KR20120021467A - 세로토닌 6 수용체와 Ｇ?ｐｒｏｔｅｉｎ α15가 동시에 안정적으로 발현하는 ＨＥＬＡ 세포주 및 상기 세포주와 칼슘 영상화를 이용하여 세라토닌 6 수용체의 선택적 리간드의 고효율 스크리닝 방법 - Google Patents

세로토닌 6 수용체와 Ｇ?ｐｒｏｔｅｉｎ α15가 동시에 안정적으로 발현하는 ＨＥＬＡ 세포주 및 상기 세포주와 칼슘 영상화를 이용하여 세라토닌 6 수용체의 선택적 리간드의 고효율 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세로토닌 6 수용체 유전자를 영구적으로 형질 감염 시킨 세포주에 G-protein α15 유전자를 영구적으로 형질 전환 시킨 세포주에 관한 것으로서, 본 발명의 세포주는 Myc-5-HT6R 와 G-protein α15 가 안정적으로 발현함으로써, 별도의 유전자 도입 과정 없이도 칼슘 형광 영상화법을 이용한 인간 세로토닌 6 수용체에 특이적인 리간드의 고효율 검색을 가능하게 하는 바, 종래 기술과 비교하여 시간 단축, 경비절감, 실험 결과의 재현성과 신뢰성을 증대시켰다. 따라서 세로토닌 6 수용체에 특이적인 저해제 또는 활성제 개발에 있어 더욱 빠르고 정밀한 결과를 제공하는바, 이와 관련한 우울증과 알츠하이머 등의 뇌질환 및 정신질환 예방과 진단 및 치료제 개발에 활용될 수 있다.

Description

세로토닌 6 수용체와 Ｇ?ｐｒｏｔｅｉｎ α15가 동시에 안정적으로 발현하는 ＨＥＬＡ 세포주 및 상기 세포주와 칼슘 영상화를 이용하여 세라토닌 6 수용체의 선택적 리간드의 고효율 스크리닝 방법{The cell line stably expressing both 5-HT6R and G-protein α15 gene and can be accepted to directly imaging of calucium-fluorescent technique and High-Throughput Screening method of selective ligands by using calcium-imaging}
본 발명은 칼슘 영상화가 직접적으로 가능하도록 제작된, 세로토닌 6 수용체와 G-protein α15 을 영구적으로 동시 발현하는 세포주와 상기 세포주 및 칼슘 영상화기법을 응용하여 세라토닌 6 수용체에 선택적 리간드의 고효율 검색법에 관한 것이다.
인간 5-하이드록시트립타민(이하 세로토닌이라 함) 수용체(5-HTR)는 5-HT1R부터 5-HT7R 외에 그들의 아형까지 포함하여 현재까지 총 15종이 알려져 있으며, 우울증, 정신 분열증, 불안증(anxiety), 수면장애 등의 정신질환 및 알츠하이머 질환 등에 관련되어 있는 것으로 알려져 있다(Martin, Neuropharm , 36(4/5):637-647, 1997). 또한, 스트레스 상황에서 5-HT1R을 과 발현시킨 쥐는 항우울제를 복용한 것처럼 활동적으로 행동한다는 연구 결과가 보고된 바 있다(Heisler et al ., PNAS 95:15049-15054, 1998). 또한, 5-HT1R과 상호작용하여 우울증 유발에 핵심적으로 관여하는 p11 단백질이 우울증과 관련된 뇌의 신경전달물질인 5-HT에 대한 세포의 반응을 조절한다는 사실이 발표되었다(Svenningsson et al ., Science, 311:77-80, 2006).
상기 세로토닌 수용체 중에서도, 5-HT6R은 가장 최근에 염기서열이 밝혀진 5-HTR로서 아직까지 정확한 기전이 밝혀지지 않았으나, 우울증과 알츠하이머 질환과 같은 퇴행성 뇌질환과 정신질환 등에 관련되어 있다고 알려져 있다. 이에 상기 5-HT6R은 우울증 치료제의 작용점으로 연구되고 있을 뿐만 아니라 5-HT6R의 억제제가 알츠하이머 환자의 인지 기능 개선효과를 보여 퇴행성 뇌질환 치료제로의 사용 가능성이 제기되었다. 최근, 5-HT6R의 자극이 생화학적, 행동학적인 면에서 항우울증제와 같은 효과를 보인다는 연구가 보고되었다(Greengard et al., J Neuroscience, 27:4201-4209. 2007). 하지만 모든 5-HTR에 비선택적으로 결합하는 클로자핀(clozapine)과, 5-HT6R에 선택적인 SB258585만이 5-HTR을 작용점으로 하는 약물로 알려졌을 뿐 있으나 아직까지 질환의 치료제로 사용되는 약물은 없고 그 종류 역시 매우 부족한 실정이다. 따라서 5-HT6R과 결합함으로써 퇴행성 뇌질환, 정신질환의 치료제 또는 식욕억제제로서의 효과를 나타내는 물질을 탐색하는 방법이 요구된다.
이와 관련된 종래기술로서 대한민국특허출원 2006-64037에는‘형광 영상화 기법을 이용한 5-HT6R 수용체 리간드 고효율 검색법’이 개시되어 있으나, 매 실험마다 수용체와 칼슘 영상화를 위한 유전자를 일시적으로 도입해야 하는 시스템이기 때문에 반복실험 간 재현성이 떨어지며, 매번 유전자 삽입에 따른 시간, 경제적 비용이 소모된다는 단점이 있었다.
한편, A. Purohit 등((Psychopharmacology, 179:461-469, 2005);(SYNAPSE, 47:218224, 2003))은 5-HT6R을 발현하는 세포주를 개시하고 있으나, 상기 세포주는 햄스터, 원숭이에서 유래한 것으로서 인간 세포에서 보이는 본연의 기능을 제대로 발휘하지 못하는 문제점이 있었다. 또한, 상기 세포주는 발현한 5-HT6R을 탐지할 만한 표지가 전혀 없어 선택적 연구가 불가능한 단점이 있었다. 이와 같은 단점을 보완하는 종래 기술로 세로토닌6 수용체가 안정적으로 발현하는 인간 세포주와 관련한 내용이 개시되어 있으며(특허출원:10-2009-0015404), 초기 시스템에서 발생하는 여러 단점들이 어느 정도 개선되었으나 칼슘 영상화를 위한 G-protein α15 유전자를 매 실험마다 도입 시켜야 하는 과정이 존재했으며, 때문에 실험간 오차와 시간, 경제적인 비용은 여전히 존재하였다.
이에, 본 발명자들은 종래 기술의 기능을 향상시키고자 세로토닌 6 수용체와 G-protein α15 가 동시에 영구적으로 발현하는 세포주를 제작하였다. 그 결과, 본 세포주를 사용 시 매 실험간 오차가 더욱 줄어들었고, 특히 유전자 삽입을 위한 시간, 경제적인 비용을 큰 폭으로 감소시킴으로 종래 기술의 모든 방면에서 효율성을 증대시킴을 확인하였다(도 9 참조). 특히 세로토닌 6 수용체 특이적인 리간드 개발을 위한 고효율 검색법 활용에 있어 편의성과 신뢰성을 향상시켜 종래 기술에 비해 더욱 빠르고 정확한 탐색을 가능케 하는바, 앞으로 5-HT6R 와 관련된 우울증과 알츠하이머 등의 뇌질환 및 정신질환의 예방, 진단 및 치료 또는 식욕 억제에 관련된 약물 개발에 있어 많은 도움을 줄 수 있다.
