KR101521214B1 - 다능성 세포의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 골격근-유래된 다능성 세포의 화학적 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 다음의 단계를 포함하는 포유동물 분화세포로부터 다능성 세포(multipotent cells)의 화학적 제조방법을 제공한다: (a) 포유동물부터 분화세포를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 분화세포에 p21 하향-조절 유도 화합물을 처리하여 다능성 세포를 수득하는 단계. 본 발명의 다능성 또는 전능성 세포 제조방법을 통해 근육형성 세포 리니지(myogenic lineage), 지방형성 세포 리니지(adipogenic lineage), 골형성 세포 리니지(osteogenic lineage) 또는 신경형성 세포 리니지(neurogenic lineage)를 제공할 수 있으며, 화학물질-기반된 접근방법은 포유동물에서 사지 재생을 유도하는 전략들의 개발에 중요하며, 말기 분화세포로부터 다능성 또는 전능성 세포의 개발을 위한 새로운 접근방법을 제시한다.

Description

다능성 세포의 제조방법{Methods for Preparing Multipotent Cells}

본 발명은 다능성 세포의 화학적 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

역분화(dedifferentiation)는 분화된 세포가 하나 이상의 서로 다른 조직 형태로 분화하기 전의 줄기세포-유사 또는 다분화능 상태(multipotent state)를 획득하는 현상에 대한 것이다(1). 세포내 역분화와 관련된 새로운 조절인자를 발견하기 위해 저분자 라이브러리(small molecule libraries)의 표현형-기반된 스크리닝 방법을 실시하였다(2). 저분자를 이용한 세포 조작은 유전적 접근법과 비교하여 상당한 장점을 갖는다(3). 예컨대, 저분자는 일시적으로 단백질의 기능을 조절할 수 있는 고도의 기술을 제공한다. 또한, 단일 저분자는 세포 내의 복합적인 특이 타겟을 동시에 조절할 수 있는 가능성을 갖는다.

유미목 양서류(urodele amphibians)는 뛰어난 역분화능 및 조직 재생능을 갖는다(4). 예컨대, 사지 절단 후에 전체를 재생할 수 있다. 더욱이, 이러한 재생능은 동물의 전생애 동안 유지된다(5). 이러한 현상의 연구를 통해, 재생능의 분자적 기작을 이해함으로써 인간 조직 재생을 향상시킬 수 있는 접근법을 개발할 수 있다.

유미목 양서류의 사지 재생 초기에는 절단 부분을 중심으로 골격근 섬유의 역분화가 일어난다(6). 섬유 융합체(syncytia)는 세포화(cellularization)하여 아체(blastema)라 불리는 간엽 성장 영역(mesenchymal growth zone)을 구성하는 단핵 세포로 증식한다. 손실된 사지를 재생하기 위한 다분화능 세포에서 아체는 필수적이다. 그러나, 이러한 조직을 재생하는 선천적 기능은 분류학상 고등척추동물에서 감소한다(7).

포유류 골격근의 역분화를 유도하기 위해 다른 실험적 접근법들이 실시되어 왔다. 예컨대, 마우스 근관(myotubes)에서 세포 주기 정지 또는 아폽토시스 후에, 바이러스성 종양유전자(oncogene)를 발현하여 세포화 및 증식을 유도하였다(8). 그러나, 이러한 역분화된 세포 중 일부는 다분화능(multipotency)을 보여주며, 간엽 리니지(mesenchmal lineage)로부터 세포로 재-분화될 수 있다(8). 유미목 양서류 사지 재생의 추출물과 함께 배양하여 마우스 근관의 역분화를 달성할 수 있으나, 세포는 본질적인 능력을 갖지는 못한다(9). 전사 억제 인자로 구성된 호메오박스(homeobox), (초기 아체 및 마우스 사지 발달에 발현하는)msx1의 유도 발현은 대체 간엽계로의 근관 역분화 및 이형분화(transdifferentiation)를 보여주었다(9, 10).

그러나, 이러한 접근법은 유전 인자의 근육 핵으로의 도입에 의존적이므로, 조직 재생을 증진하기 위한 치료로써 그 가능성이 제한적이다.

근관 역분화를 유도하기 위한 가장 최근의 접근법은 말기 분화를 유지하기 위한 특이 유전자를 타겟하는 siRNA-기반 전략이다. 본 발명진은 최근 연구에서 근관의 세포화 및 다분화능을 유도하는 저분자 및 사이클린-의존 키나제(kinase) 억제제인 p21(CDKN 1A, CIP1)의 녹아웃(knockout)을 조합하여 근관 역분화를 실시하였다(11). 사이클린-의존 키나제 억제제 2A(CDKN2A, ARF) 및 망막아종(retinoblastoma) 단백질(RB1, OSRC)의 녹아웃은 분화된 근관 핵에서 세포 주기 재진입을 유도하고 세포질 분열기작을 상향조절 및 분화능의 소실을 야기한다(12). 그러나, siRNA-기반 접근법은 치료제로써 저분자 약물과 비교하여 보다 문제될 수 있는 비-특이 세포독성(cytotoxicity) 및 그의 발생을 유도할 수 있다(13, 14).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 다능성 세포를 제조하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 분화세포에 p21 하향-조절 유도 화합물을 처리하는 경우, 다능성 세포를 얻을 수 있었고 이들의 분화능(예컨대, 지방형성 세포군, 골형성 세포군, 근육형성 세포군 또는 신경형성 세포군로의 재분화)을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 다능성 세포(multipotent or pluripotent cells)의 화학적 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법에 따라 제조된 다능성 세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법에 따라 제조된 전능성 세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 포유동물 조직 또는 기관의 재생(regeneration)방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 포유동물 분화세포로부터 다능성 세포(multipotent cells)의 화학적 제조방법을 제공한다:

(a) 포유동물부터 분화세포를 수득하는 단계; 및

(b) 상기 분화세포에 p21 하향-조절 유도 화합물을 처리하여 다능성 세포를 수득하는 단계.

본 발명자들은 다능성 세포를 제조하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 분화세포에 p21 하향-조절 유도 화합물을 처리하는 경우, 다능성 세포를 얻을 수 있었고 이들의 분화능(예컨대, 지방형성 세포군, 골형성 세포군, 근육형성 세포군 또는 신경형성 세포군의 역분화)을 확인하였다.

본 발명의 다능성 세포의 화학적 제조방법을 각각의 단계로 나누어 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 포유동물로부터 분화세포를 수득

본 발명에 따르면, 포유동물로부터 분화세포를 수득한다.

본 명세서에서, 용어 포유동물은 인간, 마우스, 래트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 및 고양이를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 분화세포는 말기 분화세포(terminally differentiated cell)이다.

본 명세서에서, 용어 말기 분화세포는 발생(development) 과정 중 종점(endpoint) 단계의 세포로, 특성화된 표현형을 갖는 성숙한(mature) 세포를 말한다. 분화세포는 다른 세포 종류와 구별되는 하나 이상의 특징 또는 기능을 갖으며, 증식할 수 있는 능력이 제한적이다.

바람직하게는, 상기 분화세포는 골격근 세포, 심근 세포, 평활근 세포, 피부 세포, 연골 세포, 지방 세포 및 골세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 세포이고, 보다 바람직하게는 상기 분화세포는 골격근 세포, 심근 세포 및 평활근 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 세포이며, 가장 바람직하게는 상기 분화세포는 골격근 세포이다.

바람직하게는, 상기 분화세포는 결합 조직, 신경 세포, 림프 세포, 맥관 세포, 신장 세포, 췌장 세포, 폐 세포, 요도 세포, 방광 세포, 위 세포, 간 세포, 소장 세포, 대장 세포 및 식도 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 세포이다.

