KR20110138986A

KR20110138986A - Ｔｒａｐ８０ 조절제를 유효성분으로 함유하는 대사증후군 치료 또는 예방용 약학조성물

Info

Publication number: KR20110138986A
Application number: KR1020100059202A
Authority: KR
Inventors: 김승환; 김근향
Original assignee: 울산대학교 산학협력단
Priority date: 2010-06-22
Filing date: 2010-06-22
Publication date: 2011-12-28
Also published as: KR101341200B1

Abstract

본 발명은 TRAP80 조절제를 유효성분으로 함유하는 대사증후군 치료 또는 예방용 약학조성물에 관한 것으로, 상기 TRAP80 조절제 예를들어, TRAP80 발현을 억제하는 siRNA 또는 TRAP80에 특이적으로 결합하는 항체는 SREBP-1c의 전사를 선택적으로 억제하여 동맥경화, 지방간 등과 같은 대사증후군을 효과적으로 치료하거나 예방할 수 있다.
또한, TRAP80 조절제와 함께 LXR 효능제를 포함하는 약학조성물은 LXR 효능제의 원치않는 효과인 혈청 트리글리세라이드 및 간 트리글리세라이드 증가와 같은 지방산 대사 활성을 억제할 수 있어 혈청 HDL을 증가시키며 동맥경화를 감소시키는 등의 LXR 효능제의 바람직한 효과를 증진시킬 수 있기 때문에 LXR 효능제에 의한 동맥경화성 질환이나 지방간 등과 같은 대사증후군의 치료제로서의 효과를 더욱 향상시킬 수 있다.

Description

ＴＲＡＰ８０ 조절제를 유효성분으로 함유하는 대사증후군 치료 또는 예방용 약학조성물{Pharmaceutical composition for treating or preventing metabolic syndrome comprising ＴＲＡＰ８０ regulator}

본 발명은 TRAP80 조절제를 유효성분으로 함유함으로써 SREBP-1c의 전사를 선택적으로 억제하여 동맥경화, 지방간 등과 같은 대사증후군을 효과적으로 치료하거나 예방할 수 있는 대사증후군 치료 또는 예방용 약학조성물에 관한 것이다.

대사성 증후군은 비만, 당뇨, 고중성지방혈증, 고혈압, 간질환, 심혈관질환 및 혈액응고 이상과 같은 위험인자가 함께 나타나는 증후군을 의미한다. 그 증상 자체는 치명적이진 않지만 당뇨병이나 허혈성 심혈관계 질환과 같은 심각한 질병으로 발전할 소인이 있기 때문에 현대인을 크게 위협하는 질환이 되고 있다.

대사성 증후군 중 동맥경화를 예방하기 위해서는, 혈중 콜레스테롤 수준을 저하시키는 것이 중요하다. 고콜레스테롤증 환자에 대한 스타틴류의 강한 콜레스테롤 저감작용이 보고되어 있다. 스타틴류는 콜레스테롤 생합성의 속도 결정 효소인 히드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소를 저해함으로써, 생체 내에서의 콜레스테롤 생합성을 억제하고, 따라서 간장 내의 콜레스테롤 함량 저하, 및 이에 따른 LDL 수용체의 증가를 통해 혈장 중 콜레스테롤 수준을 저하시킨다. 그러나, 이러한 약제가 개발된지 오랜 시간이 경과하였음에도 불구하고, 관동맥질환의 발생율에는 변화가 없다는 것이 보고되고 있어, 따라서 동맥경화의 억제는 콜레스테롤의 저감만으로는 불충분하다.

또한, 대사증후군 중 하나인 지방간 질환에 대한 안전하고 효과적인 치료방법이 없기 때문에 이러한 치료도 역시 중요하다.

한편, 핵 수용체 슈퍼패밀리의 일종인 LXR(Liver X receptor)은 핵 콜레스테롤 센서로서 지질대사 및 염증과 관련된 다양한 중요 단백질의 발현을 조절한다. LXR은 22(R)-하이드록시콜레스테롤, 24(S)-하이드록시콜레스테롤 및 24,25(S)-에폭시콜레스테롤과 같은 옥시스테롤에 의해 활성화된다.

