのサルモネラ属菌を一度に死滅させることができることを確認した。当該バクテリオファージ、並びにこれを含むバクテリオファージ組成物（ファージカクテル）を用いることで、サルモネラ属菌の防除、並びにサルモネラ属菌を原因とする食中毒や感染症の予防を有効に行うことができると考えられる。 The present inventor has been diligently studying to solve the above-mentioned problems, and the bacteriophage newly isolated from the natural world causes a plurality of Salmonella spp. That cause food poisoning in the human or cause infectious diseases in non-human animals. It has been found that the bacterium has excellent lytic activity, and by using the bacteriophage, it has been confirmed that these Salmonella can be killed at once. By using the bacteriophage and a bacteriophage composition (phage cocktail) containing the bacteriophage, it is considered that the control of Salmonella and the prevention of food poisoning and infection caused by Salmonella are effective. It is done.
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の実施態様を包含するものである。 The present invention has been completed based on this finding, and includes the following embodiments.
（Ｉ）新規バクテリオファージ
（I-1）下記の特性を有することを特徴とするバクテリオファージ：
（1-a）家禽に由来する、
（1-b）カウドウイルス目（Caudovirale）マイオウイルス科（Myoviridae）に属する、
（1-c）少なくともS. Entetitidis、S.Typhimurium、S. Gallinarum、S.Pullorum、S. Infentis、およびS.Thompsonに対して溶菌作用を有する、
（1-d）SDS存在下、95℃で5分間インキュベーションしたバクテリオファージ含有溶液を分画分子量が1〜15万のゲルで電気泳動したときに、60.1±1.0kDa、54.7±1.0kDa、42.4±1.0kDa、15.8±1.0kDa、及び14.8±1.0kDaにタンパク質のバンドが検出される、
（1-e）DNAサイズが84.5±1.0kbpである。
(I) Novel bacteriophage (I-1) Bacteriophage characterized by having the following characteristics:
(1-a) derived from poultry,
(1-b) belonging to the order of Caudovirale (Myoviridae),
(1-c) has lytic activity against at least S. Entetitidis, S. Typhimurium, S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Infentis, and S. Thompson,
(1-d) When a bacteriophage-containing solution incubated at 95 ° C. for 5 minutes in the presence of SDS was electrophoresed on a gel with a molecular weight cut off of 1 to 150,000, 60.1 ± 1.0 kDa, 54.7 ± 1.0 kDa, 42.4 ± Protein bands are detected at 1.0 kDa, 15.8 ± 1.0 kDa, and 14.8 ± 1.0 kDa,
(1-e) The DNA size is 84.5 ± 1.0 kbp.
なお、本明細書では当該バクテリオファージを「バクテリオファージΦSRY-1」、または「ファージΦSRY-1」若しくは「ΦSRY-1」と称する場合がある。 In the present specification, the bacteriophage may be referred to as “bacteriophage ΦSRY-1”, “phage ΦSRY-1” or “ΦSRY-1”.
（I-2）さらに下記の特性を有することを特徴とする（I-1）記載のバクテリオファージ：
（1-e）抽出したゲノムDNAを37℃で2時間HindIII処理し、0.8%アガロースゲルで電気泳動したときに、図６（A）の右レーンに示すパターンを示す。
（I-3）上記家禽が鶏である、（I-1）または（I-2）に記載するバクテリオファージ。
（I-4）さらにS. Hadar、S. Oranienburg、S.Newport、S. Agona、S. Derby、S. Heidelberg、S.Mbandaka、S. Meleagridis、S.Javiana、S. Paratyphi B、S.Choleraesuis、S. Worthington、S.Sofia、S. Strasbourg、S.Abortusequi、S. Dublin、S. Virchow、S. Anatum、S. Cerro、S. Montevideo、S.Give、及びS. Johannesburgからなる群から選択される少なくとも１つ、好ましくはすべてのサルモネラ属菌に対して溶菌活性を示すことを特徴とする（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載するバクテリオファージ。
（I-5）受託番号「NITE P-01498」として寄託されたバクテリオファージ、その原株、またはそれらの継代株である、（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載するバクテリオファージ。
(I-2) The bacteriophage according to (I-1), further having the following characteristics:
(1-e) When the extracted genomic DNA is treated with HindIII at 37 ° C. for 2 hours and electrophoresed on a 0.8% agarose gel, the pattern shown in the right lane of FIG. 6 (A) is shown.
(I-3) The bacteriophage according to (I-1) or (I-2), wherein the poultry are chickens.
(I-4) S. Hadar, S. Oranienburg, S. Newport, S. Agona, S. Derby, S. Heidelberg, S. Mbandaka, S. Meleagridis, S. Javiana, S. Paratyphi B, S. Choleraesuis Selected from the group consisting of: S. Worthington, S. Sofia, S. Strasbourg, S. Abortusequi, S. Dublin, S. Virchow, S. Anatum, S. Cerro, S. Montevideo, S. Give, and S. Johannesburg The bacteriophage according to any one of (I-1) to (I-3), wherein the bacteriophage exhibits lytic activity against at least one, preferably all Salmonella species.
(I-5) Described in any one of (I-1) to (I-4), which is a bacteriophage deposited under the deposit number “NITE P-01498”, its original strain, or a passage thereof. Bacteriophage.
（II）バクテリオファージ組成物
（II-1）上記（I-1）乃至（I-5）のいずれかに記載するバクテリオファージを含有し、少なくともS. Entetitidis、S.Typhimurium、S. Gallinarum、S.Pullorum、S. Infentis、およびS.Thompsonに対して溶菌作用を有するバクテリオファージ組成物。
（II-2）さらに、サルモネラ属菌に対して溶菌活性を示す他の１または２以上のバクテリオファージを含有することを特徴とする（II-1）記載のバクテリオファージ組成物。
（II-3）S. Entetitidis、S.Typhimurium、S. Gallinarum、S.Pullorum、S. Infentis、およびS.Thompsonに加えて、さらにS. Hadar、S. Oranienburg、S.Newport、S. Agona、S. Derby、S. Heidelberg、S.Mbandaka、S. Meleagridis、S.Javiana、S. Paratyphi B、S.Choleraesuis、S. Worthington、S.Sofia、S. Strasbourg、S.Abortusequi、S. Dublin、S. Virchow、S. Anatum、S. Cerro、S. Montevideo、S.Give、及びS. Johannesburgからなる群から選択される少なくとも１種のサルモネラ属菌、好ましくはこれらのサルモネラ属菌すべてに対して溶菌活性を示すことを特徴とする、（II-1）または（II-2）に記載するバクテリオファージ組成物。
（II-4）上記（I-1）乃至（I-5）のいずれかに記載するバクテリオファージに加えて、さらに下記（2）〜（6）に記載するバクテリオファージから選択される少なくとも１種のバクテリオファージを含有する、（II-1）乃至（II-3）のいずれかに記載するバクテリオファージ組成物：
（2）下記の特性を有することを特徴とするバクテリオファージ：
（2-a）家禽に由来する、
（2-b）カウドウイルス目（Caudovirale）マイオウイルス科（Myoviridae）に属する、
（2-c）少なくともS. Entetitidis、S.Typhimurium、S. Infentis、S. Newport、およびS. Gallinarum対して溶菌活性を有する、
（2-d）SDS存在下、95℃で5分間インキュベーションしたバクテリオファージ含有溶液を分画分子量が1〜15万のゲルで電気泳動したときに、53.2±1.0kDa、42.1±1.0kDa、15.8±1.0kDa、及び14.3±1.0kDaにタンパク質のバンドが検出される、
（2-e）DNAサイズが84.7±1.0kbpである；
（なお、本明細書では当該バクテリオファージを「バクテリオファージΦSRY-2」、または「ファージΦSRY-2」若しくは「ΦSRY-2」と称する場合がある。）
(II) bacteriophage composition (II-1) containing the bacteriophage described in any of (I-1) to (I-5) above, and containing at least S. Entetitidis, S. Typhimurium, S. Gallinarum, S A bacteriophage composition having lytic activity against Pullorum, S. Infentis, and S. Thompson.
(II-2) The bacteriophage composition according to (II-1), further comprising one or more other bacteriophages exhibiting lytic activity against Salmonella spp.
(II-3) In addition to S. Entetitidis, S. Typhimurium, S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Infentis, and S. Thompson, S. Hadar, S. Oranienburg, S. Newport, S. Agona, S. Derby, S. Heidelberg, S. Mbandaka, S. Meleagridis, S. Javiana, S. Paratyphi B, S. Choleraesuis, S. Worthington, S. Sofia, S. Strasbourg, S. Abortusequi, S. Dublin, S Lysis against at least one Salmonella selected from the group consisting of Virchow, S. Anatum, S. Cerro, S. Montevideo, S. Give, and S. Johannesburg, preferably all of these Salmonella The bacteriophage composition according to (II-1) or (II-2), which exhibits activity.
(II-4) In addition to the bacteriophage described in any of (I-1) to (I-5) above, at least one selected from the bacteriophages described in (2) to (6) below: The bacteriophage composition according to any one of (II-1) to (II-3), comprising:
(2) Bacteriophage characterized by having the following characteristics:
(2-a) derived from poultry,
(2-b) belonging to the order Caudovirale (Myoviridae),
(2-c) has lytic activity against at least S. Entetitidis, S. Typhimurium, S. Infentis, S. Newport, and S. Gallinarum,
(2-d) When a bacteriophage-containing solution incubated at 95 ° C. for 5 minutes in the presence of SDS was electrophoresed on a gel with a molecular weight cut off of 1 to 150,000, 53.2 ± 1.0 kDa, 42.1 ± 1.0 kDa, 15.8 ± Protein bands are detected at 1.0 kDa and 14.3 ± 1.0 kDa,
(2-e) the DNA size is 84.7 ± 1.0 kbp;
(In this specification, the bacteriophage may be referred to as “bacteriophage ΦSRY-2”, or “phage ΦSRY-2” or “ΦSRY-2”.)
（3）下記の特性を有することを特徴とするバクテリオファージ：
（3-a）家禽に由来する、
（3-b）カウドウイルス目（Caudovirale）サイフォウイルス科（Siphoviridae）に属する、
（3-c）少なくともS. Infentis、S.Gallinarum、S. Pullorum、S.Oranienburg、およびS. Derby、に対して溶菌作用を有する、
（3-d）SDS存在下、95℃で5分間インキュベーションしたバクテリオファージ含有溶液を分画分子量が1〜15万のゲルで電気泳動したときに、60.3±1.0kDa、55.5±1.0kDa、35.0±1.0kDa、28.9±1.0kDa、及び18.9±1.0kDaにタンパク質のバンドが検出される、
（3-e）DNAサイズが、106.6±1.0kbpである；
（なお、本明細書では当該バクテリオファージを「バクテリオファージΦSRY-3」、または「ファージΦSRY-3」若しくは「ΦSRY-3」と称する場合がある。）
(3) Bacteriophage characterized by having the following characteristics:
(3-a) derived from poultry,
(3-b) belongs to the order Caudovirale (Siphoviridae),
(3-c) has a lytic action against at least S. Infentis, S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Oranienburg, and S. Derby,
(3-d) When a bacteriophage-containing solution incubated at 95 ° C. for 5 minutes in the presence of SDS was electrophoresed on a gel with a molecular weight cut off of 1 to 150,000, 60.3 ± 1.0 kDa, 55.5 ± 1.0 kDa, 35.0 ± Protein bands are detected at 1.0 kDa, 28.9 ± 1.0 kDa, and 18.9 ± 1.0 kDa,
(3-e) the DNA size is 106.6 ± 1.0 kbp;
(In this specification, the bacteriophage may be referred to as “bacteriophage ΦSRY-3”, or “phage ΦSRY-3” or “ΦSRY-3”.)
（4）下記の特性を有することを特徴とするバクテリオファージ：
（4-a）家禽に由来する、
（4-b）カウドウイルス目（Caudovirale）マイオウイルス科（Myoviridae）に属する、
（4-c）少なくともS. Entetitidis、S.Typhimurium、S. Infentis、S. Thompson、S. NewportおよびS. Agonaに対して溶菌活性を有する、
（4-d）SDS存在下、95℃で5分間インキュベーションしたバクテリオファージ含有溶液を分画分子量が1〜15万のゲルで電気泳動したときに、51.2±1.0kDa、39.2±1.0kDa、16.0±1.0kDa、及び14.4±1.0kDaにタンパク質のバンドが検出される、
（4-e）DNAサイズが140.8±1.0kbpである；
（なお、本明細書では当該バクテリオファージを「バクテリオファージΦSRY-4」、または「ファージΦSRY-4」若しくは「ΦSRY-4」と称する場合がある。）
(4) Bacteriophage characterized by having the following characteristics:
(4-a) derived from poultry,
(4-b) belonging to the order of Caudovirale (Myoviridae),
(4-c) has lytic activity against at least S. Entetitidis, S. Typhimurium, S. Infentis, S. Thompson, S. Newport and S. Agona,
(4-d) 51.2 ± 1.0 kDa, 39.2 ± 1.0 kDa, 16.0 ± when a bacteriophage-containing solution incubated at 95 ° C. for 5 minutes in the presence of SDS was electrophoresed on a gel with a fractional molecular weight of 1 to 150,000. Protein bands are detected at 1.0 kDa and 14.4 ± 1.0 kDa,
(4-e) the DNA size is 140.8 ± 1.0 kbp;
(In this specification, the bacteriophage may be referred to as “bacteriophage ΦSRY-4”, or “phage ΦSRY-4” or “ΦSRY-4”.)
（5）下記の特性を有することを特徴とするバクテリオファージ：
（5-a）家禽に由来する、
（5-b）カウドウイルス目（Caudovirale）サイフォウイルス科（Siphoviridae）に属する、
（5-c）少なくともS. Entetitidis、S.Typhimurium、S. Infentis、S.GallinarumおよびS. Agonaに対して溶菌活性を有する、
（5-d）SDS存在下、95℃で5分間インキュベーションしたバクテリオファージ含有溶液を分画分子量が1〜15万のゲルで電気泳動したときに、35.2±1.0kDa、28.8±1.0kDa、及び20.2±1.0kDaにタンパク質のバンドが検出される、
（5-e）DNAサイズが108.5±1.0kbpである；
（なお、本明細書では当該バクテリオファージを「バクテリオファージΦSRY-5」、または「ファージΦSRY-5」若しくは「ΦSRY-5」と称する場合がある。）
(5) Bacteriophage characterized by having the following characteristics:
(5-a) derived from poultry,
(5-b) belongs to the order Caudovirale (Siphoviridae),
(5-c) has lytic activity against at least S. Entetitidis, S. Typhimurium, S. Infentis, S. Gallinarum and S. Agona,
When a bacteriophage-containing solution incubated at 95 ° C. for 5 minutes in the presence of (5-d) SDS was electrophoresed on a gel having a fractional molecular weight of 1 to 150,000, 35.2 ± 1.0 kDa, 28.8 ± 1.0 kDa, and 20.2 A protein band is detected at ± 1.0 kDa,
(5-e) the DNA size is 108.5 ± 1.0 kbp;
(In this specification, the bacteriophage may be referred to as “bacteriophage ΦSRY-5” or “phage ΦSRY-5” or “ΦSRY-5”.)
（6）下記の特性を有することを特徴とするバクテリオファージ：
（6-a）家禽に由来する、
（6-b）イノウイルス科（Inoviridae） に属する、
（6-c）少なくともS. Gallinarum、S.Pullorum、S. Abortusequi、S.Anatum、およびS. Giveに対して溶菌活性を有する、
（6-d）SDS存在下、95℃で5分間インキュベーションしたバクテリオファージ含有溶液を分画分子量が1〜15万のゲルで電気泳動したときに、59.2±1.0kDa、及び41.6±1.0kDaにタンパク質のバンドが検出される、
（6-e）DNAサイズが38.7±1.0kbpである；
（なお、本明細書では当該バクテリオファージを「バクテリオファージΦSRY-6」、または「ファージΦSRY-6」若しくは「ΦSRY-6」と称する場合がある。）。
(6) Bacteriophage characterized by having the following characteristics:
(6-a) derived from poultry,
(6-b) belonging to the family Inoviridae,
(6-c) has lytic activity against at least S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Abortusequi, S. Anatum, and S. Give,
When a bacteriophage-containing solution incubated at 95 ° C for 5 minutes in the presence of (6-d) SDS is electrophoresed on a gel with a molecular weight cut off of 1 to 150,000, the protein is 59.2 ± 1.0 kDa and 41.6 ± 1.0 kDa. Band is detected,
(6-e) the DNA size is 38.7 ± 1.0 kbp;
(In this specification, the bacteriophage may be referred to as “bacteriophage ΦSRY-6”, or “phage ΦSRY-6” or “ΦSRY-6”.)
