KR20120016581A

KR20120016581A - Methods for preparing powder chlorophyll a and photosensitizer from spirulina

Info

Publication number: KR20120016581A
Application number: KR1020110078295A
Authority: KR
Inventors: 박계신; 이은희; 김효준; 류정림; 김한나
Original assignee: 다이아텍코리아 주식회사
Priority date: 2011-08-05
Filing date: 2011-08-05
Publication date: 2012-02-24
Also published as: KR101138437B1

Abstract

PURPOSE: A method for preparing chlorophyll a from spirurina is provided to quickly obtain gamma-(6-amino hexyl)folic acid-chlorine e6. CONSTITUTION: A method for preapring chlorine e6-glucamine of chemical formula 5 comprises: a step of treating a chlorophyll a acetone solution of chemical formula 1 with strong base to obtain water soluble chlorophyll a derivatives of chemical formula 2; a step of treating strong acid to prepare water soluble chlorophyll a derivatives of chemical formula 2; a step of treating strong acid to the water soluble chlorophyll derivatives to prepare acid chlorine e6 of chemical formula 3; and a step of treating N-methyl-d-glucamine.

Description

Methods for Preparing Chlorophyll a and Photosensitizer from Spirulina

본 발명은 스피루리나로부터 클로로필 a 및 클로로필 a로부터 수득되는 일군의 광민감제들의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a process for the preparation of a group of photosensitive agents obtained from chlorophyll a and chlorophyll a from spirulina.

스피루리나(Spirulina)는 아프리카의 챠드 호수 및 멕시코의 텍스코코 호수와 같은 열대지역 알칼리성 호수의 수면에서 왕성하게 자생하는 극히 작은 조류(藻類 algae)에 속하는 미생물이다. 그 세포 속에는 다량의 클로로필과 피코시아닌이 들어있어서 태양광선을 흡수하여 탄소동화작용을 활발하게 수행하여 자라고 있다. 이러한 색소들이 들어있어서 청남색을 띠고 있으므로 옛날부터 남조류(blue-green algae)로 분류했었다. Spirulina (Spirulina) is a microorganism belonging to a very small bird (藻類algae), which grows vigorously in the waters of the tropics alkaline lakes such as Lake Chad and Lake Texcoco, Mexico, West Africa. The cells contain a large amount of chlorophyll and phycocyanin, which are absorbed by the sun's rays, and are actively growing by carbon assimilation. Since these pigments have a blue-green color, they have been classified as blue-green algae since ancient times.

스피루리나(Spirulina)라는 이름은 그 모양이 나선형(Spiral)이어서 붙여졌으며, DNA가 2중 나선형인 점을 고려할 때 그 형태가 원시적인 것이다. 전자현미경의 발달로 미생물의 세포구조가 자세히 밝혀지면서 녹조류나 갈조류의 구조는 고등 식물의 구조와 다른 점을 발견하였다. 즉 녹조류의 구조는 고등식물의 구조와 동일하게 진핵세포(eukaryote)구조를 가지고 있는 반면에, 남조류는 세균의 구조와 비슷한 원핵세포(prokaryote)구조를 가진 것이 밝혀짐에 따라, 1960년대 초부터 일부 미생물학자들이 남조류는 조류보다는 세균에 가까우므로, 세균류에 포함시켜야 한다는 주장이 나오게 되었다. 현재는 이 주장을 받아들여 청 남색 균류(blue-green bacteria)로 분류하고 있다. 그러나 산업계에서는 옛날 관행대로 미세조류(微細藻類 micro-algae)라 부르고 있다. The name Spirulina was given because it had a spiral shape, and the form is primitive given the fact that DNA is a double helix. With the development of electron microscopy, the cell structure of microorganisms has been elucidated, and the structure of green algae and brown algae has been found to be different from those of higher plants. In other words, green algae have the same eukaryote structure as those of higher plants, while cyanobacteria have a prokaryote structure similar to that of bacteria. Microbiologists have argued that cyanobacteria are closer to bacteria than algae, so they should be included in bacteria. It is now accepted and classified as a blue-green bacterium. However, the industry has called the microalgae the old practice.

클로로필(엽록소, 葉綠素, chlorophyll)은 광합성을 하는 생물이 가지는 동화색소의 일종이다. 4개의 피롤이 메틴기 －CH＝에 의해 결합된 고리모양 테트라피롤에 시클로펜탄고리가 연결된 포르빈의 유도체인데, 테트라피톨 고리의 중앙에 Mg원자가 1개 배위하고 피롤고리 Ⅳ의 프로피오닐기에 피롤 또는 파르네솔이 에스테르 결합한 것이다. 클로로필은 헤모글로빈의 분자구조와 거의 일치하는 것으로 확인되어,푸른혈액이라고도 불리며, 실제로 동물의 혈액과 놀랍도록 비슷한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 특히, 클로로필은 항암, 항염작용을 하며, 손상된 세포를 재생시키고, 해독작용, 항콜레스테롤 작용에 이르기까지 매우 다양한 작용을 한다.Chlorophyll (chlorophyll, 葉綠素, chlorophyll) is a kind of assimilation pigments of photosynthetic organisms. Four pyrroles are derivatives of forbin in which a cyclopentane ring is linked to a cyclic tetrapyrrole bound by a methine group -CH =, in which a Mg atom is coordinated in the center of the tetrapytol ring and pyrrole IV is a pyrrole group; Farnesol is an ester bond. Chlorophyll has been found to closely match the molecular structure of hemoglobin, also called blue blood, and is known to perform surprisingly similar functions to animal blood. In particular, chlorophyll is anti-cancer, anti-inflammatory action, regenerate damaged cells, detoxification, anti-cholesterol action and a wide variety of functions.

악성종양에 대한 광역학치료법(이하 PDT)은 현재 광범위하게 임상에 적용되고 있다. PDT의 효율성을 규정하는 중요한 요소 중의 하나는 표적성(Targeting) 또는 선택성(selectivity)으로서 종양조직과 정상조직에 있어 종양조직에만 광민감제를 선택적으로 축적시키는 정도를 나타낸다. 표적성이 높으면 PDT의 효과성이 높아져 치료시간을 단축시킬 수 있으며, 또한 체내에 주입된 약물의 부작용도 줄일 수 있게 된다. 특정 파장을 지닌 빛으로 광민감제를 활성화시키면 활성산소종의 일종인 일중항산소(singlet oxygen)와 라디칼 종(radical species)을 발생시키게 되는데, 이를 통해 직접적으로 종양세포를 죽이게 되며, 면역염증반응을 일으키고 또한 종양의 미소혈관계에 손상을 입히게 된다. 종래 광민감제들의 대부분이 종양에 선택적으로 축적이 되었지만, 피부를 포함한 정상조직에도 일부분 축적이 된 것으로 나타났다.
Photodynamic therapy for malignant tumors (PDT) is now widely applied in the clinic. One of the important factors that define the efficiency of PDT is targeting or selectivity, indicating the extent of selective accumulation of photosensitizers only in tumor tissues in tumor tissues and normal tissues. Higher targeting can increase the effectiveness of PDT, shorten the treatment time, and reduce the side effects of drugs injected into the body. Activating the photosensitizer with light with a specific wavelength generates singlet oxygen and radical species, which is a kind of reactive oxygen species, which directly kills tumor cells and triggers an immunoinflammatory reaction. And damage the tumor microvascular system. Most of the conventional photosensitizers have been selectively accumulated in tumors, but have been partially accumulated in normal tissues including skin.

광민감제의 표적화 전달은 이러한 문제들을 해결할 수 있을 것이다. 이는 종양세포에 대한 선택적 축적정도를 개선시켜 광독성을 강화함으로써 가능할 수 있다. 표적화란 광활성화 물질을 종양추적(특정적)분자와 직접적으로 또는 캐리어를 이용해서 결합시키는 것을 의미한다. 이미 몇 가지 광민감제들이 종양-관련 항원(antigen)에 대한 항체와 결합된 바 있다. 저밀도 지단백(lipoprotein), 인슐린, 스테로이드, 트랜스페린, 상피세포성장인자(EGF)와 같은 리간드들 모두가, 이러한 리간드의 수용체를 과발현하는 세포로의 리간드-기반 광민감제의 표적화를 위하여 논의되어왔다. 사실, 병변세포에서는 수용체 발현의 변화, 특정 세포 표면막 지질과 단백질의 농도 증가뿐만 아니라 세포적 미세환경(cellular microenvironment)의 변화 등이 모두 일어난다.
Targeted delivery of photosensitizers may solve these problems. This may be possible by enhancing phototoxicity by improving the degree of selective accumulation of tumor cells. Targeting means binding the photoactivating material directly to a tumor tracking (specific) molecule or using a carrier. Several photosensitizers have already been combined with antibodies to tumor-associated antigens. Ligands such as low density lipoproteins, insulin, steroids, transferrins, epidermal growth factor (EGF), all have been discussed for the targeting of ligand-based photosensitizers to cells that overexpress receptors of these ligands. In fact, in lesion cells, changes in receptor expression, increased concentrations of certain cell surface lipids and proteins, as well as changes in cellular microenvironment occur.

수용체 매개전달(receptor mediated delivery)을 이용한 여러 전달전략 중에서, 하기와 같은 이유로 엽산수용체 또한 종양특이적 약물 전달을 위한 유용한 타겟이 된다.Among several delivery strategies using receptor mediated delivery, folic acid receptors are also useful targets for tumor specific drug delivery for the following reasons.

첫째, 엽산수용체들은 난소 암, 결장, 유선(mamma gland), 폐, 신장-세포성 암, 상피 종양의 뇌로의 전이 및 신경 내분비 암에서 종양세포 상에서 발현된다.First, folic acid receptors are expressed on tumor cells in ovarian cancer, colon, mamma gland, lung, kidney-cell cancer, epithelial tumor metastasis to the brain and neuroendocrine cancer.

둘째, 정상 조직에서 엽산 수용체의 발현은 상피세포의 첨단막(apical membrane) 상의 위치로 인해 발현이 심각하게 제한되어있어 정상조식에서의 엽산 수용체에 대한 접근은 거의 일어나지 않는다. Second, the expression of folic acid receptors in normal tissues is severely restricted due to their position on the apical membrane of epithelial cells, so that access to folic acid receptors in normal breakfast rarely occurs.

셋째, 극성화된 상피세포 : 엽산수용체의 밀도가 증가한다(극성화된 상피세포 : 암이 악화된 정도에 따른 엽산수용체의 밀도 증가).Third, the polarized epithelial cells: folate receptor density is increased (polarized epithelial cells: folate receptor density increases according to the degree of cancer deterioration).

넷째, 엽산이 그것의 세포표면상 수용체와 높은 친화성을 나타낸다. 엽산과 거대분자의 결합은 거의 모든 테스트된 상태에서 시험관 내 엽산수용체-발현 암세포로의 이들의 전달을 개선시킬 수 있다.Fourth, folic acid shows high affinity with its cell surface receptors. The binding of folic acid and macromolecules can improve their delivery to folate receptor-expressing cancer cells in vitro in almost all tested conditions.

엽산수용체는 엽산과 결합하여 수용체-매개의 엔도시토시스를 통해 세포 내부로 이를 흡수하는, 수반성(adjoint) 글리코실 포스파티딜 이노시톨 당단백질이다. 비록 엽산수용체에 의한 세포 내로의 엽산 전달에 대한 정확한 작용기전이 확립되어 있지는 않지만, 엽산결합물들이 수용체-매개의 엔도시토시스를 통해 포유류 세포에 파괴되지 않은 채 축적된다는 것은 분명하다. 생리적인 엽산은 특수화된 엔도시토시스 매개 경로를 통해 원형질막을 통과해서 세포질 안으로 이동한다. 암 세포 표면상의 엽산수용체와 결합한 후, 크기에 관계없이 엽산결합물들은 엔도솜이라 불리는 세포내 성분으로 흡수되는 것으로 보여진다.Folic acid receptors are adjoint glycosyl phosphatidyl inositol glycoproteins that bind folate and absorb it into cells through receptor-mediated endocytosis. Although no precise mechanism of action for folate delivery into cells by folate receptors is established, it is clear that folates accumulate in mammalian cells through receptor-mediated endocytosis. Physiological folic acid travels through the plasma membrane through specialized endocytosis mediated pathways and into the cytoplasm. After binding to folate receptors on the surface of cancer cells, folate bonds, regardless of size, have been shown to be absorbed into intracellular components called endosomes.

일반적으로 이러한 선택성 또는 표적성의 정도는 10:1(암세포:정상세포)의 비율을 넘지 못하고 있다. 이에 항체, 올리고당, 트랜스페린, 호르몬 유사체 등과 같은 세포 표면에 특징적인 벡터 리간드와의 결합을 통해 특정 세포군의 막 수용체에 광민감제를 선택적으로 전달하는 방법이 개발되고 있다. 많은 연구결과들이 화학요법에 쓰이는 약물이 이러한 벡터와 결합되면 그렇지 않은 경우보다 변형된 세포에 5-10배 정도 더 많이 운반되고 있음을 보여주고 있다. 그 세포들은 파괴됨이 없이 수용체-매개 엔도시토시스를 통해서 결합물을 바인드할 수 있다.Generally, the degree of selectivity or target does not exceed the ratio of 10: 1 (cancer cells: normal cells). Accordingly, a method of selectively delivering a photosensitive agent to membrane receptors of a specific cell population has been developed through binding with a vector ligand characteristic to a cell surface such as antibodies, oligosaccharides, transferrins, hormone analogs, and the like. Many studies have shown that drugs used in chemotherapy, when combined with these vectors, are transported five to ten times more in modified cells than otherwise. The cells can bind the binding through receptor-mediated endocytosis without disruption.

수용체-매개 엔도시토시스로 이용 가능한 엽산은 세 개의 구성부분으로 이루어져 있으며, 비타민그룹에 속한다. 살아있는 유기물은 주로 다이하이드로폴산(dihydrofolic acid), 데트라하이드로폴산(tetrahydrofolic acid), 5-메틸-테트라하이드로폴산(5-methyl-tetrahydrofolic acid)과 같은 엽산형태로 환원하는데, 이들은 단일 탄소 단편 운반 반응을 촉매하는 효소의 보조인자(cofactor)이다. 엽산 의존적 효소들은 퓨린과 피리미딘 뉴클레오티드의 생합성과, 메티오닌, 히스티딘, 세린 및 글리신의 아미노산의 대사에 참여한다. 이 때문에 엽산은 세포분열과 성장에 반드시 필요한 성분이다. 엽산은 생체 내에 들어간 후에 혈액에 흡수되며 플라즈마와 적혈구와 함께 조직으로 운반된다. 동물세포는 엽산을 합성할 수 없기 때문에 원형질막에 있어 엽산을 바인드하고 흡수하는 특별한 시스템의 존재가 사실상 요구된다.Folic acid, available for receptor-mediated endocytosis, consists of three components and belongs to the vitamin group. Living organics are mainly reduced to folates such as dihydrofolic acid, tetrahydrofolic acid, and 5-methyl-tetrahydrofolic acid, which are single carbon fragment transport reactions. It is a cofactor of the enzyme that catalyzes. Folic acid dependent enzymes participate in the biosynthesis of purine and pyrimidine nucleotides and the metabolism of amino acids of methionine, histidine, serine and glycine. Because of this, folic acid is an essential ingredient for cell division and growth. Folic acid is absorbed into the blood after it enters the living body and transported to the tissue along with plasma and red blood cells. Since animal cells are unable to synthesize folic acid, there is in fact a need for a special system in the plasma membrane that binds and absorbs folic acid.

엽산은 뚜렷한 친수성 특이적인 특징을 나타내는 이가 음이온(dianion)으로, 단순한 확산으로는 세포의 원형질막을 통해서 통과하기 어렵다. 단지 높은 약리학적 농도에서만 수동적인 확산으로 엽산 운반을 할 수 있다. 자연적 생리학 조건에서 엽산은 조직과 혈청 내에서 나노몰 농도로 발견되는데, 이것이 이러한 비타민을 흡수하고 운반하는 세포가 고도로 효과적인 특이한 막 시스템을 가지게 되는 이유이다.Folic acid is a divalent anion that has distinct hydrophilic specific characteristics, and it is difficult to pass through the plasma membrane of cells by simple diffusion. Only at high pharmacological concentrations can folic acid be transported by passive diffusion. Under natural physiological conditions, folic acid is found in nanomolar concentrations in tissues and serum, which is why cells that absorb and transport these vitamins have a highly effective specific membrane system.

높은 속도로 엽산 운반을 촉진하는 이동성 담체가 있다. 혈액으로의 엽산흡수가 일어나는 소장의 상피세포에 많이 존재한다. 촉매 운반은 다양한 세포에서 엽산 흡수의 주된 경로이다. 그러한 운반의 기질(substrate)은 복원된 형태의 엽산으로, 이는 상기 담체가 TRV(transporter of restored vectors)로 불리는 이유이다. 이는 46 kD의 크기를 가지는 당단백질로 세포 원형질막 내에서 친수성 분자의 막을 통해서 생기는 "채널(channel)"을 형성한다. TRV 매개 운반의 동역학은 마이클리스-멘텐식(Michaelis-Menten equation)에 의존적인 것으로 설명된다. 작용하는 속도는 다소 높으며, 엽산과의 유사성은 대략 200 μM로 상대적으로 낮다.There are mobile carriers that promote folic acid transport at high rates. It is present in the epithelial cells of the small intestine where folate absorption into the blood occurs. Catalytic transport is the main route of folic acid uptake in various cells. The substrate of such transport is folic acid in the restored form, which is why the carrier is called a transporter of restored vectors (TRV). It is a 46-kD glycoprotein that forms a "channel" in the plasma membrane of the cell through the membrane of hydrophilic molecules. The kinetics of TRV mediated transport is explained as being dependent on the Michaelis-Menten equation. The rate of action is rather high and the similarity with folic acid is relatively low, approximately 200 μM.

TRV는 종양세포에서도 작용한다. 복원된 엽산의 결합력 KM은 1-4 μM 이내이다. 담체의 메토트렉세이트와의 유사성은 4-8 μM 이내에서 약간 더 낮은 KM이고, 그것의 운반 최대 속도는 세포 단백질 그램당 1-12 nmol/min 이내이다. TRV는 엽산의 막을 통한 운반을 수행할 수 있지만, 주어진 산소처리된 엽산에 대한 그것의 유사성은 낮다 (KM은 100-200 μM 이내이다).TRV also works in tumor cells. The binding force KM of the restored folate is within 1-4 μM. The similarity of the carrier with methotrexate is slightly lower KM within 4-8 μM and its maximum transport rate is within 1-12 nmol / min per gram of cellular protein. TRV can perform transport through the membrane of folic acid, but its similarity to a given oxygenated folic acid is low (KM is within 100-200 μM).

