KR20110140066A

KR20110140066A - Ｐｎａ 기반의 실시간 ｐｃｒ 클램핑을 이용한 마이크로ｒｎａ 발현양상의 분석 방법 및 키트

Info

Publication number: KR20110140066A
Application number: KR1020100060265A
Authority: KR
Inventors: 박희경; 최재진; 김현선
Original assignee: 주식회사 파나진
Priority date: 2010-06-24
Filing date: 2010-06-24
Publication date: 2011-12-30
Also published as: KR101822609B1

Abstract

본 발명은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 마이크로RNA(microRNA, miRNA) 발현양상의 분석 방법 및 키트에 관한 것으로, 본 발명에 따른 miRNA 발현양상의 분석 방법은 세포 증식, 분화 및 사멸, 지방 대사 조절 등에서 중요한 역할을 하는 miRNA의 발현양상 및 특정 기작을 밝히는데 있어, 유사한 염기서열을 가지고 있는 miRNA 아형들의 정확한 구분을 가능케 함으로써 miRNA 연구나 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＰＮＡ 기반의 실시간 ＰＣＲ 클램핑을 이용한 마이크로ＲＮＡ 발현양상의 분석 방법 및 키트{Methods and kits for expression profiling of microRNA using PNA mediated Real-Time PCR clamping}

본 발명은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 마이크로RNA 발현양상의 분석 방법 및 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 암 발생과 밀접한 관련이 있는 miRNA 및 유사 염기서열을 가지고 있어 분리가 필요한 특정 miRNA에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브, 이를 이용한 유사염기서열을 가진 miRNA 발현양상의 분석 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.

마이크로RNA(miRNA)는 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 21-25 뉴클레오타이드의 단일쇄(single-stranded) RNA 분자로서, 특정 유전자의 mRNA 3' 비번역 부위(untranslated region, UTR)에 결합하여 유전자의 번역과정을 제어하는 조절물질이다. miRNA는 1993년 캐노랍디티스 엘레강스(Caenorhabditis elegans)에서 발생시기를 조절하는 일부 유전자가 밝혀져 주목 받기 시작했는데, 이들 중 let-7과 lin-4는 단백질을 생산하지 않는 작은 RNA 조각(non-coding RNA)으로 밝혀졌다. 상기 RNA들은 특정 발생단계에서 발현되어 발생을 조절한다고 하여 stRNA(small temporal RNA)라고 명명되었다. 이들 miRNA는 표적분자의 스위치 오프를 유도하여 세포발달을 조절하는 프로그램을 일시적으로 조절하는데 결정적인 역할을 한다. 최근 수백개의 miRNA가 밝혀졌고 연충과 파리, 인간의 게놈에서 세포 성장, 분화 및 사멸을 조절하는 것으로 보인다. 인간 유전자에서만도 700개가 넘는 miRNA가 밝혀졌다( Nucleic Acids Res. 2006, 34: D140-144).

miRNA 생합성은 RNA 폴리머레이즈Ⅱ에 의한 전사를 통해 개시되며, 두 단계의 과정으로 생성되는데, 최초의 miRNA 전사체(primary miRNA/pri-miRNA)가 핵 내에서 드로샤(Drosha)라는 RNaseⅢ 타입 효소에 의해 70-90 뉴클레오타이드 정도의 스템-루프(stem-loop) 구조의 프리-miRNA(pre-miRNA)로 만들어지고, 이후 프리-miRNA는 세포질로 이동하여 다이서(Dicer)라는 효소에 의해 절단되어 21-25 뉴클레오타이드의 성숙 마이크로RNA(mature microRNA)로 만들어진다. 일부 miRNA의 염기서열은 종간의 보존도가 매우 높아 중요한 생명현상에 관여할 것이라고 예상되어 많이 연구들이 이루어지고 있다. 최근까지 많은 연구진들에 의해 miRNA가 암세포와 줄기세포(stem cell)에서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 세포 증식, 분화 및 사멸, 지방 대사 조절 등에서 중요한 작용을 하는 것으로 밝혀졌다.

그러나 아직까지 miRNA의 많은 기능이 밝혀지지 않고 있어 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 세포 내에는 수천개의 작은 RNA 단편들이 존재한다. miRNA는 그 중 한 종류이며 이러한 miRNA 발현양상 분석을 통해 특정 질병이나 암에 밀접한 관련이 있는 miRNA를 발굴하고, 발굴된 miRNA는 바이오마커로서 질병을 진단하고 예측하는 용도로 사용 가능하다(Seminars in cancer biology 2008, 18: 89-102). 그러므로 miRNA의 발현양상을 분석하는 것은 매우 중요하다.

현재 miRNA의 발현 분석을 위해 많은 실험 기법들이 개발되고 있으며, 주로 노던 블랏(Northern blot), 다양한 miRNA의 발현양상을 동시에 분석하기 위한 마이크로어레이(microarray) 칩이 개발되어 사용되고 있다(Nucleic Acids Res. 2003, 31(17): 4973-4980). DNA 칩은 고체 표면 위에 기지(旣知)의 유전정보를 기반으로 설계된 DNA 또는 PNA 프로브들을 고밀도로 고정시킨 칩으로서, 칩 상에서 분석하고자 하는 표적핵산과의 혼성화 반응을 형광으로 표지하여 검출하는 방법이다. miRNA 마이크로어레이 기법은 동시에 많은 세포나 조직으로부터 특이적으로 발현하는 miRNA를 분석할 수 있어 DNA 칩을 이용하면 1회의 실험으로 다양한 유전정보를 분석할 수 있으므로 miRNA 발현양상 연구에 유용하다 (Gynecologic Oncol. 2006, 100: 38-43; Nucleic Acids Res. 2007, 35(7): e48). 상기한 miRNA 마이크로어레이 기법으로 다양한 샘플의 발현양상을 비교분석하고, 보다 정확한 진단, 연구 및 발현조사를 위하여 어레이에서 발현양상의 변화가 있는 miRNA의 발현양 및 발현양상을 한번 더 확인하거나 많은 종류의 샘플 분석을 위하여 microRNA real-time PCR 기술이 많이 사용되고 있다(Fertil Steril. 2008, 89(6): 1771-1776).