단계 (b): p21 하향-조절 유도 화합물을 처리하여 다능성 세포의 수득

이어, 분화세포에 p21 하향-조절 유도 화합물을 처리한다.

p21은 환경적 스트레스에 따른 핵 이벤트를 조절하는 과정들에서 중요한 기능을 한다. p21은 산화적 스트레스 및 DNA 손상에 따라 매우 높은 레벨로 유도된다. p21 단백질은 사이클린-의존성 키나제의 억제제로 기능하며 세포주기 진행을 효과적으로 차단하기 때문에, 노화 또는 완전 분화된 세포들에서 과다발현 된다. 본 발명에 따르면, p21 발현의 하향-조절은 근섬유 세포화 및 세포주기 재-진입을 유도하여 유미목 양서류의 부속기관 재생의 초기 단계를 모방하도록 유도한다.

본 발명의 p21 하향-조절 유도 화합물은 p21 유전자의 발현 억제, p21 단백질의 활성 억제 또는 p21 단백질의 안정성을 감소시켜 하향-조절을 유도하는 화합물이다.

바람직하게는, 상기 p21 하향-조절 유도 화합물은 다음과 같이 4 종류의 화합물이 있다:

첫 번째, 단계 (b)에서 이용되는 p21 하향-조절 유도 화합물은 p21을 하향조절하면서 글리코겐 신타제-3 키나제(glycogen synthase-3 kinase) 단백질의 활성을 억제하는 화합물이다. 바람직하게는, 상기 첫 번째 군에 해당하는 화합물은 BIO(6-브로모인디루빈-3'-옥사임), 3F8(5-에틸-7,8-다이메톡시-1H-피롤로[3,4-c]이소퀴놀린-1,3(2H)-디원) 및 AR-A 014418(N-[(4-메톡시페닐)메틸]-N'-(5-니트로-2-디아조일)우레아)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 화합물이다. 가장 바람직하게는, 상기 첫 번째 군에 해당하는 화합물은 BIO이다. BIO의 화학 구조식은 다음과 같다:

(Ⅰ)

두 번째, 단계 (b)에서 이용되는 p21 하향-조절 유도 화합물은 p21을 하향조절하면서 p38 MAP(Mitogen-Activated Protein) 키나제 경로를 억제하는 화합물이다. 바람직하게는, 상기 두 번째 군에 해당하는 화합물은 CMPD-1(2'-플루오로-N-(4-하이드록시페닐)-[1,1'-바이페닐]-4-부타나마이드), EO 1428((2-메틸페닐)-[4-[(2-아미노-4-브로모페닐)아미노]-2-클로로페닐]메타논) 및 SB203580(4-[4-(4-플루오로페닐)-2-(4-메틸설피닐페닐)-1H-이미다졸-5-일]피리딘)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 화합물이고, 가장 바람직하게는, SB203580이다. SB203580의 화학구조식은 다음과 같다:

(Ⅱ)

세 번째, 단계 (b)에서 이용되는 p21 하향-조절 유도 화합물은 p21을 하향조절하면서 아데니릴 사이클라세(adenylyl cyclase)의 억제하는 화합물이다. 바람직하게는, 상기 세 번째 군에 해당하는 화합물은 BPIPP( 5-(3-브로모페닐)-5,11-dihydro-1,3-다이메틸-1H-인데올[2',1':5,6]피리도[2,3-d]피리미딘-2,4,6(3H)-trione), KH7((±)-2-(1H-벤지미다졸-2-일디오)프로파노익 애시드 2-[(5-브로모-2-하이드록시페닐)메틸린]하이드라자이드) 및 SQ22536(9-(테트라하이드로-2-푸라닐)-9H-퓨린-6-아민)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 화합물이고, 가장 바람직하게는, SQ22536이다. SQ22536의 화학구조식은 다음과 같다:

(Ⅲ)

네 번째, 단계 (b)에서 이용되는 p21 하향-조절 유도 화합물은 p21을 하향조절하면서 G-단백질-결합 수용체-매개 신호전달(G-protein-coupled receptor-mediated signaling)의 활성화하는 화합물이다. 바람직하게는 LPA(Lysophosphatidic acid)이다. LPA의 화학구조식은 다음과 같다:

(Ⅳ)

보다 바람직하게는, 상기 p21 하향-조절 유도 화합물은 IO(6-브로모인디루빈-3'-옥사임), SB203580(4-[4-(4-플루오로페닐)-2-(4-메틸설피닐페닐)-1H-이미다졸-5-일]피리딘), SQ22536(9-(테트라하이드로-2-푸라닐)-9H-퓨린-6-아민) 또는 LPA(Lysophosphatidic acid)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 화합물이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 p21 발현의 하향-조절은 세포화된 근관의 증식, 세포주기로의 재-진입(re-entry) 및 분화를 유도한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, p21 발현의 하향-조절 후에도 고유한 근전위(myogenic potential)를 유지고유한 근전위(myogenic potential)를 유지한다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 매우 간단한 처리를 통하여 분화세포로부터 다능성 세포를 얻을 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 수득되는 다능성 세포는 단계 (a)에서 이용되는 분화세포와 동일한 리니지 또는 배엽의 세포이다. 예컨대, 분화세포로서 골격근 세포를 이용하는 경우, 본 발명에 의해 수득되는 다능성 세포는 골격근 동일한 배엽의 세포, 예컨대 골격근, 뼈, 진피, 결합 조직, 비뇨생식계, 심장, 피(림프 세포), 신장 및 비장을 구성하는 세포로 분화될 수 있는 다능성 세포이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)에서 이용되는 분화세포는 골격근 세포이고, 단계 (b)에서 수득한 다능성 세포는 골격근 세포, 지방세포 또는 골세포로 분화될 수 있는 다능성 세포이다.

한편, 본 발명에 따르면, 매우 흥미롭게도 분화세포로부터 간단한 처리를 통하여 전능성 세포를 얻을 수 있다. 바람직하게는, 단계 (b)의 p21 하향-조절 유도 화합물 처리 이후 역분화제를 단계 (b)에서 얻은 세포에 처리하여 전능성 세포(pluripotent cell)를 수득하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 전능성 세포는 단계 (a)의 분화세포와 다른 3배엽 계통의 세포로 분화되는 능력을 갖는다.

본 발명의 용어 역분화제(dedifferentiation agent)는 하나 이상의 세포형태들의 역분화를 촉진하는 제제를 의미하며, 화학물질, 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 작은 유기분자, 항체, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi 컨스트럭트 및 리보자임을 포함한다. 다양한 역분화제는 완전 분화된 포유동물 세포에서 역분화를 유도하기에 충분한 시간 동안 하나 이상의 역분화 인자들과 인 비보 또는 인 비트로에서 세포와 접촉시킴으로써 역분화를 유도할 수 있다.

상기 3배엽은 내배엽, 중배엽 및 외배엽으로 구성되며, 내배엽에서는 위, 결장, 간, 췌장, 방광, 요도의 안쪽, 기도의 상피부분, 폐, 인두, 갑상선, 부갑상선 및 소장 조직을 구성하는 세포가 발생하고, 중배엽에서는 골격근, 뼈, 진피, 결합 조직, 비뇨생식계, 심장, 피(림프 세포), 신장 및 비장을 구성하는 세포가 발생하며, 외배엽에서는 중주신경계, 눈의 수정체, 두개골 및 감각, 신경절 및 신경, 색소 세포, 머리결합조직(head connective tissues), 표피, 털 및 유선을 구성하는 세포가 발생한다.

