KR20120034605A - Ｃ６ｏｒｆ１６７ 펩티드 및 이를 포함한 백신 - Google Patents

Ｃ６ｏｒｆ１６７ 펩티드 및 이를 포함한 백신 Download PDF

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KR20120034605A
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유수케 나카무라
야타로 다이고
타쿠야 쯔노다
류지 오사와
사치코 요시무라
토모히사 와타나베
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온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 암에 대한 펩티드 백신을 기술한다. 특히, CTL을 유도할 수 있는 C6orf167 유전자로부터 유래한 에피토프 펩티드(epitope peptide)를 제공한다. 또한, 항원-제시 세포 및 상기 펩티드를 표적으로 하는 분리된 CTL 뿐만 아니라 항원-제시 세포, 또는 CTL을 유도하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 C6orf167로부터 유래한 펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴크레오티드를 활성 성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 나아가, 본 발명은 암(종양)을 치료 및/또는 예방(즉, 방지), 및/또는 그것의 수술 후 재발의 방지, 뿐만 아니라 C6orf167로부터 유래한 펩티드, 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 펩티드를 제시하는 항원-제시 세포, 본 발명의 약학적 조성물을 이용하여 CTL을 유도하는 방법, 항-종양 면역성을 유도하는 방법을 제공한다.

Description

Ｃ６ＯＲＦ１６７ 펩티드 및 이를 포함한 백신{C６ORF１６７ peptides and vaccines containing the same}
본 출원은 2009년 4월 1일에 출원된 미국 가출원 제 61/211.700호에 대한 우선권을 주장하며, 전체 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 생물과학 분야, 보다 구체적으로 암 치료 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암 백신으로서 효과적인 신규한 펩티드 및 종양을 치료 및 예방하기 위한 약물, 및 종양을 진단하기 위한 방법에 관한 것이다.
CD8 양성 세포독성 T 림프구(CD8 positive cytotoxic T lymphocytes; CTLs)는 주조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 종류 I 분자에서 발견되는 종양관련 항원(tumor-associated antigens, TAA)에서 유래한 에피토프 펩티드(epitope peptide)를 인지한 후, 종양세포를 사멸시키는 것으로 알려져 있다. TAA의 첫 번째 예로 흑색종 항원(melanoma antigen, MAGE) 패밀리의 발견 이후, 다른 많은 TAA가 주로 면역학적 접근을 통해 발견되었다[비특허문헌 1/ Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; 비특허문헌 2/ Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9]. 상기 TAA 중 일부는 현재 면역치료법의 표적으로서 임상 개발 과정에 있다.
강력하고 특이적인 항종양 면역반응을 유도할 수 있는 새로운 TAA를 동정함으로써, 다양한 종류의 암에 대한 펩티드 백신 전략의 임상적인 응용 및 발전이 보장된다[비특허문헌 3/ Harris CC, J Natl Cancer Inst 1999 Oct 16, 88(20): 1442-55; 비특허문헌 4/ Butterfield LH et al, Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; 비특허문헌 5/ Vissers JL et al, Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; 비특허문헌 6/ Van der Burg SH et al, J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; 비특허문헌 7/ Tanaka F et al, Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; 비특허문헌 8/ Fujie T et al, Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; 비특허문헌 9/ Kikuchi M et al, Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; 비특허문헌 10/ Oiso M et al, Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94]. 현재까지, 이러한 종양관련 항원 유래 펩티드를 이용한 몇몇의 임상 실험에 대한 보고가 있다. 불행히도, 지금까지 암 백신 실험에서 매우 낮은 목표 반응이 나타나고 있다[비특허문헌 11/ Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; 비특허문헌 12/ Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; 비특허문헌 13/ Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15]. 그러므로, 면역치료법 표적으로서 유용할 것으로 기대되는 신규한 TAA의 동정이 요구된다.
지금까지, 유전자 발현 프로파일의 분석을 통해서 유전체 범위의 cDNA 마이크로어레이(microarray)를 사용하여 상향조절되는 많은 유전자가 소세포성 폐암(small lung cancer; SCLC) (특허문헌 1/WO2007/013665) 및 식도암(esophageal cancers) (특허문헌 2/WO2007/013671)에서 발견되었다. 상기 유전자는 그들 중에서 면역치료법 표적으로서 좋은 후보를 동정하려는 희망과 함께 상세히 조사되어 왔다. 면역치료법에서 특별하게 암세포를 표적시키기 위해서, 바람직한 TAA는 정상의 건강한 조직에 의해서는 발현되지 않거나 제한되고, 주로 암세포에 의해 발현되어야 한다.
염색체 6 오픈 리딩 프레임 167(open reading frame; C6orf167)는 포유류 유전자 모음의 cDNA 라이브러리 스크리닝을 통해서 동정되었다(비특허문헌 14/MGC Program Team, Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Dec 24; 99 (26):16899-903). C6orf167는 상기 언급된 분석에서 동정된 상향조절된 유전자 중 하나이다. 하지만, 암의 진단 및/또는 치료를 위한 이용가능성은 아직 확인되지 않았다.
본 발명은 신규한 암 마커 C6orf167 및 항원성 펩티드(antigenic peptide)를 이용한 암에 대한 치료법을 제공함으로써 당업계에서 개선된 암 진단 및 치료를 위한 요구를 공개한다.
WO2007/013665 WO2007/013671
Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80 Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9 Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55 Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42 Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9 Van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14 Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8 Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72 Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66 Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94 Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80 Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42 Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15 MGC Program Team, Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Dec 24; 99 (26):16899-903
[본 발명의 개요]
본 발명은 암 치료법 및 암을 탐지하거나 또는 진단하기 위한 방법에 적절한 신규한 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은, 최소한 부분적으로, 면역치료법의 표적으로서 신규한 펩티드의 발견에 기초한다. TAA(tumor-associated antigen)는 일반적으로 면역계에 의해 "자기(self)"로 인지되어 종종 내재 면역성을 갖지 않기 때문에, 적절한 표적의 발견은 매우 중요하다. 본 발명을 통해, 유전자뱅크 어세션 넘버. NM 198469.2(서열 번호: 158)의 유전자에 의해 암호화되는 C6orf167은 특이적으로 방광암(bladder cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 간내담도암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수 백혈병(chornic myelogenous leukemia; CML), 식도암(esophageal cancer), 위암(gastric cancer), 위 확산형 암(gastric diffuse-type cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 골육종(osteosarcoma), 신장암(renal carcinoma), 폐 선암(lung adenocarcinoma; ADC), 폐편평상피암(lung squamous cell carcinoma; SCC), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer; SCLC), 비소세포성 폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC), 연조직 종양(soft tissue tumor), 및 고환 종양(testicular tumor)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 암세포에서 과발현되는 것이 나타났고 면역치료법의 표적을 위한 후보이다.
또한, 본 발명은 C6orf167 특이적인 CTL을 유도하는 능력을 가지는 C6orf167 유전자 생산물의 특이적 에피토프 펩티드(epitope peptide)의 동정에 기초한다. 하기에 기재한 것과 같이, 건강한 공여자로부터 수득된 말초 혈액 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)는 C6orf167에서 유래된 HLA-A*2402 또는 HLA-A*0201에 결합하는 후보 펩티드를 사용하여 자극되었다. 그런 다음 각 후보 펩티드를 부가(pulsed)하여 HLA-A24 또는 HLA-A2 양성 표적 세포에 대하여 특이적 세포 독성을 갖는 CTL 세포주가 확립되었다. 상기 결과는 상기 펩티드가 C6orf167을 발현하는 세포에 대해 강력하고 특이적 면역반응을 유도할 수 있는 HLA-A24 또는 HLA-A2에 제한된 에피토프(epitope) 펩티드임을 증명한다. 또한, 상기 결과는 C6orf167은 강한 면역반응을 유도하고 그것의 에피토프는 종양 면역치료법에 효과적인 표적임을 가르킨다.
따라서, 본 발명의 목적은 HLA 항원에 결합하는 분리된 펩티드, 특히 C6orf167(서열 번호: 158)를 포함하는 펩티드 또는 면역학적 활성 단편을 제공하는 것이다. 상기 펩티드는 CTL 유도성을 가질 것으로 기대되고, 따라서 생체 외(ex vivo)에서 CTL을 유도하기 위해 사용될 수 있고 또는 방광암, 자궁경부암, 간내담도암, 만성 골수 백혈병, 식도암, 위암, 위 확산형 암, 폐암, 림프종, 골육종, 신장암, 폐 선암, 폐편평상피암, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 연조직 종양, 및 고환 종양을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 암에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 개체에 투여될 때 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 펩티드들은 일반적으로 노나펩티드(nonapeptides) 또는 데카펩티드(decapeptides)이고, 보다 바람직하게는, 서열 번호: 1 내지 61 및 63 내지 151로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것이다. 특히, 서열 번호: 2, 4, 7, 8, 9, 14, 16, 18, 22, 25, 26, 30, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 41, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 53, 65, 66, 76, 79, 84, 101, 110, 111, 112, 113, 114, 117, 118, 121, 122, 123, 및 124로부터 선택된 아미노 서열을 갖는 펩티드가 가장 바람직하다.
본 발명의 펩티드는 변형된 펩티드가 원래의 CTL 유도성을 가지고 있는 한, 1, 2 또는 그 이상의 아미노산이 치환 또는 첨가된 것을 특징으로 하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드 중 어떤 하나를 암호화하는 하는 분리된 폴리뉴클레오티드(polynucleotides)를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 CTL 유도성을 갖는 항원-제시 세포(antigen presenting cells, APC)를 유도하거나 또는 본 발명의 펩티드와 같은 암에 대한 면역반응을 유도하기 위해 개체 내에 투여되기 위해 사용될 수 있다.
개체 내 투여될 때, 본 발명의 펩티드는 각각의 펩티드를 표적으로 하는 CTL을 유도하기 위하여 바람직하게 APC의 표면에 제시된다.
방광암(bladder cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 간내담도암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수 백혈병(chornic myelogenous leukemia; CML), 식도암(esophageal cancer), 위암(gastric cancer), 위 확산-형암(gastric diffuse-type cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 골육종(osteosarcoma), 신장암(renal carcinoma), 폐 선암(lung adenocarcinoma; ADC), 폐편평상피암(lung squamous cell carcinoma; SCC), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer; SCLC), 비소세포성 폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC), 연조직 종양(soft tissue tumor), 및 고환 종양(testicular tumor)을 포함하지만 이로 제한되지 않는 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발을 방지하는데 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발을 방지하기 위해서 약학적 조성물 또는 물질을 제공하는데, 이는 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 중 어느 것을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물 또는 물질은 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 대신에/뿐만 아니라 본 발명의 펩티드를 나타내는 APC 또는 엑소솜(exosome)을 유효성분으로서 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 CTL을 유도하는 조성물, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드를 포함하는 상기 조성물, 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드을 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 암을 치료 및/또는 예방하기 위한 것 뿐만 아니라 수술 후 재발을 막기 위하여 제조된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드, 또는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물을 제공하고, 상기 암은 방광암, 자궁경부암, 간내담도암, 만성 골수 백혈병, 식도암, 위암, 위 확산형 암, 폐암, 림프종, 골육종, 신장암, 폐 선암, 폐편평상피암, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 연조직 종양, 및 고환 종양을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 표면에 나타내는 APC를 유도할 수 있는데, 예를 들면, 본 발명의 펩티드에 개체에서 유래한 APC를 접촉시킴으로써 또는 이러한 APC는 표적 펩티드에 대하여 높은 CTL 유도성을 가지며 암 면역치료법에 대해 유용하다. 따라서, 본 발명은 CTL 유도성을 갖는 APCs 및 상기 방법에 의해 수득된 APCs를 유도하는 방법을 포함한다.
또한, 본 발명의 목적은 CTL 유도성을 갖는 항원-제시 세포(APC)를 유도하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 APC를 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하거나, 또는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC로 도입하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명은 HLA 항원 및 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드 복합체를 표면에 제시하는 APCs와 함께 CD8 양성 세포를 공배양(co-culture)하는 단계, HLA 항원 및 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드 복합체를 표면에 제시하는 엑소솜와 함께 CD8 양성 세포를 공배양(co-culture)하는 단계, 본 발명의 펩티드와 결합하는 T 세포 수용체(T cell receptor; TCR) 폴리펩티드를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포한하는 유전자를 도입시키는 단계를 포함하는 CTL 유도 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 APC 표면에 제시하는 분리된 APC를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 표적으로 하는 분리된 CTL을 제공한다. 상기 APC 및 CTL은 암 면역치료법을 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 목적은 필요한 개체 내에서 암에 대해 면역반응을 유도하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 필요한 개체 내에서 암을 진단하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 (a) 개체에서 유래된 생물학적 샘플에서 C6orf167 유전자의 발현 정도를 결정하는 단계, 및 (b) 개체의 유전자 정상 대조군 발현 정도와 비교하여 단계 (a)에서 나타난 유전자 발현이 증가된 것 암의 존재를 관련시키는 단계를 포함한다. 바람직하게, C6orf167의 발현 정도는 C6orf167의 mRNA 또는 단백질, 또는 C6orf167 단백질의 생물학적 활성을 탐지하는 것에 의하여 결정된다.
본 발명의 또 다른 목적은 암을 진단하기 위해 사용하는 키트를 제공하는 것으로, 상기 키트는 C6orf167 mRNA를 탐지하기 위한 시약, C6orf167 단백질을 탐지하기 위한 시약, 또는 C6orf167 단백질의 생물학적 활성을 탐지하는 시약을 포함한다.
본 발명의 적용가능성은 C6orf167의 과발현으로부터 나타나는 C6orf167와 관련된 많은 질병에 적용이 가능하며, 상기 암은 방광암, 자궁경부암, 간내담도암, 만성 골수 백혈병, 식도암, 위암, 위 확산형 암, 폐암, 림프종, 골육종, 신장암, 폐 선암, 폐편평상피암, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 연조직 종양, 및 고환 종양을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
상기 뿐만 아니라, 본 발명의 또 다른 목적은 도면 및 실시예를 포함하는 하기 자세한 묘사를 읽을 때, 보다 전체적으로 명백해질 것이다. 하지만, 본 발명의 상기 요약 및 하기의 자세한 묘사는 실시예이고, 본 발명이나 또는 본 발명의 다른 대안적 실시예를 제한하지 않는다. 특히, 본 발명이 여기에서 많은 구체적 실시예와 함께 기술되지만, 그 기술은 본 발명의 예일 뿐, 본 발명을 제한하지 않는다. 본 발명의 뜻(spirit) 및 범위(scope) 내에서, 첨부된 청구항에 의해 기술된 것과 같이 다양한 변형 및 적용이 당업자에게 일어날 수 있다. 동일하게, 본 발명의 다른 목적, 특징, 유용성(benefit) 및 이점(advantages)는 상기 요약 및 하기에 기술된 특정 실시예로부터 명백해질 것이고, 용이하게 당업자에게도 명백할 것이다. 상기 목적, 특징, 유용성 및 이점은 동반되는 실시예, 데이터, 도면 및 그로부터 가능한 모든 타당한 추론과 함께, 단독으로, 또는 여기서 통합된 참조문헌의 고려와 함께 상기로부터 명백할 것이다.
본 발명의 다양한 측면 및 적용은 도면에 간단한 설명, 본 발명의 자세한 설명 및 그의 뒤따르는 바람직한 실시예의 고려하에 당업자에게 명백해질 것이다.
[도 1의 a-j] 도 1의 a-j는 C6orf167으로부터 유래된 펩티드로 유도된 CTL에대한 IFN-감마(gamma) ELISPOT 검사법(assay)의 결과를 나타낸 광 그래프 (a)-(j)의 시리즈로 구성되었다. 대조군과 비교하여 강력한 IFN-감마 생선을 보이는 웰 번호에 있는 CTL은 하기와 같다: C6orf167-A24-9-179 (서열 번호: 2)로 자극한 #1(a), C6orf167-A24-9-404 (서열 번호: 4)로 자극한 #1 및 #3(b), C6orf167-A24-9-236 (서열 번호: 7)로 자극한 #4(c), C6orf167-A24-9-480 (서열 번호: 8)로 자극한 #1 및 #7(d), C6orf167-A24-9-1170 (서열 번호: 9)로 자극한 #7(e), C6orf167-A24-9-9 (서열 번호: 14)로 자극한 #5(f), C6orf167-A24-9-530 (서열 번호: 16)로 자극한 #3 및 #4(g), C6orf167-A24-9-315 (서열 번호: 18)로 자극한 #5(h), C6orf167-A24-9-132 (서열 번호: 22)로 자극한 #3(i), 및 C6orf167-A24-9-851 (서열 번호: 25)로 자극한 #1 및 #7(j). 직사각형으로 표시된 각 웰에 있는 세포는 CTL 세포주로 수립되기 위해 증식되었다. 상기 도에서 "+"는 적절한 펩티드가 부가(pulsed)된 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미하고, "-"는 어떠한 펩티드도 부가되지 않은 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미한다.
[도 1의 k-t] 도 1의 k-t는 C6orf167으로부터 유래된 펩티드로 유도된 CTL에대한 IFN-감마(gamma) ELISPOT 검사법(assay)의 결과를 나타낸 광 그래프 (k)-(t)의 시리즈로 구성되었다. 대조군과 비교하여 강력한 IFN-감마 생선을 보이는 웰 번호에 있는 CTL은 하기와 같다: C6orf167-A24-9-55 (서열 번호: 26)로 자극된 #3 및 #6(k), C6orf167-A24-9-220 (서열 번호: 30)로 자극된 #1 및 #2(l), C6orf167-A24-10-626 (서열 번호: 33)로 자극된 #4 및 #8(m), C6orf167-A24-10-429 (서열 번호: 34)로 자극된 #1(n), C6orf167-A24-10-917 (서열 번호: 35)로 자극된 #1 및 #5(o), C6orf167-A24-10-474 (서열 번호: 36)로 자극된 #4 및 #5(p), C6orf167-A24-10-254 (서열 번호: 38)로 자극된 #4(q), C6orf167-A24-10-194 (서열 번호: 39)로 자극된 #2(r), C6orf167-A24-10-956 (서열 번호: 41)로 자극된 #7(s), C6orf167-A24-10-511 (서열 번호: 43)로 자극된 #3(t). 직사각형으로 표시된 각 웰에 있는 세포는 CTL 세포주로 수립되기 위해 증식되었다. 상기 도에서 "+"는 적절한 펩티드가 부가(pulsed)된 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미하고, "-"는 어떠한 펩티드도 부가되지 않은 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미한다.
[도 1의 u-z] 도 1의 u-z는 C6orf167으로부터 유래된 펩티드로 유도된 CTL에대한 IFN-감마(gamma) ELISPOT 검사법(assay)의 결과를 나타낸 광 그래프 (u)-(z)의 시리즈로 구성되었다. 대조군과 비교하여 강력한 IFN-감마 생선을 보이는 웰 번호에 있는 CTL은 하기와 같다: C6orf167-A24-10-315 (서열 번호: 44)로 자극된 #3(u), C6orf167-A24-10-598 (서열 번호: 45)로 자극된 #2(v), C6orf167-A24-10-966 (서열 번호: 47)로 자극된 #1 및 #3(w), C6orf167-A24-10-66 (서열 번호: 48)로 자극된 #7(x), C6orf167-A24-10-914 (서열 번호: 49)로 자극된 #3 (y) 및 C6orf167-A24-10-851 (서열 번호: 53)로 자극된 #2(z). 직사각형으로 표시된 각 웰에 있는 세포는 CTL 세포주로 수립되기 위해 증식되었다. 상기 도에서 "+"는 적절한 펩티드가 부가(pulsed)된 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미하고, "-"는 어떠한 펩티드도 부가되지 않은 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미한다.
[도 2의 a-h] 도 2의 a-h는 서열 번호: 2(a), 서열 번호: 4(b), 서열 번호: 7(c), 서열 번호: 8(d), 서열 번호: 9(e), 서열 번호: 16(f), 서열 번호: 22(g), 및 서열 번호: 25(h)로 자극된 CTL 세포주의 IFN-감마 생성을 나타내는 IFN-감마 ELISA의 결과를 나타낸 선 그래프 (a)-(h)의 시리즈로 구성되었다. 상기 결과는 각각의 펩티드로 자극되어 수립된 CTL 세포주가 그 대조군과 비교하여 강력한 IFN-감마 생산을 보인다는 것을 나타낸다. 상기 도에서 "+"는 적절한 펩티드가 부가(pulsed)된 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미하고, "-"는 어떠한 펩티드도 부가되지 않은 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미한다.
[도 2의 i-n] 도 2의 i-n은 서열 번호: 26(i), 서열 번호: 30(j), 서열 번호: 33(k), 서열 번호: 35(l), 서열 번호: 44(m) 및 서열 번호: 49(n)로 자극되어 수립된 CTL 세포주의 IFN-감마 생성을 나타내는 IFN-감마 ELISA의 결과를 나타낸 선 그래프 (i)-(n)의 시리즈로 구성되었다. 상기 도에서 "+"는 적절한 펩티드가 부가(pulsed)된 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미하고, "-"는 어떠한 펩티드도 부가되지 않은 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미한다.
[도 3] 도 3은 서열 번호: 2(a), 서열 번호: 4(b), 서열 번호: 7(c), 서열 번호: 9(d), 서열 번호: 16(e) 및 서열 번호: 30(f)으로 자극되어 수립된 CTL 세포주의 IFN-감마 생성을 나타내는 IFN-감마 ELISA의 결과를 나타낸 선 그래프 (a)-(f)의 시리즈로 구성되었다. 상기 도에서, "+"는 서열 번호: 2(a), 서열 번호: 4(b), 서열 번호: 7(c), 서열 번호: 9(d), 서열 번호: 16(e) 및 서열 번호: 30(f)가 부가(pulsed)된 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미하고, "-"는 어떠한 펩티드도 부가되지 않은 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미한다.
[도 4] 도 4는 외재적으로 C6orf167 및 HLA-A*2402를 발현하는 표적 세포에 대한 특이적 CTL 활성을 나타내는 선 그래프 (a) 내지 (d)의 시리즈로 구성된다. HLA-A*2402 또는 C6orf167 유전자의 전장(full-length)으로 형질도입(transfected)된 COS7 세포는 대조군으로서 준비되었다. C6orf167-A24-9-179 (서열 번호: 2) (a), C6orf167-A24-9-236 (서열 번호: 7) (b), C6orf167-A24-9-1170 (서열 번호: 9) (c) and C6orf167-A24-10-626 (서열 번호: 33) (d)로 수립된 상기 CTL 클론은 C6orf167 및 HLA-A*2402(검정 마름모) 모두로 형질도입된 COS7세포에 대한 특이적 CTL 활성을 보였다. 반면에, HLA-A*2402(삼각형) 또는 C6orf167(원) 중 하나를 발현하고 있는 표적세포에 대한 유의한 특이적 CTL 활성은 탐지되지 않는다.
[도 5] 도 5는 종양 조직, 세포주 및 정상 조직에서 C6orf167 발현의 분석적 결과를 나타낸다. 부분 A(part A)는 15개의 임상 폐암 샘플[폐 선암(lung adenocarcinoma; ADC), 폐편평상피암(lung squamous cell carcinoma; SCC), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer; SCLC); 위], 10개의 임상 식도암 샘플(위 패널), 15개의 폐암 세포주 및 10개의 식도암 세포주(아래 패널)에서 반정량(semiquantitative) RT-PCR 분석에 의해 탐지된 C6orf167의 발현을 나타낸다. 패널 B는 16개의 정상 인간 조직에서 C6orf167 전사체의 노던 블랏 분석(Nothern blot analysis)을 나타낸다. 양성 신호는 고환(testis) 및 소장(small intestine)에서만 관찰되었다.
[도 6의 a-f] 도 6의 a-f는 C6orf167으로부터 유래된 펩티드로 유도된 CTL에대한 IFN-감마(gamma) ELISPOT 검사법(assay)의 결과를 나타낸 광 그래프 (a) 내지 (f)의 시리즈로 구성되었다. 대조군과 비교하여 강력한 IFN-감마 생선을 보이는 웰 번호에 있는 CTL은 하기와 같다: C6orf167-A02-9-855 (서열 번호: 65)로 자극한 #4(a), C6orf167-A02-9-131 (서열 번호: 66) (b)로 자극한 #6, C6orf167-A02-9-887 (서열 번호: 76)로 자극한 #4(c), C6orf167-A02-9-261 (서열 번호: 79)로 자극한 #6(d), C6orf167-A02-9-484 (서열 번호: 84)로 자극한 #7(e), 및 C6orf167-A02-10-535 (서열 번호: 101)로 자극한 #1,#3 및 #6(f). 직사각형으로 표시된 웰에 있는 세포는 CTL 세포주를 수립하기 위하여 증식하였다. 반면에, 전형적인 음성 데이터와 같이, C6orf167-A02-9-918 (서열 번호: 62) (s)로 자극된 CTL에서는 특이적 IFN-감마 생산이 관찰되지 않았다. 상기 도에서 "+"는 적절한 펩티드가 부가(pulsed)된 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미하고, "-"는 어떠한 펩티드도 부가되지 않은 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미한다.
[도 6의 g-l] 도 6의 g-l는 C6orf167으로부터 유래된 펩티드로 유도된 CTL에대한 IFN-감마(gamma) ELISPOT 검사법(assay)의 결과를 나타낸 광 그래프 (g) 내지 (l)의 시리즈로 구성되었다. 대조군과 비교하여 강력한 IFN-감마 생선을 보이는 웰 번호에 있는 CTL은 하기와 같다: C6orf167-A02-10-527 (서열 번호: 110)로 자극된 #1(g), C6orf167-A02-10-10 (서열 번호: 111)로 자극된 #3(h), C6orf167-A02-10-577 (서열 번호: 112)로 자극된 #5(i), C6orf167-A02-10-128 (서열 번호: 113)로 자극된 #5 및 #7(j), C6orf167-A02-10-622 (서열 번호: 114)로 자극된 #4(k), 및 C6orf167-A02-10-47 (서열 번호: 116)로 자극된 #1(l). 직사각형으로 표시된 웰에 있는 세포는 CTL 세포주를 수립하기 위하여 증식하였다. 반면에, 전형적인 음성 데이터와 같이, C6orf167-A02-9-918 (서열 번호: 62) (s)로 자극된 CTL에서는 특이적 IFN-감마 생산이 관찰되지 않았다. 상기 도에서 "+"는 적절한 펩티드가 부가(pulsed)된 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미하고, "-"는 어떠한 펩티드도 부가되지 않은 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미한다.
[도 6의 m-r] 도 6의 m-r은 C6orf167으로부터 유래된 펩티드로 유도된 CTL에서 IFN-감마(gamma) ELISPOT 검사법(assay)의 결과를 나타낸 광 그래프 (g) 내지 (l)의 시리즈로 구성되었다. 대조군과 비교하여 강력한 IFN-감마 생선을 보이는 웰 번호에 있는 CTL은 하기와 같다: C6orf167-A02-10-219 (서열 번호: 117)로 자극된 #1(m), C6orf167-A02-10-1155 (서열 번호: 118)로 자극된 #3(n), C6orf167-A02-10-606 (서열 번호: 121)로 자극된 #7(o), C6orf167-A02-10-290 (서열 번호: 122)로 자극된 #6(p), C6orf167-A02-10-262 (서열 번호: 123)로 자극된 #6(q) 및 C6orf167-A02-10-965 (서열 번호: 124)로 자극된 #8(r). 직사각형으로 표시된 웰에 있는 세포는 CTL 세포주를 수립하기 위하여 증식하였다. 반면에, 전형적인 음성 데이터와 같이, C6orf167-A02-9-918 (서열 번호: 62) (s)로 자극된 CTL에서는 특이적 IFN-감마 생산이 관찰되지 않았다. 상기 도에서 "+"는 적절한 펩티드가 부가(pulsed)된 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미하고, "-"는 어떠한 펩티드도 부가되지 않은 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미한다.
[도 6의 s] 도 6의 s는 C6orf167으로부터 유래된 펩티드로 유도된 CTL에서 IFN-감마(gamma) ELISPOT 검사법(assay)의 결과를 나타낸 결과를 나타낸다. 전형적인 음성 데이터와 같이, C6orf167-A02-9-918 (서열 번호: 62) (s)로 자극된 CTL에서는 특이적 IFN-감마 생산이 관찰되지 않았다. 상기 도에서 "+"는 적절한 펩티드가 부가(pulsed)된 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미하고, "-"는 어떠한 펩티드도 부가되지 않은 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미한다.
[도 7의 a-d] 도 7의 a-d는 C6orf167-A02-9-855 (서열 번호: 65) (a), C6orf167-A02-9-131 (서열 번호: 66) (b), C6orf167-A02-9-887 (서열 번호: 76) (c), 및 C6orf167-A02-9-261 (서열 번호: 79) (d)로 자극한 CTL 세포주의 IFN-감마 생산을 IFN-감마 ELISA 검사에 의하여 나타낸 선 그래프 (a) 내지 (d)의 시리즈로 구성되어 있다. 상기 결과는 각각의 펩티드로 자극되어 수립된 CTL 세포주가 대조군과 비교하여 강력한 IFN-감마 생산을 보인다는 것을 나타낸다. 상기 도에서 "+"는 적절한 펩티드가 부가(pulsed)된 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미하고, "-"는 어떠한 펩티드도 부가되지 않은 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미한다.
[도 7의 e-j] 도 7의 e-j는 C6orf167-A02-9-484 (서열 번호: 84) (e), C6orf167-A02-10-535 (서열 번호: 101) (f), C6orf167-A02-10-527 (서열 번호: 110) (g), C6orf167-A02-10-10 (서열 번호: 111) (h), C6orf167-A02-10-577 (서열 번호: 112) (i), 및 C6orf167-A02-10-128 (서열 번호: 113) (j)에 의해 자극된 CTL 세포주의 IFN-감마 생산을 IFN-감마 ELISA 검사에 의하여 나타낸 선 그래프 (e) 내지 (f)의 시리즈로 구성되어 있다. 상기 결과는 각각의 펩티드로 자극되어 수립된 CTL 세포주가 대조군과 비교하여 강력한 IFN-감마 생산을 보인다는 것을 나타낸다. 상기 도에서 "+"는 적절한 펩티드가 부가(pulsed)된 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미하고, "-"는 어떠한 펩티드도 부가되지 않은 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미한다.
[도 7의 k-n] 도 7의 k-n는 C6orf167-A02-10-622 (서열 번호: 114) (k), C6orf167-A02-10-219 (서열 번호: 117) (l), C6orf167-A02-10-290 (서열 번호: 122) (m) and C6orf167-A02-10-262 (서열 번호: 123) (n)에 의해 자극된 CTL 세포주의 IFN-감마 생산을 IFN-감마 ELISA 검사에 의하여 나타낸 선 그래프 (k) 내지 (n)의 시리즈로 구성되어 있다. 상기 결과는 각각의 펩티드로 자극되어 수립된 CTL 세포주가 대조군과 비교하여 강력한 IFN-감마 생산을 보인다는 것을 나타낸다. 상기 도에서 "+"는 적절한 펩티드가 부가(pulsed)된 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미하고, "-"는 어떠한 펩티드도 부가되지 않은 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미한다.
[도 8의 a-f] 도 8의 a-f는 C6orf167-A02-9-855 (서열 번호: 65) (a), C6orf167-A02-9-131 (서열 번호: 66) (b), C6orf167-A02-9-887 (서열 번호: 76) (c), C6orf167-A02-9-261 (서열 번호: 79) (d), C6orf167-A02-9-484 (서열 번호: 84) (e), and C6orf167-A02-10-535 (서열 번호: 101) (f)에 의해 자극된 CTL 세포주로부터 제한된 희석에 의해 수립된 CTL 클론의 IFN-감마 생산을 나타낸 선 그래프 (a) 내지 (f)의 시리즈로 구성되어 있다. 상기 결과는 각각의 펩티드로 자극되어 수립된 CTL 세포주가 대조군과 비교하여 강력한 IFN-감마 생산을 보인다는 것을 나타낸다. 상기 도에서 "+"는 적절한 펩티드가 부가(pulsed)된 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미하고, "-"는 어떠한 펩티드도 부가되지 않은 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미한다.
[도 8의 g-i] 도 8의 g-i는 C6orf167-A02-10-527 (서열 번호: 110) (g), C6orf167-A02-10-10 (서열 번호: 111) (h), C6orf167-A02-10-128 (서열 번호: 113) (i) and C6orf167-A02-10-622 (서열 번호: 114) (j)에 의해 자극된 CTL 세포주로부터 제한된 희석에 의해 수립된 CTL 클론의 IFN-감마 생산을 나타낸 선 그래프 (g) 내지 (h)의 시리즈로 구성되어 있다. 상기 결과는 각각의 펩티드로 자극되어 수립된 CTL 세포주가 대조군과 비교하여 강력한 IFN-감마 생산을 보인다는 것을 나타낸다. 상기 도에서 "+"는 적절한 펩티드가 부가(pulsed)된 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미하고, "-"는 어떠한 펩티드도 부가되지 않은 표적세포에 대한 IFN-감마의 생성을 의미한다.
[도 9] 도 9는 C6orf167 및 HLA-A*0201를 외재적으로 발현하는 표적 세포에 대한 특이적 CTL 활성을 나타내는 선 그래프 (a) 및 (b)로 구성된다. HLA-A*0201 또는 C6orf167 유전자의 전장으로 형질도입된 COS7 세포는 대조군으로서 제조되었다. C6orf167-A02-9-261 (서열 번호: 79) (a)로 수립된 상기 CTL 세포주 및 C6orf167-A02-10-622 (서열 번호: 114) (b)로 수립된 CTL 클론은 C6orf167 및 HLA-A*0201 (검정 마름모) 모두로 형질도입된 COS7 세포에 대한 특이적 CTL 활성을 보인다. 반면에, HLA-A*0201 (삼각형) 또는 C6orf167 (원) 중 하나를 발현하는 표적 세포에 대한 유의한 특이적 CTL 활성이 탐지되지 않았다.
비록 여기서 기술한 것과 유사하거나 또는 동등한 어떤 방법 및 재료가 본 발명의 실시예의 검사 또는 실행에서 사용될 수 있지만, 선호되는 방법, 장치, 및 재료는 여기서 기술된다. 하지만, 본 발명의 재료 및 방법을 기술하기 전에, 본 발명은 여기서 기술한 특정한 크기, 종류, 면적, 재료, 방법론, 프로토콜(protocol)로 제한되지 않는데, 이것은 그것들이 일반적인 실험 및 최적화에 따라 다양할 수 있기 때문이다. 또한, 본 기술에서 사용되는 전문용어(terminology)는 오직 실시예 또는 특정 version을 기술하려는 것이고, 이것은 오직 하기 청구항에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
I. 용어의 정의
본 발명에서 사용되는 용어 "a", "an", 및 "the"는 따로 명시되지 않는 한, "적어도 1개"를 의미한다.
본 발명에서 호환적으로 사용되는 용어 "폴리펩티드(polypeptide)", "펩티드(peptide)" 및 "단백질(protein)"은 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 변형된 잔기, 또는 자연적으로 발생한 아미노산 중합체(naturally occurring amino acid polymer)뿐만 아니라 자연적으로 발생한 아미노산에 상응하는 인공 화학 모방체(artificial chemical mimetic)와 같은 비자연적으로 발생한 잔기(non-naturally occurring residue)를 갖는 아미노산 중합체에 적용된다.
