KR20120023663A - 폐 계면활성제 및 스테로이드를 포함하는 치료적 조합 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기관지폐형성장애(bronchopulmonary dysplasia, BPD)의 예방을 위해 코르티코스테로이드와 조합하는 개조된 천연 계면활성제의 용도에 관한 것으로, 이것에 의해 상기 용도는 폐 산화적 스트레스의 마커들을 낮춰준다.

Description

폐 계면활성제 및 스테로이드를 포함하는 치료적 조합{A THERAPEUTIC COMBINATION COMPRISING A PULMONARY SURFACTANT AND A STEROID}

본 발명은 미숙아의 치료를 위한 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 미숙아에서 기관지폐형성장애의 발달의 위험과 폐의 산화적 손상을 줄여주기 위한 스테로이드와 조합하는 폐 계면활성제의 용도에 관한 것이다

인간의 허파는 폐포(肺胞)라고 불리는 많은 수의 작은 공기 주머니로 이루어져 있으며, 그곳에서 기체들은 혈액과 허파의 공기 공간 사이에서 교환된다. 건강한 사람에서, 이러한 교환은 날숨(또는 호기)의 끝에서 허파의 허탈(collapsing)을 방지하는 단백질 포함 계면활성 복합체의 존재에 의하여 중재된다.

폐 계면활성 복합체는 주로 지질로 이루어져 있고 소량의 다양한 단백질을 포함한다. 이러한 복합체가 적당한 수준으로 존재하지 않으면 허파의 기능 부전을 초래한다. 이러한 증후군은 호흡 곤란 증후군(RDS)이라고 불리고, 일반적으로 미숙아(preterm infant)에 영향을 미친다.

RDS는 개조된 천연 계면활성제로서 알려진 동물 허파로부터 추출된 외인성 폐 계면활성 조제가 치료를 요하는 사람에게 투여되는 대체 요법(replacement therapy)으로 주로 치료된다. 예를 들어, 기존 임상 실무에서 사용되는 개조된 천연 계면활성제는, 큐로서프(Curosurf^？)의 상표로 판매되는, 돼지 허파로부터 얻은 돼지 폐 추출물, (포랙탄트 알파(poractant alfa)), 양쪽 모두 소과의 허파(bovine lung)로부터 추출된 베랙탄트(Surfacten^？ 또는 Survanta^？), 보백탄트 (Alveofact^？), 그리고 송아지 허파로부터 추출된 카팩탄트(Infasurf^？)이다.

외인성 폐 계면활성제는 미숙아에 관(管)을 삽입하여 산소의 기계적 호흡(mechanical ventilation with oxygen) 하에 생리적 식염수의 현탁액으로 기관내의 점적 주입(endotracheal instillation)에 의하여 최근에는 투여된다.

위와 같은 치료가 크게 출산 직후 생존을 증가시켜왔으나, RDS로부터 살아남은 어린 아이들은 기관지폐형성장애 발달 그리고, 폐 발달을 지연시켜서, 결국에는 손상된 호흡을 가지게 되는 합병증의 커다란 위험을 가지게 된다. 증거들은 폐 염증과 폐 조직의 산화적 손상이 BPD의 발병에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 가리켜준다. 또한, 염증과 산화적 스트레스는 혈장 단백질의 폐포 누출액과 세포 및 자유 라디칼의 직접 작용을 통하여 계면활성제 비활성화하게 한다.

RDS에 걸린 유아(infant)에서의 BPD의 발달 위험은 출생직후 몇주 동안 코르티코스테로이드의 전달에 의해 감소될 수 있다. 그러나, 출산 직후 코르티코스테로이드 투여의 효용성은 가능한 부정적 전신 효과 (예컨대, 고혈압, 고혈당증, 위장관 합병증, 및 신경발달 장애)에 의해 상쇄된다.

전신 투여의 대안으로써, 코르티코스테로이드의 흡입 또는 기관내 주입에 의한 전달이 제안되어왔다.

예컨대, Yeh et al (Pediatrics 2008, 121(5), e1310-e1318)은 계면활성제 Survanta^？를 담체로써 이용하는 부데소니드 (budesonide)의 기관내 주입을 제안하였다.

그러나, US 2007/0225223에 보고된 바와 같이, 관련된 전달 순서는 네번의 엘리컷(aliquots)으로 약제를 투여하고, 각각의 앨리컷은 다르게 투여되고, 다소 유아(infant)에게는 복잡한 위치(position)일 수 있으므로, 편안함 (compliance)의 측면에서 몇몇 결점을 가지고 있다.

위의 고찰들에 비추어보면, RDS에 걸린 유아들의 폐 염증과 산화적 스트레스의 마커들 및 그에 따른 BPD 위험을 효과적으로 줄여주는 좀 더 부응하는 약제의 개발이 여전히 필요하다.

특히, 기계적 호흡(mechanical ventilation)은 BPD 발달에 기여하는 것으로 인지되는 침습적 시술이기 때문에, 그러한 호흡(respiratory) 보조를 피하는 방법에 의해 효과적으로 또한 투여될 수 있는 약제를 제공한다는 점에서 특별한 장점일 것이다.

발명의 요약

본 발명은 기관지폐형성장애(BPD)의 예방을 위한 용도로, 0.4mg/kg 이상 도즈(dose)의 베클로메타손 디프로피오네이트와 조합하는 100 내지 200mg/kg 사이 도즈의 돼지 폐 추출물(포랙탄트 알파, poractant alfa)에 관한 것이다.