본 발명의 방법에 따르면, 단계 (a)의 분화세포는 p21 하향-조절 유도 화합물 처리 이후 역분화제의 처리에 따라, 다른 3배엽 계통으로 분화할 수 있다.

바람직한 구현예에 따르면, 골격근 유래인 C2C12 세포물은 본 발명의 저분자 처리 후, 리버신과 레티노산 및 N2 첨가제와 배양한 경우 신경 세포로 분화하여 전능성 세포의 특징을 나타낸다.

보다 바람직하게는, 상기 역분화제는 리버신(N6-사이클로헥실-N2-(4-모폴린-4-일-페닐)-9H-퓨린-2,6-다이아민), 트리코스타틴 A(trichostatin A), 발프론산(valproic acid), 부페닐(buphenyl) 및 5-아자시티딘(5-azacytidine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 화합물이다.

바람직하게는, 본 발명의 단계 (b)의 p21 하향-조절 유도 화합물 처리 이후 분화 유도제를 단계 (b)에서 얻은 세포에 처리하여 단계 (b)의 분화세포와 동일 3배엽 계통의 다른 세포 리니지(cell lineage)로 분화시키는 단계를 추가적으로 포함한다.

본 명세서에서, 용어 분화 유도제는 원하는 세포로 분화시키기 위해 배양배지에 포함시키는 성장인자 및 호르몬 등을 말한다.

바람직한 구현예에 따르면, 단계 (b)에서 수득한 다능성 줄기세포로부터 지방형성 세포 리니지를 수득하기 위하여 이용되는 분화 유도제는 인슐린, 덱사메타손, 로시글리타존, IBMX(isobutylmethylxanthine) 또는 이의 혼합물이다.

바람직한 구현예에 따르면, 단계 (b)에서 수득한 다능성 줄기세포로부터 골형성 세포 리니지를 수득하기 위하여 이용되는 분화 유도제는 아스코르브산-2-포스페이트, 덱사메타손, β-글리세로포스페이트 또는 이의 혼합물이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 다능성 또는 전능성 세포는 근육형성 세포 리니지(myogenic lineage), 지방형성 세포 리니지(adipogenic lineage), 골형성 세포 리니지(osteogenic lineage) 또는 신경형성 세포 리니지(neurogenic lineage)로 분화할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된 다능성 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된 전능성 세포를 제공한다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 다능성 또는 전능성 세포로부터 분화된 근육형성 세포 리니지 또는 근육세포를 유효성분으로 포함하는 근질환(myopathy) 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 근질환은 근육 피로, 근위축증, 사고 또는 수술에 의한 상처 또는 근이영양증이고, 용어 근이영양증은 베커형 근이영양증(Becker's muscular dystrophy), 선천성 근이영양증(congenital muscular dystrophy), 뒤셴형근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 원위 근이영양증(distal muscular dystrophy), 에머리-드라이푸스 근이영양증(Emery-Dreifuss muscular dystrophy), 안면견갑상완 근이영양증, 지대형 근이영양증, 근긴장성 근이영양증, 안인두성 근이영양증, 근긴장성 근이영양증, 사르코글리칸증, 척수성 근육위축 또는 BVVL(Brown-Vialetto-Van Laere syndrome)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 다능성 세포로부터 분화된 골형성 세포 리니지을 유효성분으로 포함하는 골 질환 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 골 질환은 골다공증, 청소년 골다공증, 불완전 골형성증(osteogenesis imperfecta), 과골화증, 고칼슘혈증, 부갑상선 기능항진증, 골연화증, 용해성 골질환, 골괴사증, 뼈의 파젯병, 골 발생 질환, 골 골절, 류마티스 관절염에 의한 골 손실, 염증성 류마티스 관절염, 골수염, 전이성 골질환, 치주성 골 소실, 구루병, 암에 의한 골 손실 또는 골의 노인성 손실을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 다능성 또는 전능성 세포로부터 분화된 신경형성 세포 리니지 또는 신경세포를 유효성분으로 포함하는 신경질환(neurological disorder) 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 신경질환은 물리적, 대사적, 독성, 화학적 또는 면역학적인 중추신경계의 손상으로부터 유래한 신경계 질환이며, 바람직하게는 근위축성측생경화증, 다발성경화증, 알츠하이머병, 외상성 뇌손상, 뇌졸중, 허혈성 뇌질환, 간성 뇌증 및 저산소증을 포함하는 가역성 또는 대사성 뇌병증, 간질, 머리 외상, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 3차 신경통, 설인 신경통, 벨 마비, 중증 경화증, 근육 이영양증, 점진성 근육 위축, 점진적 연수 유래 근육 위축, 헤르니아된, 파괴된 또는 탈출된 무척추 디스크 증후군, 경부 척추증, 집강 장애, 흉곽 아웃렛 파괴 증후군, 리드, 답손, 티크, 포르피린증 또는 길랑-바레 증후군에 의해 야기되는 말초신경병을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 (a) 상술한 다능성 또는 전능성 세포로부터 분화된 세포(예컨대, 근육형성 세포군, 골형성 세포군)의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 명세서에서 용어 약제학적 유효량은 상술한 다능성 세포로부터 분화된 세포의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 예를 들어 피하 주입, 근육 주입, 경피 투여, 관절강내 주사, 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 1일 당 10²-10¹⁰ 세포이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 포유동물 조직 또는 기관의 재생(regeneration)방법을 제공한다:

(a) 포유동물부터 분화세포를 수득하는 단계;

(b) 상기 분화세포에 p21 하향-조절 유도 화합물을 처리하여 다능성 세포를 수득하는 단계; 및

(c) 상기 다능성 세포를 원하는 조직 또는 기관으로 분화시키는 단계.

본 발명의 방법은 상기 제조방법을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

단계 (c): 다능성 세포를 원하는 조직 또는 기관으로 분화

이어, 단계 (b)에서 수득한 다능성 세포를 원하는 조직 또는 기관으로 분화시킨다.

상기 분화는 단계 (b)에서 수득한 다능성 세포의 배양배지에 원하는 조직 또는 기관의 분화유도제를 첨가하여 실시한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 p21 하향-조절 유도 화합물을 이용한 다능성 또는 전능성 세포의 제조방법을 제공한다.

(b) 본 발명의 다능성 또는 전능성 세포 제조방법을 통해 근육형성 세포 리니지(myogenic lineage), 지방형성 세포 리니지(adipogenic lineage), 골형성 세포 리니지(osteogenic lineage) 또는 신경형성 세포 리니지(neurogenic lineage)를 제공할 수 있다.

(c) 본 발명의 화학물질-기반된 접근방법은 포유동물에서 사지 재생을 유도하는 전략들의 개발에 중요하며, 말기 분화세포로부터 다능성 또는 전능성 세포의 개발을 위한 새로운 접근방법을 제시한다.