（II-5）上記のバクテリオファージΦSRY-2〜ΦSRY-6が、それぞれさらに下記の特性を有するものである、（II-4）に記載するバクテリオファージ組成物：
（2-e）ΦSRY-2：抽出したゲノムDNAを37℃で2時間HindIII処理し0.8%アガロースゲルで電気泳動したときに、図６（B）の右レーンに示すパターンを示す、
（3-e）ΦSRY-3：抽出したゲノムDNAを37℃で2時間HindIII処理し、0.8%アガロースゲルで電気泳動したときに、図６（C）の右レーンに示すパターンを示す、
（4-e）ΦSRY-4：抽出したゲノムDNAを37℃で2時間Hind III処理し、0.8%アガロースゲルで電気泳動したとき、図７（D）の右レーンに示すパターンを示す、
（5-e）ΦSRY-5：抽出したゲノムDNAを37℃で2時間EcoRI処理し、0.8%アガロースゲルで電気泳動したときに、図７（E）の右レーンに示すパターンを示す、
（6-e）ΦSRY-6：抽出したゲノムDNAを37℃で2時間HindIII処理し、0.8%アガロースゲルで電気泳動したときに、図７（F）の右レーンに示すパターンを示す。
（II-6）上記（2）バクテリオファージΦSRY-2が受託番号「NITE P-01499」で寄託されたバクテリオファージ、その原株、またはそれらの継代株である、（II-4）または（II-5）に記載するバクテリオファージ組成物。
（II-7）上記（3）バクテリオファージΦSRY-3が受託番号「NITE P-01500」で寄託されたバクテリオファージ、その原株、またはそれらの継代株である、（II-4）乃至（II-6）のいずれかに記載するバクテリオファージ組成物。
（II-8）上記（4）バクテリオファージΦSRY-4が受託番号「NITE P-01501」で寄託されたバクテリオファージ、その原株、またはそれらの継代株である、（II-4）乃至（II-7）のいずれかに記載するバクテリオファージ組成物。
（II-9）上記（5）バクテリオファージΦSRY-5が受託番号「NITE P-01502」で寄託されたバクテリオファージ、その原株、またはそれらの継代株である、（II-4）乃至（II-8）のいずれかに記載するバクテリオファージ組成物。
（II-10）上記（6）バクテリオファージΦSRY-6が受託番号「NITE P-01503」で寄託されたバクテリオファージ、その原株、またはそれらの継代株である、（II-4）乃至（II-9）のいずれかに記載するバクテリオファージ組成物。
（II-11）上記（I-1）乃至（I-5）のいずれかに記載するバクテリオファージが、ゼラチン含有リン酸緩衝液及びゼラチン含有グリシン緩衝液からなる群から選択されるいずれかの緩衝液中に配合されてなることを特徴とする、（II-1）乃至（II-10）のいずれかに記載するバクテリオファージ組成物。
(II-5) The bacteriophage composition according to (II-4), wherein each of the bacteriophages ΦSRY-2 to ΦSRY-6 further has the following characteristics:
(2-e) ΦSRY-2: When the extracted genomic DNA was treated with HindIII at 37 ° C. for 2 hours and electrophoresed on a 0.8% agarose gel, the pattern shown in the right lane of FIG. 6 (B) is shown.
(3-e) ΦSRY-3: When the extracted genomic DNA was treated with HindIII at 37 ° C. for 2 hours and electrophoresed on a 0.8% agarose gel, the pattern shown in the right lane of FIG. 6 (C) is shown.
(4-e) ΦSRY-4: When the extracted genomic DNA was treated with Hind III at 37 ° C. for 2 hours and electrophoresed on a 0.8% agarose gel, the pattern shown in the right lane of FIG.
(5-e) ΦSRY-5: When the extracted genomic DNA was treated with EcoRI at 37 ° C. for 2 hours and electrophoresed on a 0.8% agarose gel, the pattern shown in the right lane of FIG.
(6-e) ΦSRY-6: The extracted genomic DNA was subjected to HindIII treatment at 37 ° C. for 2 hours and electrophoresed on a 0.8% agarose gel, and the pattern shown in the right lane of FIG. 7 (F) is shown.
(II-6) The above (2) bacteriophage ΦSRY-2 is a bacteriophage deposited under the accession number “NITE P-01499”, its original strain, or a passage thereof, (II-4) or ( The bacteriophage composition described in II-5).
(II-7) The above (3) bacteriophage ΦSRY-3 is a bacteriophage deposited under the deposit number “NITE P-01500”, its original strain, or a passage thereof (II-4) to (II) The bacteriophage composition according to any one of II-6).
(II-8) The above (4) bacteriophage ΦSRY-4 is the bacteriophage deposited under the accession number “NITE P-01501”, its original strain, or a passage thereof (II-4) to ( The bacteriophage composition according to any one of II-7).
(II-9) The above (5) bacteriophage ΦSRY-5 is a bacteriophage deposited under the accession number “NITE P-01502”, its original strain, or a passage thereof (II-4) to ( The bacteriophage composition according to any one of II-8).
(II-10) The above (6) bacteriophage ΦSRY-6 is the bacteriophage deposited under the accession number “NITE P-01503”, its original strain, or a passage thereof (II-4) to (II) The bacteriophage composition according to any one of II-9).
(II-11) The buffer according to any one of (I-1) to (I-5), wherein the bacteriophage is selected from the group consisting of a gelatin-containing phosphate buffer and a gelatin-containing glycine buffer. The bacteriophage composition according to any one of (II-1) to (II-10), wherein the bacteriophage composition is formulated in a liquid.
（III）サルモネラ防除剤、及びサルモネラ属菌の防除方法
（III-1）上記（I-1）乃至（I-5）のいずれかに記載するバクテリオファージ、または上記（II-1）乃至（II-11）のいずれかに記載するバクテリオファージ組成物を有効成分とするサルモネラ属菌に対する防除剤（サルモネラ防除剤）。
（III-2）上記サルモネラ属菌が、少なくともS. Entetitidis、S.Typhimurium、S. Gallinarum、S.Pullorum、S. Infentis、およびS.Thompsonである、（III-1）に記載するサルモネラ防除剤。
（III-3）上記サルモネラ属菌が、S. Entetitidis、S.Typhimurium、S. Gallinarum、S.Pullorum、S. Infentis、S.Thompson、S. Hadar、S. Oranienburg、S.Newport、S. Agona、S. Derby、S. Heidelberg、S.Mbandaka、S. Meleagridis、S.Javiana、S. Paratyphi B、S.Choleraesuis、S. Worthington、S.Sofia、S. Strasbourg、S.Abortusequi、S. Dublin、S. Virchow、S. Anatum、S. Cerro、S. Montevideo、S.Give、及びS. Johannesburgである、（III-1）に記載するサルモネラ防除剤。
（III-4）上記サルモネラ防除剤が、食品添加物、家畜飼料用添加物、ペット餌料用添加物、ヒト用医薬組成物、非ヒト動物用医薬組成物、及び殺菌または消毒剤からなる群から選択されるいずれかである、（III-1）乃至（III-3）のいずれかに記載するサルモネラ防除剤。
（III-5）上記（I-1）乃至（I-5）のいずれかに記載するバクテリオファージ、または上記（II-1）乃至（II-11）のいずれかに記載するバクテリオファージ組成物を用いて、サルモネラ属菌を防除すべき被処理物を処理する工程を有する、サルモネラ属菌の防除方法。
（III-6）上記サルモネラ属菌が、少なくともS. Entetitidis、S.Typhimurium、S. Gallinarum、S.Pullorum、S. Infentis、およびS.Thompsonである、（III-5）に記載する防除方法。
（III-7）上記サルモネラ属菌が、S. Entetitidis、S.Typhimurium、S. Gallinarum、S.Pullorum、S. Infentis、S.Thompson、S. Hadar、S. Oranienburg、S.Newport、S. Agona、S. Derby、S. Heidelberg、S.Mbandaka、S. Meleagridis、S.Javiana、S. Paratyphi B、S.Choleraesuis、S. Worthington、S.Sofia、S. Strasbourg、S.Abortusequi、S. Dublin、S. Virchow、S. Anatum、S. Cerro、S. Montevideo、S.Give、及びS. Johannesburgである、（III-5）に記載する防除方法。
(III) Salmonella control agent and Salmonella control method (III-1) The bacteriophage according to any one of (I-1) to (I-5) above, or (II-1) to (II above) -11) A control agent (Salmonella control agent) against Salmonella spp. Containing the bacteriophage composition described in any one of the above.
(III-2) The Salmonella control agent according to (III-1), wherein the Salmonella genus is at least S. Entetitidis, S. Typhimurium, S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Infentis, and S. Thompson. .
(III-3) The above Salmonella spp. Are S. Entetitidis, S. Typhimurium, S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Infentis, S. Thompson, S. Hadar, S. Oranienburg, S. Newport, S. Agona , S. Derby, S. Heidelberg, S. Mbandaka, S. Meleagridis, S. Javiana, S. Paratyphi B, S. Choleraesuis, S. Worthington, S. Sofia, S. Strasbourg, S. Abortusequi, S. Dublin, The salmonella control agent described in (III-1), which is S. Virchow, S. Anatum, S. Cerro, S. Montevideo, S. Give, and S. Johannesburg.
(III-4) The Salmonella control agent is selected from the group consisting of food additives, livestock feed additives, pet food additives, human pharmaceutical compositions, non-human animal pharmaceutical compositions, and disinfectants or disinfectants. The salmonella control agent according to any one of (III-1) to (III-3), which is any one selected.
(III-5) A bacteriophage according to any one of (I-1) to (I-5) above or a bacteriophage composition according to any one of (II-1) to (II-11) above. A method for controlling Salmonella, comprising a step of treating an object to be treated, which is used to control Salmonella.
(III-6) The control method according to (III-5), wherein the Salmonella genus is at least S. Entetitidis, S. Typhimurium, S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Infentis, and S. Thompson.
(III-7) The above-mentioned Salmonella spp. Are S. Entetitidis, S. Typhimurium, S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Infentis, S. Thompson, S. Hadar, S. Oranienburg, S. Newport, S. Agona , S. Derby, S. Heidelberg, S. Mbandaka, S. Meleagridis, S. Javiana, S. Paratyphi B, S. Choleraesuis, S. Worthington, S. Sofia, S. Strasbourg, S. Abortusequi, S. Dublin, The control method according to (III-5), which is S. Virchow, S. Anatum, S. Cerro, S. Montevideo, S. Give, and S. Johannesburg.
本発明が提供するバクテリオファージΦSRY-1は、サルモネラ属菌の少なくともS. Enteritidis、S.Typhimurium、S. Infentis、S.Tompson、S. GallinarumおよびS.Pullorumに対して有効に働き、溶菌を引き起こす。これらのサルモネラ属菌のうち、S. EnteritidisおよびS.Typhimuriumは、ヒトに対して食中毒を起こし、家禽、ブタおよびウシなどの家畜にサルモネラ感染症を引き起こす原因菌であり、またS.Tompson及びS. Infentisはヒトに対して食中毒を起こすことが知られているサルモネラ属菌である。また、S. GallinarumおよびS.Pullorumは家禽に特異的にサルモネラ感染症を発症させる原因菌であり、その家禽サルモネラ感染症は法定伝染病に指定されている。当該バクテリオファージΦSRY-1は、より詳細には、上記サルモネラ属菌以外のサルモネラ属菌、例えばS. Hadar、S. Oranienburg、S.Newport、S. Agona、S. Derby、S. Heidelberg、S.Mbandaka、S. Meleagridis、S.Javiana、S. Paratyphi B、S.Choleraesuis、S. Worthington、S.Sofia、S. Strasbourg、S.Abortusequi、S. Dublin、S. Virchow、S. Anatum、S. Cerro、S. Montevideo、S.Give、及びS. Johannesburgからなる群から選択される１または２以上、好ましくはこれらすべてのサルモネラ属菌に対しても有効に働き、溶菌を引き起こす。また本発明のバクテリオファージ組成物は、上記バクテリオファージΦSRY-1に加えて、異なるタイプの他のバクテリオファージを１種または２種以上含むものである。 The bacteriophage ΦSRY-1 provided by the present invention works effectively against Salmonella spp. At least S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Infentis, S. Tompson, S. Gallinarum and S. Pullorum and causes lysis . Of these Salmonella spp., S. Enteritidis and S. Typhimurium are causative organisms that cause food poisoning to humans and cause Salmonella infections in domestic animals such as poultry, pigs and cattle, and S. Tompson and S. Infentis is a Salmonella that is known to cause food poisoning in humans. In addition, S. Gallinarum and S. Pullorum are causative bacteria that cause Salmonella infections specifically in poultry, and the poultry Salmonella infections are designated as legal infectious diseases. More specifically, the bacteriophage ΦSRY-1 is a Salmonella genus other than the Salmonella genus, such as S. Hadar, S. Oranienburg, S. Newport, S. Agona, S. Derby, S. Heidelberg, S. Mbandaka, S. Meleagridis, S. Javiana, S. Paratyphi B, S. Choleraesuis, S. Worthington, S. Sofia, S. Strasbourg, S. Abortusequi, S. Dublin, S. Virchow, S. Anatum, S. Cerro , S. Montevideo, S.Give, and S. Johannesburg are effective against one or more selected from the group consisting of S. Johannesburg, preferably all of these, and cause lysis. In addition to the bacteriophage ΦSRY-1, the bacteriophage composition of the present invention contains one or more other bacteriophages of different types.
従って、本発明のバクテリオファージΦSRY-1、またはこれを含むバクテリオファージ組成物によれば、自然界に分布する種々のサルモネラ属菌の防除に有効に使用することが可能である。また、自然発生するファージ耐性菌の生育も抑えることができる。 Therefore, the bacteriophage ΦSRY-1 of the present invention or the bacteriophage composition containing the bacteriophage ΦSRY-1 can be effectively used for controlling various Salmonella species distributed in nature. Moreover, the growth of naturally occurring phage-resistant bacteria can also be suppressed.
特にファージは安価で大量生産できるので、養鶏場等の家畜衛生環境に散布して、環境中に存在するサルモネラ属菌を殺菌することができる。また、鶏等家畜に直接接種させることにより、家畜に対するサルモネラ属菌の感染を予防したり、サルモネラ感染を治療することが可能である。さらに食品に、食品添加物として添加しておくと、食品中のサルモネラ属菌の増殖を抑制することができ、サルモネラ食中毒を防止することが可能である。 In particular, since phages are inexpensive and can be mass-produced, they can be sprayed in a livestock hygiene environment such as a poultry farm to sterilize Salmonella spp. In addition, by directly inoculating livestock such as chickens, it is possible to prevent Salmonella infection from livestock or to treat Salmonella infection. Furthermore, when added to food as a food additive, the growth of Salmonella spp. In the food can be suppressed, and food poisoning of Salmonella can be prevented.
（Ｉ）新規バクテリオファージ
本発明はサルモネラ属菌に対して溶菌活性を有する新規なバクテリオファージΦSRY-1に関する。当該ΦSRY-1は、少なくとも下記（1-a）〜（1-e）の特性を有することを特徴とする。
(I) Novel Bacteriophage The present invention relates to a novel bacteriophage ΦSRY-1 having lytic activity against Salmonella spp. The ΦSRY-1 has at least the following characteristics (1-a) to (1-e).
（1-a）家禽に由来する：
実施例１で説明するように、ΦSRY-1は家禽、具体的には鶏から単離されたファージである。よってΦSRY-1は家禽、特に鶏に由来するバクテリオファージである。
(1-a) derived from poultry:
As explained in Example 1, ΦSRY-1 is a phage isolated from poultry, specifically chickens. Therefore, ΦSRY-1 is a bacteriophage derived from poultry, especially chicken.
（1-b）マイオウイルス科（Myoviridae）に属する：
図１（Ａ）に示す電子顕微鏡画像に示すように頭部と収縮性の尾部を有することを特徴とするマイオウイルス科に属する細菌感染性のバクテリオファージである（実施例４）。
(1-b) belonging to Myoviridae:
As shown in the electron microscope image shown in FIG. 1 (A), it is a bacterial infectious bacteriophage belonging to the Myoviridae, characterized by having a head and a contractile tail (Example 4).