본 발명은 기관지폐형성장애(BPD)의 예방을 위한 약제의 제조에 있어서 0.4mg/kg과 동등한 또는 그 이상 도즈의 베클로메타손 디프로피오네이트와 조합하는 100과 200mg/kg 사이를 포함하는 도즈의 돼지 폐 추출물의 용도에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 용도는 폐 산화적 스트레스의 마커들을 낮춰준다.

바람직하게, 상기 베클로메타손 디프로피오네이트는 0.8mg/kg 도즈에서 이용된다.

본 발명은 또한

- 기관지폐형성장애(BPD)의 예방을 위한 동시의(simultaneous), 연속적(sequential) 또는 분리된(separate) 투여로써, 바람직하게는 동시투여로써, 0.4mg/kg과 동등한 또는 그 이상인 도즈의 베클로메타손 디프로피오네이트와

- 100과 200mg/kg 사이를 포함하는 도즈의 돼지 폐 추출물의 조합에 관한 것이다.

본 발명은 또한 0.4mg/kg, 바람직하게는 0.8mg/kg과 동등한 또는 그 이상인 도즈의 베클로메타손 디프로피오네이트와 100과 200mg/kg 사이를 포함하는 도즈의 돼지 폐 추출물의 고정된 조합을 포함하는 약제에 관한 것이다.

특별한 구현예에서, 상기 약제는 흡입 또는 기관내 투여를 위한 약학적 조성물의 형태이다.

다른 구현예에서, 본 발명은 a) 제1 유닛 제형 내 100 내지 200mg/kg 사이 도즈의 돼지 폐 추출물과 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제; b) 제2 유닛 제형 내 0.4mg/kg, 바람직하게는 0.8mg/kg과 동일하거나 이상인 베클로메타손 디프로피오네이트와 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제; 및 c) 상기 제1 제형 및 제2 제형을 포함하기 위한 용기 수단을 포함하는 키트에 관한 것이다.

다른 추가적인 구현예에서, 본 발명은 0.4mg/kg, 바람직하게는 0.8mg/kg과 동일하거나 이상인 베클로메타손 디프로피오네이트와 조합하여 100 및 200mg/kg 사이를 포함하는 도즈의 돼지 폐 추출물을, 그러한 치료를 필요로하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 기관지폐형성장애를 예방하는 방법에 관한 것이다.

용어의 정의

여기에서 사용된 것처럼, "기관지폐형성장애(bronchopulmonary dysplasia (BPD)"는 만성 폐 장애로, 만성 폐 질환(chronic lung disease, CLD)으로도 또한 알려져 있으며, 해결되지 않은 또는 비정상적으로 복구된 폐 손상의 결과이다.

BPD는 전형적으로 생애에 일찍 기계적 환기로부터의 기압외상(baurotrauma)과 산소 독성의 결과로 폐 손상을 입은 매우 낮은 출산 체중 (very low birth weight, VLBW)을 가진 유아에게서 일어난다.

여기에서 사용된 것처럼, "개조된 천연 계면활성제 (modified natural surfactant)"라는 용어는, 잘게 잘린 포유류 폐의 지질 추출물을 의미한다. 제조 과정에서 사용된 지질 추출 과정 때문에, 친수성 단백질 SP-A 및 SP-D가 제거된다. 이 제조물은 두개의 소수성, 계면 관련 단백질 SP-B 및 SP-C의 다양한 양을 포함하고 추출 방법에 따라서, 비 계면활성 지질(non-surfactant lipid), 단백질 또는 다른 성분을 포함할 수 있다.

여기에서 사용된 것처럼, "돼지 폐 추출물(포랙탄트 알파, poractant alfa)"는 돼지 폐로부터 추출된 개조된 천연 계면활성제로, 극성 지질, 주로 인지질과 단백질, SP-B 및 SP-C로 구성되어 있다. 돼지 폐 추출물는 상표명 CUROSURF^？로 사용되고 있다.

여기에서 사용된 것처럼, 용어 "고정된 조합(fixed combination)"은 활성 물질이 고정된 정량적 비율로 존재하는 조합을 의미한다.

"약학적으로 허용가능한"은 유아에 투여되는 경우 알레르기성의 또는 이와 유사한 부적당한 반응을 일으키지 않는 미디엄(medium)을 말할 때 사용되는 용어이다.

계면활성제 제조물을 위한 "계면활성제 활성"은 표면 장력을 낮추는 능력을 가진 것으로 정의된다.

외인성 계면활성제 조제물의 인 비트로(in vitro) 효능은 일반적으로 웰헬미 밸런스 (Wilhelmy Balance), 펄세이팅 버블 서팩토미터 (Pulsating Bubble Surfactometer), 캡티브 버블 서팩토미터 (Captive Bubble Surfactometer) 및 캐필러리 서팩토미터 (Capillary Surfactometer)를 비롯한 적절한 기구를 이용한 표면장력을 낮춰주는 능력을 측정함으로써 시험된다.

외인성 계면활성제 조제물의 인 비보(in vivo) 효능은 종래 알려진 기술분야의 통상의 방법에 따라 조숙 동물 모델에서 폐 역학을 측정함으로써 시험된다.

여기에서 사용된 것처럼, 용어 "중증(severe) RDS"는 본 기술이 속한 분야의 통상의 지식을 가진자에게 알려진 방법에 따라 임상적으로 및/또는 방사선사진술로 진단될 수 있는 임신령(재태기간,gestational age) 및/또는 출생시 체중에 역비례하여 관련되는, 유아(infant) 호흡 장애 증후군의 일 형태를 의미한다.

