KR20120049155A - 골격근-유래된 다능성 세포의 화학적 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 근육-유래된 다능성 세포(multipotent cells)의 화학적 제조방법을 제공한다: (a) 포유동물부터 분화세포를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 분화세포에 p21 발현의 하향-조절을 유도하여 p21 저발현 유도 후 역분화제(dedifferentiation agent)를 처리하여 다능성 세포를 수득하는 단계. 본 발명의 다능성 세포는 근육형성 세포군으로의 재분화 뿐 아니라, 지방형성 세포군 또는 골형성 세포군으로의 이형분화도 가능하다. 따라서, 본 발명의 화학물질-기반된 접근방법은 포유동물에서 사지 재생을 유도하는 전략들의 개발에 중요하며, 완전 분화된 불응성 조직으로부터 유도만능줄기세포(iPSCs)의 개발을 위한 새로운 접근방법을 제시한다.

Description

골격근-유래된 다능성 세포의 화학적 제조방법 및 이의 용도{Chemically-Defined Methods for Preparing Multipotent Cells Derived from Terminally Differentiated Skeletal Muscle and Uses Thereof}

본 발명은 골격근-유래된 다능성 세포의 화학적 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

역분화(dedifferentiation)는 분화된 세포가 하나 이상의 서로 다른 조직 형태로 분화하기 전에‘줄기세포’-유사 또는 다능성 세포 상태(multipotent state)를 획득하는 현상에 대한 것이다[1]. 모든 종은 조직을 재생하는 능력의 일부로서 자연적인 분화능을 가진다[2]. 예를 들어, 포유동물의 췌장에서 존재하는 선방세포(acinar cells) 또는 관세포(duct cells)는 인슐린-발현 베타-세포를 생산하기 위해 역분화할 수 있다[3]. 하지만, 역분화능은 종들 간에 차이가 있으며, 계통학적으로 원시적인 척추동물들이 더 큰 역분화능을 보유하고 있다. 예를 들어, 양서류 및 어류의 중추신경계의 세포들은 역분화할 수 있다[4]. 더욱이, 유미목(urodele) 양서류의 망막[5], 수정체[6] 및 사지[7]는 상기 조직들의 전체 재생 과정 동안 역분화를 거친다. 하지만, 가장 큰 역분화능은 식물에서 발견된다. 예를 들어, 담배(Nicotiana tabacum)의 엽육 원형질체(mesophyll protoplasts)는 전체 식물체를 발생시키기 위한 재프로그래밍 과정의 일부로서 역분화를 일으킨다[8].

1990년대에, 조합화학(combinatorial chemistry) 분야에서의 진보는 알려진 생물활성 화합물(bioactive compounds)의 분자 스캐폴드에 기초한 작은 분자 라이브러리의 대규모 생산을 촉진시켰다[9]. 최근에, 본 발명자들 및 다른 연구자들이 다양한 생물학적 과정들의 신규한 조절인자들(regulators)을 동정하기 위해 상기 접근방법을 이용하였다[10-12]. 세포내 과정들을 조절함에 있어 작은 분자들의 이용은 수많은 장점들을 가진다[13]. 전형적으로, 작은 분자들은 단백질 기능에 대한 일시적인 조절을 제공하고 종종 이의 역도 가능하며, 이들의 효과는 작은 분자의 농도를 변화시킴으로써 정밀하게 조절될 수 있다. 또한, 단일 작은 분자는 세포 내 다양한 특이 타겟들을 동시에 조절하는 기능(potential)을 가진다. 상술한 접근방법은 바람직한 시너지 효과를 통해 소망하는 표현형을 생산할 수 있다.

작은 분자 라이브러리에 대한 표현형-기반된 스크리닝 방법은 세포내 역분화와 관련된 신규한 조절인자들을 발견하기 위해 실시되었다[14, 15]. 그 탁월한 예가 2,6,9-대체된 퓨린(2,6,9-trisubstituted purines) 라이브러리로부터 동정된 튜블린-결합 분자인 미오세버린(myoseverin)의 발견이었다[14, 16]. 미오세버린의 분자적 스캐폴드는 세포주기 조절 단백질인 사이클린-의존성 키나제 2의 알려진 억제제인 올로뮤신(olomoucine)에 기초한다. 미오세버린은 골격근 분화에 대한 C2C12 마우스 근육모세포 모델에서 역분화를 촉진하는 것으로 보고되었다. 상술한 결과는 다핵화된 근섬유(myofibers)의 단편화(fragmentation)를 통한 단핵세포의 증식이 유미목 양서류에서 사지 재생의 중요한 특징이기 때문에 유의하였다[17-19]. 하지만, 골격근 분화에 대한 pmi28 마우스 근육모세포 모델에서의 이후 연구는 미오세버린만이 근육 섬유(muscle fibers)의 세포화(cellularization)를 유도할 수 있다는 것을 제안하였다[20]. 세포화된 단핵세포는 증식하지 않은 채로 남아있어 역분화를 일으킬 수 없었다.

유미목 양서류에서 사지 재생 과정 동안, 다핵성 골격근 섬유의 핵들은 세포주기에 재진입한다[21]. 이와 대조적으로, 최종적으로 분화된 포유동물의 골격근 세포의 핵들은 실험적으로 세포주기의 재활성화를 유도하는 것이 상대적으로 어렵다[22]. 많은 사이클린-의존성 키나제 억제제들(cyclin-dependent kinase inhibitors, CDKNs)은 골격근 최종 분화의 유지에 포함되어 있는데, 예를 들어 p18(CDKN2C 또는 INK4C로도 알려짐), p21(CIP1 또는 CDKN1A로도 알려짐), p27(CDKN1B 또는 KIP1로도 알려짐) 및 p57(CDKN1C 또는 KIP2로도 알려짐)을 포함한다[23-25]. 최근 연구결과는 외인성 성장인자들의 부재 하에서도 p21 CDKN의 억제만으로 포유동물 골격근에서 세포주기를 재활성화시키는 데 충분하다는 것을 나타냈다[24].

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 다능성 세포(multipotent cells)를 제조하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 불응성(refractory)이 매우 높은 골격근 조직으로부터 얻은 분화세포에 p21 발현의 하향-조절을 유도하면, 다능성 세포를 얻을 수 있고 이들의 분화능[예컨대, 근육세포로의 역분화(dedifferentiation), 지방세포 또는 골세포로의 이형분화(transdifferentiation)]을 최종적으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 다능성 세포의 화학적 제조방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 다능성 세포를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 포유동물 조직 또는 기관의 재생방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 포유동물 분화세포로부터 다능성 세포(multipotent cells)의 화학적 제조방법을 제공한다: (a) 포유동물부터 분화세포를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 분화세포에 p21 발현의 하향-조절을 유도하여 p21 저발현 유도 후 역분화제(dedifferentiation agent)를 처리하여 다능성 세포를 수득하는 단계.

본 발명자들은 다능성 세포(multipotent cells)를 제조하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 불응성(refractory)이 매우 높은 골격근 조직으로부터 얻은 분화세포에 p21 발현의 하향-조절을 유도하면, 다능성 세포를 얻을 수 있고 이들의 분화능(예컨대, 근육세포로의 역분화, 지방세포 또는 골세포로의 이형분화)을 최종적으로 확인하였다.

본 발명은 포유동물 골격근의 역분화(예컨대, 세포주기 재-진입 및 분화)를 유도할 수 있는 상대적으로 간단하고 가역적인 화학물질-기반된 방법을 최초로 기재한 것으로, 포유동물의 완전 분화된 불응성 조직으로부터 유도만능줄기세포(iPSCs)의 개발을 위한 새로운 접근방법을 제시한다.

본 발명에 따르면, 본 발명은 매우 높은 불응성을 가지는 포유동물의 골격근 조직에 작은 분자(화학물질)의 연속적인 처리 및 일시적인 p21 억제(suppression)를 통해 증식하는 단핵세포를 얻는다. 이후, 근섬유로부터 유래된 증식하는 단핵세포에 작은 분자인 리버신의 단계적 처리(step-wise treatment)를 통해 다능성 세포를 수득할 수 있다.

본 발명의 다능성 세포의 화학적 제조방법을 각각의 단계로 나누어 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 포유동물로부터 분화세포를 수득

본 발명에 따르면, 포유동물로부터 분화세포를 수득한다.

본 명세서에서, 용어 ‘포유동물’은 인간, 마우스, 래트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 및 고양이를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 분화세포는 말기 분화세포(terminally differentiated cell)이다.

본 명세서에서, 용어 ‘말기 분화세포’는 발생(development) 과정 중 종점(endpoint) 단계의 세포로, 특성화된 표현형을 갖는 성숙한(mature) 세포를 말한다. 분화세포는 다른 세포 종류와 구별되는 하나 이상의 특징 또는 기능을 갖으며, 증식할 수 있는 능력이 제한적이다.

바람직하게는, 상기 분화세포는 골격근 세포, 심근 세포, 평활근 세포, 피부 세포, 연골 세포, 지방 세포 및 골세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 세포이고, 보다 바람직하게는 상기 분화세포는 골격근 세포, 심근 세포 및 평활근 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 세포이며, 가장 바람직하게는 상기 분화세포는 골격근 세포이다.

바람직하게는, 상기 분화세포는 결합 조직, 신경 세포, 림프 세포, 맥관 세포, 신장 세포, 췌장 세포, 폐 세포, 요도 세포, 방광 세포, 위 세포, 간 세포, 소장 세포, 대장 세포 및 식도 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 세포이다.

바람직하게는, 본 발명의 단계 (a) 이전에 분화세포는 포유동물의 근육세포로부터 유래된 융합체(syncytia)에 세포화-유도 제제(cellularization-inducing agent)를 첨가하여 단핵세포 또는 세포물(cellulate)을 얻는 단계를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 골격근 융합체에 세포화-유도 제제(cellularization-inducing agent)를 처리하여 단핵세포 또는 세포물을 제조한다.

본 명세서의 용어 “융합체(syncytia)”는 많은 핵을 포함하는 세포질로 가득찬 거대 세포-유사(large cell-like) 구조를 가지는 다핵세포를 의미하며, 진핵생물에서 대부분의 세포는 단일 핵을 가진다는 점에서 융합체는 매우 특이한 형태이다.

본 발명의 세포화-유도 제제는 마이크로튜블 어셈블리를 억제할 수 있는 당업계에 알려진 어떠한 화학물질도 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 세포화-유도 제제는 미오세버린, 미오세버린 B, 콜치신, 노코다졸, 알로콜친, 탁세인, 포도필로톡식, 콤브레타스타틴, 스테그나신, 다이하이드록시-펜타메톡시플라나논(dihydroxy-pentamethoxyflananone), 2-메톡시에스트라디올(2-ME) 및 이의 유사체, 벤지미다졸 카바메이트, 안사미토신(ansamitocin), TN16, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 돌라스타틴, 쿠라신 A, 에토포사이드, 테니포사이드, 산구이나린(sanguinarine) 및 첼리도닌(chelidonine)을 포함하며, 보다 바람직하게는, 미오세버린, 미오세버린 B, 콜치신 및 노코다졸을 포함하고, 보다 더 바람직하게는 미오세버린 및 미오세버린 B를 포함하며, 가장 바람직하게는 미오세버린이다.