2개의 LXR 단백질 α 및 β는 포유류에서 발견되었고, LXRβ는 시험된 거의 모든 조직에서 발견된 반면, LXRα의 발현은 상당히 제한되어 있으며, 간에서 가장 높은 수준으로 발견되었고, 신장, 소장, 비장, 및 부신에서는 더 낮은 수준으로 발견되었다.

LXRα는 콜레스테롤 합성, 그의 세포내 유출(Fielding & Fielding, Biochim. Biophys. Acta, 2001, 1533, 175-89) 및 콜레스테롤 대사에 포함된 유전자의 발현을 조절한다. 따라서, LXRα 효능제는 그 자체로 또는 주지의 콜레스테롤-생합성 억제제 약물인 스타틴(statins)과 함께 혈중 콜레스테롤 수준을 조절하는데 유용하게 사용될 수 있다. T0901317 및 하이포콜라미드와 같은 LXR 효능제에 대한 최근 연구 결과는 콜레스테롤 수준이 LXR 효능제에 의해 조절될 수 있다는 것을 더욱 확신시켜주고 있다(Genes & Development, 14(22): 2831-8, 2000; Steroids, 66: 673-81, 2001).

T0901317 또는 GW3965와 같은 LXR 효능제에 의한 ABCA1의 전사 증가는 혈청 HDL의 증가와 동맥경화의 감소에 기여할 수 있으며, LXR 효능제의 이러한 바람직한 효과는 동맥경화성 질환을 지닌 환자에서 치료제로서 활용될 수 있다. 그러나, LXR 활성화는 de novo 지방산 합성의 중요한 조절제인 SREBP-1c의 mRNA 증가와 관련되어 혈청 트리글리세라이드 및 간 트리글리세라이드 함량을 증가시키는 문제가 있다.

따라서, 지방산 대사에서 LXR의 부정적인 효과를 콜레스테롤 대사에서 LXR의 긍정적인 효과와 분리할 필요가 있고, 이는 동맥경화 또는 지방간과 같은 대사증후군 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

이에, 본 발명자는 LXRa와 상호작용을 하는 보조활성인자를 동정하였고, 이들 중 TRAP80이 LXR 반응인자(LXR response element; LXRE)를 통해 리간드 의존적으로 SREBP-1c 전사를 자극하는 것을 확인하였다. 또한, TRAP80의 siRNA에 의해 SREBP-1c의 전사가 유의적으로 억제되었고, ABCA1의 전사는 억제되지 않았다. 이러한 발견에 의해 TRAP80 조절제가 대사증후군 치료 또는 예방에 사용될 수 있으며, LXR 효능제의 유용한 효과를 증대시킬 수 있다는 점에 착안하여 본 발명을 완성하였다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명의 목적은 TRAP80 조절제를 유효성분으로 함유하는 동맥경화 또는 지방간 등과 같은 대사증후군 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 LXR 효능제의 유용한 효과를 증대시키면서 원치않는 지방산 대사 활성을 억제할 수 있는 TRAP80 조절제를 LXR 효능제와 함께 포함하는 동맥경화 또는 지방간 등과 같은 대사증후군 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 TRAP80 조절제를 이용한 동맥경화 또는 지방간 등과 같은 대사증후군 치료 또는 예방용 약물의 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 TRAP80 발현 프로파일을 이용한 동맥경화 또는 지방간 등과 같은 대사증후군의 진단 방법을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 TRAP80 조절제를 투여하여 LXR과 TRAP80 간의 상호작용을 억제하는 LXR 효능제의 부작용 경감방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TRAP80 조절제를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 TRAP80 조절제는 TRAP80 발현을 억제하는 siRNA 및 TRAP80에 특이적으로 결합하는 항체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, SREBP-1c의 전사를 선택적으로 억제할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 TRAP80 발현을 억제하는 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이러한 스템-앤드-루프 구조는 인비트로(in vitro) 또는 인비보(in vivo)에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