본 발명에서 사용되는 "아미노산(amino acid)"라는 용어는 자연적으로 발생한 아미노산과 비슷하게 기능하는 아미노산 유사체(analog) 및 아미노산 모방체 뿐만 아니라 자연적으로 발생한 및 합성(synthetic) 아미노산을 의미한다. 자연적으로 발생한 아미노산은 세포 안에서 번역(tranlation) 후에 변형된 것 뿐만 아니라 유전자코드에 의해 암호화된 것이다[예를 들면, 하이드록시프롤린(hydroxyproline), 감마-카복시글루탐산(γ-carboxyglutamate) 및 O-포스포세린(O-phosphoserine)]. 상기 용어 "아미노산 유사체"는 자연적으로 발생한 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조(수소, 카복실기, 아미노기 및 R기에 결합하는 α탄소)를 가지고 있지만, 변형된 R기 또는 변형된 골격(backbone)을 가지는 화합물을 의미한다[예를 들면, 호모세린(homoserine), 노르루신(norleucine), 메티오닌(methionine), 설폭사이드(sulfoxide), 메티오닌 메틸 설포니움(methionine methyl sulfonium)]. 상기 용어 "아미노산 모방체"는 서로 다른 구조를 갖지만, 일반적인 아미노산과 비슷한 기능이 있는 화학적 화합물을 의미한다.
아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명위원회가 권장하는, 일반적으로 알려진 3문자 약어(symbol) 또는 1문자 약어에 의해 불린다.
본 발명에서 사용된 용어 "유전자", "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", "뉴클레오티드" 및 "핵산"은 따로 명시되지 않는 한, 호환적으로 사용되며, 아미노산과 마찬가지로, 일반적으로 인정되는 1문자 코드에 의해 불린다.
여기서 사용되는 "조성물"이라는 용어는 구체적 양의 구체적 성분의 조합으로부터, 직접적으로 또는 간접적으로, 형성되는 어떠한 생산물 뿐만 아니라, 구체적 양의 구체적 성분을 포함하는 생산물을 포함한다. 약학적 조성물에 관련한 상기 용어는 활성 성분, 및 전달체로 구성된 비활성 성분을 포함하는 생산물, 뿐만 아니라 둘 또는 그 이상의 성분의 조합, 복합(complexation) 또는 집적(aggregation)으로부터, 또는 성분의 하나 또는 그 이상의 분리로부터, 또는 성분의 하나 또는 그 이상의 상호결합 또는 반응의 다른 종류로부터, 직접적으로 또는 간접적으로, 형성되는 어떤 생산물을 포함한다. 따라서, 본 발명의 본 발명의 화합물 및 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 전달체의 혼합에 의해 만들어진 어떤 약학적 조성물은 어떤 조성물을 포함한다. 여기서 사용되는 "약학적으로 허용가능한 전달체" 또는 "생리학적으로 허용가능한 전달체"라는 표현은 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 재료(material), 조성물, 물질 또는 수단(vehicle)을 의미하고, 이는 스카폴드된 폴리 약물 구조(scaffolded polypharmacophores) 물질을 한 기관(organ), 또는 신체의 한 부분으로부터 다른 기관, 또는 신체의 다른 부분으로 운반하거나 또는 수송하는데 관련된 액체 또는 고체 필러(filler), 희석제, 첨가제, 영제 또는 캡슐화 물질(encapsulating material)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
별도로 명시되지 않는 한, "암(cancer)"은 C6orf167 유전자가 과발현하는 암 또는 종양을 의미하고, 상기 암 또는 종양의 예는 방광암(bladder cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 간내담도암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수 백혈병(chornic myelogenous leukemia; CML), 식도암(esophageal cancer), 위암(gastric cancer), 위 확산형 암(gastric diffuse-type cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 골육종(osteosarcoma), 신장암(renal carcinoma), 폐 선암(lung adenocarcinoma; ADC), 폐편평상피암(lung squamous cell carcinoma; SCC), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer; SCLC), 비소세포성 폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC), 연조직 종양(soft tissue tumor), 및 고환 종양(testicular tumor)을 포함하지만, 이에 한정하지 않는다.
별도로 명시되지 않는 한, "세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte)", "세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)" 및 "CTL"이라는 용어는 호환되어 쓰이며 따로 명시되지 않는 한, 비자기 세포(non-self cell, 예를 들면 종양/암 세포, 바이러스에 감염된 세포)를 인식할 수 있고 이러한 세포의 사멸을 유도할 수 있는 T 림프구의 하위집단(sub-group)을 나타낸다.
별도로 명시되지 않는 한, "HLA-A24"이라는 용어는 HLA-A*2402와 같은 아형(subtype)을 포함하는 HLA-A2형을 의미한다.
별도로 명시되지 않는 한, 여기서 사용되는 "HLA-A2"이라는 용어는 대표적으로 HLA-A*0201 및 HLA-A*0206를 의미한다.
별도로 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 "키트(kit)"라는 용어는 시약(reagent) 및 다른 물질의 혼합을 의미한다. 키트는 마이크로어레이(microarray), 칩(chip), 마커(marker)등을 포함할 수 있다. "키트" 용어는 시약 및/또는 다른 물질의 특정 혼합으로 한정하지 않는다.
본 발명의 방법 및 조성물이 암의 "치료(treatment)"라는 맥락에서 유용성을 갖는 범위 내에서, C6orf167 유전자의 발현 감소, 또는 개체 내에서 암의 크기, 유병(prevalence), 또는 전이력(metastatic potential)이 감소하는 것과 같은 임상적 이득을 초래한다면 치료는 "효과적인(efficacious)"것으로 여겨진다. 상기 치료가 예방적으로 이용될 때에는, "효과적(efficacious)"이라는 의미는 그것이 암의 형성을 지연시키거나 방지하거나 또는 암의 임상적 증상을 방지하거나 경감시키는 것을 의미한다. 효과는 특정 종양 타입을 진단하거나 또는 치료하기 위해 알려진 방법과 관련하여 결정된다.
본 발명의 방법 및 조성물이 암의 "방지(prevention)" 및 "예방(prophylaxis)"의 맥락에서 유용성을 갖는 범위 내에서, 질병으로부터 치사율(mortality) 또는 사망률(morbidity)의 부담(burden)을 감소시키는 어떤 활성을 지칭하기 위하여 상기의 용어들은 여기서 상호교환된다. 방지 및 예방은 "1차, 2차 및 3차 예방 수준"에서 일어날 수 있가. 1차 예방 및 방지가 질병의 발달을 피하는 것인 반면, 2차 및 3차 예방 및 방지는 질병 진행의 방지 및 예방 및 증상의 나타남 뿐만 아니라 기능을 개선시킴으로써 또는 질병 관련 합병증을 감소시킴으로써 이미 수립된 질병의 부정적 영향 감소시키는 활성을 포함한다. 또는, 방지 및 예방은 특정 장애(disorder)의 심각도를 완화시키는, 예를 들면 종양의 증식 및 전이를 감소시키는 예방적 치료법의 넓은 범위를 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 암의 치료 및/또는 예방 및/또는 암 수술 후 재발의 방지는 암세포의 수술적 제거, 암세포의 성장 억제, 종양의 퇴화(involution) 또는 퇴행(regression), 암 발생의 완화(remission) 및 억제(suppression), 종양의 퇴행, 및 전이의 감소 또는 억제와 같은 상기 단계의 하나를 포함한다. 효과적인 암의 치료 및/또는 예방은 치사율을 감소시키고 암을 가지는 개개인의 진단을 개선시키며, 혈액에 있는 종양 마커의 수준을 감소시킨다. 예를 들면, 증상의 감소 또는 개선은 효과적으로 치료하는 것을 의미하고 및/또는 예방은 10%, 20%, 30% 또는 그 이상의 감소, 또는 안정 병변(stable disease)을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, "항체(antibody)"라는 용어는 지정된 단백질 또는 그것의 펩티드에 대해 특이적으로 반응하는 면역글로불린(immunoglobulin) 및 그것의 단편을 의미한다. 항체는 인간 항체(human antibodies), 영장류 항체(primatized antibodies), 키메라 항체(chimeric antibodies), 이중특이적 항체(bispecific antibodies), 인간화된 항체(humanized antibodies), 다른 단백질 또는 방사선 표지와 결합된 항체, 및 항체 단편을 포함할 수 있다. 또한, 여기서 항체는 넓은 의미에서 사용되고 특히 완전한 단일클론 항체(intact monoclonal antibodies), 다클론 항체(polyclonal abtibodies), 최소한 2개의 완전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체[multispecific antibodies, 예를 들면 이중특이적 항체(bispecific antibodies)], 및 항체 단편을 그들이 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한 포함한다. "항체"는 모든 종류(예를 들면, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)를 가르킨다.
별도로 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에서 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
II . 펩티드
C6orf167으로부터 유래된 펩티드가 CTL에 의해 인식되는 항원으로서 기능 한다는 것을 보이기 위하여, C6orf167(서열 번호: 159)에서 유래된 펩티드가 흔히 HLA 대립 유전자와 만나는 HLA-A24 또는 A2에 의해 제한되는 항원 에피토프인지 결정하기 위하여 C6orf167(서열 번호: 159)에서 유래된 펩티드를 분석하였다(Date Y et al., Tissue Antigens 47:93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155:4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152:3913-24, 1994).
HLA-A24와 결합 친화력(binding affinity)에 기초하여 C6orf167로부터 유래된 HLA-A24 결합 펩티드 후보가 동정되었다. 하기 펩티드들은 후보 펩티드들이다:
C6orf167-A24-9-848 (서열 번호: 1), C6orf167-A24-9-179 (서열 번호: 2), C6orf167-A24-9-641 (서열 번호: 3), C6orf167-A24-9-404 (서열 번호: 4), C6orf167-A24-9-1171 (서열 번호: 5), C6orf167-A24-9-1219 (서열 번호: 6), C6orf167-A24-9-236 (서열 번호: 7), C6orf167-A24-9-480 (서열 번호: 8), C6orf167-A24-9-1170 (서열 번호: 9), C6orf167-A24-9-580 (서열 번호: 10), C6orf167-A24-9-203 (서열 번호: 11), C6orf167-A24-9-254 (서열 번호: 12), C6orf167-A24-9-158 (서열 번호: 13), C6orf167-A24-9-9 (서열 번호: 14), C6orf167-A24-9-561 (서열 번호: 15), C6orf167-A24-9-530 (서열 번호: 16), C6orf167-A24-9-966 (서열 번호: 17), C6orf167-A24-9-315 (서열 번호: 18), C6orf167-A24-9-92 (서열 번호: 19), C6orf167-A24-9-95 (서열 번호: 20), C6orf167-A24-9-786 (서열 번호: 21), C6orf167-A24-9-132 (서열 번호: 22), C6orf167-A24-9-598 (서열 번호: 23), C6orf167-A24-9-827 (서열 번호: 24), C6orf167-A24-9-851 (서열 번호: 25), C6orf167-A24-9-55 (서열 번호: 26), C6orf167-A24-9-626 (서열 번호: 27), C6orf167-A24-9-908 (서열 번호: 28), C6orf167-A24-9-550 (서열 번호: 29), C6orf167-A24-9-220 (서열 번호: 30), C6orf167-A24-9-437 (서열 번호: 31), C6orf167-A24-10-1170 (서열 번호: 32), C6orf167-A24-10-626 (서열 번호: 33). C6orf167-A24-10-429 (서열 번호: 34), C6orf167-A24-10-917 (서열 번호: 35), C6orf167-A24-10-474 (서열 번호: 36), C6orf167-A24-10-514 (서열 번호: 37), C6orf167-A24-10-254 (서열 번호: 38), C6orf167-A24-10-194 (서열 번호: 39), C6orf167-A24-10-240 (서열 번호: 40), C6orf167-A24-10-956 (서열 번호: 41), C6orf167-A24-10-786 (서열 번호: 42), C6orf167-A24-10-511 (서열 번호: 43), C6orf167-A24-10-315 (서열 번호: 44), C6orf167-A24-10-598 (서열 번호: 45), C6orf167-A24-10-869 (서열 번호: 46), C6orf167-A24-10-966 (서열 번호: 47), C6orf167-A24-10-66 (서열 번호: 48), C6orf167-A24-10-914 (서열 번호: 49), C6orf167-A24-10-964 (서열 번호: 50), C6orf167-A24-10-143 (서열 번호: 51), C6orf167-A24-10-647 (서열 번호: 52), C6orf167-A24-10-851 (서열 번호: 53), C6orf167-A24-10-519 (서열 번호: 54), C6orf167-A24-10-97 (서열 번호: 55), C6orf167-A24-10-827 (서열 번호: 56), C6orf167-A24-10-389 (서열 번호: 57), C6orf167-A24-10-273 (서열 번호: 58), C6orf167-A24-10-670 (서열 번호: 59), C6orf167-A24-10-132 (서열 번호: 60), 및 C6orf167-A24-10-1112 (서열 번호: 61).
또한, 시험관 내(in vitro)에서 상기 펩티드를 적재한(loaded) 수지상 세포(dendritic cells; DC)에 의해 T 세포를 자극시킨 후, CTL은 하기 펩티드의 각각을 이용하여 성공적으로 수립되었다:
C6orf167-A24-9-179 (서열 번호: 2), C6orf167-A24-9-404 (서열 번호: 4), C6orf167-A24-9-236 (서열 번호: 7), C6orf167-A24-9-480 (서열 번호: 8), C6orf167-A24-9-1170 (서열 번호: 9), C6orf167-A24-9-9 (서열 번호: 14), C6orf167-A24-9-530 (서열 번호: 16), C6orf167-A24-9-315 (서열 번호: 18), C6orf167-A24-9-132 (서열 번호: 22), C6orf167-A24-9-851 (서열 번호: 25), C6orf167-A24-9-55 (서열 번호: 26), C6orf167-A24-9-220 (서열 번호: 30), C6orf167-A24-10-626 (서열 번호: 33), C6orf167-A24-10-429 (서열 번호: 34), C6orf167-A24-10-917 (서열 번호: 35), C6orf167-A24-10-474 (서열 번호: 36), C6orf167-A24-10-254 (서열 번호: 38), C6orf167-A24-10-194 (서열 번호: 39), C6orf167-A24-10-956 (서열 번호: 41), C6orf167-A24-10-511 (서열 번호: 43), C6orf167-A24-10-315 (서열 번호: 44), C6orf167-A24-10-598 (서열 번호: 45), C6orf167-A24-10-966 (서열 번호: 47), C6orf167-A24-10-66 (서열 번호: 48), C6orf167-A24-10-914 (서열 번호: 49), 및 C6orf167-A24-10-851 (서열 번호: 53).
HLA-A24와 결합 친화력(binding affinity)에 기초하여 C6orf167로부터 유래된 HLA-A24 결합 펩티드 후보가 동정되었다. 하기 펩티드들은 면역치료법(immunotherapy)에 대한 후보 펩티드로 간주된다:
C6orf167-A2-9-202 (서열 번호: 63), C6orf167-A2-9-227 (서열 번호: 64), C6orf167-A2-9-855 (서열 번호: 65), C6orf167-A2-9-131 (서열 번호: 66), C6orf167-A2-9-533 (서열 번호: 67), C6orf167-A2-9-858 (서열 번호: 68), C6orf167-A2-9-290 (서열 번호: 69), C6orf167-A2-9-647 (서열 번호: 70), C6orf167-A2-9-929 (서열 번호: 71), C6orf167-A2-9-219 (서열 번호: 72), C6orf167-A2-9-904 (서열 번호: 73), C6orf167-A2-9-648 (서열 번호: 74), C6orf167-A2-9-133 (서열 번호: 75), C6orf167-A2-9-887 (서열 번호: 76), C6orf167-A2-9-319 (서열 번호: 77), C6orf167-A2-9-667 (서열 번호: 78), C6orf167-A2-9-261 (서열 번호: 79), C6orf167-A2-9-965 (서열 번호: 80), C6orf167-A2-9-964 (서열 번호: 81), C6orf167-A2-9-578 (서열 번호: 82), C6orf167-A2-9-623 (서열 번호: 83), C6orf167-A2-9-484 (서열 번호: 84), C6orf167-A2-9-457 (서열 번호: 85), C6orf167-A2-9-253 (서열 번호: 86), C6orf167-A2-9-671 (서열 번호: 87), C6orf167-A2-9-283 (서열 번호: 88), C6orf167-A2-9-1018 (서열 번호: 89), C6orf167-A2-9-1091 (서열 번호: 90), C6orf167-A2-9-1113 (서열 번호: 91), C6orf167-A2-9-821 (서열 번호: 92), C6orf167-A2-9-1116 (서열 번호: 93), C6orf167-A2-9-528 (서열 번호: 94), C6orf167-A2-9-1112 (서열 번호: 95), C6orf167-A2-9-99 (서열 번호: 96), C6orf167-A2-9-590 (서열 번호: 97), C6orf167-A2-9-224 (서열 번호: 98), C6orf167-A2-9-405 (서열 번호: 99), C6orf167-A2-10-716(서열 번호: 100), C6orf167-A2-10-535 (서열 번호: 101), C6orf167-A2-10-226 (서열 번호: 102), C6orf167-A2-10-303 (서열 번호: 103), C6orf167-A2-10-311 (서열 번호: 104), C6orf167-A2-10-425 (서열 번호: 105), C6orf167-A2-10-554 (서열 번호: 106), C6orf167-A2-10-648 (서열 번호: 107), C6orf167-A2-10-569 (서열 번호: 108), C6orf167-A2-10-202 (서열 번호: 109), C6orf167-A2-10-527 (서열 번호: 110), C6orf167-A2-10-10 (서열 번호: 111), C6orf167-A2-10-577 (서열 번호: 112), C6orf167-A2-10-128 (서열 번호: 113), C6orf167-A2-10-622 (서열 번호: 114), C6orf167-A2-10-178 (서열 번호: 115), C6orf167-A2-10-47 (서열 번호: 116), C6orf167-A2-10-219 (서열 번호: 117), C6orf167-A2-10-1155 (서열 번호: 118), C6orf167-A2-10-227 (서열 번호: 119), C6orf167-A2-10-253 (서열 번호: 120), C6orf167-A2-10-606 (서열 번호: 121), C6orf167-A2-10-290 (서열 번호: 122), C6orf167-A2-10-262 (서열 번호: 123), C6orf167-A2-10-965 (서열 번호: 124), C6orf167-A2-10-1113 (서열 번호: 125), C6orf167-A2-10-77 (서열 번호: 126), C6orf167-A2-10-319 (서열 번호: 127), C6orf167-A2-10-1022 (서열 번호: 128), C6orf167-A2-10-910 (서열 번호: 129), C6orf167-A2-10-738 (서열 번호: 130), C6orf167-A2-10-482 (서열 번호: 131), C6orf167-A2-10-282 (서열 번호: 132), C6orf167-A2-10-442 (서열 번호: 133), C6orf167-A2-10-625 (서열 번호: 134), C6orf167-A2-10-1120 (서열 번호: 135), C6orf167-A2-10-640 (서열 번호: 136), C6orf167-A2-10-619 (서열 번호: 137), C6orf167-A2-10-747 (서열 번호: 138), C6orf167-A2-10-1131 (서열 번호: 139), C6orf167-A2-10-71 (서열 번호: 140), C6orf167-A2-10-614 (서열 번호: 141), C6orf167-A2-10-457 (서열 번호: 142), C6orf167-A2-10-1001 (서열 번호: 143), C6orf167-A2-10-397 (서열 번호: 144), C6orf167-A2-10-268 (서열 번호: 145), C6orf167-A2-10-1088 (서열 번호: 146), C6orf167-A2-10-528 (서열 번호: 147), C6orf167-A2-10-1049 (서열 번호: 148), C6orf167-A2-10-886 (서열 번호: 149), C6orf167-A2-10-411 (서열 번호: 150) 및 C6orf167-A2-10-579 (서열 번호: 151).
또한, 시험관 내(in vitro)에서 상기 펩티드를 부가한(pulsed)[적재한(loaded)] 수지상 세포(dendritic cells; DC)에 의해 T 세포를 자극시킨 후, CTL은 하기 펩티드의 각각을 이용하여 성공적으로 수립되었다:
C6orf167-A2-9-855 (서열 번호: 65), C6orf167-A2-9-131 (서열 번호: 66), C6orf167-A2-9-887 (서열 번호: 76), C6orf167-A2-9-261 (서열 번호: 79), C6orf167-A2-9-484 (서열 번호: 84), C6orf167-A2-10-535 (서열 번호: 101), C6orf167-A2-10-527 (서열 번호: 110), C6orf167-A2-10-10 (서열 번호: 111), C6orf167-A2-10-577 (서열 번호: 112), C6orf167-A2-10-128 (서열 번호: 113), C6orf167-A2-10-622 (서열 번호: 114), C6orf167-A2-10-219 (서열 번호: 117), C6orf167-A2-10-1155 (서열 번호: 118), C6orf167-A2-10-606 (서열 번호: 121), C6orf167-A2-10-290 (서열 번호: 122), C6orf167-A2-10-262 (서열 번호: 123) 및 C6orf167-A2-10-965 (서열 번호: 124).
상기 수립된 CTL은 각각의 펩티드에 의해 자극받은 표적 세포에 대해 강력한 특이적 CTL 활성을 보인다. 본 발명의 이러한 결과는 C6orf167가 CTL에 의해 인식되는 항원이며, 상기 검사되는 펩티드들은 HLA-A24 또는 HLA-A2에 의해 제한되는 C6orf167의 에피토프 펩티드임을 나타낸다.
C6orf167 유전자는 방광암(bladder cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 간내담도암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수 백혈병(chornic myelogenous leukemia; CML), 식도암(esophageal cancer), 위암(gastric cancer), 위 확산형 암(gastric diffuse-type cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 골육종(osteosarcoma), 신장암(renal carcinoma), 폐 선암(lung adenocarcinoma; ADC), 폐편평상피암(lung squamous cell carcinoma; SCC), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer; SCLC), 비소세포성 폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC), 연조직 종양(soft tissue tumor), 및 고환 종양(testicular tumor)과 같은 암세포 또는 조직에서 과발현하고 대부분의 정상 기관에서 발현하지 않기 때문에, 면역치료법의 적절한 표적을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 C6orf167으로부터 CTL에 의해 인식되는 에피토프에 상응하는 노나펩티드(nonapeptides, 9개의 아미노산으로 구성된 펩티드)와 데카펩티드(decapeptides, 10개의 아미노산으로 구성된 펩티드)를 제공한다. 구체적으로 본 발명의 노나펩티드 및 데카펩티드의 바람직한 예는 서열 번호: 1, 8, 9, 11, 12, 18, 22, 24, 25, 26 및 32, 1 내지 61 및 63 내지 151로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펨티드를 포함한다.
일반적으로, Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1,152(1):163-75 및 Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17에 기재되어 있는 것과 같이, 인터넷상에서와 같은 현재 사용가능한 소프트웨어 프로그램은 컴퓨터 상(in silico)에서 다양한 펩티드와 HLA 항원 사이의 결합 친화성(binding affinity)을 산출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1):163-75, Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6):1872-81, Larsen MV et al. BMC Bioinformatics. 2007 Oct 31; 8: 424, Buus S et al. Tissue Antigens., 62:378-84, 2003, Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17, 및 Nielsen M et al. PLoS ONE 2007; 2: e796에 기재되고, 예를 들면 Lafuente EM et al., Current Pharmaceutical Design, 2009, 15, 3209-3220에 요약되어 있는 것과 같이, HLA 항원과의 결합 친화성을 측정할 수 있다. 결합 친화성을 결정하는 방법은, 예를 들면, Journal of Immunological Methods, 1995, 185:181-190; Protein Science, 2000, 9:1838-1846에 기재되어 있다. 따라서, C6orf167으로부터 유래된 단편은 선택될 수 있는데, 이것은 상기 소프트웨어 프로그램을 이용하여 HLA 항원과 높은 결합 친화력을 갖는 것이 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명은 C6orf167으로부터 유래된 어떤 단편으로 구성된 펩티드를 포함하는데, 이것은 알려진 프로그램에 의해 HLA 항원과 결합하기 위해 결정될 수 있다. 또한, 상기 펩티드는 C6orf167의 전장(full length)으로 구성된 펩티드를 포함할 수 있다.
상기 결과의 펩티드가 CTL 유도성을 유지하는 한, 본 발명의 노나 펩티드 및 데카 펩티드는 부가적 아미노산 잔기를 인접시킬 수 있다. 상기 부가적 아미노산 잔기는 원래 펩티드의 CTL 유도성을 손상시키지 않는 한, 어떤 유형의 아미노산으로도 구성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 HLA 항원에 대한 결합 친화성을 갖는 펩티드를 포함하고, 이것은 C6orf167으로부터 유래한 펩티드를 포함한다. 예를 들면, 상기 펩티드들은 전형적으로 약 40 아미노산 미만, 보통 20 아미노산 미만이고, 대개 약 15 아미노산 미만이다.
일반적으로, 어떠한 펩티드 중의 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산의 변형은 상기 단백질의 기능에 영향을 미치지 않고, 그리고 어떠한 경우에는 원래 단백질의 원하는 기능을 증진시킬 수 있다. 실제로, 변형된 펩티드(즉, 원래의 참조 서열에 대하여 하나, 둘 또는 여러 개의 아미노산 잔기가 치환 또는 첨가됨으로써 변형된 아미노산 서열로 구성되는 펩티드)가 원래의 펩티드의 생물학적 활성을 보유하고 있다는 것이 알려져 있다(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81:5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10:6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13). 따라서, 본 발명의 한 실시예에서, 본 발명의 펩티드는 CTL 유도성을 갖고, 펩티드는 서열 번호: 1 내지 62 및 63 내지 151로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지며, 여기에서 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산은 첨가 및/또는 치환된다.
당업자는 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산을 변화시키는 아미노산 서열에 대한 개개의 첨가 또는 치환이 원래 아미노산 서열 측쇄(side-chain)의 특성의 보존을 야기시키는 경향이 있다는 것을 알고 있다; 따라서, 상기의 것을 "보존적 치환(conservative substitution)" 또는 "보존적 변형(conservative modification)"이라고 하며, 여기서 단백질의 변화는 원래의 단백질과 동일한 기능을 가지는 변형된 단백질을 야기한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에서 잘 알려져 있다. 보존하기에 바람직한 아미노산 측쇄 특징의 예는 소수성 아미노산(hydrophobic amino acids: A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(hydrophillic amino acids: R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 및 하기 작용기 또는 공통적 특징을 가지는 측쇄를 포함한다; 지방족 측쇄(aliphatic side-chain: G, A, V, L, I, P); 수산기(hydroxy group)를 포함하는 측쇄(S, T, Y); 황 원자(sulfur atom)를 포함하는 측쇄(C, M); 카복실산 및 아미드(carboxylic acid and amide)를 포함하는 측쇄(D, N, E, Q); 염기(base)를 포함하는 측쇄(R, K, H); 및 방향족(aromatic)을 포함하는 측쇄(H, F, Y, W). 또한, 하기 8개 군 각각은 당업계에서 서로에게 보존적 치환이라고 받아들여지는 아미노산을 포함한다:
1) 알라닌(alanine; A), 글리신(glycine; G);
2) 아스파라긴산(aspartic acid; D), 글루탐산(glutamic acid; E);
3) 아스파라긴(aspargine; N), 글루타민(glutamine; Q);
4) 아르기닌(arginine; R), 리신(lysine; K);
5) 이소루신(isoleucine; I), 루신(leucine; L), 메티오닌(methionine; M), 발린(valine; V);
6) 페닐알라닌(phenylalanine; F), 티로신(tyrosine; Y), 트립토판(tryptophan; W);
7) 세린(serine; S), 트레오닌(threonine; T); 및
8) 시스테인(cysteine; C), 메티오닌(methionine; M) (예를 들면, Creighton, Proteins 1984 참조).
이러한 보존적으로 변형된 펩티드 또한 본 발명의 펩티드로 간주한다. 그러나, 본 발명의 펩티드는 그들에 한정되지 않고, 상기 변형된 펩티드가 원래 펩티드의 CTL 유도성을 가지는 한, 비보존적인 변형도 포함할 수 있다. 또한, 변형된 펩티드는 CTL 유도 가능한, 다형성 변종(polymorphic variants), 종간 상동체(interspecies homologues), 및 C6orf167 대립 유전자의 펩티드를 제외하지 않는다.
필수적인 CTL 유도성을 계속 유지하기 위하여, 소수의(예를 들면, 1, 2 또는 여러 개) 또는 아미노산의 적은 비율을 변형(삽입, 첨가 및/또는 치환)할 수 있다. 본 발명에서, 상기 용어 "여러 개"는 5 또는 그 이하의 아미노산, 예를 들면 4 또는 3개 또는 그 이하의 아미노산을 의미한다. 변형되는 아미노산의 비율은 바람직하게는 20% 또는 그 이하, 보다 바람직하게는 15% 또는 그 이하, 그보다 더 바람직하게는 10% 또는 그 이하 또는 1 내지 5%일 수 있다.
면역치료법의 맥락에서 사용되었을 경우, 본 발명의 펩티드는 세포의 표면 또는 엑소솜, 바람직하게는 HLA 항원과 복합체로서 제시되어야만 한다. 그러므로, CTL을 유도할 수 있을 뿐만 아니라 또한 HLA 항원에 높은 결합력을 갖고 있는 펩티드를 선택하는 것이 바람직하다. 상기 목적을 위하여, 상기 펩티드는 개선된 결합력을 가지는 변형된 펩티드를 제공하가 위해 아미노산 잔기의 치환, 삽입, 및/또는 첨가에 의해 변형될 수 있다.
자연적으로 나타나는 펩티드뿐만 아니라, HLA 항원에 결합함으로써 나타나는 펩티드 서열의 규칙성은 이미 알려져 있기 때문에(J Immunol 1994, 152:3913; Immunogenetics 1995, 41:178; J Immunol 1994, 155:4307), 상기 규칙성에 근거한 변형은 본 발명의 면역원성 펩티드(immunogenic peptides)에 도입될 수 있다.
예를 들면, HLA-A24 결합 친화력을 증가시키기 위하여, N-말단으로부터 2번째 아미노산을 루신 또는 메티오닌으로 치환하고, 및/또는 C-말단의 아미노산을 발린 또는 루신으로 치환하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 서열 번호: 1 내지 61로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 여기에서 상기 서열 번호의 N-말단으로부터 2번째 아미노산은 루신 또는 메티오닌으로 치환되었고, 및/또는 여기에서 상기 서열 번호의 아미노산 C-말단은 발린 또는 루신으로 치환된 펩티드는 본 발명에 의해 포함된다.
또는, HLA-A2 결합 친화력을 증가시키기 위하여, N-말단으로부터 2번째 아미노산을 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 또는 트립토판으로 치환하고, 및/또는 C-말단의 아미노산을 페닐알라닌, 루신, 이소루신, 트립토판, 또는 메티오닌으로 치환되는 것은 바람직할 수 있다. 따라서, 서열 번호: 63 내지 151로부터 선택되는 아미노산을 가지는 펩티드, 여기에서 상기 서열 번호의 N-말단으로부터 2번째 아미노산은 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 또는 트립토판으로 치환되었고, 및/또는 여기에서 상기 서열 번호의 아미노산 C-말단은 페닐알라닌, 루신, 이소루신, 트립토판, 또는 메티오닌으로 치환된 펩티드는 본 발명에 의해 포함된다.
치환은 말단 아미노산 뿐만 아니라 가능성 있는 펩티드의 T 세포 수용체(T cell receptor; TCR)인지 부위에 도입될 수 있다. 여러 연구, 예를 들면 CAP1, p53 (264-272), Her-2/neu (369-377) or gp100 (209-217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 and S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314)는 아미노산 치환을 가지는 펩티드는 원래의 펩티드와 동일하거나 또는 보다 좋을 수 있다는 것을 나타내었다.
또한, 본 발명은 하나, 둘 또는 여러 개의 아미노산이 본 발명 펩티드의 N 및/또는 C-말단으로 첨가될 수 있다. 높은 HLA 항원 결합 친화력을 갖고 CTL 유도성을 보유하는 상기 변형 펩티드는 본 발명에 의해 포함될 수 있다.
그러나, 상기 펩티드 서열이 서로 다른 기능을 가지는 내인성 또는 외인성 단백질의 아미노산 서열의 한 부분과 동일할 경우, 특이적 물질에 대한 자가면역질환 및/또는 특정 물질에 대한 알레르기 증상 등의 부작용이 유발될 가능성이 있다. 따라서, 상기 펩티드 서열이 다른 단백질의 아미노산 서열과 일치하는 상황을 피하기 위해서, 사용가능한 데이터베이스를 이용하여 상동성 검색을 먼저 수행하는 것이 바람직하다. 목표 펩티드(objective peptide)와 비교하여 하나 또는 두 개의 아미노산 차이가 있는 펩티드마저도 존재하지 않는다는 것이 상동성 검색에서 드러날 경우, 어떠한 부작용의 위험 없이 HLA 항원과 결합 친화성, 및/또는 CTL 유도성을 증강시키기 위해, 상기 목표 펩티드를 변형시킬 수 있다.
상기와 같이, HLA 항원에 대해 높은 결합 친화성을 가지는 펩티드는 매우 효과적일 것이라고 기대되지만, 높은 결합 친화성의 존재에 따라 지표로서 선택된 후보 펩티드는 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes; CTL) 유도성의 존재에 대해 한층 더 검토된다. 본 발명에서, 상기 용어 "CTL 유도성"은 항원-제시 세포(antigen-presenting cells; APCs) 상에 제시될 경우에 CTL을 유도하는 펩티드의 능력을 의미한다. 또한, "CTL 유도성"은 펩티드의 CTL 활성화, CTL 증식을 유도하고, CTL에 의한 표적세포의 용해 촉진시키며, 및 CTL의 IFN-감마(gamma) 생산을 증가시키는 능력을 포함한다.
CTL 유도성의 확인은 인간 MHC 항원을 보유하는 APCs[예를 들면, B-림프구, 대식세포(macrophage) 및 수지상세포(dendritic cell; DC)], 또는 보다 구체적으로는 인간 말초 혈액 단핵 백혈구(human peripheral blood mononuclear leukocytes)에서 유래된 수지상세포를 유도하고, 및 펩티드를 사용하여 자극시킨 후, CD8 양성 세포와 혼합하고, 그 후에 표적세포에 대한 CTL에 의해 생산 및 방출되는 IFN-감마를 측정하여 수행할 수 있다. 반응계로서, 인간 HLA 항원을 발현하도록 제작된 형질전환 동물(예를 들면, BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8):764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*2402/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T (H) response에 기재된 것)을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 표적세포를 51Cr 등으로 방사 표지할 수 있고, 상기 표적세포로부터 방출된 방사능으로부터 세포독성 활성을 산출할 수 있다. 또는, CTL 유동성은 고정화된 펩티드를 가진 항원-제시 세포(APCs)의 존재하에 CTL에 의해 IFN-감마(gamma)를 측정함으로써 그리고 항-IFN-감마 단일클론 항체를 이용한 배지에서 억제 영역을 가시화함으로써 검사될 수 있다.