현재 상용화 되어 있는 miRNA 발현 분석을 위한 실시간 PCR 방법 들은 통상 형광시약을 사용하게 된다. 형광을 측정하는 방법에는 크게 인터컬레이팅(intercalating)법, TaqMan^TMLNA법, 분자 비컨(Molecular Beacon)법을 이용하고 있다(Nucleic Acids Res. 2007, 35(19): e127; Nucleic Acids Symp Ser. 1997, 37: 255-256; Clin Chem Lab Med. 2003, 41(4): 468-474.). 상기 방법들을 이용하기 전에 miRNA 특성상 일련의 과정들이 추가적으로 필요하다. 우선 miRNA는 20-25nt로 짧아 그 자체로는 PCR이 되지 않기 때문에 추가적인 프라이머를 사용하여 cDNA로 합성하는 역전사 과정과 함께 길이를 늘려주는 과정도 필요하다. 위의 두 과정을 같은 단계에서 수행하는 경우와 나누어 수행하는 경우가 있다(Nucleic Acids Res. 2005, 33(20): e179).

두 단계로 나누어 수행하는 경우는 miRNA 3’말단에 중합효소를 이용해 염기서열 A를 연쇄반응 시켜 길이를 늘리는 것이 첫 단계이며, 이어서 역전사 효소를 이용해 cDNA를 만들어 주는 것이 두 번째 단계이다. cDNA를 가지고 특정 miRNA에 대한 forword primer와 universal reverse primer를 이용해 실시간 PCR로 발현을 분석한다. 이러한 방법을 이용하는 경우 인터컬레이팅 방법을 이용해 형광을 측정한다(Nucleic Acids Res. 2007, 35(19): e127).

miRNA의 길이 보완과 cDNA 합성을 같은 단계에서 수행하는 경우는 특정 miRNA마다 다른 역전사 primer를 이용하여 cDNA를 합성한다. 이때 이용되는 역전사 primer는 Pre-miRNA의 루프 구조를 포함하고 있기 때문에 miRNA의 길이 보완을 함께 할 수 있고, 특정 miRNA의 cDNA만을 선택적으로 합성한다. 이어서 진행되는 실시간 PCR과정에서 cDNA를 증폭시키는데 이용하는 forword primer와 reverse primer 모두 특정 miRNA에 특이적이라는 것도 universal reverse primer를 이용하는 앞선 방법과는 다른 점이다. 그렇기 때문에 universal reverse primer를 이용한 방법보다는 좀 더 높은 특이성을 나타내며 이 방법의 경우 TaqMan^TM프로브법을 이용하여 형광을 측정한다(Nucleic Acids Symp Ser. 1997, 37: 255-256).

이러한 real-time PCR 기술은 현재까지의 기술수준에서 가장 효율적인 miRNA 분석 및 진단 방법으로 알려져 있으나, 여전히 miRNA의 발현양상을 확인하는데 있어 miRNA 아형(single nucleotide different)이나 돌연변이 등 한 개의 염기서열의 변이를 구별하기가 어려운 단점이 있다(Nucleic Acids Res. 2008, 36(5): e27).

한편, PNA는 핵산염기가 인산 결합이 아니라 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 처음 보고되었고(Science. 1991, 254: 1497-1500), 화학적인 방법으로 합성되고 자연계에서는 발견되지 않으며 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 겹 가닥을 형성한다. 핵산 염기의 수가 같은 경우 PNA/DNA 겹 가닥은 DNA/DNA 겹 가닥보다, PNA/RNA 겹 가닥은 DNA/RNA 겹 가닥보다 안정하다. PNA의 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이고, 이 경우 펩티드 핵산의 기본 골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본 골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산 염기는 DNA의 핵산 염기와 비슷한 공간을 차지하고 핵산 염기 사이의 거리도 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다. PNA는 또한 전기적으로 중성이기 때문에 PNA/DNA, PNA/RNA 겹 가닥의 안정성은 염 농도에 영향을 받지 않는다. 이러한 성질 때문에 PNA는 상보적인 핵산 염기 서열을 천연 핵산보다 더 잘 인식할 수 있어서 진단 또는 다른 생물학적, 의학적 목적으로 응용된다.

PNA 클램핑 기술은 상기한 PNA의 장점을 이용하여 PNA 프로브가 완벽하게 결합되면 효소 등이 인지하지 못하여 증폭반응이 일어나지 않고, 프로브에 상보적이지 않은 서열이 있는 경우에는 PNA 프로브가 완벽하게 결합하지 못하기 때문에 증폭반응이 일어나게 되는 원리를 이용하는 방법으로, miRNA의 발현 양상을 빠르고 정확하게 분석할 수 있다.

이에 본 발명자들은 종래 기술보다 정확하게 miRNA의 유사 염기서열의 발현패턴을 정확하게 분석하기 위하여 miRNA의 10a, 10b, 181a, 181b, 181c, 181d, 18a, 18b, 196a, 196b miRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 PNA 프로브를 설계하고, 상기 PNA 프로브를 이용함으로써 높은 민감도와 특이도로 miRNA 유사 염기서열의 발현패턴을 정확하게 분석할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 miRNA 발현양상의 분석 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 miRNA 발현양상을 분석하는 방법에 사용하기 위한 분석 키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제1면은

(1) 검출대상의 전체 RNA 또는 표적 마이크로RNA(microRNA, miRNA)로부터 cDNA를 합성하는 단계;

(2) 상기 cDNA를 특정 miRNA의 클램핑 프라이머 세트 및 miRNA의 아형(single nucleotide different)과 완벽하게 결합할 수 있고, 상기 miRNA의 아형간에 상이한 염기서열을 포함하는 부위와 특이적으로 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브의 존재 하에, miRNA 에 대해 실시간 PCR(real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계; 및

(3) 상기 실시간 PCR에 의한 결과를 분석하여 miRNA 발현을 확인하는 단계:

를 포함하는, miRNA 발현양상을 분석하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제2면은

서열번호 1 내지 64로부터 선택되는 어느 하나의 PNA 클램핑 프로브를 포함하는, 본 발명에 따른 miRNA 발현양상을 분석하는 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.