본 발명의 목적은 종래 기술이 가진 문제점을 해결하고 기능을 향상시키고자 세로토닌 6 수용체(5-HT6R) 유전자와 칼슘 영상화를 위한 G-protein α15 유전자를 영구적으로 도입시켜 두 개의 유전자를 동시에 안정적으로 발현하는 세포주를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포주를 칼슘 영상화 기법을 응용하여 향상된 5-HT6R 특이적인 리간드의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포주를 포함하는 5-HT6R 리간드의 고효율 스크리닝용 키트(kit)를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 N-말단에 Myc이 표지된 5-HT6R 유전자를 포함하는 벡터가 숙주세포에 형질도입되어 Myc-5-HT6R 을 안정적으로 발현하는 세포주를 사용하여 G-protein α15 유전자를 포함하는 벡터를 영구적으로 삽입해 동시에 5-HT6R 유전자와 G-protein α15 유전자를 안정적으로 발현하게 하였다.
또한, 본 발명은
1) 5-HT6R과 G-protein α15를 동시에 안정적으로 발현하는 세포주에 피검 화합물을 처리하는 단계;
2) 상기 처리된 세포주의 칼슘 활성을 측정하는 단계; 및
3) 피검 화합물이 미처리된 세포주와 비교하여, 세포주의 칼슘 활성을 증가시킨 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 5-HT6R 리간드의 고효율 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 5-HT6R 와 G-protein α15 유전자를 동시에 안정 적으로 발현하는 세포주를 포함하는 5-HT6R 리간드의 고효율 검색용 키트를 제공한다.
본 발명의 세포주는 Myc-5-HT6R 과 G-protein α15 유전자가 동시에 안정적으로 발현함으로써, 기존에 개시된 발명품의 단점을 개선하고 그 효율성을 증가시킨 것이다. 이는 별도의 유전자를 도입시키는 과정 필요 없이 세로토닌 자극에 의해 활성화 되는 5-HT6R 의 세포 내 반응을 칼슘 형광법으로 측정할 수가 있기 때문에, 기존에 사용되어 왔던 세포-기반 칼슘 형광 분석 방법을 통한 선택적인 리간드 검색의 정확성과 신속성을 증대시킨 바, 앞으로 5-HT6R 와 관련된 우울증과 알츠하이머 등의 뇌질환 및 정신질환의 예방, 진단 및 치료 또는 식욕 억제 관련 연구에 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 쓰인 유전자인 G-protein α15 를 포함하는 pZEOsv2(+) 벡터의 재조합과정을 도식화한 것이다. 상기 벡터 중 HindIII / BamHI 제한효소 부위 사이에 G-protein α15 유전자가 삽입되어 있다.
도 2는 은 본 발명에 따른 Myc6RG15 세포주에서의 G-protein α15 mRNA 발현을 RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction)을 통해 확인한 사진이다. 상기 사진 중 P는 해당 세포주의 세대(passage)를 의미하고, Myc6R은 기존에 개시된 세포주 Myc6R 을 의미한다. GADPH는 실험 결과를 정량화하기 위한 대조군이다.
도 3a는 본 발명에 따른 Myc6RG15 세포주가 정상적인 세포내 신호전달을 가지는지를 확인한 실험이다. 본 실험은 정해진 시간 동안의 세로토닌(5-HT)자극에 의해 세로토닌 6 수용체의 활성화를 유도하고 이에 따른 ERK 인산화 증가 패턴을 분석함으로써 수행하였다. p-ERK는 ERK 인산화를 나타내는 밴드이고, ERK 는 정량적인 의미로 실험에 수행된 샘플의 양이 동일함을 의미한다.
도 3b는 본 발명에 따른 Myc6RG15 세포주가 정상적인 세포내 신호전달을 가지는지를 확인한 실험이다. 세로토닌 6 수용체에 선택적인 길항제인 SB258585를 사용하여 ERK 인산화 증가 양상은 세로토닌 6 수용체 의존적임을 다시 한 번 확인함으로서 본 발명에 따른 세포주는 기존에 알려진 세로토닌 6 수용체의 세포 내 신호 경로와 동일함을 확인하였다.
도 4a는 본 발명인 Myc6RG15가 활성제인 세로토닌에 의한 자극에 의해 활성화 되어 세포 내 칼슘 변화를 충분히 유발할 수 있음을 보여주는 그림이다. 본 발명의 세포주는 별도의 형질감염 과정을 거치지 않았으며, 대조군으로 기존에 개시된 세포주 Myc6R 과 이것에 일시적으로 G-protein α15 유전자를 형질 도입한 것을 사용하였다. 수용체 활성에 따른 세포 내 칼슘 변화의 측정은 G-protein α15 유전자 의존적임을 의미하며, G-protein α15 가 안정적으로 발현하는 것은 일시적으로 발현시킨 것에 비해 그 반응이 증가된 것을 알 수 있으며 상대적인 차이를 도 4b에 나타냈다.
도 5a는 본 발명인 Myc6RG15가 5-HT6R 특이적인 길항제인 SB258585에 의해 수용체 활성이 완벽히 사라짐을 보여주는 그림이다. 활성제인 세로토닌 자극에 의한 세포 내 칼슘 변화는 5-HT6R 에 의해 수반된 것임을 의미한다.(도 4a참조) 길항제 대신 버퍼를 처리한 대조군에서는 앞서 보인 결과와 마찬가지로 세로토닌 자극에 의해 세포 내 칼슘이 증가하였으며, 상대적인 차이를 도 5b에 나타냈다.
도 6a는 본 발명에 따른 Myc6RG15 세포주가 활성제인 세로토닌(5-HT)을 농도에 따라서 처리하였을 때, 활성 정도의 변화를 나타낸 그림이다. 약 1uM 이상의 농도에서부터 수용체 활성이 최대가 됨을 알 수 있다.
도 6b는 5-HT6R의 길항제인 SB258585 을 농도에 따라서 처리하였을 때, 일정 농도에서의 활성제인 세로토닌(5-HT)에 의한 수용체 활성이 억제되는 정도를 나타낸 그림이다. 약 300nM 이상의 농도에서부터 수용체 활성이 완벽히 사라지는 것을 알 수 있다.
도 7a는 본 발명의 세포주인 Myc6RG15 가 다른 방법의 칼슘-형광 검출법에 응용될 수 있음을 보여주는 그림이다. 도 3,4,5에서 사용된 세포-기반 칼슘 형광 의존 고효율 검색법이 아닌 칼슘 영상화 기법을 사용하여 실험을 진행하였으며, 그림에서 볼 수 있듯이 활성제의 자극에 의한 수용체의 활성이 세포 내부 칼슘 농도를 변화시키고 이를 실시간으로 영상화하여 수치화가 가능 하다는 것을 알 수 있다.