본 발명은 세포내 역분화와 관련된 신규한 조절인자들을 동정하기 위해 퓨린-기반된 화합물 라이브러리를 이용하여 동정된 미오세버린을 이용하였다. 퓨린의 화학구조(Ⅰ)는 다음과 같다:

(Ⅰ)

Schultz 및 공동연구자들은 조합화학적 합성 방법(Combinatorial Chemistry)으로 구축된 2,6,9-대체 퓨린 라이브러리를 이용하여 강력한 마이크로튜블-분해 화합물인 미오세버린을 동정하였다[14]. 미오세버린 및 이의 유사체들의 낮은 세포독성은 세포증식억제성 항종양 제제로서 적용될 수 있도록 한다. 본 발명에서 이용되는 미오세버린은 2,6,9-대체된 퓨린(2,6,9-trisubstituted purines) 라이브러리로부터 동정된 작은 화학분자로서 다음과 같은 화학구조(Ⅱ)를 가진다:

(Ⅱ)

미오세버린은 세포주기 조절 단백질인 사이클린-의존성 키나제(CDK) 2의 억제제로 알려진 퓨린 유도체인 올로뮤신(olomoucine)에 기초하며, 이의 화학구조(Ⅲ)는 다음과 같다:

(Ⅲ)

미오세버린은 스핀들 어셈블리를 방해함으로써 G2/M 이동(transition)에서 세포주기를 어레스트할 뿐 아니라, 완전 분화된 근육세포를 환경적 요인에 반응하는 상태로 역전시켜 근육 재생 및 줄기세포 분화에 적용시킬 수 있다.

본 발명은 상술한 골격근 융합체에 세포화-유도 제제를 처리하여 다핵성 골격근 근관의 세포화를 유도하였다. 보다 상세하게는, 근관 배양액에 10 μM 미오세버린, 15 μM 미오세버린 B, 1 μM 콜치신, 1 μM 노코다졸 또는 10 μM 탁솔을 24시간 동안 처리하여 세포화된 근관을 얻었으며, 이때 단핵세포 이외에 상대적으로 많은 양의 세포내 잔해물(debris)을 제거하기 위해, 트립신 처리 후 원심분리하고 70 ㎛ 메쉬를 통해 여과시켰다. 그 결과, 10 μM 미오세버린의 처리가 가장 많은 수의 단핵세포를 생산하였다(참고: 도 1c).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 미오세버린은 5-50 μM, 보다 바람직하게는 5-30 μM, 보다 더 바람직하게는 5-20 μM, 가장 바람직하게는 10-15 μM으로 처리한다.

단계 (b): p21 발현의 하향-조절 유도

이어, 분화세포에 p21 하향-조절 유도 화합물을 처리한다.

p21은 환경적 스트레스에 따른 핵 이벤트를 조절하는 과정들에서 중요한 기능을 한다. p21은 산화적 스트레스 및 DNA 손상에 따라 매우 높은 레벨로 유도된다. p21 단백질은 사이클린-의존성 키나제의 억제제로 기능하며 세포주기 진행을 효과적으로 차단하기 때문에, 노화 또는 완전 분화된 세포들에서 과다발현 된다. 본 발명에 따르면, p21 발현의 하향-조절은 근섬유 세포화 및 세포주기 재-진입을 유도하여 유미목 양서류의 부속기관 재생의 초기 단계를 모방하도록 유도한다.

본 발명의 p21 하향-조절 유도 화합물은 p21 유전자의 발현 억제, p21 단백질의 활성 억제 또는 p21 단백질의 안정성을 감소시켜 하향-조절을 유도하는 화합물이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 p21 발현의 하향-조절은 당업계에 알려진 어떠한 방법을 이용하여 실시할 수 있으며, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, miRNA, 또는 천연물 추출물을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "siRNA”는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉-다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다(Degot S, et al . 2002; Degot S, et al . 2004; Ballut L, et al . 2005).

본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(p21 mRNA 서열에 상응하는(corresponding) 서열)과 안티센스 가닥(p21 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다.

siRNA 말단 구조는 p21 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.

본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

본 발명에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드”란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 p21에 상보적이고 p21 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, p21 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6내지 100 염기이고, 바람직하게는 8내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내 40 염기이다.

본 명세서의 용어 “miRNA(microRNA)”는 21-25 뉴클레오타이드의 단일 가닥 RNA 분자로써, 타겟 mRNA의 파쇄 또는 해독단계에서의 억제를 통하여 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 조절물질이다. 이러한 miRNA는 두 단계의 프로세싱으로 이루어진다. 최초의 miRNA 전사체(primary miRNA)가 핵 안에서 Drosha라는 RNaseⅢ type 효소에 의해 70-90 염기 정도의 스템-루프 구조, 즉 pre-miRNA로 만들어지고, 이후 세포질로 이동하여 다이서(Dicer)라는 효소에 의해 절단되어 21-25 염기의 성숙한 miRNA로 만들어진다. 이렇게 생성된 miRNA는 표적 mRNA에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억압자(post-transcriptional gene suppressor)로써 작용하며, 번역 억제와 mRNA 불안정화를 유도한다. miRNAs는 다양한 생리학적 현상 및 질환에 관여한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 p21 발현의 하향-조절은 세포화된 근관의 증식 또는, 세포주기로의 재-진입(re-entry) 및 분화를 유도한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 세포화된 근관은 p21 발현의 하향-조절 후에도 고유한 근전위(myogenic potential)를 유지한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 수득되는 다능성 세포는 단계 (a)에서 이용되는 분화세포와 동일한 리니지 또는 배엽의 세포이다. 예컨대, 분화세포로서 골격근 세포를 이용하는 경우, 본 발명에 의해 수득되는 다능성 세포는 골격근 동일한 배엽의 세포, 예컨대 골격근, 뼈, 진피, 결합 조직, 비뇨생식계, 심장, 피(림프 세포), 신장 및 비장을 구성하는 세포로 분화될 수 있는 다능성 세포이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)에서 이용되는 분화세포는 골격근 세포이고, 단계 (b)에서 수득한 다능성 세포는 골격근 세포, 지방세포 또는 골세포로 분화될 수 있는 다능성 세포이다.

본 발명의 제조방법에 따라, p21 하향-조절된 분화세포에 역분화제를 처리한다.

본 발명의 용어 “역분화제(dedifferentiation agent)”는 하나 이상의 세포형태들의 역분화를 촉진하는 제제를 의미하며, 화학물질, 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 작은 유기분자, 항체, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi 컨스트럭트 및 리보자임을 포함한다. 다양한 역분화제는 완전 분화된 포유동물 세포에서 역분화를 유도하기에 충분한 시간 동안 하나 이상의 역분화 인자들과 인 비보 또는 인 비트로에서 세포와 접촉시킴으로써 역분화를 유도할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용될 수 있는 역분화제는 리버신(N6-사이클로헥실-N2-(4-모폴린-4-일-페닐)-9H-퓨린-2,6-다이아민), 트리코스타틴 A(trichostatin A), 발프론산(valproic acid), 부페닐(buphenyl) 및 5-아자시티딘(5-azacytidine)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 리버신이다.

리버신은 2,6-대체된 퓨린 화합물로 하기의 화학구조(Ⅳ)를 가지며, 근육형성 세포군(myogenic)을 증식 및 재-분화가 가능한 다능성 중간엽전구세포(예컨대, 골 및 지방으로의 증식 및 재-분화)로 유도하는 놀라운 특성을 가진다:

(Ⅳ)

상술한 바와 같이, 본 발명의 화학물질-기반된 접근방법(chemically defined approaches)에 따라 얻어진 본 발명의 다능성 세포를 화학적으로 잘 정립된 배양 조건에서 배양시킴으로써, 골격근 융합체로부터 근육형성세포로의 분화가 가능할 뿐 아니라 연골형성세포 및 지방형성 세포로의 이형분화도 가능하였다(참고: 도 3 내지 도 6).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 다능성 세포는 근육형성 세포군(myogenic lineage), 지방형성 세포군(adipogenic lineage) 또는 골형성 세포군(osteogenic lineage)으로 분화할 수 있다.

야마나카 및 공동연구자들은 2006년에 배아줄기세포와 유사한 원시세포를 생성하여, 이를 유도만능줄기세포(iPSCs)로 명명하였다(Kazutoshi Takahashi and Shinya Yamanaka, Cell, 126: 663-676(2006)). 상기 연구는 배아 파괴나 난자 제공과 같은 윤리적 문제가 없는 환자별/질환별 맞춤식 역분화 만능 줄기세포를 만들어낼 수 있는 기반을 제공하였지만, 확립된 역분화 만능줄기세포의 안정성 및 분화능이 현저히 떨어지고 있는 실정이다. 상기 문제점들을 극복하기 위해, 작은 분자(예컨대, 본 발명의 미오세버린)를 이용하여 역분화 만능 줄기세포의 안정화 및 분화능을 증가시킬 수 있는 방법의 개발이 시급하다. 따라서, 본 발명의 화학물질-기반된 접근방법은 포유동물에서 사지 재생을 유도하는 전략들의 개발에 중요하며, 완전 분화된 불응성 조직으로부터 유도만능줄기세포(iPSCs)의 개발을 위한 새로운 접근방법을 제시한다.)

바람직하게는, 상기 방법은 단계 (b)의 역분화제 처리이후 분화 유도제를 단계 (b)에서 얻은 세포에 처리하여 단계 (a)의 분화세포와 동일 3배엽 계통의 다른 세포 리니지(cell lineage)로 분화시키는 단계를 추가적으로 포함한다.

상기 3배엽은 내배엽, 중배엽 및 외배엽으로 구성되며, 내배엽에서는 위, 결장, 간, 췌장, 방광, 요도의 안쪽, 기도의 상피부분, 폐, 인두, 갑상선, 부갑상선 및 소장 조직을 구성하는 세포가 발생하고, 중배엽에서는 골격근, 뼈, 진피, 결합 조직, 비뇨생식계, 심장, 피(림프 세포), 신장 및 비장을 구성하는 세포가 발생하며, 외배엽에서는 중주신경계, 눈의 수정체, 두개골 및 감각, 신경절 및 신경, 색소 세포, 머리결합조직(head connective tissues), 표피, 털 및 유선을 구성하는 세포가 발생한다.

본 명세서에서, 용어 ‘분화 유도제’는 원하는 세포로 분화시키기 위해 배양배지에 포함시키는 성장인자 및 호르몬 등을 말한다.

바람직한 구현예에 따르면, 단계 (b)에서 수득한 다능성 줄기세포로부터 지방형성 세포 리니지를 수득하기 위하여 이용되는 분화 유도제는 인슐린, 덱사메타손, 로시글리타존, IBMX(isobutylmethylxanthine) 또는 이의 혼합물이다.