엽산의 세포내 이동은 엽산수용체라고 불리는 막 당단백질을 통해 작용하는 수용체-매개의 시스템이 있다. 엽산수용체는 엽산에 대한 결합상수가 1 nM 미만이라는 점에서 기질과 매우 유사하다는 특징을 가지고 있다. 엽산의 수용체 매개 운반은 한 방향 즉 세포 내부쪽으로만 수행된다. 정상조직의 세포들은 약간의 예외를 제외하고는 매우 적은 양의 엽산수용체만을 그 표면 상에서 발현한다. 그러나, 악성으로 형질변환된 세포들, 특히 폐, 신장, 뇌, 대장, 난소에서의 종양 세포와 백혈병에서의 골수 혈액 세포에서는 엽산에 대한 수용체의 양이 그들의 표면 상에서 증가하게 된다. 이러한 엽산수용체의 양적인 증가로 인해 엽산을 현저한 양(세포당 6107 분자 이상)으로 보다 효과적으로 바인딩할 수 있게 된다. 암세포의 진단에 사용되는 단일클론항체가 엽산과 매우 특이적으로 결합하는 것으로 나타나는 한, 이러한 당단백질은 종양 마커로서 언급되어질 수 있다.Intracellular transport of folic acid is a receptor-mediated system that acts through membrane glycoproteins called folate receptors. Folic acid receptors are very similar to substrates in that the binding constant for folic acid is less than 1 nM. Receptor-mediated transport of folic acid is carried out only in one direction, ie inside the cell. Normal tissue cells express very small amounts of folic acid receptors on their surface with a few exceptions. However, in malignantly transformed cells, particularly tumor cells in the lungs, kidneys, brain, colon, ovaries and bone marrow blood cells in leukemia, the amount of receptors for folic acid increases on their surface. This quantitative increase in folate receptors allows for more efficient binding of folic acid in significant amounts (more than 6107 molecules per cell). Such glycoproteins may be referred to as tumor markers, as long as the monoclonal antibodies used for the diagnosis of cancer cells appear to bind very specifically with folic acid.

엽산의 수용체 매개 운반은 엔도시토시스 메커니즘을 통해서 수행된다. 수용체는 재순환 메커니즘(recirculatory mechanism)을 통해서 작동한다. 즉, 리간드가 분자를 결합하고 방출하면서, 반복적으로 원형질막으로부터 엔도솜으로 그리고 그 반대로 가로질러 통과한다. 그러한 기능의 효율성은 다음과 같은 다양한 요소들에 의해 규정된다: Receptor-mediated transport of folic acid is carried out through endocytosis mechanisms. Receptors operate through a recirculatory mechanism. That is, the ligand repeatedly passes from the plasma membrane to the endosome and vice versa, binding and releasing the molecule. The effectiveness of such a function is defined by a variety of factors, including:

세포 표면상의 수용체의 수, 세포 밖 엽산-리간드의 농도, 수용체에 대한 엽산의 유사성, 에너지-의존적 엔도시토시스의 속도, 엔도솜으로부터 수용체 분자 방출 속도, 막 내부에서 반복적으로 만들어지기 위한 수용체의 능력 등.
The number of receptors on the cell surface, the concentration of extracellular folate-ligand, the similarity of folic acid to the receptor, the rate of energy-dependent endocytosis, the rate of release of receptor molecules from the endosome, the ability of the receptor to be made repeatedly inside the membrane Etc.

의약물과 결합한 엽산 결합물에서 엽산 수용체와 연합된 부분은 수용체-매개 엔도시토시스를 통해 세포로 들어가게 되고, 한편 다른 부분은 세포의 표면 상에 머물러 있게 될 것이다. 이에 따라 두 가지 타입의 치료 전략이 제안될 수 있다. 세포 내 타겟까지 접근할 필요가 있는 의약물은 엔도시토시스에 의해 시토졸로 운반될 수 있으며, 세포 밖 영역에서 작용할 수 있거나 작용해야 하는 의약물은 엽산수용체를 소비하면서 종양세포 표면 상에 축적될 것이다.
The portion associated with the folate receptor in the folate binding agent bound to the drug will enter the cell through receptor-mediated endocytosis, while the other portion will remain on the surface of the cell. Accordingly, two types of treatment strategies can be proposed. Drugs that need to reach intracellular targets can be transported to the cytosol by endocytosis, and drugs that can or should act in the extracellular domain will accumulate on the tumor cell surface while consuming folic acid receptors. .

주요한 특징은 약물이 병리적으로 변형된 세포에까지 직접 전달된다는 점이다. 치료효과를 가진 다양한 광민감제들을 이용하는 PDT의 경우, 종양 세포의 직접적인 손상이 아닌, 병소(pathological focus)의 생리학적 조건을 변화시키는 것을 통해 조정된다. 따라서, 친수성 염료(stains), 특히 클로린 e6은 종양조직의 혈관 시스템의 광 손상에 민감하게 되고(광역학치료법의 혈관에 미치는 효과), 이는 형질 변환된 세포의 직접적인 비활성화를 유도하지 않고 종양의 성장을 억제한다. 광민감제를 종양에 선택적으로 운반하는 것은 PDT의 항암치료효과를 획기적으로 개선시킬 수 있는 한 가지 방법이 될 수 있음이 분명하다.The main feature is that the drug is delivered directly to pathologically modified cells. PDT using a variety of photosensitive agents with therapeutic effects is mediated by changing the physiological conditions of the pathological focus, not directly damaging the tumor cells. Thus, hydrophilic dyes, in particular chlorine e6, are sensitive to light damage of the vascular system of tumor tissues (effects on the vessels of photodynamic therapy), which does not induce direct inactivation of transformed cells without the growth of tumors. Suppress Selective delivery of photosensitizers to tumors is clearly one way to significantly improve the anticancer effects of PDT.

클로린 e6은 천연성분이며, 유기체의 정상적인 세포에는 독성이 없다. 또한 종양치료에 사용되는 다른 광활성 화합물들과 비교하여 악성 세포에 대해 높은 광화학 활성을 가진다. 클로린 e6은 혈액과 기관으로부터 종양부위로 빨리 도달한 후, 종양세포에 높은 농도로 축적된다. 레이저에 의해 활성화된 클로린 e6는 종양에 대한 직접적인 파괴 효과뿐만 아니라 간접적으로도 세포면역을 약화시켜 항-종양 면역조절 효과를 제공한다. 염증 부위와 재생 조직에 클로린이 많이 축적되면 수술 후 상처의 회복이 보다 잘되게 하며 재감염을 막아준다.
Chlorine e6 is a natural component and is not toxic to normal cells of the organism. It also has high photochemical activity against malignant cells compared to other photoactive compounds used in tumor therapy. Chlorine e6 quickly reaches tumor sites from blood and organs, and then accumulates in high concentrations in tumor cells. Laser-activated chlorine e6 provides an anti-tumor immunomodulatory effect by indirectly attenuating cell immunity as well as indirectly destroying tumors. Accumulated chlorine in the inflamed areas and regenerated tissues can help to recover from wounds better after surgery and prevent reinfection.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 물에 용해되지 않는 산 클로린 e6에 나트륨(Na⁺)를 첨가하여 물에 용해되는 염 클로린 e6를 합성(제조)하고, 물에 용해되지 않는 산 클로린 e6에 보다 물에 잘 용해될 수 있고 완충 작용까지 할 수 있는 글루카민(N-methyl-d-glucamine)을 첨가하여 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)을 합성(제조)하고, 염 클로린 e6에 PVP를 첨가하여 물에 잘 용해할 수 있고, 종양에 대한 항암 효과를 높이는 화합물인 클로린-PVP을 합성(제조)하게 되었다. 그리고 클로린 e6과 엽산을 헥산-1,6-디아민을 통해 말단 링커를 결합시키고, 물에 용해되지 않는 클로린 e6-엽산 화합물에 글루카민(N-methyl-d-glucamine)을 첨가하여 물에 잘 용해할 수 있는 수용성 클로린 e6-엽산 화합물을 합성(제조)함으로써 다양한 매질에서 일중항 산소를 효과적으로 생성하고 종래 포르피린 계열의 광민감제에 비해 현저히 우수한 종양 선택성을 가짐으로써 악성종양에 대한 광역학치료에 유용한 특징을 가진 수용성 클로린 e6-엽산 결합 화합물을 기존의 방법보다 쉽고, 빠르며, 경제적으로 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
In view of the above, the present inventors have added (Na ⁺ ) sodium chlorine e6 to acid chlorine e6 that is not soluble in water to synthesize (manufacturing) salt chlorine e6 soluble in water, and acid chlorine e6 that is not soluble in water. N-methyl-d-glucamine (N-methyl-d-glucamine), which is more soluble in water and has a buffering effect, is added to the compound to prepare chlorine-glucamine (N-methyl-d-glucamine). The addition of PVP to chlorine e6 allows the synthesis of chlorine-PVP, a compound that can dissolve well in water and enhance antitumor effects on tumors. In addition, chlorine e6 and folic acid are combined with a terminal linker through hexane-1,6-diamine, and glucamine (N-methyl-d-glucamine) is added to chlorine e6-folic acid compound, which is insoluble in water, to dissolve well in water. By synthesizing (manufacturing) a water-soluble chlorine e6-folic acid compound, it can effectively generate singlet oxygen in various media and have significantly better tumor selectivity than conventional porphyrin-based photosensitizers, which is useful for photodynamic therapy for malignant tumors. The present invention has been completed by confirming that the water-soluble chlorine e6-folate-binding compound having an easier, faster and more economical method than the conventional method.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 스피루리나로 부터 클로로필 a 및 수용성 클로로필 a 유도체, 그리고 광민감제[산 클로린 e6, 염 클로린 e6, 클로린-글루카민(N-methyl-d -glucamine), 클로린-PVP 및 수용성 클로린 e6-엽산 결합 화합물]을 기존의 제조방법과 비교하여 보다 간편하고, 신속하며, 정제도가 향상된 제조방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 본 발명자들은 상술한 장점을 가지는 공정을 개발하는 데 성공하였으며, 이러한 공정에 의해 수득한 광민감제가 암에 대하여 우수한 광역학치료 효과를 나타냄을 확인하였다.The present inventors have derived chlorophyll a and water-soluble chlorophyll a derivatives from spirulina, and photosensitizers [acid chlorine e6, salt chlorine e6, chlorine-glucamine, chlorine-PVP and water-soluble chlorine e6-folic acid bonds. Compound] compared to the conventional manufacturing method, a research effort has been made to develop a simpler, faster and improved purification method. As a result, the present inventors have succeeded in developing a process having the above-mentioned advantages, and it was confirmed that the photosensitizer obtained by the process exhibited an excellent photodynamic therapeutic effect on cancer.

따라서, 본 발명의 목적은 클로로필 a의 제조방법을 제공하는 데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for preparing chlorophyll a.

본 발명의 다른 목적은 수용성 클로로필 a 유도체의 제조방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for preparing a water-soluble chlorophyll a derivative.

본 발명의 또 다른 목적은 산 클로린 e6의 제조방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for preparing acid chlorine e6.

본 발명의 다른 목적은 염 클로린 e6의 제조방법을 제공하는 데 있다. Another object of the present invention is to provide a method for preparing the salt chlorine e6.

본 발명의 다른 목적은 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)의 제조방법을 제공하는 데 있다. Another object of the present invention is to provide a method for preparing chlorine-glucamine (N-methyl-d-glucamine).

본 발명의 다른 목적은 클로린-PVP의 제조방법을 제공하는 데 있다. Another object of the present invention is to provide a method for preparing chlorine-PVP.

본 발명의 다른 목적은 클로린 e6-엽산 결합 화합물의 제조방법을 제공하는 데 있다. Another object of the present invention is to provide a method for preparing a chlorine e6-folate binding compound.

본 발명의 다른 목적은 수용성 클로린 e6-엽산 결합 화합물의 제조방법을 제공하는 데 있다. Another object of the present invention is to provide a method for preparing a water-soluble chlorine e6-folate binding compound.

본 발명의 다른 목적은 상술한 본 발명의 방법에 의해 제조된 광민감제를 포함하는 암에 대한 광역학치료용(photodynamic therapy) 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
Another object of the present invention is to provide a photodynamic therapy pharmaceutical composition for cancer comprising a photosensitive agent prepared by the method of the present invention described above.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings.

본 발명은 스피루리나로 부터 클로로필 a(바람직하게는 분말 클로로필 a), 수용성 클로로필 a 유도체, 산 클로린 e6, 염 클로린 e6, 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine), 클로린-PVP, 클로린 e6-엽산 결합 화합물 및 수용성 클로린 e6-엽산 결합 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.The present invention provides chlorophyll a (preferably powdered chlorophyll a), soluble chlorophyll a derivatives, acid chlorine e6, salt chlorine e6, chlorine glucamine (N-methyl-d-glucamine), chlorine-PVP, chlorine e6 from spirulina. Provided are methods for preparing folic acid binding compounds and water-soluble chlorine e6-folic acid binding compounds.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 광민감제를 포함하는 암에 대한 광역학치료용(photodynamic therapy) 약제학적 조성물을 제공한다.
The present invention also provides a photodynamic therapy pharmaceutical composition for cancer comprising a photosensitive agent prepared by the method of the present invention.

*본 발명자들은 스피루리나로 부터 클로로필 a 및 수용성 클로로필 a 유도체, 그리고 광민감제[산 클로린 e6, 염 클로린 e6, 클로린-글루카민(N-methyl- d-glucamine), 클로린-PVP 및 수용성 클로린 e6-엽산 결합 화합물]을 기존의 제조방법과 비교하여 보다 간편하고, 신속하며, 정제도가 향상된 제조방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 본 발명자들은 상술한 장점을 가지는 공정을 개발하는 데 성공하였으며, 이러한 공정에 의해 수득한 광민감제가 암에 대하여 우수한 광역학치료 효과를 나타냄을 확인하였다.
The present inventors have found that spirulina and soluble chlorophyll a derivatives from spirulina, and photosensitizers [acid chlorine e6, salt chlorine e6, chlorine-glucamine, chlorine-PVP and soluble chlorine e6-folic acid] The binding compound] compared to the conventional manufacturing method, a simple, quick, and refined research to develop a manufacturing method with improved purification. As a result, the present inventors have succeeded in developing a process having the above-mentioned advantages, and it was confirmed that the photosensitizer obtained by the process exhibited an excellent photodynamic therapeutic effect on cancer.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 하기 화학식 1의 클로로필 a의 제조방법을 제공한다:According to one aspect of the present invention, the present invention provides a method for preparing chlorophyll a of Formula 1, comprising the following steps:

(a) 스피루리나에 에탄올을 첨가하여 클로로필 a를 함유하는 스피루리나 추출액을 얻는 단계; (a) adding ethanol to spirulina to obtain a spirulina extract containing chlorophyll a;

(b) 상기 추출액을 냉동 보관하여 클로로필 a 이외의 무극성 불순물을 침전시켜 제거하는 단계; (b) freezing and storing the extract to precipitate and remove nonpolar impurities other than chlorophyll a;

(c) 상기 단계 (b)의 결과물의 에탄올을 제거하는 단계; 및 (c) removing ethanol of the resultant of step (b); And

(d) 상기 단계 (c)의 결과물을 아세톤으로 용해한 다음 냉동 보관하여 클로로필 a 이외의 극성 불순물을 침전 제거하여 클로로필 a를 얻는 단계. (d) dissolving the product of step (c) in acetone and then freezing to precipitate and remove polar impurities other than chlorophyll-a to obtain chlorophyll-a.

화학식 1Formula 1

본 발명의 클로로필 a의 제조방법을 상술하면 다음과 같다: Detailed description of the preparation method of chlorophyll a of the present invention is as follows:

단계 (a): 스피루리나 추출액을 얻는 단계 Step (a): obtaining spirulina extract

본 발명에 따르면, 우선 스피루리나에 에탄올을 첨가하여 클로로필 a를 함유하는 스피루리나 추출액을 얻는다.According to the present invention, first, ethanol is added to spirulina to obtain a spirulina extract containing chlorophyll a.

본 발명에서 사용할 수 있는 스피루리나는 당업계에 공지된 다양한 스피루리나를 포함하며, 예를 들어 Arthrospira ( Spirulina ) platensis , Arthrospira (Spirulina) maxima , Spirulina subsalsa , Spirulina major , Spirulina geitleri , Spirulina siamese , Spirulina princeps , Spirulina laxissima , Spirulina curta , and Spirulina spirulinoides . Among these , Arthrospira ( Spirulina ) platensis , Arthrospira ( Spirulina ) maxima , Spirulina geitleri 및 Spirulina siamese를 포함하며, 바람직하게는, Arthrospira ( Spirulina ) platensis와 Arthrospira (Spirulina) maxima 이며, 가장 바람직하게는, Arthrospira ( Spirulina ) maxima 이다.Spirulina which may be used in the present invention includes various spirulina known in the art, for example, Arthrospira ( Spirulina ) platensis , Arthrospira (Spirulina) maxima , Spirulina subsalsa , Spirulina major , Spirulina geitleri , Spirulina siamese , Spirulina princeps , Spirulina laxissima , Spirulina curta , and Spirulina spirulinoides . Among these , Arthrospira ( Spirulina ) platensis , Arthrospira ( Spirulina ) maxima , Spirulina geitleri And Spirulina siamese , preferably, Arthrospira ( Spirulina ) platensis and Arthrospira (Spirulina) maxima , most preferably Arthrospira ( Spirulina ) maxima .

추출액의 제조 시 사용되는 에탄올의 농도는 중요하다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 사용되는 에탄올은 70-100 v/v%, 보다 바람직하게는 90-100 v/v% 농도를 갖는다.
The concentration of ethanol used in the preparation of the extract is important. According to a preferred embodiment of the present invention, the ethanol used has a concentration of 70-100 v / v%, more preferably 90-100 v / v%.

단계 (b): 무극성 불순물의 제거 Step (b): Removal of Nonpolar Impurities

이어, 상기 과정에서 얻은 추출액을 냉동 보관하여 클로로필 a 이외의 무극성 불순물을 침전시켜 제거한다.Subsequently, the extract obtained in the above process is stored frozen to remove non-polar impurities other than chlorophyll a by precipitation.

상기 냉동 보관은 최종적으로 수득하는 클로로필 a의 순도를 높이는 데 있어서 매우 중요한 처리 과정이다. The cryopreservation is a very important process for increasing the purity of the chlorophyll a finally obtained.