상기 기술된 펩티드의 CTL 유도성을 검사한 결과, 서열 번호: 2, 4, 7, 8, 9, 14, 16, 18, 22, 25, 26, 30, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 41, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 53, 65, 66, 76, 79, 84, 101, 110, 111, 112, 113, 114, 117, 118, 121, 122, 123, 및 124에 의해 기재되는 아미노산 서열로부터 선택되는 노나펩티드 또는 데카펩티드는, HLA 항원에 대한 높은 결합 친화성뿐만 아니라 특히 높은 CTL 유도성을 보였다. 따라서, 이러한 펩티드는 본 발명의 실시예에서 예시된다.
또한, 상동성 분석의 결과는 이러한 펩티드들이 어떠한 다른 알려진 인간 유전자 산물 유래 펩티드와 현저한 상동성을 갖지 않음을 보인다. 따라서, 상기 펩티드를 면역치료법에서 사용하였을 때, 알려지지 않거나 또는 원하지 않은 면역 반응에 대한 가능성은 낮아진다. 그러므로, 또한 측면으로부터 역시, 이러한 펩티드들은 암환자에서 C6orf167에 대한 면역성을 유도하기 위해 사용된다. 따라서, 본 발명의 펩티드들은, 서열 번호: 2, 4, 7, 8, 9, 14, 16, 18, 22, 25, 26, 30, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 41, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 53, 65, 66, 76, 79, 84, 101, 110, 111, 112, 113, 114, 117, 118, 121, 122, 123, 및 124.로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 바람직하다.
상기에서 논의된 본 발명의 변형 뿐만 아니라, 본 발명은 연결된 펩티드가 원래 펩티드의 필수적인 CTL 유도성을 가지고 있는 한 다른 펩티드와 연결될 수 있다. 예시적인 다른 펩티드는 하기를 포함한다: 본 발명의 펩티드 또는 다른 TAA로부터 유래된 CTL-유도성 펩티드. 적절한 펩티드 사이의 링커(linker)는 당업계에 잘 알려져 있는데, 예를 들면, AAY(P.M. Daftarian et al., J Trans Med 2007. 5:26), AAA, NKRK(R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000. 165: 7308-7315) 또는 K(S. Ota et al., Can Res. 62. 1471-1476. K.S. Kawamura et al., J Immunol. 2002. 168: 5709-5715)가 있다.
예를 들면, 비-C6orf167(non-C6orf167) 종양관련 항원 펩티드는 HLA 종류 I 및/또는 종류 II를 통해서 면역반응을 증강시키기 위하여 거의 동시에 사용될 수 있다. 암 세포는 하나 이상의 종양관련 유전자를 발현할 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 특정 개체가 추가적 종양관련 유전자를 발현하는지 결정하는 것 및 그 후 본 발명에 따른 C6orf167 조성물 또는 백신에서 상기 유전자의 발현 생산물로부터 유래된 MHC 종류 I 및/또는 MHC 종류 II 결합 펩티드를 포함하는 것은 당업계에서 평범한 기술 중 하나를 위한 일반적인 실험방법의 영역 내에 있다.
MHC 종류 I 및 MHC 종류 II 결합 펩티드의 예는 당업자에게 알려져 있고(예를 들면, Coulie. Stem Cells 13:393-403. 1995를 참조), 여기서 공개하는 것과 같은 방법으로 본 발명에서 사용될 수 있다. 따라서, 당업자는 하나 또는 그 이상의 C6orf167 펩티드 및 하나 또는 그 이상의 비-C6orf167 펩티드를 포함하는 폴리펩티드, 또는 분자 생물학의 표준 절차를 이용하여 상기 펩티드를 암호화하는 핵산을 쉽게 제조할 수 있다.
상기 연결된 펩티드는 여기에서 "폴리톱(polytopes)"이라고 하며, 즉, 다양한 조절[예를 들면, 연결(concatenated), 겹칩(overlapping)]에서 함께 연결될 수 있는 펩티드를 자극시키는 둘 또는 그 이상의 잠재적인 면역형성적 또는 면역 반응의 군이다. 면역 반응을 자극, 증진 및/또는 유발시키는 폴리톱의 효과를 검사하기 위하여 상기 폴리톱(또는 폴리톱을 암호화하는 핵산)은 표준 면역화 프로토콜에 따라, 예를 들면 동물에 투여될 수 있다. 펩티드는 폴리톱을 형성하기 위해 직접적으로 또는 인근 서열의 사용을 통해 함께 연결될 수 있고, 백신으로서 폴리톱의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다[예를 들면 Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13):5845-5849. 1995; Gilbert et al., Nature Biothechnol. 15(12):1280-1284. 1997; Thomson et al., J Immunol. 157(2):882-826. 1996; Tarn et al., J Exp Med. 171(1):299-306. 1990을 참조]. 에피토프의 다양한 수 및 조합을 포함하는 폴리톱은 제조될 수 있고 CTL에 의한 인지 및 면역 반응을 증강시키는 효과(efficacy)를 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 펩티드는 상기 결과의 연결된 펩티드가 원래 펩티드의 필수적인 CTL 유도성을 보유하고 있는 한, 다른 물질에 더 결합될 수 있다. 적절한 물질의 예는 하기와 같은 예를 포함할 수 있다: 펩티드, 지질, 당 및 당 측쇄, 아세틸기, 천연 및 합성 폴리머 등. 상기 변형이 원래의 펩티드의 생물학적 활성을 파괴하지 않는 한, 당화(glycosylation), 측쇄 산화, 또는 인산화 등의 변형을 포함할 수 있다. 이러한 종류의 변형은 추가적인 기능(예를 들어, 표적 기능 및 전달 기능)을 제공하거나 또는 상기 펩티드를 안정시키기 위해 수행될 수 있다.
예를 들면, 펩티드의 생체 내 안정성을 증대시키기 위해, D-아미노산, 아미노산 모방체, 또는 비천연 아미노산을 도입하는 것은 당업계에서 잘 알려져 있으며; 이 개념은 또한 본 발명의 펩티드에 적용될 수 있다. 펩티드의 안정성은 여러 가지 방법으로 검사될 수 있다. 예를 들면, 펩티다제(peptidases) 및 인간 혈장 및 혈청과 같은 다양한 생물학적 배지는 안정성 시험에 사용될 수 있다(예를 들면, Verhoef et al. , Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11:291-302 참조).
또한, 상기에 기술된 것과 같이, 하나, 둘 또는 여러 개의 아미노산 잔기에 의해 치환되거나, 결실되거나 또는 첨가되어 변형된 펩티드 중에서, 원래의 펩티드와 비교하여 동일하거나 또는 더 높은 활성을 갖는 것은 스크리닝 되거나 또는 선택될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 원래의 것에 비교하여 동일하거나 더 높은 활성을 갖는 변형된 펩티드를 스크리닝하거나 또는 선택하는 방법을 제공한다. 예시적인 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:
a: 본 발명 펩티드의 최소한 하나의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 첨가하는 단계:
b: 상기 펩티드의 활성을 결정하는 단계:
c: 원래의 것에 비교하여 동일하거나 더 높은 활성을 갖는 펩티드를 선택하는 단계.
여기서, 상기 검사될 활성은 MHC 결합 활성, APC, 또는 CTL 유도성 및 세포독성 활성을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 본 발명의 펩티드는 "C6orf167 펩티드(들)" 또는 " C6orf167 폴리펩티드(들)"로 기재될 수 있다.
III . C6orf167 펩티드의 제조
본 발명의 펩티드는 잘 알려진 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드는 재조합 DNA 기술 또는 화학 합성을 사용하여 합성적으로 제조할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 개별적으로, 또는 두 개 또는 이상의 펩티드를 포함하는 더 긴 폴리펩티드로 합성할 수 있다. 다른 자연적으로 존재하는 숙주 세포 단백질 및 그의 단편, 또는 어떤 다른 화학적 물질을 거의 포함하지 않도록 상기 펩티드는 분리될 수 있는데, 즉, 정제되거나 분리될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 여기서 기술하는 본 펩티드(original peptide)의 생물학적 활성을 저해하지 않는다면, 당화(glycosylation), 측쇄 산화, 또는 인산화와 같은 변형을 포함할 수 있다. 다른 예시적 변형은 펩티드의 혈청 반감기(serum half life)를 증가시키기 위해 D-아미노산 또는 사용될 수 있는 다른 아미노산 모방체의 통합을 포함할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 선택된 아미노산 서열을 기반으로 화학 합성을 통해 얻을 수 있다. 합성에 적용될 수 있는 보편적인 펩티드 합성 방법의 예는 하기를 포함한다:
(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
(ii) The Preteins, Vol 2, Academic Press, New York, 1976;
(iii) Peptide Synthesis(일본어),Maruzen Co, 1975;
(iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis(일본어), Maruzen Co, 1985;
(v) Development of Pharmaceuticals(제 2판)(일본어), Vol. 14(peptide synthesis), Hirokawa, 1991；
(vi) WO99/67288; 및
(vii) Barany G. & Merrifield RB, Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis,"Academic Press, New York, 1980, 100-118
또는, 본 발명의 펩티드는 펩티드를 제작하기 위한 임의의 잘 알려진 유전자 조작 방법을 사용해서 얻을 수 있다(예를 들면, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132:349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology(Wu et al. 판) 1983, 101:347-62). 예를 들면, 우선, 목표 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현 가능한 종류(예를 들면, 프로모터 서열에 해당하는 조절 서열의 아래부분(downstream))로 포함하여 적절한 벡터를 제조하고 적절한 숙주 세포에 형질전환한다. 그 다음에, 상기 숙주 세포를 원하는 펩티드를 제작하기 위해 배양한다. 또한 상기 펩티드는 시험관 내(in vitro) 번역 시스템을 사용하여 시험관 내에서 제조될 수도 있다.
IV . 폴리뉴클레오티드
또한, 본 발명은 본 발명의 상기 언급한 펩티드 중 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이들은 자연적으로 존재하는 C6orf167 유전자[GenBank Accession No. NM_198468.2(서열 번호: 158)]에서 유래한 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 이의 보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열로을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에서, 상기 용어 "보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열"은 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 의미한다. 유전자 코드의 축퇴(degeneracy) 때문에, 많은 수의 기능적으로 동일한 핵산은 모든 주어진 단백질을 암호화한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCU및 GCG은 모두 알라닌 아미노산을 암호화한다. 따라서, 코돈에 의해 결정되는 알라닌의 모든 위치에서, 암호화되는 폴리펩티드의 변경없이, 상기 코돈은 상응하는 코돈 중 어느 하나로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이를 "침묵 변이(silent variations)"라 하고, 보존적으로 변형된 변종의 한 종류이다. 펩티드를 암호화하는 본 발명의 모든 핵산 서열은 상기 핵산의 모든 가능한 침묵 변종도 나타낸다. 당업계에서 보편적인 것 중 하나는 핵산의 각 코돈(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG은 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 얻기 위해 변형될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 펩티드를 암호화하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 공개된 각 서열에서 암시적으로 기재되어 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 및 이들의 유도체로 구성될 수 있다. DNA 분자는 자연적으로 존재하는 A, T, C 및 G와 같은 염기로 적절하게 구성되고, T는 RNA에서 U로 대체된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 개재(intervening) 아미노산 서열의 유무를 불문하고 사이에서 본 발명의 다양한 펩티드를 암호화할 수 있다. 예를 들면, 상기 개재 아미노산 서열은 폴리뉴클레오티드 또는 번역된 펩티드의 절단 부위(예를 들면, 효소 인식 서열)를 제공할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 코딩 서열에 대한 어떠한 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 펩티드의 발현에 필요한 조절 서열을 포함하는 재조합형 폴리뉴클레오티드일 수 있고 또는 마커 유전자등을 가지는 발현 벡터(플라스미드)일 수도 있다. 일반적으로, 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 중합효소(polymerase)및 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 이용한 종래의 재조합 기술을 통해 폴리뉴클레오티드를 조작하여 제조할 수 있다.
재조합 기술 및 화학 합성 기술은 모두 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 제작하는 데 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 반응능(competent) 세포에 형질전환되어 발현하는 적절한 벡터 내에 삽입하여 제작할 수 있다. 또는, PCR 기술 또는 적절한 숙주에서의 발현을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있다(예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). 또는, Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5에 기재되어 있는 것과 같이, 고체상 기술을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있다.
V. 엑소솜( Exosomes )
또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드와 HLA 항원 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하는 엑소솜이라는 세포내 소낭을 제공한다. 엑소솜은 예를 들면, 일본 특허출원 제 11-510507호 및 WO99/03499에 설명된 방법을 사용하여 제조할 수 있고, 치료 및/또는 예방의 표적이 되는 환자에게서 얻어진 APCs를 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 엑소솜은 본 발명의 상기 펩티드와 유사한 방법으로 백신으로서 접종할 수 있다.
복합체에 포함된 HLA 항원의 종류는 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체의 HLA 항원의 종류와 일치해야 한다. 예를 들면, 일본인 집다에 대하여, HLA-A24 및 HLA-A2, 특히 HLA-A*2402 및 HLA-A*0201 및 HLA-A*0206이 흔하고 그러므로 일본인 환자의 치료에 적합할 것이다. 일본인과 백인에게서 높게 발현되는 A24 종류의 사용은 효과적인 결과를 얻기 위해 바람직하고, A2402, A*0201 및 A*0206과 같은 아류형(subtype)도 이용할 수 있다. 일반적으로, 임상에서는, 치료를 필요로 하는 환자의 HLA 항원의 종류는 미리 검사되고 있어, 상기 특정 항원에 대해 높은 수준의 결합 친화성을 갖거나, 항원제시에 의한 세포독성 T 세포(CTL) 유도성을 가지는 펩티드를 적절하게 선택하는 것이 가능하게 된다. 또한, 높은 결합 친화성 및 CTL 유도성을 가지는 펩티드를 얻기 위하여, 자연에 존재하는 C6orf167부분적 펩티드의 아미노산 서열을 바탕으로 하나, 둘 또는 여러 아미노산의 치환, 삽입 및/또는 첨가가 수행될 수 있다.
본 발명의 엑소솜에 대한 A-24 종류 HLA 항원을 사용할 때, 서열 번호: 1 내지 61로부터 선택된 서열을 갖는 펩티드가 사용된다.
또는, 본 발명의 엑소솜에 대한 A두 종류 HLA 항원을 사용할 때, 서열 번호: 63 내지 151로부터 선택된 서열을 갖는 펩티드가 사용된다.
VI . 항원-제시 세포( antigen - presenting cells , APCs )
또한, 본 발명은 HLA 항원과 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하는 분리된 항원-제시 세포(antigen presenting cells; APCs)를 제공한다. 상기 APCs는 치료 및/또는 예방을 받는 환자로부터 유래될 수 있고, 그 자체로 또는 본 발명의 펩티드, 엑소솜 또는 CTL을 포함하는 다른 약물과 조합하여 투여될 수 있다.
상기 APCs는 특정한 종류의 세포에 한정되지 않고, 수지상세포(DC), 랑게르한스(Langerhans) 세포, 마크로파지(macrophage), B세포 및 활성화 T 세포를 포함할 수 있는데, 이들은 림프구에 의해 인식되기 위하여 세포 표면에 단백질성 항원을 제시하는 것이 알려져 있다. 수지상세포는 강력한 CTL 유도성을 가지는 APCs 중 하나이므로, 수지상세포는 본 발명의 APCs로서 사용할 수 있다.
예를 들면, 말초 혈액 단핵구로부터 DCs를 유도하고, 그런 다음 그것들을 시험관 내(in vitro), 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(ex vivo)에서 본 발명의 펩티드와 접촉(자극)시켜 본 발명의 APCs를 얻을 수 있다. 본 발명의 펩티드를 개체에 투여하면, 본 발명의 펩티드가 제시된 APCs가 개체의 체내에서 유도된다. "APC 유도"라는 표현은 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드에서 형성된 복합체를 세포 표면에 제시하기 위하여, 세포를 본 발명의 펩티드, 또는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드와 접촉(자극)시키는 것을 포함한다. 따라서 본 발명의 APCs는 본 발명의 펩티드를 개체에 주입한 후 개체에서 수집할 수 있다. 또는, 본 발명의 상기 APCs는 본 발명의 상기 펩티드가 주입된 개체로부터 수집한 APCs와 접촉함으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 상기 APCs는 개체내 암에 대한 면역 반응을 유도하기 위하여 그 자체 또는 본 발명의 상기 펩티드, 엑소솜 또는 본 발명의 CTL을 포함하는 다른 약품과의 조합으로 개체에 투여될 수 있다. 예를 들면, 생체 외 투여는 하기 단계를 포함할 수 있다:
a: 첫번째 개체로부터 APCs 수집하는 단계,
b: 단계 a의 APCs와 상기 펩티드와 접촉하는 단계 및
c; 단계 b의 APCs를 2번째 개체에 투여하는 단계.
첫 번째 개체와 두 번째 개체는 같은 개체일 수 있고, 또는 다른 개체일 수 있다. 또는, 본 발명에 따라서, 항원-제시 세포를 유도하는 약학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 펩티드의 사용이 제공된다. 또한, 본 발명은 항원-제시 세포를 유도하는 약학적 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 과정을 제공한다. 또한, 본 발명은 항원-제시 세포를 유도하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다. 단계 b에서 얻어진 상기 APCs는 방광암(bladder cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 간내담도암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수 백혈병(chornic myelogenous leukemia; CML), 식도암(esophageal cancer), 위암(gastric cancer), 위 확산형 암(gastric diffuse-type cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 골육종(osteosarcoma), 신장암(renal carcinoma), 폐 선암(lung adenocarcinoma; ADC), 폐편평상피암(lung squamous cell carcinoma; SCC), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer; SCLC), 비소세포성 폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC), 연조직 종양(soft tissue tumor), 및 고환 종양(testicular tumor)을 포함하지만 이로 제한되지 않는 암 치료 및/또는 예방을 위한 백신일 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에 따르면, APCs는 높은 수준의 CTL 유도성을 가지고 있다. "높은 수준의 CTL 유도성"이라는 용어에 있어서, 상기 높은 수준은 펩티드와 접촉시키지 않는 APCs 또는 CTL을 유도할 수 없는 펩티드와 접촉시킨 APCs의 CTL 유도성 수준과 비교한 CTL 유도성 수준이다. 높은 수준의 세포독성 T 세포 유도성을 가지는 이러한 APCs는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 유전자를 시험관 내에서 APCs에 도입하는 단계를 포함하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 도입 유전자는 DNA 또는 RNA 종류일 수 있다. 도입 방법으로는, 특별한 제한 없이, 본 기술분야에서 일반적으로 실시되는 다양한 방법, 예를 들면, 리포펙션(lipofection), 전기천공법 (electroporation), 및 인산칼슘법 등을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 이는 Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; 특허공보 제 2000-509281호에 기재된 것에 따라 실시할 수 있다. 유전자를 APCs로 도입함으로써, 상기 유전자는 세포 안에서 전사 및 번역을 겪고, 이렇게 얻어진 단백질은 MHC 종류 I 또는 종류 II에 의해 처리되고, 제시 경로를 거쳐 펩티드의 부분(partial peptide)이 제시된다.
VII . 세포독성 T 세포( Cytotoxic T lymphocytes ; CTL )
본 발명의 임의의 펩티드에 대해 유도된 세포독성 T 세포는 생체 내에서 종양 관련 내피를 표적으로 하는 면역반응을 증강하고 그로 인하여 상기 펩티드 그 자체와 유사한 방법으로 백신으로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 임의의 펩티드에 의해 특이적으로 유도 또는 활성화된 분리된 세포독성 T 세포를 제공한다.
이러한 CTL은 (1)본 발명의 펩티드를 개체에 투여하거나; 또는 (2)개체 유래 APCs, CD8 양성 T 세포, 또는 본 발명의 펩티드와 함께 시험관 내에서 말초 혈액 단핵 림프구 접촉(자극) 후 CTL 분리; 또는 (3) CD8 양성 T 세포 또는 말초 혈액 단핵 림프구와 시험관 내에서 그것의 표면에 HLA 항원과 본 발명의 펩티드 복합체를 제시하는 APCs 또는 엑소솜을 접촉하고 CTL 분리; 또는 (4) 본 발명의 펩티드와 결합하는 T 세포 수용체 서브유닛(subnit)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자의 도입으로 얻어질 수 있다. 상기 APCs 또는 엑소솜은 상기 기재 방법 및 (4) 방법의 상세 설명에 의해 준비될 수 있으며, (4)의 방법은 아래 "VIII. T 세포 수용체 (TCR)" 부분에서 기재된다.
본 발명의 CTL은 치료 및/또는 예방의 표적이 되는 개체로부터 유래할 수 있고, 그 자체, 또는 조절 효과의 목적을 위한 본 발명의 펩티드 또는 엑소솜을 포함하여 다른 약물과 조합하여 투여할 수 있다. 상기 얻어진 세포독성 T 세포는 본 발명의 펩티드, 예를 들어, 유도를 위해 사용한 것과 동일한 펩티드를 제시하는 표적 세포에 대해 특이적으로 작용한다. 상기 표적 세포는 암세포와 같은 C6orf167을 내생적으로 발현하는 세포, 또는 C6orf167 유전자가 형질전환된 세포이고; 본 발명의 펩티드에 의한 자극에 의해 세포 표면에 상기 펩티드를 제시하는 세포도 활성화된 CTL 공격의 표적이 될 수 있다.
VIII . T 세포 수용체(T cell receptor , TCR )
또한, 본 발명은 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)의 서브유닛(subunit)를 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 방법을 제공한다. 상기 TCR 서브유닛(subunit)는 C6orf167을 제시하는 종양세포에 대한 특이성을 T 세포에 부여하는 TCR 형성 능력을 가진다. 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드로 유도된 CTL의 TCR 서브유닛로서의 알파(alpha) 측쇄 및 베타(beta) 측쇄의 핵산을 동정할 수 있다(WO2007/032255 및 Morgan et al., J Immunol, 171, 3288, 2003). 예를 들면, PCR 방법은 TCR을 분석하는데 바람직하다. 상기분석을 위한 PCR 프라이머는, 예를 들어, 5' 측면(side) 프라이머로서 5'-R 프라이머(5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3') (서열 번호: 160) 및 TCR 알파 사슬(alpha chain) C 부위에 특이적인 3-TRa-C 프라이머(5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3') (서열 번호: 161), TCR 베타 사슬(beta chain) C1 부위에 특이적인 3-TRb-C1 프라이머(5'-tcagaaatcctttctcttgac-3') (서열 번호: 162) 또는 3' 측면 프라이머로서 TCR 베타 사슬 C2 부위에 특이적인 3-TR 베타-C2 프라이머(5'- ctagcctctggaatcctttctctt-3') (서열 번호: 163)일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. TCR 유도체는 C6orf167를 제시하는 표적세포에 높은 결합력(avidity)으로 결합할 수 있고, 상기 C6orf167 펩티드를 제시하는 표적세포의 효과적인 사멸을 생체 내 또는 시험관 내에서 선택적으로 매개할 수 있다.
TCR 서브유닛을 암호화하는 핵산은 적절한 벡터, 예를 들면 레트로바이러스 벡터로 통합될 수 있다. 상기 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다. 핵산 또는 상기의 것을 포함한 벡터는 유용하게 T 세포, 예를 들면 환자로부터의 T 세포로 이동시킬 수 있다. 유리하게는, 우수한 암세포를 사멸시키는 특성을 갖는, 빠르고 쉽게 변형된 T 세포를 제공하기 위해서, 본 발명은 환자 자신의(또는 다른 포유류) T 세포의 급격한 변형을 가능하게 하는 즉시 사용가능한 조성물(off-the-shelf composition)을 제공한다.
특이적 TCR은 특이적으로 본 발명의 펩티드 및 HLA 분자의 복합체를 특이적으로 인지할 수 있는 수용체(receptor)이고, 이것은 상기 TCR이 상기 T 세포 표면에 있을 때, 표적세포에 대한 T 세포 특이적 활성을 제공한다. 상기 복합체의 특이적 인식은 어떠한 알려진 방법에 의해 확인될 수 있으며, 바람직한 방법은, 예를들어, HLA 분자 및 본 발명의 펩티드를 이용하는 HLA 멀티머 염색 분석(HLA multimer staining) 및 ELISPOT 검사을 포함한다. ELISPOT 검사을 수행함으로써, 세포 표면에 TCR을 발현하는 상기 T 세포가 TCR에 의해 세포를 인식하고, 상기 신호가 세포 내부로 전달된다. 상기 복합체가 T 세포 표면에 존재할 때, 그 복합체가 T 세포독성 활성을 줄 수 있는지 확인하는 것 또한 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 방법은, HLA 양성 세포에 대한 세포 독성 활성의 결정을 위해 예를 들어, 크로뮴 분비 검사(chromium release assay)와 같은 방법을 포함한다.
또한, 본 발명은 HLA-A24에서, C6orf167 펩티드, 예를 들면 서열 번호: 1 내지 61 및 HLA-A2에서 서열 번호: 63 내지 151의 펩티드에 결합하는 TCR 서브유닛 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 도입함으로써 제조되는 CTL을 제공한다.
상기 형질전환된 CTL은 생체 내에서 암세포로 홈밍(homing)할 수 있으며, 잘 알려진 시험관 내 배양 방법으로 증식시킬 수 있다[예를 들면, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)]. 본 발명의 상기 CTL은 치료나 보호를 필요로 하는 환자의 암의 치료 또는 예방에 유용한 면역학적 조성물을 구성하는데 쓰일 수 있다(WO2006/031221 여기서 참조문헌으로 제공된 내용 참조).
예방 및 방지는 질병 유래의 사망률 또는 발병률의 부담을 감소하는 어떠한 활동을 포함한다. 예방 및 방지는 "1차, 2차 및 3차 예방 단계 ”를 일으킬 수 있다. 1차 예방 및 방지는 질환의 발달을 피하는 반면, 2차 및 3차 수준의 예방 및 방지는 질환의 진행 및 증상의 위험성의 예방과 방지 및 기능을 회복시키고 질환-관련 합병증을 감소시킴으로써 이미 발생한 질환의 부정적인 영향을 감소하는 활동을 포함한다. 또는, 예방 및 방지는 광범위한 특정한 질병의 고통을 완화를 위한 예방적 치료, 예를 들면 종양의 전이와 증식을 감소하는것, 혈관형성을 감소하는 것을 포함한다.
암의 치료 및/또는 예방에 대하여, 및/또는 그것의 수술 후 재발의 방지는 다음 단계 중 어떤 것을, 예를 들어 암 세포의 수술적 제거, 암의 세포의 성장 저해, 종양의 퇴화 또는 회귀, 암의 발생의 차도 및 억제의 유도, 종양 회귀 및 전이의 저해 또는 감소를 포함한다. 효과적인 암의 치료 및/또는 예방은 사망자수를 감소시키며, 암을 가지고 있는 개개인의 예후를 향상시키고, 혈중 종양 마커의 수준을 감소시키고, 암과 수반되는 증상을 완화시킨다. 예를 들면, 증상의 개선 또는 감소는 효과적으로 치료된 것으로 여겨지며 및/또는 상기 방지는 10%, 20%, 30% 또는 그 이상의 감소, 또는 안정한 질환을 포함한다.
IX . 약학적 물질 또는 조성물
C6orf167 발현은 정상조직에 비해 방광암, 자궁경부암, 간내담도암, 만성 골수 백혈병, 식도암, 위암, 위 확산형 암, 폐암, 림프종, 골육종, 신장암, 폐 선암, 폐편평상피암, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 연조직 종양, 및 고환 종양을 포함하지만 이로 제한되지 않는 암에서 특이적으로 증가되어 있기 때문에, 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발에 대한 예방에 쓰일 수 있다. 따라서, 본 발명은 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발을 방지하는 약학적 조성물을 제공하며, 이는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 활성 성분으로 포함한다. 또는, 본 발명의 펩티드는 상기 엑소솜 또는 약학적 조성물로서 사용되는 APCs와 같은 세포의 임의의 표면에서 발현될 수 있다. 또한, 상기 언급한 본 발명의 어떤 펩티드를 표적으로 하는 세포독성 T 세포는 또한 본 발명의 약학적 물질 및 조성물의 활성 성분으로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 물질 및 조성물은 백신으로 사용될 수 있다. 본 발명에서, "백신(vaccine)"이라는 표현(면역원 조성물; immunogenic composition이라고 명명)은 동물에게 투여되었을 때 항종양 면역을 유도하는 기능을 가지는 물질을 일컫는다.
본 발명의 약학적 조성물은 마우스(mouse), 랫(rat), 기니피그(guinea-pig), 토끼, 고양이, 개, 양, 염소, 돼지, 소, 말, 원숭이, 개코원숭이 및 침팬치를 포함하지만 이로 제한되지 않은 다른 포유류, 특히 상업적으로 중요한 동물 또는 사육되는 동물 및 인간을 포함한 개체 또는 환자에서 암을 치료 및/또는 방지, 및/또는 수술 후 재발을 방지하기 위해 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 또한 본 발명은 암 또는 종양을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물 또는 물질을 제조하는데 있어서, 하기 선택되는 활성 성분의 용도를 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현할 수 있는 종류로 본 명세서에 공개된 펩티드를 암호화하는 핵산;
(c) 본 발명의 펩티드를 그것의 표면에 제시하는 APCs 또는 엑소솜; 및
(d) 본 발명의 CTL.
그렇지 않으면, 본 발명은 추가적으로 종양의 암 치료 또는 예방에 사용을 위한 하기로부터 선택되는 유효성분을 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현할 수 있는 종류로 본 명세서에 공개된 펩티드를 암호화하는 핵산;
(c) 본 발명의 펩티드를 그것의 표면에 제시하는 APCs 또는 엑소솜; 및
(d) 본 발명의 CTL.
또는, 본 발명은 추가적으로 암 또는 종양을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물 또는 물질을 제조하기 위한 방법 또는 과정을 제공하며, 상기 방법 또는 과정은 유효성분으로서 하기로부터 선택되는 약학적으로 또는 생리활성적으로 허용가능한 활성 성분이 있는 담체를 제형화하는 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현할 수 있는 종류로 본 명세서에 공개된 이러한 펩티드를 암호화하는 핵산;
(c) 본 발명의 펩티드를 그것의 표면에 제시하는 APCs 또는 엑소솜;및
(d) 본 발명의 CTL.
다른 실시예에서, 본 발명은 또한 종양 또는 암을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물 또는 물질 제조 방법 또는 과정을 제공하며, 상기 방법 또는 과정은 하기로부터 선택되는 유효성분이 있는 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 혼합하는 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현할 수 있는 종류로 본 명세서에 공개된 이러한 펩티드를 암호화하는 핵산;
(c) 본 발명의 펩티드를 그것의 표면에 제시하는 APCs 또는 엑소솜;및
(d) 본 발명의 CTL.
본 발명에 따르면, 서열 번호: 1 내지 61로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드들은 HLA-A24에 제한된 에피토프 펩티드 또는 강력하고 특이적인 면역 반응을 유도하는 후보인 것이 발견되었고 또한 서열 번호L 63 내지 151은 HLA-A2에 제한된 에피토프 펩티드 또는 강력하고 특이적인 면역 반응을 유도하는 후보인 것이 발견되었다. 그러므로, 서열 번호: 1 내지 61 및 63 내지 151의 아미노산 서열을 갖는 상기 펩티드들의 어느 것을 포함하는 본 발명의 상기 약학적 물질 또는 조성물은 특이적으로 HLA 항원이 각각 HLA-A24 및 HLA-A02인 개체에 투여에 대해 적합하다. 동일하게 상기 펩티드들 중 어떤 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(즉, 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 약학적 물질 및 조성물에도 적용된다.
본 발명의 약학적 조성물에 의해 치료되는 암은 한정되지 않으나, C6orf167가 관련된(예를 들면 과발현된), 예를 들어, 방광암, 자궁경부암, 간내담도암, 만성 골수 백혈병, 식도암, 위암, 위 확산형 암, 폐암, 림프종, 골육종, 신장암, 폐 선암, 폐편평상피암, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 연조직 종양, 및 고환 종양과 같은 모든 종류의 암 또는 종양을 포함한다.
상기 약학적 조성물은 상기 기재한 활성 성분뿐만 아니라, 암 세포에 대해 CTL을 유도하는 능력이 있는 다른 펩티드, 상기 다른 펩티드를 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드, 상기 다른 펩티드들을 제시하는 다른 세포를 포함할 수 있다. 여기서, 암세포에 대해 CTL을 유도하는 능력을 가지는 다른 펩티드들은 암 특이적 항원(예를 들어, 동정된 TAA들)에 의해 예시가 될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 상기 활성 성분, 예를 들면 본 발명의 펩티드의 어떤 것과 같은 것의 항종양적 효과를 억제하지 않는 한, 필요하다면 선택적으로 다른 치료적 물질을 활성 성분으로서 포함한다. 예를 들면, 제제는 항염증적 물질, 진통제, 화학요법 및 그와 같은 종류의 것을 포함할 수 있다. 그 약제 안에 다른 치료적 물질을 포함하는 것 뿐만 아니라, 본 발명의 약제는 역시 하나 또는 그 이상의 다른 약학적 조성물과 단계적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 약제 및 약학적 조성물의 양은, 예를 들면, 사용되는 약학적 물질 또는 조성물의 유형, 치료되는 질병, 투여의 일정과 루트(route)에 의존한다.
특히 상기 언급한 성분 뿐만 아니라, 본 발명의 약학적 조성물은 논의가 되고 있는 제형의 종류에 관하여 당업계에서 일반적인 다른 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 실시예에서, 상기 약학적 조성물은, 예를 들어 암과 같은, 질병의 병리 조건을 치료하는데, 유용한 물질을 포함하는 제품 및 키트에 포함될 수 있다. 상기 제품은 라벨이 있는 상기 약학적 조성물 중 어느 하나의 용기를 포함할 수 있다. 적합한 용기는 병, 바이알 및 테스트 튜브를 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 만들어질 수 있다. 상기 용기의 라벨은 상기 질병의 하나 또는 그 이상의 조건을 치료 또는 예방하는데 사용되는 조성물인 것을 나타내야 한다. 또한 라벨은 투여에 관한 지시 등에 대해 나타낼 수 있다.
또한 상기 기재한 용기뿐 아니라, 본 발명의 약학적 조성물을 포함한 키트는 선택적으로 약학적으로 허용할 수 있는 희석액을 보관하는 두 번째 용기를 포함할 수 있다. 또한 이것은 상업적 및 사용자의 관점으로부터 바람직한 다른 물질, 다른 버퍼, 희석액, 필터, 니들, 주사기 및 사용설명서를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 바람직하다면, 활성 성분이 포함된 하나 또는 그 이상의 구성 단위 제형을 포함할 수 있는 팩 또는 디스펜서(dispenser) 장치에 존재할 수 있다. 상기 팩은, 예를 들어, 금속 또는 블리스터 팩과 같은 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 투여에 대한 지시에 의해 동반될 수 있다.
(1)상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물.