바람직한 구현예에 따르면, 단계 (b)에서 수득한 다능성 줄기세포로부터 골형성 세포 리니지를 수득하기 위하여 이용되는 분화 유도제는 아스코르브산-2-포스페이트, 덱사메타손, β-글리세로포스페이트 또는 이의 혼합물이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 다능성 또는 전능성 세포는 근육형성 세포 리니지(myogenic lineage), 지방형성 세포 리니지(adipogenic lineage) 또는 골형성 세포 리니지(osteogenic lineage)로 분화할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 방법에 따라 제조된 다능성 세포를 제공한다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 다능성 또는 전능성 세포로부터 분화된 근육형성 세포 리니지 또는 근육세포를 유효성분으로 포함하는 근질환(myopathy) 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 ‘근질환’은 근육 피로, 근위축증, 사고 또는 수술에 의한 상처 또는 근이영양증이고, 용어 ‘근이영양증’은 베커형 근이영양증(Becker's muscular dystrophy), 선천성 근이영양증(congenital muscular dystrophy), 뒤셴형근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 원위 근이영양증(distal muscular dystrophy), 에머리-드라이푸스 근이영양증(Emery-Dreifuss muscular dystrophy), 안면견갑상완 근이영양증, 지대형 근이영양증, 근긴장성 근이영양증, 안인두성 근이영양증, 근긴장성 근이영양증, 사르코글리칸증, 척수성 근육위축 또는 BVVL(Brown-Vialetto-Van Laere syndrome)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 다능성 세포로부터 분화된 골형성 세포 리니지을 유효성분으로 포함하는 골 질환 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 ‘골 질환’은 골다공증, 청소년 골다공증, 불완전 골형성증(osteogenesis imperfecta), 과골화증, 고칼슘혈증, 부갑상선 기능항진증, 골연화증, 용해성 골질환, 골괴사증, 뼈의 파젯병, 골 발생 질환, 골 골절, 류마티스 관절염에 의한 골 손실, 염증성 류마티스 관절염, 골수염, 전이성 골질환, 치주성 골 소실, 구루병, 암에 의한 골 손실 또는 골의 노인성 손실을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 (a) 상술한 다능성 또는 전능성 세포로부터 분화된 세포(예컨대, 근육형성 세포군, 골형성 세포군)의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 다능성 세포로부터 분화된 세포의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 예를 들어 피하 주입, 근육 주입, 경피 투여, 관절강내 주사, 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 1일 당 10²-10¹⁰ 세포이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 포유동물 조직 또는 기관의 재생(regeneration)방법을 제공한다:

(a) 포유동물부터 분화세포를 수득하는 단계;

(b) 상기 분화세포에 p21 하향-조절 유도 후 역분화제(dedifferentiation agent)를 처리하여 다능성 세포를 수득하는 단계; 및

(c) 상기 다능성 세포를 원하는 조직 또는 기관으로 분화시키는 단계.

본 발명의 방법은 상기 제조방법을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

단계 (c): 다능성 세포를 원하는 조직 또는 기관으로 분화

이어, 단계 (b)에서 수득한 다능성 세포를 원하는 조직 또는 기관으로 분화시킨다.

상기 분화는 단계 (b)에서 수득한 다능성 세포의 배양배지에 원하는 조직 또는 기관의 분화 유도제를 첨가하여 실시한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 근육-유래된 다능성 세포의 화학적 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

(b) 본 발명의 방법은 연속적인 작은 분자의 처리 및 일시적인 p21 억제(suppression)를 통해 분화가 완료된 포유동물 골격근으로부터 증식하는 단핵세포 또는 세포물을 얻은 후 이에 리버신의 단계적 처리에 의해 다능성 세포를 수득하는 매우 간단하고 효율적인 방법이다.

(c) 본 발명의 다능성 세포는 근육형성 세포군으로의 역분화 뿐 아니라, 지방형성 세포군 또는 골형성 세포군으로의 이형분화도 가능하다.

(d) 따라서, 본 발명의 화학물질-기반된 접근방법은 포유동물에서 사지 재생을 유도하는 전략들의 개발에 중요하며, 완전 분화된 불응성 조직으로부터 유도만능줄기세포(iPSCs)의 개발을 위한 새로운 접근방법을 제시한다.

도 1은 C2C12 근육모세포에 대한 AraC, 5-FU 및 미오세버린의 효과를 나타내는 결과이다. 도 1a는 분화하는 C2C12 근육모세포 배양에 50 μM AraC를 72시간 동안 처리하면 분화하는 배양액의 세포융합지수(fusion index)를 증가시킨다(즉, 다핵 근관 융합체로 삽입된 세포 핵의 수)는 것을 보여주는 결과이다. 분화하는 C2C12 근육모세포 배양에 다른 항-유사분열 약물인 5-FU(10 μM)를 72시간 동안 처리하면 세포융합지수의 증가를 야기하지 않았다. 오차막대 = 표준편차; *, 비처리된 분화된 C2C12 배양과 비교하여 P = < 0.05. 데이터는 세 개의 서로 독립적인 실험들에 대한 대표적인 결과이다. 도 1b는 분화하는 C2C12 근육모세포 배양에 50 μM AraC를 72시간 동안 처리하면 분화하는 배양액의 트위치 카운트(twitch count)를 증가시킨다(즉, 1초 당 최소 하나 이상의 비율로 자발적인 수축을 일으키는 근관)는 것을 보여주는 결과이다. 분화하는 C2C12 근육모세포 배양에 10 μM 5-FU를 72시간 동안 처리하면 트위치 카운트의 증가를 야기하지 않았다. 오차막대 = 표준편차; *, 비처리된 분화된 C2C12 배양과 비교하여 P = < 0.05. 데이터는 세 개의 서로 독립적인 실험들에 대한 대표적인 결과이다. 도 1c는 10 μM 미오세버린, 15 μM 미오세버린 B, 1 μM 콜치신, 1 μM 노코다졸 또는 10 μM 탁솔을 24시간 동안 처리함으로써, 근관 배양이 세포화를 일으킨다는 것을 보여주는 결과이다. 살아있는 세포는 트립판 블루 다이로 염색되지 않은 세포로 분류하였다. 미오세버린은 가장 적은 세포독성을 가지며 세포화를 유도하는 것으로 확인되었다. 오차막대 = 표준편차; *, 콜치신 처리구와 비교하여 P = < 0.05; **, 노코다졸, 콜치신 및 미오세버린 B 처리구와 비교하여 P = < 0.05; #, 미오세버린 처리구와 비교하여 P = < 0.05. 데이터는 세 개의 서로 독립적인 실험들에 대한 대표적인 결과이다.
도 2는 세포화된 근관에서 p21 하향-조절의 효과를 보여주는 결과이다. 도 2a는 p21 하향-조절에 따른 세포화된 근관의 증식 반응을 관찰하기 위한 실험적 프로토콜의 개략적인 도식을 보여준다. 도 2b는 48시간 동안의 p21 하향-조절이 세포화된, 불응성 근섬유에서 증식을 유도할 수 있다는 것을 보여주는 PI(propidium iodide) 염색에 대한 유세포 분석 결과이다. 즉, 세포주기의 G₂/M기로의 쉬프트를 관찰할 수 있었다. 도 2c는 48시간 동안의 p21 하향-조절이 세포화된 C2C12 근관의 단기간 세포 분열을 유도한다는 것을 보여주는 그래프이다. 데이터는 세 개의 서로 독립적인 실험들에 대한 대표적인 결과이다. 도 2d는 세포화된 C2C12 근관에서 BrdU 삽입에 대한 유세포 분석을 통해, 48시간 동안의 p21 하향-조절이 DNA 합성을 유도한다는 것을 보여주는 결과이다. 도 2e는 p21 하향-조절 또는 리버신의 처리는 세포화된 C2C12 근관에서 역분화를 유도한다는 것을 보여주는 결과로, 아세틸콜린 수용체에 대한 리간드인 FITC-α-붕가로톡신의 감소된 표지(형광)으로서 검출하였다. 도 2f는 세포화된 C2C12 근관에서 FITC-α-붕가로톡신의 시그널을 정량한 마이크로플레이트 판독기 분석 결과이다. p21 하향-조절 또는 리버신의 처리는 세포화된 C2C12 근관에서 역분화를 유도하였다. 오차막대 = 표준편차; *, 근육모세포와 비교하여 P = < 0.05; **, 대조군 siRNA가 처리된 C2C12 세포물과 비교하여 P = < 0.05. 데이터는 세 개의 서로 독립적인 실험들에 대한 대표적인 결과이다.
도 3은 p21 하향-조절이 리버신 처리에 의해 감소된 근전위를 역전시킨다는 것을 보여주는 결과이다. 도 3a는 리버신 처리가 C2C12 근육모세포 및 C2C12 세포물의 근전위를 감소시킨다는 것을 보여주는 결과로, 분화 배지에서 10일 동안 배양한 후 세포융합지수에서 감소가 나타났다. 오차막대 = 표준편차; *, 비처리된 근육모세포와 비교하여 P = < 0.05; **, 미오세버린 단독으로 처리된 C2C12 세포물과 비교하여 P = < 0.05. 도 3b는 C2C12 세포물에서 p21 넉-다운이 리버신의 억제 효과를 역전시킨다는 것을 보여주는 그래프이다. 오차막대 = 표준편차; *, 미오세버린 단독으로 처리된 C2C12 세포물과 비교하여 P = < 0.05; **, 미오세버린 및 리버신이 처리된 C2C12 세포물과 비교하여 P = < 0.05. 데이터는 세 개의 서로 독립적인 실험들에 대한 대표적인 결과이다. 도 3c는 50 nM 리버신 또는 50 nM 리버신 및 80 pmol p21 siRNA로 처리된 세포화된 근관으로부터 유래된 C2C12 배양에서 근육형성을 관찰한 광학 현미경 분석 결과이다. 헤마톡실린 염색은 p21 siRNA로 처리된 C2C12 세포물로부터 유래된 배양물에서 보다 많은 핵이 근관 융합체 내에 위치한다는 것을 보여준다. 예시적인 핵들이 근관 세포질의 연속관(continuous tract) 내에 화살표로 표시되어 있다.
도 4는 p21 하향-조절이 세포화된 근관에서 지방세포로의 전환을 촉진시킨다는 것을 보여주는 결과이다. 도 4a는 p21 넉-다운 및 리버신으로 처리되고 지방형성 배지에서 배양된 C2C12 세포물은 지질을 축적할 수 있다. 이전에 기재된 바와 같이, 리버신으로 처리되고 지방형성 배지에서 배양된 C2C12 근육모세포도 지질을 축적하였다[15]. 하지만, 리버신으로 처리되고 지방형성 배지에서 배양된 C2C12 세포물은 지질을 축적하지 않았다. 도 4b는 p21 넉-다운, 리버신 및 지방형성 칵테일로 처리된 C2C12 세포물에서의 지질 축적을 관찰한 현미경 분석 결과로, 리버신 및 지방형성 칵테일로 처리된 C2C12 근육모세포에서 세포질 염색과 유사한 패턴을 보였다. 도 4c는 p21 넉-다운, 리버신 및 지방형성 칵테일로 처리된 C2C12 세포물이 인슐린 자극(지방세포-특이적 기능) 후 형광 글루코오스 유사체인 6-NBDG의 증가된 섭취를 보인다는 것을 보여주는 결과이다. p21 siRNA의 대조군 siRNA로의 대체는 인슐린-자극된 글루코오스의 섭취가 가능한 세포를 생산하는 데 실패했다. 리버신(500 nM) 및 지방형성 칵테일로 처리된 C2C12 근육모세포도 인슐린 자극 후 6-NBDG의 증가된 섭취를 보였다. 6-NBDG 섭취량은 인슐린 자극 후 3T3-L1 지방세포에서 관찰된 양보다 적었다. 오차막대 = 표준편차; *, 6-NBDG 단독으로 처리된 군과 비교하여 P = < 0.05. 데이터는 세 개의 서로 독립적인 실험들에 대한 대표적인 결과이다. 도 4d는 인슐린 자극 후 6-NBDG의 섭취를 형광 현미경으로 시각화한 결과이다. 6-NBDG는 C2C12 근육모세포 및 세포물-유래된 지방세포의 막에 축적하는 것으로 확인되었다. 도 4e는 p21 넉-다운, 리버신(500 nM) 및 지방형성 칵테일로 처리된 C2C12 세포물이 에피네프린-자극(지방세포-특이적 기능) 후 인슐린-민감성 유리 지방산 방출을 나타냈다. p21 siRNA의 대조군 siRNA로의 대체는 상기 지방세포-특이적 기능을 가지는 세포를 생산하는 데 실패했다. 리버신(500 nM) 및 지방형성 칵테일로 처리된 C2C12 근육모세포도 에피네프린-자극후 인슐린-민감성 유리 지방산 방출을 나타냈다. 유리 지방산의 방출량 및 인슐린 민감성은 3T3-L1 지방세포에서 관찰된 것보다 낮았다. 오차막대 = 표준편차; *, 에피네프린 단독으로 처리된 군과 비교하여 P = < 0.05. 데이터는 세 개의 서로 독립적인 실험들에 대한 대표적인 결과이다.
도 5는 p21 하향-조절은 세포화된 근관에서 골형성을 촉진시킨다는 것을 나타내는 결과이다. 도 5a는 리버신 처리 및 p21 넉-다운 후 골형성 조건에서 배양된 C2C12 세포물에서 증가된 알칼린 포스파타제 활성을 보여주는 그래프이다. p21 siRNA를 대조군 siRNA로 대체하는 것은 알칼린 포스파타제 활성에서 현저한 감소를 초래하였다. 골형성 조건에서 배양된 연골형성 전구세포인 ATCD5 세포는 양성 대조군으로 이용하였다. 도 5b는 세포 용해물을 첨가하고 300초 후 얻은 AttoPhos 기질 용액 사진이다. 실험군들은 마이크로플레이트 밑에 상응하는 웰(번호)에 기재되어 있다. 도 5c는 골형성 촉진 배지에서 10일 동안 배양한 후, ATDC5 세포 및 C2C12 세포물에서 무기화를 시각화한 알리자린 레드 S 염색 결과이다. 리버신(500 nM) 및 p21 siRNA로 처리된 C2C12 세포물은 500 nM 리버신이 처리된 C2C12 근육모세포와 유사한 정도의 무기화를 유도하였다. p21 siRNA의 대조군 siRNA로의 대체는 무기화를 감소시켰다. 도 5d는 발색 어세이를 통한 무기화의 반-정량 결과이다. 리버신(500 nM) 및 p21 siRNA로 처리된 C2C12 세포물은 골형성 칵테일을 첨가한 후 무기화를 유도하였다. 무기화 정도는 500 nM 리버신 및 골형성 칵테일이 처리된 C2C12 근육모세포와 유사하였다. 하지만, 상기 세포들의 무기화는 골형성 칵테일 하에서 배양된 연골형성 전구세포인 ATCD5 세포에서 관찰된 정도보다 낮았다. 오차막대 = 표준편차; *, C2C12 세포물+골형성 칵테일과 비교하여 P = < 0.05. 데이터는 세 개의 서로 독립적인 실험들에 전체 평균이다.
도 6은 완전 분화된 골격근 조직으로부터 다능성 세포를 얻기 위한 화학적 접근방법의 개략적인 도식을 보여준다. 증식하는 근육모세포는 다핵 근관 융합체로의 분화를 증진시키기 위해 AraC가 처리될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

