KR20120039778A - Multi-block biopolymer, gene thereof and expression vector thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 자연계에 존재하는 양이온 또는 음이온 아미노산과 인간 트로포틴엘라스틴의 모방 펩타이드를 기반으로 한 온도 감응성 이중 블럭 엘라스틴 단백질과 이들 단백질 구조를 지정하는 유전자, 이중 블럭 엘라스틴 단백질의 발현 및 정제, 이중 블럭 엘라스틴 단백질을, 약물전달, 포유동물 기반 바이오센서, 세포치료 또는 조직공학용 기질로 사용하는 것에 관한 것이다.The present invention relates to a temperature sensitive double block elastin protein and genes that designate these protein structures based on cationic or anionic amino acids present in nature and mimetic peptides of human tropotin elastin, expression and purification of double block elastin proteins, and double block elastin. The invention relates to the use of proteins as substrates for drug delivery, mammalian based biosensors, cell therapy or tissue engineering.
엘라스틴은 탄성이 매우 중요한 다수 조직의 세포외 매트릭스에서 발견되는 탄성 섬유의 주성분이다. 엘라스틴은 다수의 수용성 트로포엘라스틴 분자로부터 형성되는 불용성 분자이다. 트로포엘라스틴은 단일 카피 유전자에 의해 코딩되지만, 전사체의 선택적 스플라이싱 (alternative splicing)은 각각 분자량이 대략 70 kDa인 다양한 이성질체 형태의 단백질을 초래한다. Elastin is the main component of elastic fibers found in the extracellular matrix of many tissues where elasticity is very important. Elastin is an insoluble molecule formed from many water soluble tropoelastin molecules. Tropoelastin is encoded by a single copy gene, but alternative splicing of transcripts results in proteins of various isomeric forms each having a molecular weight of approximately 70 kDa.
트로포엘라스틴의 1차 구조는 교번하는 소수성 및 가교성 도메인으로 이루어져 있다. 소수성 도메인은 VPGVG 및 APGVGV와 같은 교번하는 소수성 아미노산 서열의 반복체로 구성되는 반면에, AK 가교성 도메인은 주로 Ala와 Lys로, 예를 들면 AAAAKAAKYGA로 구성되어 있다. 생리적 조건하에서, 트로포엘라스틴의 소수성 도메인은 코아세르베이션(coacervation)으로 불리는 자기-조립 과정을 거치며, 생성되는 조립체는 Lys 잔기간의 분자간 가교결합의 형성에 의해 안정화되어 탄성 섬유의 고도로 불용성인 네트워크를 생성한다.The primary structure of tropoelastin consists of alternating hydrophobic and crosslinkable domains. The hydrophobic domain consists of repeats of alternating hydrophobic amino acid sequences such as VPGVG and APGVGV, while the AK crosslinkable domain consists mainly of Ala and Lys, for example AAAAKAAKYGA. Under physiological conditions, the hydrophobic domain of tropoelastin undergoes a self-assembly process called coacervation, and the resulting assembly is stabilized by the formation of intermolecular crosslinks between Lys residues to form a highly insoluble network of elastic fibers. Create
생물학적 관련 자극(biologically relevant stimuli)에 대하여 입체구조 또는 특성의 변화를 보이면서 반응하는 단백질계 중합체는 종종 인텔리전트 또는 스마트 생체 재료일 것으로 생각된다. 특히, 트로포엘라스틴의 VPGXG 펜타펩타이드 반복체(여기에서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)를 본떠서 형성되는 엘라스틴-유사 단백질(ELP)은 온도, 염 및 pH의 변화에 응하여 가용성-불용성 상전이를 보이며, 그에 따라 생체의학적 응용을 위한 유망한 스마트 단백질로서 대두되고 있다. 역전이온도(Tt)로 알려져 있는, 가용성-불용성 입체구조 변화가 일어나는 온도를 이용하여 자극 인자의 변화에 대한 ELP의 반응성을 특성해석하여 왔다. ELP는 살아있는 세포와 고도로 화합성을 띠며 따라서 이들은 약물 또는 유전자 전달에의 사용 또는 포유동물 세포 배양 또는 외상 치유를 위한 매트릭스로서 사용하기 위한 높은 가능성을 지닌다. 그러나, 소수성 VPGXG 단위의 낮은 화학 반응성으로 인하여, ELP의 비-변형 형태의 생물학적 활용에는 제한이 따른다. Protein-based polymers that respond with changes in conformation or properties to biologically relevant stimuli are often thought to be intelligent or smart biomaterials. In particular, elastin-like proteins (ELPs) formed after VPGXG pentapeptide repeats of tropoelastin (where X is any amino acid except proline), develop soluble-insoluble phase transitions in response to changes in temperature, salt and pH. It is thus emerging as a promising smart protein for biomedical applications. The responsiveness of ELP to changes in stimulus factors has been characterized using the temperature at which soluble-insoluble conformational changes occur, known as the reverse transition temperature (T t ). ELPs are highly compatible with living cells and therefore they have a high potential for use in drug or gene delivery or as a matrix for mammalian cell culture or trauma healing. However, due to the low chemical reactivity of hydrophobic VPGXG units, there is a limit to the biological utilization of non-modified forms of ELP.
그 결과, X 위치에 염기성 또는 산성 아미노산을 함유하는 기능화된 ELP 또는 ELP의 다중모드 형태는 생물학적 활성 서열 또는 도메인을 ELP의 구조적 백본과 융합 또는 접합시킴으로써 생성하여 왔다. As a result, multimodal forms of functionalized ELPs or ELPs containing basic or acidic amino acids at the X position have been produced by fusing or conjugating a biologically active sequence or domain with the structural backbone of the ELP.
예를 들면, 다중모드형을 생성하기 위하여, 호밍(homing) 펩타이드 또는 친화성 리간드를 ELP의 N- 또는 C-말단에 융합시키면, 생물학적 관련 부위로의 이들 단백질의 수용체-매개 표적화가 가능해진다. 이와 유사하게, 단백질이 약물에 결합하여 이를 전달하는 능력은 ELP 백본을 음이온성 또는 양이온성 도메인에 융합시킴으로써 좀더 조절될 수 있다. 그러한 양이온성 또는 음이온성 ELP는 약물 카고(drug cargo)의 공유결합을 위한 아미노 또는 카복실기를 제공할 뿐만 아니라, 하이드로겔 또는 미셀 구조로 자기-조립될 수 있다. 또한, 미셀 입자의 크기는 상이한 서열의 양이온성 또는 음이온성 도메인 및 개수를 선택함으로써 조절될 수 있는데, 이는 국소 온열요법에 의한 항암제의 표적화 또는 인텔리전트 유전자 전달 비히클의 개발의 관점에서 큰 관심을 끈다. For example, fusion of homing peptides or affinity ligands to the N- or C-terminus of ELP, to generate multimodal forms, allows for receptor-mediated targeting of these proteins to biologically relevant sites. Similarly, the ability of a protein to bind to and deliver a drug can be further controlled by fusing the ELP backbone to the anionic or cationic domain. Such cationic or anionic ELPs not only provide amino or carboxyl groups for the covalent linkage of drug cargo, but can also self-assemble into hydrogel or micelle structures. In addition, the size of micelle particles can be controlled by selecting the cationic or anionic domains and number of different sequences, which is of great interest in terms of the targeting of anticancer agents by topical thermotherapy or the development of intelligent gene delivery vehicles.
따라서, 다양한 환경 조건하에서의 양이온성 ELP의 상전이 특성에 관한 세부적인 특성해석이 필요한데, 그 이유는 이화학적 특성의 정밀한 제어에 대한 통찰력을 제공하기 때문이다. 이전에는, 엘라스틴계 폴리라이신 이중 블럭 생체고분자, K8ELP1-60는 열-표적화 화학요법 또는 유전자 전달을 위한 비히클로서 시험되어 왔다. 그러나, 양이온성 도메인이 이중 모드 ELP의 자극 민감성에 미치는 영향에 관하여 문헌에 보고된 바 없다.Thus, detailed characterization of the phase transition properties of cationic ELPs under various environmental conditions is needed because it provides insight into the precise control of physicochemical properties. Previously, the elastin-based polylysine double block biopolymer, K 8 ELP1-60, has been tested as a vehicle for heat-targeted chemotherapy or gene delivery. However, no effect has been reported in the literature on the effect of cationic domains on the stimulus sensitivity of bimodal ELP.
본 발명은, 양이온 또는 음이온 아미노산과 인간 트로포틴엘라스틴의 모방 펩타이드를 기반으로 한 엘라스틴 단백질 생합성을 제공하여, 약물 및 세포 전달체와 조직공학용 기질 등으로 사용하기 적합한 온도감응성 이중 블럭 엘라스틴 단백질을 생산하기 위한 유전자 조작성과 약물의 부착 및 세포의 부착성을 확보하여 약물의 전달체, 세포 치료용 또는 조직공학용 기질로 사용하는 것을 목적으로 한다. The present invention provides an elastin protein biosynthesis based on mimic peptides of cationic or anionic amino acids and human tropotin elastin to produce a temperature sensitive double block elastin protein suitable for use as drug and cell carriers and tissue engineering substrates. It aims to be used as a substrate for drug delivery, cell therapy, or tissue engineering by securing genetic manipulation, drug adhesion and cell adhesion.
일측면에서, 본 발명은 이온성 제1블럭, 제1블럭과 일렬로 연결된 엘라스틴 유래 또는 모방 펩타이드인 제2블럭, 제1블럭 또는 제2블럭 중 하나에 각각 지정된 제1터미널과 제2터미널을 포함하는 이중 블럭 엘라스틴 단백질을 제공할 수 있다.In one aspect, the present invention provides a first terminal and a second terminal assigned to one of an ionic first block, a second block, a first block, or a second block, each of which is an elastin-derived or mimic peptide in line with the first block. It is possible to provide a double block elastin protein comprising.
