KR20120010861A - Ｐｌｇａ／ｐｃｌ 복합체를 포함하는 섬유상 매트의 제조방법 - Google Patents

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홍현진
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Abstract

본 발명에 따른 섬유상 매트의 제조방법은, PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid))와 THF(tetrahydrofuran)의 혼합용액을 제조하는 공정; PCL(polycaprolactone)과 MC(methylchloride)의 혼합용액을 제조하는 공정; 및 제조된 두 용액을 혼합하고 전기방사하여 섬유상 매트를 제조하는 공정을 포함하며, 상기섬유상 매트는 생체적합성과 기계적 특성이 우수하고, 조직공학용 생체재료로 다양하게 활용 가능하다.

Description

ＰＬＧＡ／ＰＣＬ 복합체를 포함하는 섬유상 매트의 제조방법{Preparation Method of Fibrous Mats comprising PLGA/PCL Complex}
본 발명은 전기방사된 공중합체 PLGA/PCL 복합체를 포함하는 전기방사된 섬유상 매트 및 그 제조방법에 관한 것이다.
조직공학은 생물학, 약학 및 공학을 포함하여 여러 분야에 걸쳐서 발전하고 있으며, 이들 분야는 조직의 재건, 유지 또는 강화 및 고기능화에 의해 향상되어 진보하고 있다. 진단분야에서 조직공학의 토대는 다양한 방법으로 살아있는 세포를 이용하는 기술에 기초하고 있다. 조직공학 연구는 다음을 포함한다: 생체재료, 세포, 분자생물학, 공학설계관점, 조직공학 정보학, 줄기세포연구 등. 현재의 새로운 생체재료는 생물체 성장 및 물리적, 화학적 신호 모두에 응답하는 기능성 조직 단계에서 세포의 차별화 단계까지 설계되었다. 조직공학 분야에서 세포의 연관성은 세포의 증식 및 차별성에 대한 모든 방법의 개발을 포함한다. 조직공학 설계시의 생체기계학적 관점은 천연조직, 요구되는 특성에 대한 최소한의 동일성, 조직공학을 조절하는 기계적 신호 및 효능, 조직공학의 효과 및 안전성을 포함한다.
　전기방사는 세포외 지지체와 같은 섬유상 매트의 제조에 대한 방법 중 가장 간단한 방법 중 하나이다. 전기방사는 마이크로미터에서 나노미터로의 기공 직경의 감소를 가능케한 이래로 생체고분자에 대한 새로운 방향을 제시하였으며 이로 인해 부피 또는 질량비에 대한 표면적의 증가 및 고분자의 기계적 특성을 현저하게 증가시켰다. 전기방사법의 장점은 나노미터에서 마이크로미터 단계의 매우 가는 섬유의 제조가 가능하며 넓은 표면적, 다양한 분야로의 활용 가능성, 우수한 기계적 특성 및 제조의 용이성으로 인해 다양한 조직공학 분야에서 시도되고 있다. 전기방사 지지체의 경우 충분한 기계적 특성을 가진다면 세포의 성장이 용이하다. 일반적으로, 섬유의 기계적 특성은 섬유의 내부직경이 감소할 때 증가한다. 전기방사 지지체는 현재 동맥에 적용되고 있으나, 기계적 내구성 및 생체적합성이 최적화되지 못하였다. 전기방사 생체고분자 지지체의 구조 및 특성은 조직공학에서 중요한 부분을 차지한다. 전기방사된 매트는 생체적합성이 우수하여야 하며, 이식 부위의 조직과 일치하는 기계적 특성 및 분해 또는 흡수가능한 생분해성이 요구된다.
또한, 상처치유는 피부의 재건 및 기능을 재정립하는 복잡한 과정이나 박테리아 과증식 및 감염은 이러한 상처치유 과정을 방해한다. 그러므로 인공 기지체는 상처치유 과정에서 미생물 감염을 막을 수 있도록 제조되어야 한다.