폐 역학상에서의 코르티코스테로이드의 급성 투여의 효과는 무시되는 것이 일반적이기 때문에, 본 출원의 문맥에서, 용어 "상승적인(synergistic)"은 계면활성제의 활성에 베클로메타손 디프로피오네이트를 더한 것이, 폐 역학상의 파라미터 중 어느 하나에 있어, 오직 계면활성제만의 활성보다 그 이상일 것으로 기대됨을 의미한다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명은 0.4mg/kg과 동등하거나 그 이상의 도즈에서의 베클로메타손 디프로피오네이트가 돼지 폐 추출물를 비롯한 개조된 천연 계면활성제와 조합하여, 계면활성제의 표면 활성의 변화없이 기관지폐형성장애의 위험을 효과적으로 줄일 수 있다는 예견치못한 결과에 일부 근거한 것이다.

그러므로, 본 발명은 기관지폐형성장애(BPD)의 예방을 위한 약제로써 0.4mg/kg과 동등하거나 그 이상의 도즈의 베클로메타손 디프로피오네이트의 조합한 100과 200mg/kg 사이에 포함된 도즈의 돼지 폐 추출물에 관한 것이다.

유익하게, 베클로메타손 디프로피오네이트의 도즈는 0.4mg/kg (400㎍/kg) 이상, 바람직하게는 0.6 내지 0.8㎍/kg 범위이다.

일 구현예로, 베클로메타손 디프로피오네이트는 0.6mg/kg 이다.

베클로메타손 디프로피오네이트의 바람직한 도즈는 0.8mg/kg (800㎍/kg)이다.

바람직하게는, 돼지 폐 추출물의 도즈는 200mg/kg이다.

청구된 도즈에서의 돼지 폐 추출물와 베클로메타손 디프로피오네이트의 조합은 연속적으로, 분리하여, 또는 함께 투여될 수 있다. 유익하게, 두 개의 활성 물질이 함께 투여될 때, 그것들은 고정된 조합으로써 투여된다.

그러므로, 본 발명은 또한 고정된 조합으로써 청구된 도즈의 두 활성 물질을 포함하는 약제에 관한 것이다. 약제는 약학적 조성물의 형태일 수 있다.

상기 제제(formulation)는 용액, 분산제, 현탁액 또는 건조 분말의 형태로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 적절한 생리학적으로 허용가능한 용매 내에 현탁된 상기 청구된 조합을 포함한다.

더 바람직하게는, 제제는 수용액(aqueous solution), 바람직하게는, 멸균 용액을 포함할 수 있고, 또한, pH 완충제 및 다른 약학적으로 허용가능한 부형제, 예컨대, 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 80 또는 습윤제로써 솔비탄 모노라우레이트 및 등장제로써 소듐 클로라이드를 포함할 수 있다.

본 제제는 단일-도즈 또는 다중-도즈 용기, 예컨대, 밀봉된 앰플 및 바이알에 분배될 수 있거나, 사용하기 전에 즉시 멸균 액체 담체를 오직 추가해야하는 동결 또는 동결건조된 조건에서 저장될 수 있다.

바람직하게는, 제제는 단일-용도 바이알에서 완충된(buffered) 생리학적 식염수 (0.9% w/v 소듐 클로라이드) 수용액 내 멸균 현탁액으로써 공급된다.

청구된 제제의 투여는, 알려진 방법, 예컨대, 시장에서 일반적으로 사용되는 메쉬-진동식 네불라이저 또는 제트 초음파에 의한 연무 (nebulization)에 의해, 또는 분무 (spray)에 의해 또는 기관내 점적에 의해서 수행될 수 있다.

제제가 기관내 점적에 의해 투여될 때, 호흡 장애 증후군의 정도에 따라서, 다른 방법들이 적절할 수 있다. 예컨대, 청구된 제제는 지속적 양압 호흡 또는 간헐적 양압 호흡 (continuous or intermittent positive pressure ventilation)으로 투여될 수 있다.

또 다르게, 제제는 기관내에 위치하는 가느다란 카테터를 사용함으로써 투여될 수 있고, 환자 호흡은 WO 2008/148469에 기재된 방법에 따라, 비강 지속적 양압 호흡 (continuous positive airway pressure, nCPAP)으로 알려진 방법에 따라 튜브 또는 프롱(prong), 또는 마스크를 비롯한 특별히 고안된 비강 장비를 통해 보조한다.

후자의 접근은 낮은 점도를 가지는 돼지 폐 추출물를 비롯한 외연성 계면활성제를 가지고서만 오직 가능하고, 높은 점도는 가느다란 카테터를 통한 계면활성제의 흐름을 더 어렵게 만든다.

두 조합된 활성 물질이 현탁되어 있는 수용액의 부피는 희망하는 농도에 의존적이다.

유익하게, 본 제제의 부피는 5.0ml 보다 크지 않고, 바람직하게는, 4.5에서 2.0ml 사이를 포함하고, 더욱 바람직하게는 3.5에서 2.5ml사이를 포함한다.

예컨대, 200mg의 돼지 폐 추출물 양과 0.8mg의 베클로메타손 디프로피오네이트를 위해서는, 2.5ml 부피가 이용될 때에, 돼지 폐 추출물과 베클로메타손 디프로피오네이트의 최종 농도는 각각 80mg/ml 과 0.32mg/ml 이 될 것이다.

만약 4.5ml이 사용된다면, 동일한 도즈로, 최종 농도는 각각 약 44mg/ml 및 약 0.18mg/ml일 것이다.

만약 100mg의 돼지 폐 추출물이 사용되어야 한다면, 2.5ml 부피를 위해, 최종 농도는 각각 40mg/ml 및 0.32 mg/ml일 것이다.