다른 측면에서, 본 발명은 제1블럭을 코딩하는 DNA 서열과 제2블럭을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 이중 블럭 엘라스틴 단백질을 지정하는 유전자 및 이중 블럭 엘라스틴 단백질을 지정하는 유전자의 코딩 서열을 함유한 발현 벡터를 제공할 수 있다.In another aspect, the invention comprises a gene specifying a double block elastin protein comprising a DNA sequence encoding a first block and a DNA sequence encoding a second block and a coding sequence of a gene specifying a double block elastin protein. Expression vectors can be provided.
또다른 측면에서, 본 발명은 이중 블럭 엘라스틴 단백질의 발현 및 정제, 이중 블럭 엘라스틴 단백질을 약물전달, 포유동물 기반 바이오센서, 세포치료 또는 조직공학용 기질로 사용하는 것을 제공할 수 있다.In another aspect, the present invention may provide for the expression and purification of the double block elastin protein, the use of the double block elastin protein as a substrate for drug delivery, mammalian based biosensors, cell therapy or tissue engineering.
본 발명의 실시예들에 따른 이중 블럭 엘라스틴 단백질은 양이온 또는 음이온 작용기를 포함함으로써 약물 및 세포 부착 기능성이 부여 되어 있어, 배양된 세포나 약물을 생체내의 목표 위치에 이동시키는 세포 운반체 또는 약물운반체로 사용하거나, 화학적 또는 효소학적 방법을 이용하여 단일 단백질 가닥들을 서로 연결시킨 후 세포 및 조직 배양의 기질로 이용할 수 있는 효과가 있다. 또는 N- 또는 C-터미널에 존재하는 시스테인을 이용하여 금 표면에 결합시켜 나노 금 결합 화합물을 형성시킬 수 있는 효과가 있다. The double block elastin protein according to the embodiments of the present invention is provided with drug and cell attachment functionality by including a cationic or anionic functional group, and used as a cell carrier or drug carrier to move cultured cells or drugs to a target position in vivo. Alternatively, there is an effect that can be used as a substrate for cell and tissue culture after connecting single protein strands to each other using chemical or enzymatic methods. Alternatively, the cysteine present in the N- or C-terminal may be used to bind to the gold surface to form a nano gold-bonded compound.
도 1은 일실시예에 따른 이중 블럭 엘라스틴 단백질의 모식도이다.
도 2는 도 1의 일예의 모식도이다.
도 3은 도 1의 다른 예의 모식도이다.
도 4는 도 1의 또다른 예의 모식도이다.
도 5는 도 1의 또다른 예의 모식도이다.
도 6은 양이온성 ELP의 2모드 조성(A) 및 단리 단백질의 순도와 MW의 SDS-PAGE 분석(B)에 대한 개략도이다.
도 7의 A는 ELP1-90(o) 및 [V(VKG)3VKVPG]n-ELP1-90 [n = 1 (●), 2 (▲), 3 (▼), 및 4 (□)]에 대해 수득된 혼탁도 프로파일이고, 도 7의 B와 C는 50 (□), 100 (■), 300 (▼), 500 (▲), 1,000 (●), 및 2,000 (○) mM NaCl의 존재하에서 [V(VKG)3VKVPG]3-ELP1-90 및 [V(VKG)3VKVPG]4-ELP1-90의 역온도전이이다.
도 8은 pH 변화에 대한 [V(VKG)3VKVPG]nELP1-90(n = 3 또는 4)의 민감성을 예시하였다. 1 is a schematic diagram of a double block elastin protein according to one embodiment.
FIG. 2 is a schematic diagram of one example of FIG. 1.
3 is a schematic diagram of another example of FIG. 1.
4 is a schematic diagram of another example of FIG. 1.
5 is a schematic view of still another example of FIG. 1.
6 is a schematic diagram of the bimodal composition of cationic ELP (A) and the purity of the isolated protein and SDS-PAGE analysis of MW (B).
7A shows ELP1-90 (o) and [V (VKG) 3 VKVPG] n -ELP1-90 [n = 1, (●), 2 (▲), 3 (▼), and 4 (□)]. The turbidity profile obtained for FIG. 7, B and C in FIG. 7 are 50 (□), 100 (■), 300 (▼), 500 (▲), 1,000 (●), and 2,000 (○) mM NaCl [V (VKG) 3 VKVPG] 3 -ELP1-90 and [V (VKG) 3 VKVPG] 4 -ELP1-90.
8 illustrates the sensitivity of [V (VKG) 3 VKVPG] n ELP1-90 (n = 3 or 4) to pH changes.
이하, 본 발명의 일부 실시예들을 예시적인 도면을 통해 상세하게 설명한다. 각 도면의 구성요소들에 참조부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.Hereinafter, some embodiments of the present invention will be described in detail through exemplary drawings. In adding reference numerals to the components of each drawing, it should be noted that the same reference numerals are assigned to the same components as much as possible even though they are shown in different drawings. In the following description of the present invention, a detailed description of known functions and configurations incorporated herein will be omitted when it may make the subject matter of the present invention rather unclear.
또한, 본 발명의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제 1, 제 2, A, B, (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다. 어떤 구성 요소가 다른 구성요소에 "연결", "결합" 또는 "접속"된다고 기재된 경우, 그 구성 요소는 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되거나 또는 접속될 수 있지만, 각 구성 요소 사이에 또 다른 구성 요소가 "연결", "결합" 또는 "접속"될 수도 있다고 이해되어야 할 것이다.In addition, in describing the component of this invention, terms, such as 1st, 2nd, A, B, (a), (b), can be used. These terms are intended to distinguish the constituent elements from other constituent elements, and the terms do not limit the nature, order or order of the constituent elements. If a component is described as being "connected", "coupled" or "connected" to another component, that component may be directly connected to or connected to that other component, but there may be another configuration between each component. It is to be understood that the elements may be "connected", "coupled" or "connected".
본 발명은 양이온 또는 음이온 아미노산과 엘라스틴 유래 펩타이드로 구성된 온도 감응성 이중 블럭 엘라스틴 단백질의 음이온 또는 양이온 블럭의 함량을 조절하여 이중 블럭 엘라스틴 단백질의 온도, 이온 활성도 및 pH에 대한 감응도를 조절하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of controlling the temperature, ionic activity and pH sensitivity of the double block elastin protein by controlling the content of the anion or cation block of the temperature sensitive double block elastin protein composed of a cationic or anionic amino acid and an elastin-derived peptide. .
도 1은 일실시예에 따른 이중 블럭 엘라스틴 단백질의 모식도이다.1 is a schematic diagram of a double block elastin protein according to one embodiment.
도 1을 참조하면, 일실시예에 따른 이중 블럭 엘라스틴 단백질(100)은 이온성 제1블럭(110)과 제1블럭(110)과 일렬로 연결된 엘라스틴 유래 또는 모방 펩타이드인 제2블럭(120)을 포함한다. 또한, 이중 블럭 엘라스틴 단백질(100)은 제1블럭(110) 또는 제2블럭(120) 중 하나에 각각 지정된 제1터미널(130)과 제2터미널(140)을 포함한다.Referring to FIG. 1, the double
이온성 제1블럭(110)은 최소한 1개의 양이온 아미노산 또는 음이온 아미노산 중 적어도 하나를 포함하는 아미노산 배열의 블럭을 m개(m은 1 이상의 정수) 포함할 수 있다. The ionic
엘라스틴 유래 펩타이드인 제2블럭(120)은 인간 트로포틴엘라스틴의 모방 펩타이드인 XGVPG 펜타 펩타이드 또는 세포 부착성 RGD 트리펩타이드를 n개(n은 1 이상의 정수) 포함할 수 있다. The
제1터미널(130)은 이중 블럭 엘라스틴 단백질의 N- 또는 C-터미널 아미노산 중 하나로 양이온, 음이온성 아미노산 또는 시스테인으로 지정될 수 있다. 제1터미널(130)은 제1블럭(110)의 말단에 결합되어 있을 수도 있고 제2블럭(110)의 말단에 결합되어 있을 수 있다.The
한편, 제2터미널(140)은 이중 블럭 엘라스틴 단백질의 N- 또는 C-터미널 아미노산 중 하나일 수 있다. 제2터미널(140)은 제1터미널(130)이 N-터미널 아미노산인 경우 C-터미널 아미노산이고 제1터미널(130)이 C-터미널 아미노산인 경우 N-터미널 아미노산일 수 있다. 제2터미널(140)은 제1블럭(110) 또는 제2블럭(120)의 말단 중 제1터미널(130)이 배열되는 반대편 말단에 배열될 수 있다. Meanwhile, the
이상 도 1을 참조하여 일실시예에 따른 이중 블럭 엘라스틴 단백질을 설명하였으나 이하 도 2 내지 도 5를 참조하여 일실시예에 따른 이중 블럭 엘라스틴 단백질을 설명한다.The double block elastin protein according to one embodiment has been described above with reference to FIG. 1, but the double block elastin protein according to one embodiment is described below with reference to FIGS. 2 to 5.
도 2는 도 1의 일예의 모식도이다.FIG. 2 is a schematic diagram of one example of FIG. 1.
도 2를 참조하면 다른 실시예에 따른 이중 블럭 엘라스틴 단백질(200)은 양이온 제1블럭(210)과 제1블럭(210)과 일렬로 연결된 엘라스틴 유래 또는 모방 펩타이드인 제2블럭(220)을 포함한다. 또한, 이중 블럭 엘라스틴 단백질(200)은 제1블럭(210)에 N-터미널 아미노산(230)이 연결되어 있고 또는 제2블럭(220)에 C-터미털 아미노산(240)이 연결되어 있다. Referring to FIG. 2, the double
양이온 제1블럭(210)은 최소한 1개의 양이온 아미노산을 적어도 하나를 포함하는 아미노산 배열의 블럭(212)을 m개(m은 1 이상의 정수) 포함하고 있다. The cationic
엘라스틴 유래 펩타이드인 제2블럭(220)은 인간 트로포틴엘라스틴의 모방 펩타이드인 XGVPG 펜타 펩타이드 또는 세포 부착성 RGD 트리펩타이드(222)를 n개(n은 1 이상의 정수) 포함할 수 있다. The
도 3은 도 1의 다른 예의 모식도이다.3 is a schematic diagram of another example of FIG. 1.