무극성 불순물을 제거하기 위한 냉동 보관은, 바람직하게는 -80℃ 내지 0℃, 보다 바람직하게는 -50℃ 내지 -10℃, 보다 더 바람직하게는 -40℃ 내지 -10℃, 보다 더욱 더 바람직하게는 -30℃ 내지 -10℃, 가장 바람직하게는 -25℃ 내지 -15℃에서 실시한다.Cryopreservation for removing nonpolar impurities is preferably -80 ° C to 0 ° C, more preferably -50 ° C to -10 ° C, even more preferably -40 ° C to -10 ° C, even more preferably Is carried out at -30 ° C to -10 ° C, most preferably at -25 ° C to -15 ° C.

상기 냉동 보관 처리시간은, 바람직하게는 5-50시간, 보다 바람직하게는 10-40시간, 보다 더 바람직하게는 10-30시간, 가장 바람직하게는 20-28시간이다.
The freezing storage treatment time is preferably 5-50 hours, more preferably 10-40 hours, even more preferably 10-30 hours, most preferably 20-28 hours.

단계 (c): 에탄올 제거 Step (c): Ethanol Removal

그런 다음, 상기 냉동보관 되어 무극성 불순물이 제거된 결과물로부터 에탄올 용매를 제거한다. 에탄올 용매의 제거는 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 실시할 수 있으며, 예를 들어 농축기를 이용하여 에탄올 용매를 제거할 수 있다.
Then, the ethanol solvent is removed from the resultant frozen product to remove nonpolar impurities. Removal of the ethanol solvent can be carried out using a variety of methods known in the art, for example, it is possible to remove the ethanol solvent using a concentrator.

단계 (d): 극성 불순물의 제거 Step (d): removal of polar impurities

에탄올 용매가 제거된 결과물을 아세톤으로 용해한 다음 냉동 보관하여 클로로필 a 이외의 극성 불순물을 침전 제거하여 클로로필 a를 얻는다.
The resultant from which the ethanol solvent was removed was dissolved in acetone, and then frozen and stored to precipitate out polar impurities other than chlorophyll-a to obtain chlorophyll-a.

*이 냉동 보관은 최종적으로 수득하는 클로로필 a의 순도를 높이는 데 있어서 매우 중요한 처리 과정이며, 이 과정을 통하여 극성 불순물이 제거된다.* This cryopreservation is a very important treatment to increase the purity of the final chlorophyll a, which removes polar impurities.

극성 불순물을 제거하기 위한 냉동 보관은, 바람직하게는 -80℃ 내지 0℃, 보다 바람직하게는 -50℃ 내지 -10℃, 보다 더 바람직하게는 -40℃ 내지 -10℃, 보다 더욱 더 바람직하게는 -30℃ 내지 -10℃, 가장 바람직하게는 -25℃ 내지 -15℃에서 실시한다. 상기 냉동 보관 처리시간은, 바람직하게는 5-50시간, 보다 바람직하게는 10-40시간, 보다 더 바람직하게는 10-30시간, 가장 바람직하게는 20-28시간이다.Cryopreservation for removing polar impurities is preferably -80 ° C to 0 ° C, more preferably -50 ° C to -10 ° C, even more preferably -40 ° C to -10 ° C, even more preferably Is carried out at -30 ° C to -10 ° C, most preferably at -25 ° C to -15 ° C. The freezing storage treatment time is preferably 5-50 hours, more preferably 10-40 hours, even more preferably 10-30 hours, most preferably 20-28 hours.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (d) 이후에 단계 (d)의 결과물로부터 아세톤을 제거하여 분말 클로로필 a를 수득하는 단계를 추가적으로 포함한다. 아세톤 용매의 제거는 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 실시할 수 있으며, 예를 들어 농축기를 이용하여 아세톤 용매를 제거할 수 있다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the method further comprises the step of (d) after step (d) removing acetone from the product of step (d) to obtain powdered chlorophyll a. The removal of the acetone solvent can be carried out using various methods known in the art, for example, the acetone solvent can be removed using a concentrator.

실질적으로 상업적으로 유통되는 클로로필 a는 분말상이며, 본 발명은 이러한 분말상의 클로로필 a를 제공하는 데 매우 유리하다.Substantially commercially available chlorophyll a is in powder form, and the present invention is very advantageous for providing such powdered chlorophyll a.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 최종적으로 수득되는 클로로필 a는 88-90%의 정제도 및 2.4-2.7%의 수율을 나타낸다.
According to a preferred embodiment of the invention, the chlorophyll a finally obtained by the process of the invention exhibits a purity of 88-90% and a yield of 2.4-2.7%.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 하기 화학식 2의 수용성 클로로필 a 유도체의 제조방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for preparing a water-soluble chlorophyll a derivative of formula 2 comprising the following steps:

(a) 상기 클로로필 a의 아세톤 용액에 강염기를 처리하여 클로로필 a로부터 파이톨(phytol)을 제거하여 하기 화학식 2의 수용성 클로로필 a 유도체를 수득하는 단계; 및(a) treating the acetone solution of chlorophyll-a with a strong base to remove phytol from chlorophyll-a to obtain a water-soluble chlorophyll-a derivative of Formula 2 below; And

(b) 상기 단계 (a)의 결과물에 강산을 처리하여 pH를 6-9로 조절하는 단계; 화학식 2 (b) treating the resultant of step (a) with a strong acid to adjust the pH to 6-9; (2)

본 발명의 수용성 클로로필 a의 제조방법을 상술하면 다음과 같다:Detailed description of the preparation method of the water-soluble chlorophyll a of the present invention is as follows:

단계 (a): 클로로필 a의 아세톤 용액에 강염기를 처리하는 단계 Step (a): Treatment of Strong Base in Acetone Solution of Chlorophyll a

본 발명에 따르면, 우선 상기 과정에서 수득한 클로로필 a를 아세톤에 녹인 후 클로로필 a로부터 파이톨(phytol)을 제거하기 위해서 강염기를 첨가하여 교반한다.According to the present invention, first, the chlorophyll-a obtained in the above process is dissolved in acetone, and then a strong base is added and stirred to remove phytol from chlorophyll-a.

상기 강염기의 처리는 클로로필 a로부터 파이톨(phytol)을 제거하기 위해 매우 중요한 과정이다.Treatment of the strong base is a very important process for removing phytol from chlorophyll a.

상기 화학식 2에서 M⁺는 바람직하게는 Na⁺ 또는 K⁺이고, 가장 바람직하게는 Na⁺이다.In Formula 2, M ⁺ is preferably Na ⁺ or K ⁺ , most preferably Na ⁺ .

파이톨(phytol)을 제거하기 위해 사용되는 강염기로는 당업계에서 공지된 다양한 염기를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 무기 염기이고, 보다 바람직하게는 NaOH 또는 KOH이며, 가장 바람직하게는 NaOH이다.As the strong base used to remove phytol, various bases known in the art can be used, preferably an inorganic base, more preferably NaOH or KOH, and most preferably NaOH.

상기 강염기의 첨가에 의해 용액의 pH를 바람직하게는 10-14, 보다 바람직하게는 12-14, 가장 바람직하게는 13-14가 되도록 한다.By addition of the strong base the pH of the solution is preferably 10-14, more preferably 12-14, most preferably 13-14.

상기 교반 시간은 바람직하게는 1시간 내지 5시간, 보다 바람직하게는 3시간 내지 5시간, 가장 바람직하게는 3시간이다.
The stirring time is preferably 1 hour to 5 hours, more preferably 3 hours to 5 hours, most preferably 3 hours.

단계 (b): 강산의 처리 Step (b): Treatment of Strong Acids

이후 강염기가 첨가되어 교반된 상기 수용성 클로로필 a 유도체를 중화하기 위해서 강산을 첨가한다.A strong acid is then added to add a strong acid to neutralize the stirred soluble chlorophyll-a derivative.

본 발명에 첨가되는 강산으로는 당업계에서 공지된 다양한 산을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 무기산, 보다 바람직하게는 HCl 또는 H₂SO₄ _,가장 바람직하게는 HCl이다.As the strong acid added to the present invention, various acids known in the art may be used, preferably an inorganic acid, more preferably HCl or H ₂ SO ₄ _{, and} most preferably HCl.

상기 강산의 첨가에 의해 용액의 pH를 바람직하게는 7-10, 보다 바람직하게는 8-9로 맞춘다.
The pH of the solution is preferably adjusted to 7-10, more preferably 8-9 by the addition of said strong acid.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 진행되면서 생긴 부산물 및 여분의 강염기를 제거하여 정제시키기 위해 상기 증류수에 녹인 수용성 클로로필 a를 다공성 폴리아크릴아마이드 비드에 통과시키는 단계 및 수용성 클로로필 a 유도체에 해당하는 피크만 모은 후 동결건조 시키는 단계를 추가적으로 포함한다. According to a preferred embodiment of the present invention, the step of passing the water-soluble chlorophyll a dissolved in the distilled water to the porous polyacrylamide beads in order to remove by-products and excess strong bases generated in progress and only the peaks corresponding to the water-soluble chlorophyll a derivative And further freeze-drying the pooled.

다공성 폴리아크릴아마이드 비드는 아크릴아마이드 및 N,N'-메틸렌-비스-아크릴아마이드의 공중합체로서 전하를 띄지 않고, 친수성이 매우 강하여 민감한 화합물의 여과를 효율적으로 수행할 수 있도록 한다. Porous polyacrylamide beads are copolymers of acrylamide and N, N'-methylene-bis-acrylamide, have no charge, and have very strong hydrophilicity, so that filtration of sensitive compounds can be efficiently performed.

다공성 폴리아크릴아마이드 비드의 입자 크기는 특별하게 제한되지 않지만, 바람직하게는 30-120 μm이며, 보다 바람직하게는 40-100 μm이고, 가장 바람직하게는 45-90 μm이다. The particle size of the porous polyacrylamide beads is not particularly limited, but is preferably 30-120 μm, more preferably 40-100 μm, most preferably 45-90 μm.

이러한 다공성 폴리아크릴아마이드 비드는 상업적으로 구입 가능하며, 예를 들어 Bio-Rad Laboratories의 Bio-gel P-2 gel, Bio-gel P-4 gel, Bio-gel P-6 gel, Bio-gel P-6D gel, Bio-gel P-10 gel, Bio-gel P-30 gel, Bio-gel P-60 gel, Bio-gel P-100 gel을 포함한다. 상기 Bio-gel P-2 gel은 45-90 μm의 입자 크기를 가지는 비드로 되어 있다.
Such porous polyacrylamide beads are commercially available, for example Bio-gel P-2 gel, Bio-gel P-4 gel, Bio-gel P-6 gel, Bio-gel P- from Bio-Rad Laboratories. 6D gel, Bio-gel P-10 gel, Bio-gel P-30 gel, Bio-gel P-60 gel, Bio-gel P-100 gel. The Bio-gel P-2 gel is composed of beads having a particle size of 45-90 μm.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 방법으로 수득한 수용성 클로로필 a 유도체의 용액에 강산을 처리하는 단계를 포함하는 하기 화학식 3의 산 클로린 e6의 제조방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a process for preparing acid chlorine e6 of formula 3 comprising the step of treating a strong acid in a solution of the water-soluble chlorophyll a derivative obtained by the above method.

화학식 3Formula 3

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수용성 클로로필 a 유도체를 증류수에 용해한 후 강산을 처리하여 수용성 클로로필 a 유도체로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 산 클로린 e6를 합성한다.According to a preferred embodiment of the present invention, acid chlorine e6 is synthesized by dissolving the water-soluble chlorophyll-a derivative in distilled water and then treating the strong acid to remove magnesium ions from the water-soluble chlorophyll-a derivative.

본 발명에서 수용성 클로로필 a 유도체 용액은 수용성 용액임을 특징으로 한다.In the present invention, the water-soluble chlorophyll-a derivative solution is characterized in that the water-soluble solution.

본 발명에서 이용되는 강산으로는 당업계에서 공지된 다양한 산을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 무기산, 보다 바람직하게는 HCl 또는 H₂SO₄ _,가장 바람직하게는 HCl이다.As the strong acid used in the present invention, various acids known in the art may be used, preferably an inorganic acid, more preferably HCl or H ₂ SO ₄ _{, and} most preferably HCl.

상기 강산의 첨가에 의해 용액의 pH를 바람직하게는 1-3, 보다 바람직하게는 1-2로 맞춘다. 이 경우, pH 3 이상이면 마그네슘 이온 제거율이 크게 감소되는 문제점이 있다.
The pH of the solution is adjusted to 1-3, more preferably to 1-2, by addition of the strong acid. In this case, if the pH 3 or more, there is a problem that the magnesium ion removal rate is greatly reduced.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 방법으로 수득한 산 클로린 e6의 용액에 강염기를 처리하는 단계를 포함하는 하기 화학식 4의 염 클로린 e6의 제조방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a process for preparing the salt chlorine e6 of the formula (4) comprising the step of treating a strong base to a solution of the acid chlorine e6 obtained by the above method.

화학식 4Formula 4

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 산 클로린 e6를 증류수에 용해한 후 강염기를 처리하여 염 클로린 e6를 합성한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the acid chlorine e6 is dissolved in distilled water and then treated with a strong base to synthesize salt chlorine e6.

본 발명에서 이용되는 강염기로는, 당업계에서 공지된 다양한 염기를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 무기 염기이고, 보다 바람직하게는 NaOH 또는 KOH이며, 가장 바람직하게는 NaOH이다.As the strong base used in the present invention, various bases known in the art can be used, preferably an inorganic base, more preferably NaOH or KOH, and most preferably NaOH.

상기 화학식 4에서 M⁺는 바람직하게는 Na⁺ 또는 K⁺이고, 가장 바람직하게는 Na⁺이다.In Formula 4, M ⁺ is preferably Na ⁺ or K ⁺ , and most preferably Na ⁺ .

상기 강염기의 첨가에 의해 용액의 pH를 바람직하게는 7-11, 보다 바람직하게는 7-10, 가장 바람직하게는 8-9가 되도록 한다.By addition of the strong base the pH of the solution is preferably 7-11, more preferably 7-10, most preferably 8-9.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 진행되면서 생긴 부산물 및 여분의 강염기를 제거하여 정제시키기 위해 상기 증류수에 녹인 염 클로린 e6를 다공성 폴리아크릴아마이드 비드에 통과시키는 단계 및 염 클로린 e6에 해당하는 피크만 모은 후 동결건조 시키는 단계를 추가적으로 포함한다. According to a preferred embodiment of the present invention, the step of passing the salt chlorine e6 dissolved in the distilled water through the porous polyacrylamide beads in order to remove the by-products and excess strong bases generated as a progression and collected only peaks corresponding to salt chlorine e6 After lyophilizing further comprises.

다공성 폴리아크릴아마이드 비드의 입자 크기는 특별하게 제한되지 않지만, 바람직하게는 30-120 ㎛이며, 보다 바람직하게는 40-100 ㎛이고, 가장 바람직하게는 45-90 ㎛이다. The particle size of the porous polyacrylamide beads is not particularly limited, but is preferably 30-120 μm, more preferably 40-100 μm, most preferably 45-90 μm.

이러한 다공성 폴리아크릴아마이드 비드는 상업적으로 구입 가능하며, 예를 들어 Bio-Rad Laboratories의 Bio-gel P-2 gel, Bio-gel P-4 gel, Bio-gel P-6 gel, Bio-gel P-6D gel, Bio-gel P-10 gel, Bio-gel P-30 gel, Bio-gel P-60 gel, Bio-gel P-100 gel을 포함한다. 상기 Bio-gel P-2 gel은 45-90 ㎛의 입자 크기를 가지는 비드로 되어 있다.
Such porous polyacrylamide beads are commercially available, for example Bio-gel P-2 gel, Bio-gel P-4 gel, Bio-gel P-6 gel, Bio-gel P- from Bio-Rad Laboratories. 6D gel, Bio-gel P-10 gel, Bio-gel P-30 gel, Bio-gel P-60 gel, Bio-gel P-100 gel. The Bio-gel P-2 gel is composed of beads having a particle size of 45-90 μm.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 산 클로린 e6의 용액에 글루카민(N-methyl-d-glucamine)을 처리하는 단계를 포함하는 하기 화학식 5의 클로린-글루카민의 제조방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a process for preparing chlorine-glucamine of the following formula (5) comprising treating glucamine (N-methyl- d -glucamine) in the solution of the acid chlorine e6 .

화학식 5Formula 5

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 산 클로린 e6를 증류수에 용해한 후 글루카민을 첨가하여 클로린-글루카민을 합성한다.According to a preferred embodiment of the present invention, chlorine-glucamine is synthesized by dissolving the acid chlorine e6 in distilled water and adding glucamine.

상기 단계에서 글루카민을 첨가함에 있어서, 바람직하게는 글루카민은 산 클로린 e6 1당량(eq)에 2당량(eq)의 글루카민(N-methyl-d-glucamine)을 첨가한다.In adding glucamine in this step, preferably, glucamine adds 2 equivalents (eq) of glucamine (N-methyl-d-glucamine) to 1 equivalent (eq) of acid chlorine e6.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 진행되면서 생긴 부산물 및 여분의 글루카민을 제거하여 정제시키기 위해 상기 증류수에 녹인 클로린-글루카민을 다공성 폴리아크릴아마이드 비드에 통과시키는 단계 및 클로린-글루카민에 해당하는 피크만 모은 후 동결건조 시키는 단계를 추가적으로 포함한다. According to a preferred embodiment of the present invention, the step of passing the chlorine-glucamine dissolved in the distilled water to the porous polyacrylamide beads in order to remove and by-products and excess glucamine generated by the process and corresponds to the chlorine-glucamine After collecting only the peaks further comprises the step of lyophilization.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 염 클로린 e6의 용액에 폴리비닐필로리돈(polyvinylpyrrolidone)을 처리하는 단계를 포함하는 클로린-PVP의 제조방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method of preparing chlorine-PVP comprising treating polyvinylpyrrolidone to the solution of the salt chlorine e6.

화학식 5-1Formula 5-1

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 염 클로린 e6를 증류수에 용해한 후 폴리비닐필로리돈(polyvinylpyrrolidone)을 첨가하여 클로린-PVP를 합성한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the salt chlorine e6 is dissolved in distilled water, and then polyvinylpyrrolidone is added to synthesize chlorine-PVP.

