KR20120038698A

KR20120038698A - 항생제 저항성 포도상구균(ｍｒｓａ)억제 유산균 바이셀라 비리데센스

Info

Publication number: KR20120038698A
Application number: KR1020100100290A
Authority: KR
Inventors: 함준상; 정석근; 채현석; 장애라; 한기성; 오미화; 김동훈; 이승규; 이완규
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2010-10-14
Filing date: 2010-10-14
Publication date: 2012-04-24
Also published as: KR101258692B1

Abstract

본 발명은 항생제 저항성 포도상구균(MRSA) 억제 능력을 갖는 유산균 바이셀라 비리데센스 균주에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바이셀라 비리데센스 2-T-2-20 배양액 1 mL 당 반코마이신 100 ug/mL 이상의 항생제 저항성 포도상구균(MRSA) 억제 효과를 나타내었으며, 돼지에 급여시 분변내 유산균수 10배 증가, 포도상구균수 1/100 감소, 항생제 저항성 포도상구균수 1/20 감소 효과를 나타내어 프로바이오틱으로 활용시 인체 및 가축의 건강증진 효과를 기대할 수 있다.

Description

항생제 저항성 포도상구균(ＭＲＳＡ)억제 유산균 바이셀라 비리데센스{Weissella viridescens for the growth inhibiting of antibiotic resistant Staphylococcus aureus(MRSA)}

본 발명은 항생제 저항성 포도상구균(MRSA) 억제 능력을 갖는 유산균 바이셀라 비리데센스 균주에 관한 것이다.

2차 세계대전때 부상당한 환자의 감염을 막기 위해 개발된 페니실린은 기적의 물질로 취급되었으나, 항생제의 이용이 늘어나면서 항생제에 저항하는 세균이 나타나게 되었다. 가장 먼저 보고된 항생제저항성 세균은 포도상구균(Staphylococcus aureus )이며, 포도상구균은 공기, 토양 등에 널리 분포하며, 특히 단백질, 탄수화물이 많은 식품에 오염될 가능성이 매우 높고 식품으로의 오염경로도 매우 다양하여 식중독의 원인균으로 식품위생상 중요하게 다뤄지고 있으며, 최근에 포도상구균 임상분리주 가운데 미국은 34%, 일본, 싱가포르, 대만은 60%, 이탈리아와 포르투갈은 50% 이상이 항생제저항성으로 알려지고 있어 항생제저항성 균주에 대한 경각심이 높아가고 있다.

사료첨가용 항생제는 1950년대부터 가축의 생장촉진제로 널리 사용되어 왔으나 육제품에 항생제의 잔류로 인한 잠재적 위해성이 제기되면서 전세계적으로 사용이 규제되고 있는 경향으로, 항생제는 가축의 질병치료에만 사용하고 항생제를 대체할 수 있는 생육촉진제의 개발이 필요하게 되었다. 생균제는 이러한 목적에서 개발되었으며, 1989년 Fuller에 의해 장내 미생물의 균총을 개선함으로써 숙주동물에게 유익한 작용을 유도할 수 있는 생균제제로 그 개념이 확정되었다. 생균제를 가축의 사료에 혼합 사용할 경우 생육촉진제로서의 효과가 입증되었는데 Pollmann(1980) 등은 돼지에서 체중 증가의 결과를 얻었다고 보고하였다. 또한 국내에서도 장 등(2000)이 돼지에 유산균을 첨가한 사료를 급여하였을때 증체율이 증가되는 것을 확인하였다. 생균제로의 이용을 위한 균주의 선발기준은 안전, 기능적 및 기술적 측면(Saarela 등. 2000)으로 요약될 수 있고, 기능적 측면은 위산 및 담즙 독성에 대한 저항성(Dunne 등. 1999), 항산화 활성(Kullisaar 등. 2002), 항미생물질의 생산, 면역반응 조절 및 장 조직 접착능력(Saarela 등. 2000) 같은 기준을 포함한다. 그중 항미생물질의 생산 측면에서 유산균(lactobacilli)은 유기산, 과산화수소, 이산화탄소, 디아세틸(diacetyl), 아세트알데히드(acetaldehyde), 및 박테리오신(bacteriocin)과 같은 여러 종류의 항미생물질의 생산으로 인해 생균제로서의 강점을 갖으며 널리 이용되고 있다(Ouwehand, 1998). 생균제는 항생제와는 달리 부작용이 없으며 기관이나 조직에 축적되지 않고 병원성 미생물에 대하여 내성을 일으키지 않는다. 생균제는 장내 유익균총을 증가시키고(Boda 등, 1991; Line 등, 1998) 병원성 미생물을 억제 감소시켜 장내의 세균총 변화를 유도한다. 병원성 미생물의 억제 효과는 병원성 미생물의 종류와 사용되는 생균제 유산균의 종류에 따라 다른 효과를 나타내며, 항생제 저항성 포도상구균(MRSA) 억제 유산균을 생균제로 사용시 장내 항생제 저항성 포도상구균의 억제효과를 기대할 수 있다.