도 7b는 도 7a에서 보여지는 세포 내부 칼슘 농도 증가가 5-HT6R 에 의존적임을 확인한 실험이다. 이를 통해 G-protein α15 유전자를 안정적으로 발현하는 Myc6RG15 세포주는 별도의 형질도입 과정 없이 곧바로 칼슘 농도를 측정할 수 있음을 을 안정적으로 발현하는 HELA 세포주(청색) 및 Myc-5-HT6R을 일시적으로 발현시킨 야생형 HELA 세포주(적색)에서의 5-HT 자극에 따른 세포내 칼슘 양의 변화를 보여주는 그래프이다. 상기 그래프 중 5-HT에 대한 EC50 값은 y/ymax = 1/ 1+(K1 /2/[5-HT]nH) 식을 이용하여 구하였다. 그래프 내의 ymax는 최대 반응을, K1 /2는 EC50 값을, nH는 Hill 상수를 의미한다.
도 8은 본 발명에 따른 Myc6RG15 세포주가 나타내는 반응의 크기와 재현성을 기존에 개시된 Myc6R 세포주와 비교하여 나타낸 그래프이다. S 표기는 Myc-5-HT6R 과 G-protein α15 유전자가 영구적으로 형질도입되어 안정적으로 발현하는 본 발명의 세포주 Myc6RG15 를 나타내며, T 표기는 기존에 개시된 Myc6R 세포주에 G-protein α15 유전자를 일시적으로 형질도입하여 발현시킨 것이다. 같은 조건 하에 실험에도 불구하고 T 실험군은 재현성과 반응성이 S 실험군에 비해서 낮음을 알 수 있으며, 본 발명의 세포주는 기존의 개시된 세포주에 비해 우수함을 의미한다.
도 9는 본 발명에 따른 세포주를 기존에 고효율 검색법(HTS, High Throughput System)에 사용하였을 때, 1회 실험에 소요되는 시간을 기존 세포주와 비교하여 도식화한 것이다. 본 발명의 세포주를 사용하였을 때, 2일정도의 시간을 단축할 수 있다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 정의한다.
용어 "5-HT6R 리간드"는 세로토닌 6 수용체(5-HT6R)에 결합하여 활성 을 조절하는 물질을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 Gs 경로를 특징으로 갖는 GPCR (G-protein coupled receptor) 유전자와 G-protein α15 유전자를 발현하는 벡터가 영구적으로 형질도입 되어 동시에 안정적으로 발현하여 수용체 활성에 따른 세포 내 칼슘 변화를 확인할 수 있는 세포를 제공한다.
본 발명의 GPCR (G-protein coupled receptor) 유전자는 5-HT6R을 암호화하는 유전자일 수 있다.
본 발명은 종래 개시된 기술을 이용하여 칼슘 영상화를 위한 G-protein α15 유전자를 포함하는 벡터가 숙주세포에 영구적으로 도입되어 세로토닌 6 수용체(5-HT6R)뿐만 아니라 G-protein α15 유전자가 동시에 영구적으로 발현하여 칼슘 영상화가 가능하게 세포 내 신호 경로를 조작한 세포주를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 해당 세포주 제작 과정을 모식도로 나타나었다(도 1 참조). 먼저 G-protein α15 유전자( NCBI Reference Sequence : NM _010304.3)를 증폭시켜 zeocin 항생제 내성을 가지고 있는 pZEOsv2(+)벡터에 클로닝 하였다. G-protein α15 유전자를 포함하는 벡터를 종래 개시된 세포주인(KCLRF-BP-00200)에 형질도입 시켰다.
상기 형질도입은 리포펙타민(Lipofectamine), 도진도(Dojindo)사의 힐리맥스(Hilymax), 퓨젠(Fugene), 제트 피이아이(jetPEI), 이펙텐(Effectene) 및 드림펙트(DreamFect)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 상용화된 형질도입용 시약; 칼슘-인산(calcium-phosphate), 양전하성 고분자, 리포좀, 나노입자, 뉴클레오펙션(nucleofection), 전기천공법(electroporation), 열 충격(heat shock), 마그네토펙션(magnetofection)을 이용하는 방법; 및 레트로 바이러스를 이용하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 수행될 수 있다.
이와 같이 유전자를 형질도입하여, G-protein α15 유전자와 Myc-5-HT6R 를 동시에 발현하는 세포를 장기간에 걸쳐 항생제 의존적으로 선별하여 단일 콜로니를 얻어내었다. 상기 선별된 세포주를 여러 세대 동안 배양하여 각 세대별로 유전자의 발현정도를 역전사중합효소-연쇄반응법(RT-PCR)을 통해 검증하였다(도 2 참조).
또한, 본 발명에 따른 세포주에 세로토닌(5-HT)를 시간별로 처리한 후, ERK의 인산화가 증가한 것을 확인함으로써(도 3a 참조), 상기 세포주가 발현한 Myc-5-HT6R이 세포내에서 정상적인 기능을 나타냄을 확인하였다. 또한, 상기 세포주에서 5-HT 자극에 의해 ERK 인산화가 증가하였으며, 5-HT6R의 길항제인 SB258585에 의해 그 효과가 감소하는 것을 확인하였다(도 3b 참조). 이로써 상기 세포주에서 ERK의 인산화가 5-HT4R에 특이적임을 확인하였다.
본 발명의 세포주는 G-protein α15 유전자를 안정적으로 발현하는 세포주 중에서 G-protein α15의 발현량이 높은 세포주를 선별한 것으로, 상기 검증된 세포주는 서울대 의대 세포주 은행에 2010년 7월 7일자로 기탁한, 기탁번호 KCLRF - BP -00237로 기탁 된 Myc-5-HT6R 과 G-protein α15 유전자를 동시에 안정적으로 발현하는 HELA/Myc6RG15 세포주인 것을 특징으로 한다. 서울대 의대 세포주 은행에 2010년 7월 7일자로 기탁하였다.
또한, 본 발명의 세포주는 세로토닌 자극에 의해서 정상적으로 세포 내 신호경로가 활성화되고(도 3 참고), 이것이 세로토닌 6 수용체 의존적으로 나타남을 확인하였다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 Myc-5-HT6R와 G-protein α15를 동시에 안정적으로 발현하는 세포주(Myc6RG15)를 실험군으로 종래 기술에 G-protein α15를 일시적으로 발현시킨 세포주(Myc6R)와 그 세포주 자체를 각각 대조군으로 설정하여 활성제인 세로토닌(5-HT)으로 자극한 후 수용체 활성에 따른 칼슘 활성 정도를 세포 기반 고효율 검색기기 FDSS6000(Hamamatsu Photonics, JP)을 사용하여 칼슘 영상화로 나타내어 분석하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 세포주가 별도의 G-protein α15 유전자 도입 과정을 거치지 않음에도 불구하고 수용체 활성에 따른 세포 내 칼슘 활성을 나타내어 칼슘 영상화 고효율 검색법에 적용될 수 있음을 확인하였다. 반면, G-protein α15 유전자가 도입되지 않은 대조군은 수용체 활성에 따른 세포 내 칼슘 활성을 보이지 않음을 확인하였고(도 4a 참조), 또한, 일시적으로 G-protein α15 유전자를 발현시킨 대조군에 비해 본 발명의 세포주는 수용체 활성에 따른 세포 내 칼슘 활성 정도가 2배가량 더 높음을 확인하였다(도 4b 참조).