도 1은 골격근 역분화 또는 분화에 사용된 저분자의 구조를 보여준다(알파벳순).
도 2a는 C2C12 분화 마우스 근관에서 저분자를 처리하여 세포 증식을 조사한 실험과정의 모식도를 보여준다. 도 2b는 C2C12 근육 세포물에 2.5 μM BIO(6-bromoindirubin-3'-oxime), 10 μM SB203580(4-[4-(4-fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-1H-imidazol-5-yl]pyridine), 300 μM SQ22536(9-(Tetrahydro-2-furanyl)-9H-purin-6-amine) 또는 30 μM LPA(Lysophosphatidic acid)를 48시간 동안 처리하여 DNA 합성을 유도한 결과로 FITC-BrdU 신호가 증가된 것을 확인하였다. C2C12 근육 세포물에 50 μM MLB 또는 5 μM MPc11을 48시간 동안 처리한 결과, DNA 합성이 증가하지 않음을 보여준다. 도 2c는 C2C12 근육 세포물에 10 μM SB203580, 300 μM SQ22536, 30 μM LPA, 50 μM MLB 또는 5 μM MPc11을 48시간 동안 처리한 결과, 세포독성을 유도하지 않음을 7-AAD 염색을 통해 보여준다. 세포독성 확인의 양성대조군으로 0.1% 트리톤 X-100을 처리하였다. 도 2d는 C2C12 근육 세포물에 2.5 μM BIO를 48시간 동안 처리하여 세포독성이 유도되지 않음을 MTT 분석으로 확인한 결과를 보여준다. 도 2e는 C2C12 근관에 2.5 μM BIO, 10 μM SB203580, 300 μM SQ22536 또는 30 μM LPA를 48시간 동안 처리하여 유도된 세포주기 재-진입(re-entry)을 PI(propidium iodide) 염색을 통해 세포주기의 G₂-M기의 세포함량을 유세포 분석을 실시한 결과로 보여준다. C2C12 근아세포를 양성 대조군으로 이용하였다.
도 3a은 2.5 μM BIO 또는 10 μM SB203580을 48시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물의 p57 발현 감소를 확인한 웨스턴 블럿 결과를 보여준다. 300 μM SQ22536 또는 30 μM LPA를 처리한 C2C12 근육 세포물은 p57의 발현을 감소시키지 않음을 보여준다. 그러나, C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 처리하였을 때, p27의 발현에 영향이 없음을 보여준다. 대조적으로, C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 처리하였을 때, p21 발현이 감소한 결과를 보여준다. GAPDH 발현을 로딩 대조군으로 사용하였다. 밴드 이미지 밑에 표기된 숫자는 무처리 세포물과 비교한 밴드의 강도(intensity)를 보여준다. 도 3b는 C2C12 근육 세포물에 2.5 μM BIO, 10 μM SB203580 또는 30 μM LPA를 48시간 동안 처리하여 분화된 근육-특이 아세틸콜린 수용체의 발현(FITC-결합 α-붕가로톡신의 검출)이 감소된 것으로 역분화를 확인한 결과이다. 300 μM SQ22536, 50 μM MLB 또는 5 μM MPc11를 48시간 동안 처리한 경우, 아세틸콜린 수용체의 발현이 감소되지 않음을 보여준다. 도 3c는 C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580, 또는 LPA를 처리로 역분화를 유도하여 이를 FITC-결합 α-붕가로톡신 표지의 감소를 형광 마이크로플레이트 리더(reader) 분석을 통해 확인한 결과이다. 무처리 세포물과 비교하여 p<0.05의 신뢰도를 나타낸다. 도 3d는 분화배지에서 5일 동안 배양 후, C2C12 근육 세포물에 2.5 μM BIO, 10 μM SB203580, 300 μM SQ22536 또는 30 μM LPA를 48시간 동안 처리한 경우 융합지수(예컨대, 다수의 세포 핵이 다핵성 근관 융합체에 포함)에 영향이 없음을 나타낸 결과이다. 대조적으로 분화배지에서 5일 동안 배양 후, 1 μM 리버신을 48시간 동안 처리한 경우 융합지수가 감소되었다. 무처리 세포물과 비교하여 p<0.05의 신뢰도를 나타낸다.
도 4는 C2C12 근육 세포물에 2.5 μM BIO, 10 μM SB203580, 300 μM SQ22536 또는 30 μM LPA를 48시간 동안 처리하고 지방세포형성 인자를 7일 동안 처리한 경우 지방세포화의 특징인 지질 축적이 유도됨을 나타낸다. 지질은 오일 레드 O(Oil Red O) 염색으로 가시화하였다. 무처리 C2C12 세포물 또는 50 μM MLB 또는 5 μM MPc11를 48시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 지방세포 형성 인자를 처리한 경우 지질 축적이 나타나지 않음을 보여준다. C2C12 근아세포에 250 nM 리버신을 처리하고 48시간 동안 지방세포화 배지에서 배양한 경우 이전 보고된 논문에서와 같이 지질 축적이 확인되었다(33). 비교를 위해 3T3-L1 지방세포의 지질 축적을 나타내었다. 도 4bi는 아디포레드(AdipoRed)^TM 라벨링으로 측정한 지질축적을 나타낸다. C2C12 근육 세포물에 2.5 μM BIO, 10 μM SB203580, 300 μM SQ22536 또는 30 μM LPA를 48시간 동안 처리하고 지방세포형성 인자를 처리한 경우 지질 축적이 상당히 증가한 결과이다. 대조적으로, 무처리 C2C12 세포물 또는 50 μM MLB 또는 5 μM MPc11를 48시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 지방세포형성 인자를 처리한 경우에는 지질 축적이 증가하지 않음을 나타낸다. 결과는 무처리 세포물과 비교하여 p<0.05의 신뢰도를 나타낸다. 도 4bii는 C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 48시간 동안 처리하고 250 nM 리버신을 처리한 후, 지방세포형성 인자를 처리하여 배양한 결과 아디포레드^TM 프로브(probe)로부터 형관 신호가 증가하는 것으로 지질 축적이 증가함을 확인하였다. C2C12 근육 세포물에 MLB 또는 MPc11을 48시간 동안 처리하고 250 nM 리버신을 처리한 후, 지방세포형성 인자를 처리하여 배양한 결과, 지질 축적이 증가하지 않았다. 결과는 무처리 세포물과 비교하여 p<0.05의 신뢰도를 나타낸다. 도 4c는 C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 48시간 동안 처리하고 지방세포형성 인자를 처리한 결과, 지방세포 특이적 기능인 인슐린-경로 매개 글루코즈 섭취능을 나타냈다. 무처리 C2C12 세포물 또는 50 μM MLB 또는 5 μM MPc11를 48시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 지방세포형성 인자와 배양한 경우, 인슐린-경로 매개 글루코즈 섭취능을 나타내지 않음을 보여준다. 결과는 인슐린-경로를 자극하지 않은 세포물과 비교하여 p<0.05의 신뢰도를 갖는다.
도 5a는 C2C12 근육 세포물에 2.5 μM BIO, 10 μM SB203580, 300 μM SQ22536 또는 30 μM LPA를 48시간 동안 처리하고 골형성 인자를 처리하여 골형성 전환의 특징인 무기질화(mineralization)를 유도한 결과를 나타낸다. 무처리 세포물 또는 50 μM MLB 또는 5 μM MPc11를 48시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 골형성 인자와 배양한 경우, 무기질화를 나타내지 않았다. C2C12 근아세포에 250 nM 리버신을 처리한 후, 골형성 배지에서 48시간 동안 배양한 경우 무기질화가 형성되었으며, 이는 이전 보고와 일치한다(33). ATDC5 골형성 세포의 무기질화 비교하여 나타내었다. 도 5bi는 C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 48시간 동안 처리하고 골형성 인자를 처리한 경우, 무기질화가 상당히 증가함을 보여준다. 반대로, 무처리 C2C12 세포물, 또는 MLB 또는 MPc11를 48시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 골형성 인자를 처리한 경우, 무처리 세포물과 비교하여 무기질화가 증가하지 않았다(p<0.05). 도 5bii는 C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 48시간 동안 처리하고 250 nM 리버신을 48시간 처리한 후, 골형성 인자를 첨가하여 배양한 경우, 알리자린 레드(Alizarin red) 염색을 통해 무기질화가 증가함을 보여준다. 또한, 4 처리군 간의 리버신 처리에 대한 차이는 감소하였다. MLB 또는 MPc11를 48시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 골형성 인자를 처리한 경우 250 nM 리버신을 48시간 처리한 후, 골형성 인자를 첨가하여 배양한 경우, 무기질화가 증가하지 않음을 보여준다. 결과는 무처리 세포물과 비교하여 p<0.05의 신뢰도를 갖는다. 도 5Ci는 증가된 알칼라인 포스파타제 활성은 골형성 전화의 하나의 특징이다. C2C12 세포물에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 48시간 처리하고 골형성 인자를 처리한 후 알칼라인 포스파타제 활성 상당히 증가한 결과를 보여준다. 반대로, 무처리 C2C12 근육 세포물, 또는 MLB 또는 MPc11를 48시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 골형성 인자를 처리한 경우, 알칼라인 포스파타제 활정이 증가하지 않음을 보여준다. 무처리, MLB 또는 MPc11 처리한 C2C12 근육 세포물은 유사한 분석값을 보여준다. 도 5cii는 C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 48시간 동안 처리하고 250 nM 리버신을 48시간 처리한 후, 골형성 인자를 첨가하여 배양한 경우, 4 처리군 간의 알칼라인 포스파타제 활성의 차이가 줄어듬을 보여준다. 반대로, 무처리 C2C12 세포물, MLB 또는 MPc11를 48시간 동안 처리한 C2C12 근육 세포물에 골형성 인자를 처리하고 250 nM 리버신을 48시간 처리한 후, 골형성 인자를 첨가하여 배양한 경우, 알칼라인 포스파타제 활성을 증가시키지 않음을 보여준다. 무처리, MLB 또는 MPc11 처리한 C2C12 근육 세포물은 유사한 분석값을 보여준다.
도 6a는 C2C12 근육 세포물에 2.5 μM BIO, 10 μM SB203580 또는 300 μM SQ22536를 48시간 동안 처리하고 신경형성 인자를 처리하고 250 nM 리버신을 48시간 처리한 후, 신경형성 배지에서 배양하여 신경 전사인자, Hes-6의 발현을 유도을 유도한 결과이다. 반대로, 30 μM LPA, 50 μM MLB 또는 5 μM MPc11를 C2C12 근육 세포물에 48시간 처리하고 250 nM 리버신을 48시간 처리한 후, 신경형성 배지에서 배양한 경우, Hes-6 발현을 유도하지 않음을 보여준다. 도 6b는 C2C12 근육 세포물에 BIO를 처리하고 250 nM 리버신을 48시간 처리한 후, 신경형성 배지에서 배양한 결과 신경형성으로 보이는 형태학적 변화가 관찰되었다. 도 6c는 C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580 또는 SQ22536를 48시간 처리하고 250 nM 리버신을 48시간 처리한 후, 신경형성 인자와 배양한 경우 신경-특이적 특징인 탈분극화-의존 소포 재순환(depolarization-dependent vesicle recycling)을 확인한 결과이다. 소포 재순환은 형광 표지. FM 1-43으로 가시화하였다. 반대로, MLB 또는 MPc11를 C2C12 근육 세포물에 48시간 처리하고 250 nM 리버신을 48시간 처리한 후, 신경형성 인자가 포함된 배지에서 배양한 경우, 탈분극화-의존 소포 재순환을 나타내지 않았다. 도 6d는 C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580 또는 SQ22536를 48시간 동안 처리하고 250 nM 리버신을 48시간 처리한 후, 신경형성 인자를 첨가하여 배양한 경우 고농도 세포외 칼륨을 이용한 탈분극으로 FM 1-43 흡수가 증가하였다. 반대로, C2C12 근육 세포물에 MLB 또는 MPc11을 48시간 처리하고 250 nM 리버신을 48시간 처리한 후, 신경형성 인자를 첨가하여 배양한 경우 FM 1-43 형광 신호가 증가하지 않음을 보여준다. 저농도 세포외 칼륨을 이용한 대조군과 비교하여 p<0.05의 신뢰도를 갖는다. FM 1-43 형광 신호의 탈분극-의존 증가를 비교하기 위해 p19 뉴런을 이용하였다. 도 6e는 C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580 또는 SQ22536를 48시간 동안 처리하고 250 nM 리버신을 48시간 처리한 후, 신경형성 인자를 포함하여 배양한 결과, 신경-특이적 특징인 글루타메이트-의존 칼슘 유입을 확인한 결과이다. 글루타메이트-의존 칼슘 유입은 형광 표지, Fluo-3로 가시화하였다. 반대로, C2C12 근육 세포물에 MLB 또는 MPc11을 48시간 처리하고 250 nM 리버신을 48시간 처리한 후, 신경형성 인자를 포함하여 배양한 경우 글루타메이트-의존 칼슘 유입이 확인되지 않았다.
도 7는 완전히 분화된 골격근 조직으로부터 전능성 세포를 수득하기 위한 저분자 방법의 모식도를 보여준다. 최근에 발표된 결과는 도룡뇽과 같은 유미목 양서류의 사지 재생 동안 근조직의 역분화 및 본질적으로 새로운 사지(예컨대, 단분화능 세포)에 새로운 근조직을 형성함을 보여준다(31). 본 발명의 저분자 방법은 신경세포의 특징을 나타내는 세포로의 전환이 보여주듯이, 전분화능을 갖는 세포로 역분화함으로써 포유류 근육 조직에 대한 세포의 발생학적 가소성을 보다 넓힐 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