다른 구현예에서, 돼지 폐 추출물 및 베클로메타손 디프로피오네이트가 분리하여 투여될 때에, 개개의 활성 물질들은 분리하여 제조될 수 있다. 이 경우에, 두 개의 개별적인 활성 물질은 무조건적으로 동시에 다뤄질 필요는 없다.

분리 투여의 경우에, 두 개의 개별적인 활성 물질의 제제는 적절한 용기 수단에서 동시에 포장될 수 있다. 적절한 용기 내에 구성성분의 그러한 분리된 포장은 키트로써 또한 표현될 수 있다.

그러므로, 본 발명은 또한 a) 제1 유닛 제형에서 100과 200 mg 사이를 포함하는 돼지 폐 추출물과 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제; b) 제2 유닛 제형에서 0.4mg이거나 그 이상인 베클로메타손 디프로피오네이트와 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 c) 제1과 제2 제형을 포함하는 용기 수단을 포함하는 키트에 관한 것이다.

바람직하게는, 제1 유닛 제형은 완충 생리학적 식염수 (0.9% w/v 소듐 클로라이드) 수용액 내에 현탁된 80mg/ml 돼지 폐 추출물의 멸균 제제 2.5ml로 채워진 단일-용도 바이알이고, 제2 유닛 제형은 폴리솔베이트 (Tween) 20, 솔비탄 모노라우레이트 및 소듐 클로라이드를 포함하는 수용액에 현탁된 0.8mg/ml의 미분화된(micronized) 베클로메타손 디프로피오네이트의 멸균 제제 2ml 채워진 단일-용도 바이알이다.

본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진자에 의해 확립된 조건에 따라 출산후에 유아(infant)에게 투여될 수 있는 본 발명의 조합은 기관지폐형성장애의 발달을 억제하거나 막거나 경감하거나 지연하거나 또는 예방하는데 적절하다.

바람직하게, 본 발명의 조합은 중증 정도의 RDS (호흡장애증후군)에 의한 영향을 받는 미숙아에서 기관지폐형성장애의 발달을 예방하는데에 적절하다.

그러나, 성인호흡장애증후군(ARDS), 급성 폐 손상 (ALI, acute lung injury), 및 태변흡인증후군(MAS)를 비롯한 내인성 계면활성제의 기능 장애, 또는 결핍에 관련된 다른 질병들의 예방 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있다.

치료 실무에서 현재 적용되는 것에 비해 높은 도즈의 베클로메타손 디프로피오네이트와 돼지 폐 추출물을 조합한 이점은 다음의 결과로부터 더욱 분명해질 것이다.

RDS에 걸린 미숙 양 (preterm lamb)에서 임의로 추출한 연구에서, 0.4mg/kg 보다 높은 도즈의 베클로메타손 디프로피오네이트와 돼지 폐 추출물의 조합은 폐 역학(mechanic) 파라미터상에 상승적 방법으로서, 그리고 몇몇 폐 조직 산화적 스트레스 마커들에 추가적인 방법으로써 작용한다는 것을 알아냈다.

본 연구는 단독 계면활성제와 비교하여, 서로 다른 도즈에서의 베클로메타손 디프로피오네이트와 돼지 폐 추출물을 합하여 기관내 투여하는 방법으로 수행되었다.

폐 조직 산화는 기관지 흡입액 샘플에서 총 히드로과산화물(total hydroperoxide, TH), AOPP(advanced oxidation protein products), 및 NPBI (non protein bound iron)를 측정함으로써 연구하였다. TH는 계면활성제 그룹보다, 400 또는 800㎍/kg의 베클로메타손 디프로피오네이트와 계면활성제의 조합을 투여한 실험군에서 낮게 측정된 반면, AOPP는 800㎍/kg의 베클로메타손 디프로피오네이트와 계면활성제를 조합하여 처리한 군이, 다른 그룹들에 비하여 낮게 나타났고, NPBI는 모든 그룹에서 유사한 수준으로 나타났다. 폐 용압률 (lung compliance) 또한 측정되었다.

계면활성제 처리 뒤에 일호흡 (tidal volume, TV), 그리고 기도저항(airway resistance, Raw)이 지속적으로 개선되었고, 이것은 예상했던대로, 베클로메타손 디프로피오네이트의 존재하에서, 심지어 최고 높은 수준의 도즈에서도 영향을 받지 않았다. 그러나, 놀랍게도, 800㎍/kg의 베클로메타손 디프로피오네이트의 추가는, 동일한 수치의 TV를 얻어야하는 MAP (mean airway pressure)의 상승적 감소를 가져왔다. 반대로, 계면활성제와 400mg/kg 도즈의 베클로메타손 디프로피오네이트를 조합하여 투여한 군에서는, MAP상의 영향이 계면활성제 단독으로 처리한 군과 통계적으로 크게 다르지 않았다.

이것은 부드러운 기계 호흡(softer mechanical ventilation)이 본 발명의 조합을 수여받는 환자들에게 좀 더 적은 위험의 압력손상 (barotrauma)으로 적용될 수 있음을 의미한다.

그러므로, 앞서 언급한 결과들(즉, 산화적 폐 스트레스의 감소 및 폐 역학 파라미터들 중 하나의 상승적 개선)에서 볼 때, 본 발명은 기관지폐형성장애를 예방하기 위한 특별히 효과적인 조합을 제공한다.

또한, 베클로메타손 디프로피오네이트가 매우 친유성의 코르티코스테로이드이므로, 이것은 점막 흡수와 무시해도 될 정도로 적은 전신흡수의 인지질 세포막 통과를 통한 흡수를 선호하고, 이것은 본 발명의 조합이 유아(infant)에서의 치료적 용도로써 안전하도록 해준다.