본 발명에서 이용되는 TRAP80에 특이적으로 결합하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 이러한 항체는 당 업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(European Journal of Immunology, 6: 511-519, 1976), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Nature, 352: 624-628, 1991; J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597, 1991)에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에 따르면, LXRa 리간드 결합 도메인(ligand binding domain; LBD)과 상호작용을 하는 보조활성인자 단백질을 동정하였고, 이러한 단백질을 Flag-LXRa와 in vivo 상호작용을 이용한 면역침강 분석에 의해 확인하였다. GST 풀-다운 분석을 통해 5개의 보조활성인자 단백질 중 TRAP80 및 TRAP220이 LXRa와 직접 결합하는 것을 확인하였고, TRAP80은 GST-LXRa LBD과 리간드 비의존적으로 상호작용하지만, 합성 및 천연 프로모터 둘 모두의 LXRa 매개 전사를 리간드 의존적으로 자극하였다. SREBP-1c 프로모터의 LXRE에 대한 TRAP80 동원은 리간드 의존적이었고, TRAP80 siRNA는 LXR 효능제 의존성 SREBP-1c 발현을 강하게 억제하였으나, ABCA1 발현을 억제하지는 않았다.

즉, TRAP80은 리간드 의존적으로 LXR-의존성 경로를 통해 선택적으로 SREBP-1 유전자의 전사를 촉진시켰고, TRAP80-LXR의 상호작용을 억제하는 새로운 접근법이 동맥경화 또는 지방간 등의 대사증후군을 효과적으로 치료하고 예방할 수 있는 새로운 약물 또는 LXR 효능제의 개발을 촉진할 수 있다.

상기 대사증후군으로는 동맥경화, 간질환, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 비만, 고혈압, 과인슐린혈증, 과혈당증, 1형 및 2형 당뇨병, 인슐린 내성을 특징으로 하는 이상지혈증, 발기부전, 심혈관계질환 및 허혈성질환으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 상기 간질환은 알콜성 및 비알콜성 간의 지질대사 이상으로 인한 지방간, 간염 및 간경화로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학조성물은 LXR 효능제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 LXR 효능제는 LXRα 효능제인 것이 바람직하며, 상기 LXRα 효능제는 22(R)-하이드록시콜레스테롤, 24(S),25-에폭시콜레스테롤, 24(S)-하이드록시콜레스테롤, 27-하이드록시콜레스테롤, 콜레스테노익산, T-314407, T-0901317, GW3965, SB742881, GSK 2186, WAY-252623(LXR-623), WAY-254011, WYE-672, DMHCA(N,N-Dimethyl-3b-hydroxycholenamide), 4-(3-바이아릴)퀴놀린 설폰, F₃MethylAA, APD(acetyl-podocarpic dimer), 포도카르픽 이미드 이합체(podocarpic imide dimer), CRX000541, CRX000864, CRX000929, CRX000823, CRX000987, CRX001093, CRX001094, CRX156651, CRX000909, CRX000908, CRX000369, CRX001045, CRX001046, LN7181, LN7179, LN7172, LN6672, LN7031, LN7033, LN6500, LN6662, 리카르딘 C(Riccardin C), XL-652, DY136, DY142 및 하이포콜라마이드(3a,6a-dihydroxy-5b-cholanoic acid-N-methyl-N-methoxy-24-amide)로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니고 LXRα 효능제로 사용될 수 있는 것이라면 어느 것이라고 무방하다.

본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 TRAP80 조절제를 0.1 내지 50.0 중량부로 함유하는 것이 바람직하다. 만약, TRAP80 조절제를 상기 함량 범위를 벗어나 포함하면 de novo 지방산 합성의 중요한 조절제인 SREBP-1c의 전사를 선택적으로 억제할 수 없어 본 발명에서 원하는 효과를 얻을 수 없다.