（1-c）少なくともS. Entetitidis、S.Typhimurium、S. Gallinarum、S.Pullorum、S. Infentis、およびS.Thompsonに対して溶菌活性を有する：
図２に各種サルモネラ属菌に対する溶菌活性を示す（実施例２）。これからわかるように、ΦSRY-1は少なくともS. Entetitidis、S.Typhimurium、S. Gallinarum、S.Pullorum、S. Infentis、およびS.Thompsonに対して溶菌作用を有し、より詳細には上記サルモネラ属菌に加えて、さらに他のサルモネラ属菌、例えばS. Hadar、S. Oranienburg、S.Newport、S. Agona、S. Derby、S. Heidelberg、S.Mbandaka、S. Meleagridis、S.Javiana、S. Paratyphi B、S.Choleraesuis、S. Worthington、S.Sofia、S. Strasbourg、S.Abortusequi、S. Dublin、S. Virchow、S. Anatum、S. Cerro、S. Montevideo、S.Give、及びS. Johannesburgに対しても溶菌活性を有する。
(1-c) has lytic activity against at least S. Entetitidis, S. Typhimurium, S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Infentis, and S. Thompson:
FIG. 2 shows the lytic activity against various Salmonella species (Example 2). As can be seen, ΦSRY-1 has a lytic action on at least S. Entetitidis, S. Typhimurium, S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Infentis, and S. Thompson, and more specifically, Salmonella In addition to fungi, other Salmonella species, such as S. Hadar, S. Oranienburg, S. Newport, S. Agona, S. Derby, S. Heidelberg, S. Mbandaka, S. Meleagridis, S. Javiana, S Paratyphi B, S.Choleraesuis, S. Worthington, S.Sofia, S. Strasbourg, S.Abortusequi, S. Dublin, S. Virchow, S. Anatum, S. Cerro, S. Montevideo, S.Give, and S Has lytic activity against Johannesburg.
（1-d）SDS存在下、95℃で5分間インキュベーションしたバクテリオファージ含有溶液を分画分子量が1万〜15万のゲルで電気泳動したときに、60.1±1.0kDa、54.7±1.0kDa、42.4±1.0kDa、15.8±1.0kDa、及び14.8±1.0kDaにタンパク質のバンドが検出される：
図３（Ａ）に、ΦSRY-1をSDS存在下、95℃で5分間インキュベーションしたバクテリオファージ含有溶液を分画分子量が1万〜15万のゲルで電気泳動した画像を示す（実施例５）。これからわかるように、電気泳動像上、60.1kDa、54.7kDa、42.4kDa、15.8kDa、及び14.8kDaに相当する位置（検出誤差を考慮しても±0.1程度）にタンパク質のバンドが検出される。このことから、ΦSRY-1は、少なくとも60.1±1.0kDa、54.7±1.0kDa、42.4±1.0kDa、15.8±1.0kDa、及び14.8±1.0kDaの分子量を有するタンパク質を主要構造タンパク質として有するバクテリオファージであると考えられる。
(1-d) When a bacteriophage-containing solution incubated at 95 ° C. for 5 minutes in the presence of SDS was electrophoresed on a gel with a molecular weight cut off of 10,000 to 150,000, 60.1 ± 1.0 kDa, 54.7 ± 1.0 kDa, 42.4 Protein bands are detected at ± 1.0 kDa, 15.8 ± 1.0 kDa, and 14.8 ± 1.0 kDa:
FIG. 3A shows an image obtained by electrophoresis of a bacteriophage-containing solution obtained by incubating ΦSRY-1 in the presence of SDS at 95 ° C. for 5 minutes with a gel having a molecular weight cut-off of 10,000 to 150,000 (Example 5). . As can be seen, protein bands are detected at positions corresponding to 60.1 kDa, 54.7 kDa, 42.4 kDa, 15.8 kDa, and 14.8 kDa (about ± 0.1 considering the detection error) on the electrophoresis image. From this, ΦSRY-1 is a bacteriophage having a protein with a molecular weight of at least 60.1 ± 1.0 kDa, 54.7 ± 1.0 kDa, 42.4 ± 1.0 kDa, 15.8 ± 1.0 kDa, and 14.8 ± 1.0 kDa as the main structural protein it is conceivable that.
（1-e）DNAサイズが84.5±1.0kbpである。 (1-e) The DNA size is 84.5 ± 1.0 kbp.
当該DNAサイズは、ΦSRY-1から抽出したのゲノムDNAをシークエンス解析することに得ることができる。当該シークエンス解析によりΦSRY-1のゲノムDNAのサイズは84.5kbpとして特定されるが、測定誤差を考慮しても84.5kbp±1.0kbpの範囲内にある。 The DNA size can be obtained by sequence analysis of genomic DNA extracted from ΦSRY-1. Although the size of the genomic DNA of ΦSRY-1 is specified as 84.5 kbp by the sequence analysis, it is within the range of 84.5 kbp ± 1.0 kbp even if measurement error is taken into consideration.
このように、ΦSRY-1は鶏から単離され、上記（1-b）〜（1-e）の特性を有するものであり、その限りにおいて特に限定されるものではない。 Thus, ΦSRY-1 is isolated from chickens and has the characteristics (1-b) to (1-e) described above, and is not particularly limited as long as it is.
なお、図６（Ａ）の右レーンに、ΦSRY-1から抽出したゲノムDNAを37℃で2時間HindIII処理した処理物を0.8％アガロースゲルで電気泳動した画像を示す（実施例６）。これからわかるように、ΦSRY-1のゲノムDNAは制限酵素HindIII処理により特徴的な切断パターンを示す。このため、ΦSRY-1は上記（1-a）〜（1-e）の特性に加えて、さらに下記の特性（1-f）を有するものであってもよい。 The right lane of FIG. 6 (A) shows an image obtained by electrophoresis of a processed product obtained by treating HindIII with genomic DNA extracted from ΦSRY-1 at 37 ° C. for 2 hours on a 0.8% agarose gel (Example 6). As can be seen, the genomic DNA of ΦSRY-1 shows a characteristic cleavage pattern by treatment with the restriction enzyme HindIII. Therefore, ΦSRY-1 may further have the following characteristic (1-f) in addition to the above characteristics (1-a) to (1-e).
（1-f）抽出したゲノムDNAを37℃で2時間HindIII処理し、0.8%アガロースゲルで電気泳動したとき、図6（A）の右レーンに示すパターンを示す。 (1-f) When the extracted genomic DNA is treated with HindIII at 37 ° C. for 2 hours and electrophoresed on a 0.8% agarose gel, the pattern shown in the right lane of FIG. 6 (A) is shown.
かかる（1-a）〜（1-f）の特性を有するΦSRY-1は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8に住所を有する独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに、2012年12月28日付けで識別の表示：ΦSRY-1、受託番号NITE P-01498として寄託されている（通知番号：2012-0515、通知年月日：2013年4月25日）。但し、上記（1-a）〜（1-e）または（1-a）〜（1-f）の特性を備える限り、当該寄託菌に限らず、その継代株、並びに寄託菌の原株及びその継代株も本発明のΦSRY-1に含まれる。 ΦSRY-1, which has the characteristics of (1-a) to (1-f), is an independent administrative agency, Product Evaluation Technology Fundamental Organization, which has an address in Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan. Indication of identification as of December 28, 2012: ΦSRY-1 and deposit number NITE P-01498 (Notification number: 2012-0515, Notification date: April 25, 2013) . However, as long as it has the above characteristics (1-a) to (1-e) or (1-a) to (1-f), it is not limited to the deposited bacterium, its passages, and the original strain of the deposited bacterium And its passage strains are also included in ΦSRY-1 of the present invention.
（II）バクテリオファージ組成物
本発明が提供するバクテリオファージ組成物は、上記バクテリオファージΦSRY-1を含有し、サルモネラ属菌のうち少なくともS. Enteritidis、S. Typhimurium、S. Gallinarum、S. Pullorum、S. InfentisおよびS. Thompsonに対して溶菌活性を有することを特徴とする組成物である。好ましくは、これらのサルモネラ属菌に加えて、さらにS. Hadar、S. Oranienburg、S.Newport、S. Agona、S. Derby、S. Heidelberg、S.Mbandaka、S. Meleagridis、S.Javiana、S. Paratyphi B、S.Choleraesuis、S. Worthington、S.Sofia、S. Strasbourg、S.Abortusequi、S. Dublin、S. Virchow、S. Anatum、S. Cerro、S. Montevideo、S.Give、及びS. Johannesburgからなる群から選択される少なくとも１種のサルモネラ属菌、より好ましくはこれらすべてのサルモネラ属菌に対して溶菌活性を示すバクテリオファージ組成物である。
(II) Bacteriophage composition The bacteriophage composition provided by the present invention contains the bacteriophage ΦSRY-1, and at least S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Gallinarum, S. Pullorum, It is a composition characterized by having lytic activity against S. Infentis and S. Thompson. Preferably, in addition to these Salmonella species, S. Hadar, S. Oranienburg, S. Newport, S. Agona, S. Derby, S. Heidelberg, S. Mbandaka, S. Meleagridis, S. Javiana, S. Paratyphi B, S.Choleraesuis, S. Worthington, S.Sofia, S. Strasbourg, S.Abortusequi, S. Dublin, S. Virchow, S. Anatum, S. Cerro, S. Montevideo, S.Give, and S A bacteriophage composition exhibiting lytic activity against at least one Salmonella selected from the group consisting of Johannesburg, more preferably against all these Salmonella.
当該バクテリオファージ組成物には、上記バクテリオファージΦSRY-1に加えて、さらにサルモネラ属菌に対して溶菌活性を示す他の１または２以上のバクテリオファージを含有する組成物が含まれる。かかるバクテリオファージとして、具体的には下記（2）〜（6）に挙げるバクテリオファージΦSRY-2〜ΦSRY-6を挙げることができる。これら（2）〜（6）のバクテリオファージは、１種単独でΦSRY-1と組み合わせてバクテリオファージ組成物としてもよいし、また任意の２種以上をΦSRY-1と組み合わせてバクテリオファージ組成物としてもよい。 In addition to the bacteriophage ΦSRY-1, the bacteriophage composition further includes a composition containing one or more other bacteriophages exhibiting lytic activity against Salmonella. Specific examples of such bacteriophages include bacteriophages ΦSRY-2 to ΦSRY-6 listed in (2) to (6) below. These bacteriophages (2) to (6) may be used alone or in combination with ΦSRY-1 to form a bacteriophage composition, or any two or more of them may be combined with ΦSRY-1 as a bacteriophage composition. Also good.
（2）バクテリオファージΦSRY-2：
（2-a）家禽に由来する：
実施例１で説明するように、ΦSRY-2は家禽、具体的には鶏から単離されたファージである。よってΦSRY-2は家禽、特に鶏に由来するバクテリオファージである。
(2) Bacteriophage ΦSRY-2:
(2-a) derived from poultry:
As explained in Example 1, ΦSRY-2 is a phage isolated from poultry, specifically chickens. Therefore, ΦSRY-2 is a bacteriophage derived from poultry, especially chicken.
（2-b）マイオウイルス科（Myoviridae）に属する：
図１（Ｂ）に示す電子顕微鏡画像に示すように頭部と収縮性の尾部を有することを特徴とするマイオウイルス科に属する細菌感染性のバクテリオファージである（実施例４）。
(2-b) belonging to Myoviridae:
As shown in the electron microscope image shown in FIG. 1B, it is a bacterial infectious bacteriophage belonging to the Myoviridae, characterized by having a head and a contractile tail (Example 4).
（2-c）S. Entetitidis、S.Typhimurium、S. Infentis、S. Newport、およびS. Gallinarum対して溶菌活性を有する：
図２に各種サルモネラ属菌に対する溶菌活性を示す（実施例２）。これからわかるように、ΦSRY-2は少なくともS. Entetitidis、S.Typhimurium、S. Infentis、S. Newport、およびS. Gallinarumに対して溶菌作用を有し、より詳細には上記サルモネラ属菌に加えて、さらにS. Hadar、S. Agona、S. Pullorum（一部）、S.Derby、S. Heidelberg、S.Meleagridis、S. Javiana、S. Paratyphi B、S.Choleraesuis、S. Worthington、S.Sofia、S. Strasbourg、S.Abortusequi、S. Dublin、S. Montevideo、及びS.Johannesburgのサルモネラ属菌に対しても溶菌活性を有する。
(2-c) Has lytic activity against S. Entetitidis, S. Typhimurium, S. Infentis, S. Newport, and S. Gallinarum:
FIG. 2 shows the lytic activity against various Salmonella species (Example 2). As can be seen, ΦSRY-2 has a lytic effect on at least S. Entetitidis, S. Typhimurium, S. Infentis, S. Newport, and S. Gallinarum, more specifically in addition to the above Salmonella spp. S. Hadar, S. Agona, S. Pullorum (partial), S. Derby, S. Heidelberg, S. Meleagridis, S. Javiana, S. Paratyphi B, S. Choleraesuis, S. Worthington, S. Sofia S. Strasbourg, S. Abortusequi, S. Dublin, S. Montevideo, and S. Johannesburg also have lytic activity against Salmonella spp.
（2-d）SDS存在下、95℃で5分間インキュベーションしたバクテリオファージ含有溶液を分画分子量1万〜15万のゲルで電気泳動したときに、53.2±1.0kDa、42.1±1.0kDa、15.8±1.0kDa、及び14.3±1.0kDaにタンパク質のバンドが検出される：
図３（Ｂ）に、ΦSRY-2をSDS存在下、95℃で5分間インキュベーションしたバクテリオファージ含有溶液を分画分子量1万〜15万のゲルで電気泳動した画像を示す（実施例５）。これからわかるように、電気泳動像上、53.2kDa、42.1kDa、15.8kDa、及び14.3kDaに相当する位置（検出誤差を考慮しても±0.1程度）にタンパク質のバンドが検出される。このことから、ΦSRY-2は、少なくとも53.2±1.0kDa、42.1±1.0kDa、15.8±1.0kDa、及び14.3±1.0kDaの分子量を有するタンパク質を主要構造タンパク質として有するバクテリオファージであると考えられる。
(2-d) 53.2 ± 1.0 kDa, 42.1 ± 1.0 kDa, 15.8 ± when a bacteriophage-containing solution incubated at 95 ° C. for 5 minutes in the presence of SDS was electrophoresed on a gel with a molecular weight cut off of 10,000 to 150,000. Protein bands are detected at 1.0 kDa and 14.3 ± 1.0 kDa:
FIG. 3 (B) shows an image obtained by electrophoresis of a bacteriophage-containing solution obtained by incubating ΦSRY-2 in the presence of SDS at 95 ° C. for 5 minutes with a gel having a molecular weight cut-off of 10,000 to 150,000 (Example 5). As can be seen from this, protein bands are detected at positions corresponding to 53.2 kDa, 42.1 kDa, 15.8 kDa, and 14.3 kDa on the electrophoretic image (about ± 0.1 considering the detection error). From this, it is considered that ΦSRY-2 is a bacteriophage having a protein having a molecular weight of at least 53.2 ± 1.0 kDa, 42.1 ± 1.0 kDa, 15.8 ± 1.0 kDa, and 14.3 ± 1.0 kDa as a main structural protein.
（2-e）DNAサイズが84.7±1.0kbpである。 (2-e) The DNA size is 84.7 ± 1.0 kbp.
当該DNAサイズは、ΦSRY-2から抽出したゲノムDNAをシークエンス解析することに得ることができる。当該シークエンス解析によりΦSRY-2のゲノムDNAのサイズは84.7kbpとして特定されるが、測定誤差を考慮しても84.7kbp±1.0kbpの範囲内にある。 このように、ΦSRY-2は鶏から単離され、上記（2-b）〜（2-e）の特性を有するものであり、その限りにおいて特に限定されるものではない。 The DNA size can be obtained by sequence analysis of genomic DNA extracted from ΦSRY-2. Although the size of the genomic DNA of ΦSRY-2 is specified as 84.7 kbp by the sequence analysis, it is within the range of 84.7 kbp ± 1.0 kbp even if measurement error is taken into consideration. Thus, ΦSRY-2 is isolated from chickens and has the characteristics (2-b) to (2-e) described above, and is not particularly limited as long as it is.