세포배양

C2C12 마우스(mus musculus) 근아세포(myoblasts)를 이전에 보고된 방법에 따라 배양하였다(11). 근관으로 분화하기 위해, 근아세포를 콜라겐-코팅 조직 배양 플레이트(시그마, 미국)에서 배양하였다. 컨플루언트 근아세포에 10일 동안 분화 배지(5% 호올스(horse) 혈청, 50 units/㎖ 페니실린 및 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM)에서 배양하여 분화 유도하였다. 분화를 높이고 단핵 근아세포를 제거하기 위해, 분화배양배지에 24시간 배양 후 50 μM AraC3을 72시간 동안 처리한다.

근관의 정제 배양물을 수득하기 위해, 분화된 근관 배양물에 트립신 처리하여 800 rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 10 ㎖ 분화배지에 재-현탁 한 후에 40 ㎛ 메쉬(BD sciences, 미국)에 2 번 분리하였다. 메쉬를 20 ㎖ 배양배지로 세척하여 근관을 수득하였다. 일반적으로, 하나의 10 ㎠ 디쉬의 근관을 얻는데, 5개의 컨플루언트 10 ㎠ 디쉬의 분화된 C2C12 배양물이 필요하다.

3T3-L1 마우스(mus musculus) 배아 섬유아세포를 배양하여 보고된 방법으로 지방세포로 분화하였다(11). ATDC5 마우스(mus musculus)의 골-연골형성 전구세포(osteo-chondrogenic precursor cells)를 이전 보고된 방법으로 골아세포로 배양 및 분화하였다(11).

골격근 근관의 세포화

C2C12 근관 배양물에 20 μM 미오세버린을 48시간동안 처리하고 이전 보고된 방법으로 수확하였다(11).

세포화된 골격근 근관에서의 지질형성 유도

세포를 10% FBS, 100 nM 인슐린, 5 μM 덱사메사손(dexamethasone), 1 μM 로시글리타존(rosiglitazone) 및 0.5 mM IBMX(Isobutylmethylxanthine)가 첨가된 DMEM로 48시간 동안 배양하고, 100 nM 인슐린 및 1 μM 로시글리타존으로 7일 동안 추가 배양하였다. 배양 배지를 매 48시간 마다 교환하였다.