본 발명의 펩티드들은 약학적 조성물로 직접적으로 투여될 수 있으며, 또는 필요하다면, 종래의 제조 방법에 의해 제조되기도 한다. 후자의 경우, 본 발명의 펩티드 뿐만 아니라, 담체, 부형약 및 약물에서 평이하게 사용되는 것이 특이적 제한 없이 적절한 것으로 포함될 수 있다. 상기 담체들은 멸균된 물, 생리학적 살린(saline), 인산 버퍼(phosphate buffer), 배양 유액 등이다. 또한, 상기 약학적 조성물은 필요하다면, 안정제, 현탁액, 보존료, 계면활성제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 항암 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드들은 생체 내에서 CTL을 유도하기 위해 둘 또는 그 이상의 본 발명의 펩티드를 포함하는 조합으로 준비될 수 있다. 상기 펩티드는 혼합제(cocktail)의 종류를 가질 수 있고, 또는 표준 기술을 이용하여 각각 다른 것이 접합될 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드들은 단독 융합 폴리펩티드 서열로서 발현되거나 화학적으로 연결될 수 있다. 상기 조합의 펩티드들은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 본 발명의 펩티드들을 투여함으로써, 펩티드들은 APCs에 HLA 항원에 의해 높은 밀도로 제시되며, 그 후에 제시된 펩티드 및 HLA 항원으로 구성된 복합체에 대해 특이적으로 반응하는 CTL은 유도된다. 또는, 그들의 표면에 본 발명의 펩티드의 어떤 것을 제시하는 APC를 얻기 위해, APC(예를 들면, DCs)는 개체로부터 제거되고 그 후 본 발명의 펩티드에 의해 자극된다. 상기 APC는 다시 개체 내에서 CTL을 유도하기 위해 개체 내로 투여되고, 그 결과, 종양 관련 상피에 대한 공격성이 증가 될 수 있다.
또한, 본 발명의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 암의 치료 및/또는 예방에 대한 상기 약학적 조성물은 세포성 면역을 효과적으로 확립한다고 알려진 보강제(adjuvant)을 포함할 수 있다. 또는 약학적 조성물은 다른 활성 성분과 함께 투여 될 수 있으며, 또는 과립(granule)으로 제형되어 투여될 수 있다. 보강제는 면역학적 활성을 가진 단백질과 함께(또는 연속적으로) 투여될 때, 상기 단백질에 대한 면역 반응을 증진시키는 화합물을 나타낸다. 여기서 고려되고 있는 보강제는 문헌(Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89)에 기술되어 이는 것들을 포함한다. 예시적인 적절한 보강제는 알루미늄 포스패이트(aluminum phosphate), 알루미늄 하이드록시드(aluminum hydroxide), 알럼(alum), 콜레라 독소(cholera toxin), 살모넬라 독소(salmonella toxin)와 같은 것을 포함한다.
또한, 리포좀 제형, 미세한 마이크로미터 지름의 비드(bead)가 결합된 펩티드를 가지는 과립 제형, 및 지질(lipid)과 결합되는 펩티드 제형이 편리하게 쓰일 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 또한 본 발명의 펩티드들은 약학적으로 허용가능한 염의 종류로 투여될 수 있다. 염의 바람직한 예는 알카리 메탈이 있는 염, 메탈이 있는 염, 유기 염기가 있는 염, 유기산이 있는 염 및 무기산이 있는 염을 포함한다.
또한, 어떤 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 CTL을 준비하는 구성요소를 포함한다. 지질은 바이러스 항원에 대해 생체 내에서 CTL을 초회감작(priming)시킬 수 있는 성물로 확인되었다. 예를 들면, 팔미트 산 잔기(palmitic acid residues)는 라이신 잔기의 엡실론-아미노(epsilon-amino) 및 알파-아미노(alpha-amino) 그룹에 붙여질 수 있으며, 그 후에 본 발명의 펩티드들과 연결될 수 있다. 지질화 펩티드들은 마이셀(micelle) 또는 입자(particle) 안에 직접적으로 투여되거나, 리포좀(liposome)에 통합되거나, 또는 보강제에 유화시킬 수 있다. CTL 반응을 준비시키는 지질의 또 다른 예로, 적절한 펩티드들과 공유적으로 결합될 때, 트리팔미토일-S-글리세릴시스테인리세릴-세린(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinyl-seryl-serine, P3CSS)과 같은 E. coli 지질단백질(lipidprotein)이 CTL을 준비하는 것에 사용될 수 있다(참조, 예를 들어, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4).
투여 방법은 경구, 피내, 피하, 정맥 주사, 또는, 및 전신 투여 또는 표적하는 장소 부근에 국소 투여일 수 있다. 상기 투여는 단독 투여로 수행될 수 있으며 또는 다수의 투여로 신장시킬 수 있다. 본 발명의 펩티드의 복용량은 치료되기 위한 질환, 환자의 연령, 몸무게, 투여 방법, 등등에 알맞게 적용될 수 있고, 보통 0.001mg 내지 1000mg, 예를 들면, 0.001mg 내지 1000mg, 예를 들면, 0.1mg 내지 10mg이며, 몇 일 내지 몇 달에 한 번 투여될 수 있다. 당업자가 적절하게 알맞은 용량을 선택할 수 있다.
(2)폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 발현할 수 있는 종류로 본 명세서에서 공개된 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 여기에서, 상기 용어 "발현할 수 있는 종류”는 세포 안으로 상기 폴리뉴클레오티드가 도입되었을 때, 생체 내에서 폴리뉴클레오티드가 항종양 면역을 유도하는 폴리펩티드로 발현될 것임을 의미한다. 예시된 실시태양에서, 관심있는 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열은 폴리뉴클레오티드의 발현에 대해 필요한 조절 요소를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 표적세포의 유전체로 안정한 삽입을 향상시키기 위해 준비 될 수 있다(예를 들어, 상동성 재조합 카세트 벡터에 대해 Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 참조). 예를 들어, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; U.S. Patent Nos. 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; 및 WO 98/04720)를 참조한다. DNA-기반의 전달 기술의 예로서 “네이키트 DNA(naked DNA)”, 용이한 전달[부피바카인(bupivacaine), 폴리머, 펩티드-매개], 양이온 지질 복합체 및 입자-매개("유전자 총”)또는 압력-매개 전달을 포함한다(참조, 예를 들어, U.S. Patent No. 5,922,687).
또한, 본 발명의 펩티드는 바이러스 또는 세균 벡터로 발현될 수 있다. 발현 벡터의 예로 백시니아(vaccinia) 또는 계두(fowlpox)와 같은 강화된 바이러스 숙주를 포함한다. 이러한 접근은 백시니아 바이러스의 사용, 예를 들어, 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 벡터를 포함한다. 숙주에 도입하였을 때, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 면역성 펩티드를 발현하고, 그렇게 함으로써 면역 반응을 유도한다. 면역법 프로토콜에서 유용한 백시니아 벡터 및 방법은, 예를 들어, U.S. Patent No. 4,722,848에 기재되어 있다. 다른 벡터는 BCG(Bacille Calmette Guerin)이다. BCG 벡터는 Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60에 기재되어 있다. 치료상의 투여 또는 면역법에 대한 유용한 다양한 다른 벡터들, 예를 들어, 아데노 및 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이럴 벡터, 살모넬라 타이피 벡터, 독성이 없는 탄저균 독소 벡터, 기타 같은 종류의 것이 분명할 것이다. (참조, 예를 들어, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85).
환자로의 폴리뉴클레오티드 전달은 폴리뉴클레오티드를 운반하는 벡터에 환자가 직접적으로 노출되는 직접적 경우 또는 세포가 시험관 내에서 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 첫 번째로 형질 전환된 후, 세포가 환자에 이식되는 간접적 경우 중 어느 것이 될 수 있다. 이 두 가지 방법이 각각 생체 내 및 생체 외 유전자 치료법으로 알려져 있다.
유전자 치료의 상기 방법의 일반적인 리뷰는(Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215 참조)를 참조한다. 또한, 본 발명에서 사용될 수 있는 재조합 DNA의 일반적으로 당업계에 알려진 방법은 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; and Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990에 기재되어 있다.
투여 방법은 경구, 피내, 피하, 정맥 주사, 또는, 및 전신 투여 또는 표적하는 장소 부근에 국소 투여일 수 있다. 상기 투여는 단독 투여로 수행될 수 있으며 또는 다수의 투여로 신장시킬 수 있다. 적절한 담체에 포함된 상기 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 상기 펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포의 용량은 치료되기 위한 질환, 환자의 연령, 몸무게, 투여 방법, 등등에 알맞게 적용될 수 있으며, 그리고 보통 0.001mg 내지 1000mg, 예를 들면, 0.001mg 내지 1000mg, 예를 들면, 0.1mg 내지 10mg이며, 몇 일 내지 몇 달에 한 번 투여될 수 있다. 당업자는 적합한 용량을 적절히 선택할 수 있다.
X.펩티드, 엑소솜 , APCs 및 CTL 을 이용하는 방법
본 발명의 펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 APCs 및 CTL을 유도하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 엑소솜 및 APCs는 CTL을 유도하는데 사용될 수 있다. 상기 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 엑소솜 및 APCs는 화합물이 그들의 CTL 유도성을 저해하지 않는 한 어떠한 다른 화합물의 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 상기에 언급한 본 발명의 약학적 조성물 중 어떤 것은 CTL을 유도하는데 사용될 수 있으며, 그것에 더하여, 또한 이러한 펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것은 아래 기재된 APCs를 유도하는데 사용될 수 있다.
(1) 항원-제시 세포(antigen-presenting cells, APCs) 유도 방법
본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드를 사용하여 높은 CTL유도성이 있는 APCs를 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 본 발명의 펩티드를 APCs와 접촉하는 하기 단계를 포함한다. 예를 들어, 생체 외에서 펩티드와 APCs를 접촉하는 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
a: 개체로부터 APCs를 수집하는 단계; 및
b: 펩티드 및 단계 a의 APCs를 접촉하는 단계.
APCs는 특정한 종류의 세포에 한정되지 않으며, 림프구에 의해 인식되기 위해서 단백질성의 항원을 그들의 세포 표면에 발현하는 것으로 알려져 있는 수지상세포, 랑게르한스 세포, 대식세포, B 세포 및 활성화된 T 세포를 포함한다. 바람직하게, DCs는 APCs들 사이에서 가장 강한 CTL 유도성을 갖기 때문에 사용될 수 있다. 본 발명의 어떠한 펩티드는 단독으로서 또는 본 발명의 다른 펩티드와 함께 사용될 수 있다.
반면에, 본 발명의 펩티드가 개체 내로 투여될 때, APCs는 생체 내에서 상기 펩티드와 접촉하고, 결과적으로, 상기 높은 CTL 유도성을 갖는 APCs는 개체 내에서 유도된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 생체 내로 투여하는 것을 포함한다. 유사하게, 생체 내에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있는 종류로서 개체 내로 투여될 때, 본 발명의 펩티드들은 생체 내에서 발현되고 APCs와 접촉되어, 결과적으로 생체 내에서 높은 CTL 유도성을 가지는 APCs를 유도된다. 따라서, 본 발명은 또한 개체로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함한다. 상기 용어 “발현될 수 있는 종류”는 상기 부분 "IX. 약학적 조성물 (2) 활성 성분으로서 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물"에서 기술되었다.
또한, 본 발명은 CTL 유도성을 갖는 APCs를 유도하기 위해 APCs 내로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 포함한다. 예를 들면, 상기 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
a: 개체로부터 APCs의 수집하는 단계; 및
b: 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 도입하는 단계.
단계 b는 상기 "VI. 항원-제시 세포" 부분에 기재한 것과 같이 수행될 수 있다.
(2) CTL을 유도하는 방법
또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 엑소솜 또는 APCs를 사용하여 CTL을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, APCs, 또는 엑소솜이 개체로 투여될 때, CTL은 개체의 몸에서 유도되고, 표적하는 암세포에 대한 면역 반응의 강도는 증진된다. 따라서, 본 발명의 방법은 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, APCs 또는 엑소솜을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
또는, CTL은 그들을 생체 외에서 사용하여 유도될 수 있고, CTL 유도 후, 활성화된 CTL은 개체에 되돌려 진다. 예를 들면, 상기 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
a: 개체로부터 APCs를 수집하는 단계;
b: 펩티드와 단계 a)의 APCs를 접촉하는 단계; 및
c: CD8 양성 세포와 단계 b)의 APCs를 공배양(co-culture)하는 단계.
상기 단계 c)에서 CD8 양성 세포와 공배양된 APCs는 상기 "VI. 항원-제시 세포" 부분에서 기재한 것과 같이 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 APCs에 형질전환함으로써 준비될 수 있으나, 본 발명은 이에 한정되지 않고 본 발명의 펩티드 및 HLA항원의 복합체를 그것의 표면에 효과적으로 제시하는 모든 APCs를 포함한다.
상기 APCs 대신에, 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 표면에 제시하는 엑소솜도 사용될 수 있다. 즉, 본 발명은 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 엑소솜을 공배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 엑소솜은 상기 "V. 엑소솜" 부분에 기술된 방법에 의해 준비될 수 있다.
또한, 본 발명의 펩티드에 결합하는 TCR 서브유닛를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 CD8 양성 세포에 도입시킴으로써 CTL은 유도될 수 있다. 이러한 형질 도입은 상기 "VIII. T 세포 수용체 (TCR)" 부분에 기재된 것과 같이 수행될 수 있다.
또한 본 발명은 CTL을 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 방법 또는 과정을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 펩티드와 약학적으로 허용가능한 운반체를 혼합 또는 제조하는 단계를 포함한다.
XI . 암을 탐지하거나 또는 진단하는 방법:
또한, 본 발명은 암을 탐지하거나 진단하는 방법을 제공한다. C6orf167의 발현이 여러 종류의 암세포 및 임상적 암 조직(표 1 및 도 5)에서 특이적으로 상승된 것을 찾을 수 있었다. 그러므로 세포 샘플에서 C6orf167의 발현을 측정함으로써 여기서 동정된 유전자 뿐만 아니라 그들의 전사 및 번역 생산물은 암을 위한 마커로서 유용성이 있다.
특히, 본 발명은 방법을 제공한다. 생물학적 샘플에서 C6orf167의 발현 수준을 결정함으로써 및 결정된 발현 수준을 암(이하, "암 대조군"이라고 명명) 또는 암이 아니라고 알려진(이하, "정상 대조군"이라고 명명) 샘플에서 결정된 대조군 수준과 비교함으로써 생물학적 샘플 또는 생물학적 샘플이 유래한 개체에서 암의 존재를 탐지하는 방법을 제공한다. 상기 방법 및 본 발명의 방법의 조성으로 탐지되는 암은 C6orf167이 상향 조절(up-regulation)된 것과 관련있는 모든 암일 수 있다. 상기 암의 예는 방광암(bladder cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 간내담도암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수 백혈병(chornic myelogenous leukemia; CML), 식도암(esophageal cancer), 위암(gastric cancer), 위 확산-형암(gastric diffuse-type cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 골육종(osteosarcoma), 신장암(renal carcinoma), 폐 선암(lung adenocarcinoma; ADC), 폐편평상피암(lung squamous cell carcinoma; SCC), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer; SCLC), 비소세포성 폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC), 연조직 종양(soft tissue tumor), 및 고환 종양(testicular tumor)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 개체에서 암을 진단하는 방법을 제공한다. 상기 진단은 상기 기술된 암을 탐지하는 방법에 의해 수득된 결과에 기초하여 수행될 수 있다.
본 발명에 따라서, 개체의 상태를 검사하기 위한 중간 매개 결과를 제공한다. 상기 중간 매개 결과는 의사, 간호사, 또는 다른 수행자가 개체가 상기 질병을 겪고 있는지 진단하는 것을 돕기 위하여 첨가적 정보와 함께 조합될 수 있다. 또는 본 발명은 개체-유래 조직에서 암세포를 탐지하는데 사용될 수 있고 의사에게 개체가 상기 질병을 가진다고 진단하기 위한 유용한 정보를 제공할 수 있다.
특히, 본 발명은 하기 방법 [1] 내지 [10]을 제공한다.
[1] 암을 탐지 또는 진단하기 위한 방법으로, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(a) 생물학적 샘플에서 C6orf167의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 결정하기 위한 단계; 및
(b) 상기 유전자의 정상 대조군 수준과 비교하여 결정된 상기 발현 수준의 증가와 질병의 존재의 상관성을 결정하는 단계.
[2] [1]의 방법에서, 상기 발현 수준은 정상 대조군 수준보다 최소한 10% 이상이다.
[3] [1]의 방법에서, 상기 발현 수준은 하기로부터 선택된 방법에 의해 결정된다:
(a) C6orf167 유전자의 mRNA를 탐지하는 방법,
(b) C6orf167 유전자에 의해 암호화된 단백질을 탐지하는 방법, 및
(c) C6orf167 유전자에 의해 암호화된 단백질의 생물학적 활성을 탐지하는 방법.
[4] [1]의 방법에서, 상기 암은 방광암(bladder cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 간내담도암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수 백혈병(chornic myelogenous leukemia; CML), 식도암(esophageal cancer), 위암(gastric cancer), 위 확산-형암(gastric diffuse-type cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 골육종(osteosarcoma), 신장암(renal carcinoma), 폐 선암(lung adenocarcinoma; ADC), 폐편평상피암(lung squamous cell carcinoma; SCC), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer; SCLC), 비소세포성 폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC), 연조직 종양(soft tissue tumor), 및 고환 종양(testicular tumor)의 군으로부터 선택된다.
[5] [3]의 방법에서, 상기 발현 수준은 상기 유전자 전사체에 대한 탐침(probe)의 혼성화를 탐지함으로써 결정된다.
[6] [3]의 방법에서, 상기 발현 수준은 상기 유전자의 발현 수준으로서 유전자에 의해 암호화되는 단백질에 대한 항체의 결합을 탐지함으로써 결정된다.
[7] [1]의 방법에서, 상기 생물학적 샘플은 생검(biopsy), 가래(sputum), 혈액(blood), 흉막삼출(pleural effusion) 또는 요(urine)를 포함한다.
[8] [1]의 방법에서, 상기 개체-유래 생물학적 샘플은 상피세포(epithelial cell)를 포함한다.
[9] [1]의 방법에서, 상기 개체-유래 생물학적 샘플은 암세포를 포함한다.
[10] [1]의 방법에서, 상기 개체-유래 생물학적 샘플은 암 상피세포(cancerous epithelial cell)를 포함한다.
또는, 본 발명은 개체-유래 방광 조직, 자궁경부 조직, 담관 조직(간내 담관 조직), 백혈구, 식도 조직, 위 조직, 폐 조직, 림프 조직, 뼈 조직, 신장 조직, 폐 조직, 연 조직 또는 고환 조직에서 암세포를 탐지하거나 동정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 생물학적 샘플에서 C6orf167 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계로 구성되고, 여기에서 정상 대조군과 비교하여 상기 유전자의 발현 수준의 증가는 그 조직에서 암세포의 존재 또는 그 가능성을 나타낸다.
상기 결과는 의사, 간호사 또는 다른 건강 관련 종사자가 상기 질병을 겪고 있는 개체를 진단하는 것을 돕기 위해 첨가적 정보와 조합될 수 있다. 다시 말해서, 본 발명은 의사에게 개체가 상기 질병을 앓고 있다는 진단을 내리기 위한 유용한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따라, 개체에서 수득된 조직에서 암세포의 존재에 대한 의심이 있을 때, 임상적 결정은 조직의 병리, 혈액에서 알려진 종양 마커의 수준 및 개체의 임상적 경과 등과 함께 C6orf167 유전자의 발현 수준을 고려함으로써 도달할 수 있다. 예를 들어, 혈액에서 몇몇의 알려진 진단용 종양 마커는 하기와 같다.
방광암(bladder cancer);
IAP, SCC, NMP, BFP, 및 TPA
자궁경부암(cervical cancer);
SCC, CEA, CYFRA21-1, CEA, 또는 CA125
간내담도암(cholangiocellular carcinoma);
CEA, 또는 CA19-9
만성 골수 백혈병(chornic myelogenous leukemia; CML);
TK 활성
식도암(esophageal cancer);
CEA, DUPAN-2, IAP, NSE, SCC, SLX, 또는 Span-1
위암(gastric cancer);
CEA, SLX, STN, or NCC-ST-439
위 확산-형암(gastric diffuse-type cancer);
CEA, SLX, STN, NCC-ST-439, hsCRP 또는 PG I/II
폐암(lung cancer);
AP, ACT, BFP, CA19-9, CA50, CA72-4, CA130, CEA, KMO-1, NSE, SCC, SP1, Span-1, TPA, CSLEX, SLX, STN 또는 CYFRA
림프종(lymphoma);
IAP, Span-1, 또는 TPA
골육종(osteosarcoma);
CD44, 또는 ALP
신장암(renal carcinoma);
BFP, 또는 IAP
폐 선암(lung adenocarcinoma; ADC);
NCC-ST-439, CEA, 또는 SLX
폐편평상피암(lung squamous cell carcinoma; SCC);
SCC, 또는 Cyfra
소세포성 폐암(small-cell lung cancer; SCLC);
Pro-GRP, 또는 NSE
비소세포성 폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC);
NCC-ST-439, CEA, SLX, SCC, 또는 Cyfra
고환 종양(testicular tumor);
AFP, 또는 BFP
즉, 본 발명의 특정 실시예에서, 유전자 발현 분석의 결과는 개체의 질병 상태의 진단을 위한 중간 매개 결과로서 기능한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 암의 진단 마커를 탐지하기 위한 방법, 개체-유래 생물학적 샘플에서 C6orf167 유전자의 발현을 탐지하기 위한 단계로 구성되는 방법을 방광암(bladder cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 간내담도암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수 백혈병(chornic myelogenous leukemia; CML), 식도암(esophageal cancer), 위암(gastric cancer), 위 확산-형암(gastric diffuse-type cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 골육종(osteosarcoma), 신장암(renal carcinoma), 폐 선암(lung adenocarcinoma; ADC), 폐편평상피암(lung squamous cell carcinoma; SCC), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer; SCLC), 비소세포성 폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC), 연조직 종양(soft tissue tumor), 및 고환 종양(testicular tumor)의 진단 마커로서 제공한다.
암을 탐지하거나 또는 진단하기 위한 방법은 하기에 더 자세하게 기술될 것이다.
본 발명에 의해 치료되는 개체는 바람직하게는 포유류이다. 예시적인 포유류는 예를 들면 인간, 비 인간 영장류(non-human primate), 마우스(mouse), 랫(rat), 개, 고양이, 말, 및 소를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
진단될 개체로부터 생물학적 샘플을 수거하는 것은 상기 진단을 수행하기 위해 바람직하다. 모든 생물학적 물질이 C6orf167의 전사 또는 번역 생산물을 포함하는한 생물학적 샘플로서 사용될 수 있다. 상기 생물학적 샘플은 몸 조직 및 혈액, 가래 및 요(urine)과 같은 체액을 포함하지만, 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 생물학적 샘플은 상피 세포, 보다 바람직하게는 암 상피세포 또는 암으로 의심되는 조직으로부터 유래한 상피세포를 포함하는 세포 집단을 포함한다. 또한, 필요하다면, 상기 세포는 수득된 몸의 조직 및 체액으로부터 정제된 후, 생물학적 샘플로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 개체 유래 생물학적 샘플에서 C6orf167의 발현 수준이 결정된다. 상기 발현 수준은 당업계에 알려진 방법을 이용하여 전사 생산물(즉 mRNA) 수준에서 결정될 수 있다. 예를 들면, C6orf167의 mRNA는 혼성화 방법으로 탐침을 이용하여 정량될 수 있다(예를 들어, Northern hybridization). 탐지는 칩 또는 어레이로 수행될 수 있다. 어레이의 사용은 C6orf167을 포함하는 유전자 다수(예를 들면 다양한 암 특이적 유전자)의 발현 수준을 탐지하는데 바람직하다. 당업자들은 이러한 C6orf167(서열 번호: 158; GenBank accession number: NM 198468.2)의 서열정보를 이용하여 탐침을 제조할 수 있다. 예를 들면, C6orf167의 cDNA는 탐침으로 사용될 수 있다. 만약 필요하다면, 상기 탐침은 염료, 형광 및 동위원소와 같은, 적절한 표지로 표지될 수 있으며, 유전자의 발현 수준은 혼성화된 표지의 강도로 탐지될 수 있다.
또한, C6orf167 유전자의 전사 생산물은 증폭-기반 탐지 방법에 의해 프라이머를 사용하여 정량될 수 있다(예를 들면, RT-PCR). 또한, 상기 프라이머는 상기 유전자의 이용가능한 서열 정보를 기반으로 제조될 수 있다. 예를 들면, "실시예"에서 사용된 프라이머(서열 번호: 154, 155, 156 및 157)는 RT-PCR 또는 노던 블랏에 의해 탐지를 위하여 적용될 수 있으나, 본 발명이 이에 제한되지는 않는다.
특히, 상기 제시된 방법에 대해 사용된 탐침 또는 프라이머는 엄격한 상태, 적절하게 엄격한 상태 또는 낮게 엄격한 상태하에서 C6orf167의 mRNA와 혼성화된다. 본 명세서에 사용되었던, 상기 용어 “엄격한 (혼성화) 조건”은 탐침 또는 프라이머가 그것의 표적 서열에 혼성화하는 조건을 나타내지만, 다른 서열에는 혼성화되지 않는다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 다른 환경하에서 달라질 것이다. 더 긴 서열의 특이적 혼성화는 짧은 서열에 비해 높은 온도에서 관찰된다. 일반적으로, 엄격한 조건의 온도는 정의된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대해 열융해점(Thermal melting point, Tm)보다 약 5℃ 낮게 선택된다. 상기 Tm은 (정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에) 50%의 상기 탐침이 상보적으로 상기 표적 서열에 동등하게 혼성화되는 온도이다. 상기 표적 서열이 일반적으로 과다하게 존재하므로, Tm에서 상기 탐침의 50%는 동등하게 점유된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 염 약 1.0M 소듐 이온 미만인 농도일 수 있으며, 일반적으로, pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01 내지 1.0M 소듐 이온 (또는 다른 염들) 온도는 짧은 탐침 또는 프라이머에 대해 적어도 약 30℃이고, (예를 들면, 10 내지 50 뉴클레오티드) 긴 탐침 또는 프라이머에 대해서는 적어도 약 60℃이다. 엄격한 조건은 포름아마이드(formamide)와 같은 불안정화 조성물의 첨가로 얻을 수 있다.
또는, 번역 생산물(즉 단백질)은 본 발명의 진단을 위해 탐지될 수 있다. 예를 들면, C6orf167 단백질은 결정될 수 있다. 번역 생산물로서 단백질의 양을 결정하는 방법은 상기 단백질을 인식하는 특이적 항체를 사용한 면역분석 방법을 포함한다. 상기 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 또한, 그 단편이 C6orf167 단백질에 결합하는 능력을 유지하는 한, 항체의 어떤 단편 또는 변형(예를 들어, 키메라 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, 등등)은 탐지를 위해 쓰일 수 있다. 본 발명의 펩티드에 대한 상기 항체 및 그것의 단편은 본 발명에 의해 제공된다. 단백질의 탐지를 위해 상기 유형의 항체를 준비하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 어떤 방법은 본 발명에서 이러한 항체 및 그들의 등가물을 준비하는 것에 적용될 수 있다.
C6orf167 유전자 발현 수준을 탐지하기 위한 다른 방법은 그것의 번역 산물에 기초하기 때문에, 염색의 강도는 C6orf167 단백질에 대한 항체를 이용한 면역조직학적 분석을 통해 관찰될 수 있다. 즉, 상기 관찰에서, 강한 염색은 증가된 단백질의 존재 수준 및, 동시에, C6orf167 유전자의 높은 발현수준을 나타낸다.
또한, 상기 번역 생산물은 그 생물학적 활성에 기초하여 탐지될 수 있다. 예를 들면, C6orf167 단백질은 암세포의 증식과 관련되는 것으로 나타난다. 따라서, C6orf167 단백질의 세포 증식 활성은 생물학적 샘플에 존재하는 C6orf167 단백질의 지표로서 사용될 수 있다.
또한, C6orf167 유전자의 발현 수준뿐만 아니라, 예를 들면, 암에서 차별적으로 발현되는 것으로 알려진 유전자, 다른 암-관련 유전자의 발현 수준은 진단의 정확성을 증가시키기 위해 검사될 수 있다.
만약 예를 들어 10%, 25%, 또는 50%; 또는 1.1배 이상, 1.5배 이상, 2.0배 이상, 5.0배 이상, 10.0배 이상 또는 그 이상과 같이 상응하는 암 마커 유전자의 대조군 수준 이상이면, 상기 표적 유전자의 상기 대조군 수준으로부터 수준이 증가된 것에 따라 확인될 수 있다(예를 들면, 정상 세포의 상기 수준).
상기 대조군 수준은 질환 상태(암성 또는 비암성)라고 알려진 개체로부터 검사 생물학적 샘플과 동일한 시간에 결정될 수 있고 또는 이전에 수집되고 저장된 샘플을 사용함으로써 상기 암세포와 동시에 확인될 수 있다. 또는, 상기 대조군 수준은 이전에 질환 상태에 있다고 알려진 생물학적 샘플에서 확인된 C6orf167 유전자의 발현 수준을 분석함으로써 얻어진 상기 결과를 기반으로 하는 통계학적인 방법으로 확인될 수 있다. 또한, 이전에 시험된 세포의 발현 패턴 데이터베이스로부터 대조군 수준은 유래될 수 있다. 또한, 본 발명의 측면에 따르면, 생물학적 샘플 안의 C6orf167 유전자의 발현 수준은 대조군 수준과 복수로 비교될 수 있으며, 이는 복수의 참조 샘플로부터 결정될 수 있다. 생물학적 샘플과 유사한 조직 종류로부터 유래된 참조 샘플로부터 대조군을 결정하는 것이 바람직하다. 또한, 질환 상태로 알려져 있는 군의 C6orf167 유전자의 발현 수준의 기준치를 이용하는 것이 바람직하다. 기준치는 당업계에 알려진 어떤 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 평균 +/- 2 S.D. 또는 평균 +/- 3 S.D. 의 범위가 기준치로 사용될 수 있다.
본 발명에서, 암이 아닌 것으로 알려진 생물학적 시료 유래에 의해 확인된 대조군 수준은“정상 대조군 수준”으로 나타낸다. 반면에, 만약 대조군 수준이 암의 생물학적 시료로부터 확인되면, “암 대조군 수준”으로 나타낸다.
C6orf167 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 수준에 비해 증가되었을 때, 또는 암 대조군 수준에 유사할 때, 개체는 치료될 암을 갖는 것 또는 암이 발달하는 위험 상태로 진단될 수 있다. 또한, 상기 다수의 암-관련 유전자의 발현 수준을 비교할 때, 샘플 및 암으로 참고되는 것 사이에서 유전자 발현 패턴에서 유사성은 개체가 암을 갖거나 또는 암이 발달하는 상태를 가르킨다.
검사 생물학적 샘플의 발현 수준 및 그 대조군 수준 사이 상이성은 핵산, 예를 들면 암 또는 암이 아닌 상태의 세포에서 그 발현이 다르지 않은 것으로 알려진 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 발현 수준을 사용하여 평준화시킬 수 있다. 대조군 유전자의 예는 베타-액틴(beta-actin), 글리세랄데히드 3 포스페이트 디하이드로게나아제 및 리보조말 단백질 P1(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
XII . 암을 탐지 또는 진단하기 위한 키트
본 발명은 본 발명의 C6orf167 폴리펩티드로 치료될 수 있는 암을 갖고 있는 또는 갖는 것으로 의심되는 개체를 진단 또는 결정하기 위한 진단 키트를 제공하고, 이것은 암의 진단을 검사하거나 및/또는 암 치료법, 특히 암 면역 치료법의 효율성 또는 적합성을 모니터하기 위하여 사용될 수 있다. 진단 또는 결정될 수 있는 암의 예는 방광암(bladder cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 간내담도암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수 백혈병(chornic myelogenous leukemia; CML), 식도암(esophageal cancer), 위암(gastric cancer), 위 확산-형암(gastric diffuse-type cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 골육종(osteosarcoma), 신장암(renal carcinoma), 폐 선암(lung adenocarcinoma; ADC), 폐편평상피암(lung squamous cell carcinoma; SCC), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer; SCLC), 비소세포성 폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC), 연조직 종양(soft tissue tumor), 및 고환 종양(testicular tumor)을 포함하지만 이로 제한되지는 않는다. 보다 구체적으로, 키트는 바람직하게는 개체-유래 세포에서 C6orf167 유전자의 발현을 탐지하기 위한 최소한 하나의 시약을 포함하고, 상기 시약은 하기의 군으로부터 선택될 수 있다:
(a) C6orf167 유저자의 mRNA를 탐지하디 위한 시약;
(b) C6orf167 단백질 또는 그것의 면역학적 단편을 탐지하기 위한 시약; 및
(c) C6orf167 단백질의 생물학적 활성을 탐지하기 위한 시약.
C6orf167의 mRNA를 탐지하기 위한 적절한 시약의 예는 C6orf167 mRNA에 특이적으로 결합하거나 또는 C6orf167 mRNA를 확인하는, 예를 들면 C6orf167 mRNA의 부분에 대한 상보적 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 같은 핵산을 포함한다. 이러한 유형의 올리고뉴클레오티드는 C6orf167 mRNA에 특이적인 프라이머 및 탐침으로 증폭될 수 있다. 이러한 유형의 올리고뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법에 기초하여 준비될 수 있다. 만약 필요하다면, C6orf167 mRNA를 탐지하기 위한 시약은 고체 매트릭스에 고정화될 수 있다. 또한, C6orf167 mRNA를 탐지하기 위한 하나 이상의 시약은 키트에 포함될 수 있다.
반면에, C6orf167 단백질을 탐지하기 위한 적절한 시약의 예는 C6orf167 단백질에 대한 항체를 포함한다. 상기 항체는 단일클론(monoclonal) 또는 다중클론(polyclonal)일 수 있다. 또한 그 단편이 C6orf167 단백질에 결합하는 능력을 유지하는 한, 상기 항체의 어떤 단편 또는 변형 [예를 들어, 키메라 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv 등]은 시약으로 사용될 수 있다. 단백질 탐지를 위한 이러한 유형의 항체를 준비하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 어떤 방법은 이러한 항체 및 그것의 등가물을 준비하는 방법도 본 발명에서 적용될 수 있다. 또한, 항체는 직접적인 연결 또는 간접적인 표지 기술을 통해 신호 발생 분자로 표지될 수 있다. 표지 및 항체 표지에 대한 방법 및 그들의 표적으로 항체의 결합을 탐지하는 것은 당업계에 잘 알려져 있으며, 어떤 표지 및 방법은 본 발명에 적용될 수 있다. 또한, C6orf167 단백질을 탐지하기 위한 하나 이상의 시약은 키트안에 포함될 수 있다.
또한, 상기 생물학적 활성은 생물학적 샘플에서 발현되는 C6orf167 단백질 때문에, 예를 들면 세포 증식 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 세포는 생물학적 샘플의 존재하에 배양된 후, 예를 들면 증식하는 속도를 탐지함으로써 또는 세포 주기 또는 콜로니 형성 능력을 측정함으로써 생물학적 샘플의 세포 증식 활성이 검사될 수 있다. 필요하다면, C6orf167 mRNA를 탐지하기 위한 시약은 고체 매트릭스(solid matrix)에서 고정될 수 있다. 또한, C6orf167 단백질의 생물학적 활성을 탐지하기 위한 하나 이상의 시약은 키트에 포함될 수 있다.