본 발명에 따른 PNA 프로브는 생물학적 효소 및 물리적인 요소에 매우 안정하고 분석하는 방법이 매우 간단하며 단시간 내에 발현의 분석이 이루어지므로, 대량 분석 및 임상에서 사용하기에 매우 용이하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 miRNA 발현양상의 분석 방법은 세포 증식, 분화 및 사멸, 지방 대사 조절 등에서 중요한 역할을 하는 miRNA의 발현양상 및 특정 기작을 밝히는 데 있어, 유사한 염기서열을 가지고 있는 miRNA 아형들의 정확한 구분을 가능케 함으로써 miRNA 연구나 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 miRNA 발현양상을 확인하기 위한 PNA 클램핑 프로브를 이용한 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑 원리를 나타내는 모식도이고,
(A: cDNA상에서 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑 원리, B: miRNA 에서 cDNA 합성 시 PNA기반의 실시간 PCR 클램핑 원리)
도 2는 hsa-miR-18a, hsa-miR-10a, hsa-miR-10b, hsa-miR-196a 및 hsa-miR-196b miRNA의 아형에 대한 기존 방법과 본 발명의 miRNA 발현양상 검출 특이도(△C_t)를 비교한 그래프이며.
도 3은 본 발명에 따른 PNA 클램핑 프로브를 이용하여 miRNA 발현양상의 검출 특이도 (△Ct) 를 비교한 그래프이고.
도 4는 Target hsa-miR-10b와 혼합된 hsa-miR-10a miRNA의 아형 농도에 따른 miRNA 발현을 기존 방법과 본 발명의 miRNA 발현양상 검출 특이도(△C_t)를 비교한 그래프이며,
도 5는 Target hsa-miR-10a와 혼합된 hsa-miR-10b miRNA의 아형 농도에 따른 miRNA 발현을 기존 방법과 본 발명의 miRNA 발현양상 검출 특이도(△C_t)를 비교한 그래프이고,
도 6는 Target hsa-miR-18b와 혼합된 hsa-miR-18a의 miRNA의 아형 농도에 따른 miRNA 발현을 기존 방법과 본 발명의 miRNA 발현양상 검출 특이도(△C_t)를 비교한 그래프이며,
도 7은 Target hsa-miR-18a와 혼합된 hsa-miR-18b의 miRNA의 아형 농도에 따른 miRNA 발현을 기존 방법과 본 발명의 miRNA 발현양상 검출 특이도(△C_t)를 비교한 그래프이고,
도 8은 Target hsa-miR-181b와 혼합된 hsa-miR-181a의 miRNA의 아형 농도에 따른 miRNA 발현을 기존 방법과 본 발명의 miRNA 발현양상 검출 특이도(△C_t)를 비교한 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 PNA 프로브를 이용한 PNA 클램핑 기술과 실시간 PCR 기술을 접목하여 miRNA의 발현을 보다 쉽고 간편하게 miRNA 발현양상을 분석하는 것이다.

1. PNA 클램핑 프로브의 설계 및 제작

본 발명의 PNA 프로브는 각각 miRNA 유사염기서열을 가진 아형서열에 완벽하게 결합할 수 있는 것으로서 10개 이상, 바람직하게는 13 내지 30개, 보다 바람직하게는 13 내지 20개, 가장 바람직하게는 14 내지 22개의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 PNA 프로브는 각각 has-let7a, has-let7c, has-let7g, hsa-miR-10a, miR-10b, hsa-miR-18a, hsa-miR-18b, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-181c, hsa-miR-181d, hsa-miR-196a 및 hsa-miR-196b의 각각에 대한 아형의 불일치 서열 부위를 포함하도록 고안된 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 PNA 프로브는 하기 표 1에 기재한 서열번호 1 내지 64 중 어느 하나의 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 염기서열로부터 당업자가 통상의 지식을 이용하여 용이하게 변형할 수 있는 범위 내의 PNA 프로브 서열들은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 보아야 할 것인 바, 10mer 이상의 길이를 갖는 PNA 프로브로서 본 발명에 따른 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용하여 miRNA 발현양을 효과적으로 비교 분석할 수 있는 것인 한, 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이다.