도 3을 참조하면 또다른 실시예에 따른 이중 블럭 엘라스틴 단백질(300)은 음이온 제1블럭(310)과 제1블럭(310)과 일렬로 연결된 엘라스틴 유래 또는 모방 펩타이드인 제2블럭(320)을 포함한다. 또한, 이중 블럭 엘라스틴 단백질(300)은 제1블럭(310)에 N-터미널 아미노산(330)이 연결되어 있고 또는 제2블럭(320)에 C-터미털 아미노산(340)이 연결되어 있다. Referring to FIG. 3, the double
음이온 제1블럭(310)은 최소한 1개의 음이온 아미노산을 적어도 하나를 포함하는 아미노산 배열의 블럭(312)을 m개(m은 1 이상의 정수) 포함하고 있다. The anion first block 310 includes m blocks (312 is an integer of 1 or more) of an amino acid sequence including at least one of at least one anion amino acid.
엘라스틴 유래 펩타이드인 제2블럭(320)은 인간 트로포틴엘라스틴의 모방 펩타이드인 XGVPG 펜타 펩타이드 또는 세포 부착성 RGD 트리펩타이드(322)를 n개(n은 1 이상의 정수) 포함할 수 있다. The
도 4는 도 1의 또다른 예의 모식도이다.4 is a schematic diagram of another example of FIG. 1.
도 4를 참조하면 또다른 실시예에 따른 이중 블럭 엘라스틴 단백질(400)은 양이온 제1블럭(410)과 제1블럭(410)과 일렬로 연결된 엘라스틴 유래 또는 모방 펩타이드인 제2블럭(420)을 포함한다. 또한, 이중 블럭 엘라스틴 단백질(400)은 제2블럭(420)에 N-터미널 아미노산(430)이 연결되어 있고 또는 제1블럭(410)에 C-터미털 아미노산(440)이 연결되어 있다. Referring to FIG. 4, the double
양이온 제1블럭(410)과 엘라스틴 유래 펩타이드인 제2블럭(420)은 도 2를 참조하여 설명한 바와 동일하다. 즉 양이온 제1블럭(410)은 최소한 1개의 양이온 아미노산을 적어도 하나를 포함하는 아미노산 배열의 블럭(412)을 m개(m은 1 이상의 정수) 포함하고 있다. The cationic
엘라스틴 유래 펩타이드인 제2블럭(420)은 인간 트로포틴엘라스틴의 모방 펩타이드인 XGVPG 펜타 펩타이드 또는 세포 부착성 RGD 트리펩타이드(422)를 n개(n은 1 이상의 정수) 포함할 수 있다. The
도 5는 도 1의 또다른 예의 모식도이다.5 is a schematic view of still another example of FIG. 1.
도 5를 참조하면 또다른 실시예에 따른 이중 블럭 엘라스틴 단백질(500)은 음이온 제1블럭(510)과 제1블럭(510)과 일렬로 연결된 엘라스틴 유래 또는 모방 펩타이드인 제2블럭(520)을 포함한다. 또한, 이중 블럭 엘라스틴 단백질(500)은 제2블럭(520)에 N-터미널 아미노산(530)이 연결되어 있고 또는 제1블럭(510)에 C-터미털 아미노산(540)이 연결되어 있다. Referring to FIG. 5, the double
음이온 제1블럭(510)과 엘라스틴 유래 펩타이드인 제2블럭(520)은 도 3을 참조하여 설명한 바와 동일하다. 즉 음이온 제1블럭(510)은 최소한 1개의 음이온 아미노산을 적어도 하나를 포함하는 아미노산 배열의 블럭(512)을 m개(m은 1 이상의 정수) 포함하고 있다. The anion first block 510 and the
엘라스틴 유래 펩타이드인 제2블럭(520)은 인간 트로포틴엘라스틴의 모방 펩타이드인 XGVPG 펜타 펩타이드 또는 세포 부착성 RGD 트리펩타이드(522)를 n개(n은 1 이상의 정수) 포함할 수 있다. The
도 1 내지 도 5를 참조하여 설명한 실시예들에 따른 이중 블럭 엘라스틴 단백질(100 내지 500)은 양이온 또는 음이온 아미노산과 인간 트로포틴엘라스틴의 모방 펩타이드를 기반으로 한 엘라스틴 단백질을 제공한다. 실시예들에 따른 이중 블럭 엘라스틴 단백질(100 내지 500)은 후술한 바와 같이 약물 및 세포 전달체와 조직공학용 기질 등으로 사용하기 적합한 온도감응성 이중 블럭 엘라스틴 단백질을 생산하기 위한 유전자 조작성과 약물의 부착 및 세포의 부착성을 확보하여 약물의 전달체, 세포 치료용 또는 조직공학용 기질로 사용할 수 있다. Double block elastin proteins (100-500) according to the embodiments described with reference to FIGS. 1-5 provide elastin proteins based on mimic peptides of cationic or anionic amino acids and human tropotin elastin. The double block elastin protein (100 to 500) according to the embodiments is genetically engineered to produce a temperature-sensitive double block elastin protein suitable for use as a drug and cell carrier and a substrate for tissue engineering, as described below, the adhesion of the drug and the cell It can be used as a substrate for drug delivery, cell therapy, or tissue engineering by securing adhesion.
구체적으로 VPGXG 펜타 아미노산(X는 알라닌, 글라이신, 발린 등 프로린을 제외한 비 이온성 아미노산)을 기본 단위로하는 단순한 반복 구조를 갖는 (VPGXG)n(n은 정수) 엘라스틴 단백질을 제조하거나 이를 응용할 수도 있다. 이 (VPGXG)n 구조의 엘라스틴 단백질은 포유동물 세포 내에서의 면역 유발성이 없으며 세포독성을 유발하지 않기 때문에 포유동물에 조직에 대한 적합성이 우수할 수 있다. Specifically, (VPGXG) n (n is an integer) elastin protein having a simple repeating structure based on VPGXG penta amino acid (X is a nonionic amino acid except proline such as alanine, glycine, valine, etc.) may be prepared or applied. . Elastin protein of this (VPGXG) n structure may be excellent in tissue compatibility with mammals because it is not immunogenic in mammalian cells and does not cause cytotoxicity.
그러나 (VPGXG)n 구조의 엘라스틴 단백질은 세포 부착성이 미약하며, 특히 세포 또는 유기합성 약물 등과 결합할 수 있는 양이온 또는 음이온 등의 화학적 작용기를 가지고 있지 못하여 조직공학용 기질이나 약물 또는 세포전달용 운반체로서의 사용에 제한을 받을 수 있다. 또한 소수성 잔기를 보유하는 아미노산으로 구성되어 있어 온도, 염 또는 pH 변화에 의한 감응성이 매우 낮으며, 소수성 약물을 전달하기에 유리한 자기조립 마이셀 나노구조를 형성할 수 없을 수도 있다. However, elastin proteins of (VPGXG) n structure have poor cell adhesion, and in particular, they do not have chemical functional groups such as cations or anions that can bind to cells or organic synthetic drugs. Restrictions on use may apply. In addition, since it is composed of amino acids having hydrophobic residues, it is very sensitive to changes in temperature, salt or pH, and may not be able to form self-assembled micelle nanostructures that are advantageous for delivering hydrophobic drugs.
(VPGXG)n 구조의 엘라스틴 단백질과 비교할 때 도 1 내지 도 5를 참조하여 설명한 실시예들에 따른 이중 블럭 엘라스틴 단백질(100 내지 도 5)은 양이온 또는 음이온 작용기를 포함함으로써 약물 및 세포 부착 기능성이 부여되어, 배양된 세포나 약물을 생체내의 목표 위치에 이동시키는 세포 운반체 또는 약물운반체로 사용하거나, 화학적 또는 효소학적 방법을 이용하여 단일 단백질 가닥들을 서로 연결시킨 후 세포 및 조직 배양의 기질로 이용할 수 있다.또한 N-터미널 또는 C-터미널에 존재하는 시스테인을 이용하여 금 표면에 결합시켜 나노 금 결합 화합물을 형성시킬 수도 있다.
Compared to the elastin protein of the (VPGXG) n structure, the double block elastin protein (100 to 5) according to the embodiments described with reference to FIGS. 1 to 5 includes a cationic or anionic functional group to impart drug and cell adhesion functionality. Can be used as cell carriers or drug carriers to move cultured cells or drugs to target locations in vivo, or can be used as substrates for cell and tissue culture after linking single protein strands together using chemical or enzymatic methods. In addition, the cysteine present in the N-terminal or C-terminal can be used to bond to the surface of the gold to form nano gold-bonded compounds.
이상 이하 도 1 내지 도 5를 참조하여 실시예들에 따른 이중 블럭 엘라스틴 단백질을 설명하고 그 효과 및 응용에 대해 설명하였으나 이하 도 2를 참조하여 설명한 이중 블럭 엘라스틴 단백질(200)와 (VPGXG)n 구조의 엘라스틴 단백질을 비교실험한 결과와 그 결과에 대한 분석결과를 상세히 설명한다. Hereinafter, the double block elastin protein according to the embodiments will be described with reference to FIGS. 1 to 5, and the effects and applications thereof will be described. Hereinafter, the double
후술하는 바와 같이 이중 블럭 엘라스틴 단백질(200)의 실험한 결과는 이온성 제1블럭(210)과 엘라스틴 유래 펩타이드(220)가 이중 블럭을 형성한 것에 기인한 것으로, 도 3 내지 도 5의 다른 이중 블럭 엘라스틴 단백질(300 내지 500)도 동일한 결과를 얻었으나 그 결과가 도 2를 참조하여 설명한 이중 블럭 엘라스틴 단백질(200)과 실질적으로 동일하여 생락하였다.