이와 같은 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 예의 노력한 결과 항생제 저항성 포도상구균의 억제효과를 갖는 균주를 개발하기에 이르렀다.

결국, 본 발명의 목적은 항생제 저항성 포도상구균(MRSA)억제능을 갖는 바이셀라 비리데센스 유산균 및 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 항생제 저항성 포도상구균(MRSA)억제능을 갖는 수탁번호 KACC91550의 바이셀라 비리데센스(Weissella viridescens ) 2-T-2-20 유산균이 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 유산균 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물이 제공될 수 있다.

일 실시예에 따르면, 사료용 또는 식품용 첨가제로 사용되는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱 조성물이 제공될 수 있다.

일 실시예에 따르면, 약학적 담체 및 부형제를 추가로 포함하는 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 프로바이오틱 조성물이 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 바이셀라 비리데센스 2-T-2-20 배양액 1 mL 당 반코마이신 100 ug/mL 이상의 항생제 저항성 포도상구균(MRSA) 억제 효과를 나타내었으며, 돼지에 급여시 분변내 유산균수 10배 증가, 포도상구균수 1/100 감소, 항생제 저항성 포도상구균수 1/20 감소 효과를 나타내어 프로바이오틱으로 활용시 인체 및 가축의 건강증진 효과를 기대할 수 있다.

도 1은 항생제 저항성 포도상구균인 지시균 Staphylococcus aureus KCCM 40510의 항생제 저항성을 나타낸다.
도 2는 신생아에서 분리한 유산균의 MRSA 억제활성을 나타낸다.
도 3은 반코마이신 농도에 따른 항생제 저항성 포도상구균인 지시균 Staphylococcus aureus KCCM 40510의 억제 경향을 나타낸다. 반코마이신 농도는 다음과 같다. 1:10mg/mL, 2:1mg/mL, 3:100μg/mL, 4:10μg/mL.
도 4는 MRSA 억제 유산균 바이셀라 비리데센스 2-T-2-20의 전자현미경 관찰결과이다(5,000배 확대)
도 5는 MRSA 억제 유산균 바이셀라 비리데센스 2-T-2-20의 동결건조후 항균활성을 나타낸다.
도 6은 바이셀라 비리데센스 2-T-2-20 배양액 급여시험에 사용된 가축(돼지)의 사진이다.
도 7은 바이셀라 비리데센스 2-T-2-20 급여 전후 돼지 분변내 유산균수 변화 그래프를 나타낸다.
도 8은 바이셀라 비리데센스 2-T-2-20 급여 전후 돼지 분변내 포도상구균수를 나타낸다.
도 9는 바이셀라 비리데센스 2-T-2-20 급여 전후 항생제 저항성 포도상구균수 변화를 나타낸다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 항생제 저항성 포도상구균(MRSA)억제능을 갖는 수탁번호 KACC91550의 바이셀라 비리데센스(Weissella viridescens) 2-T-2-20 유산균이 제공될 수 있다. 이 때, 본 발명의 항생제 저항성 포도상구균은 페니실린(Penicillin)계 항생제인 메티실린(methicillin)에 내성을 보이는 균을 의미하며, MRSA(methicillin resistant staphylococcus aureus)라고 부른다. MRSA는 메티실린에만 내성을 보이는 것이 아니고, 대부분의 항생제에 강한 내성을 가지고 있다. 항생제의 사용이 많아지면서 병원균들도 내성을 갖는 변종균이 생겨나기 시작했는데 특히 MRSA는 대부분의 항생제에 내성을 보여 극히 제한된 항생제로만 치료가 가능한 병원균이다. 더욱 심각한 것은 병원내 감염을 유발하는 병원균 중 가장 빈번히 나타나는 원인균이고 면역력이 약한 환자나 노약자에게는 치명적일 수 있다는 점이다. 병원 내 감염으로 사망이나 장애에 이르는 대부분의 환자들은 이 세균에 감염됐다고 보면 무리가 없다. 그만큼 맹독성이 강한 세균이다. 뜻대로 풀이하자면 메티실린계 항생제에 내성을 가지고 있는 포도상 구균이 된다. 하지만 이 세균은 병원 내에 상주하며 넘쳐나는 각종 항생제와 싸우는 과정에서 거의 모든 항생제에 내성을 가지게 된 세균이다.