수용체 활성에 따른 세포 내 칼슘 활성은 세로토닌 6 수용체(5-HT6R)의 선택적인 길항제인 SB258585에 의해 나타나지 않음을 확인하였고(도 5a 참조), HEPES를 처리한 대조군에서는 활성제인 세로토닌(5-HT)에 의한 수용체 활성이 세포 내 칼슘 활성을 일으킴을 재차 확인하였다. 이로써 앞서 보인 칼슘 활성 증가 패턴은 세로토닌 6 수용체(5-HT6R)에 의존적임을 최종 검증하였다(도 5 참조).
이후, 본 발명에 따른 세포주의 리간드 효율을 측정해본 결과 다음과 같이 나타났다(도 6 참조). 활성제인 세로토닌(5-HT)에 의한 수용체 활성은 농도-의존적인 패턴을 나타내었으며, 기존에 알려진 참고자료와 비슷한 50% 활성효율값(EC50)을 나타내었다(도 6a 참조). 또한 세로토닌 6 수용체(5-HT6R)의 선택적인 길항제인 SB258585에 의한 수용체 활성억제 또한 농도-의존적인 패턴을 보였으며, 활성제와 마찬가지로 여러 참고 문헌과 비슷한 50% 억제효율값(IC50)를 나타내었다(도 6b 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 세포주가 다른 형광 영상화 시스템에 응용될 수 있음을 보였으며(도 7 참조), 앞서 검증한 결과와 마찬가지로 활성제인 세로토닌에 의한 세로토닌 6 수용체 (5-HT6R)활성에 따른 세포 내 칼슘 활성이 나타났고(도 7a 참조), 세로토닌 6 수용체(5-HT6R)의 선택적인 길항제인 SB258585 에 의해 활성제에 의한 수용체 활성이 완벽히 완전히 사라지는 것을 확인함으로써(도 7b 참조), 세포 내 칼슘 활성은 세로토닌 6 수용체(5-HT6R)의존적임을 검증하였다.
또한, 세로토닌 6 수용체(5-HT6R)유전자와 G-protein α15 유전자가 동시에 안정적으로 발현하는 본 발명의 세포주는, 종래 기술에 비해 세포 내 칼슘 활성이 크고 반복 실험간 재현성이 우수한 것을 최종 확인하였다. (도 8 참조).
이에, 본 발명에 따른 세포주는 세포 표면 밖에 위치하는 Myc를 이용하여 5-HT6R의 발현패턴을 선택적으로 확인할 수 있고, 다양한 형광 기반 실험법에 응용될 수 있으며, 특히 수용체의 활성정도를 실시간으로 볼 수 있고 형질감염 과정이 필요없는 것을 특정으로 한다. 또한 5-HT6R 수용체 활성 효율의 재현성과 안정도가 우수한 것을 검증함으로써 5-HT6R 선택적인 리간드 검색에 있어 상당한 이점을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) Gs 경로를 특징으로 갖는 GPCR (G-protein coupled receptor) 유전자와 G-protein α15 유전자를 발현하는 벡터가 영구적으로 형질도입 되어 동시에 안정적으로 발현하여 수용체 활성에 따른 세포 내 칼슘 변화를 확인할 수 있는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 상기 처리된 세포주의 수용체 활성을 측정하는 단계; 및
3) 피검 화합물이 미처리된 세포주와 비교하여, 상기 세포주의 수용체 활성을 증가 또는 감소시킨 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 세포-기반 칼슘 형광 의존적 고효율 스크리닝 방법을 제공한다.
세포주는 5-HT6R 및 G-protein α15을 동시에 발현하는 세포주일 수 있으며, 바람직하게는 기탁번호 KCLRF-BP-00237 인 세포주일 수 있다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법 중 단계 1)의 피검화합물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 단계 3)의 선별된 피검화합물은 우울증 또는 알츠하이머의 치료용도 또는 식욕 억제 용도로 사용되는 것을 특징으로 한다.
한편, 단계 2)의 5-HT6R 활성의 측정은 이에 제한되는 것은 아니나, 5-HT6R에 의한 세포내 칼슘 농도 유입을 측정하는 방법에 의해 수행될 수 있고, 이때 세포내 칼슘 농도 유입이 측정될 대상 세포주는 피검화합물 처리 전에 키메라 Ga15 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터로 형질 감염될 수 있다.
단계 2)의 5-HT6R 활성의 측정은 이에 제한되는 것은 아니나, 5-HT6R에 의해 인산화된 ERK를 측정하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 단계 3)의 선별된 피검화합물은 우울증 또는 알츠하이머의 치료용도 또는 식욕 억제 용도로 사용될 수 있다.
아울러, 본 발명은 Gs 경로를 특징으로 갖는 GPCR (G-protein coupled receptor) 유전자와 G-protein α15 유전자를 발현하는 벡터가 영구적으로 형질도입 되어 동시에 안정적으로 발현하여 수용체 활성에 따른 세포 내 칼슘 변화를 확인할 수 있는 세포주를 포함하는 5-HT6R 리간드의 고효율 스크리닝용 키트를 제공한다.
또한, 상기 키트에는 추가적으로 형광성 칼슘 표지물 및 세척 완충용액을 추가로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 형질전환 세포주 제작
<1-1> Zeocin 항생제 내성 유전자를 포함하는 G- protein α15 발현 벡터의 제조
Institute for Pharmaceutical Biology , Germany 의 Evi Kostenis 박사로부터 얻은 Mus musculus 유래의 G-protein α15 유전자 (NCBI Reference Sequence: NM_010304.3)가 포함되어 있는 벡터(이하 : 벡터A)로부터 Zeocin 항생제 내성 유전자를 포함하는 Mus musculus 유래의 G-protein α15 발현 벡터(이하 : 벡터B)를 제조하기 위해, 우선 A 벡터의 서열 정보를 확인하였다. A 벡터의 확인된 서열정보를 바탕으로 Mus musculus 유래의 G-protein α15 유전자가 BamHI 과 XhoI 제한효소 부위에 포함하도록 프라이머를 제작하여 PCR을 수행하였다. 서열번호 1로 기재되는 정방향 프라이머(5'- GGA TCC ATG GCC CGG TCC CT -3‘) 및 서열번호 2로 기재되는 역방향 프라이머(5‘- CTC GAG TCA CAG CAG GTT GAT C - 3’) 를 사용하여 G-protein α15 유전자를 증폭시켰다. PCR 조건은 95℃에서 5분 동안 예비 변성시킨 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 40초 를 하나의 세트로 30회 반복 수행하고 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시킨 후, 4℃로 반응을 종료하였다. PCR를 통해 얻어진 Mus musculus 유래의 G-protein α15 유전자( NCBI Reference Sequence : NM _010304.3)는, pZEOsv2(+) (Invitrogen, Carlsbad, CA) 벡터와 함께 BamHI 과 XhoI 제한효소로 처리하고 pZEOsv2(+) 벡터의 BamHI 과 XhoI 제한효소 부위에 삽입하여 Zeocin 항생제 내성 유전자를 포함하는 Mus musculus 유래의 G-protein α15 유전자 발현 벡터를 완성하였다(도 1 참조).