다음의 실시예들은 본 발명을 좀 더 상세히 설명해줄 것이다.

실시예

실시예 1- 베클로메타손 디프로피오네이트 존재하에 돼지 폐 추출물의 표면활성의 캐필러리 서팩토미터에 의한 인 비트로 평가

돼지 폐 추출물의 표면 활성(베클로메타손 디프로피오네이트, 2ml, 0.8mg의 존재하에)은 미국, Calmia Medical Inc.에서 상업적으로 이용할 수 있는 캐필러리 서팩토미터(capillary surfactometer)를 가지고 돼지 폐 추출물 단독과 비교하여 평가하였다.

두 개의 샘플을 제조하였다: 인지질에 1mg/ml의 농도로 식염수를 섞은 돼지 폐 추출물 (1.5ml, 80mg/ml) 바이알로부터 하나의 샘플, 베클로메타손 디프로피오네이트 (2ml, 0.8mg)바이알과 돼지 폐 추출물 (1.5ml, 80mg/ml)바이알을 섞어, 동일한 농도 (1mg/ml 인지질)로 식염수를 희석한, 다른 하나의 샘플을 준비하였다. 두 용액의 0.5ml 샘플은 그리고나서 캐필러리 서팩토미터에서 평가하였다.

캐필러리 서팩토미터의 원리는 터미널(terminal) 인체 기도를 시뮬레이션하는 것이다. 샘플은 유리 캐필러리(모세혈관)의 좁은 단면으로 주입되고, 내부 직경은 0.25mm이고, 이것은 터미널 인체 기도와 유사하다. 이 모세혈관의 한쪽 말단은 벨로우(bellow) 및 압력 변환기와 연결되어 있다. 벨로우는 천천히 압축되고, 압력은 올라가고 기록된다. 상승하는 압력은 샘플이 모세혈관의 좁은 단면으로부터 밀려나가도록 한다. 공기가 통과하면, 압력은 갑자기 낮아진다. 샘플이 만약 잘 기능하는 폐 계면활성제를 담고있다면, 샘플 액체는 좁은 단면으로 다시 돌아오지 않을 것이다. 벨로우의 지속적인 압축으로 인해 얻어지는 꾸준한 공기흐름은 어떠한 저항도 받지않고, 압력도 0으로 기록될 것이다. 만약 샘플이 잘 기능하는 폐 계면활성제를 담고있지 않다면, 샘플 액체는 반복하여 돌아올 것이다.

돼지 폐 추출물과 베클로메타손 디프로피오네이트의 결합에 의한 작용은 돼지 폐 추출물 단독과 통계적으로 구별되지 않는 것으로 나타났고, 이것은 상기 도즈에서 베클로메타손 디프로피오네이트는 계면활성제의 표면활성에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 2- 베클로메타손 디프로피오네이트( beclometasone dipropionate )와 조합된 돼지 폐 추출물( poractant alfa )의 인 비보 평가

물질 및 방법

동물 및 기기

모든 동물들은 마사 이웨스(Massa exes)(145일의 임신령)로부터 124±1.7일의 임신령(gestational age)에서 제왕절개에 의해 출산되었다. 태아의 머리와 목의 노출 후, 경동맥 카테터(carotid artery catheter)가 연속적인 혈압 모니터링 및 혈액 샘플링을 위해 삽입되었다. 상기 카테터는 가슴 중간 레벨까지 0으로 맞춰진(referenced) 압력 변환기(pressure transducer)에 연결된다.

정맥 카테터는 유체들(덱스트로스 10%, 100 ml/kg/d) 및 약물의 연속적인 투입을 위해 우측 내경정맥 내에 삽입되고, 기관삽관 튜브(endotracheal tube)는 기관(trachea) 내에 묶여진다. 주사에 의해 쉽게 주입될 수 있는 태아의 폐액이 회복되고, 상기 양(lamb)들이 출산되어 체중이 측정된다(2425±410 그람). 표준 사지 유도(standard limb lead) 심전도(ECG)를 사용한다. 직장(rectal) 온도는 전기식 보온 패드(warming pad)를 사용하는 일반적인 온도 내에서 유지된다.

첫번째 호흡 전에 상기 양들은 무작위로 200 mg/kg의 돼지 폐 추출물(poractant alfa)(Curosurf^？, Chiesi SpA, 파르마, 이탈리아), 이어서 주사에 의해 기도 안으로 주어지는 10 ml의 공기를 받거나, 또는 400 또는 800 ㎍/kg의 베클로메타손 디프로피오네이트(Clenil A^？, Chiesi SpA, 파르마, 이탈리아)와 조합된 200 mg/kg의 상기 동일 계면활성제를 받는다. 무작위 배정은 출산 전 폐쇄 봉투 방법(closed envelope method)을 사용하여 수행되었다.

모든 동물들은 유사한 호흡 전략을 사용하여, 시간 주기 및 압력 제한된 유아(infant) 벤틸레이터(Newport Breeze Ventilator, Soma Technology Inc., Bloomfield, CT, USA)를 가지고 6시간 동안 호흡된다. 60 숨(breath)/분의 비율로, 0.5초의 흡기 시간(inspiratory time), 및 4cm H₂O의 양종말호기압(positive end-expiratory pressure, PEEP)은 변하지 않는다. 최고흡기압(peak inspiratory pressure, PIP)은 35-65 torr의 CO₂ 분압으로 유지하도록 변화하였다. 압력은 기흉을 피하도록 PIP 35 cm H₂O로 제한되었다. 흡기된 산소 분획은 100-150mm Hg의 O₂ 분압 타겟으로 유지하도록 조절된다. 벤틸레이터 셋팅 변화가 본 연구의 결과에 영향을 미칠 가능성을 배제하기 위하여, 벤틸레이터 조절을 담당하는 자는 처리시에 마스크(mask)한다.