상기 키트는 상기 언급한 시약의 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 고체 매트릭스 및 C6orf167 유전자에 대한 탐침에 결합하는 시약 또는 C6orf167 단백질에 대한 항체, 배지 및 배양하는 세포를 위한 용기, 양성 및 음성 대조군 시약, 및 C6orf167 단백질에 대한 항체를 탐지하기 위한 2차 항체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 암이 아닌 것으로 알려진 개체로부터 얻어진 조직 샘플은 유용한 대조 시약으로 제공할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 바람직한 상업적 및 사용자의 관점으로부터, 버퍼, 희석액, 필터, 바늘(needle), 주사기 및 사용설명서(예를 들어, 문서, 테이프, CD-ROM)를 포함하는 다른 물질을 포함할 수 있다. 적절한 용기는 병, 바이알(vials) 및 테스트 튜브(test tube)를 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질, 예를 들면 유리 또는 플라스틱으로 만들어졌다.
어떤 실시예에서, C6orf167 mRNA에 대한 탐침이 시약일 때, 상기 시약은 탐지 부위가 적어도 한 개로 구성되는 다공성 스트립과 같은 고체 메트릭스에 고정화될 수 있다. 다공성 스트립의 측정 또는 탐지는 각각의 구성하는 핵산(탐침)부위의 많은 수를 포함할 수 있다. 시험 스트립은 또한 음성 및/또는 양성 대조군에 대한 부위를 포함할 수 있다. 또는, 대조군 부위는 시험 스트립으로부터 분리된 스트립에 위치할 수 있다. 선택적으로 다른 탐지 부위는 고정화된 핵산의 다른 양, 즉, 첫번째 탐지 부위의 높은 양 및 다음 부위 안의 적은 양을 포함할 수 있다. 시험 시료를 더했을 때, 탐지가능한 신호를 제시하는 부위의 수는 시료 안에 존재하는 C6orf167 mRNA의 양의 정량적 지표를 제공한다. 상기 탐지 부위는 어떠한 적절하게 탐지가능한 모양으로 구성될 수 있으며, 일반적으로 시험 스트립의 바 또는 도트 스패닝(dot spanning) 상기 너비 안에 있다.
또한 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 항원 또는 그것의 단편을 특이적으로 인지할 수 있는 단백질 또는 그것의 면역학적 단편을 포함하는 진단용 키트를 제공한다.
여기서 고려되는 본 발명 단백질 및 그것의 면역학적 단편 및 펩티드의 예는 본 발명 단백질의 아미노산 서열에서 최소한 8개, 바람직하게는 15개, 보다 바람직하게는 20개의 연속적인 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 포함한다. 암은 샘플(예를 들면, 혈액, 조직)에서 본 발명의 펩티드(폴리펩티드) 또는 단백질을 사용하여 항체를 탐지함으로써 진단될 수 있다. 본 발명의 단백질 및 펩티드를 제조하는 방법은 상기에 기술되어 있다.
암을 진단하기 위한 방법은 항-C6orf167 항체의 양 및 상기 기술된 것과 같은 상응하는 대조군 샘플에서의 양 사이의 차이를 결정함으로써 수행될 수 있다. 개체의 생물학적 샘플이 유전자의 발현 생산물(C6orf167)에 대한 항체를 포함하고, 항-C6orf167 항체의 양이 정상 대조군에서의 것과 비교하여 판정 기준치(cut-off) 이상으로 결정되면, 그 개체는 암을 앓고 있는 것으로 추정된다.
한 실시예에서, 본 발명의 진단용 키트는 본 발명의 펩티드 및 그것에 결합하는 HLA 분자를 포함할 수 있다. 항원성 펩티드 및 HLA 분자를 사용하여 항원 특이적 CTL을 탐지하는 방법은 이미 수립되었다(예를 들면, Altman JD et al., Science. 1996. 274(5284): 94-6). 따라서, 본 발명의 펩티드 및 HLA 분자의 복합체는 종양 항원 특이적 CTL을 탐지하기 위한 탐지 방법에 적용될 수 있고, 그러므로 조기 탐지(earlier detection), 암의 재발 및/또는 전이가 가능하다. 또한, 이것은 본 발명의 펩티드를 활성 성분으로서 포함하는 약학물과 함께 적용할 수 있는 개체의 선택, 또는 약학물의 치료 효과의 검사에 적용될 수 있다.
특히, 알려진 방법에 따르면(예를 들면 Altman JD et al., Science. 1996. 274(5284): 94-6 참조), 방사선 표지된 HLA 분자 및 본 발명의 펩티드의 테트라머와 같은 올리고머 복합체가 준비될 수 있다. 상기 복합체는 암을 앓고 있는 것으로 추정되는 개체로부터 유래된 말초 혈액 림프구에서 항원-펩티드 특이적 CTLs을 정량하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 여기에서 기술된 펩티드 에피토프를 이용함으로서 개체의 면역 반응을 평가하기 위한 방법 및 진단제를 제공한다. 어떤 실시예에서, 여기서 기술된 HLA A-24 제한된 펩티드는 개체에서 면역 반응을 평가하거나 또는 예측하기 위한 시약으로서 사용된다. 평가되는 면역 반응은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 면역원(immunogen)을 면역능력이 있는 세포(immunocompetent cell)을 접촉시킴으로써 유도한다. 어떤 실시예에서, 시약으로서 적용되는 조성물은 펩티드 에피토프와 결합하고 그것을 인지하는 항원 특이적 CTL의 형성을 야기하는 모든 조성물일 수 있다. 펩티드 시약은 면역원으로서 사용될 필요는 없다. 상기 분석을 위해 사용된 검사 시스템은 테트라머(tetramer), 세포내 림포카인(lynphokine) 및 인터페론(interferon) 분비 검사법을 위한 염색, 또는 ELISPOT과 같은 상대적으로 최근의 기술 발달을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 펩티드 시약과 접촉하는 면역기능이 있는 세포는 수지상 세포를 포함한 항원-제시 세포일 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 펩티드는 종양 세포 항원 또는 면역원에 노출되어 항원-특이적 CTL의 존재를 위해 말초 혈액 단핵구를 검사하기 위한 테트라머 염색 검사법에서 사용될 수 있다. HLA 테트라머 복합체는 말초 혈액 단핵구의 샘플에서 직접적으로 항원 특이적 CTL을 가시화 하고(Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998; 및 Altman et al., Science 174: 94-96. 1996 참조), 항원-특이적 CTL 집단의 빈도를 결정하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드를 사용한 테트라머 시약은 하기에 기술된 것과 같이 생산될 수 있다.
HLA 분자에 결합하는 펩티드를 상응하는 HLA 중쇄 및 베타 2-마이크로글로불린의 존재하에 3분자 복합체를 생산하기 위하여 다시 접는다(refolding). 상기 복합체에서, 중쇄의 카복실 말단을 그 전에 단백질로 조작되었던 부위에서 바이오틴화한다. 그 후, 상기 3분자 복합체 및 스트렙토아비딘(streptoavidin)으로 구성된 테트라머를 형성하기 위하여 스트렙토아비딘을 복합체에 첨가한다. 형광으로 표지된 스트렙토아비딘으로써, 상기 테트라머는 항원-특이적 세포를 염색시키는데 사용될 수 있다. 그 후 상기 세포는, 예를 들면 세포 유동 분석(flow cytometry)에 의해서 동정된다. 상기 분석은 진단용 또는 예후의 목적을 위해 사용될 수 있다. 상기 과정에 의해 동정된 세포는 또한 치료적 목적을 위해 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 면역 회상 반응(immune recall response)을 평가하기 위해 본 발명의 펩티드를 포함하는 시약을 제공한다(Bertoni et al., J. Clin. Invest. 100: 503-513.1997 및 Penna et al., J. Exp. Med. 174: 1565-1570. 1991 참조). 예를 들면, 치료될 암을 앓고 있는 개개인으로부터의 환자 PBMC 샘플은 특이적 펩티드를 사용하여 항원-특이적 CTL의 존재를 위해 분석된다. 단핵구를 포함하는 혈액 샘플은 PBMC를 배양하고 상기 세포를 본 발명의 펩티드로 자극시킴으로써 검사된다. 적절한 배양 기간 후에, 상기 증식된 세포 집단에서 예를 들면 CTL 활성을 분석한다.
상기 펩티드는 백신의 효험(efficacy)를 평가하기 위해 시약으로서 사용될 수 있다. 면역원으로 예방접종된 환자로부터 수득한 PBMCs를, 예를 들면 상기 방법 중 하나를 사용하여 분석할 수 있다. 환자는 분석을 위해 선택되었다는 점에서, 환자는 HLA 종류가 있고, 대립 유전자 특이적 분자를 인지하는 펩티드 에피토프 시약이 있다. 백신의 면역원성은 PBMC 샘플에서 에피토프-특이적 CTLs의 존재에 의해 나타날 수 있다.
본 발명의 펩티드는 당업계에서 잘 알려진 기술을 사용함으로써 항체를 만드는데 사용될 수 있고(예를 들면 CurrentProtocolSinImmunology. Wiley/Greene. NY; 및 Antibodies a laboratory Manual. Harlow and Lane. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989를 참조), 이것은 암을 진단하고 모니터하는 시약으로서 유용할 수 있다. 상기 항체는 HLA 분자의 맥락에서, 펩티드를 인지하는 것, 즉 펩티드-MHC 복합체에 결합하는 항체일 수도 있다.
본 발명의 펩티드 및 조성물은 많은 첨가적 용도를 갖고, 그 일부는 여기서 기술된다. 예를 들면, 본 발명은 C6orf167 면역원성 폴리펩티드의 발현 또는 제시에 의해 특징화되는 질환을 진단하고 탐지하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 생물학적 샘플에서 C6orf167 HLA 결합 펩티드, 또는 C6orf167 HLA 결합 펩티드 및 HLA 종류 I 분자의 복합체의 발현 및 제시를 결정하는 것과 관련이 있다. 펩티드 또는 펩티드 및 HLA 종류 I 분자의 복합체의 발현 및 제시는 상기 펩티드 또는 복합체의 결합 파트너로 검사함으로써 결정되거나 탐지될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 펩티드 또는 복합체를 위한 결합 파트너는 펩티드에 특이적으로 결합하고 인지하는 항체이다. 생물학적 샘플, 예를 들면 종양 조직검사(biopsy)에서 C6orf167의 발현은 C6orf167 프라이머를 사용한 일반적인 PCR 증폭 프로토콜에 의하여 검사될 수 있다. 종양 발현의 예는 여기서 나타나고 나아가 C6orf167에 대한 예시적인 조건 및 프라이머의 공개는 WO2003/27322에서 발견될 수 있다.
바람직한 진단 방법은 생물학적 샘플에서 C6orf167 결합 펩티드의 존재를 탐지하기 위하여 C6orf167 HLA 결합 펩티드를 위한 특이적 물질과 함께 개체로부터 분리된 생물학적 샘플을 접촉시키는 것과 관련이 있다. 여기서 사용된 것과 같이, "접촉"은 물질 및 생물학적 샘플에 존재하는 C6orf167 HLA 결합 펩티드 사이에서 특이적 상호결합이 생성될 수 있도록 시약과 충분히 근접한 곳과 예를 들면 농축, 온도, 시간, 이온화 강도와 같은 적절한 조건에 생물학적 샘플을 놓아두는 것을 의미한다. 일반적으로, 분자 및 상기 분자의 생물학적 샘플에 있는 인지체(cognate) (예를 들면, 단백질 및 상기 단백질 인지체 수용체, 항체 및 상기 항체 인지체 단백질, 핵산 및 상기 핵산에 상보적 서열 인지체) 사이의 특이적 상호결합을 촉진하기 위해 물질을 생물학적 샘플과 접촉시키는 조건은 당업자에게 자명하다. 분자 및 그것의 인지체 사이의 특이적 상호결합을 촉진시키기 위한 예시적인 조건은 Low et al.에 의해 발행된 U.S. Patent No. 5,108,921에 기술되어 있다.
본 발명의 진단 방법은 생체 내 및 시험관 내 중 하나 또는 그 모두에서 수행될 수 있다. 따라서, 생물학적 샘플은 본 발명에서 생체내 또는 시험관 내에 위치할 수 있다. 예를 들면, 생물학적 샘플은 생체내에서 조직일 수 있고, C6orf167 면역원성 폴리펩티드에 특이적인 물질은 그 조직에서 상기 분자의 존재를 탐지하기 위해 사용될 수 있다. 또는, 생물학적 샘플은 시험관내에서 수집되거나 또는 분리될 수 있다(예를 들면, 혈액 샘플, 종양 조직검사, 조직 추출물). 특별히 선호되는 예에서, 생물학적 샘플은 세포 포함 샘플일 수 있고, 보다 바람직하게는 진단되거나 치료되는 개체로부터 수집된 종양 세포를 포함하는 샘플일 수 있다.
또는, 상기 진단은 형광으로 표지된 HLA 다중결합 복합체를 사용한 염색을 통해 항원-특이적 T 세포의 직접적인 정량을 허용하는 방법에 의해 수행될 수 있다(예를 들면, Altman. J. D. et al., 1996, Science 274: 94; Altman. J. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10330;). 세포내 림포카인 염색 및 인터페론-감마(interferon-gamma) 분비 검사법 또는 ELISPOT이 제공된다. 테트라머 염색, 세포내 림포카인 염색 및 ELISPOT 검사법 모두는 일반적인 검사에 비해 최소한 10배 이상의 민감하다(Murali-Krishna, K. et al., 1998, Immunity 8: 177; Lalvani, A. et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 859; Dunbar, P. R. et al., 1998, Curr. Biol. 8: 314;). 펜타머(pentamer) (예를 들면 US 2004-209295A), 덱스트라머(dextramer) (예를 들면, WO 02/072631), 및 스트렙타머[예를 들면 Nature Medicine 6. 631-637 (2002)] 또한 사용될 수 있다.
XIII . 면역 반응을 유도하는 방법
또한, 본 발명은 C6orf167에 관련된 질병에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 방법을 제공한다. 적당한 질병은 방광암(bladder cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 간내담도암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수 백혈병(chornic myelogenous leukemia; CML), 식도암(esophageal cancer), 위암(gastric cancer), 위 확산-형암(gastric diffuse-type cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 골육종(osteosarcoma), 신장암(renal carcinoma), 폐 선암(lung adenocarcinoma; ADC), 폐편평상피암(lung squamous cell carcinoma; SCC), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer; SCLC), 비소세포성 폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC), 연조직 종양(soft tissue tumor), 및 고환 종양(testicular tumor)를 포함하는 암이지만, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 본 발명의 어떤 펨티드 또는 그들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 물질 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명의 방법은 본 발명의 어떤 펩티드를 제시하는 엑소솜 또는 APC를 투여하는 것을 포함한다. 상세하게는, "IX. 약학적 조성물", 특히 백신으로서 본 발명의 약학적 조성물의 사용을 기술하는 부분을 참고할 수 있다. 또한, 면역 반응을 유도하는 본 발명의 방법에 적용할 수 있는 엑소솜 및 APC는 "V. 엑소솜", "VI. 항원-제시 세포(APCs)" 및 "펨티드, 엑소솜, APC 및 CTL을 사용하는 방법"의 (1) 및 (2)에 자세히 기술되어 있다.
또한, 본 발명은 면역 반응을 유도하는 약학적 조성물 또는 물질을 제조하는 방법 또는 과정을 제공하고, 여기에서 상기 방법은 본 발명의 펩티드를 약학적으로 허용가능한 전달체와 혼합하거나 또는 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
또는, 본 발명의 방법은 하기를 포함하는 백신 또는 약학적 조성물 또는 물질을 투여하는 단계를 포함할 수 있다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현 가능한 형태의 여기서 공개되는 펨티드를 암호화하는 핵산;
(c) 본 발명의 펩티드를 그 표면에 나타내는 APC 또는 엑소솜; 또는
(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.
본 발명에서, C6orf167을 과발현하는 암은 상기 활성 성문으로서 치료될 수 있다. 상기 암의 예는 방광암(bladder cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 간내담도암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수 백혈병(chornic myelogenous leukemia; CML), 식도암(esophageal cancer), 위암(gastric cancer), 위 확산-형암(gastric diffuse-type cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 골육종(osteosarcoma), 신장암(renal carcinoma), 폐 선암(lung adenocarcinoma; ADC), 폐편평상피암(lung squamous cell carcinoma; SCC), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer; SCLC), 비소세포성 폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC), 연조직 종양(soft tissue tumor), 및 고환 종양(testicular tumor)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 따라서, 활성 성분을 포함하는 백신 또는 약학적 조성물 또는 물질의 투여 이전에, 치료될 개체내 C6orf167의 발현 수준이 증진되었는지 확인하는 것은 바람직하다. 따라서, 한 실시예에서, 본 발명은 그것이 필요한 환자내 C6orf167을 (과)발현하는 암을 치료하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
i) 치료될 암을 가진 개체로부터 생물학적 샘플에서 C6orf167의 발현 수준을 결정하는 단계;
ii) C6orf167의 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계; 및
iii) 상기 기술된 (a) 내지 (d)로 구성된 군으로부터 선택된 최소한 하나의 구성요소를, 정상 대조군에 비해 C6orf167을 과발현하는 암을 갖는 개체내에 투여하는 단계.
또는, 본 발명은 C6orf167을 과발현하는 암을 갖는 개체로 투여되기 위해, 상기 기술된 (a) 내지 (d)fh 구성된 군으로부터 선택된 최소한 하나의 구성요소를 포함하는 백신 또는 약학적 조성물 또는 물질을 제공한다. 다시 말해서, 본 발명은 본 발명의 C6orf167 폴리펩티드로 치료되는 개체를 밝혀내기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 개체-유래 생물학적 샘플에서 C6orf167의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기에서 정상 대조군에 비해 상기 유전자의 발현 수준의 증가는 그 개체가 본 발명의 C6orf167 폴리펩티드로 치료될 수 있는 암을 갖고있을 수도 있다는 것을 가르킨다. 본 발명의 암을 치료하는 방법은 하기에 보다 자세히 기술될 것이다.
본 발명에 따라서, 개체로부터의 생물학적 샘플에서 C7orf167의 발현 수준은 결정될 수 있다. 상기 발현 수준은, 예를 들어 "XI. 암을 탐지 또는 진단하기 위한 방법"에 기술된 방법에 따라서 결정될 수 있다.
하나의 예시에서, 본 발명은 (i) 개체가 치료될 수 있는 암을 가지는지 진단하고, 및/또는 (ii) 암 치료를 위한 개체를 선택하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 치료될 암을 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 C6orf167의 발현 수준을 결정하는 단계;
b) C6orf167의 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계;
c) C6orf167의 발현 수준이 정상 대조군과 비교하여 증가되었다면, 치료될 암을 갖는 개체로 진단하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 그 개체가 치료될 암을 갖는 것으로 진단되었다면, 암 치료를 위한 개체로 선택하는 단계.
또는, 상기 방법은 하기의 단계로 구성될 수 있다:
a) 치료될 암을 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 C6orf167의 발현 수준을 결정하는 단계;
b) 암 대조군 수준과 C6orf167의 발현 수준을 비교하는 단계;
c) C6orf167의 발현 수준이 암 대조군 수준과 유사하거나 또는 동등하다면, 치료될 암을 갖는 개체로 진단하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 치료될 암을 갖는 것으로 진단되는 개체라면, 암 치료를 위한 개체로 선택하는 단계.
XIV . 항체
본 발명은 본 발명의 펩티드에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직한 항체는 특이적으로 본 발명의 펩티드와 결합하고 본 발명의 펩티드가 아닌 것에 결합하지 않을 것이다(또는 약하게 결합). 또는, 항체는 본 발명의 펩티드 뿐만 아니라 그것의 상동체와 결합한다. 본 발명의 펩티드에 대한 항체는 암 진단 또는 예후 검사법, 이미지화 방법론(imaging methodology)에서 사용될 수 있다. 유사하게, 상기 항체는 암 환자에서 발현되거나 또는 과발현되는 정도의 다른 암을 치료, 진단 및/또는 예후에서 사용될 수 있다. 또한, 세포 내 발현되는 항체(예를 들면, 단일 사슬 항체)는 C6orf167의 발현이 관련된 암, 예를 들면 방광암(bladder cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 간내담도암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수 백혈병(chornic myelogenous leukemia; CML), 식도암(esophageal cancer), 위암(gastric cancer), 위 확산-형암(gastric diffuse-type cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 골육종(osteosarcoma), 신장암(renal carcinoma), 폐 선암(lung adenocarcinoma; ADC), 폐편평상피암(lung squamous cell carcinoma; SCC), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer; SCLC), 비소세포성 폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC), 연조직 종양(soft tissue tumor), 및 고환 종양(testicular tumor)을 치료하는게 치료적으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 C6orf167 단백질(서열 번호: 159) 또는 서열 번호: 1 내지 61 및 63 내지 151로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 포함하는 그것의 단편의 탐지 및/또는 정량을 위한 다양한 면역학적 검사법을 제공한다. 상기 검사법은 C6orf167 단백질 또는 그것의 단편과 결합하고 인지할 수 있는 하나 또는 그 이상의 항-C6orf167 항체를 적절하게 포함할 수 있다.
본 발명에서, C6orf167 폴리펩티드와 항-C6orf167 항체의 결합은 바람직하게 서열 번호: 1 내지 61 및 63 내지 151로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 폴레펩티드를 인지한다. 항체의 결합 특이성은 억제 검사(inhibition test)를 사용하여 확인될 수 있다. 즉, 서열 번호: 1 내지 61 및 63 내지 151의 아미노산 서열로 구성된 어떤 단편의 폴리펩티드의 존재하에서 분석될 항체 및 C6orf167 폴리펩티드 전장 사이의 결합이 억제될 때, 상기 항체는 그 단편에 특이적으로 결합하는 것을 보여준다. 본 발명에서, 상기 면역학적 검사법은 당업계에 잘 알려진 다양한 면역학적 검사법 종류 내에서 수행되고, 방사선면역검사법(radioimmunoassay), 면역-크로마토그래프 기술(immuno-chromatograph technique), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), ELIFA(enzyme-linked immunofluorescent assay), 및 그와 같은 것의 다양한 유형을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 관련된 면역학적이지만 비항체 검사법은 T 세포 면역원성 검사법(억제성 또는 자극성)뿐만 아니라 MHC(major histocompatibility complex) 결합 검사법을 포함할 수 있다. 또한, C6orf167을 발현하는 암을 탐지할 수 있는 면역학적 이미지 방법은 본 발명에 의해 제공되고, 본 발명의 표지된 항체를 사용한 방사선 동위 원소 이미지 방법(radioscintigraphic imaging method)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 상기 검사법은 C6orf167을 발현하는 암, 예를 들면 방광암(bladder cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 간내담도암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수 백혈병(chornic myelogenous leukemia; CML), 식도암(esophageal cancer), 위암(gastric cancer), 위 확산-형암(gastric diffuse-type cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 골육종(osteosarcoma), 신장암(renal carcinoma), 폐 선암(lung adenocarcinoma; ADC), 폐편평상피암(lung squamous cell carcinoma; SCC), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer; SCLC), 비소세포성 폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC), 연조직 종양(soft tissue tumor), 및 고환 종양(testicular tumor)을 포함하지만 이로 제한되지 않는 암의 탐지, 모니터, 및 예후에 임상적으로 유용하다.
본 발명은 본 발명의 펩티드와 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 단일클론 또는 다중클론 항체와 같은 어떠한 형체에서도 사용될 수 있고, 또한 본 발명의 펩티드로 면역화된 동물, 예를 들면 토끼에 의해 수득된 항혈청을 포함하고, 모든 종류의 다중클론 및 단일클론 항체, 인간항체, 및 유전적 재조합에 의해 생성된 인간화된 항체를 포함한다.
항체를 얻기 위해 항원으로서 사용된 본 발명의 펩티드는 어떠한 동물의 종류에서도 유래될 수 있으나, 바람직하게는 인간, 마우스(mouse), 또는 랫(rat), 보다 바람직하게는 인간과 같은 포유류로부터 유래된 것이다. 인간-유래 펩티드는 여기서 공개된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로부터 수득될 수 있다.
본 발명에 따라, 면역원성 항원으로서 사용되는 상기 펩티드는 완전한 단백질일 수도 있고 상기 단백질의 부분적 펩티드일 수도 있다. 예를 들면, 부분적 펩티드는 본 발명 펩티드의 아미노 N 말단 또는 카복시(C) 말단 단편을 포함할 수 있다.
여기에서, 항체는 C6orf167 펩티드의 전장 또는 단편에 반응하는 단백질로 정의된다. 바람직한 실시예에서는, 본 발명의 항체는 서열 번호: 1 내지 61 및 63 내지 151로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 C6orf167의 단편 펩티드를 인지할 수 있다. 올리고펩티드를 합성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 합성 후에, 펩티드는 면역원으로서 사용되기 전에 선택적으로 정제될 수 있다. 본 발명에서, 올리고펩티드(예를 들면 9 또는 10mer)는 면역원성을 증진시키기 위해 담체와 결합되거나 연결될 수 있다. KLH(Keyhole-Limpet hemocyanin)은 담체로서 잘 알려져 있다. KLH와 펩티드를 결합시키는 방법도 당업계에 잘 알려져 있다.
또는, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 유전자 또는 그것의 단편은 알려진 발현 벡터로 삽입될 수 있고, 그 후 여기서 기술되는 것과 같이 숙주 세포에 형질도입시키는데 사용된다. 원하는 펩티드 또는 그것의 단편은 어떤 표준 방법에 의해 숙주 세포의 안 또는 밖으로부터 회복될 수 있고, 그 후에 항원으로서 사용될 수 있다. 또는, 펩티드를 발현하는 전체 세포 또는 그들의 용해물(lysate) 또는 화학적으로 합성된 펩티드가 항원으로서 사용될 수 있다.
모든 포유류 동물은 항원으로 면역화될 수 있지만, 세포 융합에 사용된 모 세포(parental cell)와 양립성(compatibility)이 있는 것이 바람직하다. 일반적으로, 설치류(Rodentia), 토끼류(Lagomorpha) 또는 영장류(Primates)의 동물이 사용될 수 있다. 설치류의 동물은 예를 들면 마우스, 랫 및 햄스터(hamster)를 포함한다. 토끼류는 예를 들면 토끼(rabbit)을 포함한다. 영장류는 예를 들면 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis), 붉은털 원숭이(rhesus monkey), 망토개코원숭이(sacred baboon) 및 침팬지와 같은 토끼목[Catarrhini(늙은 세계 원숭이, old world monkey)]의 원숭이를 포함한다.
항원으로 동물을 면역화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 항원의 복강내(intraperitoneal) 주입 또는 피하(subcutaneous) 주입이 포유류의 면역화를 위한 표준 방법이다. 보다 구체적으로, 항원은 PBS(phosphate buffered saline), 생리적 살린(physiological saline) 등의 적절한 양에서 희석되거나 서스펜션될 수 있다. 바람직하다면, 상기 항원 서스펜션은 적절한 양의 프로인트 완전 보강제(Freund's complete adjuvant)와 같은 표준 보강제와 혼합되고, 유화액으로 만들어진 후 포유류 동물에게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 그 후매 4 내지 21일마다 프로인트 완전 보강제의 적절한 양과 한께 혼합한 항체를 여러번 투여하는 것이다. 적절한 담체(carrier)도 면역화를 위해 사용될 수 있다. 상기와 같은 면역화 후, 혈청은 원하는 항체의 양의 증가를 위한 표준 방법에 의해 조사될 수 있다.
본 발명의 펩티드에 대한 다중 클론 항체는 혈청에서 바라는 항체의 증가를 위해 시험되는 면역화된 포유류의 혈액을 수거함으로써, 그리고 어떠한 보편적인 방법에 의해 혈액으로부터 혈청을 분리시킴으로써 준비될 수 있다. 다중클론 항체는 다중클론 항체를 포함하는 혈청을 포함할 뿐만 아니라 상기 다중클론 항체를 포함한 분획물을 혈청으로부터 분리할 수 있다. 면역글로불린(immunoglobulin) G 또는 M은 오직 본 발명의 펩티드를 인지하는 분획물로부터 예를 들면 본 발명의 펩티드와 연결된 친화성 컬럼을 사용하여, 그리고 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼을 사용하여 상기 분획물을 정제하는 것에 의해 준비될 수 있다.
단일클론 항체를 준비하기 위하여, 항원으로 면역화시킨 포유류로부터 면역세포를 수거하고, 그 면역세포에서 상기 기술된 것과 같이 혈청에서 바라는 항체의 증가된 수준을 검사하고, 세포 융합을 한다. 바람직하게, 세포 융합을 위해 사용되는 면역 세포는 비장으로부터 수득된다. 바람직한 상기 면역세포와 함께 융합되는 다른 모 세포는 포유류의 골수 세포(myeloma cell), 보다 바람직하게는 약물에 의해 융합된 세포의 선택을 위해 획득한 특성을 갖는 골수 세포를 포함한다.
상기 면역 세포 및 골수 세포는 알려진 방법, 예를 들면 Milstein et al.[Galfre and Milstein, Method Enzymol 73: 3-26(1981)]의 방법에 따라 융합될 수 있다.
상기 세포 융합에 의해 수득된 결과인 하이브리도마(hybridoma)는 HAT 배지[히포크산틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin) 및 티미딘(thymidine)을 포함하는 배지]와 같은 표준 선택 배지에 그들을 배양함으로써 선택될 수 있다. 상기 세포 배양은 일반적으로 HAT 배지에서 몇 일 내지 몇 주동안 지속되는데, 이는 원하는 하이브리도마를 제외하고 모든 다른 세포(non-fused cell)을 사멸시키기 위해 충분한 시간이다. 그 후, 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포을 복제(clone)시키고 스크린하기 위해 표준 제한 희석(standard limiting dilution)을 수행한다.
하이브리도마를 제조하기 위해 비인간 동물을 항원으로 면역화시킨 상기 방법 뿐만 아니라, EB 바이러스에 의해 감염된 인간과 같은 인간 림프구는 펩티드, 펩티드를 발현하는 세포 또는 그들의 용해물을 사용하여 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 그 후, 상기 펩티드에 결합할 수 있는 원하는 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 생산하기 위해, 면역화된 림프구를 U266과 같은 무한으로 분열할 수 있는 인간 유래 골수 세포와 융합한다(Unexamined Published Japanese Patent Application No. Sho 63-17688).
그 후 상기 수득된 하이브리도마를 마우스(mouse)의 복강(abdominal cavity)로 이식하고 그 복수를 추출한다. 상기 수득한 단일클론 항체를, 예를 들면 암모늄 황산 침전, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼, DEAE 이온 교환 크로마토그래피 또는 본 발명의 펩티드가 연결된 친화성 컬럼과 같은 방법에 의해 정제할 수 있다. 본 발명의 항체는 본 발명의 펩티드의 정제 및 탐지에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명의 펩티드의 작용제 및 길항제에 대한 후보로서 사용될 수도 있다.
또는, 항체를 생산하는 면역화된 림프구와 같은 면역 세포는 종양유전자(oncogene)에 의해 무한증식(immortalization)될 수 있고 단일클론 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
그러므로 수득된 단일클론 항체는 유전자 조작 기술을 사용하여 재조합적으로 제조될 수 있다[예를 들면 MacMillan Publishers LTD의해 영국에서 출간된 Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies(1990) 참조]. 예를 들면, 항체를 암호화하는 DNA는 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 면역화된 림프구와 같은 면역 세포로부터 클론될 수 있고, 적절한 벡터로 삽입될 수 있으며, 재조합 항체를 만들기 위해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 기술된 재조합 항체를 제공한다.
또한, 본 발명의 항체는 하나 또는 그 이상의 본 발명 펩티드와 결합하는 한 항체의 단편 또는 변형된 항체일 수 있다. 예를 들면, 상기 항체 단편은 Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일 쇄 Fc(scFv)일 수 있고, 여기서 H 및 L 사슬로부터의 Fv 단편은 적절한 링커(linker)에 의해 연결된다[Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)]. 보다 구체적으로, 항체 단편은 파페인(papain) 또는 펩신(pepsin)과 같은 효소와 함께 항체를 처리함으로써 생성될 수 있다. 또는, 상기 항체 단편을 암호화하는 유전자는 제조될 수 있고, 발현 벡터로 삽입될 수 있으며 적절한 숙주 세포내에서 발현될 수 있다[예를 들면, Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994); Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989); Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986); Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991) 참조].
항체는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol; PEG)와 같은 다양한 분자와 연결됨으로써 변형될 수 있다. 본 발명은 상기 변형된 항체를 제공한다. 상기 변형된 항체는 화학적으로 변형된 항체로부터 얻을 수 있다. 상기 변형 방법은 당업계에서 보편적이다.
또는, 본 발명의 항체는 비인간 항체로부터 유래된 가변 부위(variable region) 및 인간 항체로부터 유래된 불변 부위(constant region) 사이의 키메라 항체로서, 또는 비인간 항체로부터 유래된 CDR(complementarity determining region), FR(framework region) 및 인간항체로부터 유래된 불변 부위를 포함하는 인간화된 항체로서 수득될 수 있다. 상기 항체는 알려진 기술에 따라 제조될 수 있다. 인간 항체의 상응하는 서열에 대한 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 치환함으로써 인간화(humanization)이 수행될 수 있다[예를 들면, Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) 참조]. 따라서, 상기 인간화된 항체는 키메라 항체이고, 여기서 온전한 인간 가변 도메인 보다 상당히 적은 도메인은 비인간 종류로부터 그에 상응하는 서열에 의해 치환되었다.
전체적으로 인간 프레임워크 및 불변 부위 뿐만 아니라 인간 가변 부위로 구성된 인간 항체 또한 사용될 수 있다. 상기 항체는 당업계에 알려진 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들면 시험관 내 방법(in vitro method)은 인간 항체 단편이 제시되는 박테리오파지의 재조합 라이브러리[예를 들면, Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991)]의 사용과 관련이 있다. 유사하게, 인간 항체는 인간 면역글로불린 위치(loci)를 형질전환 동물, 예를 들면 내재성 면역 글로불린 유전자(endogenous immunoglobulin gene)이 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스로 도입시킴으로써 만들어질 수 있다. 상기 접근은 예를 들면 U.S. Patent Nos. 6,150,584, 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016에 기술되어 있다.
상기와 같이 수득한 항체는 동종성(homogeneity)으로 정제될 수 있다. 예를 들면 항체의 분리 및 정제는 일반적인 단백질에서 사용되는 분리 및 정제 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 적절하게 선택되고 혼합된 컬럼 크로마토그래피의 사용, 예를 들면 친화성 크로마토그래피, 여과, 울트라여과, 염-외 희석(salting-out dialysis), SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 등점적 전기영동(isoelectric focusing)에 의해 상기 항체는 분리(sepseration) 및 분리(isolation)될 수 있으나[Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)], 이에 한정되지는 않는다. 단백질 A 컬럼 및 단백질 G 컬럼은 친화성 컬럼으로서 사용될 수 있다. 사용되는 예시적인 단백질 A 컬럼은 예를 들면 Hyper D, POROS 및 Sepharose F.F. (Pharmacia)를 포함한다.