따라서, 본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
구체적으로 본 발명의 목적은 조직공학용 생체 재료로 적합한 섬유상 매트 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
이러한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 섬유상 매트의 제조방법은, PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid))와 THF(tetrahydrofuran)의 혼합용액을 제조하는 공정; PCL(polycaprolactone)과 MC(methylchloride)의 혼합용액을 제조하는 공정; 및 제조된 두 용액을 혼합하고 전기방사하여 섬유상 매트를 제조하는 공정을 포함한다. 본 발명에서 전기방사된 PLGA/PCL 매트는 저가의 합성 고분자인 PLGA를 이용하여 제조되었다. 또한, PCL(polycaprolactone)은 상대적으로 저가이며 재료의 처리 및 보관의 용이성으로 인하여 주재료로 사용되었다.
PCL은 PLGA의 취성 및 낮은 연장성을 극복할 수 있는 유연성을 가진 생체고분자이며, PLGA는 강한 친수성으로 인하여 PCL보다 세포 부착 및 증식이 유리하다. PCL은 소수성이므로 생리학적 활동을 하지 않으며 생물체와 접촉했을 때 세포 성장이 둔화되지만, 그럼에도 PCL 멤브레인은 상피 성장을 강화시킨다. 그러나, PCL에 대한 세포 유연은 낮은 친수성 및 표면 세포 인식 범위의 부재로 인하여 일반적으로 낮다. 본 발명의 복합체에서 사용된 PCL의 장점은 PCL이 조직공학 분야에서 매우 중요한 특성인 우수한 기계적 강도를 갖는다는 것이다. PLGA는 세포 부착 및 증식을 증가시키기 위하여 복합체에 첨가되었다.
또한, 전기방사된 매트의 특성은 적당한 세포외 기질 구조가 세포 부착, 증식, 분화가 용이하게 하고 생분해성 또는 생체적합성 재료로부터 제조된 조직이 실제 조직과 유사하며 내부연결된 기공들로 채워져있고 내부가 생리학적으로 요구하는 조건인 기계적 특성을 충족시킨다.
본 발명에 따른 섬유상 매트의 제조방법에서, PLGA와 PCL의 혼합비율은, 특별히 제한되지 않으나, 5~40:95~60 (v/v) 범위일 수 있으며, 구체적으로는 5~15:85~95, 15~25:85~75 또는 25~35:75~65 범위이며, 보다 구체적으로는 10:90, 20:80 또는 30:70 비율이다. PLGA와 PCL의 혼합비율에 따라, 제조된 섬유상 매트의 물리적, 생물학적 특성이 달라질 수 있다. 상기 범위의 혼합범위는, 섬유상 매트에 대한 세포 부착성 및 증식력을 높이고, 기계적 특성을 향상시키기 위한 것이다.
상기 PLGA와 PCL의 혼합비율에 따라, 제조된 섬유상 매트의 특성이 달라지며, 이는 섬유상 매트를 구성하는 섬유의 구조가 달라지기 때문이다. 일실시예에서, PLGA와 PCL의 혼합비율(v/v)이 5~15:85~95, 예를 들어 10:90인 경우에 섬유상 매트를 구성하는 섬유의 60% 이상의 직경은 400~600 nm이고,
PLGA와 PCL의 혼합비율(v/v)이 15~25:85~75, 예를 들어 20:80인 경우에 섬유상 매트를 구성하는 섬유의 60% 이상의 직경은 800~1200 nm이고,
PLGA와 PCL의 혼합비율(v/v)이 25~35:75~65, 예를 들어 30:70인 경우에 섬유상 매트를 구성하는 섬유의 50% 이상의 직경은 1800~2200 nm인 것으로 나타난다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 PLGA과 PCL 복합체를 포함하는 전기방사된 섬유상 매트를 제공한다. 상기 섬유상 매트는, 조직공학용 생체재료로 활용가능하며, 예를 들어 생체내 손상된 조직을 재건하기 위한 생체재료로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 PLGA과 PCL 복합체를 포함하는 섬유상 매트는, 생체적합성과 기계적 특성이 우수하고, 조직공학용 생체재료로 다양하게 활용 가능하다.