바람직하게는, 상기 단계에서 폴리비닐필로리돈(polyvinylpyrrolidone)을 첨가함에 있어서, 폴리비닐필로리돈은 염 클로린 e6 1당량(eq)에 2당량(eq)을 첨가한다.Preferably, in the step of adding polyvinylpyrrolidone, the polyvinylpyrrolidone is added 2 equivalents (eq) to 1 equivalent (eq) of salt chlorine e6.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 진행되면서 생긴 부산물 및 여분의 폴리비닐필로리돈을 제거하여 정제시키기 위해 상기 증류수에 녹인 클로린-PVP을 다공성 폴리아크릴아마이드 비드에 통과시키는 단계 및 클로린-PVP에 해당하는 피크만 모은 후 동결건조 시키는 단계를 추가적으로 포함한다. According to a preferred embodiment of the present invention, the step of passing the chlorine-PVP dissolved in the distilled water to the porous polyacrylamide beads to purify by removing the by-products and the extra polyvinyl pilolidon generated by the process and corresponds to the chlorine-PVP The method further includes the step of lyophilizing after collecting only peaks.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 하기 화학식 6의 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 제조방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for preparing [[gamma]-(6-aminohexyl) folic acid] -chlorine e6 having the following formula:

(a) 엽산과 [tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트를 반응시켜 γ-{(tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산을 수득하는 단계;(a) reacting folic acid with [tert-butyl-N- (6-aminohexyl)] carbamate to obtain γ-{(tert-butyl-N- (6-aminohexyl)] carbamate} folic acid step;

(b) 상기 γ-{[tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산에 트리플루오로-아세트산을 첨가하여 반응시킴으로서 γ-(6-아미노헥실)엽산을 수득하는 단계; 및(b) adding γ-{[tert-butyl-N- (6-aminohexyl)] carbamate} folic acid to trifluoro-acetic acid to give γ- (6-aminohexyl) folic acid ; And

(c) 상기 단계에서 제조한 γ-(6-아미노헥실)엽산에 산 클로린 e6를 첨가하여 반응시키는 단계.(c) reacting by adding acid chlorine e6 to γ- (6-aminohexyl) folic acid prepared in the step.

화학식 66

본 발명의 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6의 제조방법을 상술하면 다음과 같다: Detailed description of the preparation method of [γ- (6-aminohexyl) folic acid] -chlorine e6 of the present invention is as follows:

단계 (a): γ-{( tert -부틸-N-(6- 아미노헥실 )] 카르바메이트 }엽산의 수득 Step (a): obtaining γ-{( tert -butyl-N- (6- aminohexyl )] carbamate } folic acid

우선, 엽산과 [tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트를 반응시켜 γ-{(tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산을 제조한다. 본 반응은 바람직하게는 상온에서 실시한다. 반응 대기조건은 비활성 대기 조건이며, 예를 들어 질소 대기 조건이다.
First, γ-{(tert-butyl-N- (6-aminohexyl)] carbamate} folic acid is produced by reacting folic acid with [tert-butyl-N- (6-aminohexyl)] carbamate. The reaction is preferably carried out at room temperature The reaction atmospheric conditions are inert atmosphere conditions, for example nitrogen atmosphere conditions.

단계 (b): γ-(6- 아미노헥실 )엽산의 수득 Step (b): obtaining γ- (6- aminohexyl ) folic acid

이후 상기에서 수득된 γ-{[tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산에 트리플루오로-아세트산을 반응시켜 γ-(6-아미노헥실)엽산을 제조한다. 본 반응은 바람직하게는 상온에서 실시한다.
Thereafter, trifluoro-acetic acid is reacted with γ-{[tert-butyl-N- (6-aminohexyl)] carbamate} folic acid obtained above to prepare γ- (6-aminohexyl) folic acid. This reaction is preferably performed at room temperature.

단계 (c): [γ-(6- 아미노헥실 )엽산]- 클로린 e6 의 수득 Step (c): [γ- (6- aminohexyl ) folic acid] -chlorine obtained in e6

상기 단계에서 제조한 γ-(6-아미노헥실)엽산에 산 클로린 e6을 반응시켜 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6을 제조한다. 본 반응은 바람직하게는 암실에서 실시한다. 반응 대기조건은 비활성 대기 조건이며, 예를 들어 질소 대기 조건이다.
[Γ- (6-aminohexyl) folic acid] -chlorine e6 is prepared by reacting the acid chlorine e6 with γ- (6-aminohexyl) folic acid prepared in the above step. This reaction is preferably carried out in a dark room. The reaction atmospheric conditions are inert atmosphere conditions, for example nitrogen atmosphere conditions.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6에 글루카민(N-methyl-d-glucamine) 또는 NaOH를 첨가하는 단계를 포함하는 하기 화학식 7 또는 화학식 7-1의 수용성 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 제조방법을 제공한다. According to another embodiment of the present invention, the present invention comprises the step of adding glucamine (N-methyl-d-glucamine) or NaOH to the [γ- (6-aminohexyl) folic acid] -chlorine e6 Or it provides a method for producing a water-soluble [γ- (6-aminohexyl) folic acid]-chlorine e6 of formula (7-1).

화학식 7Formula 7

화학식 7-1Formula 7-1

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 산 클로린 e6-엽산 화합물에 소량의 증류수를 첨가한 후 글루카민 또는 NaOH를 첨가하여 수용성 클로린 e6-엽산 화합물을 합성한다.According to a preferred embodiment of the present invention, a small amount of distilled water is added to the acid chlorine e6-folic acid compound, and then glucamine or NaOH is added to synthesize a water-soluble chlorine e6-folic acid compound.

본 발명에서 글루카민 또는 NaOH의 첨가는 산 클로린 e6-엽산 화합물을 증류수에 용해될 수 있도록 하는 매우 중요한 단계이다.The addition of glucamine or NaOH in the present invention is a very important step to dissolve the acid chlorine e6-folic acid compound in distilled water.

상기 단계에서 글루카민 또는 NaOH을 첨가함에 있어서, 바람직하게는, 산 클로린 e6-엽산 화합물 1당량(eq)에 3당량(eq)의 글루카민(N-methyl-d-glucamine) 또는 NaOH를 첨가한다.In the addition of glucamine or NaOH in this step, preferably, 3 equivalents (eq) of glutamine (N-methyl-d-glucamine) or NaOH is added to 1 equivalent (eq) of the acid chlorine e6-folic acid compound. .

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 진행되면서 생긴 부산물 및 여분의 글루카민 또는 NaOHf를 제거하여 정제시키기 위해 상기 증류수에 녹인 산 클로린 e6-엽산 화합물을 다공성 폴리아크릴아마이드 비드에 통과시키는 단계 및 산 클로린 e6-엽산 화합물에 해당하는 피크만 모은 후 동결건조 시키는 단계를 추가적으로 포함한다. According to a preferred embodiment of the present invention, the acid chlorine e6-folate compound dissolved in the distilled water is passed through a porous polyacrylamide bead and acid chlorine e6 to remove by-products and excess glucamine or NaOHf generated as a process. -Additionally lyophilizing after collecting only peaks corresponding to the folic acid compound.

본 발명의 다른 양태에 따르면 본 발명은 상기 화학식 4의 염 클로린 e6, 상기 화학식 5의 클로린-글루카민, 상기 화학식 5-1의 클로린-PVP, 상기 화학식 6의 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 또는 상기 화학식 7 또는 화학식 7-1의 수용성 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6를 포함하는 암에 대한 광역학치료용(photodynamic therapy) 약제학적 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides the salt of chlorine e6 of Formula 4, chlorine-glucamine of Formula 5, chlorine-PVP of Formula 5-1, [γ- (6-aminohexyl) of Formula 6 Provided is a photodynamic therapy pharmaceutical composition for cancer comprising folic acid] -chlorine e6 or the water-soluble [γ- (6-aminohexyl) folic acid] -chlorine e6 of Formula 7 or Formula 7-1. .

본 발명에서 사용되는 용어 "암"은 형질전환된 세포의 억제되지 않는 증식과 무질서한 성장 결과로 빚어지는 복합적인 질환을 일컬으며, 본 발명에서는 광역학적 치료를 위해 고형암을 의미한다. 고형암이란 혈액암을 제외한 모든 덩어리로 이루어진 암을 의미한다. 고형암의 종류로는 뇌종양(Brain Tumor), 양성성상세포종 (Low- grade astrocytoma), 악성성상세포종 (High-grade astrocytoma), 뇌하수체 선종 (Pituitary adenoma), 뇌수막종 (Meningioma), 뇌림프종 (CNS lymphoma), 핍지교종 (Oligodendroglioma), 두개내인종 (Craniopharyngioma), 상의세포종 (Ependymoma), 뇌간종양 (Brain stem tumor), 두경부 종양(Head & Neck Tumor), 후두암 (Larygeal cancer), 구인두암 (Oropgaryngeal cancer), 비강/부비동암 (Nasal cavity/PNS tumor), 비인두암 (Nasopharyngeal tumor), 침샘암 (Salivary gland tumor), 하인두암 (Hypopharyngeal cancer), 갑상선암 (thyroid cancer), 구강암 (Oral cavity tumor), 흉부종양(Chest Tumor), 소세포성 폐암 (Small cell lung cancer), 비소세포성 폐암 (NSCLC), 흉선암 (Thymoma), 종격동 종양 (Mediastinal tumor), 식도암 (Esophageal cancer), 유방암 (Breast cancer), 남성유방암 (Male breast cancer), 복부종양 (Abdomen-pelvis Tumor), 위암 (Stomach cancer), 간암 (Hepatoma), 담낭암 (Gall bladder cancer), 담도암 (Billiary tract tumor), 췌장암 (pancreatic cancer), 소장암 (Small intestinal tumor), 대장(직장)암 (Large intestinal tumor), 항문암 (Anal cancer), 방광암 (Bladder cancer), 신장암 (Renal cell carcinoma), 전립선암 (Prostatic cancer), 자궁경부암 (Cervix cancer), 자궁내막암 (Endometrial cancer), 난소암 (Ovarian cancer), 자궁육종 (Uterine sarcoma), 피부암(Skin Cancer) 등이 있다.As used herein, the term "cancer" refers to a complex disease resulting from uncontrolled proliferation and disordered growth of transformed cells, and in the present invention refers to solid cancer for photodynamic therapy. Solid cancer refers to cancer composed of all masses except blood cancer. Solid tumors include brain tumor, low-grade astrocytoma, high-grade astrocytoma, pituitary adenoma, meningioma, cerebral lymphoma, CNS lymphoma, Oligodendroglioma, Craniopharyngioma, Ependymoma, Brain stem tumor, Head & Neck Tumor, Larygeal cancer, Oropharyngeal cancer, Nasal / Nasal cavity / PNS tumor, Nasopharyngeal tumor, Salivary gland tumor, Hypopharyngeal cancer, Thyroid cancer, Oral cavity tumor, Chest Tumor , Small cell lung cancer, non-small cell lung cancer (NSCLC), thymic cancer (Thymoma), mediastinal tumor, esophageal cancer, breast cancer, male breast cancer ), Abdominal tumor (Abdomen-pelvis Tumor), Gastric cancer (Stomach cancer), Hepatoma, Gall bladder cancer, Biliary tract tumor, Pancreatic cancer, Small intestinal tumor, Large intestinal tumor, Anal cancer, Bladder cancer, Renal cell carcinoma, Prostatic cancer, Cervical cancer, Endometrial cancer, Ovarian cancer, Uterine sarcoma, Skin Cancer, and the like.

본 발명의 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 7-1의 화합물 또는 화학식 5-1 클로린-PVP은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물 또는 수화물로 제조될 수 있다.The compound of formula 4, formula 5, formula 6, formula 7, formula 7-1 or formula 5-1 chlorine-PVP of the present invention is a pharmaceutically acceptable salt, solvate or hydrate according to conventional methods in the art. It can be prepared as.

염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알콜(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.As salts are acid addition salts formed with pharmaceutically acceptable free acids. Acid addition salts are prepared by conventional methods, for example by dissolving a compound in an excess of aqueous acid solution and precipitating the salt using a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. Equivalent molar amounts of the compound and acid or alcohol (eg, glycol monomethyl ether) in water can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered.

이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로아이오딕산 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.In this case, organic acids and inorganic acids may be used as the free acid, and hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, tartaric acid, and the like may be used as the inorganic acid, and methanesulfonic acid, p -toluenesulfonic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, and maleic acid may be used as the organic acid. (maleic acid), succinic acid, oxalic acid, benzoic acid, tartaric acid, fumaric acid, manderic acid, propionic acid, citric acid, lactic acid, glycolic acid, gluconic acid (gluconic acid), galacturonic acid, glutamic acid, glutaric acid, glucuronic acid, glucuronic acid, aspartic acid, ascorbic acid, carbonic acid, vanic acid, hydroiodic acid, and the like can be used. It is not limited.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.In addition, bases can be used to make pharmaceutically acceptable metal salts. Alkali metal or alkaline earth metal salts are obtained, for example, by dissolving a compound in an excess of alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and then evaporating and drying the filtrate. In this case, as the metal salt, it is particularly suitable to prepare sodium, potassium or calcium salt, but is not limited thereto. Corresponding silver salts may also be obtained by reacting alkali or alkaline earth metal salts with a suitable silver salt (eg, silver nitrate).

상기 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 7-1의 화합물 또는 화학식 5-1 클로린-PVP의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 7-1의 화합물 또는 화학식 5-1 클로린-PVP의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔술포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며 당업계에서 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.The compound of Formula 4, Formula 5, Formula 6, Formula 7, Formula 7-1, or the pharmaceutically acceptable salt of Formula 5-1 Chlorine-PVP, unless otherwise indicated, Formula 4, Formula 5, Formula 6 , Salts of acidic or basic groups which may be present in compounds of formula 7, formula 7-1 or compounds of formula 5-1 chlorine-PVP. For example, pharmaceutically acceptable salts may include sodium, calcium and potassium salts of the hydroxy group, and other pharmaceutically acceptable salts of the amino group include hydrobromide, sulfate, hydrogen sulphate, phosphate, hydrogen phosphate, Dihydrogen phosphate, acetate, succinate, citrate, tartrate, lactate, mandelate, methanesulfonate (mesylate) and p -toluenesulfonate (tosylate) salts, and the like. It can be prepared through.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be prepared including a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutically acceptable carriers are conventionally used in the formulation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, poly Vinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like. In addition to the above components, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and agents are Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여하는 것이 바람직하고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered parenterally, and in the case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, or the like.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-1000 ㎎/㎏이다.Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the invention vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to reaction, Usually a skilled practitioner can easily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment or prophylaxis. According to a preferred embodiment of the present invention, the daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-1000 mg / kg.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다: The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 스피루리나로부터 클로로필 a(특히, 분말 클로로필 a), 수용성 클로로필 a 유도체, 산 클로린 e6, 염 클로린 e6, 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine), 클로린-PVP 및 수용성 클로린 e6-엽산 결합 화합물을 제조하는 방법을 제공한다. (a) The present invention provides chlorophyll-a (particularly powdered chlorophyll-a), water-soluble chlorophyll-a derivatives, acid chlorine e6, salt chlorine e6, chlorine-glucamine, chlorine-PVP and water-soluble from spirulina. Provided are methods for preparing the chlorine e6-folic acid binding compound.

(b) 본 발명은 스피루리나로부터 에탄올과 아세톤을 이용해 저온 냉동침전 방법으로 불순물을 제거하는 방법을 통해 효율적으로 클로로필 a(특히, 분말 클로로필 a)를 수득하고, 상기에서 수득한 클로로필 a에 염기를 처리하여 수용성 클로로필 a 유도체를 형성시키고, 산을 처리하여 산 클로린 e6를 형성시키고, NaOH를 첨가하여 염 클로린 e6을 수득하고, 글루카민(N-methyl-d-glucamine)을 첨가하여 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)을 수득하고, PVP를 첨가하여 클로린-PVP을 수득한다. 분말 클로로필 a를 높은 순도로 수득하고 이로부터 클로로필 a에서 형성되어진 높은 순도의 수용성 클로로필 a 유도체, 염 클로린 e6, 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)과 클로린-PVP을 제조할 수 있는 매우 뛰어난 효과를 가진다.(b) The present invention efficiently obtains chlorophyll a (particularly powdered chlorophyll a) by removing impurities from spirulina by low temperature cryoprecipitation using ethanol and acetone, and then treating chlorophyll a with a base. To form a water-soluble chlorophyll-a derivative, to treat acid to form acid chlorine e6, and to add chlorine e6 by addition of NaOH, and to add chlorine-glucamine (N-methyl-d-glucamine) N-methyl-d-glucamine) is obtained and chlorine-PVP is added by adding PVP. Powder chlorophyll a can be obtained with high purity from which a high purity water soluble chlorophyll a derivative formed from chlorophyll a, the salt chlorine e6, chlorine-glucamine and chlorine-PVP can be prepared. It has a very good effect.

또한, 본 발명은 스피루리나를 이용하여 비교적 간단한 공정으로 대량생산에 적합한 방식으로 분말 클로로필 a 수득과 NaOH를 첨가하여 수용성 클로로필 a 유도체의 합성 및 제조, NaOH를 첨가하여 광민감제 염 클로린 e6의 합성 및 제조, 글루카민(N-methyl-d-glucamine)을 첨가하여 광민감제 클로린-글루카민(N-methyl-d- glucamine)의 합성 및 제조, PVP를 첨가하여 광민감제 클로린-PVP의 합성 및 제조할 수 있는 장점을 가진다.In addition, the present invention is the synthesis and preparation of a water-soluble chlorophyll a derivative by obtaining powdered chlorophyll a and the addition of NaOH in a manner suitable for mass production using a spirulina in a relatively simple process, the synthesis and preparation of the photosensitive salt chlorine e6 by adding NaOH , Synthesis and preparation of photosensitive chlorine-glucamine by adding glucamine (N-methyl-d-glucamine), synthesis and preparation of photosensitive chlorine-PVP by adding PVP Has the advantage.

(c) 본 발명은 산 클로린 e6와 엽산을 헥산-1,6-디아민을 통해 말단 링커를 결합시킴으로써, 산 클로린 e6와 엽산이 결합된 형태의 화합물인 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 를 비교적 간단하고 빠른 시간내에 제조하는 방법을 제공할 수 있는 효과를 가진다.(c) The present invention relates to a compound of [γ- (6-aminohexyl) folic acid, which is a compound in which acid chlorine e6 and folic acid are bound by binding a terminal linker to chlorine e6 and folic acid through hexane-1,6-diamine. It has the effect of providing a method for producing chlorine e6 in a relatively simple and fast time.