혈액 가스, pH 및 염기 과잉(base excess, BE)은 혈액 가스, 전해질 및 대사물 시스템 (Radiometer Copenhagen USA, West Lake, OH)은 최소한 매 30분마다 또는 가슴 움직임과 일호흡용적(tidal volume)에 변화가 나타나는 것으로 벤틸레이터 상태가 변할때에 분석된다.

전체 실험 동안, 혈장증량제 폴리젤린(polygeline) (Emagel^？, Novaselect, Potenza, Italy) 및/또는 도파민, 10-20㎍/kg/min은 30mmHg 이상의 평균 SAP을 유지하는데 필요하도록 투여되었다. 대사성산증(metabolic acidosis) (pH < 7.25 및 BE < 8 mmol/L)은 소듐 바이카보네이트 또는 THAM 투입 (과탄산혈증의 경우: PaCO₂ > 45 mmHg)에 의해 교정된다. 각각의 동물의 pH, pO₂, 및 pCO₂은 전달 후에 그리고, 계면활성제 투여 후 1 (T₁), 2 (T₂), 4 (T₄), 및 6 (T₆) 시간들 후에, 적어도 가능한 빨리 기록되었다.

폐 역학 모니터링. MAP(mean airway pressure), Cdyn (dynamic lung compliance), 호기 일일 용적량 (exhaled tidal volume, TV), 그리고 호기 저항 (Raw)은 신생아 호흡 모니터 (Florian Neonatal Respiration Monitor™ Acutronic, Hirzel, Switzerland)를 통해 측정되고, 그것들의 수치는 베이스라인 T₁, T₂, T₄, and T₆ 에서 기록된다.

폐 산화적 스트레스 어세이. 각각의 그룹에서 동물로부터 기관지 흡입액 샘플을 다음과 같은 방법으로 얻었다: 1 ml/kg 멸균 0.9% 식염수는 기관내 삽관으로 위치한 8F 게이지 피딩 카테터를 통해 10ml 시린지를 사용하여 주입되었고, 그 팁은 튜브의 말단부 2cm 이상 연장된다. 식염수는 주입되었고, 즉시 시린지를 통해 흡입되었다.

회수된 식염수의 평균 용적은 1.5ml이다. 모든 샘플들은 원심분리 (1000 rpm x 5 min)에 의해 정제되고, 상청액은 즉시 -70℃에 얼려, 다음의 분석을 위해 보관되었다. 기관지 흡입액 샘플들은 계면활성제 투여 전에 신생아 머리의 노출 후에, 계면활성제 투여로부터 1 (T₁), 2 (T₂), 4 (T₄), 및 6 (T₆) 시간들에서, 각각의 동물들로부터 회수되었다.

각각의 기관지 흡입액 샘플에서, 총 히드로과산화물 (TH) 농도, AOPP, NPBI는 측정되었다. TH 생산은 스펙트로포토미터 절차를 이용한 d-ROMs 키트 (Diacron srl, 이탈리아)를 가지고 측정하였다.

이 결과는 통상의 유닛으로 표현된다. (Carr 유닛: Carr 유닛 1 수치는 0.08mg/dl 농도의 과산화수소와 같다). AOPP는 마이크로 플레이트 리더기 상에 스팩트로포토미터를 이용하여 Witko-Sarsat et al. (Kidney Int.1996, 49(5): 1304-13)에 의해 측정되었다. AOPP 농도는 μmol/l 클로라민-T 등가물로써 표현된다. NPBI 수준은 Kime et al(Clin Sci(Lond) 1996, 91(5):633-8), 일부 개조됨) 방법을 이용하여 HPLC에 의해 결정된다. 결과들은 nmol/ml로써 표현된다.

조직 제거 및 병리적 시험. 실험의 끝에, 동물들은 과량의 도즈의 펜토바르비탈로써 희생시켰다. 흉부는 조심스럽게 열었고, 기흉의 징조를 체크하고, 조직을 회수하였다. 기관 및 폐는 제거되었고, 완충된 10% 포르말린 배쓰에 넣어두었다. 두개의 무작위(random) 폐 표본들은 폐의 위엽 그리고 아래엽(lobes)으로부터 얻어졌다. 파라핀 임베딩을 위한 조직을 준비하는데에는 통상의 기술이 사용되었다. 5 마이크로미터 두께의 단편은 헤마토자일린-에오신으로 염색하였고, 두 명의 병리학자들은 블라인드 미세현미경 시험을 수행하였다. 터미널 기도 팽창(terminal airway distension)은 대조군과 비슷하다면 0의 점수를 주고, 팽창되면 1 (1-1.5배 사이, 대조군 기도 칼리버), 그리고 매우 팽창되면 (1.5배 이상, 대조군 기도 칼리버) 2이다. 덧붙여, 다음과 같은 조직학적 특징이 분석되었다: 무기폐(atelectasis), 간질성(intestitial) 및 폐포 부종, 염증 침투, 소엽 격막 파열, 그리고 세기관지 상피의 박리(desquamation of bronchiolar epithelium) 영역들. 각각의 병리학적 특징은 존재하면 1로써 평가하고, 없으면 0으로써 평가한다. 폐 손상 점수는, 음성(negative)=0, 경미(slight)=0-1, 보통(moderate)= 2-3, 중증(severe)>4로 점수를 더해가며 매겼다.