なお、図６（Ｂ）の右レーンに、ΦSRY-2から抽出したゲノムDNAを37℃で2時間HindIII処理した処理物を0.8％アガロースゲルで電気泳動した画像を示す（実施例６）。これからわかるように、ΦSRY-2のゲノムDNAは制限酵素HindIII処理により特徴的な切断パターンを示す。このため、ΦSRY-2は上記（2-a）〜（2-e）の特性に加えて、さらに下記の特性（2-f）を有するものであってもよい。 The right lane of FIG. 6 (B) shows an image obtained by electrophoresis of a processed product obtained by treating HindIII with genomic DNA extracted from ΦSRY-2 at 37 ° C. for 2 hours on a 0.8% agarose gel (Example 6). As can be seen, the genomic DNA of ΦSRY-2 shows a characteristic cleavage pattern by treatment with the restriction enzyme HindIII. Therefore, ΦSRY-2 may further have the following characteristic (2-f) in addition to the above characteristics (2-a) to (2-e).
（2-f）抽出したゲノムDNAを37℃で2時間HindIII処理し、0.8%アガロースゲルで電気泳動したとき、図6（B）の右レーンに示すパターンを示す。 (2-f) When the extracted genomic DNA is treated with HindIII at 37 ° C. for 2 hours and electrophoresed on a 0.8% agarose gel, the pattern shown in the right lane of FIG. 6 (B) is shown.
かかる（2-a）〜（2-f）の特性を有するΦSRY-2は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８に住所を有する独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに、2012年12月28日付けで識別の表示：ΦSRY-2、受託番号NITE P-01499として寄託されている（通知番号：2012-0516、通知年月日：2013年4月25日）。但し、上記（2-a）〜（2-e）または（2-ａ）〜（2-f）の特性を備える限り、当該寄託菌に限らず、その継代株、並びに寄託菌の原株及びその継代株も本発明のΦSRY-2に含まれる。 ΦSRY-2 having the above characteristics (2-a) to (2-f) is an independent administrative institution, National Institute of Technology and Evaluation for Patents, deposited at 2-5-8, Kazusa Kamashi, Kisarazu, Chiba, Japan. Indication of identification as of December 28, 2012: ΦSRY-2, deposit number NITE P-01499 (Notification number: 2012-0516, Notification date: April 25, 2013) . However, as long as it has the above-mentioned characteristics (2-a) to (2-e) or (2-a) to (2-f), it is not limited to the deposited bacteria, its passages, and the original strains of the deposited bacteria And its passage strains are also included in ΦSRY-2 of the present invention.
（3）バクテリオファージΦSRY-3：
（3-a）家禽に由来する：
実施例１で説明するように、ΦSRY-3は家禽、具体的には鶏から単離されたファージである。よってΦSRY-3は家禽、特に鶏に由来するバクテリオファージである。
（3-b）サイフォウイルス科（Siphoviridae）に属する：
図１（Ｃ）に示す電子顕微鏡画像に示すように、頭部と長くて曲がりやすい非収縮性の尾部を有することを特徴とするサイフォウイルス科に属する細菌感染性のバクテリオファージである（実施例４）。
（3-c）少なくともS. Infentis、S.Gallinarum、S. Pullorum、S. Oranienburg及びS. Derbyに対して溶菌作用を有する：
図２に各種サルモネラ属菌に対する溶菌活性を示す（実施例２）。これからわかるように、ΦSRY-3は少なくともS. Infentis、S.Gallinarum、S. Pullorum、S. Oranienburg及びS. Derbyに対して溶菌作用を有し、より詳細には上記サルモネラ属菌に加えて、さらにS. Hadar、S. Typhimurium（一部）、S. Newport、S. Agona、S. Derby、S. Heidelberg、S.Mbandaka、S. Paratyphi B、S.Choleraesuis（一部）、S. Worthington、S.Sofia、S. Virchow、S. Cerro、及びS. Montevideoのサルモネラ属菌に対しても溶菌活性を有する。
（3-d）SDS存在下、95℃で5分間インキュベーションしたバクテリオファージ含有溶液を分画分子量1万〜15万のゲルで電気泳動したときに、60.3±1.0kDa、55.5±1.0kDa、35.0±1.0kDa、28.9±1.0kDa、及び18.9±1.0kDaにタンパク質のバンドが検出される、
図４（Ｃ）に、ΦSRY-3をSDS存在下、95℃で5分間インキュベーションしたバクテリオファージ含有溶液を分画分子量1万〜15万ので電気泳動した画像を示す（実施例５）。これからわかるように、電気泳動像上、60.3kDa、55.5kDa、35.0kDa、28.9kDa、及び18.9kDaに相当する位置（検出誤差を考慮しても±0.1程度）にタンパク質のバンドが検出される。このことから、ΦSRY-3は、少なくとも60.3±1.0kDa、55.5±1.0kDa、35.0±1.0kDa、28.9±1.0kDa、及び18.9±1.0kDaの分子量を有するタンパク質を主要構造タンパク質として有するバクテリオファージであると考えられる。
（3-e）DNAサイズが106.6±1.0kbpである。
(3) Bacteriophage ΦSRY-3:
(3-a) derived from poultry:
As explained in Example 1, ΦSRY-3 is a phage isolated from poultry, specifically chickens. Therefore, ΦSRY-3 is a bacteriophage derived from poultry, especially chicken.
(3-b) belonging to the family Siphoviridae:
As shown in the electron microscope image shown in FIG. 1 (C), a bacteriophage of bacterial infectivity belonging to the family Sciphoviridae, characterized by having a head and a long, non-contracting tail that is easily bent (Example) 4).
(3-c) has lytic activity against at least S. Infentis, S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Oranienburg and S. Derby:
FIG. 2 shows the lytic activity against various Salmonella species (Example 2). As can be seen, ΦSRY-3 has a lytic action against at least S. Infentis, S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Oranienburg and S. Derby, more specifically in addition to the above Salmonella spp. In addition, S. Hadar, S. Typhimurium (part), S. Newport, S. Agona, S. Derby, S. Heidelberg, S. Mbandaka, S. Paratyphi B, S. Choleraesuis (part), S. Worthington, It also has lytic activity against Salmonella spp. Of S. Sofia, S. Virchow, S. Cerro, and S. Montevideo.
(3-d) When a bacteriophage-containing solution incubated at 95 ° C. for 5 minutes in the presence of SDS was electrophoresed on a gel with a molecular weight cut off of 10,000 to 150,000, 60.3 ± 1.0 kDa, 55.5 ± 1.0 kDa, 35.0 ± Protein bands are detected at 1.0 kDa, 28.9 ± 1.0 kDa, and 18.9 ± 1.0 kDa,
FIG. 4C shows an image obtained by electrophoresis of a bacteriophage-containing solution obtained by incubating ΦSRY-3 for 5 minutes at 95 ° C. in the presence of SDS with a molecular weight cut-off of 10,000 to 150,000 (Example 5). As can be seen, protein bands are detected at positions corresponding to 60.3 kDa, 55.5 kDa, 35.0 kDa, 28.9 kDa, and 18.9 kDa (about ± 0.1 considering the detection error) on the electrophoresis image. From this, ΦSRY-3 is a bacteriophage having a protein with a molecular weight of at least 60.3 ± 1.0 kDa, 55.5 ± 1.0 kDa, 35.0 ± 1.0 kDa, 28.9 ± 1.0 kDa, and 18.9 ± 1.0 kDa as the main structural protein it is conceivable that.
(3-e) The DNA size is 106.6 ± 1.0 kbp.
当該DNAサイズは、ΦSRY-3から抽出したゲノムDNAをシークエンス解析することに得られたものである。当該シークエンス解析によりΦSRY-3のゲノムDNAのサイズは106.6kbpとして特定されるが、測定誤差を考慮しても106.6kbp±1.0kbpの範囲内にある。 The DNA size was obtained by sequence analysis of genomic DNA extracted from ΦSRY-3. Although the size of the genomic DNA of ΦSRY-3 is specified as 106.6 kbp by the sequence analysis, it is within the range of 106.6 kbp ± 1.0 kbp even if measurement error is taken into consideration.
このように、ΦSRY-3は鶏から単離され、上記（3-b）〜（3-e）の特性を有するものであり、その限りにおいて特に限定されるものではない。 Thus, ΦSRY-3 is isolated from chickens and has the properties (3-b) to (3-e) described above, and is not particularly limited as long as it is.
なお、図６（C）の右レーンに、ΦSRY-3から抽出したゲノムDNAを37℃で2時間Hind III処理した処理物を0.8％アガロースゲルで電気泳動した画像を示す（実施例６）。これからわかるように、ΦSRY-3のゲノムDNAは制限酵素HindIII処理により特徴的な切断パターンを示す。このため、ΦSRY-3は上記（3-a）〜（3-e）の特性に加えて、さらに下記の特性（3-f）を有するものであってもよい。 The right lane of FIG. 6 (C) shows an image obtained by electrophoresis of a processed product obtained by treating Hind III with genomic DNA extracted from ΦSRY-3 at 37 ° C. for 2 hours on a 0.8% agarose gel (Example 6). As can be seen, the genomic DNA of ΦSRY-3 shows a characteristic cleavage pattern by the restriction enzyme HindIII treatment. Therefore, ΦSRY-3 may further have the following characteristic (3-f) in addition to the above characteristics (3-a) to (3-e).
（3-f）抽出したゲノムDNAを37℃で2時間HindIII処理し、0.8%アガロースゲルで電気泳動したとき、図6（C）の右レーンに示すパターンを示す。 (3-f) When the extracted genomic DNA is treated with HindIII at 37 ° C. for 2 hours and electrophoresed on a 0.8% agarose gel, the pattern shown in the right lane of FIG. 6 (C) is shown.
かかる（3-a）〜（3-f）の特性を有するΦSRY-3は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8に住所を有する独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに、2012年12月28日付けで識別の表示：ΦSRY-3、受託番号NITE P-01500として寄託されている（通知番号：2012-0517、通知年月日：2013年4月25日）。但し、上記（3-a）〜（3-e）または（3-a）〜（3-f）の特性を備える限り、当該寄託菌に限らず、その継代株、並びに寄託菌の原株及びその継代株も本発明のΦSRY-3に含まれる。 ΦSRY-3, which has the characteristics (3-a) to (3-f), is an independent administrative agency, Product Evaluation Technology Infrastructure Organization, which has an address in Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan. Indication of identification as of December 28, 2012: ΦSRY-3, deposit number NITE P-01500 (Notification number: 2012-0517, Notification date: April 25, 2013) . However, as long as it has the above characteristics (3-a) to (3-e) or (3-a) to (3-f), it is not limited to the deposited bacterium, its passage, and the original strain of the deposited bacterium And its passage strains are also included in ΦSRY-3 of the present invention.
（4）バクテリオファージΦSRY-4：
（4-a）家禽に由来する：
実施例１で説明するように、ΦSRY-4は家禽、具体的には鶏から単離されたファージである。よってΦSRY-4は家禽、特に鶏に由来するバクテリオファージである。
（4-b）マイオウイルス科（Myoviridae）に属する：
図１（Ｄ）に示す電子顕微鏡画像に示すように頭部と収縮性の尾部を有することを特徴とするマイオウイルス科に属する細菌感染性のバクテリオファージである（実施例４）。
（4-c）少なくともS. Entetitidis、S.Typhimurium、S. Infentis、S. Thompson、S. NewportおよびS. Agonaに対して溶菌活性を有する、
図２に各種サルモネラ属菌に対する溶菌活性を示す（実施例２）。これからわかるように、ΦSRY-4は少なくともS. Entetitidis、S.Typhimurium、S. Infentis、S. Thompson、S. NewportおよびS. Agonaに対して溶菌作用を有し、より詳細には上記サルモネラ属菌に加えて、さらにS. Oranienburg、S.Derby、S. Heidelberg、S.Javiana、S. Paratyphi B、S.Choleraesuis（一部）、S. Worthington、S.Sofia、S. Strasbourg、S. Virehow、S. Cerro、S. Montevideo、S. Give、S. Johannesburgのサルモネラ属菌に対しても溶菌活性を有する。
（4-d）SDS存在下、95℃で5分間インキュベーションしたバクテリオファージ含有溶液を分画分子量1万〜15万のゲルで電気泳動したときに、51.2±1.0kDa、39.2±1.0kDa、16.0±1.0kDa、及び14.4±1.0kDaにタンパク質のバンドが検出される、
図４（Ｄ）に、ΦSRY-4をSDS存在下、95℃で5分間インキュベーションしたバクテリオファージ含有溶液を分画分子量1万〜15万のゲルで電気泳動した画像を示す（実施例５）。これからわかるように、電気泳動像上、51.2kDa、39.2kDa、16.0kDa、及び14.4kDaに相当する位置（検出誤差を考慮しても±0.1程度）にタンパク質のバンドが検出される。このことから、ΦSRY-4は、少なくとも51.2±1.0kDa、39.2±1.0kDa、16.0±1.0kDa、及び14.4±1.0kDaの分子量を有するタンパク質を主要構造タンパク質として有するバクテリオファージであると考えられる。
（4-e）DNAサイズが140.8±1.0kbpである。
(4) Bacteriophage ΦSRY-4:
(4-a) derived from poultry:
As explained in Example 1, ΦSRY-4 is a phage isolated from poultry, specifically chickens. Therefore, ΦSRY-4 is a bacteriophage derived from poultry, especially chicken.
(4-b) belonging to the Myoviridae family:
As shown in the electron microscope image shown in FIG. 1 (D), it is a bacterial infectious bacteriophage belonging to the Myoviridae, characterized by having a head and a contractile tail (Example 4).
(4-c) has lytic activity against at least S. Entetitidis, S. Typhimurium, S. Infentis, S. Thompson, S. Newport and S. Agona,
FIG. 2 shows the lytic activity against various Salmonella species (Example 2). As can be seen, ΦSRY-4 has a lytic action against at least S. Entetitidis, S. Typhimurium, S. Infentis, S. Thompson, S. Newport and S. Agona, and more specifically, Salmonella spp. In addition to S. Oranienburg, S. Derby, S. Heidelberg, S. Javiana, S. Paratyphi B, S. Choleraesuis (part), S. Worthington, S. Sofia, S. Strasbourg, S. Virehow, It also has lytic activity against Salmonella spp. Of S. Cerro, S. Montevideo, S. Give, and S. Johannesburg.
(4-d) 51.2 ± 1.0 kDa, 39.2 ± 1.0 kDa, 16.0 ± when a bacteriophage-containing solution incubated at 95 ° C. for 5 minutes in the presence of SDS was electrophoresed on a gel with a molecular weight cut off of 10,000 to 150,000. Protein bands are detected at 1.0 kDa and 14.4 ± 1.0 kDa,
FIG. 4 (D) shows an image obtained by electrophoresis of a bacteriophage-containing solution obtained by incubating ΦSRY-4 in the presence of SDS at 95 ° C. for 5 minutes with a gel having a molecular weight cut off of 10,000 to 150,000 (Example 5). As can be seen from this, protein bands are detected at positions corresponding to 51.2 kDa, 39.2 kDa, 16.0 kDa, and 14.4 kDa on the electrophoretic image (approximately ± 0.1 considering the detection error). From this, it is considered that ΦSRY-4 is a bacteriophage having a protein having a molecular weight of at least 51.2 ± 1.0 kDa, 39.2 ± 1.0 kDa, 16.0 ± 1.0 kDa, and 14.4 ± 1.0 kDa as a main structural protein.
(4-e) The DNA size is 140.8 ± 1.0 kbp.
当該DNAサイズは、ΦSRY-4から抽出したゲノムDNAをシークエンス解析することに得られたものである。当該シークエンス解析によりΦSRY-4のゲノムDNAのサイズは140.8kbpとして特定されるが、測定誤差を考慮しても140.8kbp±1.0kbpの範囲内にある。 The DNA size was obtained by sequence analysis of genomic DNA extracted from ΦSRY-4. Although the size of the genomic DNA of ΦSRY-4 is specified as 140.8 kbp by the sequence analysis, it is within the range of 140.8 kbp ± 1.0 kbp even if measurement error is taken into consideration.
このように、ΦSRY-4は鶏から単離され、上記（4-b）〜（4-e）の特性を有するものであり、その限りにおいて特に限定されるものではない。 Thus, ΦSRY-4 is isolated from chickens and has the characteristics (4-b) to (4-e) described above, and is not particularly limited as long as it is.