항체 및 시약

미오세버린, 미오세버린 B, 콜치신, 노코다졸, 뉴로다진, 사이토신 β-D-아라비노퓨라노시드(AraC), 5-플루오로우라실(5-FU), 5-브로모-2’-데옥시우리딘(BrdU), 인간 트랜스페린, 소듐 셀레나이트, 덱사메타손, 3-이소뷰틸-1-메틸 크산틴(IBMX) 및 인슐린은 Sigma(MO, USA)로부터 구입하였다. 리버신은 Santa Cruz Biotechnology(CA, USA)로부터 구입하였다. p21 siRNA 및 대조군 siRNA는 Santa Cruz Biotechnology(CA, USA)로부터 구입하였다. α-붕가로톡신(α-bungarotoxin) 및 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)-6-데옥시글루코오스(6-NBDG)는 Molecular Probes(OR, USA)로부터 구입하였다.

세포 배양

C2C12 마우스(mus musculus) 근육모세포(myoblasts)는 10% 우태아혈청(FBS; Life Technologies, CA, USA), 50 유니트/mL 페니실린(Pen; Life Technologies., CA, USA) 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신(Strep; Life Technologies., CA, USA)이 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Life Technologies., CA, USA)으로 이루어진 증식 배지에서 유지하였다. 근육모세포는 5% 말 혈청, 50 유니트/mL 페니실린 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신이 보충된 DMEM으로 이루어진 증식 배지에서 8일 동안 배양을 통해 골격근의 근관(myotubes)으로의 분화가 유도되었다. 분화 배지는 48시간 마다 교체되었다. 분화 단계를 위해, 근육모세포는 콜라겐-코팅된 6-웰 조직배양 플레이트(Sigma, MO, USA)에서 배양하였다. 분화를 증진시키고 오염물을 제거하기 위해, 이전에 보고된 바와 같이 근육모세포 배양액에 50 μM AraC[26]를 72시간 동안 처리하거나 또는 10 μM 5-FU[27]를 48시간 동안 처리하였다. AraC 또는 5-FU 처리는 분화용 배양배지의 첨가한 후 18시간째에 실시하였다. 순수한 근관 배양액을 얻기 위해, 분화된 근관 배양액에 트립신을 처리하고 10분 동안 800 rpm에서 원심분리한 후, 10 mL 분화 배지에 부드럽게 재현탁하고 70 ㎛ 메쉬 (BD bioscience, CA, USA)에 통과시켜 단핵세포를 분리하였다. 이후, 상기 메쉬를 20 mL 분화 배지로 세척하여 근관을 수득하였다.

3T3-L1 마우스(mus musculus) 배아섬유아세포는 10% FBS, 50 유니트/mL 페니실린 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신이 보충된 DMEM으로 이루어진 증식 배지에서 유지하였다. 3T3-L1 섬유아세포의 지방세포로의 분화가 다음과 같이 유도되었다: 48시간 째의 포스트컨플루언트 세포(0일째로 간주)를 10% FBS, 0.5 mM 3-이소뷰틸-1-메틸-크산틴, 2 ㎍/mL 덱사메타손, 1 ㎍/mL 인슐린, 50 유니트/mL 페니실린 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 2일 동안 배양하였다. 이후, 세포는 2일 마다 10% FBS 및 1 ㎍/mL 인슐린이 보충된 신선한 DMEM에서 배양하였다. 분화 유도 후 8일 째 3T3-L1 지방세포가 실험에 이용되었다.

ATDC5 세포는 광주과기원 생명과학부 전장수 교수로부터 제공받았다. ATDC5 세포는 5% FBS, 10 ㎍/mL 인간 트랜스페린 및 3×10^-8 M 소듐 셀레나이트를 포함하는 DMEM 및 Ham's F-12 배지의 1:1 복합물로 구성된 유지 배지에서 배양하였다. 연골형성 과정(chondrogenesis)의 유도를 위해, 세포 배양 배지에 10 ㎍/mL 소 인슐린이 첨가되었다. 배치는 48시간 마다 교체되었으며 연골세포는 8일 후 실험에 이용되었다.

P19 마우스 배아 암종세포는 광주과기원 생명과학부 송미령 교수로부터 제공받았다. 이전에 보고된 바와 같이[28], P19 세포의 신경형성(neurogenesis)은 비-부착성 배양 디쉬에서 세포구 형성(cell ball formation) 및 500 nM 레티노산(retinoic acid)의 처리를 통해 실시하였다. 신경교세포-유사(glial-like) 세포로 분열하는 성장을 억제하기 위해, 배양 배지에 플레이팅 후 48시간 째 50 μM AraC가 보충되었다.

골격근 근관의 세포화

근관 배양액에 10 μM 미오세버린, 15 μM 미오세버린 B, 1 μM 콜치신, 1 μM 노코다졸 또는 10 μM 탁솔을 24시간 동안 처리하였다(근관 분해에 있어서 IC₅₀ 마우스에서 보고된 바와 같은 처리방법[16]). 세포화는 단핵세포 이외에 상대적으로 많은 양의 세포내 잔해물(debris)을 생산한다고 밝혀졌다. 세포 단일층에 트립신을 처리하고 750 rpm에서 5분 동안 부드럽게 원심분리하였다. 세포 펠렛을 10 mL 증식 배지에서 부드럽게 재현탁하고 잔해물을 제거하기 위해 70 ㎛ 세포 여과기(cell strainer; BD Biosciences, CA, USA)에 통과시켰다. 단핵세포의 생존율을 측정하기 위해, 수득된 세포를 1×10⁶ 세포/mL의 밀도로 DMEM에 재현탁한 후 0.4% 트립판 블루 다이(Sigma-Aldrich, MO, USA)로 염색하였다. 100개의 세포를 혈구계수기(Mariefeld GmbH, Germany) 로 카운팅하고 트립판 블루로 염색되지 않은 세포를 생존 세포로 간주하였다.

siRNA-매개된 유전자 사일런싱

제조자의 프로토콜에 따라(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) 단핵세포에 50 pmol의 목적 siRNA 또는 대조군 siRNA를 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 48시간 째의 단핵세포를 실험에 이용하였다.

세포융합지수(fusion index)를 이용한 근육모세포 분화의 정량

세포융합지수는 이전에 보고된 바와 같이 산출하였다[29]. 배양액을 70%(v/v) 및 96%(v/v) 에탄올에서 연속적으로 반응시켜 고정한 후, 핵을 시각화하기 위해 헤마톡실린 용액(Sigma, MO, USA)으로 염색하였다. 염색된 배양액의 이미지들이 CKX41 도립형 현미경(Olympus, Japan)을 이용하여 얻어 DigiEye 330 디지털 카메라(Dewinter, India) 및 Biowizard 4.3 소프트웨어(Dewinter, India)로 기록하였다. 세포융합지수는 다섯 개의 현미경 필드에서 결정하였으며 다음과 같이 계산하였다: 세포융합지수 = 골격근 근관에 위치한 핵의 수/핵의 전체 수. 근관은 세 개 또는 그 이상의 핵을 포함하는 융합체(syncytia)로 제한하였다.