구체적으로, 서열번호 1 내지 4는 miRNA hsa-let7a 아형에 완벽하게 결합하도록 설계하였고, 또한 hsa-let7a외의 아형인 let7b, let7c, let7d, let7e, let7f, let7g 및 let7i와 구별이 가능하도록 염기서열의 차이가 존재하는 부위가 포함되도록 설계하였다. 서열번호 5 내지 8은 hsa-let7c 아형에 완벽하게 결합하도록 설계하였고 또한, has-let7C외의 아형인 let7a, let7b, let7d, let7e, let7f, let7g 및 let7i와 구별이 가능하도록 염기서열의 차이가 발생하는 부위가 포함되도록 설계하였다. 서열번호 9 내지 12는 hsa-let7g 아형에 완벽하게 결합하도록 설계하였고 또한, has-let7g외의 아형인 let7a, let7b, let7c, let7d, let7e, let7f 및 let7i와 구별이 가능하도록 염기서열의 차이가 발생하는 부위가 포함되도록 설계하였다. 서열번호 13 내지 17은 hsa-miR-10a 아형에 완벽하게 결합하도록 설계하였고, hsa-miR-10b와 구별이 가능하도록 염기서열의 차이가 발생하는 부위가 포함되도록 설계하였다. 서열번호 18 내지 22은 hsa-miR-10b 아형에 완벽하게 결합하도록 설계하였고, hsa-miR-10a와 구별이 가능하도록 염기서열의 차이가 발생하는 부위가 포함되도록 설계하였다. 서열번호 23 내지 29은 hsa-miR-18a 아형에 완벽하게 결합하도록 설계하였고, hsa-miR-18b와 구별이 가능하도록 염기서열의 차이가 발생하는 부위가 포함되도록 설계하였다. 서열번호 30 내지 34은 hsa-miR-18b 아형에 완벽하게 결합하도록 설계하였고, hsa-miR-18a와 구별이 가능하도록 염기서열의 차이가 발생하는 부위가 포함되도록 설계하였다. 서열번호 35 내지 39은 hsa-miR-181a 아형에 완벽하게 결합하도록 설계하였고, hsa-miR-181b, hsa-miR-181c 및 hsa-miR-181d와 구별이 가능하도록 염기서열의 차이가 발생하는 부위가 포함되도록 설계하였다. 서열번호 40 내지 45는 hsa-miR-181b 아형에 완벽하게 결합하도록 설계하였고, hsa-miR-181a, hsa-miR-181c 및 hsa-miR-181d와 구별이 가능하도록 염기서열의 차이가 발생하는 부위가 포함되도록 설계하였다. 서열번호 46 내지 51은 hsa-miR-181c 아형에 완벽하게 결합하도록 설계하였고, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b 및 hsa-miR-181d와 구별이 가능하도록 염기서열의 차이가 발생하는 부위가 포함되도록 설계하였다. 서열번호 52 내지 57은 hsa-miR-181d 아형에 완벽하게 결합하도록 설계하였고, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b 및 hsa-miR-181c와 구별이 가능하도록 염기서열의 차이가 발생하는 부위가 포함되도록 설계하였다. 서열번호 58 내지 61은 hsa-miR-196a 아형에 완벽하게 결합하도록 설계하였고, hsa-miR-196b와 구별이 가능하도록 염기서열의 차이가 발생하는 부위가 포함되도록 설계하였다. 서열번호 62 내지 64는 hsa-miR-196b 아형에 완벽하게 결합하도록 설계하였고, hsa-miR-196a와 구별이 가능하도록 염기서열의 차이가 발생하는 부위가 포함되도록 설계하였다.

본 발명의 PNA 프로브는 반응효율 및 용해도를 증가시키기 위하여 N-말단(N-terminal) 또는 C-말단(C-terminal) 친수성 기능기를 포함할 수 있으며, 예를 들어 N-말단 또는 C-말단에 친수성 링커나 친수성 아미노산, 또는 아민기를 1개 내지 여러 개 포함할 수 있다(J Chem Technol Biotechnol. 2006, 81: 892-899; Tetrahedron Lett. 1998, 39: 7255-7258; Proc Natl Acad Sci USA. 2002, 99: 5953-5958; Anal Chem. 1997, 69: 5200-5202). 구체적인 예로서, N-말단에 라이신이 1개 부착된 PNA 프로브를 사용하였다.

본 발명에서 사용되는 PNA 올리고머는 한국등록특허 제464,261호의 방법에 따라 Bts(Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체, 또는 공지의 Fmoc(9-flourenylmethloxycarbonyl) 또는 t-Boc(t-butoxycarbonyl)으로 보호된 PNA 단량체를 이용하여 합성될 수 있다(J Organic chem. 1994, 59(19): 5767-5773; J Peptide Sci. 1995, 1(3): 175-183).

2. miRMA 검출을 위한 real - time PCR 프라이머 및 cDNA 합성

본 발명에서 miRMA 검출을 위한 real-time PCR 프라이머 및 cDNA 합성은 miRNA을 검출을 위해 사용되고 있는 통상의 방법이 적용 가능하다.

대표적으로 루프 구조의 역전사 프라이머로 miRNA로부터 cDNA를 합성하고, 합성된 cDNA를 주형으로 forward primer 및 reverse primer와 TaqMan^TM프로브로 검출하도록 설계된 프라이머 및 프로브를 이용하는 것이 가능하다(Nucleic Acids Res. 2005, 33(20): e179).

또한 Adenylation 중합효소를 이용해 miRNA 3’말단에 A를 연속적으로 합성하고, 합성된 A에 상보적인 oligo dT primer와 역전사 효소를 이용해 cDNA를 합성한 다음, 합성된 cDNA를 주형으로 forward primer 및 universal reverse primer를 이용하는 것도 가능하다(BioTechniq. 2005, 39(4): 519-525).

또한, cDNA 합성 과정에 miRNA의 특정 아형과 완벽하게 결합할 수 있고, 상기 miRNA의 다른 아형과는 상이한 염기서열을 포함하는 부위와 특이적으로 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브를 추가로 적용함으로써 특이도를 향상시키는 것도 가능하다.

3. PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 miRNA 아형의 검출

본 발명에 따른 miRNA 아형의 발현양상 분석방법은

를 포함한다.

본 발명의 상기 단계 (1)에서 사용되는 전체 RNA 또는 miRNA는 대상 검체로부터 추출하여 사용한다. 본 발명에서는 RNA추출에 특별한 제한이 없으며, 일반적으로 사용하는 모든 RNA 추출방법을 사용할 수 있으며, 시판중인 RNA 추출키트 등을 사용하여 발현을 비교하고자 하는 시료로부터 RNA를 추출하여 준비된다.

본 발명에 있어서, 상기 (1) 단계의 cDNA는 유니버셜 프라이머(Universal primer) 또는 특정 miRNA 특이적 프라이머인 역전사 프라이머의 존재하에 합성된다.

보다 상세하게는 단계 (1)에서는, 검출대상으로부터 추출된 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하는 단계로 miRNA을 검출을 위해 사용되고 있는 통상의 방법들이 적용 가능하다. 대표적인 예로 루프 구조의 역전사 프라이머로 miRNA로부터 cDNA를 합성하고, 합성된 cDNA를 주형으로 forward primer와 reverse primer와 TaqMan^TM프로브로 검출하도록 설계된 프라이머 및 프로브를 이용 하는 방법(Nucleic Acids Res. 2005, 33(20): e179)에서 개시된 바와 같이 루프 구조의 역전사 프라이머로 miRNA로부터 cDNA를 합성하는 방법이 이용 가능하다.