なお、図７（D）の右レーンに、ΦSRY-4から抽出したゲノムDNAを37℃で2時間HindIII処理した処理物を0.8％アガロースゲルで電気泳動した画像を示す（実施例６）。これからわかるように、ΦSRY-4のゲノムDNAは制限酵素HindIII処理により特徴的な切断パターンを示す。このため、ΦSRY-4は上記（4-a）〜（4-e）の特性に加えて、さらに下記の特性（4-f）を有するものであってもよい。
（4-f）抽出したゲノムDNAを37℃で2時間HindIII処理し、0.8%アガロースゲルで電気泳動したとき、図7（D）のパターンを示す。
The right lane of FIG. 7 (D) shows an image obtained by electrophoresis of a processed product obtained by treating HindIII with genomic DNA extracted from ΦSRY-4 at 37 ° C. for 2 hours on a 0.8% agarose gel (Example 6). As can be seen, the genomic DNA of ΦSRY-4 shows a characteristic cleavage pattern by treatment with the restriction enzyme HindIII. Therefore, ΦSRY-4 may further have the following characteristic (4-f) in addition to the above characteristics (4-a) to (4-e).
(4-f) When the extracted genomic DNA is treated with HindIII at 37 ° C. for 2 hours and electrophoresed on a 0.8% agarose gel, the pattern of FIG. 7 (D) is shown.
かかる（4-a）〜（4-f）の特性を有するΦSRY-4は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8に住所を有する独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに、2012年12月28日付けで識別の表示：ΦSRY-4、受託番号NITE P-01501として寄託されている（通知番号：2012-0518、通知年月日：2013年4月25日）。但し、上記（4-a）〜（4-e）または（4-a）〜（4-f）の特性を備える限り、当該寄託菌に限らず、その継代株、並びに寄託菌の原株及びその継代株も本発明のΦSRY-4に含まれる。 ΦSRY-4, which has the characteristics (4-a) to (4-f), is an independent administrative institution, National Institute of Technology and Evaluation, which has an address in Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan. Indication of identification as of December 28, 2012: ΦSRY-4, deposit number NITE P-01501 (Notification number: 2012-0518, Notification date: April 25, 2013) . However, as long as it has the above characteristics (4-a) to (4-e) or (4-a) to (4-f), it is not limited to the deposited bacterium, its passages, and the original strain of the deposited bacterium And its passage strains are also included in ΦSRY-4 of the present invention.
（5）バクテリオファージΦSRY-5：
（5-a）家禽に由来する：
実施例１で説明するように、ΦSRY-5は家禽、具体的には鶏から単離されたファージである。よってΦSRY-5は家禽、特に鶏に由来するバクテリオファージである。
（5-b）サイフォウイルス科（Siphoviridae）に属する：
図１（Ｅ）に示す電子顕微鏡画像に示すように、頭部と長くて曲がりやすい非収縮性の尾部を有することを特徴とするサイフォウイルス科に属する細菌感染性のバクテリオファージである（実施例４）。
（5-c）少なくともS. Entetitidis、S.Typhimurium、S. Infentis、S.GallinarumおよびS. Agonaに対して溶菌活性を有する、
図２に各種サルモネラ属菌に対する溶菌活性を示す（実施例２）。これからわかるように、ΦSRY-5は少なくともS. Entetitidis、S.Typhimurium、S. Infentis、S.GallinarumおよびS. Agonaに対して溶菌作用を有し、より詳細には上記サルモネラ属菌に加えて、さらに他のサルモネラ属菌、例えばS. Hadar、S. Newport、S.Pullorum（一部）、S.Heidelberg、S. Javiana、S. Choleraesuis、S.Worthington、S. Sofia、S. Strasbourg、S.Dublin、S. Cerro及びS. Johannesburgに対しても溶菌活性を有する。
（5-d）SDS存在下、95℃で5分間インキュベーションしたバクテリオファージ含有溶液を分画分子量1万〜15万のゲルで電気泳動したときに、35.2±1.0kDa、28.8±1.0kDa、及び20.2±1.0kDaにタンパク質のバンドが検出される、
図５（Ｅ）に、ΦSRY-5をSDS存在下、95℃で5分間インキュベーションしたバクテリオファージ含有溶液を分画分子量1万〜15万のゲルで電気泳動した画像を示す（実施例５）。これからわかるように、電気泳動像上、35.2kDa、28.8kDa、及び20.2kDaに相当する位置（検出誤差を考慮しても±0.1程度）にタンパク質のバンドが検出される。このことから、ΦSRY-5は、少なくとも35.2±1.0kDa、28.8±1.0kDa、及び20.2±1.0kDaの分子量を有するタンパク質を主要構造タンパク質として有するバクテリオファージであると考えられる。
（5-e）DNAサイズが108.5±1.0kbpである。
(5) Bacteriophage ΦSRY-5:
(5-a) derived from poultry:
As explained in Example 1, ΦSRY-5 is a phage isolated from poultry, specifically chickens. Therefore, ΦSRY-5 is a bacteriophage derived from poultry, especially chicken.
(5-b) belonging to the family Siphoviridae:
As shown in the electron microscopic image shown in FIG. 1 (E), it is a bacterial infectious bacteriophage belonging to the Cyphoviridae, characterized by having a head and a long, non-contracting tail that is easily bent (Example) 4).
(5-c) has lytic activity against at least S. Entetitidis, S. Typhimurium, S. Infentis, S. Gallinarum and S. Agona,
FIG. 2 shows the lytic activity against various Salmonella species (Example 2). As can be seen, ΦSRY-5 has a lytic action on at least S. Entetitidis, S. Typhimurium, S. Infentis, S. Gallinarum and S. Agona, more specifically in addition to the above Salmonella spp. Still other Salmonella species such as S. Hadar, S. Newport, S. Pullorum (some), S. Heidelberg, S. Javiana, S. Choleraesuis, S. Worthington, S. Sofia, S. Strasbourg, S. It also has lytic activity against Dublin, S. Cerro and S. Johannesburg.
When a bacteriophage-containing solution incubated at 95 ° C. for 5 minutes in the presence of (5-d) SDS was electrophoresed on a gel with a molecular weight cut off of 10,000 to 150,000, 35.2 ± 1.0 kDa, 28.8 ± 1.0 kDa, and 20.2 A protein band is detected at ± 1.0 kDa,
FIG. 5 (E) shows an image obtained by electrophoresis of a bacteriophage-containing solution obtained by incubating ΦSRY-5 in the presence of SDS at 95 ° C. for 5 minutes with a gel having a molecular weight cut off of 10,000 to 150,000 (Example 5). As can be seen from this, protein bands are detected at positions corresponding to 35.2 kDa, 28.8 kDa, and 20.2 kDa (about ± 0.1 considering the detection error) on the electrophoresis image. From this, it is considered that ΦSRY-5 is a bacteriophage having a protein having a molecular weight of at least 35.2 ± 1.0 kDa, 28.8 ± 1.0 kDa, and 20.2 ± 1.0 kDa as a main structural protein.
(5-e) The DNA size is 108.5 ± 1.0 kbp.
当該DNAサイズは、ΦSRY-5から抽出したゲノムDNAをシークエンス解析することに得られたものである。当該シークエンス解析によりΦSRY-5のゲノムDNAのサイズは10kbpとして特定されるが、測定誤差を考慮しても108.5kbp±1.0kbpの範囲内にある。 The DNA size was obtained by sequence analysis of genomic DNA extracted from ΦSRY-5. Although the size of the genomic DNA of ΦSRY-5 is specified as 10 kbp by the sequence analysis, it is within the range of 108.5 kbp ± 1.0 kbp even if measurement error is taken into consideration.
このように、ΦSRY-5は鶏から単離され、上記（5-b）〜（5-e）の特性を有するものであり、その限りにおいて特に限定されるものではない。 Thus, ΦSRY-5 is isolated from chickens and has the characteristics (5-b) to (5-e) described above, and is not particularly limited as long as it is.
なお、図７（Ｅ）に、ΦSRY-5から抽出したゲノムDNAを37℃で2時間EcoRI処理した処理物を0.8％アガロースゲルで電気泳動した画像を示す（実施例６）。これからわかるように、ΦSRY-5のゲノムDNAは、制限酵素EcoRIで特徴的な切断パターンを示す。このため、ΦSRY-5は上記（5-a）〜（5-e）の特性に加えて、さらに下記の特性（5-f）を有するものであってもよい。
（5-f）抽出したゲノムDNAを37℃で2時間EcoRI処理し、0.8%アガロースゲルで電気泳動したとき、図７（E）のパターンを示す。
FIG. 7 (E) shows an image obtained by electrophoresis of a genomic DNA extracted from ΦSRY-5 treated with EcoRI at 37 ° C. for 2 hours on a 0.8% agarose gel (Example 6). As can be seen, the genomic DNA of ΦSRY-5 shows a characteristic cleavage pattern with the restriction enzyme EcoRI. Therefore, ΦSRY-5 may further have the following characteristic (5-f) in addition to the above characteristics (5-a) to (5-e).
(5-f) When the extracted genomic DNA is treated with EcoRI at 37 ° C. for 2 hours and electrophoresed on a 0.8% agarose gel, the pattern of FIG. 7E is shown.
かかる（5-a）〜（5-f）の特性を有するΦSRY-5は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8に住所を有する独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに、2012年12月28日付けで識別の表示：ΦSRY-5、受託番号NITE P-01502として寄託されている（通知番号：2012-0519、通知年月日：2013年4月25日）。但し、上記（5-a）〜（5-e）または（5-a）〜（5-f）の特性を備える限り、当該寄託菌に限らず、その継代株、並びに寄託菌の原株及びその継代株も本発明のΦSRY-5に含まれる。 ΦSRY-5 having the characteristics of (5-a) to (5-f) is an independent administrative agency of the National Institute of Technology and Evaluation, which has an address in Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan. Indication of identification as of December 28, 2012: ΦSRY-5, deposit number NITE P-01502 (Notification number: 2012-0519, Notification date: April 25, 2013) . However, as long as it has the above characteristics (5-a) to (5-e) or (5-a) to (5-f), it is not limited to the deposited bacteria, its passages, and the original strains of the deposited bacteria And its passage strains are also included in ΦSRY-5 of the present invention.
（6）バクテリオファージΦSRY-6：
（6-a）家禽に由来する：
実施例１で説明するように、ΦSRY-6は家禽、具体的には鶏から単離されたファージである。よってΦSRY-6は家禽、特に鶏に由来するバクテリオファージである。
（6-b）イノウイルス科（Inoviridae） に属する、
図１（Ｆ）に示す電子顕微鏡画像に示すように、頭部と繊維状の尾部を有することを特徴とするイノウイルス科に属する細菌やマイコプラズマに感染性のバクテリオファージである（実施例４）。
（6-c）少なくともS. Gallinarum、S.Pullorum、S. Abortusequi、S.Anatum、およびS. Giveに対して溶菌活性を有する：
図２に各種サルモネラ属菌に対する溶菌活性を示す（実施例２）。これからわかるように、ΦSRY-6は少なくともS. Gallinarum、S.Pullorum、S. Abortusequi、S.Anatum、およびS. Giveに対して溶菌作用を有し、より詳細には上記サルモネラ属菌に加えて、さらに他のサルモネラ属菌、例えばS. Typhimurium（一部）、S.Meleagridis、S. Javiana、S. Paratyphi B、S.Choleraesuis（一部）、及びS. Dublinに対しても溶菌活性を有する。
（6-d）SDS存在下、95℃で5分間インキュベーションしたバクテリオファージ含有溶液を分画分子量1万〜15万のゲルで電気泳動したときに、59.2±1.0kDa、及び41.6±1.0kDaにタンパク質のバンドが検出される：
図５（Ｆ）に、ΦSRY-6をSDS存在下、95℃で5分間インキュベーションしたバクテリオファージ含有溶液を分画分子量1万〜15万のゲルで電気泳動した画像を示す（実施例５）。これからわかるように、電気泳動像上、59.2kDa、及び41.6kDaに相当する位置（検出誤差を考慮しても±0.1程度）にタンパク質のバンドが検出される。このことから、ΦSRY-6は、少なくとも59.2±1.0kDa、及び41.6±1.0kDaの分子量を有するタンパク質を主要構造タンパク質として有するバクテリオファージであると考えられる。
（6-e）DNAサイズが38.7±1.0kbpである。
(6) Bacteriophage ΦSRY-6:
(6-a) derived from poultry:
As explained in Example 1, ΦSRY-6 is a phage isolated from poultry, specifically chickens. Therefore, ΦSRY-6 is a bacteriophage derived from poultry, especially chicken.
(6-b) belonging to the family Inoviridae,
As shown in the electron microscopic image shown in FIG. 1 (F), it is a bacteriophage that is infectious to bacteria and mycoplasma belonging to the family Inoviridae characterized by having a head and a fibrous tail (Example 4). .
(6-c) has lytic activity against at least S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Abortusequi, S. Anatum, and S. Give:
FIG. 2 shows the lytic activity against various Salmonella species (Example 2). As can be seen, ΦSRY-6 has a lytic effect on at least S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Abortusequi, S. Anatum, and S. Give, and more specifically in addition to the above Salmonella spp. Furthermore, it has lytic activity against other Salmonella species, for example, S. Typhimurium (part), S. Meleagridis, S. Javiana, S. Paratyphi B, S. Choleraesuis (part), and S. Dublin .
When a bacteriophage-containing solution incubated at 95 ° C for 5 minutes in the presence of (6-d) SDS was electrophoresed on a gel with a molecular weight cut off of 10,000 to 150,000, the protein was 59.2 ± 1.0 kDa and 41.6 ± 1.0 kDa. The following bands are detected:
FIG. 5 (F) shows an image obtained by electrophoresis of a bacteriophage-containing solution obtained by incubating ΦSRY-6 for 5 minutes at 95 ° C. in the presence of SDS with a gel having a molecular weight cut off of 10,000 to 150,000 (Example 5). As can be seen from this, protein bands are detected at positions corresponding to 59.2 kDa and 41.6 kDa on the electrophoretic image (about ± 0.1 considering the detection error). From this, it is considered that ΦSRY-6 is a bacteriophage having a protein having a molecular weight of at least 59.2 ± 1.0 kDa and 41.6 ± 1.0 kDa as a main structural protein.
(6-e) The DNA size is 38.7 ± 1.0 kbp.
当該DNAサイズは、ΦSRY-6から抽出したゲノムDNAをシークエンス解析することに得られたものである。当該シークエンス解析によりΦSRY-6のゲノムDNAのサイズは38.7kbpとして特定されるが、測定誤差を考慮しても38.7kbp±1.0kbpの範囲内にある。 The DNA size was obtained by sequence analysis of genomic DNA extracted from ΦSRY-6. Although the size of the genomic DNA of ΦSRY-6 is specified as 38.7 kbp by the sequence analysis, it is within the range of 38.7 kbp ± 1.0 kbp even if measurement error is taken into consideration.
このように、ΦSRY-6は鶏から単離され、上記（6-b）〜（6-e）の特性を有するものであり、その限りにおいて特に限定されるものではない。 Thus, ΦSRY-6 is isolated from chickens and has the characteristics (6-b) to (6-e) described above, and is not particularly limited as long as it is.
なお、図７（Ｆ）に、ΦSRY-6から抽出したゲノムDNAを37℃で2時間HindIII処理した処理物を0.8％アガロースゲルで電気泳動した画像を示す（実施例６）。これからわかるように、ΦSRY-6のゲノムDNAは、制限酵素HindIIIで特徴的な切断パターンを示す。このため、ΦSRY-6は上記（6-a）〜（6-e）の特性に加えて、さらに下記の特性（6-f）を有するものであってもよい。
（6-f）抽出したゲノムDNAを37℃で2時間HindIII処理し、0.8%アガロースゲルで電気泳動したとき、図７（F）のパターンを示す：
かかる（6-a）〜（6-f）の特性を備えるΦSRY-6は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8に住所を有する独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに、2012年12月28日付けで識別の表示：ΦSRY-6、受託番号NITE P-01503として寄託されている（通知番号：2012-0520、通知年月日：2013年4月25日）。但し、上記但し、上記（6-a）〜（6-e）または（6-a）〜（6-f）の特性を備える限り、当該寄託菌に限らず、その継代株、並びに寄託菌の原株及びその継代株も本発明のΦSRY-6に含まれる。
FIG. 7F shows an image obtained by electrophoresis of a genomic DNA extracted from ΦSRY-6 treated with HindIII at 37 ° C. for 2 hours on a 0.8% agarose gel (Example 6). As can be seen, the genomic DNA of ΦSRY-6 shows a characteristic cleavage pattern with the restriction enzyme HindIII. Therefore, ΦSRY-6 may further have the following characteristic (6-f) in addition to the above characteristics (6-a) to (6-e).