친화성을 제외한 크로마토그래피의 예는, 예를 들면 이온교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography), 소수성 크로마토그래피(hydrophobic chromatography), 겔 여과(gel filtration), 역상 크로마토그래피(reverse-phase chromatography), 흡착 크로마토그래피(adsorption chromatography) 및 그와 같은 것[Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)]을 포함한다. HPLC 및 FPLC와 같은 크로마토그래피 절차는 액체상 크로마토그래피(liquid-phase chromatography)에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 흡수도의 측정, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), EIA(enzyme immunoassay), RIA(radioimmunoassay) 및/또는 면역형광이 본 발명 항체의 항원 결합 활성(antigen binding activity)을 측정하기 위해 사용될 수 있다. ELISA에서, 본 발명의 항체를 플레이트에 고정시키고, 본 발명의 펩티드를 플레이트에 첨가한 후, 항체를 생산하는 세포의 배양 상층액 또는 정제된 항체와 같은 원하는 항체를 포함하는 샘플을 첨가한다. 그 후, 1차 항체를 인지하고 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)와 같은 효소로 표지된 2차 항체를 적용하고, 상기 플레이트를 배양한다. 그 다음, 씻어준 후, p-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenyl phosphate)와 같은 효소 기질을 플레이트에 적용시키고, 상기 샘플의 항원 결합 활성을 평가하기 위하여 그 흡수도를 측정한다. C 말단 또는 N 말단 단편과 같은 펩티드의 단편은 항체의 결합 활성을 평가하기 위해 항원으로서 사용될 수 있다. 비아코어[BIAcore(Pharmacia)]는 본 발명에 따른 항체의 활성을 평가하기 위하여 사용될 수 있다.
상기 방법은 본 발명의 항체를 본 발명의 펩티드를 포함한다고 가정되는 샘플에 노출시킴으로써 본 발명의 펩티드를 탐지 또는 측정하게 해주고 상기 항체 및 상기 펩티드에 의해 형성된 면역 복합체를 탐지 또는 측정하게 해준다.
본 발명에 따른 펩티드를 탐지 또는 측정하는 방법은 특이적으로 펩티드를 탐지 또는 특정할 수 있기 때문에, 이 방법은 상기 펩티드를 사용하는 다양한 실험에서 유용할 것이다.
XV . 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 도입시키는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 벡터는 뉴클레오티드, 특히 숙주세포에서 본 발명의 DNA를 보유하기에 유용하고, 본 발명의 펩티드를 발현시키기에 또는 유전자 치료를 위한 본 발명의 뉴클레오티드를 투여하기에 유용하다.
E.coli가 숙주 세포이고 벡터가 E.coli 내에서(예를 들면, JM109, DH5 alpha, HB101 또는 XL1Blue) 대량으로 증폭되고 생산될 때, 상기 벡터는 E.coli 내에서 증폭되기 위해 "ori" 및 형질전환된 E.coli를 선별하기 위한 유전자 마커[예를 들면 암피실린(ampicillin), 테트라사이클린(tetracycline), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 또는 그와 같은 것과 같은 약물에 의해 선별되는 약물 내성 유전자]을 가져야 한다. 예를 들면 M13-시리즈 벡터, pUC-시리즈 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등이 사용될 수 있다. 또한, pGEM-T, pDIRECT 및 pT7 또한 상기 기술된 cDNA 뿐만 아니라 벡터를 서브클로닝하고 추출하기 위해 사용될 수 있다. 벡터가 본 발명의 단백질을 생산하기 위해 사용될 때, 발현 벡터는 특히 유용하다. 예를 들면, E.coli에서 발현되는 발현 벡터는 E.coli 내에서 증폭되기 위하여 상기 특징을 가져야 한다. JM109, DH5 alpha, HB101 또는 XL1 Blue와 같은 E.coli를 숙주 세포로서 사용할 때, 벡터는 E.coli내에서 원하는 유전자를 효율적으로 발현시키는 프로모터, 예를 들면 lacZ 프로모터[Ward et al., Nature 341: 544-6 (1989); FASEB J 6: 2422-7 (1992)], araB 프로모터[Better et al., Science 240: 1041-3 (1988)], T7 프로모터 또는 그와 같은 것을 가져야 한다. 상기 면에서, 예를 들면 pGEX-5X-1(Pharmacia), "QIAexpress system"(Qiagen), pEGFP 및 pET(이 경우에는, 숙주 세포는 우선적으로 T7 RNA 중합효소를 발현하는 BL21이다)가 상기 벡터들 대신 사용될 수 있다. 또한, 상기 벡터는 펩티드 분비를 위한 신호 서열(signal sequence)을 포함할 수 있다. E. coli의 주변 세포질(periplasm)로 분비되도록 펩티드에 지시하는 신호 서열의 예는 pelB 신호 서열[Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987)]이 있다. 벡터를 표적 숙주 세포로 도입시키기 위한 수단은 예를 들면 칼슘 클로라이드(calcium chloride) 방법 및 전기침공(electroporation) 방법을 포함한다.
E.coli 뿐만 아니라, 예를 들면, 포유류로부터 유래된 발현 벡터[예를 들면, pcDNA3(Invitrogen) 및 pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)), pEF, pCDM8], 곤충 세포로부터 유래된 발현 벡터[예를 들면, "Bac-to-BAC baculovirus expression system" (GIBCO BRL), pBacPAK8], 식물로부터 유래된 발현 벡터(예를 들면, pMH1, pMH2), 동물 바이러스로부터 유래된 발현 벡터(예를 들면, pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스로부터 유래된 발현 벡터(예를 들면, pZIpneo), 효모로부터 유래된 발현 벡터[예를 들면, "Pichia Expression Kit" (Invitrogen), pNV11, SP-Q01] 및 바실러스 섭틸릭스(Bacillus subtilis)로부터 유래된 발현 벡터(예를 들면, pPL608, pKTH50)가 본 발명의 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있다.
CHO, COS 또는 NIH3T3와 같은 동물 세포에서 벡터를 발현시키기 위해서, 벡터는 상기 세포 내에서 발현에 필요한 프로모터, 예를 들면 SV40 프로모터[Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)], MMLV-LTR 프로모터, EF1 알파 프로모터[Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)], CMV 프로모터 및 그와 같은 것를 가져야 하고, 바람직하게 형질전환체를 선별하기 위한 유전자 마커[예를 들면, 약물(neomycin, G418)에 의해 선별되는 약물 내성 유전자]를 가져야 한다. 상기 특징을 가진 알려진 벡터의 예는, 예를 들면 pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV 및 pOP13를 포함한다.
본 발명은 구체적인 실시예과 함께 자세히 기술되었지만, 앞으로의 기술은 예시 및 설명이고 본 발명 및 그것의 바람직한 실시예를 예시하기 위한 의도임을 이해해야 한다. 일반적은 실험방법을 통하여, 당업자는 다양한 변화 및 변형이 본 발명의 뜻과 범위에서 벗어나지 않고 만들어 질수 있다는 것을 쉽게 인지할 것이다. 따라서, 본 발명은 상기 기술이 아니고 하기 청구항 및 그와 동등한 것에 의해 정의되려는 의도를 갖는다.
실시예
재료 및 방법
실험 1
세포주 및 임상 샘플
23개의 인간 폐암 세포주는 19개의 NSCLC(A427, A549, NCI-H1373, LC319, PC-14, PC-3, PC-9, NCI-H1666, NCI-H1781, NCI-H647, NCI-H226, NCI-H1703, NCI-H520, LU61, RERF-LC-AI, SK-MES-1, EBC-1, LX1, 및 NCI-H2170) 및 4개의 SCLC(DMS114, DMS273, SBC-3, 및 SBC-5)를 포함한다. 인간 식도암 세포주는 9개의 SSC(squamous cell carcinomas: TE1, TE2, TE3, TE4, TE5, TE6, TE8, TE9, 및 TE10) 및 1개의 선암(ADC: TE7)을 포함한다. 모든 세포는 단일층으로 10% 우태아 혈청(FCS)이 첨가된 적절한 배지에서 성장하였고 5% CO2가 있는 습한 공기의 37℃에서 유지되었다.
또한, 인간 소 기도 상피 세포( small airway epithelial cell ), SAEC(Cambrex Bio Science Inc ., East Rutherford , NJ )도 사용되었다. 1차세포( primary cell ) NSCLC 샘플은 선동의하에 수득되었다 .
A24 림프아형 세포주(A24 lymphoblastoid cell line ; A24LCL)를 엡스테인 -바( Epstein - Barr ) 바이러스를 사용하여 HLA -A24 양성 인간 B 림프구로 형질전환함으로써 제작하였다. 아프리칸 그린 원숭이 신장 세포주인 COS7 를 ATCC 에서 구입하였다.
반정량 RT -PCR( semiquantatitive RT - PCR )
임상 폐 및 식도암 샘플의 mRNA 로부터 준비된 각각의 단일-선 cDNA 를 적절히 희석하여 준비하고, 베타-액틴( beta actin ; ACTR ) 발현 수준을 정량적 대조군으로 사용하였다. 증폭을 위한 프라이머 세트는 하기와 같다: ACTB 증폭을 위해, ACTB -F (5'- GAGGTGATAGCATTGCTTTCG -3') (서열 번호: 152) 및 ACTB -R (5'-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3') (서열 번호: 153), C6orf167 증폭을 위해, C6orf167 -F (5'-GTCTCACCTTGGACAGATGG-3') (서열 번호: 154) 및 C6orf167 -R (5'-CCAAGGATCCTATTACACAGTTGC-3') (서열 번호: 155).
모든 반응은 GeneAmp PCR 시스템 9700( Applied Biosystems , Foster City , CA)를 사용하여, 초기 변성을 위한 95℃에서 5분 후 사이클( cycle ) [95℃에서 30초, 56℃에서 30초, 및 72℃에서 60초]를 ACTB 증폭시 22회, C6orf167 증폭시 30회로 수행되었다.
노던- 블랏 분석( Northen - blot analysis )
인간 다수-조직 블랏 ( multi - tissue blots ) (심장, 뇌, 태반, 폐, 간, 골격근, 신장, 췌장, 비장, 흉선, 전립선, 고환, 난소, 소장, 결장, 백혈구를 포함한 16개의 정상 조직; BD Biosciences Clontech , Palo Alto , CA )을 C6orf167 의 32 P-표지 PCR 생산물과 혼성화시켰다 . C6orf167 cDNA 의 부분( partial length )을 프라이머 C6orf167 -F1 ( CTGGAAGAGGCAGTTGAAAA ) (서열 번호: 156) 및 C6orf167 - R1 (ATCGCCCAATATACTGCTCA) (서열 번호: 157)를 사용하여 RT - PCR 에 의해 준비하였다. 선혼성화( prehybridization ), 혼성화 , 및 세척을 공급자의 지시에 따라 수행되었다. 상기 블랏은 -80℃에서 7일 동안 스크린을 강화시켜 방사능 사진으로 나타내었다.
C6orf167 유래 펩티드의 후보 선택
HLA-A*2402 분자에 결합하는 C6orf167 유래의 9-머(mer) 및 10-머 아미노산 펩티드를 결합 예측 소프트웨어 "BIMAS"(http://www-bimas. cit. nih. gov/molbio/hla_bind)를 사용하여 예측하였다[Parker KC et al.(J Immunol 1994, 152(1): 163-75) 및 Kuzushima K et al.(Blood 2001, 98(6): 1872-81)]. 이러한 펩티드는 표준적인 고체상 합성법에 따라 SIGMA(Sapporo, Japan)에 의해 합성되었고, 역상고속액체크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다. 상기 펩티드의 순도(>90%) 및 확인(identity)은 각각 분석용 HPLC 및 질량분석(mass spectrometry analysis)을 통하여 각각 측정하였다. 펩티드를 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 20mg/ml로 용해하고, -80℃에서 저장하였다.
시험관 내에서의 CTL 유도
단핵구 유래 수지상세포(dendritic cell, DC)를 항원-제시 세포(antigen-presenting cell, APC)로 사용하여 인간 백혈구 항체(human leukocyte antigen, HLA)에 제시된 펩티드에 대한 CTL 반응을 유도하였다. 참고 문헌[(Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8]에 기재된 바와 같이, DC를 시험관 내에서 제작하였다. 구체적으로, 피콜-플라크(Ficoll-Plaque; Pharmacia) 용액을 사용하여 정상적인 지원자(HLA-A*2402 양성)에서 분리한 말초 혈액 단핵구(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 단핵구 비율을 높이기 위하여 플라스틱 조직 배양 접시(Becton Dickinson)에 대한 부착에 의해 분리하였다. 단핵구가 많은 개체군을 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)(R&D System)의 1000U/ml 및 인터루킨-4(interleukin-4, IL-4) (R&D System)의 1000U/ml가 존재하에 열에 의해 비활성화된 자가혈청(autologous, AS)의 2%를 포함하는 AIM-V 배지(Invitrogen)에서 배양하였다. 배양 7일 후, 사이토카인-유도 DC에, AIM-V 배지에서 37℃에서 3시간 동안,β2-마이크로글로불린의 3μg/ml 존재하에서 합성 펩티드의 20μg/ml를 부가하였다(pulse). 제조된 세포는 그 세포표면에, CD80, CD83, CD86 및 HLA 종류 II 등의 DC 관련 분자를 발현하는 것으로 나타났다(결과는 나타내지 않음). 그런 다음, 펩티드 부가한(pulsed) DCs를 X-선 방사선(20Gy)로 불활성화하여, CD8 양성 분리 키트(Positive Isolation Kit) (Dynal)를 사용하여 양성 선택으로 얻은 자가 CD8 양성 T 세포와(autologous CD8+ Tcells)과 1:20의 비율로 혼합하였다. 이들 배양물을 48-웰 플레이트(Corning)에 배양하여; 각 웰은 1.5×104개의 펩티드-부가 DC(peptide-pulsed DC), 3×105개의 CD8 양성 T 세포 및 10ng/ml의 IL-7(R&D System)을 0.5ml의 AIM-V/2% AS 배지에 포함하였다. 배양 3일 후, 상기 배양액에 최종 농도를 20IU/ml가 되도록 하여 IL-2(CHIRON)를 첨가하였다. 7일 및 14일째에, 자가 펩티드-부가 DC(autologous peptide-pulsed DCs)로 T 세포를 더 자극하였다. 상기와 같은 방법으로 상기 DC를 매회 제조하였다. 21일 째에 3차 펩티드 자극 후, 펩티드-부가 A24LCL 세포에 대한 CTL을 측정하였다[Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1):94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20,84(8):1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24):8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5):411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506].
CTL 증식 과정
Riddell 등에 의해 보고된 방법과 유사한 방법을 사용한 배양에서 CTL을 증식시켰다[Walter et al., N Engl J Med 1995, 333(16):1038-44; Riddell et al, Nat Med 1996 Feb, 2(2):216-23]. 총 5×104 개의 CTL을 40ng/ml의 항 CD3 단일 클론 항체(Pharmingen)의 존재 하에서, 25ml의 AIM-V/5% AS 배지에 미토마이신 C(mitomycin C)에 의해 불활성화된 두 종류의 인간 B 림프아구양(lymphoblastoid) 세포주와 함께 현탁하였다. 배양 시작한 뒤 1일 후, IL-2의 120IU/ml를 상기 배양에 첨가하였다. 5, 8 및 11일째에 IL-2의 30IU/ml를 포함하는 신선한 AIM-V/5% AS 배지를 상기 배양에 공급하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5,84(1):94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20,84(8):1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24):8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May ,97(5):411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506).
CTL 클론( clone )의 수립
96 웰 둥근 밑면 마이크로 타이터 플레이트(round-bottomed micro titer plate, Nalge Nunc International)에 한 웰당 0.3, 1 및 3 CTL이 되도록 희석하였다. CTL을 1×104 세포/웰(well)의 두 종류의 인간 B 림프아구양 세포주, 30ng/ml의 항-CD3 항체 및 IL-2의 125U/ml와 함께, 5%의 AS를 포함하는 AIM-M 배지의 총 150μl/웰에서 배양하였다. 10일 후, IL-2의 최종농도가 125U/ml이 되도록 상기 배지에 IL-2의 50μl/웰을 첨가하였다. 14일째에 CTL 활성을 시험하였고, 상기와 기술된 것과 동일한 방법을 이용하여 CTL 클론을 증식시켰다[Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24):8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5):411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506].
특이적인 CTL 활성
특이적인 CTL 활성을 조사하기 위하여, 인터페론-감마(interferon-gamma, IFN-γ) ELISPOT(enzyme-linked immunospot) 검사 및 IFN-감마 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 실시하였다. 구체적으로, 펩티드-부가 A24LCL(1×104/웰)을 자극 세포(stimulator cell)로서 제조하였다. 48웰에 배양된 세포를 반응 세포(responder cell)로서 사용하였다. IFN-감마 ELISPOT 검사 및 IFN-감마 ELISA 검사를 제조사 과정에 따라서 수행하였다.
플라스미드 형질도입( transfection )
표적 유전자 또는 HLA-A2402의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 암호화하는 cDNA를 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 PCR-증폭 생산물은 pCAGGS 벡터로 클로닝되었다. 제조사에서 제공하는 과정에 따라서 리포펙타민2000(lipofectamine 2000) (Invitrogen)을 사용하여, 상기 플라스미드를 표적 유전자 및 HLA-A24-음성 세포주, COS7으로 형질도입시켰다. 형질도입 2일 후에, 상기 형질도입된 세포를 versene(Invitrogen)을 사용하여 수거하였고, CTL 활성 검사를 위해 표적세포로서 사용되었다(5x104세포/웰).
결과
암에서 증가된 C6orf167 발현
cDNA-마이크로어레이(microarray)를 사용하여 다양한 암으로부터 수득된 전체 유전자 발현 분석 데이타는 C6orf167[GenBank Accession No. NM 198468.2; 예를 들면 서열 번호: 158)]발현이 증가된 것을 나타낸다. C6orf167 발현은 상응하는 정상 조직과 비교했을 때, 방광암 17례 중 13례에서, 자궁 경부암 2례 중 2례에서, 간내담도암 11례 중 8 례에서, CML 33례 중 20례에서, 식도암 15례 중 11례에서, 위암 8례 중 5례에서, 위 확산형 암 2례 중 2례에서, 폐암 2례 중 1례에서, 림프종 2례 중 2례에서, 골육종 3례 중 2례에서, 신장암 12례 중 5례에서, SCLCs 4례 중 4례에서, 연조직 종양 1례 중 1례에서, 고환 종양 2례 중 1례에서 증가된 것을 나타낸다(표 1)
상응하는 정상 조직과 비교하여 암 조직에서 C6orf167의 상향-조절(up-regulation)이 관찰된 경우의 비율.
암 비율
방광암 13/17
자궁경부암 2/2
간내담도암 8/11
CML 20/33
식도암 11/15
위암 5/8
위 확산형 암 2/2
폐암 1/2
림프종 2/2
골육종 2/3
신장암 5/12
SCLC 4/4
연조직 종양 1/1
고환 종양 1/2
C6orf167 으로부터 유래된 HLA -A24 결합 펩티드의 예측
표 2 및 3는 높은 결합 친화력(binding affinity) 순으로 C6orf167의 HLA-A24 결합 9머 및 10머 펨티드를 나타낸다. 에피토프 펩티드를 결정하기 위하여 잠재적인 HLA-A24 결합 능력을 가진 총 61개의 펩티드가 선별되었고 조사되었다.
펩티드 이름 순위 개시 부위 아미노산 서열 결합 점수 서열 번호
C6orf167-A24-9머(mer) 1 848 EYMKQLVKL 330 1
2 179 LYIGHLSEL 330 2
3 641 LYPSHEKLL 300 3
4 404 MYLHCCLTL 300 4
5 1171 YYYQVYSIL 280 5
6 1219 AYSKLLSHL 240 6
7 236 VYGHQFMNL 240 7
8 480 SYTUFLCIL 200 8
9 1170 RYYYQVYSI 100 9
10 580 MYAQKNLDI 50 10
11 203 LFPPSWHLL 36 11
12 254 LFEEHCETL 36 12
13 158 PYEALEAQL 36 13
14 9 TFLTDSLEL 33 14
15 561 AFVTSQRAL 30 15
16 530 NFFSLFLLL 28.8 16
17 966 LFRIIDCLL 28 17
18 315 SFWNWLNKL 26.4 18
19 92 LFHLFRQQL 24 19
20 95 LFRQQLYNL 20 20
21 786 RYLSHVLQN 15 21
22 132 LFLHYVKVF 15 22
23 598 AFREKAKEF 13.2 23
24 827 KNLSGPDDL 12 24
25 851 KQLVKLTRL 12 25
26 55 RLILNLDPL 12 26
27 626 IYIDGVQEV 11.88 27
28 908 KSAMVTKSL 11.2 28
29 550 HVLDLLNFL 10.368 29
30 220 LVLEILYML 1.008 30
31 437 SFSISWLPF 10 31
개시 부위(start position)는 C6orf167 N-말단으로부터의 아미노산 잔기의 수를 가르킨다.
결합 점수(binding score)는 "BIMAS"로부터 유래되었다.
C6orf167으로부터 유래된 HLA-A24 결합 10머 펩티드
펩티드 이름 순위 개시 부위 아미노산 서열 결합 점수 서열 번호
C6orf167-A24-10머(mer) 1 1170 RYYYqVYSIL 560 32
2 626 IYIDgVQEVF 252 33
3 429 YYSKnLNKYI 120 34
4 917 EYLGeVLKYI 105 35
5 474 LYKSsSSYTI 50 36
6 514 KFHQkRMEEL 44 37
7 254 LFEEhCETLL 36 38
8 194 AFVNqNQIKL 33 39
9 240 QFMNlASDNL 30 40
10 956 IFATsKAQKL 26.4 41
11 786 RYLShVLQNS 25.2 42
12 511 IYSKfHQKRM 25 43
13 315 SFWNwLNKLL 24 44
14 598 AFREkAKEFL 24 45
15 869 IFSKaQVEYL 20 46
16 966 LFRIiDCLLL 20 47
17 66 NFEEdTLEIF 18 48
18 914 KSLEyLGEVL 17.28 49
19 964 KLLFriiDCL 16.8 50
20 143 RYLKvQNAES 16.5 51
21 647 KLLNdGFSML 14.4 52
22 851 KQLVkLTRLL 14.4 53
23 519 RMEElTEVGL 14.4 54
24 97 RQQLyNLETL 12 55
25 827 KNLSgPDDLL 12 56
26 389 KSISvQGVIL 12 57
27 273 RYDKvRSSES 11 58
28 670 SFLQaVLARI 10.5 59
29 132 LFLHyVKVFI 10.5 60
30 1112 LLLPgILKCL 10.08 61
개시 부위(start position)는 C6orf167 N-말단으로부터의 아미노산 잔기의 수를 가르킨다.
결합 점수(binding score)는 "BIMAS"로부터 유래되었다.
HLA -A*2402에 제한적인 C6orf167 로부터의 예측된 펩티드를 사용한 CTL 유도 및 C6orf167 유래 펩티드를 사용하여 자극한 CTL 세포주의 수립
C6orf167 유래 이러한 펩티드들에 대한 CTL은 "재료 및 방법"에 기재한 프로토콜에 따라 제작하였다. 펩티드 특이적 CTL 활성은 IFN-감마 ELISPOT 검사으로 결정되었다(도 1의 a-z). 하기의 웰 번호는 대조군과 비교했을 때, 강력한 IFN-감마 생산을 나타낸다:
C6orf167-A24-9-179 (서열 번호: 2)로 자극한 1번 웰 (a), C6orf167-A24-9-404 (서열 번호: 4)로 자극한 1 및 3번 웰 (b), C6orf167-A24-9-236 (서열 번호: 7)로 자극한 4번 웰 (c), C6orf167-A24-9-480 (서열 번호: 8)로 자극한 1 및 7(d), C6orf167-A24-9-1170 (서열 번호: 9)로 자극한 7번 웰(e), C6orf167-A24-9-9 (서열 번호: 14)로 자극한 5번 웰(f),C6orf167-A24-9-530 (서열 번호: 16)로 자극한 3 및 4번 웰(g), C6orf167-A24-9-315 (서열 번호: 18)로 자극한 5번 웰(h), C6orf167-A24-9-132 (서열 번호: 22)로 자극한 3번 웰(i), C6orf167-A24-9-851 (서열 번호: 25)로 자극한 1 및 7번 웰(j), C6orf167-A24-9-55 (서열 번호: 26)로 자극한 3 및 6번 웰(k), C6orf167-A24-9-220 (서열 번호: 30)로 자극한 1 및 2번 웰(l), C6orf167-A24-10-626 (서열 번호: 33)로 자극한 4 및 8번 웰(m), C6orf167-A24-10-429 (서열 번호: 34)로 자극한 1번 웰(n), C6orf167-A24-10-917 (서열 번호: 35)로 자극한 1 및 5번 웰(o), C6orf167-A24-10-474 (서열 번호: 36)로 자극한 4 및 5번 웰(p), C6orf167-A24-10-254 (서열 번호: 38)로 자극한 4번 웰(q), C6orf167-A24-10-194 (서열 번호: 39)로 자극한 2번 웰(r), C6orf167-A24-10-956 (서열 번호: 41)로 자극한 7번 웰(s), C6orf167-A24-10-511 (서열 번호: 43)로 자극한 3번 웰(t), C6orf167-A24-10-315 (서열 번호: 44)로 자극한 3번 웰(u), C6orf167-A24-10-598 (서열 번호: 45)로 자극한 2번 웰(v), C6orf167-A24-10-966 (서열 번호: 47)로 자극한 1 및 3번 웰(w), C6orf167-A24-10-66 (서열 번호: 48)로 자극한 7번 웰(x), C6orf167-A24-10-914 (서열 번호: 49)로 자극한 3번 웰(y) 및 C6orf167-A24-10-851 (서열 번호: 53)로 자극한 2번 웰(z). 또한, C6orf167-A24-9-179 (서열 번호: 2)로 자극한 1번, C6orf167-A24-9-404 (서열 번호:4)로 자극한 1번, C6orf167-A24-9-236 (서열 번호: 7)로 자극한 4번, C6orf167-A24-9-480 (서열 번호: 8)로 자극한 7번, C6orf167-A24-9-1170 (서열 번호: 9)로 자극한 8번, C6orf167-A24-9-530 (서열 번호: 16)로 자극한 3번, C6orf167-A24-9-132 (서열 번호: 22)로 자극한 3번, C6orf167-A24-9-851 (서열 번호: 25)로 자극한 1번, C6orf167-A24-9-55 (서열 번호: 26)로 자극한 6번, C6orf167-A24-9-220 (서열 번호: 30)로 자극한 2번, C6orf167-A24-10-626 (서열 번호: 33)로 자극한 8번, C6orf167-A24-10-917 (서열 번호: 35)로 자극한 1번, C6orf167-A24-10-315 (서열 번호: 44)로 자극한 3번 및 C6orf167-A24-10-914 (서열 번호: 49)로 자극한 3번 양성 웰에 있는 세포는 증식하여 CTL 세포주를 수립하였다. 상기 CTL 세포주의 CTL 활성은 IFN-감마 ELISA 검사에 의해 결정되었다(도 2의 a-n). 이것은 모든 CTL 세포주가 펩티드의 부가(pulse)없는 표적 세포와 비교하여 그에 상응하는 펩티드가 부가된 표적 세포에 대한 강력한 IFN-감마 생산을 보인다는 것을 나타낸다. 반면에, 표 2에서 보여진 다른 펩티드는 HLA-A*2404와 잠재적인 결합 활성을 가졌음에도 불구하고 상기 펩티드의 자극에 의한 IFN-감마의 생산은 탐지되지 않았다(데이터는 보여지지 않음). 그 결과로서, C6orf167으로부터 유래된 26개의 펩티드는 강력한 CTL을 유도할 수 있는 펩티드로서 선별되었다.
C6orf167 특이적 펩티드에 대한 CTL 세포주와 클론의 수립
CTL 클론은 "재료 및 방법"에 기술된 것과 같이 CTL 세포주로부터 희석을 제한시킴으로써 수립되었고, 펩티드가 부가된 표적 세포에 대한 CTL의 IFN-감마 생산은 IFN-감마 ELISA 검사에 의해 결정되었다. 도 3에서, C6orf167-A24-9-179 (서열 번호: 2) (a), C6orf167-A24-9-404 (서열 번호: 4) (b), C6orf167-A24-9-236 (서열 번호: 7) (c), C6orf167-A24-9-1170 (서열 번호: 9) (d), C6orf167-A24-9-530 (서열 번호: 16) (e) 및 C6orf167-A24-9-220 (서열 번호: 30) (f)로 자극한 CTL 클론으로부터 강력한 IFN-감마 생산이 확인되었다.
C6orf167 및 HLA -A*2402를 외생적으로( exogenously ) 발현하는 표적 세포에 대한 특이적 CTL 활성
이러한 펩티드에 대해 수립된 상기의 CTL 세포주에서 C6orf167 및 HLA-A*2402 분자를 내생적으로 발현하는 표적 세포를 인식하는 그들의 능력을 시험하였다. C6orf167 및 HLA-A*2402 분자 유전자 모두의 전장으로 형질도입된 COS7세포에 대한 특이적 CTL 활성(C6orf167 및 HLA-A*2402 유전자를 외생적으로 발현하는 표적 세포에 대한 특이적 모델)은 효과 세포로서 상응하는 펩티드에 의해 유도된 CTL 세포주를 이용하여 검사되었다. C6orf167 유전자 또는 HLA-A*2402의 전장으로 형질 전환된 COS7 세포는 대조군으로 준비되었다. 도 4에서, C6orf167-A24-9-179 (서열 번호: 2), C6orf167-A24-9-236 (서열 번호: 7), C6orf167-A24-9-1170 (서열 번호: 9) 및 C6orf167-A24-10-626 (서열 번호: 33)로 자극된 CTL은 C6orf167 및 HLA-A*2402 모두를 발현하는 COS7세포에 대해 강력한 활성을 보였다. 반면에, 대조군에 대해 유의적인 특이적 CTL 활성은 나타나지 않았다. 따라서, 상기 데이터는 C6orf167-A24-9-179 (서열 번호: 2), C6orf167-A24-9-236 (서열 번호: 7), C6orf167-A24-9-1170 (서열 번호: 9) 및 C6orf167-A24-10-626 (서열 번호: 33)이 내생적으로 처리되어 표적 세포에 HLA-A*2402 분자와 함께 발현되어 CTL에 의해 인지되었다는 것을 명백하게 나타낸다. 상기 결과는 C6orf167 유래된 펩티드가 C6orf167을 발현하는 암을 가진 환자에게 암 백신으로 적용될 수 있음을 나타낸다.
항원 펩티드의 상동성 분석
C6orf167-A24-9-179 (서열 번호: 2), C6orf167-A24-9-404 (서열 번호: 4), C6orf167-A24-9-236 (서열 번호: 7), C6orf167-A24-9-480 (서열 번호: 8), C6orf167-A24-9-1170 (서열 번호: 9), C6orf167-A24-9-9 (서열 번호: 14), C6orf167-A24-9-530 (서열 번호: 16), C6orf167-A24-9-315 (서열 번호: 18), C6orf167-A24-9-132 (서열 번호: 22), C6orf167-A24-9-851 (서열 번호: 25), C6orf167-A24-9-55 (서열 번호: 26), C6orf167-A24-9-220 (서열 번호: 30), C6orf167-A24-10-626 (서열 번호: 33), C6orf167-A24-10-429 (서열 번호: 34), C6orf167-A24-10-917 (서열 번호: 35), C6orf167-A24-10-474 (서열 번호: 36), C6orf167-A24-10-254 (서열 번호: 38), C6orf167-A24-10-194 (서열 번호: 39), C6orf167-A24-10-956 (서열 번호: 41), C6orf167-A24-10-511 (서열 번호: 43), C6orf167-A24-10-315 (서열 번호: 44), C6orf167-A24-10-598 (서열 번호: 45), C6orf167-A24-10-966 (서열 번호: 47), C6orf167-A24-10-66 (서열 번호: 48), C6orf167-A24-10-914 (서열 번호: 49) and C6orf167-A24-10-851 (서열 번호: 53)로 자극된 CTL은 유의적이고 특이적인 CTL 활성을 보인다. 상기 결과는 C6orf167-A24-9-179 (서열 번호: 2), C6orf167-A24-9-404 (서열 번호: 4), C6orf167-A24-9-236 (서열 번호: 7), C6orf167-A24-9-480 (서열 번호: 8), C6orf167-A24-9-1170 (서열 번호: 9), C6orf167-A24-9-9 (서열 번호: 14), C6orf167-A24-9-530 (서열 번호: 16), C6orf167-A24-9-315 (서열 번호: 18), C6orf167-A24-9-132 (서열 번호: 22), C6orf167-A24-9-851 (서열 번호: 25), C6orf167-A24-9-55 (서열 번호: 26), C6orf167-A24-9-220 (서열 번호: 30), C6orf167-A24-10-626 (서열 번호: 33), C6orf167-A24-10-429 (서열 번호: 34), C6orf167-A24-10-917 (서열 번호: 35), C6orf167-A24-10-474 (서열 번호: 36), C6orf167-A24-10-254 (서열 번호: 38), C6orf167-A24-10-194 (서열 번호: 39), C6orf167-A24-10-956 (서열 번호: 41), C6orf167-A24-10-511 (서열 번호: 43), C6orf167-A24-10-315 (서열 번호: 44), C6orf167-A24-10-598 (서열 번호: 45), C6orf167-A24-10-966 (서열 번호: 47), C6orf167-A24-10-66 (서열 번호: 48), C6orf167-A24-10-914 (서열 번호: 49) 및 C6orf167-A24-10-851 (서열 번호: 53)의 서열이 사람의 면역 시스템을 민감화시키는 것으로 알려진 다른 분자로부터 유래된 펩티드에 대해 상동성이 있기 때문일 것이다. 상기 가능성을 배제하기 위해, 유의적인 상동성이 없는 서열을 나타내는 BLAST 알고리즘(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)을 이용하여 상기 펩티드에 대한 상동성 검사를 수행하였다. 상동성 분석의 결과, C6orf167-A24-9-179 (서열 번호: 2), C6orf167-A24-9-404 (서열 번호: 4), C6orf167-A24-9-236 (서열 번호: 7), C6orf167-A24-9-480 (서열 번호: 8), C6orf167-A24-9-1170 (서열 번호: 9), C6orf167-A24-9-9 (서열 번호: 14), C6orf167-A24-9-530 (서열 번호: 16), C6orf167-A24-9-315 (서열 번호: 18), C6orf167-A24-9-132 (서열 번호: 22), C6orf167-A24-9-851 (서열 번호: 25), C6orf167-A24-9-55 (서열 번호: 26), C6orf167-A24-9-220 (서열 번호: 30), C6orf167-A24-10-626 (서열 번호: 33), C6orf167-A24-10-429 (서열 번호: 34), C6orf167-A24-10-917 (서열 번호: 35), C6orf167-A24-10-474 (서열 번호: 36), C6orf167-A24-10-254 (서열 번호: 38), C6orf167-A24-10-194 (서열 번호: 39), C6orf167-A24-10-956 (서열 번호: 41), C6orf167-A24-10-511 (서열 번호: 43), C6orf167-A24-10-315 (서열 번호: 44), C6orf167-A24-10-598 (서열 번호: 45), C6orf167-A24-10-966 (서열 번호: 47), C6orf167-A24-10-66 (서열 번호: 48), C6orf167-A24-10-914 (서열 번호: 49) 및 C6orf167-A24-10-851 (서열 번호: 53)는 유일하며(unique) 따라서, 본 출원인의 지식으로 이러한 분자는 연관되지 않은 분자에 대한 의도되지 않은 면역 반응을 일으킬 가능성이 거의 없다.