도 1은 PLGA와 PCL의 혼합비율(a): 10/90, b): 20/80, c): 30/70)을 달리한 PLGA/PCL 복합체의 SEM 분석사진 및 각 섬유의 평균직경을 분석한 결과이다.
도 2는 전기방사된 PLGA (a), PCL (b), PLGA/PCL(10/90) (c), (20/80) (d) 및 (30/70) (e)에 대한 FT-IR 측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 전기방사 매트의 인장강도 시편을 준비하기 위한 개략도이다.
도 4는 전기방사된 PCL (a), PLGA/PCL(10/90) (b), PLGA/PCL(20/80) (c), PLGA/PCL(30/70) (d)의 응력과 변형율 곡선; 및 PCL과 PLGA/PCL 복합체의 인장강도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 PLGA/PCL 비율에 따른 전기방사된 PLGA/PCL 섬유상 매트의 MTT 독성분석 결과이다.
도 6은 섬유아세포인 L-929 세포를 1 일 및 3 일 동안 착상시킨 후의 전기방사 PLGA/PCL의 세포 증식결과를 분석한 그래프이다.
도 7은 세포 착상 1 시간 후의 대조군 (a1, b1, c1), 합성 PLGA/PCL(10/90) (a2, a3), PLGA/PCL(20/80) (b2, b3) 및 PLGA/PCL(30/70) (c2, c3) 전기방사 매트의　세포 형태를 관찰한 SEM 이미지들이다.
도 8은 세포 착상 1 시간 후의 대조군 (a), 합성 PLGA/PCL(10/90) (b), PLGA/PCL(20/80) (c), PLGA/PCL(30/70) (d) 전기방사 매트에서 섬유아세포의 성장을 관찰한 SEM 이미지들이다.
도 9는 세포 착상 3 일 후의 합성 PLGA/PCL(10/90) (a1, a2, a3), PLGA/PCL(20/80) (b1, b2, b3), PLGA/PCL(30/70) (c1, c2, c3) 전기방사 매트에서 섬유아세포의 성장을 관찰한 SEM 이미지들이다.
이하, 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상술하지만, 하기 실시예 등은 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범주가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
초기 시작물질로 PLGA, PCL(polycaprolactone), THF(tetrahydrofuran), DMF(dimethylformamide) 및 MC(methylchloride)가 사용되었다.
먼저 10wt% PLGA를 THF에 용해하고, DMF (50:50) 및 12wt% PCL은 ME에 각각 용해시킨 후, 균일하게 분산될 때까지 하루 동안 배양하였다. 그런 다음, PLGA 용액을 PCL 혼합물에 a) 10:90, b) 20:80 및 c) 30:70의 비율(v/v)로 첨가하여 PLGA/PCL 혼합 용액을 준비하였다. 전기방사된 미세 섬유의 형태는 가압전압, 용액분출속도, 분출구 및 집전기 사이의 거리와 특히 농도를 포함한 고분자용액의 특성, 표면장력 및 용매의 형태와 같은 다양한 변수에 의하여 영향을 받는다. 그러나 고분자의 용해도는 균일한 전기방사 재료가 균일한 용해로부터 이루어지기 때문에 전기방사 재료는 공중합체 재료여야 한다. 본 발명에서 PLGA 및 PCL(10, 20, 30% PLGA)의 합성비율은 균일한 용액으로부터 분리되었으며, 혼합된 고분자는 균일한 공비혼합을 위해 상온에서 6 시간 동안 배양하였다. 각각의 PLGA/PCL 혼합 용액은 플라스틱 주사기 (lure-lock 형태, 12 ml)에 옮기고, 펌프의 노즐 게이지(25게이지, 내부직경 0.25mm)가 연결된 금속 주사바늘과 연결하여, 전기방사를 실시하였다. 전기방사된 PLGA/PCL 매트는 전기방사기(NNC-30kV-2mA 이동식, NanoNC, 한국)를 사용하여 제조된다. 각각의 고분자 섬유 매트의 제조를 위해 적용된 변수들은 다음과 같다: 전압 25kV, 거리 20㎝, 분출속도 0.5㎖/시 및 노즐 25G이다.