상기 벡터를 “pZEO_Gα15”로 명명하였다.
<1-2> Myc -5- HT 6 R 와 G- protein α15 유전자 형질전환 세포주 선별
상기 실시예 1-1에서 제조한 “pZEO_Gα15”벡터를 기존에 개시된 세포주(KCLRF-BP-00200)에 영구적으로 형질 도입하여 Myc6RG15 세포주를 제조하였다.
구체적으로, 기존에 개시된 Myc-5-HT6R 발현 세포주는 10% 태아 소 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신(v/v), 하이그로마이신(400 ㎍/㎖) 을 첨가한 둘베코 개질 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)에서 37℃, 95% 공기와 5% CO2의 가습 조건 하에서 배양하였다. 이후, 상기 세포를 10 cm 배양접시에 4.0 X 106 세포/웰 정도 도포하여 37℃, 가습 조건에서 공기와 CO2가 95:5%(v/v)의 비율로 충전된 배양기에서 성장시켰다. 18시간 후에, G-protein α15 유전자 발현 벡터와 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000, Invitrogen)을 1:3의 비율로(pZEO_α15 24 ㎍, Lipofectamine 72 ㎕) Opti-MEM에 넣어 5분 동안 혼합하고 30분 후, 배양접시에 혼합액을 넣어 세포주를 형질 감염시켰다. 6시간 후에 배지(DMEM, 10% 태아 소 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신(v/v), 하이그로마이신 400 ㎍/㎖)를 교환하고, 24시간 후 같은 배양액에 400 ㎍/㎖ 농도의 제오신(Zeocin, Invitrogen)을 첨가하여 저항성 있는 세포를 선택적으로 배양하였다. 7일간 선택배양한 후 콜로니를 형성한 세포군만을 선별하여 각각 24 웰 플레이트에서 아배양(subculture)하여 성장시키고 7일 후 안정적인 성장을 보인 세포군을 선별하여, G-protein α15 유전자를 포함하는 벡터가 안정적으로 발현하는 세포주를 수득하였다. 안정적인 세포주를 얻은 후 점차적으로 제오신(Zeocin)의 농도를 낮추어서 배양하였다(200 ㎍/㎖). 이후, G-protein α15 유전자가 포함된 벡터를 안정적으로 발현시키는 본 발명의 세포주(Myc6RG15)에 대한 선별을 진행하였다. 배양액은 3-4일에 한 번씩 교환하고, 세포는 매 주일마다 분주(sub-culture)하였다. Myc6RG15 세포주 배양액은 선별 항생제(selective antibiotic)인 하이그로마이신(Hygromycin, 400㎍/㎖)과 제오신(Zeocin, 200㎍/㎖)을 첨가하여 Myc-5-HT6R 과 G-protein α15 유전자를 동시에 발현하는 세포만을 성장시켰다. 한 달간 꾸준하게 선택적 아배양을 통해 안정적으로 성장하는 몇 몇 세포군들을 얻어내었고, 상기 세포군에 대해서 단백질 발현량과 반응성을 비교하여 가장 우수한 세포주를 최종 선별하였다. 제오신(Zeocin) 항생제를 첨가하여, 안정적으로 성장하는 세포군들을 1차적으로 선별하였고, 이 중 유전자 발현량과 세로토닌 자극에 의한 세포 내 반응 정도가 가장 큰 세포주를 2차적으로 최종 선별하였다. 유전자 발현량은 RT-PCR을 통해서 확인하였고, 세로토닌 자극에 의한 세포 내 반응 세기는 세포 기반 칼슘 형광 분석법을 통해서 확인하였다.
상기 세포주를 서울대 의대 세포주 은행에 2010년 7월 7일자로 기탁하여 기탁번호: KCLRF - BP - 00237 를 부여받았다.
<실시예 2> 세로토닌 6 수용체와 과 G- protein α15 유전자의 세포 내 활성 확인
<2-1> G- protein α15 유전자의 안정적인 세포내 발현 여부의 확인
실시예 1-2에서 수득한 세포주(Myc6RG15)를 두 달간 계대 배양하여 1~6 세대 중 6개의 세대(P1 ~ P6)에 대해 G-protein α15 유전자의 mRNA를 추출하여 유전자 발현 정도를 확인하였고, 대조군으로서 기존에 개시된 세포주와 G-protein α15가 들어있는 벡터를 사용하였다(Myc6R, V). 상기 세 개의 세대의 세포를 모아 Easy-BlueTM(Intron) 시약을 사용하여 Phenol-chloroform 추출법으로 Total RNA를 얻었다. 얻어진 Total RNA의 농도를 측정하고 Maxime RT Premix 키트(iNtRON, Korea)에 사용하여 cDNA를 만들었다. 사용되어진 프라이머는 Premix키트 안에 포함되어 있는 Oligo dT primer 이며, 키트 안에 동봉된 한 개의 PCR 튜브 안에 1μg 에 해당하는 볼륨(부피)의 Total RNA를 넣고 DEPC(diethyl pyrocarbonate)가 처리된 정제수로 최종 볼륨(부피) 20ul으로 맞춰주었다. RT조건은 45도에서 1시간 30분 활성단계를 주었고, 70도에서 5분간 비활성단계를 주었으며, 최종적으로 Poly-tail 를 가지는 모든 mRNA에 대한 cDNA를 얻었다.
얻어진 cDNA을 사용하여 PCR을 수행하였다. 서열번호 3으로 기재되는 정방향 프라이머 (5‘- TCA GGG ACC GGG CCA TG - 3')와 서열번호 4로 기재되는 역방향 프라이머(5' - TTG GAC ATG TAT GCG CGC G - 3')를 사용하여 G-protein α15 유전자의 말단 부분을 증폭하였다. 대조군으로서 서열번호 5로 기재되는 정방향 프라이머(5’- CTC TCC AGA ACA TCA TCC CTG - 3‘)와 서열번호 6로 기재되는 역방향 프라이머(5’- CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA - 3‘)를 사용하여 GAPDH 유전자의 말단부위를 증폭하였다.
PCR 조건은 95℃에서 5분 동안 예비 변성시킨 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안 30회 반복 수행하고 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시킨 후, 4℃로 식혀주었다.
그 결과, G-protein α15 의 PCR 산물의 밴드는 본 발명의 세포 주에서 안정적으로 나타남을 확인할 수 있었다(도 2 참조).