유세포 분석기

세포주기 상태의 분석 :

트립신-처리된 세포 또는 세포물(cellulate)을 1,000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 2.5×10⁶ 세포를 1 mL PBS에 재현탁하였다. 상기 세포들은 파이펫팅을 통해 2.5 mL 에탄올로 조심스럽게 옮겨지고 얼음 하에서 15분 동안 반응시켜 고정되었다. 세포를 1,500 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 500 ㎕의 PI 용액(50 ㎍/mL 프로피디움 아이오다이드(Sigma, MO, USA, 0.1 mg/mL RNase A(Sigma, MO, USA), 0.05% 트라이톤 X-100(Sigma, MO, USA)에 재현탁한 후, 얼음 하에서 40분 동안 반응시켰다. 이후, PBS(3 mL)를 처리하고 세포를 1,500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 유세포 분석(Beckman Coulter EPICS XL-MCL)을 위해, 상층액을 제거하고 세포를 1×10⁶ 세포/500 ㎕ PBS 완충액의 밀도로 재현탁하였다.

DNA 합성의 분석 :

세포 또는 세포물은 10 μM BrdU와 24시간 동안 반응시킨 후, 트립신/EDTA로 얻었다. 이후, 세포를 1,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 PBS로 세척한 후, 1×10⁶ 세포를 500 ㎕의 0.5% 파라포름알데하이드(Sigma, MO, USA)(in PBS)에 재현탁하였다. 세포를 얼음 하에서 20분 동안 반응시키고 PBS로 한번 세척한 후, 1,500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 수득한 세포를 1 mL의 신선하게 제조된 3N HCl/0.5% 트윈 20(Sigma, MO, USA)에 재현탁하여 25℃에서 20분 동안 반응시킴으로써 투과가 가능하도록 하였다. 세포를 세척한 후, 1 mL의 0.1 M 다이소듐 테트라보레이트(Sigma, MO, USA)에 재현탁하였다. 이후, 세포를 1,500 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 FACS 완충액(PBS + 0.5% FBS + 5 mM EDTA)으로 세척하였다. 세포에 항-마우스 FITC와 컨쥬게이션된 마우스 항-BrdU 항체(Sigma, MO, USA)(1:100 희석)를 포함하는 FACS 완충액(500 ㎕)을 처리하고 얼음 하에서 20분 동안 반응시킴으로써 세포를 염색하였다. 세포를 FACS 완충액으로 두 번에 걸쳐서 세척한 후, 500 ㎕ FACS 완충액에 1×10⁶ 세포 밀도로 재현탁하였다. 세포는 20분 안에 유세포 분석을 통해 분석하였다.

아세틸콜린 수용체들( AChRs )의 α- 붕가로톡신 표지

이전에 기재된 바와 같이[14], 단핵세포는 배양 배지 내 20 ㎍/mL의 FITC-컨쥬게이션된 α-붕가로톡신과 5% CO₂/95% 공기, 30℃에서 30분 동안 반응시켰다. 세포를 2% 파라포름알데하이드(in PBS)로 고정하고 세척한 후, 형광 마운팅 배지(Sigma-Aldrich, MO, USA)로 마운팅하여 MetaMorph 7.5 이미지 캡쳐 소프트웨어(Molecular Devices, CA, USA)가 장착된 형광 현미경(Olympus IX81, Japan)에서 시각화하였다. 얻어진 이미지들을 포토샵 CS4 소프트웨어(Adobe Systems Incorporated, CA, USA)로 분석하였다. 알파-붕가로톡신 표지를 정량화하기 위해, 이전에 기재된 바와 같이[30] 세포를 PBS로 세척하고 형광을 형광 마이크로플레이트 판독기(SpectraMax GeminiXS, Molecular Devices, CA, USA; 여기파장/형광 방출 λ: 495 nm/521 nm)로 측정하였다.

골격근 근관의 세포화로부터 유래된 단핵세포의 역분화

리버신의 최초 보고는 4일 동안 5 μM의 투여량을 이용하였다[15]. 하지만, 본 발명자들은 상술한 농도가 미오세버린에 의한 근관으로부터 유래된 단핵세포에서 광범위한 세포독성(30% 이상의 세포 단일층이 파괴됨)을 초래한다는 것을 발견하였다. 따라서, 세포독성을 감소시키기 위해, 단핵세포에 저농도의 리버신을 짧은 시간 동안 처리하였다(3일 동안 500 nM). 반응 3일 후, 리버신을 제거하고 단핵세포에 지방세포형성(adipogenesis), 골형성(osteogenesis) 또는 신경형성(neurogenesis) 과정을 유도시켰다(하기에 기재된 바와 같이).

세포화된 골격근 근관에서 골형성의 유도

리버신-처리된 근육모세포에서 세포화된 골격근 근관에서 골형성의 유도는 이전에 기재된 바와 같이 실시하였다[15, 31]. 세포를 50 ㎍/mL 아스코르빈산-2-포스페이트(Sigma, MO, USA), 0.1 μM 덱사메타손 및 10 mM β-글라이세로포스페이트(Sigma, MO, USA)가 첨가된 DMEM + 10% FBS에서 10일 동안 배양하였다. 이후, 배양 조건을 ATDC5 세포에서 내연골성(endochondral) 골형성을 모방하기 위해 스위치되었다: 5% FBS, 10 ㎍/mL 인간 트랜스페린, 3×10^-8 M 소듐 셀레나이트 및 10 ㎍/mL 소 인슐린을 포함하는 α-MEM(minimum essential medium)에서 97% 공기/3% CO₂ 하에서 추가적으로 10일 동안 배양하였다. 배양 배지는 48시간 마다 교체하였다.

세포화된 골격근 근관에서 지방세포형성의 유도

세포화된 골격근 근관에서 지방세포형성의 유도는 리버신-처리된 근육모세포에서 이전에 기재된 바와 같이 실시하였다[15, 31]. 세포를 1.7 μM 인슐린, 5 μM 덱사메타손 및 0.5 mM 이소뷰틸 메틸 크산틴이 첨가된 DMEM + 10% 소 혈청에서 7일 동안 배양하였다.

오일 레드 O 염색

지방세포에서 세포 분화는 오일 레드 O(Sigma, MO, USA)염색을 통해 평가하였다. 3T3-L1 세포를 PBS로 세척하고 4% 파라포름알데하이드로 상온에서 1시간 동안 고정한 후, PBS로 두 번에 걸쳐서 세척하였다. 이후, 세포를 녹여진 0.2% 오일 레드 O를 포함하는 60% 이소프로파놀로 5분 동안 염색하였다.

인슐린-자극된 글루코오스 섭취량( uptake ) 분석

3T3-L1 지방세포 또는 근육-유래된 지방세포를 2×10⁵ 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트(BD Bioscience, CA, USA)에 분주하였다. 48시간 후, 세포를 혈청-부재 저농도 글루코오스 DMEM에서 3시간 동안 배양시켰다. 세포에 100 nM 인슐린 및 100 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)-2-데옥시글루코오스(6-NBDG)를 첨가한 후, 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이후, 세포를 PBS로 세척하고 1% 트라이톤 X-100을 포함하는 100 ㎕ 포타슘 포스페이트 완충액(pH 10)으로 용해시켰다. 용해된 용액에 50 ㎕ DMSO를 첨가한 후, 그 일부(120 ㎕)를 96-웰 마이크로타이터 플레이트(BD Bioscience, CA, USA)로 옮겼다. 형광은 형광 마이크로플레이트 판독기(SpectraMAX GeminiXS 및 SoftMax Pro V5 software, Molecular Devices, CA, USA; λ_ex = 466 nm, λ_em = 540 nm)를 이용하여 측정하였다.

NBDG 섭취에 대한 현미경적 분석을 위해, 근육-유래된 지방세포를 2.5×10⁵ 세포/웰의 농도로 6-웰 플레이트(BD Bioscience, CA, USA)에 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, 세포에 목적 약물(drug)과 함께 100 μM 6-NBDG를 처리하였다. 세포를 PBS로 세 번에 걸쳐서 세척하고 3.7%(w/v) 포름알데하이드(in PBS)(Sigma, MO, USA)로 고정하였다. 세포를 PBS로 세 번에 걸쳐서 세척한 후, 플루오마운트(Fluormount; Sigma, MO, USA)로 마운팅하였다. NBDG 섭취는 MetaMorph 7.5 이미지 캡쳐 소프트웨어(Molecular Devices, CA, USA)가 장착된 형광 현미경(Olympus IX81, Japan)을 이용하여 즉시 시각화하였다. 얻어진 이미지들은 포토샵 CS4 소프트웨어(Adobe Systems Incorporated, CA, USA)로 분석하였다.

유리 지방산 방출 어세이

이전에 기재된 방법에 따라, 지방세포로부터 에피네프린-자극된 유리 지방산(free fatty acid, FFA) 방출을 유리 지방산 정량 키트(Biovision, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 24-웰 플레이트에서 컨플루언스에 도달할 때까지 성장된 3T3-L1 지방세포를 혈청-부재 배양 배지에서 3시간 동안 배양시켰다. 이후, 지방세포에 염에 녹여진 10 μM 에피네프린(Sigma, MO, USA)을 처리하여 FFA 방출을 유도시켰다. 에피네프린을 처리하기 10분 전에 목적 약물을 첨가하였다. 세포 용해물을 수득하여 50 ㎕의 유상(organic phase)을 발색 어세이(VERSA Max microplate reader, Molecular Devices, CA, USA)에 이용하였다. 표준 곡선을 제작하기 위해 팔미트산을 이용하였다.

알칼린 포스파타제 어세이

알칼린 포스파타제 활성은 AttoPhos AP 형광 기질 시스템(Promega, WI, USA)을 이용하여 측정하였다. 세포를 PBS로 두 번에 걸쳐서 세척하고 250 ㎕ CelLytic^TM M(Sigma, MO, USA)에서 용해시켰다. 어세이를 위해, 100 ㎍/100 ㎕의 세포 용해물이 이용되었으며, 이때 멀티-채널 파이펫을 이용하여 100 ㎕의 AttoPhos 기질이 즉시 첨가되었다. 형광은 마이크로플레이트 판독기(SpectraMAX GeminiXS, Molecular Devices, CA, USA; λ_ex = 420 nm; λ_em = 560 nm)를 이용하여 측정하였다.

알리자린 레드 염색

세포를 PBS로 한 번 세척하고 포스페이트-완충된 포르말린(Sigma, MO, USA)으로 20분 동안 고정시켰다. 고정된 세포를 증류수로 한 번 세척한 후, 증류수에 녹여진 1% 알리자린 레드 S(Sigma, MO, USA)로 5분 동안 염색하였다. 나머지 다이를 증류수로 제거하고 세포를 한 번 더 세척하였다. 마지막으로, 세포를 공기 중에서 건조시킨 후, 염색된 세포의 이미지들을 광학 현미경(CKX41, Olympus, Japan)으로 얻고 이를 소프트웨어(Leica)로 분석하였다.