전기방사를 통해 제조된 고분자 섬유매트의 구조는 25 kV 가속전압의 주사전자현미경(SEM) (SM-65F, JEOL, 일본)을 통해 이미지화 하였다. SEM 관찰전에 전기방사 섬유매트를 1cm x 1cm의 크기로 절단하여 시편을 준비하고, 준비된 시편은 JEOL JFC-1200 미세 코팅기로 60 초간 금으로 코팅하였다. 전기방사 섬유매트에 함유된 섬유의 평균섬유직경은 Adobe Photoshop 5.0 소프트웨어를 이용하여 SEM 이미지로부터 측정하였다. 관찰된 SEM 이미지와, 평균섬유직경은 도 1에 나타내었다.
도 1을 참조하면, PLGA와 PCL을 각각 a) 10:90, b) 20:80 및 c) 30:70의 비율(v/v)로 혼합하여 제조한 섬유매트의 SEM 사진과 각각의 평균섬유직경을 확인할 수 있다. 각 시편들은 서로 다른 형태를 보인다. PLGA와 PCL를 10:90의 비율로 혼합한 a)의 경우에는, 섬유가 원통형이며 서로 겹쳐져 있다. 반대로 PLGA와 PCL를 20:80의 비율로 혼합한 b)는　원통형의 분리된 연속적 섬유를 보여준다. 그리고, PLGA의 농도가 30%인 c)의 섬유는 겹쳐져 서로 녹아있는 것이 확인되었다. 시편 형태는 PLGA과 PCL의 비율이 20:80인 경우에도 변화하는데, 섬유 직경의 60%이상이 500±100 ㎚ 정도를 나타낸다. PLGA와 PCL의 혼합비율이 10:90인 매트에서는 섬유 직경의 60% 이상이 1000±200 ㎚를 나타낸다. 마지막으로 PLGA와 PCL의 혼합비율이 30:70인 전기방사 섬유는 서로 겹쳐져 있으며 섬유직경의 50% 이상이 2000±200 ㎚을 나타내며 조대한 형태로 남아있다.
[실험예 1] FT-IR 측정
PLGA/PCL 전기방사 섬유를 확인하기 위해 각기 다른 PLGA/PCL 분율에 대하여 FT-IR 분석을 실시하였다. 전기방사된 PCL, PLGA 및 합성 PLGA/PCL 섬유매트는 퓨리에 변환 분광기(Spectrum GX, PerkinElmer, 미국)에 의해 특성화되었다. 시편의 적외선 스펙트럼이 4000~500 cm-1의 범위에 걸쳐 측정되었다. 모든 스펙트럼은 스펙트럼 범위내에서 4 cm-1의 분해능으로 64 번 스캔되었다. 분석 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2를 참조하면, FT-IR 분석 결과, 합성된 전기방사 매트가 PCL 및 PLGA의 모든 피크를 함유하고 있음을 나타내었다. 특히 PLGA/PCL 복합체의 피크는, PCL 피크로부터 분리되어 나타나는 865㎝-1 피크를 제외하고, 모든 PLGA 피크와 중첩된다. 이경우 PCL 피크가 깊지만 범위가 좁은 것에 반하여 PLGA 피크는 넓은 범위를 가지지만 깊이가 얕은 것으로 나타났다. 그러므로 합성된 PLGA/PCL 섬유매트의 넓은 PCL 범위로 사료된다. 도 2 또한 PCL 및 PLGA 사이에 어떠한 반응도 일어나지 않았음을 증명한다. 섬유는 단지 혼합되어 결합되었다. 합성 PLGA/PCL 전기방사 섬유 매트의 대부분의 피크는 PCL 피크와 중첩되며 쉽게 증명될 수 있지만 865㎝-1 피크는 PLGA가 존재함을 증명한다. 그러나 피크의 강도는 PLGA의 양이 증가함에 따라 증가한다. 위의 결과들은 합성 PLGA/PCL 전기방사 섬유상 매트가 성공적으로 제조되었음을 의미한다.