<2-2> 세포신호전달 과정을 통한 세로토닌 6 수용체의 세포내 활성 확인
실시예 1-2에서 수득한 세포주를 대상으로 5-HT 자극에 따른 ERK의 인산화 변화를 통하여 최종 선별된 본 발명의 세포주가 정상적인 세포내 기능을 가지는지 확인하기 위해 다음과 같이 실험을 수행하였다. 구체적으로, Myc6RG15 세포주를 6-웰 배양접시에 1 X 106 세포/웰 의 밀도로 세포를 분주한 뒤 37℃, 가습 조건에서 공기와 CO2가 95:5% (v/v)의 비율로 충전된 배양기에서 16시간 동안 성장시켰다. 본 실험에 앞서 혈청이 포함되지 않은 배지로 교환하여 2시간 동안 세포를 안정화한 후, 10 의 세로토닌을 각각 0분, 1분, 5분, 15분, 30분, 60분 동안 넣어주었다. 각 실험군의 세포들은 정해진 시간동안 세로토닌 자극 후 각각 모아서 얼음 위에서 분쇄하였다. 얻어진 샘플을 정량한 뒤, 동량의 단백질을 이용하여 다음의 순서로 웨스턴 블랏(western blot)을 수행하였다. 먼저 10% 폴리아크릴아마이드겔을 사용하여 전기영동한 후 PVDF membrane 에 단백질을 전기이동 시켰다. 전기이동된 membrane 은 1시간 동안 상온에서 5%의 탈지 우유로 블로킹(blocking)하고 1차 항체(primary antibody)(p-ERK, 1:2000)로 4℃에서 밤샘(12~18시간) 처리한 후, 다음 날 TBST(Tris Buffered Saline + 0.1% tween-20)로 10분간 3회 씻어주고 HRP(horseradish peroxidase)가 붙어있는 2차 항체(secondary antibody, 1:10000)를 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 다시 TBST로 10분간 3회 씻어준 후 ECL(Enhanced Chemiluminescence)을 사용하여 필름을 현상하였다.
얻어진 결과에 대한 정확한 정량을 확인하기 위해 membrane을 stripping buffer(THERMO scientific, cat.21059)을 사용하여 리블랏(reblotting)하였다. stripping 버퍼에 30분간 반응시켜 p-ERK항체를 떼어낸 후, TBST에 10분간 3회 씻어주었다. 그 후 ERK 1차 항체(1:2000)를 사용하여 위와 동일한 과정을 거쳐 최종적으로 단백질 밴드의 정량을 확인하였다.
그 결과, 도 3a에서 나타난 바와 같이 본 발명의 세포주는 세로토닌의 자극에 의해 ERK의 인산화(p-ERK)가 증가하며, 자극 후 5분에서 그 반응이 최대임을 알 수 있다. 분석에 사용된 단백질 샘플의 양은 각각 동일함을 확인하였다(ERK). 본 결과는 기존 발명의 세포주에서 보인 결과와 동일하며, 이는 세로토닌(5-HT) 자극에 의한 세포 내 신호전달과정이 정상적으로 작동함을 의미한다.
<2-3> 길항제를 이용한 세로토닌 6 수용체의 세포내 활성 확인
실시예 1-2에서 수득한 세포주를 대상으로 세로토닌 6 수용체의의 길항제인 SB258585를 사용하여 도 3에서 보인 세로토닌(5-HT) 자극에 의한 세포 ERK 인산화 증가 양상이 세로토닌 6 수용체 의존적임을 확인하였다. 구체적으로, Myc6RG15 세포주를 6-웰 배양접시에 1 X 106 세포/웰의 밀도로 분주한 뒤 37℃, 가습 조건에서 공기와 CO2가 95:5% (v/v)의 비율로 충전된 배양기에서 16시간 동안 성정시켰다. 본 실험에 앞서 혈청이 포함되지 않은 배지로 교환하여 2시간 동안 세포를 안정화한 후, SB258585를 5분 동안 처리 하거나 처리하지 않은 후(대조군), 10 세라토닌(5-HT)을 첨가하여 5분간 세라토닌 6 수용체의 활성화를 유도했다. 각각의 약물 처리 후 얻어진 샘플을 웨스턴 블랏(western blot)을 수행하여 분석하였다(실시예 2-2 참고).
그 결과, 도 3a에서 나타난 바와 같이 ERK인산화의 최대치를 나타내는 시간 동안 세로토닌을 처리하였을 때, 도 3b에서 나타난 바와 같이, 세로토닌 6 수용체의 길항제인 SB258585를 처리한 군에서는 ERK의 인산화가 일어나지 않음을 보였으며, 대조군에서는 정상적으로 나타남을 보였다. 따라서 본 발명의 세포주인 Myc6RG15가 보인 세로토닌 자극에 의한 세포내 ERK인산화 증가는 세로토닌 6 수용체에 의존적임을 최종 확인하였다(도 3a 및 도 3b 참조).
<실시예 3> Myc6RG15 세포주의 생리적 활성 측정
<3-1> 세포 처리 조건
본 발명인 Myc6RG15 세포주는 10% 소태아혈청(v/v)이 포함된 DMEM 배지에 1% 페니실린(v/v), 1% 스트렙토마이신(v/v), 하이그로마이신(400㎍/㎖), 제오신(200㎍/㎖)을 첨가하여, 37℃, 5% CO2의 가습 조건에서 배양하였다. 활성 검색 하루 전 상기 세포주는 1% 소태아혈청이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 폴리-L-라이신(0.05 ㎎/㎖)으로 처리된 96-웰 플레이트에 1 × 104 cells/well 의 밀도로 분주하였다. 18시간 후, 세로토닌 자극에 의한 세포 내 칼슘-형광 효율을 측정하였다. 수용체 내재화(internalization)를 억제하기 위해 낮은 농도의 혈청(1% 소태아혈청) 조건을 이용하였으며, 대조군으로 종래 기술의 세포군(Myc6R)을 사용하였다. 형광 의존 활성 검색을 대조군과 비교하기 위해 Myc6R 세포주에 G-protein α15 유전자를 일시적으로 도입하여 발현시키거나, 세포주 자체만을 96-웰 플레이트에 각각 분주하였으며, 총 3구획으로 나누어 동시에 활성 측정을 실시하였다.
<3-2> FDSS6000 이용한 형광 칼슘 측정
세포 기반 HTS 기기 FDSS6000(Hamamatsu Photonics, JP)을 이용하여 형광 칼슘을 측정하였다. 이때, 칼슘 농도에 민감한 플루오-4/AM과 0.001% 플루로닉 F-127(Sigma, USA)을 형광성 칼슘 표지물로 사용하였다. 세포를 480 ㎚에 선택적으로 노출시킨 후, 515 ㎚를 통과하는 방출 형광을 CCD 카메라로 찍었다.
구체적으로, 실험 당일 96-웰 플레이트에 부착된 세포를 HEPES 완충용액(150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 10 mM Glucose, pH 7.4)으로 3회 세척하고 HEPES 완충용액에 녹인 4 μM 플루오-4/AM과 0.001% 플루로닉 F-127로 배양기에서 1시간 반응시킨 다음, HEPES 완충용액으로 다시 2회 세척 한 후, 세포를 480 ㎚에 선택적으로 노출시켰고 515 ㎚를 통과하는 방출 형광을 CCD 카메라로 찍어서 데이터를 얻었다.