알리자린 레드를 이용한 무기화( mineralization )의 정량

이전에 기재된 바와 같이, 알리자린 레드 염색의 정량을 실시하였다[33]. 간략하게는, 알리자린 레드 염색 후 800 ㎕의 10%(v/v) 아세트산을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 상온에서 30분 동안 교반하면서 반응시켰다. 단일층이 세포 스크래퍼를 이용해 플레이트로부터 수득되어 10%(v/v) 아세트산과 함께 1.5-mL 튜브(microcentrifuge tube)로 옮겨서 혼합(vortex)되었다. 슬러리에 500 ㎕ 미네랄 오일을 로딩하고 10분 동안 85℃까지 열을 가한 후, 얼음에서 급속히 냉각시켰다. 이후, 슬러리를 20,000 g에서 15분 동안 원심분리하고 500 ㎕의 상층액을 새로운 튜브(microcentrifuge tube)로 옮겼다. 상층액에 200 ㎕의 10%(v/v) 암모늄 하이드록사이드를 첨가하고 상층액의 분취액(150 ㎕)을 405 nm에서 96-웰 포맷의 불투명한 벽 및 투명한 바닥을 가진 플레이트에서 세 쌍으로(triplicate) 판독하였다.

데이터의 통계 분석

통계적 유의성을 결정하기 위해 Mann-Whitney U 검정(TalkStats software; Jelsoft Enterprises Ltd., UK)을 이용하였다. 0.05 이하의 P 값(양쪽-꼬리검정)을 유의한 것으로 간주하였다.

실험결과 및 추가논의사항

근관 세포화의 유도를 위한 세포 배양 조건의 확립: AraC 처리는 근육 분화를 증진시키며; 미오세버린은 근육 세포화의 유도에 있어서 바람직한 제제이다

본 연구에서 이용된 작은 분자들의 리스트가 표 1에 기재되어 있다.

골격근 역분화 및 재-분화를 촉진시키기 위해 본 연구에서 이용된 작은 분자들의 구조.

이름	구조	이름	구조
아스코르빈산		3-이소뷰틸-1-메틸 크산틴(IMBX)
콜치신		미오세버린
사이토신 β-D-아라비노퓨라노시드 하이드로클로라이드(AraC)		미오세버린 B
덱사메타손		노코다졸
5-플루오로우라실		리버신
β-글라이세로포스페이트 다이소듐

근관 세포화의 과정을 효과적으로 연구하기 위해, 높은 정도의 근육 분화가 이루어져야 한다. 하지만, 비분화된 근육모세포가 포함된 배양액의 오염이 주요 문제로, 이로 인해 세포화된 근관 배양액으로부터 모순되는 결과들이 초래되었다[14, 20]. C2C12 근육모세포 배양에서 근육형성 과정을 증가시키기 위해, 항-유사분열 약물(anti-mitotic drugs)인 AraC[26] 및 5-FU[27]가 증식하는 근육모세포를 제거할 목적으로 테스트되었다. 분화 과정 동안 AraC의 처리는 근관에 삽입된 핵의 수를 측정하는 지표인 세포융합지수(fusion index)를 현저하게 증가시킨다는 것을 확인하였다(도 1a). 한편, 근육형성 과정(in vitro)의 다른 측정수단(measure)은 배양에서 자발적인 ‘트위칭(twitching)’ 근관의 존재이다. 또한, 세포가 콜라겐-코팅된 디쉬에서 배양되는 경우 분화하는 C2C12 세포에 대한 AraC 처리는 자발적으로 수축하는 ‘트위칭(twitching)’ 근관의 존재를 증가시킨다는 것을 발견하였다(도 1b). 따라서, 본 연구에서 AraC의 처리는 C2C12 분화를 증가시키는 데 이용되었다.

근관 세포화 과정을 효과적으로 연구하기 위해, 최적의 세포화-유도 제제(agent)가 동정되었다. 네 개의 다른 작은 분자들이 상대적으로 낮은 세포독성을 유발하면서 세포화를 유도할 수 있는 지를 테스트하였다: 콜치신, 노코다졸, 미오세버린 및 미오세버린 B. 미오세버린에 의한 세포화 유도는 가장 많은 수의 단핵세포들을 생산하는 것으로 나타났으며, 이들은 세포 생존율에 대한 마커인 0.4% 트립판 블루 다이를 배제시킬 수 있었다(도 1c). 따라서, 미오세버린이 C2C12 세포화 및 이형분화(transdifferentiation) 연구에 이용되었다.

p21 하향-조절이 세포화된 근관에 증식, 세포주기로의 재-진입 및 분화를 유도할 수 있다:

C2C12 근관의 세포화에 의해 발생된 단핵세포들이 분주되고 24시간 후, 스크램블 siRNA 및 p21 siRNA가 처리되었다(도 2a). 세포 핵에 대한 PI(propidium iodide) 염색 결과는 p21 하향-조절이 세포주기의 불응성(refractory) G₀ 단계에서 G₂-M 단계로의 쉬프트를 유도한다는 것을 보여줬다(도 2b). 또한, 이러한 효과는 적을 지라도 현저한 세포수의 증가를 초래하는 p21 하향-조절과 함께 40×배율에서 관찰한 세포 수의 카운팅에서도 확인할 수 있었다(도 2c). 상술한 결과는 p21 하향-조절이 증가된 DNA 합성의 지시자인 BrdU가 삽입된 세포들의 부위에서의 증가를 야기한다는 관찰을 통해 다시 확인되었다(도 2d).

이전 연구결과는 근관의 세포화가 모근관(parent myotube)과 비교하여 단핵세포의 분화상태에서 변화를 야기하지 않는다는 것을 나타냈다[20]. 예를 들어, 단핵세포는 후기 근조직 마커(late myogenic markers)의 발현을 유지한다. 세포화된 근관으로부터 유래된 단핵세포의 분화된 상태에 대한 p21 하향-조절의 효과는 근관 형성의 마커인 아세틸콜린 수용체에 결합하는 FITC-컨쥬게이션된 α-붕가로톡신을 이용하여 평가하였다. p21 하향-조절은 단핵세포의 α-붕가로톡신 표지를 감소시켰는데(도 2e 및 도 2f), 이는 근관으로부터 벗어나(‘away’) 근육모세포로 향하는(‘towards’) 분화 상태로의 쉬프트가 일어났음을 의미한다. p21 하향-조절의 효과는 근육세포의 발달 가소성(developmental plasticity)을 증가시키는 것으로 알려진 리버신에 의한 효과와 유사하였다.

세포화된 근관은 p21 하향-조절 후 고유의 근전위(myogenic potential)를 유지한다:

유미목 양서류의 사지 재생의 흥미로운 특징은 초기에 근관의 세포화가 일어난 후 성장하는 사지에서 근육을 다시 형성하기 위해 증식 및 분화가 일어난다는 것이다[17]. p21 하향-조절이 세포환된 근관에서 증식 반응을 유도할 수 있다는 사실에 비추어 볼 때, 근육세포 분화(myogenic differentiation)로 재-진입하는 단핵세포의 능력이 조사되었다. 첫 테스트로서, 본 발명자들은 근육세포의 발달 가소성을 증가시키는 것[34]으로 알려진 리버신의 근육세포 분화 상의 효과를 조사하였다. 리버신 처리는 근육형성 과정으로 재-진입하려는 근육세포 및 세포화된 근관의 능력을 감소시키는 것으로 확인되었다(도 3a). 흥미롭게도, 세포화된 단핵세포의 근육형성에 있어서 리버신의 억제 효과는 p21의 넉-다운에 의해 극복될 수 있었다. 따라서, p21의 조절(treatment)은 근전위의 감소 없이 세포화된 근관의 증식을 유도한다. 결과적으로, 근관은 p21 넉-다운 후 더 높은 세포융합지수(도 3b 및 도 3c)를 나타냈다.

p21 하향-조절은 세포화된 근관에서 지방세포로의 전환을 촉진시킨다 :

리버신이 근육모세포에서 더 높은 가소성을 유도하고 이후 지방형성 인자들(adipogenic factors)의 칵테일 하에서의 배양을 통해 지방세포로의 분화로 이어지는 것이 알려졌다[15]. 분화하는 지방세포에서 축적하는 지질 물방울(lipid droplets)에 결합하는 오일 레드 O 염색이 감소하는 결과에서 볼 수 있듯이(도 4a), 대조군 siRNA, 리버신 및 지방형성 인자들에 의해 세포화된 근관은 지방세포로 분화할 수 없다. 하지만, 증가된 오일 레드 O 염색에서 볼 수 있듯이(도 4a), 리버신 처리 전에 세포화된 근관에서 p21의 하향-조절은 지방형성 세포들(adipogenic lineage)로의 전환을 촉진시켰다. 지질의 축적은 광학 현미경으로 관찰할 수 있었다(도 4b). 인슐린-자극된 글루코오스의 섭취는 지방형성 세포들의 특징이다[35]. 리버신 및 지방형성 인자들에 의해 세포화된 근관은 형광-태깅된 글루코오스 유사체의 인슐린-자극된 섭취를 나타내지 않았다(도 4c). 더욱이, 리버신 처리 전에 세포화된 근관에서 p21의 하향-조절은 인슐린 자극 후 글루코오스를 이동시키도록 세포의 전환을 촉진시켰다(도 4c). 하지만, 6-NBDG 섭취의 정도는 3T3-L1 지방세포주에서 관찰된 정도보다 낮았다. 현미경 분석은 지방세포 형태(morphology)의 특징인 지질 축적을 반영하는 세포에 대한 형광-태깅된 글루코오스의 증가된 결합을 보여주었다(도 4d). 지방세포에서 인슐린 민감성의 추가적인 테스트는 에피네프린 자극 후 인슐린-매개된 유리 지방산 방출의 억제를 테스트하는 것이다[36, 37]. 대조군 siRNA, 리버신 및 지방형성 인자들에 의해 세포화된 근관은 에피네프린 자극 후 유리 지방산 방출의 인슐린-자극된 억제를 나타내지 않았다(도 4e). 하지만, 리버신 처리 전에 세포화된 근관에서 p21의 하향-조절은 에피네프린에 노출 후 감소되는 유리 지방산의 양을 가지는 세포에서 세포내 유리 지방산의 증가된 양을 가지는 세포로의 전환을 촉진하였다(도 4e). 더 나아가, 인슐린 처리는 상기 세포군(cell population)에서 에피네프린-자극된 유리 지방산 방출을 억제하였는데, 이는 리버신 및 지방형성 인자들이 처리된 근육모세포에서 관찰되는 것과 유사한 정도였다(도 4e). 하지만, 지방상 축적 및 방출의 정도는 3T3-L1 지방세포주에서 관찰된 정도보다 낮았다.

p21 하향-조절은 세포화된 근관에서 골형성을 촉진시킨다 :

리버신이 처리된 근육모세포는 골형성 인자들(osteogenic factors)의 칵테일 하에서 배양함으로써 조골세포로 분화될 수 있다[15]. 알칼린 포스파타제 활성의 획득은 Wnt-1-유도된 분비 단백질 1 및 골형성 단백질 2(Bone morphogenetic protein 2) 같은 골형성 과정의 조절인자들로 트랜스펙션된 C2C12 근육모세포에서 골형성 전환(conversion)의 지시인자로서 이용되어 왔다[38]. 알칼린 포스파타제 활성의 부재에서 보여지듯이, 골형성 인자들 하에서 세포화된 C2C12 근관의 배양은 골형성 세포로의 전환을 유도하지 않았다(도 5a 및 도 5b). 하지만, 세포화된 후 리버신 및 골형성 인자들의 칵테일이 처리된 근관에서 p21 하향-조절은 현저하게 증가된 알칼린 포스파타제 활성을 가지는 세포로의 분화를 촉진시켰다(도 5a 및 도 5b). 비록 본 연구의 실험군에서 비처리된 C2C12 세포물과 비교하여 알칼린 포스파타제 활성이 상대적인 작지만 유의하게 증가하는 것으로 나타났을 지라도, 상기 알칼린 포스파타제 활성의 획득은 대조군, 스크램블 siRNA로 처리된 세포화된 근관에서 보여지는 활성보다 훨씬 더 뚜렷하게 증가하였다.