또 다른 예로 Adenylation 중합효소를 이용해 miRNA 3’말단에 A를 연속적으로 합성하여, 합성된 A에 상보적인 oligo dT primer와 역전사 효소를 이용해 cDNA를 합성하고, 합성된 cDNA를 주형으로 forward primer와 universal reverse primer를 사용하는 방법(BioTechniq. 2005, 39(4): 519-525)에서 개시된 Adenylation 중합효소를 이용해 miRNA 3’말단에 A를 연속적으로 합성하여, 합성된 A에 상보적인 oligo dT primer와 역전사 효소를 이용해 cDNA를 합성하는 방법도 이용 가능하다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 (1) 단계의 cDNA는 역전사 프라이머 및 miRNA의 아형과 완벽하게 결합할 수 있고, 상기 miRNA의 아형간에 상이한 염기서열을 포함하는 부위와 특이적으로 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브의 존재 하에 합성될 수 있다.

본 발명에 있어서, 단계 (2)에서는, 단계 (1)에서 합성된 cDNA를 특정 miRNA의 클램핑 프라이머 세트 및 miRNA의 아형(single nucleotide different)과 완벽하게 결합할 수 있고, 상기 miRNA의 아형간에 상이한 염기서열을 포함하는 부위와 특이적으로 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브의 존재 하에, miRNA 에 대해 실시간 PCR(real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계로, miRNA 검출을 위한 다양한 프라이머들이 모두 사용 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 miRNA의 아형은 has-let7a, has-let7c, has-let7g, hsa-miR-10a, miR-10b, hsa-miR-18a, hsa-miR-18b, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-181c, hsa-miR-181d, hsa-miR-196a 및 hsa-miR-196b로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 PNA 클램핑 프로브는 13 내지 30mer의 길이의 염기서열로 이루어지는 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 64로부터 선택되는 어느 하나인 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 단계 (3)에서는 실시간 PCR에 의한 cDNA 증폭을 분석하여 두 시료 이상의 miRNA 발현을 비교하는 단계로, 증폭된 Ct값으로 miRNA 발현의 유무 또는 miRNA의 발현정도를 비교할 수 있다.

보다 상세하게는 miRNA의 아형 miRNA와 혼성화되도록 고안된 본 발명의 PNA 클램핑 프로브가 miRNA 아형에 혼성화되어 miRNA 증폭을 저해하게 되면 증폭이 저해되어 Ct값이 높게 나타나며, 만약 발현조사를 하고자 하는 특정 miRNA에 PNA 클램핑 프로브가 miRNA 아형에 완전하게 혼성화되지 못하게 되면 miRNA는 증폭 되어 Ct값이 낮게 나타나게 된다. 이러한 원리를 바탕으로 본 발명의 PNA 클램핑 프로브는 유사 염기서열에 따른 비특이적인 증폭을 억제함으로써 보다 정확한 miRNA의 발현을 비교할 수 있다.

실시간 PCR 방법은 지수적인 증폭이 일어나는 초기 시료의 양을 형광물질의 지수적 증가가 탐지되기 시작하는 사이클의 수(Cycle threshold, 이하 ‘Ct’라고 칭한다)로 나타내므로 보다 정확한 정량분석이 가능하며 반응을 실시간으로 분석할 수 있다. 이 방법은 전기영동하여 영상분석기로 강도를 측정하는 단계가 생략되고 증폭산물의 증폭 정도를 자동화, 수치화시켜 빠르고 간편하게 진단할 수 있는 방법이다.

본 발명에 있어서, miRNA 발현양상의 분석은 TaqMan 프로브법, 인터컬레이팅(intercalating)법 및 분자 비컨(Molecular Beacon)법으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 유전자 증폭을 한다.

예를 들어, 본 발명에서는 연장(extension) 반응 시에 Taq DNA 폴리머레이즈가 갖는 5’→3’ 엑소뉴클레이즈 활성으로 주형에 혼성화한 TaqMan^TM프로브가 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리됨으로써 소광체에 의한 억제가 해제되어 형광을 발한 TaqMan 프로브 법을 사용하였다.

본 발명의 PNA 클램핑 프로브를 이용한 miRNA 실시간 PCR 방법은 매우 유사한 염기서열을 가진 아형으로 인해 정확한 비교가 어려운 경우 이용할 수 있으며, 이러한 miRNA 발현을 비교하는 연구뿐만 아니라 miRNA 신호 전달 체계에 관여하는 기작을 연구하는 데에도 매우 유용하게 사용될 수 있다. 또한 아형이 존재하는 특정 miRNA에 대해 다량의 시료 분석을 요구하는 연구에도 효과적으로 적용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.

[ 실시예 1] miRNA 발현양상 확인을 위한 PNA 클램핑 프로브 합성

miRNA let7a, let7c, let7g, 10a, 10b, 181a, 181b, 181c, 181d, 18a, 18b, 196a, 196b 등의 유사 염기서열의 분리를 위하여 다른 유사 염기서열의 증폭을 억제하기 위한 PNA 프로브를 합성하였다.

PNA 클램핑 프로브는 miRNA 아형을 구별하기 위한 miRNA let7a, let7c, let7g, 10a, 10b, 181a, 181b, 181c, 181d, 18a, 18b, 196a, 196b와 완벽하게 결합하는 64개의 PNA 프로브로 상기 표 1에 나타낸 바와 같이 제작하였다. 각 miRNA 아형과 완벽하게 결합하는 프로브로서 아형의 효과적인 분리를 위하여 아형의 염기차이가 발생되는 부위의 염기서열이 프로브의 중간에 위치하도록 고안하였다. 한국등록특허 제464261호에 기재된 방법에 따라, PNA 프로브를 합성하였다(Org Lett. 2007, 9:3291-3293).

[ 실시예 2] 표준화된 miRNA 의 합성

정확한 miRNA 아형 분리능을 확인하기 위하여 mature 형태의 miRNA 염기서열과 동일하게 21 내지 25mer 길이의 합성 RNA를 바이오니아(한국)에 의뢰하여 합성하였다.