<3-3> 5- HT 농도별 자극에 대한 Ca 2 + 반응의 변화
실시예 3-1과 동일한 방법으로, Myc-5-HT6R 과 G-protein α15 유전자를 동시에 안정적으로 발현하는 본 발명의 세포주(Myc6RG15, 청색)와 대조군으로 종래 기술의 세포주에 일시적으로 G-protein α15 유전자를 발현시킨(Myc-5-HT6R + Gα15, 적색)것과 종래 기술의 세포주 자체 (Myc-5-HT6R, 녹색)을 사용하였다(도 4a 참조). 세로토닌에 자극에 의한 5-HT6R 활성을 칼슘 형광 의존 분석법을 통해 확인하였다.
그 결과, 해당 분석을 통해 본 발명인 Myc6RG15 세포주는 별도의 G-protein α15 형질감염 과정 없이도 세포 내 칼슘 형광 분석법에 적용될 수 있음을 검증하였다. 또한, 그 반응 크기 또한 일시적으로 G-protein α15 유전자를 발현시키는 시스템이 비해서 더 증가된 것을 확인하였다. 반응의 크기는 세포 내 칼슘 형광의 변화량을 통해 나타내었다. G-protein α15 유전자가 도입되지 않은 대조군은 세로토닌 자극에 의한 수용체 활성이 세포 내 칼슘 변화를 수반하지 않는 것을 확인하였다(도 4a 및 도 4b 참조).
<3-4> 5- HT 6 R 특이적 길항제(SB258585 )에 대한 억제 효과
실시예 3-1과 동일한 방법으로, 본 발명인 Myc6RG15 세포주를 96-웰 플레이트에 분주하여 준비한 뒤, 길항제에 대한 활성 억제 효과 분석을 실시하였다. 5-HT6R 특이적인 길항제인 SB258585를 처리한 후에 활성제인 세로토닌(5-HT)에 의한 5-HT6R 활성을 실시예 3-2와 동일한 방법으로 측정하였다. 길항제(SB258585, 적색) 또는 히피스 버퍼(HEPES buffer, 청색)를 처리한 후 1분 30초 동안 반응시킨 다음 5-HT 자극을 주었을 때의 반응크기를 비교하여 얼마나 반응이 억제되었는지를 도 5a와 도5b에 나타내었다. 도 5a는 세로토닌 자극에 의한 5-HT6R 활성 정도에 따른 세포내 칼슘 양의 변화를 시간별로 나타낸 그래프이며, 도 5b는 반응의 억제 정도를 칼슘-형광세기 비율 변화정도를(Ratio1-Ratio0) 나타낸 그래프이다.
그 결과, 본 발명 세포주에서 5-HT6R 특이적인 길항제에 의해 활성이 완벽히 억제되어 활성제를 처리하더라도 세포 내 반응이 나타나지 않은데 비해, 히피스버퍼 (HEPES buffer)를 넣어준 음성 대조군에서는 활성제에 의해 세포 내 활성이 나타나는 것을 확인함으로써 상기 세포주의 세포내 칼슘 양의 변화가 5-HT6R 의존적으로 나타나는 것임을 검증하였다(도 5a 및 도 5b 참조)
<3-5> 활성제와 길항제의 농도별 자극에 대한 Myc6RG15 의 활성 정도
실시예 3-1과 동일한 방법으로, 본 발명인 Myc6RG15 세포주를 96-웰 플레이트에 분주하여 준비한 뒤, 활성제와 길항제의 농도 의존적인 활성 정도를 측정하였다. 농도별(10-9~ 10-5 M)로 활성제인 세로토닌(5-HT) 을 각각 처리한 후, 실시예 3-2와 동일한 방법으로 활성을 측정한 뒤, 세포내 칼슘의 변화를 농도-의존성 그래프로 나타내었다. 5-HT에 대한 EC50 값은 y/ymax = 1/1+(K1 /2/[5-HT]nH) 식을 이용하여 구하였으며, ymax는 최대 반응, K1 /2는 EC50 값, nH는 Hill 상수를 나타낸다.
그 결과, 세포내 칼슘의 변화가 5-HT 농도에 의존적이며, 100nM 미만의 미량의 농도에도 충분한 활성이 검출될 수 있음을 확인하였다. 또한 길항제인 SB258585를 위에 언급한 방법과 동일하게 농도별(10-9~ 10-5 M)로 처리한 뒤, 활성제인 세로토닌(5-HT) 에 의한 세포 내 활성의 변화를 측정하였다. 그 결과, 5-HT6R 의 활성이 길항제의 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 6a 및 6b 참조).
<실시예 4> Myc6RG15 세포주를 이용한 다른 칼슘-형광 분석
<4-1> 세포 처리 조건
칼슘 농도에 민감한 퓨라-2/AM(Molecular Probes, USA)과 0.001% 플루로닉 F-127 (Sigma, USA)을 형광성 칼슘 표지물로 사용하였다. 구체적으로, 세포는 실험 전일 폴리-L-라이신(0.025 mg/ml) 으로 처리한 커버글라스 위에 0.25×106 세포 개수의 밀도로 계대하였다. 18시간 후 커버글라스에 부착된 세포를 HEPES 완충용액(150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 10 mM Glucose, pH 7.4)으로 2회 세척한 뒤, HEPES 완충용액에 녹인 5 μM 퓨라-2/AM과 0.001% 플루로닉 F-127을 상온(25 ℃)에서 40분 반응시켰다. HEPES 완충용액으로 다시 2회 세척 한 후, 세포내 에스터레이즈 효소에 의해 분해된 아세토실메틸 그룹을 제거하기 위해 세포를 상온에서 10분간 더 놔두었다. 세포를 역상현미경(Olympus, Japan) 위에 올려놓고 제논 아크 램프에 노출시킨 뒤, 340 과 380 ㎚ 파장을 컴퓨터 제어 필터(Sutter Instruments, USA)를 이용해 선별하였다. 방출 형광광(emitter fluorescence light)은 515 ㎚ 필터를 통과해 냉각 CCD 카메라에 도달하게 하고, 방출된 형광의 비율은 디지털 형광 분석기로 계산하였다. 모든 이미징 데이터는 메타 이미징 소프트웨어(Molecular Devices, USA)를 통해 수집되고 분석되었다.
<4-2> 5- HT 자극에 대한 Ca 2 + 반응의 변화
Myc-5-HT6R 과 G-protein α15 유전자를 동시에 안정적으로 발현하는 본 발명의 세포주 (Myc6RG15, 적색)와 대조군으로 종래 기술의 세포주 (Myc6R, 흑색)을 사용하여 세로토닌 자극에 의한 5-HT6R 활성을 칼슘 형광 의존 분석법을 통해 확인하였다(도7a 참조). 그 결과, 본 발명인 Myc6RG15 세포주는 별도의 G-protein α15 형질감염 과정 없이도 세포 내 칼슘 형광 분석법에 적용될 수 있음을 검증하였으며, 반응의 크기는 세포 내 칼슘 형광의 변화량을 통해 나타내었다. G-protein α15 유전자가 도입되지 않은 대조군은 세로토닌 자극에 의한 수용체 활성이 세포 내 칼슘 변화를 수반하지 않는 것을 확인하였다(도 7a 참조).