또한, 본 발명의 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용하는 TRAP80 조절제의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 비강, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 대사증후군 환자의 혈액 또는 조직과 후보약물을 접촉시키는 단계; 및 후보약물에 의해 LXR과 TRAP80 간의 상호작용이 억제되는지 여부를 평가하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 대사증후군 치료제용 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 환자의 시료로부터 TRAP80 발현 프로파일을 얻는 단계; 및 상기 TRAP80 발현 프로파일을 정상인의 시료로부터 얻어진 TRAP80 발현 프로파일과 비교하여 평가하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 대사증후군의 진단방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 TRAP80 조절제를 투여하여 LXR과 TRAP80 간의 상호작용을 억제하는 것을 특징으로 하는 LXR 효능제의 부작용 경감방법을 제공한다.

상기 TRAP80 조절제는 TRAP80 발현을 억제하는 siRNA 및 TRAP80에 특이적으로 결합하는 항체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 상기 TRAP80 조절제는 SREBP-1c의 전사를 선택적으로 억제할 수 있다.

상기 LXR 효능제는 LXRα 효능제이며, 예를들어 22(R)-하이드록시콜레스테롤, 24(S),25-에폭시콜레스테롤, 24(S)-하이드록시콜레스테롤, 27-하이드록시콜레스테롤, 콜레스테노익산, T-314407, T-0901317, GW3965, SB742881, GSK 2186, WAY-252623(LXR-623), WAY-254011, WYE-672, DMHCA(N,N-Dimethyl-3b-hydroxycholenamide), 4-(3-바이아릴)퀴놀린 설폰, F₃MethylAA, APD(acetyl-podocarpic dimer), 포도카르픽 이미드 이합체(podocarpic imide dimer), CRX000541, CRX000864, CRX000929, CRX000823, CRX000987, CRX001093, CRX001094, CRX156651, CRX000909, CRX000908, CRX000369, CRX001045, CRX001046, LN7181, LN7179, LN7172, LN6672, LN7031, LN7033, LN6500, LN6662, 리카르딘 C(Riccardin C), XL-652, DY136, DY142 및 하이포콜라마이드(3a,6a-dihydroxy-5b-cholanoic acid-N-methyl-N-methoxy-24-amide)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 LXR 효능제의 부작용은 혈청 트리글리세라이드 및 간 트리글리세라이드의 증가를 포함한 지방산 대사에서의 원치않는 효과를 의미한다.

본 발명에 따른 TRAP80 조절제를 유효성분으로 함유하는 대사증후군 치료 또는 예방용 약학조성물은 TRAP80 조절제를 유효성분으로 포함함으로써 SREBP-1c의 전사를 선택적으로 억제하여 동맥경화, 지방간 등과 같은 대사증후군을 효과적으로 치료하거나 예방할 수 있다. 또한, LXR 효능제의 원치않는 효과인 혈청 트리글리세라이드 및 간 트리글리세라이드 증가와 같은 지방산 대사 활성을 억제할 수 있어 혈청 HDL을 증가시키며 동맥경화를 감소시키는 등의 LXR 효능제의 바람직한 효과를 증진시킬 수 있기 때문에 LXR 효능제에 의한 동맥경화 또는 지방간 등의 대사증후군의 치료제로서의 효과를 더욱 향상시킬 수 있다.

도 1은 HepG2 세포로부터 LXRa LBD와 상호작용할 수 있는 단백질을 동정한 것으로, A는 GST에 융합된 LXRa LBD의 도식도를 나타낸 것이고, B는 GST-LXRa LBD의 과발현 및 정제를 나타낸 것이고, C는 LXRa LBD와 HepG2 세포로부터 얻어진 몇가지 핵 단백질 간의 리간드 의존성 상호작용을 나타낸 것이고, D는 GST-LXRa LBD 상호작용자의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다.
도 2는 LXRa와 이에 결합하는 핵 단백질 간의 상호작용을 분석한 것으로, A는 Flag-LXRa로 형질감염된 HEK293T 세포에서 Flag-LXRa의 발현을 나타낸 것이고, B는 Flag-LXRa로 형질감염된 세포로부터 항-Flag 항체를 이용한 LXRa과 상호작용 단백질 간의 면역침강 분석 및 웨스턴 블롯 분석 결과이며, C는 GST-LXRa LBD와 ³⁵[S]-메티오닌 표지 상호작용제 간의 GST 풀-다운 분석 결과이다.
도 3은 TRAP220 및 TRAP80에 의한 LXRE-함유 프로모터 활성의 조절에 관한 것이다.
도 4는 SREBP-1c 및 ABCA1 프로모터의 염색질 면역침강 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 SREBP-1c 및 ABCA1 전사물의 수준에 대한 TRAP80 siRNA의 상이한 효과를 보편적인 RT-PCR과 정량 실시간 PCR로 분석한 것이다.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> LXRa LBD와 상호작용하는 단백질의 동정