[ 실시예 3] miRNA 아형 구별을 위한 miRNA 아형의 구별을 위한 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 클램핑 방법 확립 ( cDNA clamping ; 도면 1 참조)

(a) 농도 별로 준비된 합성 miRNA(0, 0.8, 8, 80 pg/㎕) 5 ㎕에 cDNA 합성 프라이머 3 ㎕, dNTP 믹스(100 mM) 0.15 ㎕, 역전사 효소 1 ㎕, 10X 역전사 버퍼 1.5 ㎕, RNase 억제제(20 U/㎕) 0.19 ㎕ 및 증류수 4.16 ㎕를 넣고 혼합한 후, DNA 증폭기를 이용하여 16℃에서 30분 동안 반응시킨 후 42℃에서 30분 반응, 그 다음 85℃에서 5분 반응 후 4 ℃에서 정치시켰다.

(b) (a)에서 합성된 cDNA를 가지고 실시간 PCR 클램핑을 수행하여 특정 miRNA 발현 비교를 하기 위한 최적의 농도와 PNA 프로브를 선정하였다. 합성된 cDNA 1.33 ㎕에 클램핑 센스 프라이머, 안티센스 프라이머 및 TaqMan 프로브 등을 포함한 TaqMan MicroRNA assay 1 ㎕ (ABI, 캐나다), 상기 표 1에 나타낸 프로브 중 1개의 클램핑 프로브(100 μM) 1 ㎕, TaqMan 2X universal PCR 마스터 믹스(ABI, 캐나다) 10 ㎕ 및 증류수 6.67 ㎕ 등을 넣고 혼합한 후, 실시간 DNA 증폭기(Real-time PCR machine, CFX96TM Real-Time PCR System, Bio-RAD, 미국)를 이용하여 95℃에서 10분 동안 반응시킨 후 95℃ 변성과정 15초 그리고 결합 및 신장 과정을 60℃에서 60초 반응하여 40회 반복하였다. 형광은 60℃ 결합 및 신장 반응 단계에서 측정하였다. 각 프로브들에 대한 결과는 도면 3에 나타내었다.

[ 실시예 4] miRNA 아형 구별을 위한 miRNA 아형의 구별을 위한 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 클램핑 방법 확립 ( RNA clamping ; 도면 2 참조)

(a) 합성된 miRNA를 가지고 실시간 PCR 클램핑을 수행하기 위한 cDNA 준비 하였다. 농도 별로 준비된 합성 miRNA(0, 0.8, 8, 80 pg/㎕) 5 ㎕ 에 상기 표 1 의 25 내지 27에 나타낸 프로브 중 1개의 클램핑 프로브(100 μM) 1 ㎕, cDNA 합성 프라이머 3 ㎕, dNTP 믹스(100 mM) 0.15 ㎕, 역전사 효소 1 ㎕, 10X 역전사 버퍼 1.5 ㎕, RNase 억제제(20 U/㎕) 0.19 ㎕ 및 증류수 3.16 ㎕를 넣고 혼합한 후, DNA 증폭기를 이용하여 16℃에서 30분 동안 반응시킨 후 42℃에서 30분 반응, 그 다음 85℃에서 5분 반응 후 4 ℃에서 정치시켰다.

(b) (a)에서 합성된 cDNA를 가지고 실시간 PCR 클램핑을 수행하여 특정 특정 miRNA 발현 비교를 하기 위한 최적의 농도와 PNA 프로브를 찾고자 하였다. 합성 miRNA를 원료로 합성된 cDNA 1.33 ㎕에 클램핑 센스 프라이머, 안티센스 프라이머 및 TaqMan 프로브 등을 포함한 TaqMan MicroRNA assay 1 ㎕(ABI, 캐나다), TaqMan 2X universal PCR 마스터 믹스(ABI, 캐나다) 10 ㎕ 및 증류수 7.67 ㎕ 등을 넣고 혼합한 후, 실시간 DNA 증폭기(Real-time PCR machine, CFX96TM Real-Time PCR System, Bio-RAD, 미국)를 이용하여 95℃에서 10분 동안 반응시킨 후 95℃ 변성과정 15초 그리고 결합 및 신장 과정을 60℃에서 60초 반응하여 40회 반복하였다. 형광은 60℃ 결합 및 신장 반응 단계에서 측정하였다.

[ 비교예 1] hsa - miR -10a, hsa - miR -10b, hsa - miR -18a, hsa - miR -196a, hsa -miR-196b 검출을 위한 종래기술과의 비교-1

문헌(Nucleic Acids Res. 2005, 33(20): e179)에 보고된 miRNA 발현 검출 방법과 본 발명에 따른 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 클램핑 방법을 통한 miRNA 발현 검출 방법 비교하였다. 우선 hsa-miR-18a 300 pg, 200 pg, 100 pg, 0 pg 에 아형 hsa-miR-18b를 각각 0 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg이 포함된 혼합액을 이용하여 문헌에 보고된 방법으로 hsa-miR-18a 발현 검출을 수행하였고, 동일한 혼합액을 이용한 hsa-miR-18a 발현 검출에 본 발명 방법을 적용하였다. 이러한 방법으로 hsa-miR-10a, hsa-miR-10b, hsa-miR-196a 및 hsa-miR-196b 에 대한 발현 검출을 수행하였다. 그 결과에서 0 pg과 300 pg 간의 △C_t 을 도 2에 나타내었다.

도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, hsa-miR-18a, hsa-miR-196a 및 hsa-miR-196b는 기존 방법과 본 발명 간에 큰 차이를 보이지 않았지만, hsa-miR-10a와 hsa-miR-10b의 결과는 기존방법에 비해 본 발명의 △C_t 값이 매우 큰 폭으로 차이를 보이고 있는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 보이는 것은 본 발명이 매우 민감하게 발현 검출이 가능함을 확인한 결과이다.