결론적으로, C6orf167로부터 유래된 신규한 HLA-A24 에피토프 펩티드는 확인되었다. 또한, C6orf167의 에피토프 펩티드는 암 면역치료법에 유용할 것이다.
폐암, 식도암 및 정상 조직에서의 C6orf167 의 발현
폐암(WO2007/013665) 및/또는 식도암의 많은 부분에서 매우 전사가 촉진된 요소를 스크리닝하기 위한 cDNA 마이크로어레이를 이용하여, C6orf167 유전자는 좋은 암의 진단 및/또는 치료를 위한 후보표적으로서 동정되었다. 이 유전자는 다수의 폐암 및 식도암에서 높은 발현 수준을 보였다. 그 후, NSCLC 10개의 경우 중에 7개에서(5개 ADC 중3개에서 및 5개 SSC 중 4개에서) 및 SCLC 5개 경우 중 모두에서(도 5의 A, 오른쪽 위 패널) 뿐만 아니라 NSCLC 세포주 10개의 경우 중 모두에서 및 5개의 SCLC 세포주 모두에서(도 5의 A, 오른쪽 아래 패널) 반정량 RT-PCR 실험에 의해서 그것의 전사 촉진을 확인하였다. 또한 식도암 10개의 경우 중 7개에서 및 식도암 세포주 10개의 경우 중 9개에서(도 5의 A 왼쪽 위 및 아래 패널) C6orf167의 상향 조절이 탐지되었다.
C6orf167 cDNA을 표적으로 사용한 노던 블랏 분석은 검사된 16개의 인간 조직에서 7.5-kb 전사체가 오직 고환 및 소장에서 동정되었다(도 5의 B).
실험 2
세포주
T2, HLA-A*0201-양성 B 림프아세포주, 및 COS7, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주를 ATCC로부터 구매하였다.
C6orf167 유래 펩티드의 후보 선택
결합 예측 소프트웨어 "BIAMAS"(www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind) (Parker et al. (J Immunol 1994, 152(1): 163-75), Kuzushima et al. (Blood 2001, 98(6): 1872-81))를 사용하여 HLA-A*0201 분자에 결합하는 C6orf167로부터 유래한 9-머 및 10-머 펩티드를 예측하였다. 표준 고체상 합성 방법에 따라 상기 펩티드를 생합성에 의해 합성하였고(Lewisville, Texas) 역상 고성능 액체 크로마토그래피(reverse phase high performance liquid chromatography; HPLC)에 의해 정제하였다. 상기 펩티드의 순도(＞90%) 및 강도를 각각 분석 HPLC(analytic HPLC) 및 질량 분석(mass spectrometry)에 의해 결정하였다. 펩티드를 디메틸술폭시드(dimethylsulfoxide; DMSO)에 20mg/ml로 용해시키고 -80℃에 저장하였다.
시험관 내에서의 CTL 유도
인간 백혈구 항원(HLA)에 제시된 펩티드에 대한 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 유도하기 위하여 단핵구-유래 수지상 세포(DCs)를 항원-제시 세포로서 사용하였다. DC를 (Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8)에 기술된 것과 같이 생산하였다. 특히, 정상 지원자(HLA-A*0201 양성)로부터 피콜-플라크(Ficoll-Plaque; Pharmacia) 용액에 의해 분리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)를 플라스틱 조직 배양 접시(Becton Dickinson)에 부착하는 것을 이용하여 분리하여 그들을 단핵구 분획물로 수득하였다. 단핵구가 많은 집단을 2% 열-불활성화 자신의 혈청(heat-inactivated autologous serum; AS)를 포함한 AIM-V 배지(Invitrogen)에 GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; R&D System)의 1000U/ml 및 IL(interleukin)-4(R&D System) 의 1000U/ml의 존재하에 배양하였다. 배양 7일 후, 3시간 동안 37℃에서 AIM-V 배지안에서, 베타 2-마이크로글로볼린(beta 2-microglobulin) 3μg/ml의 존재하에서 사이토카인-유도 DCs에 합성된 펩티드 각각의 20μg/ml를 부과하였다. 생성된 세포는 그들의 표면에 CD80, CD83, CD86 및 HLA 종류 II와 같은 DC-관련 분자를 발현하는 것으로 나타났다(데이터는 보여지지 않음). 상기 펩티드-부과 DC는 X-방사선 처리(20Gy)에 의하여 비활성화되었고 자신의 CD8+ T 세포와 1:20 비율로 혼합되어, CD8 양성 분리 키트(CD8 positive Isolation Kit; Dynal)를 사용한 양성 선택에 의해 수득되었다. 상기 배양은 48-웰 플레이트(Corning)에서 수행되었고; 각 웰은 AIM-V/2% AS 배지 0.5ml에 1.5x104 펩티드-부과 DC, 3x105 CD8+ T 세포 및 IL-7(R&D system)의 10ng/ml을 포함하였다. 3일 후, 상기 배양에 IL-2(CHIRON)을 첨가하여 최종 농도가 20U/ml이 되도록 하였다. 7일 째 및 14일 째, 상기 T 세포를 나아가 자신의 펩티트-부과 DC로 자극시켰다. 상기 DCs를 상기 기술된 동일한 방법으로 각 시간에서 준비되었다. 21일 째 펩티드 자극 3번 째 후 CTL은 펩티드-부과 T2 세포에 대하여 검사되었다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)..
CTL 증식 과정
Riddell et al.에 의해 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여 CTL을 배양하에 증식시켰다(Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23). 40ng/ml의 항 CD3 단일 클론 항체(Pharmingen)의 존재 하에서, 미토마이신 C(mitomycin C)에 의해 불활성화된 두 종류의 인간 B 림프아세포주와 함께 총 5x104 CTL을 AIM-V/5% AS 배지의 25ml에 현탁하였다. 배양 시작한 뒤 1일 후, IL-2의 120IU/ml를 상기 배양에 첨가하였다. 5, 8 및 11일째에 IL-2의 30IU/ml를 포함하는 신선한 AIM-V/5% AS 배지를 상기 배양에 공급하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).
CTL 클론의 수립
96 웰 둥근 밑면 마이크로 타이터 플레이트(round-bottomed micro titer plate, Nalge Nunc International)에 한 웰당 0.3, 1 및 3 CTL이 되도록 희석하였다. CTL을 1×104 세포/웰(well)의 두 종류의 인간 B 림프아구양 세포주, 30ng/ml의 항-CD3 항체 및 IL-2의 125U/ml와 함께, 5%의 AS를 포함하는 AIM-M 배지의 총 150μl/웰에서 배양하였다. 10일 후, IL-2의 최종농도가 125U/ml이 되도록 상기 배지에 IL-2의 50μl/웰을 첨가하였다. 14일째에 CTL 활성을 시험하였고, 상기와 기술된 것과 동일한 방법을 이용하여 CTL 클론을 증식시켰다[Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24):8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5):411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506].
특이적인 CTL 활성
특이적인 CTL 활성을 조사하기 위하여, 인터페론-감마(interferon-gamma; IFN-γ) ELISPOT(enzyme-linked immunospot) 검사 및 IFN-감마 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 실시하였다. 구체적으로, 펩티드-부가 T2(1×104/웰)을 자극 세포(stimulator cell)로서 제조하였다. 반응 세포(responder cell)로서 48웰에 배양된 세포를 사용하였다. IFN-감마 ELISPOT 검사 및 IFN-감마 ELISA 검사를 제조사 과정에 따라서 수행하였다.
표적 유전자 및 HLA -A02 중 하나 또는 그 모두를 발현하게 하는 세포의 수립
표적 유전자 또는 HLA-A0201의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 암호화하는 cDNA를 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 PCR-증폭 생산물은 pCAGGS 벡터 및 pIRES 벡터(Clontech Laboratories, Inc., Cat. No. 631605)로 클로닝되었다. 제조사에서 제공하는 과정에 따라서 리포펙타민2000(lipofectamine 2000) (Invitrogen)을 사용하여, 상기 플라스미드를 표적 유전자 및 HLA-A*0201-음성 세포주, COS7으로 형질도입시켰다. 형질도입 2일 후에, 상기 형질도입된 세포를 versene(Invitrogen)을 사용하여 수거하였고, CTL 활성 검사를 위해 표적세포로서 사용되었다(5x104세포/웰).
결과
C6orf167 로부터 유래한 HLA -A02 결합 펩티드의 예측
표 4 및 5는 C6orf167의 HLA-A02 결합 9머 및 10머 펩티드를 높은 결합 친화력 순서로 보여준다. 잠재적으로 HLA-A02 결합력을 갖는 총 90개의 펩티드를 선택하여 에피토프 펩티드를 결정하였다.
C6orf167로부터 유래한 HLA-A2 결합 9머(mer) 펩티드
개시 위치 아미노산 서열 결합 점수 서열 번호
918 YLGEVLKYI 2489.0 62
202 KLFPPSWHL 2074.8 63
227 MLGEKLKOV 1115.0 64
855 KLTRLLFNL 997.4 65
131 VLFLHYVKV 656.2 66
533 SLFLLLAAV 591.9 67
858 RLLFNLSEV 591.9 68
290 CLCIKELWV 382.5 69
647 KLLNDGFSM 373.1 70
929 YLGKKVFSA 304.9 71
219 WLVLEILYM 289.1 72
904 TLSDKSAMV 285.2 73
648 LLNDGFSML 282.9 74
133 FLHYVKVFI 264.0 75
887 ALVRFFEAV 246.1 76
319 WLNKLLKTL 226.0 77
667 TVLSFLQAV 196.8 78
261 TLLCDLISL 181.8 79
965 LLFRIIDCL 151.4 80
964 KLLFRIIDC 148.0 81
578 LLMYAQKNL 134.4 82
623 LLSIYIDGV 133.3 83
484 FLCILAKVV 131.2 84
457 SMLEMVKTC 125.2 85
253 SLFEEHCET 113.0 86
671 FLQAVLARI 110.4 87
283 LMSDQCPCL 107.5 88
1018 YLNQLLGNV 95.7 89
1091 SILAFILQL 95.0 90
1113 LLPGILKCL 83.5 91
821 VLQMYIKNL 83.5 92
1116 GILKCLVLV 81.4 93
528 LQNFFSLFL 77.0 94
1112 LLLPGILKC 71.9 95
99 QLYNLETLL 68.4 96
590 VLAEKFSCA 65.8 97
224 ILYMLGEKL 56.9 98
405 YLHCCLTLC 52.6 99
C6orf167로부터 유래한 HLA-A2 결합 10머(mer) 펩티드
개시 위치 아미노산 서열 결합 점수 서열 번호
716 ALWRhFFSFL 7040.9 100
535 FLLLaAVAEV 2722.7 101
226 YMLGeKLKQV 1966.4 102
303 LLDHrSKWFV 1950.9 103
311 FVSEsFWNWL 1252.6 104
425 ILWEyYSKNL 1235.8 105
554 LLNFlKPAFV 650.3 106
648 LLNDgFSMLL 565.8 107
569 LIWKgHMAFL 524.3 108
202 KLFPpSWHLL 470.3 109
527 GLQNfFSLFL 446.5 110
10 FLTDsLELEL 402.9 111
577 FLLMyAQKNL 363.6 112
128 QQCVlFLHYV 339.0 113
622 TLLSiYIDGV 290.0 114
178 LLYIgHLSEL 267.3 115
47 YLCSgALKRL 226.0 116
219 WLVLeILYML 226.0 117
1155 QLTSvFRQFI 218.0 118
227 MLGEkLKQVV 198.8 119
253 SLFEeHCETL 158.8 120
606 FLVSkNEEMV 156.8 121
290 CLCIkELWVL 151.1 122
262 LLCDlISLSL 148.9 123
965 LLFRiIDCLL 134.4 124
1113 LLPGiLKCLV 118.2 125
77 IQWVtETALV 99.5 126
319 WLNKlLKTLL 98.3 127
1022 LLGNvIEQYI 97.5 128
910 AMVTkSLEYL 95.6 129
738 QLADaAADFT 82.3 130
482 TIFLcILAKV 81.4 131
282 SLMSdQCPCL 79.0 132
442 WLPFkGLANT 78.8 133
625 SIYIdGVQEV 70.4 134
1120 CLVLvSEPQV 69.6 135
640 CLYPsHEKLL 68.4 136
619 TIWTlLSIYI 65.5 137
747 TLLAmDMPST 63.4 138
1131 RLATeNLQYM 62.8 139
71 TLEIfGIQWV 56.3 140
614 MVQRQTIWTL 54.8 141
457 SMLEmVKTCC 54.4 142
1001 YLQGmCIVCC 52.6 143
397 ILEEqLRMYL 52.4 144
268 SLSLnRYDKV 51.1 145
1088 RLASiLAFIL 50.8 146
528 LQNFfSLFLL 49.1 147
1049 VLLAlRNTAT 46.9 148
886 KALVrFFEAV 44.3 149
411 TLCDfWEPNI 42.8 150
579 LMYAqKNLDI 41.0 151
HLA -A*0201로 제한된 C6orf167 유래 예측된 펩티드를 이용한 CTL 유도
C6orf167 유래 펩티드는 "재료 및 방법"에 기술된 프로토콜에 따라 생산되었다. 특이적 CTL 활성을 나타내는 펩티드는 IFN-감마(gamma) ELISPOT 검사(도 6의 a-r)을 사용하여 결정되었다. 하기의 웰 번호는 대조군 웰과 비교하여 강력한 IFN-감마 생산을 나타낸다: C6orf167-A02-9-855 (서열 번호: 65)로 자극한 #4(a), C6orf167-A02-9-131 (서열 번호: 66)로 자극한 #6(b), C6orf167-A02-9-887 (서열 번호: 76)로 자극한 #4(c), C6orf167-A02-9-261 (서열 번호: 79)로 자극한 #6(d), C6orf167-A02-9-484 (서열 번호: 84)로 자극한 #7(e), C6orf167-A02-10-535 (서열 번호: 101)로 자극한 #1,#3 및 #6(f), C6orf167-A02-10-527 (서열 번호: 110)로 자극한 #1(g), C6orf167-A02-10-10 (서열 번호: 111)로 자극한 #3(h), C6orf167-A02-10-577 (서열 번호: 112)로 자극한 #5(i), C6orf167-A02-10-128 (서열 번호: 113) 로 자극한 #5 및 #7(j), C6orf167-A02-10-622 (서열 번호: 114)로 자극한 #4(k), C6orf167-A02-10-47 (서열 번호: 116)로 자극한 #1(l), C6orf167-A02-10-219 (서열 번호: 117)로 자극한 #1(m), C6orf167-A02-10-1155 (서열 번호: 118)로 자극한 #3(n), C6orf167-A02-10-606 (서열 번호: 121)로 자극한 #7(o), C6orf167-A02-10-290 (서열 번호: 122)로 자극한 #6(p), C6orf167-A02-10-262 (서열 번호: 123)로 자극한 #6(q) 및 C6orf167-A02-10-965 (서열 번호: 124)로 자극한 #8(r). 반면에, 특이적 CTL 활성이 관찰되지 않았다. 표 4 및 표 5에서 보여진 다른 펩티드가 HLA-A*0201과 함께 결합 활성을 가질 수 있음에도 불구하고, 상기 펩티드를 사용하여 자극시킨 웰에서는 특이적 CTL 활성이 관찰되지 않았다. 음성 데이터의 일반적인 경우로서, C6orf167-A02-9-918 (서열 번호: 62)를 사용하여 자극된 CTL로부터 특이적 IFN-감마 생산은 보여지지 않았다. 결과적으로, 이것은 C6orf167 유래 18개의 펩티드는 강력한 CTL을 유도할 수 있는 펩티드오러 스크리닝되었다는 것을 가르킨다.
C6orf167 유래 펩티드에 대한 CTL 세포주 및 클론의 수립
특이적 CTL 활성을 갖는 펩티드를 보이는 세포를 IFN-감마 ELISPOT 검사법을 사용하여 C6orf167-A02-9-855 (서열 번호: 65)로 자극한 #4(a), C6orf167-A02-9-131 (서열 번호: 66)로 자극한 #6(b), C6orf167-A02-9-887 (서열 번호: 76)로 자극한 #4(c), C6orf167-A02-9-261 (서열 번호: 79)로 자극한 #6(d), C6orf167-A02-9-484 (서열 번호: 84)로 자극한 #7(e), C6orf167-A02-10-535 (서열 번호: 101)로 자극한 #6(f), C6orf167-A02-10-527 (서열 번호: 110)로 자극한 #1(g), C6orf167-A02-10-10 (서열 번호: 111)으로 자극한 #3(h), C6orf167-A02-10-577 (서열 번호: 112) 로 자극한 #5(i), C6orf167-A02-10-128 (서열 번호: 113)로 자극한 #5(j)에서 탐지되었다. C6orf167-A02-10-622 (서열 번호: 114)로 자극한 #4(k), C6orf167-A02-10-219 (서열 번호: 117)로 자극한 #1(l), C6orf167-A02-10-290 (서열 번호: 122)로 자극한 #6(m) 및 C6orf167-A02-10-262 (서열 번호: 123)로 자극한 #6(n)는 증식하였고 CTL 세포주를 수립하였다. 이러한 CTL 세포주의 CTL 활성은 IFN-감마 ELISA 검사(도 7의 a-n)으로 결정되었다. 상기 결과는 상응하는 펩티드를 부가한 표적 세포에 대하여 CTL 세포주가 펩티드가 부가되지 않은 표적 세포 보다 강력한 IFN-감마 생산을 나타낸다는 것을 보인다. 또한, CTL 클론은 "재료 및 방법"에 기술된 것과 같이 CTL 세포주로부터 희석을 제한함으로써 수립하였고, 상기 CTL 클론으로부터 펩티드를 부가한 표적 세포에 대한 IFN-감마 생산은 IFN-감마 ELISA를 사용하여 검사되었다. 강력한 IFN-감마 생산은 C6orf167-A02-9-855 (서열 번호: 65) (a), C6orf167-A02-9-131 (서열 번호: 66) (b), C6orf167-A02-9-887 (서열 번호: 76) (c), C6orf167-A02-9-261 (서열 번호: 79) (d), C6orf167-A02-9-484 (서열 번호: 84) (e), C6orf167-A02-10-535 (서열 번호: 101) (f), C6orf167-A02-10-527 (서열 번호: 110) (g), C6orf167-A02-10-10 (서열 번호: 111) (h), C6orf167-A02-10-128 (서열 번호: 113) (i) 및 C6orf167-A02-10-622 (서열 번호: 114) (j)로 자극된 CTL 클론으로부터 결정되었다(도 8의 a-j).
외재적으로 C6orf167 및 HLA -A* 0201를 발현하는 표적 세포에 대한 특이적 CTL 활성
각 펩티드에 대하여 증식한 상기 수립된 CTL 세포주 및 클론에서 내재적으로 C6orf167 및 HLA-A*0201 분자를 발현하는 표적세포를 인지하는 능력을 검사하였다. C6orf167 및 HLA-A*0201 유전자 전장 모두로 형질도입된 COS7 세포(외재적으로 C6orf167 및 HLA-A*0201 유전자를 발현하는 표적 세포를 위한 특이적 모델)에 대한 특이적 CTL 활성은 상응하는 펩티드에 의해 증식된 CTL 세포주 및 클론을 작용 세포로서 사용함으로써 검사되었다. C6orf167 또는 HLA-A*0201의 전장 중 하나가 형질도입된 COS7 세포는 대조군으로서 준비되었다. 도 9에서, C6orf167-A02-9-261 (서열 번호: 79) (a)로 자극된 CTL 세포주 및 C6orf167-A02-10-622 (서열 번호: 114) (b)로 자극된 CTl 클론은 C6orf167 및 HLA-A*0201를 발현하는 COS7 세포에 대하여 강력한 CTL 활성을 보였다. 반면에, 대조군으로부터 유의적인 특이적 CTL 활성은 탐지되이 않았다. 따라서, 상기 데이터는 C6orf167-A02-9-261 (서열 번호: 79) 및 C6orf167-A02-10-622 (서열 번호: 114)의 펩티드가 HLA-A*0201 분자와 함께 내재적으로 처리되어 표적 세포에 발현되고 CTL에 의해 인지되는 것임을 명확하게 증명하였다. 상기 결과는 C6orf167로부터의 펩티드가 C6orf167를 발현하는 종양을 가진 암환자에 대하여 암 백신으로 적용할 수 있는 가능성을 나타낸다.
항원 펩티드의 상동성 분석
C6orf167-A02-9-855 (서열 번호: 65), C6orf167-A02-9-131 (서열 번호: 66), C6orf167-A02-9-887 (서열 번호: 76), C6orf167-A02-9-261 (서열 번호: 79), C6orf167-A02-9-484 (서열 번호: 84), C6orf167-A02-10-535 (서열 번호: 101), C6orf167-A02-10-527 (서열 번호: 110), C6orf167-A02-10-10 (서열 번호: 111), C6orf167-A02-10-577 (서열 번호: 112), C6orf167-A02-10-128 (서열 번호: 113), C6orf167-A02-10-622 (서열 번호: 114), C6orf167-A02-10-47 (서열 번호: 116), C6orf167-A02-10-219 (서열 번호: 117), C6orf167-A02-10-1155 (서열 번호: 118), C6orf167-A02-10-606 (서열 번호: 121), C6orf167-A02-10-290 (서열 번호: 122), C6orf167-A02-10-262 (서열 번호: 123) 및 C6orf167-A02-10-965 (서열 번호: 124)로 자극된 CTL은 유의적이고 특이적인 CTL 활성을 보였다. 이 결과는 C6orf167-A02-9-855 (서열 번호: 65), C6orf167-A02-9-131 (서열 번호: 66), C6orf167-A02-9-887 (서열 번호: 76), C6orf167-A02-9-261 (서열 번호: 79), C6orf167-A02-9-484 (서열 번호: 84), C6orf167-A02-10-535 (서열 번호: 101), C6orf167-A02-10-527 (서열 번호: 110), C6orf167-A02-10-10 (서열 번호: 111), C6orf167-A02-10-577 (서열 번호: 112), C6orf167-A02-10-128 (서열 번호: 113), C6orf167-A02-10-622 (서열 번호: 114), C6orf167-A02-10-47 (서열 번호: 116), C6orf167-A02-10-219 (서열 번호: 117), C6orf167-A02-10-1155 (서열 번호: 118), C6orf167-A02-10-606 (서열 번호: 121), C6orf167-A02-10-290 (서열 번호: 122), C6orf167-A02-10-262 (서열 번호: 123) 및 C6orf167-A02-10-965 (서열 번호: 124)의 서열이 인간 면역 시스템을 민감화시킨다고 알려진 다른 분자로부터 유래된 펩티드와 상동성을 갖는다는 사실 때문일 수 있다. 이러한 가능성을 배제하기 위하여, 상동성 분석을 수행하였다. 유의적인 상동성을 갖는 서열을 나타내지 않는 BLAST 알고리즘을 사용하여 이 펩테드 서열에 대해 분석하였다. 상동성 분석의 결과는 C6orf167-A02-9-855 (서열 번호: 65), C6orf167-A02-9-131 (서열 번호: 66), C6orf167-A02-9-887 (서열 번호: 76), C6orf167-A02-9-261 (서열 번호: 79), C6orf167-A02-9-484 (서열 번호: 84), C6orf167-A02-10-535 (서열 번호: 101), C6orf167-A02-10-527 (서열 번호: 110), C6orf167-A02-10-10 (서열 번호: 111), C6orf167-A02-10-577 (서열 번호: 112), C6orf167-A02-10-128 (서열 번호: 113), C6orf167-A02-10-622 (서열 번호: 114), C6orf167-A02-10-47 (서열 번호: 116), C6orf167-A02-10-219 (서열 번호: 117), C6orf167-A02-10-1155 (서열 번호: 118), C6orf167-A02-10-606 (서열 번호: 121), C6orf167-A02-10-290 (서열 번호: 122), C6orf167-A02-10-262 (서열 번호: 123) and C6orf167-A02-10-965 (서열 번호: 124)의 서열은 유일하고, 따라서 우리의 지식으로는, 이 분자가 어떤 관련없는 분자에 대하여 의도하지 않은 면역 반응을 야기하는 가능성은 거의 없다는 것을 가르킨다.
결론적으로, C6orf167로부터 유래한 신규한 HLA-A*0201 에피토프 펩티드는 동정되었다. 또한, C6orf167의 에피토프 펩티드는 암 면역 치료법에 적용 가능할 것이다.
본 발명은 새로운 TAA, 특히 강력하고 특이적인 항-종양 면역반응을 유도하고 다양한 유형의 암에 적용 가능성을 가진 C6orf167으로부터 유래된 것을 제공한다. 상기 TAA는 C6orf167와 관련된 질환, 예를 들면 방광암(bladder cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 간내담도암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수 백혈병(chornic myelogenous leukemia; CML), 식도암(esophageal cancer), 위암(gastric cancer), 위 확산-형암(gastric diffuse-type cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 골육종(osteosarcoma), 신장암(renal carcinoma), 폐 선암(lung adenocarcinoma; ADC), 폐편평상피암(lung squamous cell carcinoma; SCC), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer; SCLC), 비소세포성 폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC), 연조직 종양(soft tissue tumor), 및 고환 종양(testicular tumor)를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 암에서 펩티드 백신으로서 유용성을 가질 수 있다.