Experimental results of the double
실험예Experimental Example
이하 본 실험예는 트로포엘라스틴의 가교성 및 소수성 도메인 양자 모두를 모방하는 이중 블럭 양이온성 ELP, SKGPG[V(VKG)3VKVPG]n-ELP1-90의 세트의 상전이 특성을 특성 해석함으로써 라이신-함유 양이온성 도메인의 영향을 검토하였다. The following experimental examples characterize the phase transition properties of a set of double block cationic ELP, SKGPG [V (VKG) 3 VKVPG] n -ELP1-90, which mimics both the crosslinkable and hydrophobic domains of tropoelastin. The influence of cationic domains was examined.
온도, 이온 강도, 및 pH의 변화에 대한 반응성과 관련한 이들 양이온성 ELP의 특징은 다양한 용액 조건하에서 친양쪽성 ELP의 거동에 원인이 되는 메커니즘에 대한 유용한 정보를 제공하고, 궁극적으로는 상이한 환경 자극의 변화에 반응하는 단백질계 인텔리전트 생체 재료의 설계에 도움을 줄 수 있다.
The characteristics of these cationic ELPs regarding their responsiveness to changes in temperature, ionic strength, and pH provide useful information about the mechanisms responsible for the behavior of amphiphilic ELPs under various solution conditions, and ultimately different environmental stimuli. It can help design the protein-based intelligent biomaterials in response to the change of.
양이온성 이중 블럭 엘라스틴-유사 단백질의 설계 및 생산Design and Production of Cationic Double Block Elastin-Like Proteins
환경 자극의 변화에 대응한 양이온성 ELP의 민감성에 미치는 양이온성 도메인의 영향을 분석하기 위하여, 이중 블럭 ELP, SKGPG[V(VKG)3VKVPG]n[(VGVPG)2GGVPGAGVPG(VGVPG)3GGVPGAGVPGGGVPG]9WP(n = 1, 2, 3, 및 4)의 세트를 생합성하여, [V(VKG)3VKVPG]n-ELP1-90라고 명명하였다. 각각의 이중 블럭 ELP에서, 양이온성 단위는 4개의 라이신 잔기를 함유하였고, 제2블럭(220)에 해당하는 ELP1-90 세그먼트는 XGVPG 펜타펩타이드(여기에서, X는 5:2:3 몰비의 Val, Ala, 및 Gly에 해당한다)의 90 반복체로 구성되었다. 제1블럭(210)의 양이온성 블럭(212)에 해당하는 단위 V(VKG)3VKVPG는 양이온성 도메인을 형성하였을 때 경질성 VPGVV 및 VPGVG 서열을 생성하도록 설계하여 각각 ELP1-90 세그먼트에 연결하였다(도 6의 A 참조).To analyze the effect of cationic domains on the sensitivity of cationic ELPs to changes in environmental stimuli, double-block ELPs, SKGPG [V (VKG) 3 VKVPG] n [(VGVPG) 2 GGVPGAGVPG (VGVPG) 3 GGVPGAGVPGGGVPG] A set of 9 WPs (n = 1, 2, 3, and 4) was biosynthesized and named [V (VKG) 3 VKVPG] n -ELP1-90. In each double block ELP, the cationic unit contained four lysine residues, and the ELP1-90 segment corresponding to the
[V(VKG)3VKVPG]n-ELP1-90를 코딩한 DNA 서열은 재귀적 방향성 라이게이션(recursive directional ligation: RDL, 18)에 의해 성공적으로 클로닝되었으며, 이중 모드 ELP를 E. coli에서 발현시켜 정제하였다. 역전이 사이클링을 3 라운드 실시하여, SDS-PAGE로 판단하여 순도 95% 이상인 [V(VKG)3VKVPG]nELP1-90를 산출하였다(도 6의 B 참조). 도 6의 B에서 레인 1, 2, 3, 및 4는 각각 n = 1, 2, 3, 및 4인 [V(VKG)3VKVPG]n-ELP1-90를 나타낸다.DNA sequences encoding [V (VKG) 3 VKVPG] n -ELP1-90 were successfully cloned by recursive directional ligation (RDL, 18), and dual mode ELP was expressed in E. coli . Purified. Three rounds of reverse transition cycling were performed to determine [V (VKG) 3 VKVPG] n ELP1-90 having a purity of 95% or more, as determined by SDS-PAGE (see FIG. 6B).
표준 단백질의 MW와 비교시, 정제 단백질은 계산치보다 약간 더 큰 MW에 해당하는 위치로 이동하였다. 그러나, 발현 단백질을 상호 비교하였을 때, 상대적인 이동 거리의 차이는 MW에 있어서의 예상된 차이와 일치하였다. SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서, 단백질의 이동 거리는 크기에 영향을 받을 뿐만 아니라 단백질의 형태에 의해서도 영향을 받는다. SDS-PAGE 버퍼에서, ELP는 연장된 입체구조를 가질 수 있는데, 이는 동일한 MW를 갖는 구상 단백질 표준의 것보다 느린 이동 속도를 초래할 수 있다. 1 L의 배양액으로부터 대략 25 mg의 정제 양이온성 ELP가 수득되었고, 수율은 4종의 ELP간에 차이가 없었는데, 이는 양이온성 도메인이 이중 블럭 ELP의 생성에 악영향을 미치지 않았음을 알 수 있다.
Compared to the MW of the standard protein, the purified protein moved to the position corresponding to the MW slightly larger than the calculated value. However, when comparing the expressed proteins with each other, the difference in relative travel distance was consistent with the expected difference in MW. On SDS-polyacrylamide gels, the distance of protein movement is influenced not only by the size but also by the shape of the protein. In the SDS-PAGE buffer, the ELP may have an extended conformation, which may result in a slower migration rate than that of globular protein standards with the same MW. Approximately 25 mg of purified cationic ELP was obtained from 1 L of culture, and the yield was not different between the four ELPs, indicating that the cationic domain did not adversely affect the production of the double block ELP.
이중 모드 ELP의 전이 특징Transitional Characteristics of Dual Mode ELP
도 7의 A는 ELP1-90(o) 및 [V(VKG)3VKVPG]n-ELP1-90 [n = 1 (●), 2 (▲), 3 (▼), 및 4 (□)]에 대해 수득된 혼탁도 프로파일이고, 도 7의 B와 C는 50 (□), 100 (■), 300 (▼), 500 (▲), 1,000 (●), 및 2,000 (○) mM NaCl의 존재하에서 [V(VKG)3VKVPG]3-ELP1-90 및 [V(VKG)3VKVPG]4-ELP1-90의 역온도전이이다. 이때 양이온성 ELP의 농도는 10 mM 포스페이트 버퍼 중 25uM이었다. 도 7의 A에서, 핑크색과 청색은 각각, 용액 중에서(in solution)의 [V(VKG)3VKVPG]3 블록 및 용액 밖에서(out of solution)의 ELP1-90 도메인을 나타낸다.7A shows ELP1-90 (o) and [V (VKG) 3 VKVPG] n -ELP1-90 [n = 1, (●), 2 (▲), 3 (▼), and 4 (□)]. The turbidity profile obtained for FIG. 7, B and C in FIG. 7 are 50 (□), 100 (■), 300 (▼), 500 (▲), 1,000 (●), and 2,000 (○) mM NaCl [V (VKG) 3 VKVPG] 3 -ELP1-90 and [V (VKG) 3 VKVPG] 4 -ELP1-90. The concentration of cationic ELP was 25 uM in 10 mM phosphate buffer. In FIG. 7A, pink and blue represent [V (VKG) 3 VKVPG] 3 blocks in solution and ELP1-90 domains out of solution, respectively.
PBS 중 25 mM에서의 이중 블럭 ELP의 상전이 특성이 도 7의 A에 서술되어 있다. ELP1-90은 42℃ 의 Tt에서 혼탁도의 매우 급격한 증가를 보였다. V(VKG)3VKVPG-ELP1-90 및 [V(VKG)3VKVPG]2-ELP1-90 역시도 혼탁도의 급격한 증가를 보였다. 그러나, 이들 단백질의 경우, Tt는 각각 45℃ 및 47℃ 의 좀더 고온으로 이동하였다. 이와는 상반되게, [V(VKG)3VKVPG]3-ELP1-90의 혼탁도 프로파일은 3상 전이를 나타내었다. 50℃ 의 Tt를 갖는 첫 번째 느린 전이가 나타난 뒤에 53℃ 내지 56℃ 사이에서 흡광도의 급격한 저하, 이어서 56℃ 이상에서 혼탁도의 점진적인 증가가 이어졌다. [V(VKG)3VKVPG]4-ELP1-90의 경우에, 역온도전이는 관찰되지 않았다. The phase transition properties of the double block ELP at 25 mM in PBS are described in FIG. ELP1-90 showed a very sharp increase in turbidity at T t of 42 ° C. V (VKG) 3 VKVPG-ELP1-90 and [V (VKG) 3 VKVPG] 2 -ELP1-90 also showed a sharp increase in turbidity. However, for these proteins, T t is Moved to higher temperatures of 45 ° C. and 47 ° C., respectively. In contrast, the turbidity profile of [V (VKG) 3 VKVPG] 3 -ELP1-90 showed a three phase transition. The first slow transition with a T t of 50 ° C. followed by a sharp decrease in absorbance between 53 ° C. and 56 ° C. followed by a gradual increase in turbidity above 56 ° C. In the case of [V (VKG) 3 VKVPG] 4 -ELP1-90, no reverse temperature transition was observed.