LXRa LBD와 상호작용하는 단백질의 동정을 위하여, 이전에 알려진 방법(Genes Dev. 1998; 12: 1787-1800)에 따라 GST 풀-다운 분석을 수행하였다. 즉, HepG2 핵 추출물과 반응시키기 전에, SDS-PAGE를 이용하여 정량함으로써 글루타치온-세파로오즈 비드-고정 GST 및 GST-LXRα LBD를 등가몰농도로 조절하였다. 결합용액[20mM HEPES(pH 7.6), 20% 글리세롤, 0.2mM EDTA, 180mM KCl, 1mM DTT, 0.05% Nonidet P-40, 0.5mM PMSF, 10μM T0901317]으로 결합시키고, 세정용액[20mM HEPES(pH 7.6), 20% 글리세롤, 0.2mM EDTA, 180mM KCl, 1mM DTT, 0.1% Nonidet P-40, 0.5mM PMSF]으로 세정한 후, 시료를 세정완충액에 용해된 0.2% Sarkosyl으로 용출시키고, 4-20% SDS-PAGE(BioRad)에 의해 분리시키고, Silver Stain Plus(Biorad) 또는 웨스턴 블롯을 이용하여 염색하여 분석하는 방법을 사용하였다.

먼저, 도 1A 및 도 1B와 같이 글루타치온-Sepharose 비즈를 이용하여 GST-융합 LXRa LBD (아미노산 잔기 159-445)를 발현시키고 정제하였다. 이후 합성 LXR 리간드인 T0901317의 존재 또는 부존재 하에서 HepG2 핵 추출물을 반응한 후, 상호작용하는 단백질을 비즈로부터 용출하여 SDS-PAGE 및 실버 염색을 통해 분석한 결과, 도 1C와 같이 GST-LXRa LBD에 특이적으로 결합한 5개의 단백질을 확인하였다.

<실시예 2> 질량분석기를 이용한 LXRa LBD 결합 단백질 분석

은으로 염색된 겔 슬라이스에서 LXRa LBD 결합 단백질을 겔 트립신 소화에 적용하였다. 추출된 펩타이드를 Zip-tip^TM(Millipore)로 탈염시키고, 매트릭스에서 재현탁하며 Voyager Biospectrometry(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행시간형 질량분석기(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight; MALDI-TOF) 분석을 수행하여 펩타이드 질량 핑거프린트를 얻었다. 얻어진 데이터를 Mascot program(www.matrixscience.com)을 이용하여 처리하였다.

실시예 1에서 발견한 5개의 단백질을 MALDI-TOF 분석을 이용하여 각각을 동정하였으며, 이 후 추가 연구 결과 LXR과 직접적인 상호 작용을 하는 두 가지 단백질(TRAP220과 TRAP80)에 대한 분석 결과를 표 1에 제시하였다. 또한, 도 1D와 같은 웨스턴 블롯 분석 결과에 의해 단백질을 재검증하였다.

단백질	점수^*	예측값^†	확인된 피크 수^‡	매치된 질량^§	단백질 질량	Accession No.
TRAP220/DRIP205	34	6.3	9	23.7%	168	Q15648
TRAP80/CRSP77	81	1.2e^-4	16	19.3%	73	Q9NVC6

^*단백질 점수는 매치의 통계적 유의성 정도를 나타내는 것으로, 65 이상의 점수는 유의한 값이며, ^†예측값은 분석대상 단백질이 단지 우연히 상기한 해당 단백질 점수 이상의 점수로 해당 단백질로 확인될 가능성으로서, 이는 Blast 서치 결과에서 E-값과 동등하며, 예상치가 낮을수록 단백질 점수는 보다 유의하며, ^‡확인된 피크수는 매치된 질량 값의 수이며, ^§매치된 질량은 조사된 질량 값의 수에 대한 매치된 질량 값 수의 퍼센트를 의미한다.