<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> C6orf167 PEPTIDES AND VACCINES CONTAINING THE SAME <130> 11FPI-09-14 <150> 61/211,700 <151> 2009-04-01 <150> PCT/JP2010/002352 <151> 2010-03-31 <160> 163 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 1 Glu Tyr Met Lys Gln Leu Val Lys Leu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 2 Leu Tyr Ile Gly His Leu Ser Glu Leu 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 3 Leu Tyr Pro Ser His Glu Lys Leu Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 4 Met Tyr Leu His Cys Cys Leu Thr Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 5 Tyr Tyr Tyr Gln Val Tyr Ser Ile Leu 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Artificially synthesized peptide sequence <400> 110 Gly Leu Gln Asn Phe Phe Ser Leu Phe Leu 1 5 10 <210> 111 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 111 Phe Leu Thr Asp Ser Leu Glu Leu Glu Leu 1 5 10 <210> 112 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 112 Phe Leu Leu Met Tyr Ala Gln Lys Asn Leu 1 5 10 <210> 113 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 113 Gln Gln Cys Val Leu Phe Leu His Tyr Val 1 5 10 <210> 114 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 114 Thr Leu Leu Ser Ile Tyr Ile Asp Gly Val 1 5 10 <210> 115 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 115 Leu Leu Tyr Ile Gly His Leu Ser Glu Leu 1 5 10 <210> 116 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 116 Tyr Leu Cys Ser Gly Ala Leu Lys Arg Leu 1 5 10 <210> 117 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 117 Trp Leu Val Leu Glu Ile Leu Tyr Met Leu 1 5 10 <210> 118 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 118 Gln Leu Thr Ser Val Phe Arg Gln Phe Ile 1 5 10 <210> 119 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 119 Met Leu Gly Glu Lys Leu Lys Gln Val Val 1 5 10 <210> 120 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 120 Ser Leu Phe Glu Glu His Cys Glu Thr Leu 1 5 10 <210> 121 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 121 Phe Leu Val Ser Lys Asn Glu Glu Met Val 1 5 10 <210> 122 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 122 Cys Leu Cys Ile Lys Glu Leu Trp Val Leu 1 5 10 <210> 123 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 123 Leu Leu Cys Asp Leu Ile Ser Leu Ser Leu 1 5 10 <210> 124 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 124 Leu Leu Phe Arg Ile Ile Asp Cys Leu Leu 1 5 10 <210> 125 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 125 Leu Leu Pro Gly Ile Leu Lys Cys Leu Val 1 5 10 <210> 126 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 126 Ile Gln Trp Val Thr Glu Thr Ala Leu Val 1 5 10 <210> 127 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an Artificially synthesized peptide sequence <400> 127 Trp Leu Asn Lys Leu Leu Lys Thr Leu Leu 1 5 10 <210> 128 <211> 10 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Asp Pro Leu Pro Thr Asn Phe Glu Glu Asp Thr Leu 60 65 70 gaa ata ttt ggc att cag tgg gtt act gaa aca gca tta gtg aat tca 530 Glu Ile Phe Gly Ile Gln Trp Val Thr Glu Thr Ala Leu Val Asn Ser 75 80 85 tct aga gaa ctc ttt cat tta ttc agg caa caa ctg tac aac ttg gaa 578 Ser Arg Glu Leu Phe His Leu Phe Arg Gln Gln Leu Tyr Asn Leu Glu 90 95 100 acc ttg tta cag tcc agt tgt gat ttt ggg aag gta tca act cta cac 626 Thr Leu Leu Gln Ser Ser Cys Asp Phe Gly Lys Val Ser Thr Leu His 105 110 115 120 tgc aaa gca gac aat att agg cag cag tgt gta cta ttt ctc cat tat 674 Cys Lys Ala Asp Asn Ile Arg Gln Gln Cys Val Leu Phe Leu His Tyr 125 130 135 gtt aaa gtt ttc atc ttc agg tat ctg aaa gta cag aat gct gag agt 722 Val Lys Val Phe Ile Phe Arg Tyr Leu Lys Val Gln Asn Ala Glu Ser 140 145 150 cat gtt cct gtc cat cct tat gag gct ttg gag gct cag ctt ccc tca 770 His Val Pro Val His Pro Tyr Glu Ala Leu Glu Ala Gln Leu Pro Ser 155 160 165 gtg ttg att gat gag ctt cat gga tta ctc ttg tat att gga cac cta 818 Val Leu Ile Asp Glu Leu His Gly Leu Leu Leu Tyr Ile Gly His Leu 170 175 180 tct gaa ctt ccc agt gtt aat ata gga gca ttt gta aat caa aac cag 866 Ser Glu Leu Pro Ser Val Asn Ile Gly Ala Phe Val Asn Gln Asn Gln 185 190 195 200 att aag ctt ttt cca ccg tca tgg cat tta tta cat ctc cac ttg gat 914 Ile Lys Leu Phe Pro Pro Ser Trp His Leu Leu His Leu His Leu Asp 205 210 215 ata cat tgg ctg gtg cta gaa att ctt tac atg ctg ggt gaa aaa ttg 962 Ile His Trp Leu Val Leu Glu Ile Leu Tyr Met Leu Gly Glu Lys Leu 220 225 230 aaa caa gtt gta tat ggt cat cag ttt atg aat ctg gca agt gac aat 1010 Lys Gln Val Val Tyr Gly His Gln Phe Met Asn Leu Ala Ser Asp Asn 235 240 245 tta acc aac atc agc cta ttt gaa gaa cat tgt gaa act ctc ctt tgt 1058 Leu Thr Asn Ile Ser Leu Phe Glu Glu His Cys Glu Thr Leu Leu Cys 250 255 260 gat tta ata agc ctg tca ctc aac agg tac gac aag gtt agg tct tct 1106 Asp Leu Ile Ser Leu Ser Leu Asn Arg Tyr Asp Lys Val Arg Ser Ser 265 270 275 280 gaa tca tta atg agt gac cag tgt cca tgt tta tgc att aaa gaa tta 1154 Glu Ser Leu Met Ser Asp Gln Cys Pro Cys Leu Cys Ile Lys Glu Leu 285 290 295 tgg gtt cta ctt att cat ctt cta gac cac aga agt aaa tgg ttt gtc 1202 Trp Val Leu Leu Ile His Leu Leu Asp His Arg Ser Lys Trp Phe Val 300 305 310 tcg gaa tca ttt tgg aac tgg ttg aat aaa cta ctt aaa aca ctg ctt 1250 Ser Glu Ser Phe Trp Asn Trp Leu Asn Lys Leu Leu Lys Thr Leu Leu 315 320 325 gaa aaa tca agt gac cga aga aga tcc tct atg cct gta atc cag tcc 1298 Glu Lys Ser Ser Asp Arg Arg Arg Ser Ser Met Pro Val Ile Gln Ser 330 335 340 agg gat cca tta ggt ttt agt tgg tgg att att act cat gta gca tca 1346 Arg Asp Pro Leu Gly Phe Ser Trp Trp Ile Ile Thr His Val Ala Ser 345 350 355 360 ttt tac aag ttt gat cgc cat gga gta cca gat gaa atg aga aaa gtg 1394 Phe Tyr Lys Phe Asp Arg His Gly Val Pro Asp Glu Met Arg Lys Val 365 370 375 gaa tca aat tgg aac ttt gta gaa gaa ctg ctg aaa aag tcc atc agt 1442 Glu Ser Asn Trp Asn Phe Val Glu Glu Leu Leu Lys Lys Ser Ile Ser 380 385 390 gtt cag ggt gtc att cta gaa gaa caa tta cga atg tat ctt cac tgt 1490 Val Gln Gly Val Ile Leu Glu Glu Gln Leu Arg Met Tyr Leu His Cys 395 400 405 tgt ttg aca ctt tgt gat ttc tgg gag cca aac att gca att gtt acc 1538 Cys Leu Thr Leu Cys Asp Phe Trp Glu Pro Asn Ile Ala Ile Val Thr 410 415 420 att tta tgg gaa tat tat agt aag aac ctg aat agt tcc ttc agt att 1586 Ile Leu Trp Glu Tyr Tyr Ser Lys Asn Leu Asn Ser Ser Phe Ser Ile 425 430 435 440 tct tgg ctt cct ttt aaa ggc ctt gct aat acc atg aag tca ccc ttg 1634 Ser Trp Leu Pro Phe Lys Gly Leu Ala Asn Thr Met Lys Ser Pro Leu 445 450 455 tct atg ctt gaa atg gtg aag act tgc tgt tgc gat aaa caa gat cag 1682 Ser Met Leu Glu Met Val Lys Thr Cys Cys Cys Asp Lys Gln Asp Gln 460 465 470 gaa cta tat aaa tcc agc agt agt tat act att ttt ctt tgt att ctg 1730 Glu Leu Tyr Lys Ser Ser Ser Ser Tyr Thr Ile Phe Leu Cys Ile Leu 475 480 485 gca aaa gtt gtt aaa aaa gca atg aag agc aat ggc cct cat cct tgg 1778 Ala Lys Val Val Lys Lys Ala Met Lys Ser Asn Gly Pro His Pro Trp 490 495 500 aaa caa gtc aaa gga aga ata tat tca aaa ttc cat caa aaa aga atg 1826 Lys Gln Val Lys Gly Arg Ile Tyr Ser Lys Phe His Gln Lys Arg Met 505 510 515 520 gaa gaa cta act gaa gtt ggt cta cag aac ttt ttt agc ctt ttt cta 1874 Glu Glu Leu Thr Glu Val Gly Leu Gln Asn Phe Phe Ser Leu Phe Leu 525 530 535 ctg tta gca gct gtt gca gag gta gaa gat gtt gca agt cat gtt tta 1922 Leu Leu Ala Ala Val Ala Glu Val Glu Asp Val Ala Ser His Val Leu 540 545 550 gac ctc ctg aat ttc ctc aag cct gct ttt gta acg tct cag aga gcc 1970 Asp Leu Leu Asn Phe Leu Lys Pro Ala Phe Val Thr Ser Gln Arg Ala 555 560 565 ctc att tgg aag ggt cac atg gcc ttc ctc ttg atg tat gcc cag aaa 2018 Leu Ile Trp Lys Gly His Met Ala Phe Leu Leu Met Tyr Ala Gln Lys 570 575 580 aat ctg gac att ggt gtt ttg gct gag aaa ttt tca tgt gct ttc cgg 2066 Asn Leu Asp Ile Gly Val Leu Ala Glu Lys Phe Ser Cys Ala Phe Arg 585 590 595 600 gag aaa gca aag gaa ttc ttg gtg tct aag aat gag gaa atg gta cag 2114 Glu Lys Ala Lys Glu Phe Leu Val Ser Lys Asn Glu Glu Met Val Gln 605 610 615 aga cag act atc tgg acc ctt ctt tcc ata tac att gat ggt gtt caa 2162 Arg Gln Thr Ile Trp Thr Leu Leu Ser Ile Tyr Ile Asp Gly Val Gln 620 625 630 gaa gtg ttt gag acc agc tat tgc ttg tat cct tcc cat gaa aaa ctg 2210 Glu Val Phe Glu Thr Ser Tyr Cys Leu Tyr Pro Ser His Glu Lys Leu 635 640 645 ctt aat gat gga ttt agt atg ctt ctg cga gca tgt cga gaa tct gaa 2258 Leu Asn Asp Gly Phe Ser Met Leu Leu Arg Ala Cys Arg Glu Ser Glu 650 655 660 ctt agg aca gta ttg agc ttc cta caa gct gtt ctg gcc aga atc agg 2306 Leu Arg Thr Val Leu Ser Phe Leu Gln Ala Val Leu Ala Arg Ile Arg 665 670 675 680 agt atg cat caa caa ttg tgt cag gaa ctt caa agg gac aat gtg gac 2354 Ser Met His Gln Gln Leu Cys Gln Glu Leu Gln Arg Asp Asn Val Asp 685 690 695 cta ttt gta cag tct tca tta tcg gct aaa gag cgc cac ctt gct gca 2402 Leu Phe Val Gln Ser Ser Leu Ser Ala Lys Glu Arg His Leu Ala Ala 700 705 710 gtt gcc agt gca ctg tgg aga cat ttc ttt tca ttt ttg aag agt cag 2450 Val Ala Ser Ala Leu Trp Arg His Phe Phe Ser Phe Leu Lys Ser Gln 715 720 725 aga atg tca cag gta gtg cct ttc tca caa ctt gcg gat gca gct gca 2498 Arg Met Ser Gln Val Val Pro Phe Ser Gln Leu Ala Asp Ala Ala Ala 730 735 740 gac ttt act ttg cta gca atg gac atg cca agc aca gct cca tca gat 2546 Asp Phe Thr Leu Leu Ala Met Asp Met Pro Ser Thr Ala Pro Ser Asp 745 750 755 760 ttt cag cct cag cca gtt ata tca att att caa ctt ttt ggt tgg gat 2594 Phe Gln Pro Gln Pro Val Ile Ser Ile Ile Gln Leu Phe Gly Trp Asp 765 770 775 gat atc atc tgc cct caa gtt gta gca aga tat tta agt cat gtc cta 2642 Asp Ile Ile Cys Pro Gln Val Val Ala Arg Tyr Leu Ser His Val Leu 780 785 790 caa aat agc aca tta tgt gaa gca ctt tct cat tca ggc tat gta tct 2690 Gln Asn Ser Thr Leu Cys Glu Ala Leu Ser His Ser Gly Tyr Val Ser 795 800 805 ttt caa gcc tta acc gta aga tca tgg att cgt tgt gtt ttg caa atg 2738 Phe Gln Ala Leu Thr Val Arg Ser Trp Ile Arg Cys Val Leu Gln Met 810 815 820 tat att aaa aac ctc tct ggg cct gat gat ttg ctc ata gat aaa aat 2786 Tyr Ile Lys Asn Leu Ser Gly Pro Asp Asp Leu Leu Ile Asp Lys Asn 825 830 835 840 ctg gaa gag gca gtt gaa aaa gag tac atg aaa cag ttg gtc aaa ctg 2834 Leu Glu Glu Ala Val Glu Lys Glu Tyr Met Lys Gln Leu Val Lys Leu 845 850 855 aca aga tta cta ttt aat ctc tca gaa gta aag agt att ttc tca aag 2882 Thr Arg Leu Leu Phe Asn Leu Ser Glu Val Lys Ser Ile Phe Ser Lys 860 865 870 gcc caa gtt gaa tat tta tcc atc tca gaa gac cct aaa aaa gca ctt 2930 Ala Gln Val Glu Tyr Leu Ser Ile Ser Glu Asp Pro Lys Lys Ala Leu 875 880 885 gtt cga ttc ttt gag gct gtt ggt gta act tac ggg aac gtc cag aca 2978 Val Arg Phe Phe Glu Ala Val Gly Val Thr Tyr Gly Asn Val Gln Thr 890 895 900 ctt tct gat aaa tct gcc atg gtc aca aag tcc ttg gaa tac ctt ggt 3026 Leu Ser Asp Lys Ser Ala Met Val Thr Lys Ser Leu Glu Tyr Leu Gly 905 910 915 920 gaa gta tta aaa tat att aag cct tat ttg gga aaa aaa gtt ttc agt 3074 Glu Val Leu Lys Tyr Ile Lys Pro Tyr Leu Gly Lys Lys Val Phe Ser 925 930 935 gca ggg ctg cag ctg act tat gga atg atg gga att ctt gtg aaa tca 3122 Ala Gly Leu Gln Leu Thr Tyr Gly Met Met Gly Ile Leu Val Lys Ser 940 945 950 tgg gca caa atc ttt gcc act tct aaa gcc caa aaa tta cta ttc cgg 3170 Trp Ala Gln Ile Phe Ala Thr Ser Lys Ala Gln Lys Leu Leu Phe Arg 955 960 965 atc ata gat tgt tta ctg ctg cca cat gca gta tta cag caa gag aag 3218 Ile Ile Asp Cys Leu Leu Leu Pro His Ala Val Leu Gln Gln Glu Lys 970 975 980 gaa ctg cct gca cct atg ttg tca gca att cag aaa agt ctt cct ttg 3266 Glu Leu Pro Ala Pro Met Leu Ser Ala Ile Gln Lys Ser Leu Pro Leu 985 990 995 1000 tat ctc cag ggc atg tgt atc gtg tgt tgt caa tct caa aat ccg aat 3314 Tyr Leu Gln Gly Met Cys Ile Val Cys Cys Gln Ser Gln Asn Pro Asn 1005 1010 1015 gcc tat ttg aat caa ttg cta ggg aat gtt att gag cag tat att ggg 3362 Ala Tyr Leu Asn Gln Leu Leu Gly Asn Val Ile Glu Gln Tyr Ile Gly 1020 1025 1030 cga ttt ctt cca gct tca cca tat gtt tca gat ctt gga caa cat cct 3410 Arg Phe Leu Pro Ala Ser Pro Tyr Val Ser Asp Leu Gly Gln His Pro 1035 1040 1045 gtt ttg ctg gca ttg aga aac aca gcc act att cca cca ata tca tct 3458 Val Leu Leu Ala Leu Arg Asn Thr Ala Thr Ile Pro Pro Ile Ser Ser 1050 1055 1060 cta aag aaa tgc att gtg caa gtc ata agg aaa tcc tac ctt gag tat 3506 Leu Lys Lys Cys Ile Val Gln Val Ile Arg Lys Ser Tyr Leu Glu Tyr 1065 1070 1075 1080 aag ggg tcc tca cct cct cct cgc tta gca tcc att ctg gcc ttc atc 3554 Lys Gly Ser Ser Pro Pro Pro Arg Leu Ala Ser Ile Leu Ala Phe Ile 1085 1090 1095 ctc caa ctc ttc aag gaa act aac aca gac att tat gaa gtt gaa cta 3602 Leu Gln Leu Phe Lys Glu Thr Asn Thr Asp Ile Tyr Glu Val Glu Leu 1100 1105 1110 ctc ctc cct ggc att tta aaa tgc ttg gtg tta gtc agt gaa cca caa 3650 Leu Leu Pro Gly Ile Leu Lys Cys Leu Val Leu Val Ser Glu Pro Gln 1115 1120 1125 gtt aaa agg ctg gcc aca gag aac ctg caa tac atg gta aaa gcc tgc 3698 Val Lys Arg Leu Ala Thr Glu Asn Leu Gln Tyr Met Val Lys Ala Cys 1130 1135 1140 caa gtg ggg tca gaa gaa gaa cct tcc tcc cag ctg act tct gtg ttt 3746 Gln Val Gly Ser Glu Glu Glu Pro Ser Ser Gln Leu Thr Ser Val Phe 1145 1150 1155 1160 agg cag ttt atc cag gat tat ggt atg agg tac tat tac cag gtt tac 3794 Arg Gln Phe Ile Gln Asp Tyr Gly Met Arg Tyr Tyr Tyr Gln Val Tyr 1165 1170 1175 agc att tta gaa aca gta gca aca ttg gac cag cag gtt gtc atc cac 3842 Ser Ile Leu Glu Thr Val Ala Thr Leu Asp Gln Gln Val Val Ile His 1180 1185 1190 ttg att tct acc ctt act cag tct ctg aag gat tca gag cag aaa tgg 3890 Leu Ile Ser Thr Leu Thr Gln Ser Leu Lys Asp Ser Glu Gln Lys Trp 1195 1200 1205 ggc ctt ggc agg aat ata gca caa agg gaa gcc tat agc aaa ctt ttg 3938 Gly Leu Gly Arg Asn Ile Ala Gln Arg Glu Ala Tyr Ser Lys Leu Leu 1210 1215 1220 tct cac ctt gga cag atg gga caa gat gag atg cag aga ctg gaa aat 3986 Ser His Leu Gly Gln Met Gly Gln Asp Glu Met Gln Arg Leu Glu Asn 1225 1230 1235 1240 gat aat act taata tattttgtga ttcatcctgt ctattaatta tcagtatcta 4040 Asp Asn Thr aagccacatt gttccactct aattcctact tttaattaat tgtataatgt tctgtttaaa 4100 ataatttcta ggattttttt tccttttata tctgtaagta aaaaatgtat aaataaggaa 4160 ctgaaggtta attagcaact gtgtaatagg atccttggaa ctttttacaa aactgcattc 4220 taccttgatg aaattttagt taaactaaat taaagaaaca ttttctgaga gtgttttctg 4280 tgtgtgagta ttaagcagat acttcatcca tagacttttt gttgtagtat gacttcctgc 4340 ctccctgcct tgtgactgat ttgtcatgtt tattttttat ttttacaata atagttatgt 4400 tttaaaatga tactttttca aagtacctgg ctaccctata ctgtgttttt ggtgggggaa 4460 aggtgttggg aaatgtgact gtgtatttgt ttttcttttt tatatgtgtg aggcaagtta 4520 acaaagaaaa cccttacaaa gcacacttaa ctgtgttagg aatgagactg aatctggcta 4580 aaggattata cagctgatat ccaaaaagaa gtgtaaacat gccaacaggg tttatattta 4640 ggttccaaga gttgccaaat ttttttttta ttcatccttt cttttggagt tgtcattaaa 4700 aaaaaaatca tatcaggagg aggaaataaa ggagacttta agaggagagt aaataaaaat 4760 attctagaaa agtaacaata gtagtggtct gagaagtcag ctgatccatc ttcttgctct 4820 ttagccagag cttcttataa cttagcattt tatccaagaa acctgtttag tttcctttaa 4880 caacattgtt tctcaacttt tgaactctta actcatccag attgttttac cagttggagc 4940 ttgtccttga ctccttttcc tattgagcat tatttggttg aaagagctcc agtcctagtt 5000 ttgggaaccc acctgggtct caaactcagc tttgctttat gatcttgagc tagttacgta 5060 acctttctca gtctagtttc ttcatggaga agaaaagaag aatcccttta ctatttgaca 5120 gtgttgttgt gagaatcaat gggataatgt acgtgaaaat atttggtggc ccaaattctg 5180 ttgggaaatg tacagacacg attagtttat tactcgtgca caattaaggc aaagaacacc 5240 tctcaatttt atctttctct aatgatatgt cccagatgaa tgatcccact ttccaatgtt 5300 ttcttacatc atgttttcta actttgaagt actttgtttc cttcttggga ttatagtctt 5360 tatcatggtt ctactcttcc ttcaagaaaa catttcaacc cttctctggc tcaaggagta 5420 tctttaaaaa tgaaatactt tgcaatcagt attctgtagt taatagcgtt ctcttaatta 5480 taatctgtga aatccaaagg agtgtctgtt attttcataa catataaatg gtccttctct 5540 caaatcagct tcatcaaagg gaataaatga aagcttaagg ctgtttaata gacttcataa 5600 cactgaattt cttttcatca tgatagtgac ttactaaaca aataatgtat ggcttggaaa 5660 gttccagcag tcactaagga gttttatcta tttaaggtga tgcctttaaa gaggttattt 5720 atgtgtatat gtgtttttgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgg 5780 gttttttttt tccaaaggag attgataaag atacctttga gaatcttgct ccttagagta 5840 tgaaaacgtt taaaggatag gaaaagctgc tactgaatca tgctttagga catatatcta 5900 tagatactaa gaataactaa aatttgtact taagaatggt aacaacaaag tgtgtaacaa 5960 tatgtgtgtg tattatatgt tttgtattta tgtataagta acttttttta aagctttttt 6020 ttaaattgaa aaaagaagaa aatttatggc tcagttcctt ttttttaaaa tcttcactga 6080 tccttcactt attactacaa tcttgccctc tttcattccc agacttggag tcccttatac 6140 ctgcttcttt aatagccact ttccctaaat accctgtaat ttctgaggct gctgcttcta 6200 ccagtgtaat acaagccatt gtcttttggt caaatctgag tttgttctcc tttctcatgt 6260 tctttgtcct ctctgtgaca attgtatttt cttttatctt cccatcattt ccacaatggt 6320 actgctcctt cctacatata cagttgaccc ttgagcaaca caagtttgaa ctgtgcaggt 6380 ccacttatat gtggatctaa aatacagtat ttgtgggatg caaaatctga gtatatggag 6440 gaccaacttt ttgtagaggc aggttcctca gggttaactg caggacttga gtaagtgcag 6500 attatggtat gcacagggga tcctggaacc agtccccaga ccaaaaatga ccactgtatc 6560 ttgagagcac cttcatggtc ttctttcctg tccccagtcg taagatacga cccttcatct 6620 gctttgtctc aacattctgt tagtggtgaa ctgataactc cagcttttct ctctcttttt 6680 tttttttttt ttttttttgt tgttgttgtt gttgttgttt tgaggcagag tcttgctctg 6740 tcgcccaggc tggagtgcag tggcacgatc tcggctcact gcaagctctg cctcccgggt 6800 tcacgccatt ctcctgcctc agcctcccaa gtagctggga ctacaggtgc ccgccaccac 6860 gcccggctaa ttttttttgt atttttagta gagacggggt ttcaccatgt tgggctcgat 6920 ctcctgacct catgatccgc ccgcctcggc ctcccaaagt gctgggatta caggcgtgat 6980 gagccaccta gtgctaattc atctctaaac ctctgtagtt ggagtctcct gaaatctcag 7040 actacctcct gctttcattt tctacccagg gaatacacta ttgtcctaag ttatttagcc 7100 ttgaaatgtc agaggcattt taggttcttc atgtttctcc cactttcagt tgattaccat 7160 tacaggatct taggcttctt tttatctttt tgcagtgcct tgcatccact ggttgtttgt 7220 tttttctgtt gggcactact tatttcctta cctctggttt cttctcctac agcttatgtt 7280 ctgaaatgtg tattcctaaa atactgtttt cctcttgtta cttttctgct cgaggacttc 7340 cagtaactta ccattgttta taaggtgatg ttcaaaccct tcagtctgga gactttctgc 7400 cacctatctg actgtacctt tatcttcaag cttatctctt tccaaacaag aggctcattt 7460 agcagctttc tctgattgcc atgttcatcc tacactcagc ctcattcagt ttacagcatg 7520 gaaactgtat aggacctctt tcctatagaa attgaagaca cttaaatagg aagaaaatta 7580 aaatatacat ttggatacat gagtattcca gtcaaataat atctataaaa taccagatag 7640 agtataaaag acaactgaag gacaacagag tgatgaaagg actttattag gcatttggat 7700 ttggttatga tttaaatttc aatttaatta gaacgtttcc atggcaagga aggaagcatg 7760 gaggactgtg gaaaagtcat tcagtattga gttcatttgc attagaggaa tttcatagtt 7820 taaaacttgt atatctttac ctatccttcg tatgttttct tcttaagcat atttgacttt 7880 ttctacctca gcatctgtat aagaaaatat ttgtgagtca gatgtttgtg ggttttcctt 7940 acctattatt attttcttcc atgctttaca acacattttt taaactacct tgttcttaaa 8000 taattacacg gacctgcttc tgtgtacttt cacagaatct ttgacagtta aaaattgtat 8060 gttatataaa aatttgacaa gcttctacag ttaggaaaag cctttagaaa tctgccttcc 8120 ccaaaccgta tgttatcata gcactcatgt ctccccatgt ctaaaaggta aatagataca 8180 gaaacctcac caaaagttga atcatctgta ctaaaccact gcttttttat ccagactttt 8240 tatataaatc ttttattttc caaaaaactg atcttttacc tacccctctt agagttaaaa 8300 atattgcctg tcaggcaaga gtatagtatg ccaatataaa taatatgctt tatttggtta 8360 gaaacagttg gtttgggaag ctagcaacat agcatattct ttacaaattt aataaggtgt 8420 attttgatac tgtgataacc tgcattgtaa attaccaaat ggttggaatt gaccagttta 8480 tacttattaa aatttttgat gtgccaatgg ctatccaatt cattgcattt gtgaattgtg 8540 cttttagaaa aattgtggac attttagttt tatatacata tttatgagtt atttgtgcat 8600 atgataaaat tatatataat aataaaagta tatatgtaac tta 8643 <210> 159 <211> 1243 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 159 Met Glu Asn Cys Ser Ala Ala Ser Thr Phe Leu Thr Asp Ser Leu Glu 1 5 10 15 Leu Glu Leu Gly Thr Glu Trp Cys Lys Pro Pro Tyr Phe Ser Cys Ala 20 25 30 Val Asp Asn Arg Gly Gly Gly Lys His Phe Ser Gly Glu Ser Tyr Leu 35 40 45 Cys Ser Gly Ala Leu Lys Arg Leu Ile Leu Asn Leu Asp Pro Leu Pro 50 55 60 Thr Asn Phe Glu Glu Asp Thr Leu Glu Ile Phe Gly Ile Gln Trp Val 65 70 75 80 Thr Glu Thr Ala Leu Val Asn Ser Ser Arg Glu Leu Phe His Leu Phe 85 90 95 Arg Gln Gln Leu Tyr Asn Leu Glu Thr Leu Leu Gln Ser Ser Cys Asp 100 105 110 Phe Gly Lys Val Ser Thr Leu His Cys Lys Ala Asp Asn Ile Arg Gln 115 120 125 Gln Cys Val Leu Phe Leu His Tyr Val Lys Val Phe Ile Phe Arg Tyr 130 135 140 Leu Lys Val Gln Asn Ala Glu Ser His Val Pro Val His Pro Tyr Glu 145 150 155 160 Ala Leu Glu Ala Gln Leu Pro Ser Val Leu Ile Asp Glu Leu His Gly 165 170 175 Leu Leu Leu Tyr Ile Gly His Leu Ser Glu Leu Pro Ser Val Asn Ile 180 185 190 Gly Ala Phe Val Asn Gln Asn Gln Ile Lys Leu Phe Pro Pro Ser Trp 195 200 205 His Leu Leu His Leu His Leu Asp Ile His Trp Leu Val Leu Glu Ile 210 215 220 Leu Tyr Met Leu Gly Glu Lys Leu Lys Gln Val Val Tyr Gly His Gln 225 230 235 240 Phe Met Asn Leu Ala Ser Asp Asn Leu Thr Asn Ile Ser Leu Phe Glu 245 250 255 Glu His Cys Glu Thr Leu Leu Cys Asp Leu Ile Ser Leu Ser Leu Asn 260 265 270 Arg Tyr Asp Lys Val Arg Ser Ser Glu Ser Leu Met Ser Asp Gln Cys 275 280 285 Pro Cys Leu Cys Ile Lys Glu Leu Trp Val Leu Leu Ile His Leu Leu 290 295 300 Asp His Arg Ser Lys Trp Phe Val Ser Glu Ser Phe Trp Asn Trp Leu 305 310 315 320 Asn Lys Leu Leu Lys Thr Leu Leu Glu Lys Ser Ser Asp Arg Arg Arg 325 330 335 Ser Ser Met Pro Val Ile Gln Ser Arg Asp Pro Leu Gly Phe Ser Trp 340 345 350 Trp Ile Ile Thr His Val Ala Ser Phe Tyr Lys Phe Asp Arg His Gly 355 360 365 Val Pro Asp Glu Met Arg Lys Val Glu Ser Asn Trp Asn Phe Val Glu 370 375 380 Glu Leu Leu Lys Lys Ser Ile Ser Val Gln Gly Val Ile Leu Glu Glu 385 390 395 400 Gln Leu Arg Met Tyr Leu His Cys Cys Leu Thr Leu Cys Asp Phe Trp 405 410 415 Glu Pro Asn Ile Ala Ile Val Thr Ile Leu Trp Glu Tyr Tyr Ser Lys 420 425 430 Asn Leu Asn Ser Ser Phe Ser Ile Ser Trp Leu Pro Phe Lys Gly Leu 435 440 445 Ala Asn Thr Met Lys Ser Pro Leu Ser Met Leu Glu Met Val Lys Thr 450 455 460 Cys Cys Cys Asp Lys Gln Asp Gln Glu Leu Tyr Lys Ser Ser Ser Ser 465 470 475 480 Tyr Thr Ile Phe Leu Cys Ile Leu Ala Lys Val Val Lys Lys Ala Met 485 490 495 Lys Ser Asn Gly Pro His Pro Trp Lys Gln Val Lys Gly Arg Ile Tyr 500 505 510 Ser Lys Phe His Gln Lys Arg Met Glu Glu Leu Thr Glu Val Gly Leu 515 520 525 Gln Asn Phe Phe Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ala Ala Val Ala Glu Val 530 535 540 Glu Asp Val Ala Ser His Val Leu Asp Leu Leu Asn Phe Leu Lys Pro 545 550 555 560 Ala Phe Val Thr Ser Gln Arg Ala Leu Ile Trp Lys Gly His Met Ala 565 570 575 Phe Leu Leu Met Tyr Ala Gln Lys Asn Leu Asp Ile Gly Val Leu Ala 580 585 590 Glu Lys Phe Ser Cys Ala Phe Arg Glu Lys Ala Lys Glu Phe Leu Val 595 600 605 Ser Lys Asn Glu Glu Met Val Gln Arg Gln Thr Ile Trp Thr Leu Leu 610 615 620 Ser Ile Tyr Ile Asp Gly Val Gln Glu Val Phe Glu Thr Ser Tyr Cys 625 630 635 640 Leu Tyr Pro Ser His Glu Lys Leu Leu Asn Asp Gly Phe Ser Met Leu 645 650 655 Leu Arg Ala Cys Arg Glu Ser Glu Leu Arg Thr Val Leu Ser Phe Leu 660 665 670 Gln Ala Val Leu Ala Arg Ile Arg Ser Met His Gln Gln Leu Cys Gln 675 680 685 Glu Leu Gln Arg Asp Asn Val Asp Leu Phe Val Gln Ser Ser Leu Ser 690 695 700 Ala Lys Glu Arg His Leu Ala Ala Val Ala Ser Ala Leu Trp Arg His 705 710 715 720 Phe Phe Ser Phe Leu Lys Ser Gln Arg Met Ser Gln Val Val Pro Phe 725 730 735 Ser Gln Leu Ala Asp Ala Ala Ala Asp Phe Thr Leu Leu Ala Met Asp 740 745 750 Met Pro Ser Thr Ala Pro Ser Asp Phe Gln Pro Gln Pro Val Ile Ser 755 760 765 Ile Ile Gln Leu Phe Gly Trp Asp Asp Ile Ile Cys Pro Gln Val Val 770 775 780 Ala Arg Tyr Leu Ser His Val Leu Gln Asn Ser Thr Leu Cys Glu Ala 785 790 795 800 Leu Ser His Ser Gly Tyr Val Ser Phe Gln Ala Leu Thr Val Arg Ser 805 810 815 Trp Ile Arg Cys Val Leu Gln Met Tyr Ile Lys Asn Leu Ser Gly Pro 820 825 830 Asp Asp Leu Leu Ile Asp Lys Asn Leu Glu Glu Ala Val Glu Lys Glu 835 840 845 Tyr Met Lys Gln Leu Val Lys Leu Thr Arg Leu Leu Phe Asn Leu Ser 850 855 860 Glu Val Lys Ser Ile Phe Ser Lys Ala Gln Val Glu Tyr Leu Ser Ile 865 870 875 880 Ser Glu Asp Pro Lys Lys Ala Leu Val Arg Phe Phe Glu Ala Val Gly 885 890 895 Val Thr Tyr Gly Asn Val Gln Thr Leu Ser Asp Lys Ser Ala Met Val 900 905 910 Thr Lys Ser Leu Glu Tyr Leu Gly Glu Val Leu Lys Tyr Ile Lys Pro 915 920 925 Tyr Leu Gly Lys Lys Val Phe Ser Ala Gly Leu Gln Leu Thr Tyr Gly 930 935 940 Met Met Gly Ile Leu Val Lys Ser Trp Ala Gln Ile Phe Ala Thr Ser 945 950 955 960 Lys Ala Gln Lys Leu Leu Phe Arg Ile Ile Asp Cys Leu Leu Leu Pro 965 970 975 His Ala Val Leu Gln Gln Glu Lys Glu Leu Pro Ala Pro Met Leu Ser 980 985 990 Ala Ile Gln Lys Ser Leu Pro Leu Tyr Leu Gln Gly Met Cys Ile Val 995 1000 1005 Cys Cys Gln Ser Gln Asn Pro Asn Ala Tyr Leu Asn Gln Leu Leu Gly 1010 1015 1020 Asn Val Ile Glu Gln Tyr Ile Gly Arg Phe Leu Pro Ala Ser Pro Tyr 1025 1030 1035 1040 Val Ser Asp Leu Gly Gln His Pro Val Leu Leu Ala Leu Arg Asn Thr 1045 1050 1055 Ala Thr Ile Pro Pro Ile Ser Ser Leu Lys Lys Cys Ile Val Gln Val 1060 1065 1070 Ile Arg Lys Ser Tyr Leu Glu Tyr Lys Gly Ser Ser Pro Pro Pro Arg 1075 1080 1085 Leu Ala Ser Ile Leu Ala Phe Ile Leu Gln Leu Phe Lys Glu Thr Asn 1090 1095 1100 Thr Asp Ile Tyr Glu Val Glu Leu Leu Leu Pro Gly Ile Leu Lys Cys 1105 1110 1115 1120 Leu Val Leu Val Ser Glu Pro Gln Val Lys Arg Leu Ala Thr Glu Asn 1125 1130 1135 Leu Gln Tyr Met Val Lys Ala Cys Gln Val Gly Ser Glu Glu Glu Pro 1140 1145 1150 Ser Ser Gln Leu Thr Ser Val Phe Arg Gln Phe Ile Gln Asp Tyr Gly 1155 1160 1165 Met Arg Tyr Tyr Tyr Gln Val Tyr Ser Ile Leu Glu Thr Val Ala Thr 1170 1175 1180 Leu Asp Gln Gln Val Val Ile His Leu Ile Ser Thr Leu Thr Gln Ser 1185 1190 1195 1200 Leu Lys Asp Ser Glu Gln Lys Trp Gly Leu Gly Arg Asn Ile Ala Gln 1205 1210 1215 Arg Glu Ala Tyr Ser Lys Leu Leu Ser His Leu Gly Gln Met Gly Gln 1220 1225 1230 Asp Glu Met Gln Arg Leu Glu Asn Asp Asn Thr 1235 1240 <210> 160 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 160 gtctaccagg cattcgcttc at 22 <210> 161 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 161 tcagctggac cacagccgca gcgt 24 <210> 162 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 162 tcagaaatcc tttctcttga c 21 <210> 163 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 163 ctagcctctg gaatcctttc tctt 24

Claims (29)

  1. HLA 항원에 결합하고 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte; CTL) 유도성을 가지는 펩티드로서, 여기서 상기 펩티드는 서열 번호: 159로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드 또는 그것의 면역학적 활성 단편.
  2. 제 1항에 있어서, HLA 항원은 HLA-A24 또는 HLA-A2인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 펩티드는 서열 번호: 2, 4, 7, 8, 9, 14, 16, 18, 22, 25, 26, 30, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 41, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 53, 65, 66, 76, 79, 84, 101, 110, 111, 112, 113, 114, 117, 118, 121, 122, 123, 및 124.로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드는 노나펩티드(nonapeptide) 또는 데카펩티드(decapeptide)인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  5. 제 4항에 있어서, 펩티드는 서열 번호: 2, 4, 7, 8, 9, 14, 16, 18, 22, 25, 26, 30, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 41, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 53, 65, 66, 76, 79, 84, 101, 110, 111, 112, 113, 114, 117, 118, 121, 122, 123, 및 124로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 여러 개의 아미노산이 치환, 결실, 또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  6. 하기 특징 중 하나 또는 둘 모두를 갖는 제 5항의 분리된 펩티드:
    (a) N-말단으로부터 2번째 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 메티오닌(methionine) 및 트립토판(tryptophan)으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이거나 또는 상기 군으로부터 선택된 아미노산으로 변형된 것이고, 및
    (b) C-말단의 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine), 루신(leucine), 이소루신(isoleucine), 트립토판(tryptophan) 및 메티오닌(methionine)으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이거나 또는 상기 군으로부터 선택된 아미노산으로 변형된 것.
  7. HLA-A2에서, 하기의 군으로부터 선택된 최소한 하나의 치환을 가지는 제 5항의 분리된 펩티드:
    (a) N-말단으로부터 2번째 아미노산이 루신(leucine) 및 메티오닌(methionine)으로 구성된 군으로부터 선택되고; 및
    (b) C-말단 아미노산은 발린(valine) 및 루신(leucine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 분리된 펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  9. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에서 나타난 하나 또는 그 이상의 펩티드, 또는 제 8항에 나타난 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 그 이상을 포함하는 CTL 유도용 조성물.
  10. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에서 나타난 하나 또는 그 이상의 펩티드, 또는 제 8항에 나타난 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 암 치료 및/또는 예방, 및/또는 그것의 수술후 재발 방지용 약학적 조성물.
  11. HLA 항원이 HLA-A*2402 또는 A*0201인 개체에 투여하기 위해 제형화된, 제 10항의 약학적 조성물.
  12. 하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 CTL 유도성을 갖는 항원-제시 세포(antigen-presenting cell; APC) 유도 방법:
    (a) 시험관 내(in vitro), 생체 외(ex vivo) 또는 생체 내(in vivo)에서 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에서 나타난 펩티드와 APC를 접촉시키는 단계, 및
    (b) 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 나타난 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC에 도입시키는 단계.
  13. 하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 CTL 유도 방법:
    (a) CD8 양성 T 세포(CD8-positive T cell)와 HLA 항원 및 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에서 나타난 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 APC를 공동 배양하는 단계,
    (b) CD8 양성 T 세포(CD8-positive T cell)와 HLA 항원 및 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 나타난 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 엑소솜(exosomes)을 공동 배양하는 단계, 및
    (c) 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 나타난 펩티드에 결합하는 T 세포 수용체(T cell receptor; TCR) 서브유닛(subunit) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자를 T 세포에 도입하는 단계.
  14. HLA 항원 및 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 APC.
  15. 제 14항에 있어서, 제 13항의 방법에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 분리된 APC.
  16. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 펩티드를 표적으로 하는 CTL.
  17. 제 16항에 있어서, 제 14항의 방법에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 분리된 CTL.
  18. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에서 나타난 펩티드, 그것의 면역학적 활성 단편, 또는 상기 펩티드 또는 상기 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체 내에서의 암에 대한 면역 반응 유도 방법.
  19. 하기 단계를 포함하는 암 진단 방법:
    (a) 하기 방법으로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의한 개체-유래 생물학적 샘플에서 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계:
    (i) C6orf167 유전자의 mRNA를 탐지하는 방법,
    (ii) C6orf167 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 탐지하는 방법, 및
    (iii) C6orf167 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 생물학적 활성을 탐지하는 방법; 및
    (b) 상기 유전자의 정상 대조군 수준과 비교하여 단계 (a)에서 결정된 발현 수준 증가와 암의 존재를 연관시키는 단계.
  20. 제 19항에 있어서, 단계 (a)에서 결정되는 발현 정도는 정상 대조군보다 최소 10% 이상인 것을 특징으로 하는 암 진단 방법.
  21. 제 19항에 있어서, 암은 방광암(bladder cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 간내담도암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수 백혈병(chornic myelogenous leukemia; CML), 식도암(esophageal cancer), 위암(gastric cancer), 위 확산형 암(gastric diffuse-type cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 골육종(osteosarcoma), 신장암(renal carcinoma), 폐 선암(lung adenocarcinoma; ADC), 폐편평상피암(lung squamous cell carcinoma; SCC), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer; SCLC), 비소세포성 폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC), 연조직 종양(soft tissue tumor), 및 고환 종양(testicular tumor)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단 방법.
  22. 제 19항에 있어서, 단계 (a)에서 결정되는 발현 수준은 C6orf167 유전자의 mRNA에 대한 탐침(probe)의 혼성화를 탐지하는 것에 의하여 결정되는 것을 특징으로 하는 암 진단 방법.
  23. 제 19항에 있어서, 단계 (a)에서 결정되는 발현 수준은 C6orf167의 단백질에 대한 항체의 결합을 탐지하여 결정되는 것을 특징으로 하는 암 진단 방법.
  24. 제 19항에 있어서, 개체-유래 생물학적 샘플은 생검(biopsy), 가래(sputum), 혈액(blood), 흉막삼출(pleural effusion) 또는 요(urine)를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단 방법.
  25. 하기 시약으로 구성된 군으로부터 선택된 시약을 포함하는 암 진단 키트:
    (a) C6orf167 유전자의 mRNA를 탐지하는 시약,
    (b) C6orf167 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 탐지하는 시약, 및
    (c) C6orf167 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 생물학적 활성을 탐지하기 위한 시약.
  26. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 개시된 펩티드, 그것의 면역학적 활성 단편, 또는 상기 펩티드 또는 상기 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체 내에서의 암에 대한 면역 반응 유도 방법.
  27. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 개시된 펩티드 중 어떤 것에 대한 항체 또는 그것의 단편.
  28. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 개시된 펩티드 중 어떤 것을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  29. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 개시된 펩티드, 제 8항의 뉴클레오티드 또는 제 27항의 항체 중 어떤 것을 포함하는 진단 키트.
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