통계 분석. 시간 의존적 변화들은 반복되는 수치들의 분산의 한가지 분석(one-way analysis)으로 분석되었다. 서로 다른 그룹들에서 시간-코스 에볼루션(time-course evolution)은 반복되는 수치의 분산의 두가지 분석(two-way analysis) 및 하나의 그룹핑 요소(즉, "시간" 및 "처리")를 이용하여 비교하였다. 다른 처리 그룹들 사이에서 다른 그룹들 내 내부 그룹 비교(intra group comparison)는 paired Student's f-tests로 시험하였다. 결과들은 평균±표준편차로써 표현되었고, p 수치는 < 0.05가 유의미한 것으로 고려되었다.

결과

18마리 동물이 임의 추출되어, 200mg/kg의 천연 계면활성제를 받고(n=6), 200mg/kg의 계면활성제와 400㎍/kg의 베클로메타손 디프로피오네이트 조합을 받고 (n=6), 그리고 200mg/kg의 계면활성제와 800㎍/kg의 베클로메타손 디프로피오네이트 조합을 받았다 (n=6).

가스 교환. 표 1은 연구 그룹들에서 혈액 가스와 pH 변화 분석을 보고한 것이다. 모든 그룹에서, 베이스라인 수치들과 비교하여 T₁, T₂, T₄, and T₆ 에서 현저한 증가가 관찰되었고; pCO₂는 계면활성제 그룹에서는 변하지 않은 반면, 계면활성제와 베클로메타손 디프로피오네이트 조합 그룹에서는 T₁, T₂, T₄, and T₆에서 현저하게 감소되는것으로 나타났고; pO₂는 각각의 시간에 그룹에서 유사하고; BE는 모든 그룹에서 감소되는 경향을 나타냈으나, 통계적 변화는 일시적이고 관련성이 낮다 (poor relevant).

MAP 및 폐 역학. 표 2는 MAP, TV, Cdyn, 및 Raw의 변화를 나타낸 것이다. MAP는 계면활성제와 800㎍/kg의 베클로메타손 디프로피오네이트 조합을 투여한 군에서 T₄, 및 T₆에서 현저하게 감소되는 것으로 나타났고, 다른 그룹에 비해서 낮다; TV 및 Raw는 모든 그룹에서 베이스라인 보다 감소된 반면, Cdyn은 변하지 않았다.

산화 스트레스 어세이. 표 3은 TH, AOPP, 및 NPBI 의 변화를 나타낸다. TH는 400㎍/kg의 베클로메타손 디프로피오네이트와 계면활성제의 조합을 처리한 경우, 계면활성제 단독 처리군 보다 T₆ 에서 TH 수준이 낮고, 800㎍/kg의 베클로메타손 디프로피오네이트와 계면활성제의 조합 처리군은 다른 그룹 보다, T₄ and T₆에서의 TH 수준이 낮다; 모든 그룹들에서 AOPP는 T₁에서 증가하고, 그리고 나서, T₂, T₄, T₆ 에서 감소되었으나, 800㎍/kg의 베클로메타손 디프로피오네이트와 계면활성제의 조합 처리군에서 다른그룹에 비하여, T₆ 에서 수치는 낮다. NPBI는 모든 그룹에서 확인되고, 그 농도는 변하지 않았고, 그룹별로 차이가 많치 않다.

거시-미시적 특징. 전체 검사상에, 800㎍/kg의 베클로메타손 디프로피오네이트와 계면활성제의 조합을 처리한 동물의 폐는 다른 그룹에서보다 더 양호한 호흡을 나타내는 경향을 보인다. 미시적 검사상에, 말초 기도(distal airway)는 400 또는 800㎍/kg의 베클로메타손 디프로피오네이트와 계면활성제의 조합을 처리한 동물군에 비하여, 계면활성제 처리 군에서 더 허탈상태(collapsed)로 되는 것으로 나타난다. 또한, 마크로파지를 포함하는 몇몇 폐포 및 무기폐(atelectasis) 영역 그리고 격막 누출(leakage)이 관찰된다. 전반적인 폐 손상 점수는 계면활성제 단독 그룹 (2.4+0.6) 에서 보다, 계면활성제와 400㎍/kg의 베클로메타손 디프로피오네이트 조합의 그룹에서는 낮고 (1.8+0.7) 그리고, 800㎍/kg의 베클로메타손 디프로피오네이트 조합의 그룹에서도 낮았으나(1.8+0.3), 그 차이는 통계적으로 유의하지(significant) 않다.

논의

이 결과들은 돼지 폐 추출물과 베클로메타손 디프로피오네이트의 조합을 처리하는 것이 호흡 곤란을 겪는 미숙아 양 그룹에서 폐 산화적 스트레스를 감소시키는데 효과적인 것을 입증한다. 사실, 800㎍/kg의 베클로메타손 디프로피오네이트와 계면활성제의 기관내 주입은, 기관지 흡입액 샘플내에서 다른 그룹과 비교하여, T₄ 및 T₆에서의 TH, 그리고 T₆ 에서의 AOPP 수준을 낮춰주고, 400㎍/kg의 베클로메타손 디프로피오네이트와 계면활성제의 기관내 주입은, 계면활성제 단독 처리군과 비교하여 T₆ 에서 TH 수준의 감소를 가져오는 반면, 계면활성제 단독 처리군에서는 산화적 스트레스 마커들의 농도 상에 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과는, 그것이 지질, 펩티드 및 아미노산의 산화적 중간체 생성물인 경우, TH가 전체적인 산화적 스트레스 수치를 나타내는 반면, AOPP의 동시의 측정은 자유 라디칼 반응, 즉, 산화적 성질을 잃은 산화된 단백질에 관련된 단백질의 다른 측면에 관한 정보를 제공하기 때문에 관련성이 있다.