(6-f) When the extracted genomic DNA is treated with HindIII at 37 ° C. for 2 hours and electrophoresed on a 0.8% agarose gel, the pattern of FIG. 7 (F) is shown:
ΦSRY-6 with the characteristics of (6-a) to (6-f) is an independent administrative agency of the National Institute of Technology and Evaluation, which has an address in Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan. Indication of identification as of December 28, 2012: ΦSRY-6, deposit number NITE P-01503 (Notification number: 2012-0520, Notification date: April 25, 2013) . However, as long as it has the above-mentioned characteristics (6-a) to (6-e) or (6-a) to (6-f), it is not limited to the deposited bacteria, its passage strains, and the deposited bacteria The original strain and its passage strain are also included in ΦSRY-6 of the present invention.
バクテリオファージ組成物におけるΦSRY-1と他のバクテリオファージ、好ましくは上記ΦSRY-2、ΦSRY-3、ΦSRY-4、ΦSRY-5、及びΦSRY-6からなる群から選択される少なくとも１つのバクテリオファージとの割合は、最終的に調製されるバクテリオファージ組成物が、少なくともS. Enteritidis、S. Typhimurium、S. Gallinarum、S. Pullorum、S. InfentisおよびS. Thompsonに対して溶菌活性を有するような割合であれば、特に制限されない。好ましくは、これらのサルモネラ属菌に加えて、さらにS. Hadar、S. Oranienburg、S.Newport、S. Agona、S. Derby、S. Heidelberg、S.Mbandaka、S. Meleagridis、S.Javiana、S. Paratyphi B、S.Choleraesuis、S. Worthington、S.Sofia、S. Strasbourg、S.Abortusequi、S. Dublin、S. Virchow、S. Anatum、S. Cerro、S. Montevideo、S.Give、及びS. Johannesburgに対して溶菌活性を有するような割合に調製することが望ましい。かかる方法として、例えば、ΦSRY-1の力価と他の各バクテリオファージの力価がそれぞれ等量（1:1）になるように調製する方法を例示することができる。 ΦSRY-1 and other bacteriophages in the bacteriophage composition, preferably at least one bacteriophage selected from the group consisting of ΦSRY-2, ΦSRY-3, ΦSRY-4, ΦSRY-5, and ΦSRY-6 The proportion of the final bacteriophage composition has a lytic activity against at least S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Infentis and S. Thompson If it is, it will not be restrict | limited in particular. Preferably, in addition to these Salmonella species, S. Hadar, S. Oranienburg, S. Newport, S. Agona, S. Derby, S. Heidelberg, S. Mbandaka, S. Meleagridis, S. Javiana, S. Paratyphi B, S.Choleraesuis, S. Worthington, S.Sofia, S. Strasbourg, S.Abortusequi, S. Dublin, S. Virchow, S. Anatum, S. Cerro, S. Montevideo, S.Give, and S It is desirable to prepare such a ratio that has lytic activity against Johannesburg. As such a method, for example, a method of preparing so that the titer of ΦSRY-1 and the titres of other bacteriophages are equal (1: 1), respectively.
ここでファージ力価は、ファージ溶液中のプラークを形成できるファージの数（ファージ溶液中の感染能力のあるファージの数）で評価することができる。その指標として、例えばプラーク形成単位「pfu/ml」は、1mlのファージ溶液中に含まれる感染能力のあるファージの個数を示している。 Here, the phage titer can be evaluated by the number of phages that can form plaques in the phage solution (the number of infectious phages in the phage solution). For example, the plaque forming unit “pfu / ml” indicates the number of infectious phages contained in 1 ml of the phage solution.
本発明のバクテリオファージ組成物のうち、最も好ましいバクテリオファージ組成物は、前述するバクテリオファージΦSRY-1に加えて、上記のΦSRY-2、ΦSRY-3、ΦSRY-4、ΦSRY-5、及びΦSRY-6のすべてを含むものである。 Among the bacteriophage compositions of the present invention, the most preferred bacteriophage composition includes the above-mentioned bacteriophage ΦSRY-1, ΦSRY-2, ΦSRY-3, ΦSRY-4, ΦSRY-5, and ΦSRY- Includes all six.
当該バクテリオファージ組成物中の各ファージの配合割合としては、前述するように、少なくともS. Enteritidis、S. Typhimurium、S. Gallinarum、S. Pullorum、S. InfentisおよびS. Thompsonに対して溶菌活性を有するような割合であれば、特に制限されないが、好ましくは、これらのサルモネラ属菌に加えて、さらにS. Hadar、S. Oranienburg、S.Newport、S. Agona、S. Derby、S. Heidelberg、S.Mbandaka、S. Meleagridis、S.Javiana、S. Paratyphi B、S.Choleraesuis、S. Worthington、S.Sofia、S. Strasbourg、S.Abortusequi、S. Dublin、S. Virchow、S. Anatum、S. Cerro、S. Montevideo、S.Give、及びS. Johannesburgに対して溶菌活性を有するような割合である。かかる割合としては、好適にはΦSRY-1〜ΦSRY-6の各ファージの力価が等量になるような割合を挙げることができる（実施例７）。 本発明のバクテリオファージ組成物中のΦSRY-1の割合としては、制限されないが、ΦSRY-1のファージ力価が1×102〜1×1013pfu/mLの範囲となるような割合を挙げることができる。好ましくは1×107〜1×1011である。 本発明のバクテリオファージ組成物は、上記ΦSRY-1、並びに他のバクテリオファージ以外に、本発明の効果を損なわないことを限度に他の成分を含有していてもよい。かかる成分として、抗ウイルス剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、安定剤、等張化剤、キレート剤、粘稠剤、及び増粘剤などを挙げることができる。好ましい成分として、実施例７で示すように、ｐＨ6〜9の範囲に緩衝能を有するリン酸緩衝剤及びグリシン緩衝剤からなる群から選択される緩衝剤及びゼラチンである。 As mentioned above, the composition ratio of each phage in the bacteriophage composition is at least lytic activity against S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Infentis and S. Thompson. It is not particularly limited as long as it has a ratio, but preferably, in addition to these Salmonella species, S. Hadar, S. Oranienburg, S. Newport, S. Agona, S. Derby, S. Heidelberg, S.Mbandaka, S. Meleagridis, S.Javiana, S. Paratyphi B, S.Choleraesuis, S. Worthington, S. Sofia, S. Strasbourg, S. Abortusequi, S. Dublin, S. Virchow, S. Anatum, S The ratio is such that it has lytic activity against Cerro, S. Montevideo, S.Give, and S. Johannesburg. As such a ratio, a ratio at which the titers of the phages ΦSRY-1 to ΦSRY-6 are preferably equal can be mentioned (Example 7). The ratio of ΦSRY-1 in the bacteriophage composition of the present invention is not limited, but includes a ratio such that the phage titer of ΦSRY-1 is in the range of 1 × 10 2 to 1 × 10 13 pfu / mL. be able to. It is preferably 1 × 10 7 to 1 × 10 11 . The bacteriophage composition of the present invention may contain other components in addition to the above ΦSRY-1 and other bacteriophages as long as the effects of the present invention are not impaired. Examples of such components include antiviral agents, buffering agents, pH adjusting agents, stabilizers, isotonic agents, chelating agents, thickening agents, and thickening agents. As a preferred component, as shown in Example 7, a buffer and gelatin selected from the group consisting of a phosphate buffer and a glycine buffer having a buffer capacity in the range of pH 6-9.
ここで用いられるリン酸緩衝剤は、緩衝能がｐＨ5.8〜8.0の範囲、好ましくはｐＨ7.0〜8.0の範囲になるように、リン酸、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリム、またはリン酸水素二ナトリウム等のリン酸、リン酸塩またはリン酸水素塩を適当量含む緩衝剤であり、好ましくはリン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムの組成からなるリン酸緩衝剤を挙げることができる。その濃度は、バクテリオファージ組成物中の最終濃度として0.01M〜0.5M、好ましくは0.1M〜0.2Mを挙げることができる。 The phosphate buffer used here is phosphoric acid, sodium phosphate, sodium dihydrogen phosphate, or phosphorous so that the buffer capacity is in the range of pH 5.8 to 8.0, preferably in the range of pH 7.0 to 8.0. A buffer containing an appropriate amount of phosphoric acid, phosphate or hydrogen phosphate such as disodium hydrogen phosphate, preferably a phosphate buffer consisting of sodium dihydrogen phosphate and disodium hydrogen phosphate Can do. The concentration can be 0.01M to 0.5M, preferably 0.1M to 0.2M as the final concentration in the bacteriophage composition.
またここで用いられるグリシン緩衝剤は、緩衝能がｐＨ8.0〜10.6の範囲、好ましくはｐＨ8.0〜9.0の範囲になるように、グリシン、水酸化ナトリウムを適当量含む緩衝剤であり、好ましくはグリシン、水酸化ナトリウムの組成からなるグリシン緩衝剤を挙げることができる。その濃度は、バクテリオファージ組成物中の最終濃度として0.01M〜0.5M、好ましくは0.1M〜0.2Mを挙げることができる。 The glycine buffer used here is a buffer containing an appropriate amount of glycine and sodium hydroxide so that the buffer capacity is in the range of pH 8.0 to 10.6, preferably in the range of pH 8.0 to 9.0. Can include a glycine buffer having a composition of glycine and sodium hydroxide. The concentration can be 0.01M to 0.5M, preferably 0.1M to 0.2M as the final concentration in the bacteriophage composition.
また上記の各種緩衝剤のいずれか少なくとも１つと組み合わせて使用されるゼラチンのバクテリオファージ組成物中の配合割合としては、制限されないものの0より多く〜10重量％の範囲から適宜設定調製することができ、好ましくは0.01〜10重量％、より好ましくは1.0〜10重量％を挙げることができる。 The mixing ratio of gelatin used in combination with at least one of the above-mentioned various buffering agents in the bacteriophage composition is not limited, but can be appropriately set and prepared from a range of more than 0 to 10% by weight. , Preferably 0.01 to 10% by weight, more preferably 1.0 to 10% by weight.
かかる緩衝剤とゼラチンを含む本発明のクテリオファージ組成物は、実施例７で示すように、冷蔵下並びに室温下での保存安定性に優れており、また保存後に滅菌水で希釈して使用することもできる。 The cteriophage composition of the present invention containing such a buffer and gelatin is excellent in storage stability under refrigeration and at room temperature as shown in Example 7, and is used after diluting with sterilized water after storage. You can also
（III）サルモネラ防除剤、及びサルモネラ属菌の防除方法
本発明は前述するバクテリオファージΦSRY-1、及び当該ΦSRY-1を含むバクテリオファージ組成物の用途を提供するものである。かかる用途として、サルモネラ属菌を防除するために用いられるサルモネラ防除剤としての用途を挙げることができる。
(III) Salmonella control agent and method for controlling Salmonella genus The present invention provides the use of the bacteriophage ΦSRY-1 and the bacteriophage composition containing the ΦSRY-1 described above. As such a use, the use as a Salmonella control agent used in order to control Salmonella genus microbe can be mentioned.
ここで「サルモネラ防除」とは、サルモネラ属菌を不活性化させること、及びサルモネラ属菌の増殖を抑制することのいずれか一方、好ましくは両方を意味する。サルモネラ属菌を不活性化させるか、または／及びサルモネラ属菌の増殖を抑制することで、サルモネラ属菌感染を予防することができ、また感染したサルモネラ属菌を駆除することができる。このことから、本発明の「サルモネラ防除」には、サルモネラ感染の予防、及びサルモネラ属菌の駆除が含まれる。 Here, “controlling Salmonella” means either one of inactivating Salmonella spp. And suppressing the growth of Salmonella spp., Preferably both. By inactivating Salmonella or / and suppressing the growth of Salmonella, Salmonella infection can be prevented and infected Salmonella can be controlled. Thus, “controlling Salmonella” of the present invention includes prevention of Salmonella infection and extermination of Salmonella spp.
本発明のサルモネラ防除剤は、上記（Ｉ）で説明する本発明のバクテリオファージΦSRY-1を有効成分とするか、または上記（II）で説明する本発明のバクテリオファージ組成物を有効成分とすることを特徴とする。好ましくは本発明のバクテリオファージ組成物を有効成分とする。 The salmonella control agent of the present invention comprises the bacteriophage ΦSRY-1 of the present invention described in (I) above as an active ingredient, or the bacteriophage composition of the present invention described in (II) above as an active ingredient. It is characterized by that. Preferably, the bacteriophage composition of the present invention is an active ingredient.
当該サルモネラ防除剤は、サルモネラ属菌を不活性化させるか、またはその増殖を抑制して、サルモネラ属菌を防除（感染予防、駆除）するために用いられる。このため、本発明のサルモネラ防除剤は、この目的で使用することができ、例えば、食品添加物、家畜飼料用添加物、ペット餌料用添加物、ヒト用医薬組成物、非ヒト動物用医薬組成物、殺菌剤または消毒剤などの使用形態で使用される。好ましくは、食品添加物、家畜飼料用添加物、非ヒト動物用医薬組成物、殺菌剤または消毒剤としての使用である。 The said Salmonella control agent is used in order to inactivate Salmonella genus microbe, or to suppress the proliferation, and to control Salmonella genus microbe (infection prevention, extermination). Therefore, the Salmonella control agent of the present invention can be used for this purpose. For example, food additives, animal feed additives, pet food additives, human pharmaceutical compositions, non-human animal pharmaceutical compositions. Used in the form of use such as a product, a disinfectant or a disinfectant. Preferably, it is used as a food additive, livestock feed additive, non-human animal pharmaceutical composition, bactericidal agent or disinfectant.
これらの組成物は、本発明の効果を損なわないことを限度として、目的及び使用形態（例えば、液剤、錠剤、散剤、カプセル剤など）に応じて、バクテリオファージに加えて、他の成分を含んでいてもよい。かかる成分としては、緩衝剤、ｐＨ調整剤、安定剤、等張化剤、キレート剤、粘稠剤、及び増粘剤などを挙げることができる。 These compositions contain other components in addition to bacteriophages depending on the purpose and use form (for example, liquids, tablets, powders, capsules, etc.) as long as they do not impair the effects of the present invention. You may go out. Examples of such components include buffers, pH adjusters, stabilizers, tonicity agents, chelating agents, thickeners, and thickeners.
本発明のサルモネラ防除剤（食品添加物、家畜飼料用添加物、ペット餌料用添加物、ヒト用医薬組成物、非ヒト動物用医薬組成物、殺菌剤または消毒剤が含まれる）に含まれるΦSRY-1の割合としては、制限されないが、ΦSRY-1のファージ力価が1×102〜1×1013pfu/mLの範囲となるような割合を挙げることができる。好ましくは1×107〜1×1011pfu/mLである。また、本発明のバクテリオファージ組成物を有効成分として用いる場合、ΦSRY-1のファージ力価は1×102〜1×1013pfu/mLの範囲であり、またΦSRY-1〜ΦSRY-6のファージ力価の合計が6×102〜6×1013pfu/mLの範囲となるような割合を挙げることができる。好ましくはΦSRY-1〜ΦSRY-6のファージ力価の合計が6×107〜6×1011pfu/mLとなるような割合を挙げることができる。 ΦSRY contained in the Salmonella control agent of the present invention (includes food additives, animal feed additives, pet food additives, human pharmaceutical compositions, non-human animal pharmaceutical compositions, bactericides or disinfectants) The ratio of -1 is not limited, but may be a ratio such that the phage titer of ΦSRY-1 is in the range of 1 × 10 2 to 1 × 10 13 pfu / mL. It is preferably 1 × 10 7 to 1 × 10 11 pfu / mL. When the bacteriophage composition of the present invention is used as an active ingredient, the phage titer of ΦSRY-1 is in the range of 1 × 10 2 to 1 × 10 13 pfu / mL, and ΦSRY-1 to ΦSRY-6 An example of the ratio is such that the total phage titer is in the range of 6 × 10 2 to 6 × 10 13 pfu / mL. Preferably, the ratio is such that the total phage titer of ΦSRY-1 to ΦSRY-6 is 6 × 10 7 to 6 × 10 11 pfu / mL.