세포화된 골격근 근관에서의 골형성 유도

세포화된 골격근 근관에서의 골형성 유도는 이전에 보고된 리버신-처리 방법으로 실시하였다(33).

세포화된 골격근 근관에서의 신경형성 유도

신경형성을 유도하는 방법은 리버신-처리 C2C12 근아세포에서 뉴런을 형성한 보고를 기초로 하였다(28). 세포물을 라미닌-코팅 배양디쉬에 1.5×10⁶ 세포/9.6㎠으로 배양하였다. 저분자 처리 후에, 세포를 250 nM 리버신을 48시간 동안 처리하고, 신경 유도 배지(N2가 첨가된 DMEM/F12, invitrogen, 미국) 및 1.5 μM 전-트랜스(all-trans) 레티노산(retinoic acid) 11로 7일 동안 배양하였다.

통계 분석

3번의 독립적인 실험의 평균값으로 맨-휘트니(Mann-Whitney) U 테스트를 통해 유의값을 결정하였다(TalkStats software; Jelsoft Enterprises). p 값은 0.05 미만의 유의성을 나타내었다. 모든 오차범위는 중간값의 표준편차값이다.

결과

현재 화학 생물학 연구에 있어 세포를 조작하는 화학적 접근법은 가장 중요한 분야이다. 포유류 근육에서 양서류 사지 재생의 초기 단계를 유도하기위한 저분자의 개발이 시도되었으나 완전한 역분화를 성공하지는 못했다(15, 16). 따라서, 화학 생물학 분야에서는 저분자를 이용한 포유류 근육 역분화의 증명에 관심이 많다.

BIO, SB203580, SQ22536 및 LPA의 DNA 합성 및 세포 주기 재-진입(re-entry) 유도

본 발명에 사용한 저분자를 도 1에 나타내었다. 도 2a는 근육 세포물의 증식 정도를 보여준다. 본 발명에서 각 저분자의 농도는 이전에 보고된 문헌을 참고하여 활성을 갖는 농도로 실시하였다(17, 20, 21). 2.5 μM BIO(6-bromoindirubin-3'-oxime), 10 μM SB203580(4-[4-(4-fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-1H-imidazol-5-yl]pyridine), 300 μM SQ22536(9-(Tetrahydro-2-furanyl)-9H-purin-6-amine) 또는 30 μM LPA(Lysophosphatidic acid)를 48시간 동안 처리한 세포물은 세포물 안의 BrdU(5'-브로모-2-데옥시우리딘) 결합(incorporation)이 증가하여 DNA 합성이 증가한 것을 보여준다(도 2b). BrdU 결합은 상대적으로 SQ22536을 처리한 세포물에서 적게 나타났다. MPc11(F1F0 미토콘드리아 ATP 신타아제의 합성 억제제) 9 및 50 μM MLB B(마그네슘 리토스퍼메이트(magnesium lithospermate) B, 천연 항산화제) 8을 음성대조군으로 사용하였다(22, 23). 50 μM MLB 또는 5 μM MPc11을 48시간 동안 처리한 C2Cl2 근육 세포물은 증식이 증가하지 않았으며, 세포독성을 유도하지 않았다(도 2b 및 도2c). BIO에 의한 세포 염색으로 인해, BIO를 처리한 세포물은 7-AAD 염색을 할 수 없다. 따라서, MTT 분석법은 BIO가 세포독성을 유도하지 않는 것을 보여준다(도 2d). BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA 처리 시 세포 주기 재-진입하여 G₂-M 단계의 세포를 증가시킴을 핵염색을 통해 보여주었다(도 2e).

BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA의 CDKN 발현 조절

p21(CIP1/CDKN1A), p27(CDKN1B/KIP1) 및 p57(CDKN1C/KIP2)를 포함하는 수많은 사이클린-의존 키나제 억제제(Cyclin-Dependent Kinase Inhibitors, CDKN)는 골격근의 지속적인 분화양상을 보여준다(18, 24). 근육 세포물에서 BIO 또는 SB203580의 처리는 p57 발현을 감소시킨다(도 3a). 그러나, 저분자 처리는 p27 발현에 뚜렷하게 영향을 주지 않는다(도 3a). 반면, 저분자 처리는 p21 발현을 감소시킨다(도 3a).

BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA의 역분화 유도

근육 세포물에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 처리한 경우, 역분화된 세포물을 가리키는 FITC-결합된 α-붕가로톡신(bungarotoxin) 표지가 감소하였다(도 3b). 반대로, SQ22536, MLB 또는 MPc11은 FITC-결합된 α-붕가로톡신 표지를 감소시키지 않았다(도 3b). BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA이 FITC-결합된 α-붕가로톡신 표지를 감조시킴을 형광 평판 리더 분석법을 통해 확인하였다(도 3c).

BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA의 근전위(myogenic potential) 영향

근육 세포물의 근육을 형성하는 능력(근전위, myogenic potential)을 세포융합지수(fusion index)를 이용하여 분석하였다(11). 분화 배지에서 5일 동안 배양 한 후에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA는 융합지수에 영향을 주지 않았다(도 3d). 대조적으로, 리버신(reversine)의 처리는 세포융합지수를 감소시켰다.

BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA의 지방세포화 유도

BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 처리한 C2C12 근육 세포물에 지방세포형성 인자(adipogenic factors)의 칵테일을 처리하고 배양하여 지질 축적을 유도하였다(도 4a). C2C12 근육 세포물에 MLB 또는 MPc11 및 지방세포형성 인자를 처리한 경우, 지질 축적을 유도하지 않았다. 발명진의 이전 연구의 p21 녹아웃을 이용한 지방세포형성 전환은 리버신 처리에 의존적이였다(11). 그러나, C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA의 처리 후, 지방세포형성 인자를 처리하니 리버신의 처리 없이도 지질이 축적되는 것을 확인하였다(도 4Bⅰ). 더욱이, BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA의 처리 후, 리버신 및 지방세포형성 인자를 함께 처리한 실험군에서 지질 축적 정도가 증가하였다(도 4bⅱ).

지방세포의 특징인 인슐린-자극에 의한 포도당의 흡수(uptake)는 형광 포도당 유사체인 2-NBDG(2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diaxol-4-yl)amino]-2-deoxyglucose)로 측정하여 알 수 있다(25). BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 48시간 동안 처리한 후에 지방세포형성 인자의 칵테일을 처리하여 배양하여 인슐린-자극 포도당 흡수를 유도하였다(도 4ci). MLB 또는 MPc11 및 지방세포형성 인자는 인슐린 감수성이 없었다. 또한, 리버신 및 지방세포형성 인자를 48시간 동안 처리하고 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 처리하니 2-NBDG 흡수량이 증가하였다. 그러나, 인슐린-자극 및 비인슐린-자극 세포에서 2-NBDG 흡수의 차이는 유사하게 나타났다(도 4cⅱ)

BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA의 골원성(osteogenic) 전환

무기질화(mineralization)의 증가는 골형성(osteogenesis)의 주요한 특징이다(26). C2C12 근육 세포물에 BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA를 처리하고, 무기질화를 유도하는 골형성 인자 칵테일과 함께 배양하였다(도 5a). MLB 또는 MPc11 및 골형성 인자를 처리한 실험군에서 무기질화가 관찰되지 않았다. BIO 또는 SB203580을 처리한 실험군에서는 골형성 인자와 배양한 후에 LPA 또는 SQ22536을 처리한 실험군과 비교하여 보다 많은 무기질화가 유도되었다(도 5bⅱ). 또한, BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA와 리버신 및 골형성 인자를 처리하니 실험군 사이의 무기질화에 차이가 감소하였다.

BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA와 골형성 인자를 처리하여 골형성 전환을 나타내는 알칼린 포스파타제 활성을 유도하였다(도 5cⅰ). MLB 또는 MPc11 및 골형성 인자를 처리한 C2C12 근육 세포물에서는 알칼린 포스파타제 활성이 유도되지 않았다. 알칼린 포스파타제 활성의 유도는 LPA 및 SQ22536을 처리한 군에 비해, BIO 및 SB203580에서 더 높게 나타났다. 또한, BIO, SB203580, SQ22536 또는 LPA 및 리버신과 골형성 인자를 처리한 실험군에서는 알칼린 포스파타제 활성 정도가 증가하였다(도 5cⅱ). 또한, 처리 과정에서 리버신을 추가한 경우 실험군 간의 알칼린 포스파타제 활성의 차이가 감소하였다.

BIO, SB203580 및 SQ22536의 신경형성(neurogenic) 유도

C2C12 세포물에 저분자를 처리한 후에 신경성 특징이 발생하는지 Hes-6(신경 분화를 촉진하는 전사인자로 신경화된 C2C12 근아세포(myoblast)에서 상향 조절되는 유전자)의 발현을 RT-PCR 분석법을 통해 측정하였다(도 6a). LPA, MLB 또는 MPc11를 처리한 후에 신경 리버신 및 신경형성 인자와 배양하였을 때, Hes-6의 발현이 상향 조절되지 않았다. 상향 조절된 Hes-6 발현은 세포물의 신경이 형성되려는 형태학상 변화를 수반한다(도 5b, 28). 탈분극(depolarization)-의존 소낭의 재순환 작용은 신경세포에 특이적인 생리학적 특징이다(도 6c). 탈분극-의존 소낭 재순환 작용의 발생을 마이크로플레이트 리더(microplate reader) 분석법으로 확인하였다(도 6d). 글루타메이트-의존 칼슘유입 또한 신경세포 특이적인 생리학적 특징이다(29). BIO, SB203580 또는 SQ22536을 처리하고 리버신 및 신경형성인자와 배양하였을 때, 글루타메이트-의존 칼슘 유입이 확인되었다(도 6e). 반면, MLB 또는 MPc11를 처리하고 리버신 및 신경형성 인자와 7일 동안 배양한 실험군에서는 클루타메이트-의존 칼슘 유입이 나타나지 않았다.

고찰

동물계에서, 유미목 양서류의 사지 재생은 조직재생의 특별한 예이다(7). 사지 재생의 초기단계는 근육의 세포화 및 세포 주기 재-집입과 관련이 있다(4,6). 최근에, 포유류의 근육에서 유사한 작용을 유도하는 siRNA-기반 접근법이 연구되었다(11, 12). 그러나, 비-특이적 세포독성 및 빈약한 생물학적 기여의 문제점을 갖고 있으므로, siRNA-기반 접근법에 비해 저분자-기반 접근법이 더 우수하다.

본 발명의 중점은 오염시키는(contaminating)' 미분화된 근아세포를 배제한 근관의 정제 파퓰레이션의 분화이다. 본 발명의 목적을 이루기 위해, 발명진은 이전에 보고된 연속 세포 분리법(sequential cell seiving)을 이용하였다(11, 16). 발명진은 이전에 상기 방법이 정제 근관 배양물(purified myotube cultures)을 수득하는데 알맞은지 확인하였다(11). 발명진은 상대적으로 낮은 세포독성을 갖는 저분자인 미오세버린을 이용하여 세포화를 유도하였다(11,15). 저분자인 BIO를 이용하여 글리코겐-3 키나제의 억제하고 LPA로 G-단백질-결합 수용기-매개 신호전달을 활성화, SQ22536을 이용한 아데니릴 사이클라제 억제 또는 SB203580을 이용하여 p38 MAP 키나제 경로를 억제하여 근육 세포물의 세포를 세포주기로 재진입 시켰다(도 2b). 이는 복합적인 생화학적 경로조절를 세포의 증식을 유도하도록 조절할 수 있음을 보여준다.

이전 연구에서, 근관에서의 siRNA-매개 유전자 녹다운 또는 바이러스성 종양형성 유전자의 발현은 증식 및 아폽토시스를 유도하였다(8, 13, 14). 그러나, BIO, LPA, SB203580 및 SQ22536은 세포독성을 유도하지 않았다(도 2c). 또한, 증식하는 세포물의 세포 주기는 증식하는 근육 근아세포 및 정상세포와 유사하였다.(도 2d). 그러므로, 근육 세포물의 저분자, BIO. LPA, SB203580 또는 SQ22536에 의한 증식 도입은 조직 재생능을 개선하기 위한 치료제를 개발하는데 적합함을 보여준다.

포유류 근육 세포물 증식의 유도는 p21 발현의 녹아웃과 관련이 있다(11,18) 저분자인 BIO, LPA, SB203580 또는 SQ22536의 처리는 근육 세포물의 p21 발현을 감소시켰다(도 3a). p27 발현은 BIO를 처리한 분화된 심근세포에서 세포주기 철회의 전환과 관련 있다(21). 그러나, 본 발명진의 결과는 포유류 근육 세포물에 저분자 처리하였을때 p27의 발현에 극적인 영향을 주지 않음을 보여준다. 이러한 결과는 미요세버린-유래 세포물 및 분화된 심근세포 간의 생화학적 차이 때문일 것이다. 또한, 심근세포에서의 p21 발현은 측정하지 않았다(21). 게다가, 본 발명진의 결과는 세포물에서 저분자 BIO 및 SB203580을 처리하여 p57의 발현을 감소시킨 결과를 보여준다(도 3a). p57은 근육 세포물에서 세포 주기 철회의 중요한 조절자는 아니지만, BIO 및 SB203580에 의한 하향조절은 저분자가 p57이 정지 상태(세포 주기 철회)를 유지하는데 중요한 역할을 하는 다른 조직의 역분화를 유도하는데 적절한 방법임을 말해준다.

아세틸콜린 수용체 발현은 근육 분화의 마커로 여겨진다(30). 본 발명의 결과는 BIO를 이용한 글리코겐 신타제-3 키나제의 억제, LPA를 이용한 G-단백질-결합 수용체-매개 신호전달의 활성화 또는 SB203580을 이용한 p38 MAP 키나제 경로의 억제는 포유류 근육 세포물에서 아세틸콜린 수용체의 발현을 상당히 감소시킴을 보여준다(도 3b-3c). 본 발명의 결과는 세포물에서 세포 주기 재진입의 도입이 역분화의 주요한 요소임을 나타낸다. SQ22536을 이용한 아데니릴 사이클라제의 억제는 아세틸콜린 수용체의 발현에 영향을 주지 않고 세포가 비만 형성 세포 및 골형성 세포를 형성하는 다분화능을 갖는다(도 3b-3c, 도 4 및 도 5). 이러한 결과는 미오세버린-유래 근육 세포물의 특성일 것이다. 이전 연구에서 미오세버린 단독처리 시 세포물은 역분화하지 않았지만, 아세틸콜린 수용체의 발현을 감소시킬 수 있음을 보여주었다(16, 30). 그러므로, 미오세버린-유래 근육 세포물은 본래의 근관 배양물과 비교하여 덜 분화된(less differentiated)상태일 것이다.