상기 수탁번호는 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2010년 5월 11일 등록하여 발급받은 것이며, 본 발명의 유산균의 명칭은 Weissella viridescens 2-T-2-20로 명명되어 있다. 수탁증 상의 수탁번호는 KACC91550P이나, 특허 전자출원 기입양식상 본 문헌에는 수탁번호 KACC91550로 기재되어 있으며, 이는 무방하다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 유산균 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물이 제공될 수 있다. 이 때의 프로바이오틱(Probiotic) 조성물은 생체의 활성을 도와 건강을 증진시킬 수 있는 미생물 이용 제품을 통칭하며, 통상 증생제 또는 생균제 등으로 포함되는 제품군을 포함한다.

일 실시예에 따르면, 사료용 또는 식품용 첨가제로 사용되는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱 조성물이 제공될 수 있다. 사료로 사용시에는 대상 가축의 종류에는 제한이 없다. 본 발명의 유산균 균주는 배양액 1 mL 당 반코마이신 100 ug/mL 이상의 항생제 저항성 포도상구균(MRSA) 억제 효과를 나타내며, 돼지에 급여시 분변내 유산균수 10배 증가, 포도상구균수 1/100 감소, 항생제 저항성 포도상구균수 1/20 감소 효과를 나타내어 프로바이오틱으로 활용시 인체 및 가축의 건강증진 효과를 기대할 수 있다. 이러한 점을 활용하면, 다양한 유전자로 형질을 전환하여 부가적인 특징을 갖도록 할 수도 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

본 발명에서는 한국인 신생아에서 분리 및 동정한 350종의 유산균을 대상으로 스폿 온 더 론 방법(Spot on the lawn method)을 이용하여 항생제 저항성 포도상구균 억제유산균을 선발하였고 현재까지 알려진 가장 강력한 항생제인 반코마이신과 효과를 비교하였다.

실시예 1. MRSA 억제 유산균의 분리 및 동정

본 발명자들은 전국적으로(경기, 강원, 충청, 전라, 경상) 출생 5일 이내 신생아(남 16, 여 9)의 분변 시료에서 분리 및 동정한 유산균 350개 균주를 대상으로 항생제 저항성 포도상구균 억제 유산균을 선발하였다. 선발 방법은 다음과 같다. 우선 트립틱 소이 아가(Tryptic soy agar)에 항생제 저항성 포도상구균을 도말한 후, 유산균 배양액 5μl를 점적하고 37℃에서 철야배양한 다음 항균활성을 관찰하였다. 지시균으로 사용한 포도상구균의 항생제 저항성은 도 1과 같이 나타났다. 반코마이신과 가나마이신을 제외한 대부분의 항생제에 저항성을 나타내는 것을 알 수 있다.