<실시예 3> 면역침강 및 웨스턴 블롯 분석

Flag-LXRa로 형질감염된 HEK293T 세포를 1 mM T0901317에서 2시간 동안 처리하고, 인산 완충액에서 세정하며, 1% NP-40, 10% 글리세롤 및 50mM Tris-Cl(pH 7.4)로 이루어진 라이시스 완충액에서 10분 동안 얼음상에서 용해시켰다. 6㎍ 항-Flag 항체(F7425, Sigma)를 첨가하고, IP 완충액(180mM KCl, 1% NP-40, 10% 글리세롤 및 50mM Tris-Cl, pH 7.4)에서 4℃, 밤새토록 반응하여 면역침강 분석을 수행하였다. 면역 복합체를 단백질 G-아가로오즈(sc-2002, Santa Cruz)로 침강시키고, IP 완충액으로 세정하며 환원된 시료 완충액에서 재현탁하였다. 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, PVDF 멤브레인(QBIOGENE)에 전이시키며 TRAP220 (sc-5334), TRAP80 (ARP34192_P050, Aviva Systems Biology) 및 Flag에 대한 항체를 이용하여 검출하였다.

그 결과, in vivo에서도 5개의 단백질이 모두 확인되었으며, 그 중 TRAP220과 TRAP80에 대한 결과를 그림 2B에 제시하였다.

또한, GST-LXRa LBD와 [³⁵S]-메티오닌 표지 상호작용제 간의 GST 풀-다운 분석 결과, 도 2C와 같이 단지 두 개의 단백질, TRAP220와 TRAP80이 LXRa LBD와 직접적으로 상호작용하였다. 특히, GST-LXRa LBD에 결합된 [³⁵S]-TRAP220는 리간드 의존적으로 상호작용하였으나, [³⁵S]-TRAP80는 리간드와 별개로 상호작용하였다.

<실시예 4> 공형질감염 및 루시페레이즈 리포터 분석

LXRa 분석에서 TRAP220 및 TRAP80의 기능적 관련성을 검토하기 위하여, 공형질감염 및 루시페레이즈 리포터 분석을 수행하였다. 구체적으로, HepG2 세포에 합성 LXRE 프로모터를 함유한 루시페레이즈 리포터 플라스미드를 형질감염시키면서, 동시에 LXRa, RXRa, TRAP220, TRAP80 등의 발현 플라스미드를 공형질감염시켰다. 24시간 이후 디메틸설폭사이드(DMSO) 또는 T0901317을 처리하고, 추가로 24시간 배양한 후 세포를 용해시켜 luminometer (Berthold Technologies)를 사용하여 루시페레이즈 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 3A와 같이 TRAP220 및 TRAP80은 합성 LXRE 프로모터에서 리간드 의존적으로 LXRa의 전사 활성을 유발하였다. 이러한 보조활성인자 기능을 도 3B 및 도 3C와 같이 ABCA1 또는 SREBP-1c의 LXRE 부분을 포함하는 두 가지 주요 천연 프로모터 상에서도 확인하였다.

TRAP220 및 TRAP80은 SREBP-1c LXRE 변이 프로모터에서 전사를 유발하지 않았고, 이는 보조 활성인자의 기능이 LXRE로의 LXR 동원에 특이적으로 의존함을 의미한다(도 3D). 마찬가지로, ABCA1 LXRE 변이 프로모터도 TRAP220 또는 TRAP80에 의해 활성화되지 않았다. 이러한 결과로부터 ABCA1 및 SREBP-1c 프로모터의 LXRE에 LXR이 결합하는 것이 TRAP220 또는 TRAP80에 의한 두 유전자의 전사활성 증가에 필수적임을 알 수 있었다.