또한 본 발명은 산 클로린 e6와 엽산이 결합된 형태의 화합물인 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 를 3당량의 글루카민(N-methyl-d-glucamine) 또는 3당량의NaOH를 첨가함으로써 수용성 클로린 e6-엽산 화합물을 제조하는 방법과 다공성 폴리아크릴아마이드 비드를 통한 정제하는 방법을 제공할 수 있는 효과를 가진다.In addition, the present invention is a compound in the form of a combination of acid chlorine e6 and folic acid [γ- (6-aminohexyl) folic acid]-chlorine e6 of 3 equivalents of glucamine (N-methyl-d-glucamine) or 3 equivalents of NaOH By adding it has the effect of providing a method for producing a water-soluble chlorine e6-folate compound and a method for purification through porous polyacrylamide beads.

도 1은 본원발명의 전체 공정을 간략하게 그림으로 나타낸 것이다.
도 2는 클로로필 a의 표준물질(standard) HPLC 측정 결과이다.
도 3은 스피루리나로부터 측정된 클로로필 a의 HPLC 측정 결과이다.
도 4는 에탄올과 아세톤으로 불순물을 제거한 후 측정된 클로로필 a의 HPLC 측정 결과이다.
도 5는 에탄올과 아세톤으로 불순물을 제거한 후 측정된 클로로필 a의 Mass spectrometer 측정 결과이다.
도 6은 클로로필 a 유도체의 HPLC 측정 결과이다.
도 7은 산 클로린 e6의 HPLC 측정 결과이다.
도 8은 산 클로린 e6의 Mass spectrometer 측정 결과이다.
도 9는 산 클로린 e6의 NMR 측정 결과이다.
도 10은 염 클로린 e6의 Mass spectrometer 측정 결과이다.
도 11은 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)의 HPLC 측정 결과이다.
도 12는 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)의 Mass spectrometer 측정 결과이다.
도 13은 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)의 NMR 측정 결과이다.
도 14는 클로린-PVP의 Mass spectrometer 측정 결과이다.
도 15는 클로린-PVP의 NMR 측정 결과이다.
도 16은 클로린-PVP의 HPLC 측정 결과이다.
도 17은 γ-{(tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산의 질량분석스펙트럼(negative mode) 결과이다.
도 18은 γ-{(tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산의 브루커(Bruker) AVANCE-500 NMR 분석 결과이다.
도 19는 γ-(6-아미노헥실)엽산의 질량분석스펙트럼 결과이다. 여기에서 A는 네가티브 모드, B는 포지티브 모드 측정 결과이다.
도 20은 γ-(6-아미노헥실)엽산의 Bruker AVANCE-500 NMR 측정 결과이다.
도 21은 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 의 질량분석스펙트럼(Positive mode) 결과이다.
도 22은 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 의 NMR 측정 결과이다.
도 23는 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 의 브루커(Bruker) AVANCE-500 NMR 측정 결과이다.
도 24는 클로린 e6 결합물의 전자흡수 스펙트럼이다.
도 25는 광원노출이 없는 경우 헬라 세포 내 클로린-글루카민(N-methyl- d-glucamine) 및 클로린-PVP의 농도에 따른 세포독성을 나타낸 그래프이다
도 26은 12.5 J/㎠의 조사량으로 조사한 경우 헬라 세포 내에서클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)과 클로린-PVP의 농도별 광역학적 활성을 나타낸 그래프이다.
도 27은 시간에 따른 헬라 세포 내 염 클로린 e6 및 수용성 클로린 e6-엽산(conjugate)의 축적 비교 그래프이다.
도 28은 외인성 엽산을 첨가한 경우 시간에 따른 헬라 세포 내 염 클로린 e6 및 수용성 클로린 e6-엽산(conjugate)의 축적 비교 그래프이다.
도 29는 광원노출이 없는 경우 헬라 세포 내 염 클로린 e6 및 수용성 클로린 e6-엽산(conjugate)의 농도에 따른 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 30은 염 클로린 e6 및 수용성 클로린 e6-엽산(conjugate)의 농도별 광역학적 활성을 나타낸 그래프이다.1 is a simplified illustration of the overall process of the present invention.
2 shows the results of standard HPLC measurement of chlorophyll a.
3 shows the results of HPLC measurement of chlorophyll-a measured from spirulina.
4 is an HPLC measurement result of chlorophyll-a measured after removing impurities with ethanol and acetone.
5 is a mass spectrometer measurement result of chlorophyll-a measured after removing impurities with ethanol and acetone.
6 is a result of HPLC measurement of a chlorophyll a derivative.
7 shows the results of HPLC measurement of acid chlorine e6.
8 is a mass spectrometer measurement result of acid chlorine e6.
9 is a result of NMR measurement of acid chlorine e6.
10 is a mass spectrometer measurement result of the salt chlorine e6.
11 is a result of HPLC measurement of chlorine-glucamine (N-methyl-d-glucamine).
12 is a mass spectrometer measurement result of chlorine-glucamine (N-methyl-d-glucamine).
13 shows NMR measurement results of chlorine-glucamine (N-methyl-d-glucamine).
14 is a mass spectrometer measurement result of chlorine-PVP.
15 shows NMR measurement results of chlorine-PVP.
Fig. 16 shows the results of HPLC measurement of chlorine-PVP.
FIG. 17 shows the mass spectrometry of the γ-{(tert-butyl-N- (6-aminohexyl)] carbamate} folic acid (negative mode).
FIG. 18 shows Bruker AVANCE-500 NMR analysis of γ-{(tert-butyl-N- (6-aminohexyl)] carbamate} folic acid. FIG.
19 shows the mass spectrometry results of γ- (6-aminohexyl) folic acid. Where A is negative mode and B is positive mode measurement result.
20 shows Bruker AVANCE-500 NMR measurement results of γ- (6-aminohexyl) folic acid.
Figure 21 shows the mass spectrometry (Positive mode) results of [γ- (6-aminohexyl) folic acid] -chlorine e6.
Fig. 22 shows the NMR results of [γ- (6-aminohexyl) folic acid] -chlorine e6.
FIG. 23 is a Bruker AVANCE-500 NMR measurement result of [γ- (6-aminohexyl) folic acid] -chlorine e6. FIG.
24 is an electron absorption spectrum of chlorine e6 conjugate.
25 is a graph showing the cytotoxicity according to the concentration of chlorine-glucamine (N-methyl-d-glucamine) and chlorine-PVP in HeLa cells in the absence of light exposure.
FIG. 26 is a graph showing photodynamic activity of chlorine-glucamine and chlorine-PVP in concentrations in HeLa cells when irradiated at a dose of 12.5 J / cm 2.
FIG. 27 is a graph comparing the accumulation of salt chlorine e6 and water-soluble chlorine e6-conjugate in HeLa cells over time. FIG.
FIG. 28 is a graph comparing the accumulation of salt chlorine e6 and soluble chlorine e6-conjugate in HeLa cells over time when exogenous folic acid is added. FIG.
FIG. 29 is a graph showing cytotoxicity according to the concentration of salt chlorine e6 and water-soluble chlorine e6-conjugate in HeLa cells in the absence of light exposure.
30 is a graph showing photodynamic activity of salts chlorine e6 and water-soluble chlorine e6-conjugate at different concentrations.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description are exemplary and explanatory only and are not to be construed as limiting the scope of the present invention. It will be self-evident.

실시예Example 1: 출발물질로서 적합한 1: suitable as starting material 스피루리나의Spirulina 선택 Selection

분말 클로로필 a를 얻기 위한 출발물질로서 초음파 분쇄 스피루리나 시료를 준비하였다. 이어 초음파 분쇄 스피루리나에 클로로필 a 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는지 확인하였다. 초음파 분쇄 스피루리나 1 g을 취하여 에탄올 10 ml를 첨가하여 30분, 1시간 30분, 3시간, 6시간 및 12시간 동안 교반시킨 후 여과하여 추출용액을 얻었다. 추출용액에 대하여 HPLC(high pressure liquid chromatography) 분석과 분자량 분석(mass spectrometry)을 하였고, Agilent 1200과 Agilent 6320 ion trap LC/MS 시스템(Agilent)을 이용하여 실시하였다. 샘플 주입 볼륨은 10 ㎕, 용매 유속은 1 ㎖/min로 하였다. 전개액으로는 메탄올과 아세토나이트릴이 1:1로 혼합된 것을 이용하였다. 레퍼런스로는, Sigma-Aldrich 회사의 클로로필 a를 사용하였다. Ultrasonic grinding spirulina samples were prepared as starting materials for obtaining powdered chlorophyll-a. It was then checked how much chlorophyll a and other ingredients were contained in the ultrasonic milled spirulina. 1 g of ultrasonically ground spirulina was taken, 10 ml of ethanol was added, stirred for 30 minutes, 1 hour 30 minutes, 3 hours, 6 hours and 12 hours, followed by filtration to obtain an extract solution. HPLC extraction and high molecular weight spectrometry were performed on the extract solution, using Agilent 1200 and Agilent 6320 ion trap LC / MS systems (Agilent). The sample injection volume was 10 µl and the solvent flow rate was 1 ml / min. As a developing solution, a mixture of methanol and acetonitrile in a 1: 1 ratio was used. As a reference, chlorophyll a from Sigma-Aldrich was used.

도 3에서 확인할 수 있듯이, (주)Shandong Binzhou Tianjian Biotechnology Co. Ltd 에서 구입한 스피루리나 시료의 경우, 머무름시간(retention time) 약 16.955 min에서 클로로필 a 에 해당하는 피크가 관찰되었다. 따라서 이후 실시예에서는 (주)Shandong Binzhou Tianjian Biotechnology Co. Ltd 에서 구입한 스피루리나 시료(Arthrospira ( Spirulina ) platensis 와 Arthrospira ( Spirulina ) maxima를 이용하였다.
As can be seen in Figure 3, Shandong Binzhou Tianjian Biotechnology Co., Ltd. For spirulina samples purchased from Ltd, a peak corresponding to chlorophyll a was observed at a retention time of about 16.955 min. Therefore, in the following examples, Shandong Binzhou Tianjian Biotechnology Co., Ltd. The spirulina samples ( Arthrospira ( Spirulina ) platensis and Arthrospira ( Spirulina ) maxima ) purchased from the company were used.

실시예Example 2: 2: 스피루리나로부터From spirulina 분말 클로로필 a의 제조 Preparation of Powder Chlorophyll-a

(주)Shandong Binzhou Tianjian Biotechnology Co. Ltd 에서 구입한 스피루리나(spirulina)에 에탄올을 첨가시키고 교반하여 여과시킨 후 클로로필 a 이외의 성분들을 제거하기 위하여 빛에 노출되지 않게 호일로 잘 감싼 후 24시간 동안 -20℃ 냉동고에 넣어 두었다. 무극성 불순물은 침전되어, 여과하여 클로로필 a 추출액과 분리되었다. 여과된 클로로필 a 추출액을 농축기로 에탄올 용매를 완전히 제거한 후 아세톤으로 용해한 후 클로로필 a 이외의 성분들을 제거하기 위하여 빛에 노출되지 않게 호일로 잘 감싼 후 24시간 동안 -20℃ 냉동고에 넣어 두었다. 극성 불순물은 침전되어, 여과하여 클로로필 a 추출액과 분리되었다. 추출액을 모아서 농축기로 아세톤 용매를 완전히 제거하여 최종적으로 분말 클로로필 a를 수득하였다. Shandong Binzhou Tianjian Biotechnology Co., Ltd. Spirulina (purulina) purchased from Ltd was added to the ethanol, stirred and filtered, and then wrapped in foil so as not to be exposed to light to remove components other than chlorophyll a and placed in a -20 ℃ freezer for 24 hours. Nonpolar impurities were precipitated, filtered and separated from the chlorophyll a extract. The filtered chlorophyll a extract was completely removed by ethanol solvent with a concentrator and then dissolved in acetone. The chlorophyll-a extract was wrapped in foil so as not to be exposed to light to remove components other than chlorophyll-a, and then placed in a -20 ° C. freezer for 24 hours. Polar impurities were precipitated, filtered off and separated from the chlorophyll a extract. The extracts were collected and the acetone solvent was completely removed by a concentrator to finally obtain powder chlorophyll a.

상기 여과된 추출액을 소량 취한 후 HPLC로 클로로필 a 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는지 확인하였다. HPLC는 Agilent 1200 시스템을 이용하여 실시하였고, 샘플 주입 볼륨은 10 ㎕, 용매 유속은 1 ㎖/min로 하였다. 전개액으로는 메탄올과 아세토나이트릴이 1:1로 혼합된 것을 이용하였다. 그 결과, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 머무름시간(retention time) 약 16.069 min에서 클로로필 a에 해당하는 피크가 관찰되었고, 머무름시간 0-16 min의 불순물들이 상당량 제거되었음을 알 수 있었다. 그리고 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 질량분석 스펙트럼 측정 결과 클로리필 a의 분자량에 해당하는 893이 측정되었다. 또한, HPLC 크로마토그램에서 클로로필 a의 정제도가 89.0 %임을 확인할 수 있었다. 과정 A의 클로로필 a에 대한 수율은 2.5% 이었다. 레퍼런스로는 Sigma-Aldrich 회사의 클로로필 a를 사용하였다.
After taking a small amount of the filtered extract was HPLC to determine how much chlorophyll a and other components are contained. HPLC was performed using an Agilent 1200 system with a sample injection volume of 10 μl and solvent flow rate of 1 mL / min. As a developing solution, a mixture of methanol and acetonitrile in a 1: 1 ratio was used. As a result, as shown in FIG. 4, a peak corresponding to chlorophyll a was observed at a retention time of about 16.069 min, and it was found that a considerable amount of impurities having a retention time of 0-16 min were removed. As can be seen in FIG. 5, the mass spectrometric measurement result showed that 893 corresponding to the molecular weight of chlorophyll-a was measured. In addition, it was confirmed that the purification degree of chlorophyll-a in the HPLC chromatogram was 89.0%. The yield for chlorophyll a in process A was 2.5%. Chlorophyll a from Sigma-Aldrich was used as a reference.

실시예Example 3: 클로로필 a로부터 수용성 클로로필 a 유도체 제조 3: Preparation of Water Soluble Chlorophyll a Derivatives from Chlorophyll a

상기 실시예 2의 과정에서 얻은 클로로필 a의 아세톤 용액 500 ㎖에 5 N NaOH 2-3 ㎖을 처리하여 용액의 pH를 13-14이 되도록 조절한 다음 클로로필 a로부터 파이톨 그룹을 제거하는 반응을 위해 3시간 동안 교반하면서 실시하여 화학식 2의 수용성 클로로필 a 유도체를 수득하였다. 이어, 반응결과물에서 아세톤 용매를 여과과정을 통해 완전히 제거 한 후 침전된 수용성 클로로필 a 유도체를 수득하였다. 그런 다음, 소량의 증류수에 침전된 수용성 클로로필 a 유도체를 용해한 다음 5 N HCl을 1-3 ㎖ 첨가하여 pH를 8-9로 조정하였다. 반응이 진행되면서 생성된 부산물 및 여분의 NaOH를 제거하여 수용성 클로로필 a 유도체를 정제하기 위해, 다공성 폴리아크릴아마이드 비드(Bio-gel P-2 gel, Bio-Rad Laboratories)에 상기 pH 8-9의 용액을 통과시켰다. 수용성 클로로필 a 유도체에 해당하는 피크만 모은 후 동결건조 하였다. 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이 머무름시간(retention time) 약 5.065 min에서 클로로필 a 유도체에 해당하는 피크가 관찰되었다. HPLC 크로마토그램에서 수용성 클로로필 a 유도체의 정제도가 93.0%임을 확인할 수 있었다. 수용성 클로로필 a 유도체에 대한 수율은 52.0% 이었다.
In order to adjust the pH of the solution to 13-14 by treating 2-3 ml of 5 N NaOH to 500 ml of the acetone solution of chlorophyll a obtained in Example 2, and then removing the phytol group from chlorophyll-a. Performing with stirring for 3 hours to obtain a water-soluble chlorophyll a derivative of formula (2). Subsequently, the acetone solvent was completely removed from the reaction product through filtration to obtain a precipitated water-soluble chlorophyll a derivative. Thereafter, the water-soluble chlorophyll-a derivative precipitated in a small amount of distilled water was dissolved, and then, 1-3 ml of 5 N HCl was added to adjust the pH to 8-9. The solution of pH 8-9 in porous polyacrylamide beads (Bio-gel P-2 gel, Bio-Rad Laboratories) to purify the water-soluble chlorophyll-a derivative by removing the by-products and excess NaOH generated during the reaction. Passed. Only peaks corresponding to water-soluble chlorophyll-a derivatives were collected and lyophilized. As can be seen in FIG. 6, a peak corresponding to the chlorophyll a derivative was observed at a retention time of about 5.065 min. HPLC purification showed that the purity of the water-soluble chlorophyll-a derivative was 93.0%. The yield for the water-soluble chlorophyll a derivative was 52.0%.