표 1(단백질 특성의 요약, 및 염과 pH가 Tt 값에 미치는 영향)에 양이온성 도메인의 개수와 양이온성 ELP의 Tt 값간의 관계를 요약하였다. ELP 분자 중의 양이온성 도메인의 개수가 증가함에 따라, ELP의 Tt는 열 민감도의 동시 감소와 함께 좀더 고온으로 이동하였다.Table 1 (summary of protein properties, and the effect of salt and pH on T t values) summarizes the relationship between the number of cationic domains and the T t values of cationic ELPs. As the number of cationic domains in the ELP molecule increased, the T t of the ELP shifted to higher temperatures with a simultaneous decrease in thermal sensitivity.
표1에서 위첨자 a는 분자내 양이온성 도메인의 함량(양이온성 도메인의 MW/분자의 MW x 100), 위첨자b 는 PBS 중 단백질 25 mM에서의 Tt, 위첨자c는 측정되지 않음, 위첨자d는 3상 전이, 위첨자e는 전이 없음을 의미한다.
In Table 1, the superscript a is Content of cationic domain in the molecule (MW x 100 of MW / molecule of cationic domain), superscript b is T t at 25 mM protein in PBS , superscript c is Not measured, superscript d is Three phase transition, superscript e means no transition.
염 농도 민감성Salt concentration sensitivity
양이온성 ELP의 상전이 특성에 미치는 염 농도의 영향을 10 mM 포스페이트 버퍼(pH 7.4) 중의 [V(VKG)3VKVPG]3ELP1-90 및 [V(VKG)3VKVPG]4-ELP1-90를 사용하여 검토하였는데(도 7의 B 및 C), 그 이유는 어떠한 ELP도 50 mM NaCl에서의 온도 변화에 영향 받지 않았기 때문이다. The effect of salt concentration on the phase transition properties of cationic ELP was determined using [V (VKG) 3 VKVPG] 3 ELP1-90 and [V (VKG) 3 VKVPG] 4 -ELP1-90 in 10 mM phosphate buffer (pH 7.4). (B and C in Fig. 7), since no ELP was affected by temperature changes in 50 mM NaCl.
100 mM NaCl의 경우, [V(VKG)3VKVPG]3-ELP1-90는 3상 전이 프로파일을 나타낸 반면에, [V(VKG)3VKVPG]4ELP1-90은 열적 변화에 반응을 나타내지 않았다. 300 mM NaCl의 존재하에서, [V(VKG)3VKVPG]4ELP1-90는 온도 변화에 반응성이 되었다. NaCl의 농도를 500 mM 이상으로 증가시킴에 따라, [V(VKG)3VKVPG]3ELP1-90 및 [V(VKG)3VKVPG]4ELP1-90 양자 모두는 완전히 열-민감성이었고, 42℃ 부근의 유사한 Tt를 나타내었다. NaCl 농도를 2 M로 더 증가시키면 전이 곡선 기울기의 증가와 함께 Tt가 18℃ 로 이동하였다.
For 100 mM NaCl, [V (VKG) 3 VKVPG] 3 -ELP1-90 showed a three-phase transition profile, whereas [V (VKG) 3 VKVPG] 4 ELP1-90 did not respond to thermal changes. In the presence of 300 mM NaCl, [V (VKG) 3 VKVPG] 4 ELP1-90 became reactive to temperature changes. As the concentration of NaCl was increased above 500 mM, both [V (VKG) 3 VKVPG] 3 ELP1-90 and [V (VKG) 3 VKVPG] 4 ELP1-90 were completely heat-sensitive and near 42 ° C. A similar T t is shown. Further increasing NaCl concentration to 2 M shifted T t to 18 ° C. with increasing transition curve slope.
pH 반응성pH reactivity
도 8은 pH 변화에 대한 [V(VKG)3VKVPG]nELP1-90(n = 3 또는 4)의 민감성을 예시하였다. 도 8에서 3. pH 7.0 (▲), 10.0 (x), 및 12.0 (●)에서 [V(VKG)3VKVPG]3-ELP1-90(청색) 및 [V(VKG)3VKVPG]4-ELP1-90(핑크색)의 용액 혼탁도. 양이온성 ELP의 농도는 PBS 중 25uM이었고, 가열 속도는 1℃/min이었다.8 illustrates the sensitivity of [V (VKG) 3 VKVPG] n ELP1-90 (n = 3 or 4) to pH changes. 8. [V (VKG) 3 VKVPG] 3 -ELP1-90 (blue) and [V (VKG) 3 VKVPG] 4 -ELP1 at pH 7.0 (▲), 10.0 (x), and 12.0 (●). Solution turbidity of -90 (pink). The concentration of cationic ELP was 25 uM in PBS and the heating rate was 1 ° C./min.
pH 7.0에서, [V(VKG)3VKVPG]3ELP1-90는 3상 전이 프로파일을 나타내었다. pH를 10으로 상승시킴에 따라, 상전이 프로파일은 쌍곡선 양상을 띠었는데, 이는 열 반응성이 증대되었음을 시사한다. pH 12에서, 전이 곡선은 Tt가 47oC인 S자형을 보였다. [V(VKG)3VKVPG]4-ELP1-90에 대해서도 유사한 결과가 수득되었다. 후자는 pH 7.0에서 상전이를 나타내지 않았지만, 48oC의 Tt를 갖는 pH 12.0에서의 온도 변화에 완전히 반응성이었다. pH 12.0에서의 Tt 값이 [V(VKG)3VKVPG]3ELP1-90보다는 [V(VKG)3VKVPG]4-ELP1-90의 경우에 더 낮았다는 발견은, 비-하전 ELP 사슬 길이가 증가하였기 때문에 [V(VKG)3VKVPG]4-ELP1-90의 경우에 더 많은 분자간 상호작용이 존재함을 시사한다. 이러한 결과는 소수성 ELP 분자의 사슬 길이가 증가함에 따라 Tt가 감소한다는 보고와 일치하였다(20). 표 1에는 양이온성 도메인의 개수가 이중 블럭 ELP의 상전이 특성 및 이들의 자극 민감성에 미치는 영향을 요약하였다.
At pH 7.0, [V (VKG) 3 VKVPG] 3 ELP1-90 exhibited a three phase transition profile. As the pH was raised to 10, the phase transition profile took a hyperbolic pattern, suggesting increased thermal reactivity. At pH 12, the transition curve was sigmoidal with T t 47 o C. Similar results were obtained for [V (VKG) 3 VKVPG] 4 -ELP1-90. The latter showed no phase transition at pH 7.0, but was completely responsive to temperature changes at pH 12.0 with a T t of 48 ° C. The finding that the T t value at pH 12.0 was lower for [V (VKG) 3 VKVPG] 4 -ELP1-90 than for [V (VKG) 3 VKVPG] 3 ELP1-90, indicates that the non-charged ELP chain length was lower. Increased suggests that more intermolecular interactions exist for [V (VKG) 3 VKVPG] 4 -ELP1-90. This result is consistent with the report that T t decreases with increasing chain length of hydrophobic ELP molecules (20). Table 1 summarizes the effect of the number of cationic domains on the phase transition properties of biblock ELPs and their stimulus sensitivity.
해석Translate
용액중 ELP의 자기-조립 또는 코아세르베이션은 무작위 사슬로부터 b-턴 입체구조로의 입체구조 변화, 소수성 결합, 및 좀더 큰 응집체 형성을 위한 숙성 과정을 수반하는 메커니즘을 통해 일어난다. Tt 값이 상이한 두 상이한 ELP 세그먼트로 구성되어 있는 이중 블럭 ELP내에서는, 더 낮은 Tt 값을 갖는 ELP 블록은 b-턴 입체구조를 취하며 그의 Tt 이상에서 붕괴되는 반면에, 더 높은 Tt 값을 갖는 다른 세그먼트는 용액에 잔류한다. 이러한 조사결과를 바탕으로, [V(VKG)3VKVPG]3-ELP1-90에 대해 관찰된 3상 열전이가 코어-쉘 미셀 구조의 형성을 나타낸다고 추론 가능하다. 온도를 50oC의 Tt에 근접하게 상승시키면, 용매화된 소수성 ELP1-90 세그먼트는 입체구조 변화를 거쳐 b-턴 구조를 형성한다. 온도를 Tt 이상으로 더 상승시키면, ELP1-90 세그먼트의 b-턴 코일간의 분자간 소수성 상호작용은 단백질의 미셀 구조로의 조립을 초래하며, 여기에서 ELP1-90 세그먼트는 용매화된 양이온성 서열의 친수성 쉘로 둘러싸이는 소수성 코어를 형성한다. 53℃ 내지 56℃ 사이에서 용액의 혼탁도의 급격한 직선형 저하는 소형 입자가 미셀 구조로 재배치됨으로써 초래되고, 반면에 56℃ 내지 70℃ 사이에서 관찰된 혼탁도의 점진적인 증가는 소형 미셀을 희생한 초분자성 응집체의 형성에 기인할 수 있는 것 같다(도 7의 A의 삽화). [V(VKG)3VKVPG]3-ELP1-90의 상전이 과정 동안의 동역학적 입자 크기 모니터링은 이러한 해석을 지지해주는 증거를 제공할 수 있다.Self-assembly or coacervation of ELP in solution occurs through mechanisms that involve conformational changes from random chains to b-turn conformations, hydrophobic bonds, and ripening processes to form larger aggregates. T within the double block ELP with a t value is composed of two different segments of different ELP, more ELP block having low T t is the value while taking the b- turn conformation and collapse in his above T t, Other segments with higher T t values remain in solution. Based on these findings, it can be inferred that the three-phase thermal transition observed for [V (VKG) 3 VKVPG] 3 -ELP1-90 indicates the formation of core-shell micelle structures. When the temperature is raised close to T t of 50 ° C., the solvated hydrophobic ELP1-90 segments undergo a conformational change to form a b-turn structure. Increasing the temperature further above T t , the intermolecular hydrophobic interaction between the b-turn coils of the ELP1-90 segment results in the assembly of the protein into the micelle structure, where the ELP1-90 segment of the solvated cationic sequence It forms a hydrophobic core surrounded by a hydrophilic shell. The sharp, linear decrease in turbidity of the solution between 53 ° C. and 56 ° C. is caused by the small particles relocating to the micelle structure, while the gradual increase in turbidity observed between 56 ° C. and 70 ° C. is the supramolecule at the expense of the small micelles. This may be due to the formation of sex aggregates (illustration of A in FIG. 7). Dynamic particle size monitoring during the phase transition process of [V (VKG) 3 VKVPG] 3 -ELP1-90 may provide evidence to support this interpretation.