<4-3> 5- HT 6 R 특이적 길항제(SB258585 )에 대한 억제 효과
5-HT6R 특이적인 길항제인 SB258585 를 처리한 후에 활성제인 세로토닌 자극에 의한 5-HT6R 활성을 실시예 4-2 와 동일한 방법으로 측정하였다. 길항제(SB258585, 적색) 또는 히피스 버퍼(HEPES buffer, 흑색)를 1 분간 전 처리한 후 세로토닌 자극을 주었을 때의 반응크기를 비교하여 5-HT6R 활성 여부를 확인하였다.
그 결과, 본 발명의 세포주는 5-HT6R 특이적인 길항제인 SB258585에 의해 활성이 완벽히 억제되어 활성제인 세로토닌을 처리하더라도 세포 내 칼슘 반응이 나타나지 않은데 비해, 히피스버퍼(HEPES buffer)를 흘려준 음성 대조군에서는 활성제에 의해 세포 내 칼슘 반응이 나타나는 것을 확인함으로써 상기 세포주의 세포내 칼슘 양의 변화가 5-HT6R 의존적으로 나타나는 것임을 검증하였다(도 7b 참조).
<실시예 5> Myc -5- HT 6 R 을 안정적으로 발현하는 세포주의 확인
실시예 3-1, 3-2 과 동일한 방법으로, 여러 번의 반복 실험 결과 본 발명인 Myc6RG15 세포주와 종래 기술인 Myc6R 에 일시적으로 G-protein α15 유전자를 발현시킨 세포주간 활성 정도를 비교하였다.
그 결과, Myc-5-HT6R 과 G-protein α15 유전자를 동시에 안정적으로 발현하는 본 발명의 세포주(S1~3)의 경우에는 활성 정도도 크며, 재현성도 매우 우수한 반면, 대조군으로 종래 기술의 세포주에 일시적으로 G-protein α15 유전자를 발현시킨(T1~3)것은 활성 정도가 상대적으로 작으며, 그 차이도 본 발명에 비해 재현성이 떨어짐을 확인하였다(도 8 참조).
본 발명의 세포주는 리간드에 의한 수용체 활성시 세포 내 칼슘 변화를 수반하게끔 세포 신호 경로를 조작한 것으로, 별도의 유전자 도입과정 없이 직접적인 칼슘-영상화 기법을 적용할 수 있기 때문에 실험에 필요한 시간을 단축시키고 반복 실험간 재현성이 뛰어나다는 장점이 있다. 위에 제시된 영구적인 신호 경로 조작 세포주는 세로토닌 6 수용체뿐만 아니라 같은 신호 경로를 갖는 많은 수용체에 광범위하게 적용할 수 있으며, 이에 비슷한 신호 경로를 갖는 수용체를 타겟으로 하는 제약회사 및 병원, 학교 등에서 수행되는 각종 선택적인 리간드 검색 연구의 있어 큰 효율성과 편의성을 제공할 수 있다. 특히 제약관련업에 있어 세로토닌 6 수용체와 같은 GPCR을 타겟으로 하는 신약 발굴 사업이 전체 신약 개발의 40% 정도에 해당하는 사실로 미루어 볼 때, 본 발명과 응용은 잠재적인 상업적 가치가 크다고 볼 수 있다.
한국세포주연구재단 KCLRFBP00237 20100707

Claims (15)

  1. Gs 경로를 특징으로 갖는 GPCR (G-protein coupled receptor) 유전자와 G-protein α15 유전자를 발현하는 벡터가 형질도입 되어 상기 유전자들을 동시에 발현하는 세포주.
  2. 제 1항에 있어서, GPCR (G-protein coupled receptor) 유전자는 5-HT6R(5-hydroxytryptamine 6 receptor)인 것을 특징으로 하는 세포주.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 세포주는 기탁번호 KCLRF - BP - 00237 로 기탁 된 것을 특징으로 하는 세포주.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 형질도입은 리포펙타민(Lipofectamine), 도진도(Dojindo)사의 힐리맥스(Hilymax), 퓨젠(Fugene), 제트 피이아이(jetPEI), 이펙텐(Effectene) 및 드림펙트(DreamFect)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 상용화된 형질도입용 시약; 칼슘-인산(calcium-phosphate), 양전하성 고분자, 리포좀, 나노입자, 뉴클레오펙션(nucleofection), 전기 천공법(electroporation), 열 충격(heat shock), 마그네토펙션(magnetofection)을 이용하는 방법; 및 레트로 바이러스를 이용하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 세포주.
  5. 1) 제 1항의 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
    2) 상기 처리된 세포주의 수용체 활성을 측정하는 단계; 및
    3) 피검 화합물이 미처리된 세포주와 비교하여, 상기 세포주의 수용체 활성을 증가 또는 감소시킨 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 GPCR 특이적 리간드 스크리닝 방법.
  6. 제 5항에 있어서, GPCR은 세포토닌 6 수용체인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 세포주는 기탁번호 KCLRF - BP - 00237 로 기탁 된 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  8. 제 5항에 있어서, 단계 1)의 피검화합물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  9. 제 5항에 있어서, 수용체 활성 측정은 해당 리간드에 의한 세포내 칼슘 농도 변화를 측정하는 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 칼슘 농도 변화는 칼슘-형광법을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  11. 제 5항에 있어서, 상기 형질도입은 리포펙타민(Lipofectamine), 도진도(Dojindo)사의 힐리맥스(Hilymax), 퓨젠(Fugene), 제트 피이아이(jetPEI), 이펙텐(Effectene) 및 드림펙트(DreamFect)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 상용화된 형질도입용 시약; 칼슘-인산(calcium-phosphate), 양전하성 고분자, 리포좀, 나노입자, 뉴클레오펙션(nucleofection), 전기천공법(electroporation), 열 충격(heat shock), 마그네토펙션(magnetofection)을 이용하는 방법; 및, 레트로 바이러스를 이용하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 세포주.
  12. 제 1항의 세포주를 포함하는 GPCR 특이적인 리간드 스크리닝용 키트.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 세포주는 5-HT6R과 G-protein α15 을 동시에 발현하는 것을 특징으로 하는 스크리닝용 키트.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 세포주는 기탁번호 KCLRF - BP - 00237 로 기탁 된 것을 특징으로 하는 스크리닝용 키트.
  15. 제 12항에 있어서, 상기 키트는 추가적으로 형광성 칼슘 표지물 및 세척 완충용액을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝용 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103614382A (zh) * 2013-10-28 2014-03-05 浙江大学 菜青虫5-羟色胺受体基因Pr5-HT8及其应用

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