かかるサルモネラ防除剤を用いて被処理物を処理することで、被処理物に存在するサルモネラ属菌を防除することができる。具体的には、被処理物に存在するサルモネラ属菌を不活性化させたり、またその増殖を抑制することができ、斯くして被処理物に対するサルモネラ感染を予防し、また被処理物におけるサルモネラを駆除することができる。 By treating the object to be treated with such a Salmonella control agent, Salmonella spp. Present in the object to be treated can be controlled. Specifically, it is possible to inactivate Salmonella spp. Present in the object to be treated, or to suppress its growth, thus preventing Salmonella infection on the object to be treated, and Salmonella in the object to be treated. Can be removed.
ここで被処理物やそれに対する処理方法は、目的及び使用形態に応じて適宜設定することができる。 Here, the object to be processed and the processing method for the object can be appropriately set according to the purpose and the usage pattern.
例えば、被処理物が飲料水を含む飲食物である場合、本発明のサルモネラ防除剤（この場合「食品添加物」として使用される）を、飲食物に添加するか、飲食物に噴霧するか、または飲食物に接触させる形態で用いることができる。この場合に用いられるサルモネラ防除剤（食品添加物）中のファージ力価は、ΦSRY-1のファージ力価が1×102〜1×1013pfu/mLの範囲であり、好ましくはΦSRY-1〜ΦSRY-6のファージ力価の合計が6×107〜6×1011pfu/mLとなる範囲を挙げることができる。制限されないものの、かかるサルモネラ防除剤（食品添加物）を用いて、飲食物1kg中に、ΦSRY-1が1×107〜1×1011pfu、好ましくはΦSRY-1〜ΦSRY-6の合計として6×107〜6×1011pfuのファージが含まれるように処理することが好ましい。 For example, when the object to be treated is a food or drink containing drinking water, the salmonella control agent of the present invention (in this case, used as a “food additive”) is added to the food or drink or sprayed on the food or drink Or it can be used in the form which contacts food and drink. The phage titer in the Salmonella control agent (food additive) used in this case is such that the phage titer of ΦSRY-1 is in the range of 1 × 10 2 to 1 × 10 13 pfu / mL, preferably ΦSRY-1 The total of the phage titers of ˜ΦSRY-6 is 6 × 10 7 to 6 × 10 11 pfu / mL. Although not limited, using such a Salmonella control agent (food additive), ΦSRY-1 is 1 × 10 7 to 1 × 10 11 pfu, preferably ΦSRY-1 to ΦSRY-6, in 1 kg of food and drink It is preferable to treat so that 6 × 10 7 to 6 × 10 11 pfu phages are contained.
また被処理物が飲料水を含む家畜用飼料組成物（非ヒト動物用餌料組成物）である場合、本発明のサルモネラ防除剤（この場合「家畜飼料用添加物」または「ペット餌料用添加物」として使用される）を、飼料（餌料）に添加するか、飼料（餌料）に噴霧するか、または飼料（餌料）に接触させる形態で用いることができる。この場合に用いられるサルモネラ防除剤（家畜飼料用添加物、またはペット餌料用添加物）中のファージ力価は、ΦSRY-1のファージ力価が1×102〜1×1013pfu/mLの範囲であり、好ましくはΦSRY-1〜ΦSRY-6のファージ力価の合計が6×107〜6×1011pfu/mLとなる範囲を挙げることができる。制限されないものの、かかるサルモネラ防除剤（家畜飼料用添加物、またはペット餌料用添加物）を用いて、飼料1kg中に、ΦSRY-1が1×107〜1×1011pfu、好ましくはΦSRY-1〜ΦSRY-6の合計として6×107〜6×1011pfuのファージが含まれるように処理することが好ましい。 Further, when the object to be treated is a feed composition for livestock containing drinking water (a feed composition for non-human animals), the salmonella control agent of the present invention (in this case, “additive for livestock feed” or “additive for pet feed”) Can be used in a form that is added to the feed (feed), sprayed onto the feed (feed), or contacted with the feed (feed). The phage titer in the Salmonella control agent (additive for livestock feed or pet food) used in this case is 1 × 10 2 to 1 × 10 13 pfu / mL of phage titer of ΦSRY-1 A range in which the total of the phage titers of ΦSRY-1 to ΦSRY-6 is 6 × 10 7 to 6 × 10 11 pfu / mL can be mentioned. Although not limited, ΦSRY-1 is 1 × 10 7 to 1 × 10 11 pfu, preferably ΦSRY- in 1 kg of feed using such a Salmonella control agent (additive for livestock feed or pet feed). It is preferable to treat so as to include 6 × 10 7 to 6 × 10 11 pfu of phage as a total of 1 to ΦSRY-6.
また被処理物が鶏舎や家畜の飼育場（家屋や土壌を含む）である場合、本発明のサルモネラ防除剤（この場合「殺菌剤」または「消毒剤」として使用される）を、鶏舎や家畜の飼育場（家屋や土壌を含む）に噴霧、または散布する形態で用いることができる。この場合に用いられるサルモネラ防除剤（殺菌剤、消毒剤）中のファージ力価は、ΦSRY-1のファージ力価が1×102〜1×1013pfu/mLの範囲であり、好ましくはΦSRY-1〜ΦSRY-6のファージ力価の合計が6×107〜6×1011pfu/mLとなる範囲を挙げることができる。制限されないものの、かかるサルモネラ防除剤（殺菌剤、消毒剤）を用いて、例えば飼育場１m2あたり、ΦSRY-1が1×107〜1×1011pfu、好ましくはΦSRY-1〜ΦSRY-6の合計として6×107〜6×1011pfuのファージが噴霧または散布できるように処理することが好ましい。土壌の場合、土壌1kgあたり、ΦSRY-1が1×107〜1×1011pfu、好ましくはΦSRY-1〜ΦSRY-6の合計として6×107〜6×1011pfuのファージを添加することが好ましい In addition, when the object to be treated is a poultry house or a livestock breeding ground (including a house or soil), the salmonella control agent of the present invention (in this case, used as a “disinfectant” or “disinfectant”) is used. It can be used in the form of being sprayed or sprayed on farms (including houses and soil). The phage titer in the Salmonella control agent (bactericide, disinfectant) used in this case is such that the phage titer of ΦSRY-1 is in the range of 1 × 10 2 to 1 × 10 13 pfu / mL, preferably ΦSRY A range in which the total phage titer of −1 to ΦSRY-6 is 6 × 10 7 to 6 × 10 11 pfu / mL can be mentioned. Although not limited, ΦSRY-1 is 1 × 10 7 to 1 × 10 11 pfu, preferably ΦSRY-1 to ΦSRY-6 per 1 m 2 of the breeding ground, for example, using such a Salmonella control agent (bactericidal agent, disinfectant). It is preferable to treat so that 6 × 10 7 to 6 × 10 11 pfu of phages can be sprayed or sprayed. In the case of soil, ΦSRY-1 is added at 1 × 10 7 to 1 × 10 11 pfu, preferably 6 × 10 7 to 6 × 10 11 pfu as the total of ΦSRY-1 to ΦSRY-6 per 1 kg of soil. Is preferable
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. These examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the present invention.
実施例１ バクテリオファージの分離
鶏の臓器（そ嚢、筋胃、肝臓、空腸、回腸、盲腸）および糞便を細かく切断してストマッカー袋にいれ、4倍量の生理食塩水を加えて2分間ストマッキングした。得られた溶液を回収し、室温で3000rpmで10分間遠心した後、上清を0.2μm孔径のフィルターでろ過した。得られたろ液を鶏抽出液とした。
Example 1 Separation of bacteriophage Chicken organs (sac, stomach, liver, jejunum, ileum, cecum) and feces are cut into a stomacher bag, and 4 times the amount of physiological saline is added for 2 minutes. did. The obtained solution was collected and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes at room temperature, and then the supernatant was filtered with a 0.2 μm pore size filter. The obtained filtrate was used as a chicken extract.
2倍濃度のLB液体培地1.5mLにサルモネラ属菌のグリセロールストック10μLを接種し、37℃で2時間振とう培養した。なお、サルモネラ属菌として、図１に記載する動物由来の菌種（血清型）に属する各株菌を用いた。これに、上記で調製した鶏抽出液1.5mLを添加し、37℃で18時間振とう培養した（鶏抽出液とサルモネラ属菌の共培養液）。 10 mL of a glycerol stock of Salmonella was inoculated into 1.5 mL of a double LB liquid medium, and cultured with shaking at 37 ° C. for 2 hours. In addition, each strain which belongs to the microbial species (serotype) derived from the animal described in FIG. 1 was used as Salmonella genus bacteria. To this, 1.5 mL of the chicken extract prepared above was added and cultured with shaking at 37 ° C. for 18 hours (co-culture solution of chicken extract and Salmonella).
約50℃に保持したLB軟寒天培地（寒天濃度0.75%）4mLに、1mM MgSO4・7H2O40μLとサルモネラ属菌のLB培養液100μLを添加した。これに、上記で調製した鶏抽出液とサルモネラ属菌の共培養液1mLを添加し、十分に混和した後、LB寒天培地の上に重層した。これを37℃で18時間培養し、プラークを検出した。 To 4 mL of LB soft agar medium (agar concentration: 0.75%) maintained at about 50 ° C., 40 μL of 1 mM MgSO 4 .7H 2 O and 100 μL of Salmonella LB culture were added. To this, 1 mL of the chicken extract and Salmonella co-culture solution prepared above were added and mixed well, and then overlaid on the LB agar medium. This was cultured at 37 ° C. for 18 hours, and plaques were detected.
次に、LB液体培地3mLにサルモネラ属菌のグリセロールストック10μLを接種し、37℃で2時間振とう培養した培養液に、上記で検出したプラークをパスツールピペットを用いて採取して、添加した。これを37℃で18時間振とう培養してバクテリオファージを増幅し、室温条件下、15,000rpmで10分間遠心した後、上清を0.2μm孔径のフィルターでろ過してサルモネラ・ファージ増幅液を得た。 Next, 3 μL of LB liquid medium was inoculated with 10 μL of Salmonella glycerol stock, and cultured at 37 ° C. for 2 hours with shaking. The plaque detected above was collected using a Pasteur pipette and added. . This is cultured with shaking at 37 ° C for 18 hours to amplify the bacteriophage. After centrifugation at 15,000 rpm for 10 minutes at room temperature, the supernatant is filtered through a 0.2 µm pore size filter to obtain a Salmonella phage amplification solution. It was.
この方法を、図１に記載する各株菌についてそれぞれ実施し、鶏抽出液からサルモネラ属菌を溶菌するバクテリオファージを多数分離した。分離したバクテリオファージのうち、６種のファージ（ΦSRY-1、ΦSRY-2、ΦSRY-3、ΦSRY-4、ΦSRY-5およびΦSRY-6）を用いて、下記実施例２〜７の実験を行った。 This method was carried out for each strain described in FIG. 1, and a large number of bacteriophages that lyse Salmonella were isolated from the chicken extract. Of the isolated bacteriophages, the following Examples 2-7 were conducted using 6 types of phages (ΦSRY-1, ΦSRY-2, ΦSRY-3, ΦSRY-4, ΦSRY-5 and ΦSRY-6). It was.
実施例２ サルモネラ・ファージのサルモネラ属菌に対する溶菌スペクトルの確認
実施例１で分離した各サルモネラ・ファージ（ΦSRY-1、ΦSRY-2、ΦSRY-3、ΦSRY-4、ΦSRY-5およびΦSRY-6）について、図１に記載する各種のサルモネラ属菌を対象として下記の実験を行い、溶菌スペクトルを確認した。
Example 2 Confirmation of the lysis spectrum of Salmonella phages against Salmonella sp . Each Salmonella phage isolated in Example 1 (ΦSRY-1, ΦSRY-2, ΦSRY-3, ΦSRY-4, ΦSRY-5 and ΦSRY-6) The following experiments were conducted on various Salmonella species described in FIG. 1 to confirm the lysis spectrum.
具体的には、まずLB液体培地を用いて、各種サルモネラ属菌をそれぞれ37℃で一晩振とう培養した。次に、約50℃に保持したLB軟寒天培地（寒天濃度0.75%）4mLに、1M MgSO4・7H2O 40μLと各種サルモネラ属菌のLB培養液100μLを添加した。十分混和させた後、LB寒天培地に重層し、乾燥させた。その上に、上記実施例１で分離した各種サルモネラ・ファージの増幅液10μLをそれぞれスポットし、37℃で一晩培養した。培養後、溶菌斑の透明度を目視で判定し、溶菌活性の有無を調べた。 Specifically, first, each Salmonella bacterium was cultured overnight at 37 ° C. using LB liquid medium. Next, 40 μL of 1M MgSO 4 .7H 2 O and 100 μL of various LB culture solutions of Salmonella were added to 4 mL of LB soft agar medium (agar concentration: 0.75%) maintained at about 50 ° C. After mixing well, it was overlaid on LB agar medium and dried. On top of that, 10 μL of various Salmonella phage amplification solutions separated in Example 1 were spotted and cultured overnight at 37 ° C. After culturing, the transparency of the lysis spots was determined visually to examine the presence or absence of lytic activity.
結果を図１に併せて示す。図１に示すようにΦSRY-1は、試験に用いたすべてのサルモネラ属菌に対して溶菌活性を示した。また、ΦSRY-2、ΦSRY-3、ΦSRY-4、ΦSRY-5およびΦSRY-6もまた、図１に示す各種のサルモネラ属菌に対して溶菌活性を示した。このように、ΦSRY-1、ΦSRY-2、ΦSRY-3、ΦSRY-4、ΦSRY-5およびΦSRY-6は、図１に示す各種のサルモネラ属菌に対して異なる溶菌スペクトルを示した。 The results are also shown in FIG. As shown in FIG. 1, ΦSRY-1 showed lytic activity against all Salmonella species used in the test. Moreover, ΦSRY-2, ΦSRY-3, ΦSRY-4, ΦSRY-5, and ΦSRY-6 also showed lytic activity against various Salmonella species shown in FIG. Thus, ΦSRY-1, ΦSRY-2, ΦSRY-3, ΦSRY-4, ΦSRY-5, and ΦSRY-6 exhibited different lysis spectra for various Salmonella species shown in FIG.
実施例３ サルモネラ・ファージの大量培養、及びファージの回収
実施例１で分離した各サルモネラ・ファージ（ΦSRY-1、ΦSRY-2、ΦSRY-3、ΦSRY-4、ΦSRY-5およびΦSRY-6）を下記の方法で大量培養した。
Example 3 Mass culture of Salmonella phage and phage recovery Each Salmonella phage isolated in Example 1 (ΦSRY-1, ΦSRY-2, ΦSRY-3, ΦSRY-4, ΦSRY-5 and ΦSRY-6) Mass culture was performed by the following method.
具体的には、各サルモネラ属菌のグリセロールストック500μLをLB液体培地 100mLに添加し、37℃で2時間、旋回培養した。この培養液に、予め調製した各ファージ液1mLを添加し、37℃で7時間旋回培養した。培養後、室温条件下、15,000 rpmで10分間遠心分離し、上清を0.2μmのフィルターでろ過滅菌した。その後、フィルターろ液を、MWCO 100kDaの透析膜（スペクトラム社製）を用いて0.1Mリン酸緩衝液（pH7.8）に対して透析し、得られた透析液をさらに0.2μmのフィルターでろ過滅菌し、各サルモネラ・ファージ（ΦSRY-1、ΦSRY-2、ΦSRY-3、ΦSRY-4、ΦSRY-5およびΦSRY-6）を単離回収した。
Specifically, 500 μL of the glycerol stock of each Salmonella genus was added to 100 mL of LB liquid medium, and swirled at 37 ° C. for 2 hours. To this culture solution, 1 mL of each phage solution prepared in advance was added, and swirling culture was performed at 37 ° C. for 7 hours. After incubation, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes at room temperature, and the supernatant was sterilized by filtration through a 0.2 μm filter. The filter filtrate is then dialyzed against 0.1M phosphate buffer (pH 7.8) using a
実施例４ サルモネラ・ファージの形態観察
透過型電子顕微鏡（H-7100、日立）を用いて、上記実施例３で単離回収したファージΦSRY-1〜ΦSRY-6の形態を観察した。その結果を図２（Ａ）〜（Ｆ）に示す。図２（Ａ）、（Ｂ）および（Ｄ）に示すように、ΦSRY-1、ΦSRY-2およびΦSRY-4は、頭部と長い収縮性の尾部からなるマイオウイルス科（Myoviridae）のウイルスに属することが判明した。また、図２（Ｃ）および（Ｅ）に示すように、ΦSRY-3とΦSRY-5は、頭部と長い非収縮性の尾部からなるサイフォウイルス科（Siphoviridae）のウイルスに属することが、また図１（Ｆ）に示すように、ΦSRY-6は繊維状であることからイノウイルス科（Inoviridae）のウイルスに属することがわかった。
Example 4 Morphological Observation of Salmonella Phage The morphology of phages ΦSRY-1 to ΦSRY-6 isolated and recovered in Example 3 above was observed using a transmission electron microscope (H-7100, Hitachi). The results are shown in FIGS. As shown in FIGS. 2 (A), (B) and (D), ΦSRY-1, ΦSRY-2 and ΦSRY-4 are myrioviridae viruses consisting of a head and a long contractile tail. It turned out to belong. In addition, as shown in FIGS. 2 (C) and (E), ΦSRY-3 and ΦSRY-5 belong to the virus of the Siphoviridae family consisting of a head and a long non-shrinkable tail. As shown in FIG. 1 (F), it was found that ΦSRY-6 belongs to the virus of the family Inoviridae because it is fibrous.