유미목 양서류 사지의 역분화된 근육 세포는 새로운 근육 조직을 재형성한다(4). 본 발명진의 결과는 BIO, LPA, SB203580 또는 SQ22536이 세포물이 근육 근관으로 역분화하는 것을 억제하지 않음을 보여준다(도 3d). 또한, 발명진은 지방형성 세포 및 골형성 세포로 분화하는 것을 보여줌으로써, BIO, LPA, SB203580 또는 SQ22536의 처리에 의한 다분화능 상태를 보여준다(도 4 및 도 5). 본 발명의 결과는 근아세포 역분화 제제인 리버신과 함께 siRNA-매개 p21 녹다운을 이용하여 세포물의 역분화를 유도하였다(11). p21 녹다운만 할 경우, 다분화능 세포를 제조하는데 불충분하였다(11). 본 발명에서는 리버신 처리 없이 BIO, LPA, SB203580 또는 SQ22536을 처리하여 다분화능 상태를 유도하였다. 이러한 저분자 방법으로 세포물의 역분화를 유도할 수 있는 결과는 복합적인 생화학적 반응을 조절하는 저분자가 siRNA 방법보다 우수함을 보여준다.

전분화능(pluripotent) 상태는 3배엽(내배엽, 중배엽 및 외배엽) 및 그의 파생된 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포군으로 정의된다(2). 본 발명에서, 발명진은 포유류 근육 세포물에 BIO, SB203580 또는 SQ22536을 처리하고 리버신을 처리하여 신경세포의 특징을 갖는 세포로 분화함을 보여준다(도 6). 저분자를 처리한 세포물은 신경세포로의 형태학적 변화를 보여주었다. 사이토칼라신(cytochalasin) B 또는 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 처리와 같은 다른 인자에 의한 세포 스트레스로부터 유도되는 전형적인 신경세포와 다른 형태학적인 변화를 유도하기 때문에 이는 근육 세포 내의 신경발생으로 생각된다(28). 발명진은 신경 세포로의 전환을 확인하는 기능 테스트를 실시하였다(도 6d-6e). 이전에, 이러한 테스트는 전사 억제제 및 신경-제한 억제 인자(neuron-restrictive silencer factor)에 의해 억제된 신경 유전자를 활성화 시키는 REST-VP16 컨스트럭트를 도입한 근육세포에서 신경세포 전환을 보이기 위해 사용했었다(29). LPA 처리는 신경 세포 전환능을 나타내지 않았으며, 이는 G-단백질-결합 수용체의 활성화는 근육 세포물이 전분화능이 아닌 다분화능을 갖는데 요구됨을 가리킨다.

유미목 양서류 사지 재생 과정에 있어, 최근 연구는 역분화된 근관이 계통 제한된 재생 사지에서 새로운 근육 조직을 형성함을 보여준다(31). 그러므로, 본 발명의 포유류 근육 역분화를 유도하기 위한 저분자-기반 접근법은 자연에서 관찰되는 부분적 재생보다 더 큰 발생학적 가소성 얻기 위해 성인 포유류 골격근에 허용된다. 본 발명의 저분자-기반 접근법의 구성도를 도 7에 나타내었다. 피부의 섬유아세포는 유미목 양서류 사지 재생과정 동안 다분화능군을 구성하는 것으로 생각된다(4, 31). 그러므로, 본 발명에서 저분자 방법은 양서류 피부 섬유아세포와 유사한 방식으로 작용하여 역분화된 포유류 근육 세포를 유도한다고 설명한다.

본 발명의 역분화 근육을 유도하기 위한 저분자-기반 방법은 추가 연구에 대한 수많은 가능성을 제공한다. 예를 들면, 인간 근육 조직검사는 환자-특이 다분화능 세포를 생산하는데 활용될 수 있다. 또한, 이러한 방법은 상처 치유의 포유류 모델에 적용할 수 있다. 본 발명에 사용된 저분자(BIO, LPA, SB203580 및 SQ22536)는 p21 발현을 하향 조절한다. 머피 로지스 라지(Murphy Roths Large) 마우스는 감소된 p21 발현과 관련된 개선된 상처 치유 능력을 보여준다(32). 그러므로, 이러한 저분자는 상처 치유를 개선하고 흉터를 감소시켜 국부의 의학적 적용의 기반을 형성할 수 있다. 본 발명의 결과는 표유류의 사지 재생을 유도하는 방법의 개발에 제공하며, 완전히 분화된 포유류 조직의 전분화능 줄기세포에 대한 새로운 접근법을 제시한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims (6)

1. 다음의 단계를 포함하는 포유동물 골격근 조직으로부터 다능성 세포(multipotent cells)의 화학적 제조방법:
   (a) 포유동물의 개체로부터 분리된 골격근 조직에 미오세버린을 처리하여 말기 분화세포인 골격근 세포를 수득하는 단계; 및
   (b) 상기 말기 분화세포에 p21 하향-조절 유도 화합물을 처리하여 다능성 세포를 수득하는 단계로서, 상기 단계 (b)의 p21 하향-조절 유도 화합물은 글리코겐 신타제-3 키나제(glycogen synthase-3 kinase) 단백질 활성 억제 화합물, p38 MAP(Mitogen-Activated Protein) 키나제 경로 억제 화합물, 아데니릴 사이클라세(adenylyl cyclase) 억제 화합물 및 G-단백질-결합 수용체-매개 신호전달(G-protein-coupled receptor-mediated signaling) 활성화 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물이다.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 p21 하향-조절 유도 화합물은 BIO(6-bromoindirubin-3'-oxime), SB203580(4-[4-(4-fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-1H-imidazol-5-yl]pyridine), SQ22536(9-(Tetrahydro-2-furanyl)-9H-purin-6-amine) 또는 LPA(Lysophosphatidic acid)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (b)의 p21 하향-조절 유도 화합물 처리이후 역분화제를 단계 (b)에서 얻은 세포에 처리하여 전능성 세포(pluripotent cell)를 수득하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 전능성 세포는 내배엽 또는 외배엽 계통의 세포로 분화되는 능력을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 역분화제는 리버신(N6-사이클로헥실-N2-(4-모폴린-4-일-페닐)-9H-퓨린-2,6-다이아민), 트리코스타틴 A(trichostatin A), 발프론산(valproic acid), 부페닐(buphenyl) 및 5-아자시티딘(5-azacytidine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (b)의 p21 하향-조절 유도 화합물 처리이후 분화 유도제를 단계 (b)에서 얻은 세포에 처리하여 근육형성 세포 리니지(myogenic lineage), 지방형성 세포 리니지(adipogenic lineage), 골형성 세포 리니지(osteogenic lineage) 또는 신경형성 세포 리니지(neurogenic lineage)로 분화시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 다음의 단계를 포함하는 포유동물 조직 또는 기관의 재생(regeneration)방법:
   (a) 포유동물의 개체로부터 분리된 골격근 조직에 미오세버린을 처리하여 말기 분화세포인 골격근 세포를 수득하는 단계;
   (b) 상기 말기 분화세포에 p21 하향-조절 유도 화합물을 처리하여 다능성 세포를 수득하는 단계; 및
   (c) 상기 다능성 세포를 원하는 조직 또는 기관으로 분화시키는 단계로서, 상기 단계 (b)의 p21 하향-조절 유도 화합물은 글리코겐 신타제-3 키나제(glycogen synthase-3 kinase) 단백질 활성 억제 화합물, p38 MAP(Mitogen-Activated Protein) 키나제 경로 억제 화합물, 아데니릴 사이클라세(adenylyl cyclase) 억제 화합물 및 G-단백질-결합 수용체-매개 신호전달(G-protein-coupled receptor-mediated signaling) 활성화 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물이다.

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