실시예Example 4: 4: 광민감제Photosensitizer 산 mountain 클로린Chlorine e6e6 의 제조Manufacture

상기 실시예 3의 클로로필 a 유도체 침전물을 증류수로 용해한 후 여기에 1 N HCl 또는 1N H₂SO₄를 첨가하여 수용성 클로로필 a 유도체 용액의 pH를 1-2로 조정하고 3시간 동안 교반시켜 클로로필 a 유도체로부터 마그네슘을 제거하여, 광민감제 산 클로린 e6 침전물을 형성시켰다. 여과를 한 후 동결건조기를 이용하여 증류수를 완전히 제거하였다. 상기에서 얻은 산 클로린 e6 침전물을 소량 취한 후, HPLC로 산 클로린 e6 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는지 확인하였다. 그 결과, 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이 머무름 시간 약 5.008 min에서 산 클로린 e6에 해당하는 피크가 관찰되었고, 산 클로린 e6의 정제도는 95% 이었다. 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이 질량분석 스펙트럼 측정 결과 산 클로린 e6에 해당하는 분자량 597.6 이 측정되었다. 그리고 도 9에서 확인할 수 있는바와 같이 NMR 스펙트럼 결과는 다음과 같이 나타났다: -2.61 (s, 1H, NH), -2.05 (s, 1H, NH), 1.21 (m, 1H), 1.65.-1.72 (m, 7H,), 2.78 (s, 6H), 3.33 (s, 3H), 3.68 (q, J = 6.7 Hz, 2H), 4.55 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.60 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 18.9 Hz, 1H), 5.57 (d, J = 18.8 Hz, 1H), 6.15 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 6.45 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 8.35 (dd, J = 17.8, 11.6 Hz, 1H), 9.10 (s, 1H), 9.62 (s, 1H), 9.75 (s, 1H)
The precipitate of chlorophyll a derivative of Example 3 was dissolved in distilled water, and then 1N HCl or 1N H ₂ SO ₄ was added thereto to adjust the pH of the aqueous chlorophyll a derivative solution to 1-2 and stirred for 3 hours, thereby stirring the chlorophyll a derivative. Magnesium was removed from to form a photosensitizer acid chlorine e6 precipitate. After filtration, distilled water was completely removed using a lyophilizer. After taking a small amount of the acid chlorine e6 precipitate obtained above, HPLC confirmed how much acid chlorine e6 and other components were contained. As a result, as shown in FIG. 7, a peak corresponding to acid chlorine e6 was observed at a retention time of about 5.008 min, and the purity of acid chlorine e6 was 95%. As can be seen in FIG. 8, the mass spectrometry measurement result showed that the molecular weight 597.6 corresponding to acid chlorine e6 was measured. And as can be seen in Figure 9, NMR spectrum results were as follows: -2.61 (s, 1H, NH), -2.05 (s, 1H, NH), 1.21 (m, 1H), 1.65.-1.72 ( m, 7H,), 2.78 (s, 6H), 3.33 (s, 3H), 3.68 (q, J = 6.7 Hz, 2H), 4.55 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.60 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 18.9 Hz, 1H), 5.57 (d, J = 18.8 Hz, 1H), 6.15 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 6.45 (d, J = 18.0 Hz , 1H), 8.35 (dd, J = 17.8, 11.6 Hz, 1H), 9.10 (s, 1H), 9.62 (s, 1H), 9.75 (s, 1H)

실시예Example 5: 5: 광민감제Photosensitizer 염 salt 클로린Chlorine e6e6 의 제조Manufacture

상기 실시예 4에서 여과하여 얻어진 산 클로린 e6을 분리한 후 동결건조기로 증류수를 완전히 제거하였다. 산 클로린 e6에 소량의 증류수를 넣어주고, 1 N NaOH 또는 1 N KOH를 미량 첨가하여 pH 8-9로 맞춘 후, 3시간 동안 교반시켜주었다. 여과한 후 여분의 NaOH 또는 KOH 제거를 위해 다공성 폴리아크릴아마이드 비드(Bio-gelP-2 gel, Bio-Rad Laboratories)를 통과시켜주고, 염 클로린 e6에 해당하는 피크만 모아서 동결건조 시킨 후 염 클로린 e6를 수득하였다. 도 10에서 확인할 수 있는바와 같이 , 질량분석 스펙트럼 측정 결과 염 클로린 e6에 해당하는 분자량 641이 측정 되었다. HPLC 크로마토그램에서 염 클로린 e6의 정제도가 97.0%임을 확인할 수 있었다. 염 클로린 e6에 대한 수율은 90.0% 이었다.
The acid chlorine e6 obtained by filtration in Example 4 was separated and distilled water was completely removed by a lyophilizer. A small amount of distilled water was added to acid chlorine e6, and a small amount of 1 N NaOH or 1 N KOH was added to adjust pH to 8-9, followed by stirring for 3 hours. After filtration, porous polyacrylamide beads (Bio-gelP-2 gel, Bio-Rad Laboratories) are removed to remove excess NaOH or KOH, and only the peaks corresponding to salt chlorine e6 are collected and lyophilized, followed by salt chlorine e6. Obtained. As can be seen in Figure 10, the mass spectrometry measurement was carried out to determine the molecular weight 641 corresponding to the salt chlorine e6. The HPLC chromatogram showed that the purity of the salt chlorine e6 was 97.0%. The yield for salt chlorine e6 was 90.0%.

실시예Example 6: 6: 광민감제Photosensitizer 클로린Chlorine -- 글루카민(N-methyl-d-glucamine)의Glucamine (N-methyl-d-glucamine) 제조 Produce

여과하여 얻어진 산 클로린 e6를 분리한 후 동결건조기로 미량의 수분을 완전히 제거하였다. 동결건조 완료하여 미량의 수분이 완전히 제거된 산 클로린 e6 1.0 g에 증류수를 10 ml을 채워준 후 클로린 1 당량(eq) 대비 2 당량(2eq)의 0.7 g 글루카민(N-methyl-d-glucamine, Sigma-Aldrich)을 넣어주고 1시간 동안 교반시켰다. 물에 용해되지 않는 산 클로린 e6는 2 당량의 글루카민(N-methyl-d-glucamine)에 의해 증류수로 용해되어 들어갔다. 여과한 후 여분의 글루카민(N-methyl-d-glucamine) 제거를 위해 다공성 폴리아크릴아마이드 비드(Bio-gel P-2 gel, Bio-Rad Laboratories)를 통과시켜주고, 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)에 해당하는 피크만 모아서 동결건조시켜 증류수를 완전히 제거하여 최종 산물인 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)을 수득한다. HPLC 크로마토그램에서 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)의 정제도가 98.0%임을 확인할 수 있었다. 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)에 대한 수율은 87.0% 이었다. After removing the acid chlorine e6 obtained by filtration, a small amount of water was completely removed by a lyophilizer. After completion of lyophilization, 10 g of distilled water was filled in 1.0 g of acid chlorine e6 from which trace amounts of water were completely removed, followed by 2 equivalents (2 eq) of 0.7 g glucamine (N-methyl- d -glucamine, 1 equivalent of chlorine). Sigma-Aldrich) was added and stirred for 1 hour. Acid chlorine e6, which is not soluble in water, was dissolved in distilled water by two equivalents of glucamine (N-methyl- d -glucamine). After filtration, porous polyacrylamide beads (Bio-gel P-2 gel, Bio-Rad Laboratories) were passed to remove excess glucamine (N-methyl- d -glucamine), and chlorine-glucamine (N- Only peaks corresponding to methyl- d- glucamine are collected and lyophilized to completely remove distilled water to obtain final product chlorine-glucamine (N-methyl- d -glucamine). The HPLC chromatogram showed that the purity of chlorine-glucamine (N-methyl- d -glucamine) was 98.0%. The yield for chlorine-glucamine (N-methyl- d -glucamine) was 87.0%.

도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이 머무름 시간 약 8.409 분에서 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)에 해당하는 피크가 관찰되었다. 도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이 질량분석 스펙트럼 측정 결과 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)에 해당하는 분자량 995 가 측정되었다. 그리고 도 13에서 확인할 수 있는바와 같이 NMR 스펙트럼 결과는 다음과 같이 나타났다: -2.56 (s, 1H, NH), -1.99 (s, 1H, NH), 1.56-1.48 (m, 4H), 2.81-2.76 (m, 5H), 2.89 (td, J = 15.9, 7.9, 7.9 Hz, 1H), 3.42 (s, 3H), 3.49 (s, 3H), 3.51 (s, 3H), 3.84 (q, J = 6.7 Hz, 2H, 8(1)), 4.59 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.87 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 5.14 (d, J = 18.9 Hz, 1H), 5.62 (d, J = 18.8 Hz, 1H), 6.17 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 6.47 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 8.36 (dd, J = 17.8, 11.6 Hz, 1H), 9.14 (s, 1H), 9.69 (s, 1H), 9.70 (s, 1H)
The peaks were observed for the glucamine (N-methyl- d -glucamine) - at about a retention time 8.409 minutes As can be seen in Figure 11 chlorin. As can be seen in FIG. 12, the mass spectrometric measurement resulted in a molecular weight of 995 corresponding to chlorine-glucamine (N-methyl- d -glucamine). And as can be seen in Figure 13, NMR spectrum results were as follows: -2.56 (s, 1H, NH), -1.99 (s, 1H, NH), 1.56-1.48 (m, 4H), 2.81-2.76 (m, 5H), 2.89 (td, J = 15.9, 7.9, 7.9 Hz, 1H), 3.42 (s, 3H), 3.49 (s, 3H), 3.51 (s, 3H), 3.84 (q, J = 6.7 Hz, 2H, 8 (1)), 4.59 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.87 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 5.14 (d, J = 18.9 Hz, 1H), 5.62 (d, J = 18.8 Hz, 1H), 6.17 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 6.47 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 8.36 (dd, J = 17.8, 11.6 Hz, 1H), 9.14 (s, 1H), 9.69 (s, 1H), 9.70 (s, 1H)

실시예Example 7: 7: 광민감제Photosensitizer 클로린Chlorine -- PVPPVP 의 제조Manufacture

상기 실시예 5에서 수득된 염 클로린 e6에 소량의 증류수를 넣어주고, 염 클로린 e6 1 g 에 폴리비닐필로리딘{polyvinylpyrrolidone(PVP), Sigma-Aldrich} 1당량을 정확히 넣어주고, 3시간 동안 교반시켰다. 여과하여 여분의 PVP 제거를 위해 다공성 폴리아크릴아마이드 비드(Bio-gel P-2 gel, Bio-Rad Laboratories)를 통과시켜주고, 클로린-PVP에 해당하는 피크만 모아서 동결건조기를 이용하여 수분을 완전히 제거하고 클로린-PVP을 수득하였다. HPLC 크로마토그램에서 클로린-PVP의 정제도가 98.0%임을 확인할 수 있었다. 클로린-PVP에 대한 수율은 80.0% 이었다. A small amount of distilled water was added to the salt chlorine e6 obtained in Example 5, and exactly 1 equivalent of polyvinylpyrrolidone (PVP) and Sigma-Aldrich} was added to 1 g of salt chlorine e6, followed by stirring for 3 hours. I was. Filter through the porous polyacrylamide beads (Bio-gel P-2 gel, Bio-Rad Laboratories) to remove excess PVP, and collect only peaks corresponding to chlorine-PVP to completely remove moisture using a freeze dryer. And chlorine-PVP. The HPLC chromatogram showed that the purity of chlorine-PVP was 98.0%. The yield for chlorine-PVP was 80.0%.

도 16에서 확인할 수 있는 바와 같이 머무름 시간 약 3.25 분에서 클로린-PVP에 해당하는 피크가 관찰되었다. 도 14에서 확인할 수 있는 바와 같이 질량분석 스펙트럼 측정 결과 클로린-PVP에 해당하는 분자량 597(positive mode)과 595(negative mode) 가 측정되었다. 그리고 도 15에서 확인할 수 있는바와 같이 NMR 스펙트럼 결과는 다음과 같이 나타났다: -1.98 (s, 1H, NH), -1.71 (s, 1H, NH), 1.56-1.48 (m, 1H, 17(1)), 1.61 (t, J = 6.7 Hz, 3H, 8(2)) 1.63 (d, J = 7.2 Hz, 3H, 18(1)), 2.15-2.06 (m, 1H17(1)), 2.32-2.22 (m, 1H, 17(2)), 2.60 (td, J = 15.9, 7.9, 7.9 Hz, 1H, 17(2)), 3.21 (s, 3H, 7(1)), 3.45 (s, 3H, 2(1)), 3.54 (s, 3H, 12(1)), 3.71 (q, J = 6.7 Hz, 2H, 8(1)), 4.43 (d, J = 10.0 Hz, 1H, 17), 4.58 (q, J = 7.2 Hz, 1H, 18), 5.29 (d, J = 18.9 Hz, 1H, 15(1)), 5.38 (d, J = 18.8 Hz, 1H, 15(1)), 6.09 (d, J = 11.6 Hz, 1H, 3(2)), 6.36 (d, J = 18.0 Hz, 1H, 3(2)), 8.20 (dd, J = 17.8, 11.6 Hz, 1H, 3(1)), 9.06 (s, 1H, 20), 9.61 (s, 1H, 5), 9.70 (s, 1H, 10)
As can be seen in FIG. 16, a peak corresponding to chlorine-PVP was observed at a retention time of about 3.25 minutes. As can be seen in FIG. 14, the mass spectrometry measurement result showed that the molecular weights 597 (positive mode) and 595 (negative mode) corresponding to chlorine-PVP were measured. And as can be seen in Figure 15, NMR spectrum results were as follows: -1.98 (s, 1H, NH), -1.71 (s, 1H, NH), 1.56-1.48 (m, 1H, 17 (1) ), 1.61 (t, J = 6.7 Hz, 3H, 8 (2)) 1.63 (d, J = 7.2 Hz, 3H, 18 (1)), 2.15-2.06 (m, 1H17 (1)), 2.32-2.22 (m, 1H, 17 (2)), 2.60 (td, J = 15.9, 7.9, 7.9 Hz, 1H, 17 (2)), 3.21 (s, 3H, 7 (1)), 3.45 (s, 3H, 2 (1)), 3.54 (s, 3H, 12 (1)), 3.71 (q, J = 6.7 Hz, 2H, 8 (1)), 4.43 (d, J = 10.0 Hz, 1H, 17), 4.58 (q, J = 7.2 Hz, 1H, 18), 5.29 (d, J = 18.9 Hz, 1H, 15 (1)), 5.38 (d, J = 18.8 Hz, 1H, 15 (1)), 6.09 (d , J = 11.6 Hz, 1H, 3 (2)), 6.36 (d, J = 18.0 Hz, 1H, 3 (2)), 8.20 (dd, J = 17.8, 11.6 Hz, 1H, 3 (1)), 9.06 (s, 1H, 20), 9.61 (s, 1H, 5), 9.70 (s, 1H, 10)

실시예Example 8: [γ-(6- 8: [γ- (6- 아미노헥실Aminohexyl )엽산]-) Folic Acid]- 클로린Chlorine e6e6 의 제조Manufacture

실시예Example 8-1: γ-{( 8-1: γ-{( terttert -부틸-N-(6--Butyl-N- (6- 아미노헥실Aminohexyl )])] 카르바메이트Carbamate }엽산의 제조} Production of Folic Acid

상온, 질소 대기 하에서, 무수 디메틸설폭사이드{(dimethylsulfoxide)DMSO}와 피리딘 내 엽산(1615 mg, 3.66 mmol, Sigma-Aldrich) 용액에 [tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트(= N-boc-1,6- hexanediamine, Sigma-Aldrich) (871 ㎎, 4.03mmol) 및 디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(1887 ㎎, 9.15 mmol) (또는 1,1'-carbonyldiimidazole, Sigma-Aldrich)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 상온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과한 후, 0℃로 냉각된 무수 에테르의 강력하게 교반되는 용액 안으로 상기 여과액을 천천히 부었다. 노란색의 침전물을 여과하여 모은 다음, 에테르로 씻어 DMSO 잔류물을 제거하고 진공 상태에서 건조시켰다. 2132 ㎎을 수득하였고, 91.0%의 수율을 나타냈다. γ-{(tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산은 도 17에서 확인할 수 있는 바와 같이 질량분석 스펙트럼 측정 결과 분자량은 638.5에 해당하는 분자량 640.0(positive mode) 으로 나타났다. 도 18에서 확인할 수 있는바와 같이 NMR 스펙트럼 결과는 다음과 같이 나타났다: 1.90-1.85 (m, 1H, β-glutamic), 2.10-1.99 (m, 1H, β-glutamic), 2.31 (t, J = 7.5, 7.5 Hz, 2H, α-glutamic), 4.33 (ddd, J = 9.8, 7.7, 4.9 Hz, 1H), 4.48 (d, J = 6.0 Hz, 2H, CH2N), 6.64 (d, J = 8.8 Hz, 2H, benzoyl), 6.94 (t, J = 6.0, Hz, 1H, CH2NH), 7.65 (d, J = 8.8 Hz, 2H, benzoyl), 8.13 (d, J = 7.7 Hz, 1H, CHNH), 8.65 (s, 1H, pteridine), 11.44 (br s, 1H)
[Tert-butyl-N- (6-aminohexyl)] carbamate in an aqueous solution of folic acid (1615 mg, 3.66 mmol, Sigma-Aldrich) in pyridine with anhydrous dimethylsulfoxide {(dimethylsulfoxide) DMSO} at ambient temperature and nitrogen atmosphere (= N-boc-1,6-hexanediamine, Sigma-Aldrich) (871 mg, 4.03 mmol) and dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (1887 mg, 9.15 mmol) (or 1,1'-carbonyldiimidazole, Sigma -Aldrich) was added. The mixture was stirred at room temperature for 18 hours. After the reaction mixture was filtered, the filtrate was slowly poured into a strongly stirred solution of anhydrous ether cooled to 0 ° C. The yellow precipitate was collected by filtration, washed with ether to remove DMSO residue and dried in vacuo. 2132 mg was obtained, yielding 91.0%. As can be seen in FIG. 17, γ-{(tert-butyl-N- (6-aminohexyl)] carbamate} folic acid was found to have a molecular weight of 640.0 (positive mode) with a molecular weight of 638.5. As can be seen in Figure 18, the NMR spectral results were as follows: 1.90-1.85 (m, 1H, β-glutamic), 2.10-1.99 (m, 1H, β-glutamic), 2.31 (t, J = 7.5, 7.5 Hz, 2H, α-glutamic), 4.33 (ddd, J = 9.8, 7.7, 4.9 Hz, 1H), 4.48 (d, J = 6.0 Hz, 2H, CH2N), 6.64 (d, J = 8.8 Hz , 2H, benzoyl), 6.94 (t, J = 6.0, Hz, 1H, CH2NH), 7.65 (d, J = 8.8 Hz, 2H, benzoyl), 8.13 (d, J = 7.7 Hz, 1H, CHNH), 8.65 (s, 1H, pteridine), 11.44 (br s, 1H)

실시예Example 8-2: γ-(6- 8-2: γ- (6- 아미노헥실Aminohexyl )엽산의 제조Production of folic acid

상기 실시예 8-1-a 에서 제조되어진 γ-{(tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산(2232 ㎎, 3.49 mmol, Sigma-Aldrich)을 트리플루오로-아세트산(TFA, Sigma-Aldrich)으로 처리하고, 대기 온도에서 2시간 동안 교반한 다음 TFA를 진공 하에서 증발시켰다. 잔류물을 무수 DMF(Sigma-Aldrich)에 넣은 다음, 피리딘(Sigma-Aldrich치)을 노란색 침전물이 형성될 때까지 방울방울 넣어주었다. 노란색의 침전물을 여과하여 모은 다음 에테르로 세척하고 진공 하에서 건조시켜 γ-(6-아미노헥실)엽산을 제조하였다. γ-{(tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산을 출발물질로 하여 제조된 γ-(6-아미노헥실)엽산은 1652 mg을 수득하였고, 수율은 87.9%를 나타내었다.Γ-{(tert-butyl-N- (6-aminohexyl)] carbamate} folic acid (2232 mg, 3.49 mmol, Sigma-Aldrich) prepared in Example 8-1-a was trifluoro-acetic acid. (TFA, Sigma-Aldrich), stirred at ambient temperature for 2 hours and the TFA was evaporated under vacuum The residue was placed in anhydrous DMF (Sigma-Aldrich) and the pyridine (Sigma-Aldrich) yellow Droplets were added until a precipitate formed, yellow precipitates were collected by filtration, washed with ether and dried in vacuo to prepare γ- (6-aminohexyl) folic acid γ-{(tert-butyl-N- Γ- (6-aminohexyl) folic acid prepared using (6-aminohexyl)] carbamate} folic acid as a starting material was obtained 1652 mg, and the yield was 87.9%.