[실험예 2] 인장 강도의 측정
시편의 치수는 인장강도(두께 100㎛, 넓이 1㎜, 길이 27㎜) 측정 전 SEM 및 디지털 측정기에 의해 각각 측정되었다. 기계적 특성평가는 전기방사된 섬유 매트를 인장강도 측정기에 장착함에 의해 측정된다. 단일 고분자 나노섬유가 매우 약하기 때문에 결과적으로 섬유 매트는 매우 섬세하여 장착되는 동안 매트 표면이 접촉하게 되면 섬유가 손상을 입는다. 따라서 시편은 비슷한 고분자 농도에서 알루미늄 호일을 사용하여 집적되고 시편의 두께는 SEM을 이용하여 측정된다. 이러한 시편들은 측정후 절단하여 프레임에 접착하고 (도 3) 알루미늄 호일은 제거한다. 시편들은 다음의 과정에 의해 준비된다. 첫 번째로 흰 종이는 도 3과 같이 절단되고 시편 (1)은 한면의 위, 아래로 접착된다 (2). 양면테잎 (3)은 2 ㎜로 절단되고 고정 (4)은 로드-셀의 프레임부분을 제거하기 위하여 사용된다. 프레임은 섬유 매트의 윗변에 접착되고 수직선을 따라 직사각형 형태로 절단된다. 종이 프레임은 인장강도 측정 전에 절단된다.
PLGA 농도 변화에 따른 전기방사된 PLGA/PCL 섬유 매트의 인장강도는 PLGA의 양이 증가함에 따라 증가하였다. 그러나 응력은 PLGA의 양이 증가함에 따라 항상 증가하지 않는다. PCL(도 4의 (a)) 및 PLGA/PCL(10/90) (도 4의 (b))의 경우에는 응력이 1.8±0.05 MPa에서 2.5±0.05 MPa까지 증가하며 변형률은 130±5(%)에서 1.34±5(%)까지 증가하였다. 그러나 이러한 변화는 PLGA 농도가 10% (PLGA/PCL (10/90)) (도 4의 (b))에서 20%(PLGA/PCL (20/80)) (도 4의 (c))까지 증가할때는 관찰되지 않았다. 이때 응력은 2.5±0.5 MPa에서 6.1±0.5 MPa까지 증가하지만, 변형률은 134±5(%)에서 88±5(%)까지 감소한다. PLGA의 농도가 20% (PLGA/PCL (20/80)) (도 4의 (c))에서 30% (PLGA/PCL (30/70)) (도 4의 (d))까지 증가할 때, 응력은 갑자기 6.1±0.5 MPa에서 3.8±0.5 MPa, 그리고 변형률이 88±5(%)에서 59±5(%)로 각각 감소되었다.
인장강도의 변화는 도 4의 우측 상단에 표시된 그래프로 확인할 수 있으며, 응력과 변형률 사이의 관계에 대하여 좀 더 명확하게 설명된다. 도 4의 (d)에서 보여지듯이 응력 및 변형률은 PLGA의 양이 높더라도 낮지 않다는 것을 보여준다. 이러한 결과들은 전기방사된 30% PLGA 섬유가 PLGA/PCL (20/80) 및 PLGA/PCL(10/90) 섬유들처럼 미세하지 않다는 것을 의미한다. 게다가 PLGA는 매우 취성이 강한 재료이며 응력이 증가하면 쉽게 부러질 수 있다. 이러한 이유로 전기방사된 PLGA/PCL 매트의 기계적 특성은 PLGA의 양이 증가함에 따라 증가한다. 위의 결과를 기초로 하여 PLGA/PCL 섬유의 응력은 PLGA의 량 및 전기방사된 섬유의 균일성에 영향을 받는다. 왜냐하면 전기방사된 PLGA/PCL(30/90) 섬유는 서로 뭉쳐있으며 복합체가 균일하지 않고 응력은 PLGA/PCL(20/80) 섬유보다 더 낮다. 10 wt%의 PLGA를 함유한 공중합체 매트는 PLGA를 함유하지 않은 복합체보다 더 높은 변형률 값을 가진다. 응력-변형률 결과는 PCL이 유연한 고분자이며 취성을 가진 PLGA(유연하지 않은)에 소량 첨가될 때 기계적 특성이 증가한다는 것을 나타낸다.