다르게는, NPBI 농도는 연구 그룹들에서 크게 달라지지 않았다. 그러나, 앞서 보고한 바와 같이, NPBI 수치는 산화적 스트레스 가능성의 다른 마커들의 농도 변화와는 관련없을 수 있고, 그 이유는 그것들이 다른 소스들로부터 또한 형성되기 때문이다.

또한, 폐 용압률(lung compliance)이 관련되는 한, 계면활성제 처리 후에 점진적인 TV, Raw의 개선이 나타나고, Cdyn은 변하지 않았다. 그러나, 놀랍게도 800μg/kg 도즈의 베클로메타손 디프로피오네이트는 400mg/kg 도즈의 베클로메타손 디프로피오네이트와 계면활성제 조합 처리군 및 계면활성제 단독 처리군에 비하여, 동일한 수치의 TV를 얻게되는 MAP를 상승적으로 낮춰준다.

그러므로, 800μg/kg 도즈의 베클로메타손 디프로피오네이트의 기관내 효과는 폐 산화적 스트레스의 감소에 제한되지 않고, 폐 역학의 개선, 동물의 호흡 기능 개선에도 일치한다.

다른 결과와 일치하게, 조직학적 검사는 계면활성제와 베클로메타손 디프로피오네이트 조합을 처리한 그룹에서의 형태학상 폐 손상의 감소 경향을 나타내었다.

표 1. 400 μg/kg 또는 800 μg/kg 의 베클로메타손 디프로피오네이트 (BDP)와 계면활성제 조합을 처리한 미숙아 양 집단에서 혈액 가스 변화 분석 결과. 평균 ± 표준편차.

표 2. 계면활성제, 400 μg/kg의 베클로메타손 디프로피오네이트 (BDP)와 계면활성제 조합, 또는 800 μg/kg 의 베클로메타손 디프로피오네이트 (BDP)와 계면활성제 조합을 처리한 미숙아 양 집단에서 폐 역학과 MAP(mean airway pressure)의 변화. 평균 ± 표준편차.

표 3. 계면활성제, 400 μg/kg의 베클로메타손 디프로피오네이트 (BDP)와 계면활성제 조합, 또는 800 μg/kg 의 베클로메타손 디프로피오네이트 (BDP)와 계면활성제 조합을 처리한 미숙아 양 집단에서 TH, AOPP, 및 NPBI의 변화. 평균 ± 표준편차.

Claims (14)

1. 기관지폐형성장애(BPD)의 예방을 위한 용도로, 0.4mg/kg 이상 도즈의 베클로메타손 디프로피오네이트와 조합하는 100과 200mg/kg 사이를 포함하는 도즈의 돼지 폐 추출물(poractant alfa).
2. 기관지폐형성장애(BPD)의 예방을 위한 약제의 제조에 있어서 0.4mg/kg과 동등한 또는 그 이상 도즈의 베클로메타손 디프로피오네이트와 조합하는 100과 200mg/kg 사이를 포함하는 도즈의 돼지 폐 추출물의 용도.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 용도는 폐 산화적 스트레스의 마커들을 낮추는 것을 특징으로 하는 용도.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돼지 폐 추출물의 도즈는 200mg/kg인 것을 특징으로 하는 용도.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도즈는 0.8mg/kg인 것을 특징으로 하는 용도.
6. 기관지폐형성장애(BPD)의 예방을 위한 동시의, 연속적 또는 분리된 용도로써, 0.4mg/kg과 동등한 또는 그 이상인 도즈의 베클로메타손 디프로피오네이트와 100과 200mg/kg 사이를 포함하는 도즈의 돼지 폐 추출물의 조합(combination).
7. 고정된 조합으로써 0.4mg/kg과 동등한 또는 그 이상인 도즈의 베클로메타손 디프로피오네이트와 100과 200mg/kg 사이를 포함하는 도즈의 돼지 폐 추출물을 포함하는 약제.
8. 제7항에 있어서, 상기 돼지 폐 추출물의 도즈는 200mg/kg인 것을 특징으로 하는 약제.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 베클로메타손 디프로피오네이트의 도즈는 0.8mg/kg인 것을 특징으로 하는 약제.
10. 흡입 또는 기관내 투여를 위한 약학적 조성물의 형태인 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 약제.
11. 완충된 생리학적 식염수 (0.9% w/v 소듐 클로라이드) 수용액 내 멸균 현탁액의 형태인 제10항에 따른 약제.
12. a) 제1 유닛 제형 내 100과 200mg/kg 사이로 포함되는 도즈의 돼지 폐 추출물과 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제; b) 제2 유닛 제형 내 0.4mg/kg과 동일하거나 이상인 베클로메타손 디프로피오네이트와 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제; 및 c) 상기 제1 제형 및 제2 제형을 포함하기 위한 용기(container) 수단을 포함하는 키트.
13. 제12항에 있어서, 상기 돼지 폐 추출물의 도즈는 200mg/kg인 것을 특징으로 하는 키트.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 제1 유닛 제형은 완충된 생리학적 식염수 (0.9% w/v 소듐 클로라이드) 수용액으로 현탁되는 80mg/ml 돼지 폐 추출물의 2.5ml의 멸균 제제로 채워진 단일 용도 바이알인 반면, 제2 유닛 제형은 폴리솔베이트 (Tween) 20, 솔비탄 모노라우레이트 및 소듐 클로라이드를 포함하는 수용액으로 현탁되는 0.8ml의 미분화된 베클로메타손 디프로피오네이트의 2ml 멸균 제제로 채워진 단일 용도 바이알인 것을 특징으로 하는 키트.