무기화(mineralization)은 골형성 동안 일어나는 골화(ossification)의 한 특징이다[33]. 석회화(calcification)는 p21 넉-다운, 리버신 처리 및 골형성 배지에서 배양 후 C2C12 세포물에서 알리자린 레드 S 염색으로 확인하였다. 내연골성(endochondral) 골형성을 일으키도록 유도된 ATDC5 세포가 대조군으로서 이용되었다. 광학 현미경 분석은 p21 넉-다운, 리버신 처리 및 골형성 배지에서 배양 후 세포물에서 무기화가 일어났음을 나타냈다(도 5c). 무기화는 마이크로플레이트 판독기-기반된 어세이로 정량하였다(도 5d)[33]. p21 넉-다운, 리버신 처리 및 골형성 배지에서 배양 후 C2C12 세포물은 동일한 조건에서 배양된 C2C12 근육모세포와 유사한 정도로 무기화의 증가를 나타냈다. 무기화 레벨은 골형성 배양 후 ATDC5 세포에서 관찰되는 정도보다 더 낮았다. 더욱이, p21 siRNA 대신에 대조군 siRNA로 처리된 C2C12 세포물은 골형성 배양 후 현저하게 감소된 레벨의 무기화를 야기하였다.

본 연구에서 제시된 결과들은 양서류에서 사지 재생의 초기 단계를 모방한 화학물질-기반된 프로토콜의 첫 번째 기재이다. 이전에, 많은 실험적 접근방법들은 다능성 세포 또는 줄기세포로 형성시키기 위해 성체 세포(adult cells)를 유도하도록 개발되어 왔다. 상기 예들은 체세포 핵전이(somatic cell nuclear transfer) 및 전능성과 관련된 전사인자들의 트랜스펙션을 포함한다[45]. 하지만, 상술한 접근방법들은 인간에서 세포군(cellular population)의 대부분을 차지하는 완전히 분화된 성체세포를 이용하지 않았다[46]. 또한, 상술한 접근방법들은 현재 낮은 효율 같은 기술적 문제에 직면하고 있다. 본 발명에서 기재하고 있는 다능성을 획득하기 위한 화학적 접근방법은 매우 높은 불응성을 가지는 것으로 간주되고 있는 골격근 조직[22]에서 역분화 및 세포군의 전환(cell lineage conversion)을 촉진할 수 있다.

본 발명자들은 다핵 골격근 융합체의 세포화를 다능성의 유도에서 가장 중요한 첫 번째 단계로 고려하였는데, 이는 유사한 현상이 유미목 골격근 역분화 및 이후의 사지 절단에서 일어나기 때문이다[47]. 골격근 세포화를 유도하는 다른 화합물에 대한 본 발명자들의 비교는 화학물질들의 효과가 조직에 따라 차이가 존재하기 때문에 유용하다[22, 39, 40]. 근육모세포주의 분화에 대한 최적화된 프로토콜(도 2a)을 이용하여 화학물질 미오세버린이 근육 융합체(muscle syncytia)로부터 살아있는 단핵세포를 제조하는데 보다 더 효과적이라는 것을 발견하였다. 비록 본 연구가 항-유사분열 제제인 AraC 또는 5-FU로 처리된 근육모세포로부터 유래된 근관에서 미오세버린 활성에 대한 최초 보고일 지라도, 미오세버린의 상대적으로 낮은 세포독성은 최초 보고[14]에 기재되어 있었다.

미오세버린이 처리된 근육 융합체로부터 유래된 세포들은 여전히 불응성을 가지는 것으로 확인되었다(도 2b 및 도 2c). 상술한 발견은 Duckmanton 등[20]에 의한 보고와 일치하며 미오세버린 활성에 대한 최초 보고들[14, 16]과 대조적인데, 이는 아마도 세포화의 유도 전에 높은 순도의 근관을 획득할 필요성이 있음을 의미하는 것이다. 사이클린-의존성 키나제 억제제(CDKN)인 p21의 넉-다운은 세포화된 근관에서 증식 반응을 유도하였으며(도 2b-2d), 이는 p21이 골격근에서 최종 분화의 핵심 조절자라는 최근 발견[24]을 다시 한번 확인하는 것이다. 미오세버린 및 p21 넉-다운의 조합은 근섬유 세포화 및 세포주기 재-진입[21, 41] 같은 유미목 양서류에서 부속기관 재생(appendage regeneration)의 중요한 초기 단계를 모방하도록 포유동물 근육을 유도한다.

유미목 양서류에서 부속기관 재생에 대한 최근 연구들은 근육 세포물이 이후에 신규한 근육 조직으로 재-분화시키는 전구세포들의 일군을 형성한다는 것을 나타낸다. 즉, 재생하는 사지에서 다른 조직 형태들의 어떠한 기여도 있지 않다는 것이다[41]. 본 연구는 작은 분자들의 처리에 의해 얻어진 근육 세포물도 근관(muscle myotubes)으로 재-분화할 수 있다는 것을 확인하였다. 재-분화 상에 리버신 처리의 억제 효과는 근육형성 조절인자 발현의 하향-조절과 연관될 수 있다[42]. 따라서, 본 발명자들은 근육형성 조절인자 발현 상에 p21 넉-다운의 기능(action)이 이후 조사될 흥미로운 분야라고 생각하는데, 이는 p21 넉-다운이 재-분화 상에 리버신의 억제 효과를 역전시켰기 때문이다(도 3b 및 도 3c). 더욱이, p21 넉-다운 및 리버신으로 처리된 근육 세포물은 다양한 운명을 가질 수 있는 전구세포들의 형성을 유도하였다(도 4 및 도 5). 또한, 이와 유사한 상황이 진피-유래된 섬유아세포가 연골, 결합조직 및 힘줄(tendons)을 형성하는 전구세포들의 형성을 유도하는 것으로 알려진 유미목 부속기관 재생(regenerate)에서 일어난다. 따라서, 본 연구에서 기재된 화학적 접근방법은 포유동물의 성체 골격근이 부속기관 재생의 자연적인 예에서 발견되는 것보다 더욱 우수한 정도의 다능성을 가지도록 한다. 본 발명의 화학적 접근방법의 개략적인 도면이 도 6에 제시되어 있다.

지방세포 및 골세포로 재-분화하는 리버신-처리된 근육모세포의 능력이 이전에 보고되었다[34, 42]. 하지만, 본 발명자들의 데이터는 상술한 발견이 주의있게 해석되어야 한다는 것을 나타낸다. 리버신의 이전 연구들은 계통-특이적 마커들의 발현 또는 지방세포 형성 과정 동안 지질 축적 같은 표현형 마커들을 확인하였다. 본 연구는 보다 강력하고 기능적인 어세이를 이용하여 지방세포 및 골세포 형성을 모니터링하고 알려진 세포 형태와 비교하고자 시도하였다. 예를 들어, 본 발명자들은 리버신-처리된 근육세포가 지질 축적을 한다는 것을 확인하였다. 하지만, 그들의 기능적 ‘실행(performance)’은 계통-특이적 지방세포와 비교하여 현저하게 감소된다(도 4c 및 도 4e). 리버신-처리된 근육세포에서 지방형성 인자들의 칵테일을 변형시킴으로써 추가적으로 지방세포형성 과정을 강제(‘push’)하는 것이 가능할 수 있는데, 예를 들어 핵실 지방형성 인자인 퍼록시좀 증식인자-활성화된 수용체-γ를 활성화시키는 티아졸리딘에디온(triazolidinediones)를 처리하는 것이다[48].

분화된 근육으로부터 다능성 세포를 생산하는 본 발명의 화학적 방법(chemically defined method)은 향후 연구에서 수많은 실행가능한 분야를 가진다. 예를 들어, 근육모세포는 뉴런 분화 배지에서 리버신 처리 및 배양함으로써 신경형성 세포를 형성할 수 있다는 것이 보고되었다[43]. 중배엽 계통 세포(예컨대, 지방세포 및 골세포)으로부터 신경외배엽 계통 세포로의 유사한 ‘점프(jump)’가 세포화된 근섬유에서 가능할 수 있다. 선택적으로, 환자-특이적 다능성 세포를 제조하기 위한 시도로 근육생검이 본 연구에 기재된 화학물질-기반된 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 예를 들어, 국소 마취 하에서 환자로부터 외측광근 골격근 스트립이 얻어질 수 있다[44]. 골격근은 본 발명의 접근방법을 위한 아주 매력적인 조직 형태인데, 그 이유는 잔여 근육 전구세포들(muscle precursor cells)을 활성화시킴으로써, 잃어버린 조질을 재생할 수 있기 때문이다[44]. 더 나아가, 본 연구에 기재된 화학적 접근방법은 유미목 양서류의 부속기관 재생의 초기 이벤트를 모방하며, 염증의 징후 및 상처봉합 전에 기능성 전구세포들을 얻기 위한 시도에서 상처 치유의 포유동물 모델들에 본 발명의 방법을 적용하는 것이 보다 바람직할 수 있다. 따라서, 본 연구의 결과들은 포유동물에서 사지 재생을 유도할 수 있는 방법의 개발과 밀접하게 연관되어 있으며 불응성, 완전 분화된 포유동물 조직으로부터 유도된 전능성 줄기세포의 개발을 위한 미래의 접근방법을 제시한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고문헌

[1] Grafi G. The complexity of cellular dedifferentiation: implications for regenerative medicine. Trends in Biotechnology 2009;27:329-332.

[2] Tsonis PA. Regeneration in Vertebrates. Developmental Biology 2000;221:273-284.

[3] Luc B. Transdifferentiation versus stem cell hypothesis for the regeneration of islet beta-cells in the pancreas. Microscopy Research and Technique 1998;43:332-336.

[4] Christina MOH, Margaret WE, Ellen AGC. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics 1992;193:103-115.

[5] Tsonis PA. Regeneration of the vertebrate lens and other eye structures. London.: Nature Publ. [www.els.net], 1999.

[6] Tsonis PA. Regeneration of the lens in amphibia. . Heidelberg: Springer-Verlag, 2000.

[7] Tsonis PA, . Limb Regeneration. Cambridge, UK: Cambridge Univ. Press, 1996.

[8] Takebe I. Regeneration of whole plants from isolated mesophyll protoplasts of tobacco. Naturwissenschaften 1971;58:318-320.

[9] Martin AB, Schultz PG. Opportunities at the interface of chemistry and biology. Trends in Cell Biology 1999;9:M24-M28.

[10] Williams D, Jung D-W, Khersonsky SM, Heidary N, Chang Y-T, Orlow SJ. Identification of Compounds that Bind Mitochondrial F1F0 ATPase by Screening a Triazine Library for Correction of Albinism. Chemistry & Biology 2004;11:1251-1259.