양이온성 ELP의 염 민감성에 대한 라이신-함유 도메인의 기여도 분석에 있어서, NaCl의 첨가는 Tt의 농도-의존성 감소 및 순(純) 양전하를 띠는 중성 pH에서 양이온성 ELP의 열 민감성 증가를 가져왔다. 함량이 10% 이상의 친수성 양이온성 블록인 양이온성 ELP의 상전이를 유도하는 데에는 NaCl 고농도(>500 mM)가 필요하였으며, 이는 NaCl이 ELP 분자의 소수성 상호작용을 증대시킴을 시사한다. Cl- 이온은 소수성 수화에 수반되고, 열-유도 상전이 하에서 ELP의 소수성 펜타펩타이드 주위에 정렬하는 물 분자를 불안정화시키는 것으로 제안되어 왔다. In the analysis of the contribution of lysine-containing domains to the salt sensitivity of cationic ELPs, the addition of NaCl resulted in reduced concentration-dependence of T t and increased thermal sensitivity of cationic ELPs at neutral pH with a net positive charge. come. High concentrations of NaCl (> 500 mM) were required to induce the phase transition of cationic ELPs with a content of at least 10% hydrophilic cationic blocks, suggesting that NaCl enhances the hydrophobic interaction of ELP molecules. Cl − ions are involved in hydrophobic hydration and have been proposed to destabilize water molecules that align around the hydrophobic pentapeptides of ELP under heat-induced phase transitions.
그러나, [V(VKG)3VKVPG]3-ELP1-90 및 [V(VKG)3VKVPG]4-ELP1-90의 경우에, 고농도의 NaCl에서 열 민감성의 관찰된 증가는 부분적으로는 라이신 잔기의 양으로 하전된 e-아미노 그룹에 대한 Cl- 카운터이온의 차폐 또는 중화 효과의 결과일 수 있다. 이는 양이온성 도메인의 계면에서의 정전기적 반발을 줄일 뿐만 아니라, 양이온성 도메인과 물 분자간의 상호작용을 감소시킬 것이며, 그에 따라 양이온성 도메인 주위에 정렬된 물 구조의 형성을 향상시킬 것이다. 양이온성 ELP의 경우, 온도 민감성의 겉보기 증가는 두 메커니즘의 병합 효과일 것이다. However, in the case of [V (VKG) 3 VKVPG] 3 -ELP1-90 and [V (VKG) 3 VKVPG] 4 -ELP1-90, the observed increase in thermal sensitivity at high concentrations of NaCl was partially dependent on the lysine residues. It may be the result of a masking or neutralizing effect of Cl − counterions on positively charged e-amino groups. This will not only reduce the electrostatic repulsion at the interface of the cationic domain, but will also reduce the interaction between the cationic domain and the water molecules, thus improving the formation of water structures aligned around the cationic domain. In the case of cationic ELP, the apparent increase in temperature sensitivity would be the merging effect of the two mechanisms.
pH-전이 프로파일과 분자 구조의 관점에서 볼 때, [V(VKG)3VKVPG]n-ELP1-90(여기에서, n = 1 및 2)의 pH 반응성은 라이신의 e-아미노 그룹에 의해 보여지는 하전 및 비-하전 이온 상태의 전반적인 균형에 의해 설명될 수 있다. pH 7.0에서, [V(VKG)3VKVPG]3ELP1-90의 열 민감성은 그의 카운터파트 ELP1-90의 것보다 낮았고, 반면에 [V(VKG)3VKVPG]4-ELP1-90은 전이를 보이지 않은 것으로 나타났다. 이는 양이온성 계면에서의 정전기적 반발에 의하여, 또는 ELP 세그먼트간의 소수성 b-턴의 패킹을 방지하는 양으로 하전된 양이온성 도메인에 의하여 초래될 수 있다. pH를 10.0로 증가시킴에 따라, [V(VKG)3VKVPG]3-ELP1-90 및 [V(VKG)3VKVPG]4-ELP1-90 양자 모두는 열적 변화에 대하여 증진된 반응성을 보인 것으로 나타났다. pH 12.0에서, 양이온성 ELP는 열적 변화에 대하여 신속한 반응을 나타내었다. 이러한 거동은 10.3의 pI를 갖는 라이신 측쇄의 이온화도와 상관 관계가 있다. [V(VKG)3VKVPG]3-ELP1-90 및 [V(VKG)3VKVPG]4-ELP1-90의 pI 값은 각각 11.1 및 11.2이다(표 1). 따라서, pH <12.0에서, 측쇄는 완전히 탈프로톤화되고 전하를 띠지 않으며, 그에 따라 전체 분자 구조는, pH 7.0에서의 프로톤화된 상태와는 대조적으로, 순전하를 띠지 않으며; 비-하전 구조는 더 낮은 온도에서 ELP 세그먼트간의 소수성 상호작용을 조장한다.In terms of pH-transition profile and molecular structure, the pH reactivity of [V (VKG) 3 VKVPG] n -ELP1-90 (where n = 1 and 2) is shown by the e-amino group of lysine. This can be explained by the overall balance of charged and non-charged ion states. At pH 7.0, the thermal sensitivity of [V (VKG) 3 VKVPG] 3 ELP1-90 was lower than that of its counterpart ELP1-90, whereas [V (VKG) 3 VKVPG] 4 -ELP1-90 showed no transition. Turned out to be. This can be caused by electrostatic repulsion at the cationic interface, or by positively charged cationic domains that prevent packing of hydrophobic b-turns between ELP segments. As the pH was increased to 10.0, both [V (VKG) 3 VKVPG] 3 -ELP1-90 and [V (VKG) 3 VKVPG] 4 -ELP1-90 were shown to exhibit enhanced responsiveness to thermal changes. . At pH 12.0, cationic ELP showed a rapid response to thermal changes. This behavior correlates with the ionization of lysine side chains with a pi of 10.3. The pi values of [V (VKG) 3 VKVPG] 3 -ELP1-90 and [V (VKG) 3 VKVPG] 4 -ELP1-90 are 11.1 and 11.2, respectively (Table 1). Thus, at pH <12.0, the side chains are completely deprotonated and uncharged, so that the entire molecular structure is not purely charged, as opposed to the protonated state at pH 7.0; Non-charged structures encourage hydrophobic interactions between ELP segments at lower temperatures.
결론적으로, 본 실험예의 결과는 ELP의 자극 민감성이 열-반응성 ELP 세그먼트에 융합된 양이온성 블록의 서열과 개수를 변경함으로써 조절될 수 있음을 보여준다. 하전된 도메인의 융합에 의한 자극 민감성에 대한 그러한 조절은 온도, 염 및 pH에 대한 민감성이 강하게 요구되는 ELP 응용 분야를 확장시킬 수 있다.
In conclusion, the results of this experimental example show that the stimulus sensitivity of ELP can be modulated by altering the sequence and number of cationic blocks fused to heat-reactive ELP segments. Such regulation of stimulus sensitivity by the fusion of charged domains can extend ELP applications where strong sensitivity to temperature, salt and pH is required.
재료 및 방법Materials and methods
V(VKG)V (VKG) 33 VKVPG 단위에 대한 코딩 서열의 작제Construction of Coding Sequences for VKVPG Units
V(VKG)3VKVPG 모노머 블록 단위를 코딩한 두 올리고뉴클레오타이드(순방향: 5'- AATTCCCACGGCGTGGTTAAAGGTGTTAAA GGTGTTAAAGGTGTTAAAGTGCCGGGCGGGCA-3' 및 역방향: 5'-AGCTTG CCCGCCCGGCACTTTAACACCTTTAACACCTTTAACACCTTTAACCACGCCGTGGG-3')는 이들을 어닐링하여 이본쇄 DNA 단편을 형성하였을 때 EcoRI, PflMI, BglI, 및 HinDIII 제한효소 부위가 생성되도록 디자인하였다. 두 올리고뉴클레오타이드의 혼합물을 리가제 버퍼 중 95℃ 에서 5분간 가열한 다음, 1℃ /min의 속도로 실온으로 냉각시킴으로써 이본쇄 DNA 카세트가 형성되었다. 클로닝 벡터 pUC19(NEB)를 EcoRI와 HinDIII(NEB)로 소화시킨 다음, 송아지 장 포스파타제(CIP; Promega)를 사용하여 탈인산화시켰다. 이어서, 선형화 pUC19 벡터를 스핀 칼럼 정제 키트(Qiagen)를 이용하여 아가로스 겔로부터 정제한 다음 V(VKG)3VKVPG를 위한 이본쇄 DNA 카세트와 라이게이션시켰다. 라이게이션 후, E. coli Top 10 세포(Invitrogen)를 열 쇼크법에 의해 라이게이션 생성물로 형질전환시키고, 암피실린(100 mg/ml)을 보충한 CircleGrow 아가 배지(Q-BIO gene) 상에 도말한 다음, 37ㅀC 에서 밤새 배양하였다. 다중 콜로니를 선발하여 암피실린을 보충한 5 mL의 CircleGrow 배지에서 12시간 동안 37℃ 에서 증식시켰다. 플라스미드를 단리하고, miniprep 키트(Qiagen)를 이용하여 5 mL의 배양액으로부터 정제하였다. 정확한 삽입체를 갖는 재조합 플라스미드를 함유한 클론을 EcoRI, PflMI, 및 HinDIII를 사용하여 진단 소화(diagnostic digestion)에 의해 동정하였다.