<실시예 5> 염색질 면역침강 분석

내인성 염색질 LXRE에 대한 TRAP220 및 TRAP80 동원의 기전을 조사하기 위하여, SREBP-1c 및 ABCA1 프로모터 영역에 대하여 염색질 면역침강 및 PCR 분석을 수행하였다.

본 실시예는 이전에 알려진 보고를 약간 변형하여 염색질 면역침강 분석을 수행하였다(Methods, 1997; 11: 205-214). 즉, 실온에서 20분 동안 1% 포름알데히드로 세포를 처리한 후, 4℃에서 20분 동안 처리하였다. 다음으로, 세포를 냉장 인산 완충액(PBS)으로 세정하고 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1% SDS 및 10 mM EDTA를 함유한 라이시스 완충액에서 재현탁하였다. 세포로부터 용해된 염색질을 초음파처리하여 준비하고, TRAP220 (sc-5334, Santa Cruz), TRAP80 (ARP34192_P050, Aviva Systems Biology), 및 아세틸화된 H4 (06-598, Upstate)에 대한 항체를 이용하여 면역침강시켰다. 최종 DNA 추출물을 SREBP-1c 및 ABCA1 프로모터에 특이적인 프라이머를 이용하여 증폭하여 250bp 산물을 얻었다.

그 결과, 도 4A와 같이 TRAP220 및 TRAP80 둘다 T0901317에 반응하여 내인성 SREBP-1c 프로모터의 LXRE에 동원되었다. 또한, SREBP-1c 프로모터에 대한 TRAP220 및 TRAP80의 동원에 대한 히스톤 아세틸화 효과를 검토하였다. 즉, 히스톤 아세틸트랜스페레이즈 저해제인 가시놀(garcinol)의 처리에 의해 TRAP220 및 TRAP80 동원 뿐 아니라, 예상한 대로 아세틸화된 H4 수준도 억제되었다. 특히, TRAP80은 TRAP220보다 SREBP-1c 프로모터의 아세틸화 상태에 대해 보다 민감하였다. ABCA1 프로모터에 대한 TRAP80의 동원은 리간드 및 히스톤의 아세틸화 상태에 대해 덜 반응하는 반면, TRAP220은 ABCA1 및 SREBP-1c 프로모터 둘다에 유사한 동원 패턴을 나타내었다(도 4B). TRAP80은 염색질 관점에서 ABCA1 및 SREBP-1c에 상이한 효과를 나타내었다.

<실시예 6> TRAP80에 의한 LXR 표적 유전자의 상이한 조절 효과

앞서 살펴본 바와 같이, 루시페레이즈 리포터 분석에서, TRAP80은 ABCA1 및 SREBP-1c 프로모터 상에서 리간드 의존적으로 LXRa의 전사 활성을 상향조절하였다(도 3). 한편, TRAP80은 리간드에 반응하여 SREBP-1c 프로모터로의 동원이 증가되었지만, ABCA1 프로모터로의 동원은 리간드의 존재와 연관되어 있지 않았다(도 4). 이러한 차이를 증명하기 위하여, TRAP80 siRNA (Santa Cruz, sc-38575)를 HepG2 세포에 형질감염시키고, T0901317을 18시간 동안 처리한 후 Trizol (Invitrogen)을 사용하여 전체 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 DNaseI (10u/mg of total DNA) 처리하고, Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (Promega)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 이후 만들어진 cDNA를 주형으로 사용하고, SYBR green PCR master mix와 ABI PRISM 7000 장비를 사용하여 SREBP-1c와 ABCA1 유전자에 대한 정량 실시간 PCR을 수행하여 SREBP-1c 및 ABCA1 전사물 수준을 결정하였다(도 5). 이 때 scrambled siRNA를 음성대조군으로 사용하였으며, PCR primer는 Primer Express 2.0 software를 사용하여 디자인하였다.

그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이 TRAP80 siRNA는 T0901317 존재 유무에 상관없이 유의성있게 SREBP-1c 전사물 생성을 억제하였다. 한편, ABCA1 전사물 수준은 TRAP80 siRNA에 의해 유의성 있는 변화를 보이지 않았다. 이러한 결과는 LXR의 표적유전자인 SREBP-1c와 ABCA1가 TRAP80에 의해 다르게 조절되며, TRAP80의 억제는 LXR의 표적유전자 중 SREBP-1c를 선택적으로 억제할 수 있음을 의미한다.