[ 비교예 2] has - miR -10a 와 has - miR -10b 검출을 위한 종래기술과의 비교-2

합성된 miRNA Target hsa-miR-10a 0%, 10%, 20%, 50%, 80%, 90%, 100% 비율로 존재하며, 나머지 비율은 합성된 아형 miRNA Target hsa-miR-10b가 포함되도록 혼합하여 서열번호 22 PNA 클램핑 프로브를 사용하여 hsa-miR-10a 대한 실시간 PCR 클램핑을 수행하였다. 또한 동일한 혼합 합성 miRNA를 이용하여 서열번호 17 PNA 클램핑 프로브를 사용하여 has-miR-10b에 대한 실시간 PCR 클램핑을 수행하였다. 그리고 각 Target 농도에 따른 Ct값 사이의 상관관계를 분석하여, 정확성을 확인하였다.

서열번호 22를 이용한 결과를 도 4에 나타내었고, 서열번호 17을 이용한 결과를 도 5에 나타내었다.

그 결과 도 4에서도 확인할 수 있듯이, 용액 내 상대적인 hsa-miR-10a 비율이 높을수록 0% 비율의 Ct 값과의 차이가 일정하게 증가하는 것을 확인할 수 있었고 hsa-miR-10a의 양과 Ct값 사이에 상관관계가 있음을 확인하였다. 또한 상기의 결과에 있어서 기존방법과 비교하여 높은 △C_t 값을 보이는 것은 아형인 hsa-miR-10b가 100% 존재하는 시료에서 비특이적 검출이 매우 낮기 때문임을 확인하였다. 이는 본 발명의 PNA 클램핑 프로브가 miRNA 발현 검출하는데 있어 비 특이적인 반응을 최소화하여 좀 더 정확한 발현비교가 가능함을 확인한 결과이기도 하다.

또한, 도 5는 hsa-miR-10b에 대한 실시간 PCR 클램핑을 수행하여 기존방법과 본 발명을 비교한 결과이다. 도 5의 결과에서도 확인할 수 있듯이 기존방법과 본 발명간의 △C_t가큰 차이를 보이는 것으로, 이는 기존 방법에 의한 비특이적 검출이 매우 크게 나타났음을 확인한 것이며, 본 발명으로 비특이적 검출을 최소화 한 것으로 해석할 수 있다.

[ 비교예 3] has - miR -18a와 has - miR -18b 검출을 위한 종래기술과의 비교-3

합성된 miRNA Target hsa-miR-18a 0%, 10%, 20%, 50%, 80%, 90%, 100% 비율로 존재하며, 나머지 비율은 합성된 아형 miRNA Target hsa-miR-18b가 포함되도록 혼합하여 서열번호 34 PNA 클램핑 프로브를 사용하여 hsa-miR-18a 대한 실시간 PCR 클램핑을 수행하였다. 또한 동일한 혼합 합성 miRNA를 이용하여 서열번호 27 PNA 클램핑 프로브를 사용하여 has-miR-18b에 대한 실시간 PCR 클램핑을 수행하였다. Target hsa-miR-18a 농도에 따른 Ct값 사이의 상관관계를 분석하여, 정확성을 확인하였다. 그 결과는 도 6 내지 7에 나타내었다.

도 6에도 확인할 수 있듯이, 용액 내 상대적인 hsa-miR-18a 비율이 높을수록 0% 비율의 Ct 값과의 차이가 일정하게 증가함을 통해 hsa-miR-18a의 양과 Ct값 사이에 상관관계가 있음을 확인하였다. 또한 기존방법과 비교하여 매우 높은 △C_t 값을 보이는 것은 아형인 hsa-miR-18b가 100% 존재하는 시료에서 비특이적 검출이 매우 낮기 때문으로, 본 발명의 PNA 클램핑 프로브가 miRNA 발현 검출하는데 있어 비 특이적인 반응을 최소화하여 좀 더 정확한 발현비교가 가능함을 확인한 결과이다.

도 7은 hsa-miR-18b에 대한 실시간 PCR 클램핑을 수행하여 기존방법과 본 발명을 비교한 결과이다. 도 7에서도 확인할 수 있듯이, 기존방법과 본 발명간의 △C_t이매우 큰 차이를 보이는 것을 확인하였고, 이는 기존 방법에 의한 비특이적 검출이 매우 크게 나타났음을 확인한 것이며, 본 발명으로 비특이적 검출을 최소화 한 것으로 해석할 수 있다.

[ 비교예 4] has - miR -181a 검출을 위한 종래기술과의 비교-4

합성된 miRNA Target hsa-miR-181a 0%, 10%, 20%, 50%, 80%, 90%, 100% 비율로 존재하며, 나머지 비율은 합성된 아형 miRNA Target hsa-miR-181a, has-miR-181c 및 hsa-miR-181d 등이 포함되도록 혼합한 시료에 서열번호 44, 50, 56 등의 PNA 클램핑 프로브를 사용하여 hsa-miR-181a 대한 실시간 PCR 클램핑을 수행하였다. Target hsa-miR-181a 농도에 따른 Ct값 사이의 상관관계를 분석하여, 정확성을 확인하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에서도 확인할 수 있듯이, 용액 내 상대적인 hsa-miR-181a 비율이 높을수록 0% 비율의 Ct 값과의 차이가 일정하게 증가함을 통해 hsa-miR-181a의 양과 Ct값 사이에 상관관계가 있음을 확인할 수 있었다. 또한 상기의 결과에 있어서 기존방법과 비교하여 매우 높은 △C_t 값을 보이는 것은 아형인 hsa-miR-181b, hsa-miR-181c, hsa-miR-181d 등의 miRNA가 100% 시료에서 비특이적 검출이 매우 낮기 때문임을 확인하였다. 이는 본 발명의 PNA 클램핑 프로브가 miRNA 발현 검출하는데 있어 비특이적인 반응을 최소화하여 좀 더 정확한 발현비교가 가능함을 확인한 결과이다.