도 19에서 확인할 수 있는 바와 같이 상기 γ-(6-아미노헥실)엽산의 질량분석스펙트럼 결과 분자량은 Negative mode에서 538.79, Positive mode 540.8 으로 나타났다. 도 20에서 확인할 수 있는 바와 같이 NMR 스펙트럼 결과는 다음과 같이 나타났다: 8.64 (s, 1H pteridine), 7.92 (d, J =8 Hz, 1H, NH-glutamic), 7.82 (brt, J =4 Hz 1H, NH), 7.65 (d, J = 9 Hz, 2H, benzoyl), 6.93 (br t, J =6 Hz 1H, NH), 6.74 (br t, J =6 Hz 1H, NH), 6.63 (d, J = 9 Hz, 2H, benzoyl), 4.49 (d, J= 6 Hz, 2H, NCH2Ar), 4.36-4.23 (m, 1H, glutamic), 3.01 (m, 2H, NCH2-hexyl), 2.88 (m, 2H, BOCNCH2-hexyl), 2.29-2.15 (m, 2H, glutamic), 1.98-1.82 (m, 2H, glutamic), 1.41-1.16 (m, 8H hexyl), 1.36 (s, 9H, tBu)
As can be seen in FIG. 19, the mass spectrometry of the γ- (6-aminohexyl) folic acid showed molecular weight of 538.79 in positive mode and 540.8 in positive mode. As can be seen in FIG. 20, the NMR spectral results were as follows: 8.64 (s, 1H pteridine), 7.92 (d, J = 8 Hz, 1H, NH-glutamic), 7.82 (brt, J = 4 Hz 1H , NH), 7.65 (d, J = 9 Hz, 2H, benzoyl), 6.93 (br t, J = 6 Hz 1H, NH), 6.74 (br t, J = 6 Hz 1H, NH), 6.63 (d, J = 9 Hz, 2H, benzoyl), 4.49 (d, J = 6 Hz, 2H, NCH2Ar), 4.36-4.23 (m, 1H, glutamic), 3.01 (m, 2H, NCH2-hexyl), 2.88 (m, 2H, BOCNCH2-hexyl), 2.29-2.15 (m, 2H, glutamic), 1.98-1.82 (m, 2H, glutamic), 1.41-1.16 (m, 8H hexyl), 1.36 (s, 9H, tBu)

실시예Example 8-3: γ-(6- 8-3: γ- (6- 아미노헥실Aminohexyl )엽산-Folic acid 클로린Chlorine e6e6 의 제조Manufacture

질소 대기 하의 빛이 차단된 환경에서, 상기 실시예 8-1-b에서 제조한 γ-(6-아미노헥실)엽산 용액에 산 클로린 e6를 첨가하여 실온에서 12-48 시간 동안 교반한 다음, 0℃로 냉각된 에테르의 강력하게 교반되는 용액 안으로 상기 혼합물을 천천히 부었다. 이후 어두운 적색의 침전물을 여과하여 모은 다음, 에테르와 디클로로메탄(Dichlorlmethane, DCM, Sigma-Aldrich)으로 세척한 후 진공하에서 건조시켜 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6을 제조하였다. 도 21에서 확인할 수 있는 바와 같이 질량분석 스펙트럼 측정 결과 분자량은 결과 분자량은 1116 (negative mode)으로 나타났다. 도 22에서 확인할 수 있는바와 같이 NMR 스펙트럼 결과는 다음과 같이 나타났다: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 12.2 (s, 1H, COOH), 11.68 (s, 1H, COOH), 10.37(s, 1H, NH), 9.78(s, 1H), 9.64(s, 1H), 9.15(s, 1H), 8.88(s, 1H, NH), 8.8(s, 1H), 8.20(q,1H), 7.56(s, 2H), 7.15(s, 2H), 6.89(s, 2H, NH2), 6.38(d, 1H), 6.15(d, 1H), 5.80(s, 1H), 5.40(m, 1H), 4.59(m, 2H) , 4.22(t.2H), 4.02(s, 2H), 3.59(s, 3H), 3.43(s, 3H), 3.20(s, 3H), 3.7(q, 1H), 2.65(m, 1H), 2.08-2.41(m, 8H), 1.89(t, 2H), 1.52-1.78(m, 12H), 1.28(m, 4H), 1.08-1.10(m, 7H), -1.72(s, 1H, NH), -1.96(s, 1H, NH)
In a light-blocked environment under a nitrogen atmosphere, acid chlorine e6 was added to the γ- (6-aminohexyl) folic acid solution prepared in Example 8-1-b and stirred at room temperature for 12-48 hours, followed by 0 The mixture was slowly poured into a strongly stirred solution of ether cooled to ° C. Thereafter, the dark red precipitate was collected by filtration, washed with ether and dichloromethane (Dichlorlmethane, DCM, Sigma-Aldrich), and then dried under vacuum to prepare [γ- (6-aminohexyl) folic acid] -chlorine e6. As can be seen in FIG. 21, the mass spectrometry measurement result showed that the molecular weight was 1116 (negative mode). As can be seen in Figure 22, the NMR spectral results were as follows: ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 12.2 (s, 1H, COOH), 11.68 (s, 1H, COOH), 10.37 ( s, 1H, NH), 9.78 (s, 1H), 9.64 (s, 1H), 9.15 (s, 1H), 8.88 (s, 1H, NH), 8.8 (s, 1H), 8.20 (q, 1H) , 7.56 (s, 2H), 7.15 (s, 2H), 6.89 (s, 2H, NH2), 6.38 (d, 1H), 6.15 (d, 1H), 5.80 (s, 1H), 5.40 (m, 1H ), 4.59 (m, 2H), 4.22 (t.2H), 4.02 (s, 2H), 3.59 (s, 3H), 3.43 (s, 3H), 3.20 (s, 3H), 3.7 (q, 1H) , 2.65 (m, 1H), 2.08-2.41 (m, 8H), 1.89 (t, 2H), 1.52-1.78 (m, 12H), 1.28 (m, 4H), 1.08-1.10 (m, 7H), 1.72 (s, 1H, NH), -1.96 (s, 1H, NH)

실시예Example 9: 수용성 9: water soluble 클로린Chlorine e6e6 -엽산 결합 화합물의 제조Preparation of Folic Acid Binding Compounds

상기 실시예 8-1-c에서 제조한 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 의 정확한 무게를 측정한 뒤 소량의 증류수를 부어주고 산 클로린 e6-엽산 화합물 1 당량에 3 당량의 글루카민(N-methyl-d-glucamine) 또는 NaOH를 가하여 3시간 동안 교반하여 주었다. 증류수에 용해되지 않는 산 클로린 e6-엽산 화합물은 3 당량의 글루카민(N-methyl-d-glucamine)또는 NaOH 의해 증류수에 용해되어 들어갔다. 반응이 끝난 후 여분의 글루카민(N-methyl-d-glucamine) 또는 NaOH를 제거하기 위해 다공성 폴리아크릴아마이드 비드(Bio-gel P-2 gel, Bio-Rad Laboratories)에 통과시켜 주고, 수용성 클로린 e6-엽산 화합물에 해당하는 피크만 모아서 동결 건조하였다. After measuring the exact weight of [γ- (6-aminohexyl) folic acid] -chlorine e6 prepared in Example 8-1-c, pour a small amount of distilled water and add 3 equivalents to 1 equivalent of the acid chlorine e6-folic acid compound. Glucamine (N-methyl-d-glucamine) or NaOH was added and stirred for 3 hours. The acid chlorine e6-folic acid compound not dissolved in distilled water was dissolved in distilled water by 3 equivalents of glucamine (N-methyl-d-glucamine) or NaOH. After completion of the reaction, pass through a porous polyacrylamide bead (Bio-gel P-2 gel, Bio-Rad Laboratories) to remove excess G-amine (N-methyl-d-glucamine) or NaOH, water-soluble chlorine e6 Only peaks corresponding to folic acid compounds were collected and lyophilized.

도 23에서 확인할 수 있는바와 같이 NMR 스펙트럼 결과는 다음과 같이 나타났다: -2.13(brs, 1H, NH), -1.78(brs, 1H, NH), 1.16-1.73(m, 9H, 17(1), hexyl), 1.61-1.63(m, 6H, 8(2), 18(1)), 1.76-2.02(m, 2H, glutamic), 2.08-2.23(m, 4H, 17(2), 17(1), glutamic), 2.68-2.74(m, 1H, 17(2)), 2.86-3.04(m, 4H, NCH, hexyl), 3.23(s, 3H, 2(1)), 3.49(s, 3H,2(1)), 3.51(s, 3H, 12(1)), 3.79(m, 2H, 8(1)), 4.25-4.31(m, 1H, glutamic), 4.43(m, 1H, 17), 4.44(m, 2H, NCH, Ar), 4.54(m, 1H, 18), 5.07(d, J=17.5Hz, 1H, 15(1)), 5.33(m, 1H, 15(1)), 6.14(d, J=11.3Hz, 1H, 3(2)), 6.42(d, J=18.1Hz, 1H, 3(2)), 6.57(d, J=8.6Hz, 2H, benzoyl), 6.88(m, 1H, NHCH, Ar), 7.60(d, J=7.5Hz, 2H, BENZOYL), 7.75(m, 1H, HN-hexyl), 7.90(m, 1H, HN-hexyl), 8.28(dd, J=17.7, 11.7Hz, 1H, 3(1)), 8.60(s, 1H, pteridine), 9.05(s, 1H, 20), 9.69(s, 1H, 5), 9.72(s, 1H, 10),As can be seen in FIG. 23, the NMR spectral results were as follows: -2.13 (brs, 1H, NH), -1.78 (brs, 1H, NH), 1.16-1.73 (m, 9H, 17 (1), hexyl), 1.61-1.63 (m, 6H, 8 (2), 18 (1)), 1.76-2.02 (m, 2H, glutamic), 2.08-2.23 (m, 4H, 17 (2), 17 (1) , glutamic), 2.68-2.74 (m, 1H, 17 (2)), 2.86-3.04 (m, 4H, NCH, hexyl), 3.23 (s, 3H, 2 (1)), 3.49 (s, 3H, 2 (1)), 3.51 (s, 3H, 12 (1)), 3.79 (m, 2H, 8 (1)), 4.25-4.31 (m, 1H, glutamic), 4.43 (m, 1H, 17), 4.44 (m, 2H, NCH, Ar), 4.54 (m, 1H, 18), 5.07 (d, J = 17.5 Hz, 1H, 15 (1)), 5.33 (m, 1H, 15 (1)), 6.14 ( d, J = 11.3 Hz, 1H, 3 (2)), 6.42 (d, J = 18.1 Hz, 1H, 3 (2)), 6.57 (d, J = 8.6 Hz, 2H, benzoyl), 6.88 (m, 1H, NHCH, Ar), 7.60 (d, J = 7.5 Hz, 2H, BENZOYL), 7.75 (m, 1H, HN-hexyl), 7.90 (m, 1H, HN-hexyl), 8.28 (dd, J = 17.7 , 11.7 Hz, 1H, 3 (1)), 8.60 (s, 1H, pteridine), 9.05 (s, 1H, 20), 9.69 (s, 1H, 5), 9.72 (s, 1H, 10),

11.38(s, 1H, OH)
11.38 (s, 1 H, OH)

실시예Example 10: 10: 광민감제들의Photosensitizer 시험관내In vitro 생물학적 효과 조사 Investigate biological effects

실시예 10-1: 본 발명 클로린 - 글루카민(N-methyl-d-glucamine)과 클로린 - PVP의 시험관 내 생물학적 효과 조사 Example 10-1: This invention chlorin-glucamine (N-methyl-d-glucamine ) and In Vitro Biological Effects of Chlorine - PVP

10-1.1 세포독성(10-1.1 cytotoxicity ( 항증식성Antiproliferative 분석) analysis)

세포의 증식 강도, 광민감제의 농도, 및 광학적 파워를 고려하여 세포 독성을 조사하였다. 이를 위해 단일층의 세포를 담은 3개의 75㎠ 세포 배양 플라스크가 사용되었다. 세포로는 자궁경부암 세포인 HeLa 종양 세포(ATCC에서 구입)의 단일층 배양물을 사용하였다.Cytotoxicity was investigated in consideration of cell proliferation intensity, photosensitizer concentration, and optical power . For this purpose, three 75 cm 2 cell culture flasks containing a single layer of cells were used. As a cell, a monolayer culture of HeLa tumor cells (purchased from ATCC), which is cervical cancer cells, was used.

HeLa 종양 세포의 배양액은 10% 우태아 혈청(Fetal Bovine Serum, Hyclone) 및 100 Units/㎖의 페니실린과 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신의 혼합액(Hyclone)을 첨가한 영양배지 RPMI- 1640 배지(Sigma-Aldrich) 내에서 성장시켰다.Cultures of HeLa tumor cells were supplemented with 10% fetal bovine serum (Fetal Bovine Serum, Hyclone) and 100 Units / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin (Hyclone). Aldrich).

플라스크 내에 세포 배양물을 접종(영양 배지 2.0 ㎖ 당 100,000 cells) 한 후 4일째에 광민감제를 최종농도가 각각 1, 2.5, 5.0, 7.5 및 10.0 mcg/㎖씩 첨가하였다.On day 4 after inoculating the cell culture in the flask (100,000 cells per 2.0 ml of nutrient medium), the photosensitizer was added at a final concentration of 1, 2.5, 5.0, 7.5 and 10.0 mcg / ml, respectively.

플라스크는 빛을 차단하기 위해 광-보호 커버로 싼 후 37℃에서 1 시간 동안 배양시켰다. 세포를 Hank's 용액(Sigma-Aldrich)을 이용하여 4회 세척하였다. 신선한 영양 배지 2.0 ㎖를 첨가하고 20-24 시간 후에 유효한 세포 단일층을 트립신 용액(GIBCO)으로 분산시키고, 헤마토사이토미터(H-1401, MARIENFELD)를 이용하여 살아있는 종양세포를 계수하였다.The flask was wrapped with a light-protective cover to block light and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Cells were washed four times using Hank's solution (Sigma-Aldrich). 2.0 ml of fresh nutrient medium was added and 20-24 hours later the effective cell monolayers were dispersed with trypsin solution (GIBCO) and live tumor cells were counted using a hematocytometer (H-1401, MARIENFELD).

도 25은 24시간 동안 배양 후, HeLa 세포의 수를 대조구에 대한 비율을 %로 나타내어 보여주고 있다. 세포 생존율은 약 85%가 넘는 생존율을 보이는 실험결과들을 통해 HeLa와 광활성 화합물인 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)과 클로린-PVP을 배양하더라도 광원 노출이 없는 경우에는 세포독성을 유발하지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.(도 25).
FIG. 25 shows the number of HeLa cells in% of the control after incubation for 24 hours. The cell survival rate was about 85%, and the results showed that cytotoxicity in the absence of light source was induced even if HeLa and the photoactive compounds chlorine-glucamine and chlorine-PVP were cultured. It was confirmed that not (Fig. 25).

10-1.2 클로린 - 글루카민(N-methyl-d-glucamine)과 클로린 - PVP 의 광독성 (광역학적인 활성) 분석 10 to 1.2 chlorine-glucamine (N-methyl-d-glucamine ) and Phototoxicity (photodynamic activity) analysis of chlorine - PVP

광민감제들의 광역학 효과를 조사하기 위해, 자궁경부암 세포인 HeLa 세포를 96 웰 플레이트(BD Falcon)에 이식 후 20~24시간 후에, 영양배지에 조사하고자 하는 광민감제 용액을 최종 농도가 2.5, 5.0 또는 10 mcg/㎖가 되도록 첨가하였다. 플라스크는 빛을 차단하기 위해 광-보호 커버로 싼 후 37℃에서 3 시간 동안 배양시켰다. 그 다음 Hank's 용액으로 세척한 후, 레이저 의료기기 "LD 680-2000"(파장 670-690 nm, LATUS 2.662.6, LATUS)를 이용하여 12.5 J/㎠(400㎽)의 조사량으로 조사되었다. 1시간 후에 세포 생존율을 측정하기 위해, 세포 증식 및 독성을 측정하는 방법인 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide, Sigma-Aldrich) 어쎄이를 시행하였다. MTT 어쎄이 시행 후, 마이크로 플레이트 리더기(ELx808, Bio-Tek)를 이용하여 샘플의 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 MTT 어쎄이을 통해 측정된 결과 값을 대조구에 대한 % 비율로 나타내었다. In order to investigate the photodynamic effects of the photosensitizers, 20 to 24 hours after transplanting HeLa cells, cervical cancer cells, into 96 well plates (BD Falcon), the final concentrations of the photosensitizer solutions to be examined in the nutrient medium were 2.5 and 5.0. Or 10 mcg / ml. The flask was wrapped with a light-protective cover to block light and then incubated at 37 ° C. for 3 hours. After washing with Hank's solution, it was irradiated with a laser dose of 12.5 J / cm 2 (400 Hz) using the laser medical device "LD 680-2000" (wavelength 670-690 nm, LATUS 2.662.6, LATUS). After 1 hour, MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma-Aldrich) assay was used to measure cell proliferation and toxicity. . After the MTT assay, the absorbance of the sample was measured using a micro plate reader (ELx808, Bio-Tek). Cell viability is expressed as a percentage of control relative to the results measured through the MTT assay.

도 26은 3시간 동안 광민감제로 배양시키고 12.5 J/㎠의 조사량으로 광노출을 추가로 시킨 다음 HeLa 세포의 증식 억제 정도를 대조구에 대한 비율를 %로 나타낸 것이다.FIG. 26 shows the percentage of inhibition of proliferation of HeLa cells as a percentage of the control group after incubation with a photosensitizer for 3 hours and additional light exposure at a dose of 12.5 J / cm 2.

광역학적 활성에 대한 분석으로 이의 높은 효율성을 확인할 수 있었다. 2.5 mcg/㎖의 농도에서 약 50%, 10mcg/㎖에선 약 25%까지 HeLa 세포의 증식을 억제하였다(도 26).
Analysis of photodynamic activity confirmed its high efficiency. At a concentration of 2.5 mcg / ml, the proliferation of HeLa cells was inhibited by about 50% and 10% at 25 mcg / ml (Fig. 26).