[실험예 3] 세포독성평가
PLGA/PCL 나노섬유 매트의 독성은 MTT 분석을 통해 정량적으로 평가하였다. 다양한 희석추출(0%, 25%, 50%, 75%, 100%)에서 3 일 동안 세포를 배양시킨 후 L-929 세포의 증식을, MTT 분석을 통해 측정하였다. 대조군의 경우에는 배양된 세포를 포함하는 희석물을 첨가하지 않았다. 측정 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5를 참조하면, 합성 전기방사 PLGA/PCL 나노섬유 매트를 포함하는 희석물은, 대조군과 비교하여, 세포대사가 억제되지 않았다. 합성 전기방사 PLGA/PCL 나노 섬유상의 세포대사는 PLGA의 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 정략적 값에 기초하여 나노섬유 매트의 희석물은 도 5에서 보여지듯이 어떠한 독성도 나타내지 않았다. 게다가 세포사 또는 형태상 변형도 배양기간 동안 관찰되지 않았다. 따라서 PLGA/PCL 나노섬유상 매트는 잔여 용매의 존재로 인한 어떠한 독성도 나타내지 않았다.
[실험예 4] 세포 증식 평가
합성 전기방사 PLGA/PCL 섬유상 매트에서의 조골세포의 증식은 mitochondrial succinate dehydrogenase in complex II (succinate-ubiquinone 산화 환원 요소 복합체)에 의해 MTT에서 포마잔의 감소에 의해 조사하였다. 포마잔 내의 MTT의 감소 레벨은 세포대사에 투영된다.
도 6은 각기 다른 PLGA 농도로 제조된 합성 PLGA/PCL 나노섬유 매트의 포마잔 흡광도를 비교하였다. 생체모방형 조직은 PLGA/PCL 나노섬유 매트상에 형성되었고 세포 생존률 및 증식에 영향을 미친다. PLGA/PCL (90/10) 공중합체 섬유 매트의 세포 부착 및 증식은　1일과 3일 사이에 배가 된다. 게다가 흡광도 값은 세포부착 및 증식이 PLGA/PCL 복합체에서 PLGA 농도가 증가함에 따라 증가함을 보여준다. 그러나 PLGA/PCL (20/80) 및 PLGA/PCL(30/70) 사이에서 약간의 증가가 발견되었다. 결과에 따르면 전기방사된 PLGA/PCL (20/80)은 PLGA/PCL(30/70) 및 PLGA/PCL(10/90) (도 6)과 비교할 때 ECM 형성에 지대한 영향을 미침을 확인하였다.
[실험예 5] 전기방사된 섬유상 매트에 증식된 세포형태 관찰
세포 형태는 모든 PLGA/PCL 합성 멤브레인의 생체적합성을 연속적으로 분석하면서 조사하였다. 분석 결과는 도 7에 나타내었다. 도 7에서 a1, b1 및 c1은 대조군이며, a2 및 a3는 PLGA/PCL (10/90), b2 및 b3는 PLGA/PCL (20/80), 그리고 c2 및 c3는 PLGA/PCL (30/70)를 혼합하여 제조한 전기방사된 섬유상 매트에 대한 관찰 결과이다.