<110> Panagene Inc. <120> Methods and kits for expression profiling of microRNA using PNA mediated Real-Time PCR clamping <160> 64 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-let7-a-1 <400> 1 gtagtaggtt gtgtggtt 18 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-let7-a-2 <400> 2 gtaggttgtg tggtt 15 <210> 3 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-let7-a-3 <400> 3 ggttgtgtgg tt 12 <210> 4 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-let7-a-4 <400> 4 taggttgtgt 10 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-let7-c-1 <400> 5 gtagtaggtt gtatggtt 18 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-let7-c-2 <400> 6 gtaggttgta tggtt 15 <210> 7 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-let7-c-3 <400> 7 ggttgtatgg tt 12 <210> 8 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-let7-c-4 <400> 8 taggttgtat g 11 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Sequence <220> <223> CmiR-10b-1 <400> 18 cctgtagaac cgaatttg 18 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-10b-2 <400> 19 tgtagaaccg aattt 15 <210> 20 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-10b-3 <400> 20 gtagaaccga a 11 <210> 21 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-10b-4 <400> 21 ctgtagaacc ga 12 <210> 22 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-10b-5 <400> 22 aattcggttc tacag 15 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-18a-1 <400> 23 gtgcatctag tgcagatag 19 <210> 24 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-18a-2 <400> 24 tagtgcagat ag 12 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-18a-3 <400> 25 ggtgcatcta gtgcagatag 20 <210> 26 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-18a-4 <400> 26 gtgcagatag 10 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-18a-5 <400> 27 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181a-3 <400> 37 tcaccgacag cgttgaat 18 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181a-4 <400> 38 accgacagcg ttgaatgt 18 <210> 39 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181a-5 <400> 39 acagcgttga at 12 <210> 40 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181b-1 <400> 40 cccaccgaca gcaat 15 <210> 41 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181b-2 <400> 41 ccaccgacag caat 14 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181b-3 <400> 42 ccaccgacag caatgaat 18 <210> 43 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181b-4 <400> 43 caccgacagc aatgaat 17 <210> 44 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181b-5 <400> 44 ccgacagcaa tgaat 15 <210> 45 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181b-6 <400> 45 cccaccgaca gcaa 14 <210> 46 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181c-1 <400> 46 actcaccgac aggtt 15 <210> 47 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181c-2 <400> 47 actcaccgac aggt 14 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181c-3 <400> 48 tcaccgacag gttgaatg 18 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181c-4 <400> 49 accgacaggt tgaatgtt 18 <210> 50 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181c-5 <400> 50 ccgacaggtt gaat 14 <210> 51 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181c-6 <400> 51 actcaccgac agg 13 <210> 52 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181d-1 <400> 52 aacccaccga caaca 15 <210> 53 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181d-2 <400> 53 aacccaccga caac 14 <210> 54 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181d-3 <400> 54 ccaccgacaa caatgaat 18 <210> 55 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181d-4 <400> 55 caccgacaac aatgaat 17 <210> 56 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181d-5 <400> 56 ccgacaacaa tgaatgt 17 <210> 57 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-181d-6 <400> 57 ccaccgacaa caat 14 <210> 58 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-196a-1 <400> 58 tagtttcatg tt 12 <210> 59 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-196a-2 <400> 59 gtagtttcat gttgttgg 18 <210> 60 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-196a-3 <400> 60 taggtagttt catgttgt 18 <210> 61 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-196a-4 <400> 61 gtttcatgtt g 11 <210> 62 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-196b-1 <400> 62 tagtttcctg tt 12 <210> 63 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-196b-2 <400> 63 gtagtttcct gttgttgg 18 <210> 64 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmiR-196b-3 <400> 64 taggtagttt cctgttgt 18

Claims

(1) 검출대상의 전체 RNA 또는 표적 마이크로RNA(microRNA, miRNA)로부터 cDNA를 합성하는 단계;
(2) 상기 cDNA를 특정 miRNA의 클램핑 프라이머 세트 및 miRNA의 아형(single nucleotide different)과 완벽하게 결합할 수 있고, 상기 miRNA의 아형간에 상이한 염기서열을 포함하는 부위와 특이적으로 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브의 존재 하에, miRNA 에 대해 실시간 PCR(real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계; 및
(3) 상기 실시간 PCR에 의한 결과를 분석하여 miRNA 발현을 확인하는 단계:
를 포함하는, miRNA 발현양상을 분석하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 miRNA 발현양상의 분석은 실시간 PCR의 C_t(cycle threshold)값을 측정하여 miRNA 발현 유무 또는 miRNA 발현 정도를 비교하는 것을 특징으로 하는 miRNA 발현양상을 분석하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 (1) 단계의 miRNA의 아형은 has-let7a, has-let7c, has-let7g, hsa-miR-10a, miR-10b, hsa-miR-18a, hsa-miR-18b, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-181c, hsa-miR-181d, hsa-miR-196a 및 hsa-miR-196b로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 miRNA 발현양상을 분석하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 (1) 단계의 cDNA는 유니버셜 프라이머(Universal primer) 또는 특정 miRNA 특이적 프라이머인 역전사 프라이머의 존재 하에 합성되는 것을 특징으로 하는 miRNA 발현양상을 분석하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 (1) 단계의 cDNA는 역전사 프라이머 및 miRNA의 아형과 완벽하게 결합할 수 있고, 상기 miRNA의 아형간에 상이한 염기서열을 포함하는 부위와 특이적으로 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브의 존재 하에 합성되는 것을 특징으로 하는 miRNA 발현양상을 분석하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 (2) 단계의 PNA 클램핑 프로브는 13 내지 30mer의 길이의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 miRNA 발현양상을 분석하는 방법.
제 6항에 있어서,
상기 PNA 클램핑 프로브는 서열번호 1 내지 64로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 miRNA 발현양상을 분석하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 miRNA 발현양상의 분석은 TaqMan 프로브법, 인터컬레이팅(intercalating)법 및 분자 비컨(Molecular Beacon)법으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 유전자 증폭을 비교하는 것을 특징으로 하는 miRNA 발현양상을 분석하는 방법.
서열번호 1 내지 64로부터 선택되는 어느 하나의 PNA 클램핑 프로브를 포함하는, 제 7항에 따른 miRNA 발현양상을 분석하는 방법에 사용하기 위한 키트.