한국인 신생아에서 분리 및 동정된 유산균의 항균활성 측정 결과는 도 2와 같이 한 개의 균주(7번)에서 뚜렷이 관찰되었으며, 2개의 균주에서 약한 활성이 나타났다.

항균 활성이 나타난 유산균의 효과를 계수화하기 위해 반코마이신 농도에 따라 억제활성을 비교한 결과 MRSA 억제활성이 반코마이신 농도 100/mL 이상에 해당되는 것으로 나타났다.

MRSA 억제 효과가 뚜렷한 유산균의 형태적 특성은 도 4와 같았으며, 서열목록 1에 기재되어 있는 바와 같이 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과 Weissella viridescens로 동정되었다. 이를 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하였으며, 기탁번호는 KACC91550이다.

실시예 2. 바이셀라 비리데센스 2-T-2-20의 MRSA 억제활성 테스트

바이셀라 비리데센스 2-T-2-20를 MRS 액체배지에 배양한 후 동결건조하였다. 동결건조 분말에 증류수를 가하고 항균활성을 측정하였다. 도 5는 MRSA 억제 유산균 바이셀라 비리데센스 2-T-2-20의 동결건조후 항균활성을 나타낸다. 도 5를 참조하면, 1,2 : 바이셀라 비리데센스 2-T-2-20 배양액 250mL 동결건조후 증류수 25mL을 첨가한 경우, 3,4 : 바이셀라 비리데센스 2-T-2-20 배양액 250mL 동결건조 및 증류수 25mL 가한 후 0.45μm필터로 여과한 경우, 5,6 : 바이셀라 비리데센스 2-T-2-20 배양액 250mL 동결건조후 증류수 25mL을 첨가한 경우, 7,8 : 바이셀라 비리데센스 2-T-2-20 배양액 250mL 동결건조 및 증류수 25mL 가한 후 초음파(sonication)로 세포파괴 후 0.45μm필터로 여과한 경우를 나타낸다. 이 때, 1, 2 및 5, 6에서 항균활성이 나타나는 것을 알 수 있다. 즉, 동결건조후 증류수 첨가시 MRSA 억제활성이 나타났으며, 이를 농축(10배)한 경우 활성 증가는 나타나지 않았는바, 이는 동결건조과정에서 바이셀라 비리데센스 2-T-2-20의 사멸 또는 활성저하가 나타난 것으로 생각되며, 여과나 세포파괴시 억제활성이 나타나지 않은 것으로 판단된다. 따라서, 바이셀라 비리데센스 2-T-2-20의 생존여부가 MRSA 억제활성에 크게 영향을 미치는 것으로 나타났다.

실시예 3. 배양액의 가축 급여

바이셀라 비리데센스 2-T-2-20를 엠알에스 브로스(MRS broth)에 배양하여 번식돈 3두(145~170kg)에 매일 두당 100mL씩 사료에 혼합하여 일주일간 급여하였다. 도 6에는 바이셀라 비리데센스 2-T-2-20 배양액 급여시험에 사용된 가축(돼지)의 사진이 나타나 있다.

도 7은 바이셀라 비리데센스 2-T-2-20 급여 전후 돼지 분변 내 유산균수 변화 그래프를 나타낸다. 도 8은 마찬가지로 상기 균주 처리 전후 돼지 분변 내 포도상구균수를 나타내며, 도 9는 동일 균주의 처리 전후 항생제 저항성 포도상구균수 변화를 나타낸다.

바이셀라 비리데센스 2-T-2-20의 급여전과 급여후 돼지 분변의 미생물을 분석한 결과, 유산균 수(BCP agar에서 노랑색 콜로니)는 1.5×10⁸ CFU/g에서 1.8×10⁹ CFU/g으로 약 10배 증가한 반면, 포도상구균수(Baird Parker agar 콜로니)는 1.4×10⁸ CFU/g에서 2.1×10⁶ CFU/g으로 약 1/100으로, 항생제 저항성 포도상구균수(CHROMagar MRSA)는 8.6×10⁴ CFU/g에서 3.7×10³ CFU/g으로 약 1/20으로 감소한 것으로 나타났다.