도 7은 조직 배양 플레이트 (TCPs) (도 7의 a1-a3)에 1 시간 동안 세포를 착상한 후 하나의 조골세포 L-929의 형태를 보여준다. 도 7의 b2 및 b3가 PLGA/PCL (20/80) 전기방사 매트의 세포 부착 이미지를 보여주는데 반하여, 도 7의 a2 및 a3는 PLGA/PCL (10/90)의 세포 부착 이미지를 보여준다. 마지막으로, 도 7의 c2 및 c3는 PLGA/PCL (30/70) 전기방사 매트의 세포부착 이미지를 보여준다. 대조군과 다른 조건의 필로포디움(filopodium) 및 라멜리포디움(lamellipodium)의 비교에 의해 필로포디움과 라멜리포디움의 성장이 대조군만큼 우수하다는 것을 확인하였다. 그러나, 도 7의 a2, b2 및 c2의 비교에 의해 필로포디움 및 라멜리포디움의 성장은 PLGA의 양이 증가함에 따라 증가함을 확인하였다. 한편, 확대 이미지(도 7의 a3, b3 및 c3)에서 L-929 세포는 PLGA/PCL 섬유에 우수한 부착성을 보여준다. 따라서, PLGA/PCL 전기방사 섬유상은 생체재료에 적합한 우수한 생체적합성을 보여준다.
[실험예 6] 세포 증식 평가
PLGA/PCL 전기방사 섬유상 매트의 세포 증식을 평가하기 위하여 세포는 동일한 밀도로 착상되었으며 각기 다른 기간 동안 배양되었다. 도 8은 착상 1 일 후의 세포 증식을 보여주고 도 9는 착상 3 일 후의 세포 증식을 보여준다. 세포 착상 1 일 및 3 일 후 세포는 지지체 전반에 걸쳐 분포한다.
도 8에서 조골세포는 착상 1 일 후 TCP 및 PLGA/PCL 섬유상 매트에 분포한다. 이러한 결과는 모든 PLGA/PCL 전기방사 매트에 착상된 쥐 조골세포 L-929의 세포 부착 및 증식을 나타낸다. 그러나, 시편 도 8의 b)~d)의 세포증식은 표면에서의 세포부착을 나타내는 라멜로포디아(lamellopodia)의 발달을 증거로 TCP 표면 도 8의 a)보다 더 명확하다. 게다가 착상 1 일 후 세포는 우수하게 성장했으며, 균일하고 넓게 분포하였고 대조군과 유사한 생체재료의 표면을 덮고 있다. 라멜로포디아의 존재 및 교차된 섬유상 연결구조는 세포 부착이 매우 우수함을 나타낸다. 세포 퍼짐은 PLGA 농도가 증가할 때, 도 8의 b), c) 및 d)와 같이, PLGA/PCL 전기방사 매트에서 증가함을 나타낸다.
3 일 후 (도 9) 세포는 완벽하게 전기방사 매트를 덮고 있다. 표면의 세포 증식 및 부착을 확인하기 위하여 각기 다른 배율에서 관찰하였다. 가장 높은 배율(도 9의 a3, b3 및 c3)에서 세포 증식은 PLGA 농도가 최고일 때로 증가한다. 게다가 세포 부착은 PLGA/PCL (30/70) 전기방사 섬유상 매트상에서 좀 더 명확하게 관찰된다. 배양시간이 3 일 일지라도 조골세포의 형태는 원형에서 길쭉한 형태 (도 9 의 a3, b3 및 c3])으로 변화하였다. 이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 전기방사 PLGA/PCL 공중합체는 조직공학 분야에 있어 우수한 복합체임을 확인하였다.