Two oligonucleotides encoding V (VKG) 3 VKVPG monomer block units (forward: 5′-AATTCCCACGGCGTGGTTAAAGGTGTTAAA GGTGTTAAAGGTGTTAAAGTGCCGGGCGGGCA-3 ′ and reverse: 5′-AGCTTG CCCGCCCGGCACTTTAACACCTTTAACTTCHACACGTTCC) Eco RI, Pfl MI, Bgl I, and Hin DIII restriction sites were designed to generate. A double stranded DNA cassette was formed by heating a mixture of two oligonucleotides at 95 ° C. for 5 minutes in ligase buffer and then cooling to room temperature at a rate of 1 ° C./min. Cloning vector pUC19 (NEB) was digested with Eco RI and Hin DIII (NEB) and then dephosphorylated using calf intestinal phosphatase (CIP; Promega). Linearized pUC19 vectors were then purified from agarose gels using a spin column purification kit (Qiagen) and then ligated with a double stranded DNA cassette for V (VKG) 3 VKVPG. After ligation,
[V(VKG)[V (VKG) 33 VKVPG]VKVPG] nn 도메인에 대한 코딩 서열의 작제 Construction of coding sequences for domain
[V(VKG)3VKVPG]n(여기에서, n = 1, 2, 3, 또는 4)를 코딩한 DNA 단편을 RDL을 적용하여 V(VKG)3VKVPG를 코딩한 플라스미드로부터 제조하였다. 간단히 설명하자면, V(VKG)3VKVPG 모노머 단위에 대한 서열을 함유하는 pUC19를 PflMI로 선형화하고, CIP로 탈인산화한 다음, 단편을 아가로스 겔 상에서 분리하였다. 선형화 플라스미드를 스핀 칼럼 정제 키트(Qiagen)를 이용하여 겔로부터 정제하였다. 플라스미드의 별도의 샘플을 PflMI와 BglI로 소화시켜 V(VKG)3VKVPG 모노머를 코딩하는 서열을 방출시켰다. 소화 후, 반응 생성물을 전기영동에 의해 고-융점 아가로스 겔 상에서 분리시키고, 삽입체를 DNA 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 정제하였다. 정제 삽입체를 선형화 pUC19 벡터에 라이게이션한 다음, 생성되는 산물을 E. coli Top10 세포 중으로 형질전환시켰다. 형질전환체를 처음에 EcoRI 및 HinDIII를 사용하여 진단 소화에 의해 스크리닝한 다음, DNA 서열분석에 의해 추가 확인하였다. RDL의 후속 라운드를 위해 [V(VKG)3VKVPG]2 펩타이드에 대한 서열을 함유한 클론을 동정하여 선발하였다. 출발 클론으로서 선행 라운드로부터의 작제물을 사용하여 동일한 방법으로 부가적인 라운드를 실시하였다.
DNA fragments encoding [V (VKG) 3 VKVPG] n (where n = 1, 2, 3, or 4) were prepared from plasmids encoding V (VKG) 3 VKVPG by applying RDL. Briefly, pUC19 containing the sequence for the V (VKG) 3 VKVPG monomer unit was linearized with Pfl MI, dephosphorylated with CIP, and the fragments were separated on agarose gels. Linearization plasmids were purified from gels using a spin column purification kit (Qiagen). Separate samples of plasmids were digested with Pfl MI and Bgl I to release sequences encoding V (VKG) 3 VKVPG monomers. After digestion, the reaction product was separated on a high-melting agarose gel by electrophoresis and the insert was purified using a DNA extraction kit (Qiagen). Purified inserts were ligated into the linearized pUC19 vector, and the resulting product was transformed into E. coli Top10 cells. Transformants were initially screened by diagnostic digestion using Eco RI and Hin DIII and then further confirmed by DNA sequencing. Clones containing sequences for the [V (VKG) 3 VKVPG] 2 peptide were identified and selected for subsequent rounds of RDL. Additional rounds were conducted in the same manner using constructs from the preceding rounds as starting clones.
[V(VKG)[V (VKG) 33 VKVPG]VKVPG] nn -ELP1-90 유전자 라이브러리의 작제Construction of -ELP1-90 Gene Library
ELP1-90에 대한 코딩 서열의 카피를 함유한, pUC19계 클로닝 벡터인 pUC19-ELP1-90를 공표된 방법에 따라 제조하였다. 벡터를 PflMI로 소화하고, CIP로 탈인산화한 다음, 아가로스 겔 상에서 분리하고, 선형화 플라스미드를 스핀 DNA 추출 키트를 이용하여 겔로부터 정제하였다. [V(VKG)3VKVPG]n에 대한 서열을 함유한 별도의 pUC19 벡터를 PflMI 및 BglI로 소화하여 표적 삽입체를 방출시켰다. 소화 후, 반응 생성물을 전기영동에 의해 아가로스 겔 상에서 분리하고, 삽입체를 DNA 추출 키트를 이용하여 겔로부터 정제하였다. pET-25b(+)SV2 벡터를 SfiI로의 소화에 의해 선형화하고, CIP로 탈인산화한 다음, 전기영동 후 아가로스 겔 추출에 의해 정제하였다. 정제 [V(VKG)3VKVPG]n 서열 및 선형화 pET-25b(+)SV2 벡터를 16℃ 에서 5시간 동안 라이게이션하고(20 pmol의 벡터 및 100 pmol의 삽입체를 NEB로부터 입수한 10 단위의 리가제를 함유한 20 ml의 리가제 버퍼에서 배양하였다), 라이게이션 혼합물을 E. coli Top10 세포 중으로 형질전환시켰다. 생성되는 형질전환체로부터 단리한 플라스미드를 AvaI 및 XbaI(NEB)로의 진단 소화에 의해 스크리닝한 다음, 삽입체의 아이덴티티를 추가로 DNA 서열분석에 의하여 확인하였다. 이중 블럭 [V(VKG)3VKVPG]n-ELP1-90 중합체에 대한 코딩 서열을 함유한 플라스미드를 열 쇼크법에 의해 E. coli 균주 BLR(DE3) 중으로 형질전환시켰다.
PUC19-based cloning vector, pUC19-ELP1-90, containing a copy of the coding sequence for ELP1-90 was prepared according to the published method. Vectors were digested with Pfl MI, dephosphorylated with CIP, then separated on agarose gels, and linearized plasmids were purified from gels using a spin DNA extraction kit. Separate pUC19 vectors containing the sequence for [V (VKG) 3 VKVPG] n were digested with Pfl MI and Bgl I to release the target insert. After digestion, the reaction product was separated on an agarose gel by electrophoresis and the insert was purified from the gel using a DNA extraction kit. The pET-25b (+) SV2 vector was linearized by digestion with Sfi I, dephosphorylated with CIP, and then purified by agarose gel extraction after electrophoresis. Purification [V (VKG) 3 VKVPG] n sequence and linearized pET-25b (+) SV2 vector were ligated at 16 ° C. for 5 hours (20 pmol of vector and 100 pmol of insert from NEB) Cultured in 20 ml of ligase buffer containing ligase), the ligation mixture was transformed into E. coli Top10 cells. Plasmids isolated from the resulting transformants were screened by diagnostic digestion with Ava I and Xba I (NEB), and then the identity of the insert was further confirmed by DNA sequencing. Plasmids containing the coding sequence for the double block [V (VKG) 3 VKVPG] n -ELP1-90 polymer were transformed into E. coli strain BLR (DE3) by heat shock method.
양이온성 ELP의 발현 및 정제Expression and Purification of Cationic ELP
[V(VKG)3VKVPG]nELP1-90에 대한 코딩 서열을 함유한 pET계 발현벡터로 형질전환시킨 E. coli BLR(DE3)를 CircleGrow 배지 중 37℃ 에서 24시간 증식시켰다. 수확 후, 세포를 초음파처리에 의해 파괴한 다음, 이중 블럭 ELP을 앞서 기술된 바의 역전이 사이클링(ITC) 법에 의해 세포 용해물로부터 정제하였다. 단백질 농도를 280 nm에서의 단일 Trp 잔기의 몰 흡광계수 5,690 M-1 cm-1를 이용하여 UV 분광측정법으로 측정하였다. 정제 단백질을 PBS(pH 7.4; Gibco)에 20 mg/ml의 농도로 용해시킨 다음, 사용할 때까지 -80℃ 에서 보관하였다. 양이온성 ELP의 순도와 분자량은 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 스테인(Bio-Rad)을 이용하여 12% SDS-PAGE 겔 상에서 가시화하여 분석하였다. [V(VKG)3VKVPG]nELP1-90 중합체의 분자량(MW)을 ExPASy Proteomics Server로부터 입수가능한 Compute pI/MW 소프트웨어로 계산하였다.
E. coli BLR (DE3) transformed with a pET-based expression vector containing coding sequence for [V (VKG) 3 VKVPG] n ELP1-90 was grown for 24 hours at 37 ° C. in CircleGrow medium. After harvesting, the cells were disrupted by sonication and then the double block ELPs were purified from cell lysates by the reverse transition cycling (ITC) method as described above. Protein concentration was determined by UV spectroscopy using a molar extinction coefficient of 5,690 M −1 cm −1 of a single Trp residue at 280 nm. Purified protein was dissolved in PBS (pH 7.4; Gibco) at a concentration of 20 mg / ml and then stored at -80 ° C until use. Purity and molecular weight of cationic ELPs were analyzed by visualization on a 12% SDS-PAGE gel using Coomassie Brilliant Blue R-250 stain (Bio-Rad). [V (VKG) 3 VKVPG] n The molecular weight (MW) of ELP1-90 polymer was calculated by Compute pI / MW software available from ExPASy Proteomics Server.