결론적으로, 바이셀라 비리데센스(Weissella viridescens) 2-T-2-20 배양액 1 mL 당 반코마이신 100 ug/mL 이상의 항생제 저항성 포도상구균(MRSA) 억제 효과를 나타내었으며, 돼지에 급여시 분변내 유산균수 10배 증가, 포도상구균수 1/100 감소, 항생제 저항성 포도상구균수 1/20 감소 효과를 나타내었으며, 이 균주를 프로바이오틱으로 활용할 경우, 인체 및 가축의 건강증진 효과를 기대할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

국립농업과학원 농업유전자원센터

KACC91550

20100511

SEQUENCE LISTING <110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Weissella viridescens for the growth inhibiting of antibiotic resistant Staphylococcus aureus(MRSA) <130> NPF18241 <160> 1 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1446 <212> DNA <213> Weissella viridescens <400> 1 ttagacggtt ggctcctaaa aggttacctc accggctttg ggtgttacaa actctcatgg 60 tgtgacgggc ggtgtgtaca agacccggga acgtattcac cgcggcgtgc tgatccgcga 120 ttactagcga ttccgacttc atgtaggcga gttgcagcct acaatccgaa ctgagacaag 180 ttttaagaga ttcgcgtacc ctcgcgggtt agctgctcgt tgtacttgcc attgtagcac 240 gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt 300 ttgtcaccgg cagtctcact agagtgccca actgaatgct ggcaactagt aataagggtt 360 gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc 420 acctgtcact ttgtccccga agggaaagct tcatctctga agtggtcaaa ggatgtcaag 480 acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg 540 tccccgtcaa ttcctttgag tttcaacctt gcggtcgtac tccccaggcg gagtgcttaa 600 tgcgttagct gcgacactta agggcggaaa ccctcaaaca tctagcactc atcgtttacg 660 gtgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctacccac actttcgagc ctcaacgtca 720 gttacagtcc agagagccgc cttcgccact ggtgttcttc catatatcta cgcatttcac 780 cgctacacat ggagttccac tctcctctac tgcactcaag ttatccagtt tccaaagcac 840 ttccacagtt aagctgtggg ctttcacttc ggacttaaat aaccgtctgc gctcgcttta 900 cgcccaataa atccggataa cgcttggaac atacgtatta ccgcggctgc tggcacgtat 960 ttagccgttc ctttctggta agataccgtc acacactgaa cagttactct caatgtcatt 1020 cttctcttac aacagtgttt tacgagccga aacccttcat cacacacgcg gcgttgctcc 1080 atcagacttt cgtccattgt ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtatgggcc 1140 gtgtctcagt cccattgtgg ccgatcagtc tctcaactcg gctatgtatc attgccttgg 1200 taagccatta ccttaccaac tagctaatac accgcgggac catctcttag tgatagcaag 1260 accatctttt aactaataac catgcggtta ttagtgttat acggtattag cacttgtttc 1320 caagtgttat cccctgctaa gaggtaggtt tcccacgtgt tactcacccg ttcgccactc 1380 tttgcaatgt ccatcgtcat atctgagcaa gctcttcaaa tcagttggac cacaaagcgt 1440 tcgact 1446

Claims

항생제 저항성 포도상구균(MRSA)억제능을 갖는 수탁번호 KACC91550의 바이셀라 비리데센스(Weissella viridescens ) 2-T-2-20 유산균.
제1항의 유산균 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물.
제2항에 있어서, 사료용 또는 식품용 첨가제로 사용되는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱 조성물.
제2항에 있어서, 약학적 담체 및 부형제를 추가로 포함하는 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 프로바이오틱 조성물.