본 발명에서 생체재료 및 조직공학 적용을 위한 새로운 전기방사 PLGA/PCL 조성을 제조하였다. PLGA/PCL 전기방사 매트는 각기 다른 PLGA 및 PCL 비율에서 단일 PLGA/PCL 조성의 결합에 의해 제조되었다. 구체적으로는, 각기 다른 비율의 PLGA와 결합된 PCL은 PLGA/PCL 전기방사 섬유상 매트의 제조를 위해 결합되었으며, PLGA/PCL 합성의 최대 PLGA 농도는 30%까지 사용되었다. 도 1의 SEM 이미지를 통해, PLGA 농도가 미세한 PLGA/PCL 섬유 매트를 제조하는 데에 매우 중요하다는 것을 보여준다. PLGA/PCL 전기방사 섬유 (10/90)은 매우 조대하며 기계적 강도가 PLGA를 포함하지 않은 복합체보다 훨씬 높음을 보여준다. 그러나 20% PLGA일 때 PLGA/PCL 전기방사 매트는 매우 미세하고 조대하며, 원통형의 균일한 섬유를 가지며, 이 조성에서 전기방사매트의 응력은 높지만 변형률은 PLGA/PCL (10/90) 전기방사 매트와 비교할 때 낮다. PLGA/PCL (30/70) 복합체에서 고농도의 PLGA는 열에 의한 용해를 변화시키며 합성 용액에 영향을 미치고 결과적으로 섬유의 조대화를 이룬다. PLGA/PCL (30/70) 전기방사 매트의 형태는 PLGA/PCL (20/80) 전기방사 매트보다 낮은 기계적 강도는 나타내는 데에 대한 중요한 열쇠이다. 본 발명에서 PCL 전기방사 매트는 DMF/MC(80/20) 용액의 PCL로부터 제조되었으며 유사한 응력을 가지나 낮은 변형율(130%)을 가진다. PLGA/PCL (20/80) 전기방사 매트는 이러한 섬유상 매트가 균일하고 직경이 작으며 전기방사의 기계적 특성의 중요한 요소인 가장 우수한 기계적 강도 및 계수강도를 가진다. FT-IR 곡선은 PLGA/PCL 전기방사 매트가 865 ㎝-1의 존재에 의해 PLGA/PCL 합성으로 성공적으로 제조되었음을 나타낸다. PLGA/PCL 전기방사 매트는 모든 조성에서 비독성임을 나타낸다(도 5). 게다가 조골세포의 세포 증식은 MTT 결과를 통하여 1 일 및 3 일 사이에 두배로 증식한다(도 6). 한편 세포는 PLGA/PCL 전기방사 매트에 60 분 내에 부착된다(도 7). SEM 이미지는 전기방사 매트상의 필로포디움 및 라멜리포디움의 성장이 대조군만큼 우수함을 보여준다. 그러나, 세포증식 및 부착은 PLGA/PCL 전기방사된 매트의 PLGA 농도가 세포 착상 1 일(도 8) 및 3 일(도 9) 후 증가함에 따라 우수함을 보여준다. 이러한 결과는 PLGA/PCL 전기방사 매트의 PLGA의 존재는 생체적합성, 세포부착 및 증식을 향상시킴을 나타낸다.

Claims (6)

  1. PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid))와 THF(tetrahydrofuran)의 혼합용액을 제조하는 공정;
    PCL(polycaprolactone)과 MC(methylchloride)의 혼합용액을 제조하는 공정; 및
    제조된 두 용액을 혼합하고 전기방사하여 섬유상 매트를 제조하는 공정을 포함하는 PLGA과 PCL 복합체 함유 섬유상 매트의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    PLGA와 PCL의 혼합비율은 5~40:95~60인 PLGA과 PCL 복합체 함유 섬유상 매트의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    PLGA와 PCL의 혼합비율(v/v)은 10:90, 20:80 또는 30:70인 PLGA과 PCL 복합체 함유 섬유상 매트의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    PLGA와 PCL의 혼합비율(v/v)이 5~15:85~95인 경우에, 섬유상 매트를 구성하는 섬유의 60% 이상의 직경은 400~600 nm이고,
    PLGA와 PCL의 혼합비율(v/v)이 15~25:85~75인 경우에, 섬유상 매트를 구성하는 섬유의 60% 이상의 직경은 800~1200 nm이고,
    PLGA와 PCL의 혼합비율(v/v)이 25~35:75~65인 경우에, 섬유상 매트를 구성하는 섬유의 50% 이상의 직경은 1800~2200 nm인 PLGA과 PCL 복합체 함유 섬유상 매트의 제조방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 PLGA과 PCL 복합체 함유 섬유상 매트.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 섬유상 매트는 조직재건을 위한 생체재료인 PLGA과 PCL 복합체 함유 섬유상 매트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111035809A (zh) * 2019-12-04 2020-04-21 中山大学 一种具备三维形变结构的双层复合纳米纤维膜及其制备方法和应用
KR20220096759A (ko) * 2020-12-31 2022-07-07 단국대학교 산학협력단 생체 적합성 구조물의 제조 방법

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