역온도전이에 의한 자극 민감성의 특성해석Characterization of Stimulus Sensitivity by Reverse Temperature Transition
[V(VKG)3VKVPG]nELP1-90의 열-유도 상전이에 미치는 양이온성 도메인 함량, 염 및 pH의 영향을 멀티셀 열전기 온도 조절기를 구비한 Cary 100 UV-가시광 분광 광도계(Varian) 상에서, 온도의 함수로서 350 nm에서의 단백질 용액의 광학 밀도를 모니터링하여 특성해석하였다. 온도의 가열 및 냉각 속도는 1oC/min이었고, Tt는 최대 광학 밀도의 1/2이 관측되는 온도로서 측정되었다.
[V (VKG) 3 VKVPG] n Influence of cationic domain content, salt and pH on the heat-induced phase transition of ELP1-90 on a
전술한 바와 같이 이중 블럭 엘라스틴 단백질(200)의 실험한 결과는 이온성 제1블럭(210)과 엘라스틴 유래 펩타이드(220)가 이중 블럭을 형성한 것에 기인한 것으로, 도 3 내지 도 5의 다른 이중 블럭 엘라스틴 단백질(300 내지 500)도 동일한 결과를 얻었으나 그 결과가 도 2를 참조하여 설명한 이중 블럭 엘라스틴 단백질(200)과 실질적으로 동일하였다. As described above, the experimental results of the double
요약하면, 일련의 엘라스틴-유사 단백질, SKGPG[V(VKG)3VKVPG]n-(ELP1-90)WP (n = 1, 2, 3, 및 4)가 트로포엘라스틴의 소수성 및 라이신 결합 도메인에 기반하여 생합성한 후, 자기-조립 소수성 응집체의 형성을 모니터하여 염과 pH의 변화에 대한 민감성뿐만 아니라 상전이 특성에 미치는 양이온성 세그먼트의 영향을 검토하였다. In summary, a series of elastin-like proteins, SKGPG [V (VKG) 3 VKVPG] n- (ELP1-90) WP (n = 1, 2, 3, and 4), are based on the hydrophobic and lysine binding domains of tropoelastin After biosynthesis, the formation of self-assembled hydrophobic aggregates was monitored to examine the effect of cationic segments on the phase transition properties as well as sensitivity to salt and pH changes.
오직 하나 또는 두 개의 양이온성 블록(n = 1 또는 2)과 융합된 단백질의 열전이 프로파일은 카운터파트 ELP1-90의 것과 유사하였다. 이와 반대로, 3 및 4개의 양이온성 블록을 함유하는 2블록 단백질은 각각 3상(三相) 프로파일을 나타내고 전이를 보이지 않았다. 염 농도와 pH를 증가시킬 경우, 가용성 입체구조로부터 불용성 응집체로의 자극-유도 상전이가 관찰되었다. 양이온성 2모드 ELP의 자극 민감성에 미치는 양이온성 세그먼트의 영향은 구조적 및 분자적 특징의 관점에서 해석되어 왔다.The heat transfer profile of the protein fused with only one or two cationic blocks (n = 1 or 2) was similar to that of counterpart ELP1-90. In contrast, diblock proteins containing three and four cationic blocks each exhibited a three-phase profile and showed no transition. Increasing salt concentration and pH observed stimulus-induced phase transition from soluble conformation to insoluble aggregates. The effect of cationic segments on the stimulus sensitivity of cationic bimodal ELP has been interpreted in terms of structural and molecular characteristics.
이상 도면을 참조하여 실시예들을 설명하였으나 본 발명은 이에 제한되지 않는다.Embodiments have been described above with reference to the drawings, but the present invention is not limited thereto.
위 실시예들에서 이중 블럭 엘라스틴 단백질에 대해 설명하였으나 실험예에서 설명한 바와 같이 본 발명은 이중 블럭 엘라스틴 단백질와 관련된 염기 서열 또는 유전자, 유전자 라이브러리, 발현벡터, 숙주, 이중 블럭 엘라스틴 단백질의 발현 및 정제 방법이나 절차를 포함한다. 본 명세서에서 이와 관련하여 설명하지 않은 내용은 일반적인 생화학 또는 유전공학, 분자생물학의 일반적인 내용으로 대체한다.In the above embodiments, the double block elastin protein was described, but as described in the experimental example, the present invention provides a method for expressing and purifying a base sequence or gene, gene library, expression vector, host, and double block elastin protein related to the double block elastin protein. Include procedures. Content not described herein in this context is replaced by the general content of general biochemistry or genetic engineering, molecular biology.
예를 들어, 실험예에서 설명한 바와 같이 본 발명은 이중 블럭 엘라스틴 단백질의 제1블럭을 코딩하는 DNA 서열과 제2블럭을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 이중 블럭 엘라스틴 단백질을 지정하는 유전자 또는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 실험예에서 설명한 바와 같이 본 발명은 이중 블럭 엘라스틴 단백질을 지정하는 유전자의 코딩 서열을 함유한 발현 벡터를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 이중 블럭 엘라스틴 단백질을 지정하는 유전자의 코딩 서열의 유전자 라이브러리를 포함할 수 있다. For example, as described in the experimental example, the present invention provides a gene or a nucleotide sequence designating a double block elastin protein comprising a DNA sequence encoding a first block of a double block elastin protein and a DNA sequence encoding a second block. It may include. In addition, as described in the experimental example, the present invention may include an expression vector containing a coding sequence of a gene designating a double block elastin protein. It may also comprise a gene library of coding sequences of genes designating the double block elastin proteins of the invention.
또한 본 발명은 이중 블락 엘라스틴 단백질을, 약물전달, 포유동물 기반 바이오센서, 세포치료 또는 조직공학용 기질로 사용하는 것을 포함한다. The present invention also encompasses the use of double block elastin proteins as substrates for drug delivery, mammalian based biosensors, cell therapy or tissue engineering.
이상의 설명은 본 발명을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 실시예들은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 사상과 범위가 한정되는 것은 아니다. While the present invention has been described with reference to exemplary embodiments, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments. Accordingly, the embodiments disclosed herein are intended to be illustrative rather than limiting, and the spirit and scope of the present invention are not limited by these embodiments.
본 발명의 보호범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술은 본 발명의 권리범위에 포함하는 것으로 해석되어야 할 것이다.The protection scope of the present invention should be interpreted by the following claims, and all the technologies within the equivalent scope should be interpreted as being included in the scope of the present invention.
Claims (6)
상기 제1블럭과 일렬로 연결된 엘라스틴 유래 또는 모방 펩타이드인 제2블럭;
상기 제1블럭 또는 상기 제2블럭 중 하나에 각각 지정된 제1터미널과 제2터미널을 포함하는 이중 블럭 엘라스틴 단백질. Ionic first block;
A second block which is an elastin-derived or mimic peptide linked in series with the first block;
A dual block elastin protein comprising a first terminal and a second terminal respectively assigned to one of the first block or the second block.
상기 이온성 제1블럭은 최소한 1개의 양이온 아미노산 또는 음이온 아미노산 중 적어도 하나를 포함하는 아미노산 배열의 블럭을 m개(m은 1 이상의 정수) 포함하며, 엘라스틴 유래 펩타이드인 제2블럭은 인간 트로포틴엘라스틴의 모방 펩타이드인 XGVPG 펜타 펩타이드 또는 세포 부착성 RGD 트리펩타이드를 n개(n은 1 이상의 정수) 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 블럭 엘라스틴 단백질. The method of claim 1,
The ionic first block comprises m blocks of an amino acid sequence including at least one of at least one cationic amino acid or anionic amino acid (m is an integer of 1 or more), and the second block, which is an elastin-derived peptide, is a human tropotin elastin. A double block elastin protein, comprising n (n is an integer of 1 or more) of XGVPG penta peptides or cell-adhesive RGD tripeptides which are mimic peptides.
상기 제1터미널은 N- 또는 C-터미널 아미노산 중 하나로 양이온, 음이온성 아미노산 또는 시스테인으로 지정되며, 상기 제1블럭 또는 상기 제2블럭 중 하나의 말단에 결합되어 있고,
상기 제2터미널은 N- 또는 C-터미널 아미노산 중 하나로 양이온, 음이온성 아미노산 또는 시스테인으로 지정되며 상기 제1터미널이 N-터미널 아미노산인 경우 C-터미널 아미노산이고 제1터미널(130)이 C-터미널 아미노산인 경우 N-터미널 아미노산이며, 제1블럭 또는 제2블럭의 말단 중 제1터미널이 배열되는 반대편 말단에 배열되는 것을 특징으로 하는 이중 블럭 엘라스틴 단백질. The method of claim 2,
The first terminal is one of the N- or C-terminal amino acid is designated as a cation, anionic amino acid or cysteine, and is bonded to one end of the first block or the second block,
The second terminal is one of N- or C-terminal amino acids and is designated as a cation, anionic amino acid, or cysteine. When the first terminal is an N-terminal amino acid, the second terminal is a C-terminal amino acid and the first terminal 130 is a C-terminal. In the case of amino acids, the N-terminal amino acid is a double block elastin protein, characterized in that arranged at the opposite end of the first terminal is arranged in the terminal of the first block or the second block.
상기 제1블럭은 SKGPG[V(VKG)3VKVPG]n(n = 1, 2, 3, 4 중 하나)이며, 상기 제2블럭은 [(VGVPG)2GGVPGAGVPG(VGVPG)3GGVPGAGVPGGGVPG]9WP인 것을 특징으로 하는 이중 블럭 엘라스틴 단백질. The method of claim 1,
The first block is SKGPG [V (VKG) 3 VKVPG] n (one of n = 1, 2, 3, 4), and the second block is [(VGVPG) 2 GGVPGAGVPG (VGVPG) 3 GGVPGAGVPGGGVPG] 9 WP Double block elastin protein, characterized in that.
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