Claims

TRAP80 조절제를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 TRAP80 조절제는 TRAP80 발현을 억제하는 siRNA 및 TRAP80에 특이적으로 결합하는 항체로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 TRAP80 조절제는 SREBP-1c의 전사를 선택적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 대사증후군은 동맥경화, 간질환, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 비만, 고혈압, 과인슐린혈증, 과혈당증, 1형 및 2형 당뇨병, 인슐린 내성을 특징으로 하는 이상지혈증, 발기부전, 심혈관계질환 및 허혈성질환으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 간질환은 알콜성 및 비알콜성 간의 지질대사 이상으로 인한 지방간, 간염 및 간경화로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, LXR 효능제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 6에 있어서, 상기 LXR 효능제는 LXRα 효능제인 것을 특징으로 하는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학조성물.
대사증후군 환자의 혈액 또는 조직과 후보약물을 접촉시키는 단계; 및 후보약물에 의해 LXR과 TRAP80 간의 상호작용이 억제되는지 여부를 평가하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 대사증후군 치료제용 약물의 스크리닝 방법.
환자의 시료로부터 TRAP80 발현 프로파일을 얻는 단계; 및 상기 TRAP80 발현 프로파일을 정상인의 시료로부터 얻어진 TRAP80 발현 프로파일과 비교하여 평가하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 대사증후군의 진단방법.
TRAP80 조절제를 투여하여 LXR과 TRAP80 간의 상호작용을 억제하는 것을 특징으로 하는 LXR 효능제의 부작용 경감방법.
청구항 10에 있어서, 상기 TRAP80 조절제는 TRAP80 발현을 억제하는 siRNA 및 TRAP80에 특이적으로 결합하는 항체로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 LXR 효능제의 부작용 경감방법.
청구항 10 또는 청구항 11에 있어서, 상기 TRAP80 조절제는 SREBP-1c의 전사를 선택적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 LXR 효능제의 부작용 경감방법.
청구항 12에 있어서, 상기 LXR 효능제는 LXRα 효능제인 것을 특징으로 하는 LXR 효능제의 부작용 경감방법.
청구항 13에 있어서, 상기 LXRα 효능제는 대사증후군 치료제, 알츠하이머병 치료제 및 니만피크병 치료제로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 LXR 효능제의 부작용 경감방법.
청구항 13에 있어서, 상기 LXRα 효능제는 22(R)-하이드록시콜레스테롤, 24(S),25-에폭시콜레스테롤, 24(S)-하이드록시콜레스테롤, 27-하이드록시콜레스테롤, 콜레스테노익산, T-314407, T-0901317, GW3965, SB742881, GSK 2186, WAY-252623(LXR-623), WAY-254011, WYE-672, DMHCA(N,N-Dimethyl-3b-hydroxycholenamide), 4-(3-바이아릴)퀴놀린 설폰, F₃MethylAA, APD(acetyl-podocarpic dimer), 포도카르픽 이미드 이합체(podocarpic imide dimer), CRX000541, CRX000864, CRX000929, CRX000823, CRX000987, CRX001093, CRX001094, CRX156651, CRX000909, CRX000908, CRX000369, CRX001045, CRX001046, LN7181, LN7179, LN7172, LN6672, LN7031, LN7033, LN6500, LN6662, 리카르딘 C(Riccardin C), XL-652, DY136, DY142 및 하이포콜라마이드(3a,6a-dihydroxy-5b-cholanoic acid-N-methyl-N-methoxy-24-amide)로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 LXR 효능제의 부작용 경감방법.
청구항 10 또는 청구항 11에 있어서, 상기 LXR 효능제의 부작용은 혈청 트리글리세라이드 및 간 트리글리세라이드의 증가를 포함한 지방산 대사에서의 원치않는 효과인 것을 특징으로 하는 LXR 효능제의 부작용 경감방법.