[11] Darren RW, Sung-Kyun K, Sungjin P, Myung-Ryul L, Injae S. An Apoptosis-Inducing Small Molecule That Binds to Heat Shock Protein 7013. Angewandte Chemie International Edition 2008;47:7466-7469.

[12] Min J, Kyung Kim Y, Cipriani PG, Kang M, Khersonsky SM, Walsh DP, et al. Forward chemical genetic approach identifies new role for GAPDH in insulin signaling. Nat Chem Biol 2007;3:55-59.

[13] Xu Y, Shi Y, Ding S. A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine. Nature 2008;453:338-344.

[14] Rosania GR, Chang YT, Perez O, Sutherlin D, Dong H, Lockhart DJ, et al. Myoseverin, a microtubule-binding molecule with novel cellular effects. Nat Biotechnol 2000;18:304-308.

[15] Chen S, Zhang Q, Wu X, Schultz PG, Ding S. Dedifferentiation of Lineage-Committed Cells by a Small Molecule. Journal of the American Chemical Society 2003;126:410-411.

[16] Perez OD, Chang Y-T, Rosania G, Sutherlin D, Schultz PG. Inhibition and Reversal of Myogenic Differentiation by Purine-Based Microtubule Assembly Inhibitors. Chemistry & Biology 2002;9:475-483.

[17] Brockes JP, Kumar A. Plasticity and reprogramming of differentiated cells in amphibian regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol 2002;3:566-574.

[18] Lo DC, Allen F, Brockes JP. Reversal of muscle differentiation during urodele limb regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A 1993;90:7230-7234.

[19] Echeverri K, Clarke JDW, Tanaka EM. In Vivo Imaging Indicates Muscle Fiber Dedifferentiation Is a Major Contributor to the Regenerating Tail Blastema. Developmental Biology 2001;236:151-164.

[20] Duckmanton A, Kumar A, Chang Y-T, Brockes JP. A Single-Cell Analysis of Myogenic Dedifferentiation Induced by Small Molecules. 2005;12:1117-1126.

[21] Tanaka EM, Gann AA, Gates PB, Brockes JP. Newt myotubes reenter the cell cycle by phosphorylation of the retinoblastoma protein. J Cell Biol 1997;136:155-165.

[22] Tiainen M, Pajalunga D, Ferrantelli F, Soddu S, Salvatori G, Sacchi A, et al. Terminally differentiated skeletal myotubes are not confined to G0 but can enter G1 upon growth factor stimulation. Cell Growth Differ 1996;7:1039-1050.

[23] Myers TK, Andreuzza SE, Franklin DS. p18INK4c and p27KIP1 are required for cell cycle arrest of differentiated myotubes. Experimental Cell Research 2004;300:365-378.

[24] Pajalunga D, Mazzola A, Salzano AM, Biferi MG, De Luca G, Crescenzi M. Critical requirement for cell cycle inhibitors in sustaining nonproliferative states. J Cell Biol 2007;176:807-818.

[25] Halevy O, Novitch BG, Spicer DB, Skapek SX, Rhee J, Hannon GJ, et al. Correlation of terminal cell cycle arrest of skeletal muscle with induction of p21 by MyoD. Science 1995;267:1018-1021.

[26] Thelen MH, Simonides WS, van Hardeveld C. Electrical stimulation of C2C12 myotubes induces contractions and represses thyroid-hormone-dependent transcription of the fast-type sarcoplasmic-reticulum Ca2+-ATPase gene. Biochem J 1997;321 ( Pt 3):845-848.

[27] Im YS, Shin HK, Kim HR, Jeong SH, Kim SR, Kim YM, et al. Enhanced cytotoxicity of 5-FU by bFGF through up-regulation of uridine phosphorylase 1. Mol Cells 2009;28:119-124.

[28] Jones-Villeneuve EM, McBurney MW, Rogers KA, Kalnins VI. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. J Cell Biol 1982;94:253-262.

[29] van der Putten HH, Joosten BJ, Klaren PH, Everts ME. Uptake of tri-iodothyronine and thyroxine in myoblasts and myotubes of the embryonic heart cell line H9c2(2-1). J Endocrinol 2002;175:587-596.

[30] Arias E, Ales E, Gabilan NH, Cano-Abad MF, Villarroya M, Garcia AG, et al. Galantamine prevents apoptosis induced by beta-amyloid and thapsigargin: involvement of nicotinic acetylcholine receptors. Neuropharmacology 2004;46:103-114.

[31] Sze Wan S, Mei Kuen T, Pak Ham C, Miguel M, Dong Qing C, Kenneth KHL. Induction of growth arrest and polycomb gene expression by reversine allows C2C12 cells to be reprogrammed to various differentiated cell types. PROTEOMICS 2007;7:4303-4316.

[32] Nakai M, Sekiguchi F, Obata M, Ohtsuki C, Adachi Y, Sakurai H, et al. Synthesis and insulin-mimetic activities of metal complexes with 3-hydroxypyridine-2-carboxylic acid. J Inorg Biochem 2005;99:1275-1282.

[33] Gregory CA, Gunn WG, Peister A, Prockop DJ. An Alizarin red-based assay of mineralization by adherent cells in culture: comparison with cetylpyridinium chloride extraction. Anal Biochem 2004;329:77-84.

[34] Chen S, Takanashi S, Zhang Q, Xiong W, Zhu S, Peters EC, et al. Reversine increases the plasticity of lineage-committed mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences 2007;104:10482-10487.

[35] Garcia de Herreros A, Birnbaum MJ. The acquisition of increased insulin-responsive hexose transport in 3T3-L1 adipocytes correlates with expression of a novel transporter gene. J Biol Chem 1989;264:19994-19999.

[36] Nishide M, Yoshikawa Y, Yoshikawa EU, Matsumoto K, Sakurai H, Kajiwara NM. Insulinomimetic Zn(II) complexes as evaluated by both glucose-uptake activity and inhibition of free fatty acids release in isolated rat adipocytes. Chem Pharm Bull (Tokyo) 2008;56:1181-1183.

[37] Kawabe K, Yoshikawa Y, Adachi Y, Sakurai H. Possible mode of action for insulinomimetic activity of vanadyl(IV) compounds in adipocytes. Life Sci 2006;78:2860-2866.

[38] French DM, Kaul RJ, D'Souza AL, Crowley CW, Bao M, Frantz GD, et al. WISP-1 Is an Osteoblastic Regulator Expressed During Skeletal Development and Fracture Repair. Am J Pathol 2004;165:855-867.

[39] Huby RDJ, Weiss A, Ley SC. Nocodazole Inhibits Signal Transduction by the T Cell Antigen Receptor. Journal of Biological Chemistry 1998;273:12024-12031.

[40] Ai H, Ralston E, Lauritzen HP, Galbo H, Ploug T. Disruption of microtubules in rat skeletal muscle does not inhibit insulin- or contraction-stimulated glucose transport. Am J Physiol Endocrinol Metab 2003;285:E836-844.

[41] Tweedell KS. The urodele limb regeneration blastema: the cell potential. ScientificWorldJournal;10:954-971.

[42] Amabile G, D'Alise AM, Iovino M, Jones P, Santaguida S, Musacchio A, et al. The Aurora B kinase activity is required for the maintenance of the differentiated state of murine myoblasts. Cell Death Differ 2009;16:321-330.

[43] Lee EK, Bae GU, You JS, Lee JC, Jeon YJ, Park JW, et al. Reversine increases the plasticity of lineage-committed cells toward neuroectodermal lineage. J Biol Chem 2009;284:2891-2901.

[44] Zierath JR, Krook A, Wallberg-Henriksson H. Insulin action and insulin resistance in human skeletal muscle. Diabetologia 2000;43:821-835.

[45] Hochedlinger, K.; Plath, K., Epigenetic reprogramming and induced pluripotency. Development 2009, 136, (4), 509-23.

[46] Marieb, E. K. H., Human Anatomy & Physiology. 7th ed.; Pearson Benjamin Cummings: 2007.

[47] Brockes, J. P.; Kumar, A., Comparative aspects of animal regeneration. Annu Rev Cell Dev Biol 2008, 24, 525-49.

[48] Braissant, O.; Foufelle, F.; Scotto, C.; Dauca, M.; Wahli, W., Differential expression of peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs): tissue distribution of PPAR-alpha, -beta, and -gamma in the adult rat. Endocrinology 1996, 137, (1), 354-66.

Claims (15)

1. 다음의 단계를 포함하는 포유동물 분화세포로부터 다능성 세포(multipotent or pluripotent cells)의 화학적 제조방법:
   (a) 포유동물부터 분화세포를 수득하는 단계; 및
   (b) 상기 분화세포에 p21 발현의 하향-조절 유도 후 역분화제(dedifferentiation agent)를 처리하여 다능성 세포를 수득하는 단계.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 분화세포는 말기 분화세포(terminally differentiated cell)인 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 분화세포는 골격근 세포, 심근 세포, 평활근 세포, 피부 세포, 연골 세포, 지방 세포 및 골세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 분화세포는 결합 조직, 신경 세포, 림프 세포, 맥관 세포, 신장 세포, 췌장 세포, 폐 세포, 요도 세포, 방광 세포, 위 세포, 간 세포, 소장 세포, 대장 세포 및 식도 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 포유동물의 근육세포로부터 유래된 융합체(syncytia)를 분화시키고 단핵세포 또는 세포물(cellulate)을 얻기 위하여 상기 분화된 융합체에 세포화-유도 제제(cellularization-inducing agent)를 처리하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 세포화-유도 제제는 미오세버린(myoseverin), 미오세버린 B, 콜치신 또는 노코다졸인 것을 특징으로 하는 방법.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 세포화-유도 제제는 미오세버린인 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. 제 1 항에 있어서, 상기 p21 발현의 하향-조절은 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 또는 miRNA를 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
9. 제 1 항의 단계 (b)에 있어서, 상기 역분화제는 리버신(reversine; 2-(4-morpholinoanilino)-6-cyclohexylaminopurine)인 것을 특징으로 하는 방법.
   
10. 제 1 항에 있어서, 상기 p21 발현의 하향-조절은 세포화된 근관의 증식, 세포주기로의 재-진입(re-entry) 및 분화를 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
11. 제 1 항에 있어서, 상기 다능성 세포는 근육형성 리니지(myogenic lineage), 지방형성 리니지(adipogenic lineage) 또는 골형성 리니지(osteogenic lineage)으로 분화할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
    
12. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (b)의 역분화제 처리이후 분화 유도제를 단계 (b)에서 얻은 세포에 처리하여 단계 (a)의 분화세포와 동일 3배엽 계통의 다른 세포 리니지(cell lineage)로 분화시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
13. 제 3 항에 있어서, 상기 분화세포는 골격근 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
    
14. 제 1 항의 방법에 따라 제조된 다능성 세포.
    
15. 다음의 단계를 포함하는 포유동물 조직 또는 기관의 재생(regeneration)방법:
    (a) 포유동물부터 분화세포를 수득하는 단계;
    (b) 상기 분화세포에 p21 하향-조절 유도 후 역분화제(dedifferentiation agent)를 처리하여 다능성 세포를 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 다능성 세포를 원하는 조직 또는 기관으로 분화시키는 단계.

Images