실시예 10-2: 수용성 클로린 e6 -엽산 화합물의 시험관 내 생물학적 효과 조사 Example 10-2 Water Soluble Chlorine In Vitro Biological Effects of e6 -Folic Acid Compounds

10-2.1 수용성 10-2.1 Water Soluble 클로린Chlorine e6e6 -엽산 화합물의 Of folic acid compounds 세포내Intracellular 축적 및 경쟁 분석 Accumulation and Competitive Analysis

광활성 화합물의 세포내 축적과 표적화된 운반은, 엽산수용체를 과발현하는 다수의 종양세포 타입 중 하나인 HeLa 세포를 이용하여 조사하였다.Intracellular accumulation and targeted delivery of photoactive compounds were investigated using HeLa cells, one of many tumor cell types that overexpress folate receptors.

세포를 3일간 엽산이 제거된 RPMI-1640 배지에서 배양하여 Hank's 용액/RPMI-1640 배지 (9/1)에 이식했다. 3시간 후에 트립신 용액을 이용하여 기질로부터 세포를 수집하여 Hank's 용액에 옮겼다(10⁵cells/㎖). 세포 현탁액에 클로린 e6-엽산 결합물을 2×10^-7 M/l의 농도로 첨가하고, 37℃에서 배양하였다. 1, 5, 10, 15, 24 시간 후에, 시료를 원심분리하고, 침전물을 차가운 Hank's 용액 내에서 세척한 후, 상기 침전물을 Hank's 용액에 초기 현탁액 내 세포 농도까지 넣었다. 얻어진 시료 내의 염 클로린 e6와 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 상대적 농도는 λ_σ=40 5 nm, λ_per=665 nm에서의 현탁액의 형광 세기로 측정하였다.Cells were cultured in RPMI-1640 medium without folic acid for 3 days and transplanted into Hank's solution / RPMI-1640 medium (9/1). After 3 hours cells were collected from the substrate using trypsin solution and transferred to Hank's solution (10 ⁵ cells / ml). Chlorine e6-folate conjugate was added to the cell suspension at a concentration of 2 × 10 ⁻⁷ M / l and incubated at 37 ° C. After 1, 5, 10, 15, 24 hours, the samples were centrifuged and the precipitate washed in cold Hank's solution, after which the precipitate was placed in Hank's solution to the cell concentration in the initial suspension. The relative concentrations of the salt chlorine e6 and the water-soluble chlorine e6-folate compound in the obtained sample were measured by the fluorescence intensity of the suspension at λ _σ = 40 5 nm and λ _per = 665 nm.

표 1에 HeLa 세포 내의 염 클로린 e6와 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 농도(상대적인 값 units/10⁴cl.)를 시간에 따라 측정한 값을 나타내었다. Table 1 shows the concentrations (relative values of units / 10 ⁴ cl.) Of salts of chlorine e6 and water-soluble chlorine e6-folate compounds in HeLa cells measured over time.

배양시간(hours)Incubation hours 염 salt 클로린Chlorine e6e6 수용성 receptivity 클로린Chlorine e6e6 -엽산 화합물Folic acid compounds 1 One 0.750.75 0.420.42 3 3 1.221.22 1.551.55 66 1.531.53 2.052.05 1212 1.791.79 5.455.45 1818 0.780.78 15.215.2 2424 0.420.42 17.017.0

상기 표 1을 통해, 염 클로린 e6와 수용성 클로린 e6-엽산 화합물 모두 세포에 축적됨을 알 수 있었다. 그러나, 축적의 동역학은 다르게 나타났다. 대부분의 염 클로린 e6가 6시간 이내에 세포에 축적되는 반면에, 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 축적은 18시간에 걸쳐 선형적으로 증가하였다.Through Table 1, it can be seen that both the salt chlorine e6 and the water-soluble chlorine e6-folate compound accumulate in the cells. However, the kinetics of accumulation differed. Most of the salt chlorine e6 accumulates in the cells within 6 hours, whereas the accumulation of soluble chlorine e6-folic acid compounds linearly increased over 18 hours.

3시간 배양한 후에, 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 축적 수치가 염 클로린 e6의 축적 수치보다 뚜렷하게 높게 나타났다(도 27).After 3 hours of incubation, the accumulation level of the water-soluble chlorine e6-folate compound was significantly higher than that of the salt chlorine e6 (FIG. 27).

24시간 노출한 후에 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 축적 수치는 염 클로린 e6의 축적 수치보다 평균적으로 10배 가량 높게 나타났다. 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 축적 수치가 24시간에 걸쳐 지속적으로 증가하였는데, 이는 비특이적인 세포 흡수 보다는 수용체-매개의 엔도시토시스를 통한 활발한 운반이 일어남을 시사하는 것이다.After 24 hours of exposure, the accumulation of water-soluble chlorine e6-folic acid compounds was on average 10-fold higher than that of salt chlorine e6. Accumulation of water-soluble chlorine e6-folic acid compounds increased continuously over 24 hours, suggesting that active transport through receptor-mediated endocytosis occurs rather than nonspecific cellular uptake.

외인성 엽산의 존재가 염 클로린 e6 와 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 HeLa 세포내의 축적에 미치는 영향을 조사하기 위해서, 엽산을 염 클로린 e6 와 수용성 클로린 e6-엽산 화합물 첨가 전에 4 μM/l의 농도로 세포 현탁액에 첨가한 후에 염 클로린 e6와 수용성 클로린 e6-엽산 화합물과 함께 24시간 동안 배양하였다. 이후 시료를 원심분리하고, 상층액을 수거하고 침전물을 차가운 Hank's 용액 내에서 다시 세척하였다. 수득된 두번째 침전물을 다시 Hank's 용액에 넣었다.To investigate the effect of the presence of exogenous folic acid on HeLa cell accumulation of salts chlorine e6 and water-soluble chlorine e6-folate compounds, folate was added to cells at a concentration of 4 μM / l before the addition of salts chlorine e6 and water-soluble chlorine e6-folic acid compounds. After addition to the suspension was incubated with the salt chlorine e6 and the water-soluble chlorine e6-folic acid compound for 24 hours. The sample was then centrifuged, the supernatant was collected and the precipitate was washed again in cold Hank's solution. The second precipitate obtained was put back into Hank's solution.

형광 세기를 측정하여 HeLa 세포 내 염 클로린 e6과 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 축적량을 비교하였다.Fluorescence intensity was measured to compare the accumulation of salt chlorine e6 and soluble chlorine e6-folate compounds in HeLa cells.

24시간 노출 후에, 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 축적량이 염 클로린 e6의 축적량보다 많았다. 도 28은 4 μM/l의 엽산이 HeLa 세포에서의 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 축적을 상당량 감소시켰음을 보여준다(p < 0.05). 반면에 엽산의 존재는 염 클로린 e6의 축적량에는 영향을 미치지 않았다. 사실상, 클로린 e6의 세포 내 축적은 배양 매질 내 길항적인 농도의 엽산의 존재에 의해 영향을 받지 않았다. 그러나, 길항적인 엽산의 존재 하에서 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 축적이 감소하더라도, 여전히 염 클로린 e6에 비해서는 우월한 것으로 나타났다. 이는 엽산의 존재가 또한 비특이적인 축적을 증가시킬 수 있음을 제시하는 것이다.
After 24 hours of exposure, the accumulation of water-soluble chlorine e6-folic acid compounds was greater than that of salt chlorine e6. 28 shows that 4 μM / l folic acid significantly reduced the accumulation of soluble chlorine e6-folic acid compounds in HeLa cells ( p < 0.05). On the other hand, the presence of folic acid did not affect the accumulation of salt chlorine e6. In fact, intracellular accumulation of chlorine e6 was not affected by the presence of antagonistic concentrations of folic acid in the culture medium. However, even though the accumulation of water-soluble chlorine e6-folic acid compounds in the presence of antagonistic folic acid is reduced, it still appears superior to the salt chlorine e6. This suggests that the presence of folic acid can also increase nonspecific accumulation.

10-2.2 세포독성(10-2.2 cytotoxicity ( 항증식성Antiproliferative 분석) analysis)

세포의 증식 강도, 광민감제의 농도, 및 광학적 파워를 고려하여 세포 독성을 조사하였다. 이를 위해 단일층의 세포를 담은 3개의 75 ㎠ 세포 배양 플라스크가 사용되었다. 세포로는 자궁경부암 세포인 HeLa종양 세포의 단일층 배양물을 사용하였다.Cytotoxicity was investigated in consideration of cell proliferation intensity, photosensitizer concentration, and optical power . For this purpose three 75 cm 2 cell culture flasks containing a single layer of cells were used. As a cell, a monolayer culture of HeLa tumor cells, cervical cancer cells, was used.

HeLa 종양 세포의 배양액은 10% 우태아 혈청 및 100 Units/㎖의 페니실린과 100 ㎍/㎖l의 스트렙토마이신을 첨가한 영양배지 RPMI-1640 배지 내에서 성장시켰다. 플라스크 내에 세포 배양물을 접종(영양 배지 2.0 ㎖ 당 100,000 cells) 한 후 4일째에 광민감제를 각각 0, 25, 50, 75, 100, 125 ㎍/㎖씩 첨가하였다.Cultures of HeLa tumor cells were grown in nutrient medium RPMI-1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum, 100 Units / ml penicillin and 100 μg / ml l streptomycin. After 4 days of inoculation of the cell culture into the flask (100,000 cells per 2.0 ml of nutrient medium), photosensitizers were added at 0, 25, 50, 75, 100, and 125 µg / ml, respectively.

플라스크는 빛을 차단하기 위해 광-보호 커버로 싼 후, 1시간 동안 37.5 ℃에서 배양하였다. 세포를 Hank's 용액을 이용하여 4회 세척하였다. 신선한 영양 배지 2.0 ㎖를 첨가하고, 20-24 시간 후에 헤마토사이토미터를 이용하여 종양세포를 계수하였다. The flask was wrapped with a light-protective cover to block light and then incubated at 37.5 ° C. for 1 hour. The cells were washed four times using Hank's solution. 2.0 ml of fresh nutrient medium was added and tumor cells were counted using a hematocytometer after 20-24 hours.

표 2는 24시간 동안 배양 후 HeLa세포의 수를 대조구에 대한 비율을 %값으로 보여주고 있다.Table 2 shows the percentage of HeLa cells after the incubation for 24 hours as a percentage of the control.

광민감제 농도(㎍/㎖)Photosensitizer concentration (µg / ml) 염 클로린 e6Salt chlorine e6 수용성 클로린 e6-엽산 화합물 Water Soluble Chlorine e6-Folic Acid Compound 00 100100 100100 1One 102.5102.5 104.5104.5 55 99.199.1 100.2100.2 1010 95.595.5 97.497.4 2525 92.092.0 95.695.6 5050 88.888.8 91.991.9 100100 85.485.4 87.887.8

상기 표 2를 통해 알 수 있듯이, 약 90%의 생존율을 보이는 실험결과을 통해 HeLa 세포와 광활성 화합물인 염 클로린 e6과 수용성 클로린 e6-엽산 화합물을 24시간 동안 배양하더라도 광원노출이 없는 경우에는 세포독성을 유발하지 않는다는 것을 확인할 수 있었다(도 29). 또한, 엽산을 첨가하더라도 클로린 e6에서 세포독성이 보이지 않는 성질이 변형되지 않았다.
As can be seen from Table 2, the experiment results showing a survival rate of about 90% through the experimental results showing HeLa cells and photoactive compounds salt chlorine e6 and water-soluble chlorine e6-folic acid compound for 24 hours, even if there is no light source exposure cytotoxicity It was confirmed that it does not cause (Fig. 29). In addition, the addition of folic acid did not modify the properties of cytotoxicity in chlorine e6.

10-2.3 염 클로린 e6 와 수용성 클로린 e6 -엽산 화합물의 광독성 (광역학적 활성) 분석 10 to 2.3 salt chlorin e6 and water soluble chlorine Phototoxicity (photodynamic activity ) analysis of e6 -folate compound

HeLa 세포 배양물에 대한 광민감제들의 광역학 효과를 조사하기 위해, 엽산이 제거된 배양액에 이식한 후 3일째에 되었을 때, 영양배지의 조사하고자 하는 광민감제 용액을 최종 농도가 0.1, 0.5, 1.0, 5.0 또는 10 ㎍/㎖가 되도록 첨가하였다. 플라스크들을 광 보호 커버로 싸고 37℃에서 3시간 동안 배양시켰다. 그 다음 Hank's 용액으로 세척한 후, 레이저 의료기기 "LD 680-2000"(파장 670-690 nm)를 이용하여 3.3 J/㎠의 조사량으로 조사되었다. 1시간 후, 세포 생존율을 측정하기 위해, 세포 증식 및 독성을 측정하는 방법인 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol -2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 어쎄이를 시행하였다. MTT 어쎄이 시행 후, 마이크로 플레이트 리더기를 이용하여 샘플의 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 MTT 어쎄이를 통해 측정된 결과값을 대조구에 대한 % 비율로 나타내었다. 표 3은 3 시간 동안 광민감제로 배양시키고 3.3 J/㎠의 조사량으로 광노출을 추가로 시킨 다음 HeLa 세포의 수를 대조구에 대한 비율을 %로 나타낸 것이다.To investigate the photodynamic effects of photosensitizers on HeLa cell cultures, at 3 days after transplantation into folic acid-free cultures, the photosensitizer solution to be examined in the nutrient medium had a final concentration of 0.1, 0.5, 1.0. , 5.0 or 10 μg / ml was added. The flasks were wrapped with a light protective cover and incubated at 37 ° C. for 3 hours. It was then washed with Hank's solution and irradiated at a dose of 3.3 J / cm 2 using a laser medical device "LD 680-2000" (wavelength 670-690 nm). After 1 hour, MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay, which measures cell proliferation and toxicity, was performed to measure cell viability. After the MTT assay, the absorbance of the sample was measured using a microplate reader. Cell viability is expressed as a percentage of control relative to the results measured via the MTT assay. Table 3 shows the ratio of HeLa cells as a percentage to the control after incubation with photosensitizer for 3 hours, additional light exposure at a dose of 3.3 J / cm 2.

광민감제 농도(㎍/㎖)Photosensitizer concentration (µg / ml) 염 클로린 e6 Salt chlorine e6 수용성 클로린 e6-엽산 화합물 Water Soluble Chlorine e6-Folic Acid Compound 0.10.1 88.088.0 65.165.1 0.50.5 82.082.0 40.340.3 1.01.0 64.164.1 10.610.6 5.05.0 2525 0.30.3 10.010.0 5.85.8 --

광역학적 활성에 대한 분석으로 이의 높은 효율성을 확인할 수 있었다. 5-10 mcg/㎖의 농도에서 수용성 클로린 e6-엽산 화합물은 HeLa 세포의 증식을 완전히 억제하였다.Analysis of photodynamic activity confirmed its high efficiency. Water soluble chlorine e6-folate compounds at a concentration of 5-10 mcg / ml completely inhibited the proliferation of HeLa cells.

다른 실험에서, 세포들은 광민감제와 함께 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 동일한 레이저기기인 "LD 680-2000"(파장 670-690 ㎚)를 이용하여 1.5-15 J/㎠의 조사량으로 조사되었다.In another experiment, cells were incubated with a photosensitizer at 37 ° C. for 24 hours and then irradiated at a dose of 1.5-15 J / cm 2 using the same laser instrument “LD 680-2000” (wavelength 670-690 nm). It became.

도 30은 농도에 다른 광민감제의 광독성을 실험한 것으로, 수용성 클로린 e6-엽산 화합물이 염 클로린 e6에 비해 낮은 농도에서도 광독성을 나타냄을 보여주었다.30 is a test of the phototoxicity of the different photosensitizers at concentrations, and showed that the water-soluble chlorine e6-folic acid compound exhibited phototoxicity even at a lower concentration than the salt chlorine e6.

본 실험은 클로린 e6의 광생물학적 활성이 엽산결합을 통해 향상되었음을 보여주었다. 따라서, 엽산 수용체를 과발현하는 HeLa 세포를 이용하여 24시간 동안 배양한 후에는 수용성 클로린 e6-엽산 화합물이 염 클로린 e6보다 평균적으로 10배 정도 많이 축적되었다. This experiment showed that the photobiological activity of chlorine e6 was enhanced through folate binding. Therefore, after 24 hours of incubation using HeLa cells overexpressing the folate receptor, water-soluble chlorine e6-folate compounds accumulated on average 10 times higher than the salt chlorine e6.

종양세포들은 정상세포와 비교해서 과발현하는 수용체의 수와 유형이 상당히 다르게 나타난다. 특정 수용체의 과발현 현상이 광민감제의 종양선택적 운반에 종종 이용된다. 엽산수용체를 과발현하는 HeLa 세포의 경우 엽산 표적 리간드(folate-targeting ligand)를 이용하게 된다.Tumor cells differ significantly in the number and type of receptors that overexpress compared to normal cells. Overexpression of certain receptors is often used for oncoselective delivery of photosensitizers. In the case of HeLa cells overexpressing folate receptors, folate-targeting ligands are used.

수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 HeLa 세포내의 축적은 엽산 특이적인 것이며 비결합 클로린 e6보다 훨씬 더 크게 이루어진다고 결론 내릴 수 있다.
It can be concluded that the accumulation of water-soluble chlorine e6-folate compounds in HeLa cells is folate specific and much greater than unbound chlorine e6.

Claims

Formula 1

(a) treating the acetone solution of chlorophyll-a with the strong base to remove phytol from chlorophyll-a to obtain a water-soluble chlorophyll-a derivative of the following Chemical Formula 2;
(b) treating the resultant of step (a) with a strong acid to adjust the pH to 6-9 to prepare a water-soluble chlorophyll a derivative of Formula 2;

(2)

(c) treating the solution of the water-soluble chlorophyll-a derivative of Formula 2 of step (b) with a strong acid to produce acid chlorine e6 of Formula 3; And
(3)

(D) a method for producing chlorine e6-glucamine of the formula (5) comprising the step of treating glucamine (N-methyl- d -glucamine) in the solution of the acid chlorine e6 of the formula (3) of the step (c).
Formula 5

The method of claim 1, wherein the glucamine is added to 2 equivalents (eq) of 1 equivalent (eq) of acid chlorine e6.

The method of claim 1, wherein the method further comprises the step of purifying the resultant by passing through the porous polyacrylamide beads.

A photodynamic therapy pharmaceutical composition for cancer comprising chlorine e6-glucamine of formula (5).