実施例５ タンパク質のパターン分析
実施例３においてリン酸緩衝液に対して透析したファージ液160μLに、5×SDS試料溶液40μLを添加混合し、95℃で5分間インキュベートした。得られた処理液を、ゲル濃度10~20%の蛋白用グラジェントゲル（分画分子量範囲：1万〜15万、オリエンタルインスツルメンツ株式会社製）で展開し、銀染色IIキットワコー（和光純薬）を用いて銀染色を行った。得られた電気泳動像を図３〜５に示す。
Example 5 Analysis of protein pattern 40 μL of 5 × SDS sample solution was added to and mixed with 160 μL of phage solution dialyzed against phosphate buffer in Example 3, and incubated at 95 ° C. for 5 minutes. The resulting treatment solution was developed on a gradient gel for proteins with a gel concentration of 10 to 20% (fraction molecular weight range: 10,000 to 150,000, manufactured by Oriental Instruments Co., Ltd.), and silver staining II kit Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ) Was used for silver staining. The obtained electrophoresis images are shown in FIGS.
その結果、図３（Ａ）に示すように、ΦSRY-1については、60.1kDa、54.7kDa、42.4kDa、15.8kDaおよび14.8kDaに相当する部位にバンドが観察され、これらの分子量を有するタンパク質を主要タンパク質として含むことが確認された。ΦSRY-2についても同様に、図３（Ｂ）から、53.2kDa、42.1kDa、15.8kDaおよび14.3kDaに相当する部位にバンドが観察され、これらの分子量を有するタンパク質を主要タンパク質として含むことが確認された。ΦSRY-3についても同様に、図４（Ｃ）から、60.3kDa、55.5kDa、35.0kDa、28.9kDaおよび18.9kDaの分子量を有するタンパク質を主要タンパク質として含むことが；ΦSRY-4については、図４（Ｄ）から51.2kDa、39.3kDa、16.0kDaおよび14.4kDaの分子量を有するタンパク質を主要タンパク質として含むことが；ΦSRY-5については、図５（Ｅ）から35.2kDa、28.8kDaおよび20.2kDaの分子量を有するタンパク質を主要タンパク質として含むことが；さらにΦSRY-6については図５（Ｆ）から59.2kDaと41.6kDaの分子量を有するタンパク質を主要タンパク質として含むことが確認された。 As a result, as shown in FIG. 3A, for ΦSRY-1, bands were observed at sites corresponding to 60.1 kDa, 54.7 kDa, 42.4 kDa, 15.8 kDa, and 14.8 kDa, and proteins having these molecular weights were observed. It was confirmed to contain as a major protein. Similarly for ΦSRY-2, bands are observed at sites corresponding to 53.2 kDa, 42.1 kDa, 15.8 kDa and 14.3 kDa from FIG. 3 (B), and it is confirmed that proteins having these molecular weights are included as major proteins. It was done. Similarly for ΦSRY-3, from FIG. 4 (C), it may contain proteins having molecular weights of 60.3 kDa, 55.5 kDa, 35.0 kDa, 28.9 kDa, and 18.9 kDa as major proteins; (D) to contain proteins having molecular weights of 51.2 kDa, 39.3 kDa, 16.0 kDa and 14.4 kDa as major proteins; for ΦSRY-5, molecular weights of 35.2 kDa, 28.8 kDa and 20.2 kDa from FIG. It was confirmed that for ΦSRY-6, proteins having molecular weights of 59.2 kDa and 41.6 kDa were included as major proteins for ΦSRY-6.
実施例６ サルモネラ・ファージの遺伝子学的解析
各ファージ（ΦSRY-1〜ΦSRY-6）からゲノムDNAを抽出した。具体的には、QIAamp UltraSens Virus Kit（QIAGEN）を用いて、各サルモネラ・ファージ調製液1mLからファージDNAを抽出した。この抽出したファージDNAを、37℃で2時間、制限酵素処理（HindIIIまたはEcoRI）し、0.8%アガロースゲルで電気泳動した。ΦSRY-1〜ΦSRY-3のゲノムDNAのHindIII処理物の電気泳動像を図６（A）〜（C）に、ΦSRY-4及びΦSRY-6のHindIII処理物の電気泳動像をそれぞれ図７（D）及び（F）に、またΦSRY-5のEcoRI処理物の電気泳動像をそれぞれ図７（E）にそれぞれ示す。図６及び７に示すように、各ファージ（ΦSRY-1〜ΦSRY-6）のゲノムDNAはそれぞれ異なる切断パターンを示した。
Example 6 Genetic analysis of Salmonella phage Genomic DNA was extracted from each phage (ΦSRY-1 to ΦSRY-6). Specifically, phage DNA was extracted from 1 mL of each Salmonella phage preparation using QIAamp UltraSens Virus Kit (QIAGEN). The extracted phage DNA was subjected to restriction enzyme treatment (HindIII or EcoRI) at 37 ° C. for 2 hours and electrophoresed on a 0.8% agarose gel. Electrophoresis images of HindIII-treated products of genomic DNA of ΦSRY-1 to ΦSRY-3 are shown in FIGS. 6 (A) to (C), and electrophoresis images of HindIII-treated products of ΦSRY-4 and ΦSRY-6 are shown in FIG. The electrophoretic images of the EcoRI-treated product of ΦSRY-5 are shown in FIG. 7 (E), respectively. As shown in FIGS. 6 and 7, the genomic DNA of each phage (ΦSRY-1 to ΦSRY-6) exhibited different cleavage patterns.
実施例7 サルモネラ・ファージのDNAサイズの分析
実施例6にて抽出したゲノムDNAを用い、Genome Sequencer FLX+ System（ロッシュ・ダイアグノスティクス社）による高速シークエンス解析を実施し、各ファージのゲノムDNAサイズの分析を行った。その結果、ΦSRY-1のゲノムDNAは84.5±1.0kbp、ΦSRY-2のゲノムDNAは84.7±1.0kbp、ΦSRY-3のゲノムDNAは106.6±1.0kbp、ΦSRY-4のゲノムDNAは140.8±1.0kbp、ΦSRY-5のゲノムDNAは108.5±1.0kbp、ΦSRY-6のゲノムDNAは38.7±1.0kbpであることが確認された。
Example 7 Analysis of DNA size of Salmonella phage Using the genomic DNA extracted in Example 6, high-speed sequence analysis was performed using the Genome Sequencer FLX + System (Roche Diagnostics), and the genomic DNA size of each phage was determined. Analysis was carried out. As a result, the genomic DNA of ΦSRY-1 is 84.5 ± 1.0kbp, the genomic DNA of ΦSRY-2 is 84.7 ± 1.0kbp, the genomic DNA of ΦSRY-3 is 106.6 ± 1.0kbp, and the genomic DNA of ΦSRY-4 is 140.8 ± 1.0kbp It was confirmed that the genomic DNA of ΦSRY-5 was 108.5 ± 1.0 kbp and the genomic DNA of ΦSRY-6 was 38.7 ± 1.0 kbp.
実施例8 サルモネラ・ファージカクテルの調製とその効果
109PFU/mLにそれぞれ調製した各種ファージ液（ΦSRY-1、ΦSRY-2、ΦSRY-3、ΦSRY-4、ΦSRY-5、ΦSRY-6）を、力価が等量になるように全種類混合し、ファージカクテル液（バクテリオファージ組成物）を調製した。このファージカクテル液10μLを用いて、実施例２と同様の方法でスポットアッセイした。また、比較例として、特許文献１〜３に記載されている３種のサルモネラ・ファージ（KCCM 10969P、KCCM 10976P、KCCM 10997P）（公知ファージ）についても、それぞれファージ液を109PFU/mLに調製し、実施例２と同様の方法でスポットアッセイを行った。
Example 8 Preparation of Salmonella phage cocktail and its effect
All types of phage solutions (ΦSRY-1, ΦSRY-2, ΦSRY-3, ΦSRY-4, ΦSRY-5, ΦSRY-6) prepared to 10 9 PFU / mL, respectively, so that the titers are equal. The mixture was mixed to prepare a phage cocktail solution (bacteriophage composition). A spot assay was carried out in the same manner as in Example 2 using 10 μL of this phage cocktail. As comparative examples, three types of Salmonella phages (
その結果を図８に示す。図８に示すように、実施例１で単離した本発明のファージ（ΦSRY-1、ΦSRY-2、ΦSRY-3、ΦSRY-4、ΦSRY-5、ΦSRY-6）をすべて含むファージカクテル液は、試験したすべてのサルモネラ属菌に対して高い溶菌活性を示した。一方、特許文献１〜３に記載されている公知ファージ（KCCM 10969P、KCCM 10976P、KCCM 10997P）は、いずれも一部のサルモネラ属菌に対してのみ溶菌活性を示すに留まった。特に本発明のファージカクテル液は、サルモネラ食中毒を引き起こすS. Infentis及びS. Tompsonに対しても高い溶菌活性を示す点で、公知ファージとは異なる有用な溶菌スペクトルを有しており、サルモネラ防除剤として、また殺菌若しくは消毒剤として有用であることが確認された。
The result is shown in FIG. As shown in FIG. 8, the phage cocktail solution containing all of the phages of the present invention isolated in Example 1 (ΦSRY-1, ΦSRY-2, ΦSRY-3, ΦSRY-4, ΦSRY-5, ΦSRY-6) It showed high lytic activity against all the Salmonella species tested. On the other hand, all of the known phages (
実施例9 ファージ保存液の調製と保存効果
10重量%濃度でゼラチンを含む各種緩衝液（0.1Mリン酸緩衝液、0.1Mグリシン緩衝液）に、それぞれ実施例７で調製したファージカクテル液を添加混合し、4℃および室温（20−25℃）のそれぞれの条件で4週間保存した。調製直後および4週間保存後（4℃、室温）に、ファージ数をプラークアッセイにて測定した。また、比較として通常ファージの保存液として用いられるＳＭバッファー（50mM Tris-HCl pH7.5, 0.1M NaCl, 7mM MgSO4, 0.01% Gelatin）を用いて、同様に4週間保存した。
Example 9 Preparation and preservation effect of phage preservation solution
The phage cocktail solution prepared in Example 7 was added to and mixed with various buffer solutions (0.1 M phosphate buffer solution and 0.1 M glycine buffer solution) containing gelatin at a concentration of 10% by weight, respectively, and mixed at 4 ° C. and room temperature (20-25 (C) for 4 weeks. Immediately after preparation and after storage for 4 weeks (4 ° C., room temperature), the number of phages was measured by plaque assay. Further, as a comparison, SM buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1 M NaCl, 7 mM MgSO 4 , 0.01% Gelatin), which is usually used as a stock solution for phages, was similarly stored for 4 weeks.
ゼラチン含有リン酸緩衝液（pH7.8）による保存結果を表１、ゼラチン含有グリシン緩衝液（pH9.0）による保存結果を表２、SMバッファー（pH7.6）による保存結果を表３にそれぞれ示す。 Table 1 shows the results of storage with gelatin-containing phosphate buffer (pH 7.8), Table 2 shows the results of storage with gelatin-containing glycine buffer (pH 9.0), and Table 3 shows the results of storage with SM buffer (pH 7.6). Show.
この結果から、上記３種の緩衝液中、４℃条件及び室温条件での保存後4週間経過した後でもファージのタイターは減少せず、本発明のファージはいずれも安定であることがわかった。 From these results, it was found that the phage titer did not decrease even after 4 weeks passed after storage at 4 ° C. and room temperature in the above three buffers, and that the phage of the present invention was stable. .
実施例10 水道水で1,000倍希釈した場合のファージ安定性
実施例9で4℃及び室温でそれぞれ4週間保存したファージカクテル液を、滅菌した水道水で1,000倍に希釈した。この希釈液中に含まれるファージ数（６種のファージの総数）をプラークアッセイにて測定した。結果を表４に示す。
Example 10 Phage stability when diluted 1,000 times with tap water The phage cocktail solution stored in Example 9 at 4 ° C and room temperature for 4 weeks, respectively, was diluted 1,000 times with sterilized tap water. The number of phages contained in this diluted solution (total number of 6 types of phages) was measured by plaque assay. The results are shown in Table 4.
この結果からわかるように、ファージ混合物（バクテリオファージ組成物）をゼラチン含有緩衝液で保存した後、水道水で1,000倍希釈しても、ファージの活性が失われないことが確認された。これに対して、通常ファージの保存液として用いられるSMバッファーの場合、水道水で1,000倍希釈するとファージの活性が失われることが確認された。このことから、本発明のバクテリオファージ組成物は、保存する場合、10重量%のゼラチンを含む0.1Mリン酸緩衝液または0.1Mグリシン緩衝液で調製することが好ましく、そうすることで室温また４℃の冷蔵下で安定して保存が可能であるとともに、使用時の希釈によっても活性の低下を有意に抑えることができる。但し、ファージ混合物（バクテリオファージ組成物）の調製に使用する緩衝液へのゼラチンの配合は必須ではなく、ファージ混合物を長期保存しない場合や、使用時に希釈しない場合等は、必ずしもゼラチンを使用する必要はない。 As can be seen from this result, it was confirmed that the phage activity was not lost even when the phage mixture (bacteriophage composition) was stored in a gelatin-containing buffer and diluted 1,000 times with tap water. On the other hand, in the case of the SM buffer usually used as a stock solution for phage, it was confirmed that the phage activity was lost when diluted 1,000 times with tap water. For this reason, the bacteriophage composition of the present invention is preferably prepared in a 0.1 M phosphate buffer or 0.1 M glycine buffer containing 10% by weight gelatin when stored, so that it can be prepared at room temperature or 4%. In addition to being able to be stably stored under refrigeration at 0 ° C., a decrease in activity can be significantly suppressed by dilution during use. However, it is not essential to add gelatin to the buffer used to prepare the phage mixture (bacteriophage composition). If the phage mixture is not stored for a long time or not diluted at the time of use, it is necessary to use gelatin. There is no.
NITE P-01498、NITE P-01499、NITE P-01500、NITE P-01501、NITE P-01502、及びNITE P-01503 NITE P-01498, NITE P-01499, NITE P-01500, NITE P-01501, NITE P-01502, and NITE P-01503
Claims (8)
（2）受託番号「NITE P-01499」として寄託されたバクテリオファージ、その原株、またはそれらの継代株、
（3）受託番号「NITE P-01500」として寄託されたバクテリオファージ、その原株、またはそれらの継代株、
（4）受託番号「NITE P-01501」として寄託されたバクテリオファージ、その原株、またはそれらの継代株、
（5）受託番号「NITE P-01502」として寄託されたバクテリオファージ、その原株、またはそれらの継代株、
（6）受託番号「NITE P-01503」として寄託されたバクテリオファージ、その原株、またはそれらの継代株。 In addition to the bacteriophage according to the claim 1, further comprising at least one bacteriophage is selected from bacteriophage described below (2) to (6), in any one of claims 2 to 4 Bacteriophage composition to be described:
(2) The bacteriophage deposited under the deposit number “NITE P-01499”, its original strain, or their passages,
(3) The bacteriophage deposited under the deposit number “NITE P-01500”, its original strain, or their passages,
(4) The bacteriophage deposited under the deposit number “NITE P-01501”, its original strain, or their passages,
(5) Bacteriophage deposited under the deposit number “NITE P-01502”, its original strain, or their passages,
(6) The bacteriophage deposited under the deposit number “NITE P-01503”, its original strain, or a subculture thereof.
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