KR20110138414A - 급성 골수성 백혈병의 치료 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 분자 의학 분야에 속하며, 급성 골수성 백혈병의 치료 방법을 제공한다. 이러한 방법은 마이크로RNA-9/9*의 과다발현이 시험관내에서 골수성 분화를 차단한다는 점에서 마이크로RNA-9 및 마이크로RNA-9*가 질병의 병인에 관여한다는 발견에 기초한다. 보다 구체적으로, 마이크로RNA-9/9*는 급성 골수성 백혈병의 백혈병 전환에 일정한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다.

Description

급성 골수성 백혈병의 치료 방법{METHOD FOR THE TREATMENT OF ACUTE MYELOID LEUKEMIA}
본 발명은 분자 의학 분야에 속하며, 급성 골수성 백혈(AML)의 치료 방법을 제공한다. 이러한 방법은 마이크로RNA-9/9*의 과다발현이 시험관내에서 골수성 분화를 차단한다는 점에서 마이크로RNA-9 및/또는 마이크로RNA-9*(마이크로RNA-9/9*)가 질병의 병인에 관여한다는 발견에 기초한다. 보다 구체적으로, 마이크로RNA-9/9*는 급성 골수성 백혈병의 백혈병 전환에 일정한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다.
급성 골수성 백혈병은 상이한 분화 단계에서 차단되는, 조혈 전구세포의 비조절된 클론 과성장을 특징으로 하는 매우 이질적인 악성 질병이다. 가변적인 임상 생물학 및 예후가 체세포유전 이상, 예컨대 t(15;17), t(8;21), inv(16), 11q23, 3q26 이상 및 모노솜 핵형(1-3) 및 다양한 유전자 돌연변이에 의해 주로 결정된다. 중요한 예는 뉴클레오포스민-1(NPM1), fms-유사 티로신 키나아제 수용체(FLT3-내부 순차 중복(ITD)) 및 CCAAT 결합 전사 인자 CEBPA(4-7)의 돌연변이가 있다. 이러한 후천적 유전적 변이는 공존할 수 있고, 백혈병 발병시 상승적으로 협력하는 것으로 여겨진다.
AML의 병인은 궁극적으로 조혈 전구세포의 악성 전환을 유도하는 세포 분화, 증식 및 세포자멸사에 영향을 미치는 다단계 과정이다. 병인론적 관념은 백혈병 전환을 위해 둘 이상의, 아마도 대부분의 경우 여러 번의 충돌이 요구된다는 것이다. 유전적 이상(유형 1)의 한 범주는 증식 신호의 구조적 활성화를 일으키고, 신호 분자, 예컨대 RAS, FLT3 및 c-KIT를 포함한다. 제 2 유형의 병변(유형 2), 예컨대 전사 인자를 포함하는 염색체 병변 t(8;21) 또는 inv(16)의 결과로서 융합 유전자의 형성은 골수성 분화를 차단시킨다. 마우스 모델에서의 다양한 연구는 AML 발병시 두 가지 유형의 유전적 탈조절의 협력 작용을 확립시켰다.
ALM에서 비정상적으로 발현된 유전자에 대한 다량의 정보가 존재한다. 보통, AML 및 이의 임상적 서브그룹의 진단은 총체적으로 분류자로서 지칭되는 유전자 프로파일의 발현을 기준으로 한다.
최근에, AML에서 마이크로RNA 발현 프로파일링은 또한 고도의 특이적인 마이크로RNA 발현 프로파일을 나타내는 것으로 입증되었다(8).
마이크로RNA는 전사후 유전자 발현을 조절하는 소 비코딩 RNA의 유형이다(9). 이들은 mRNA의 3' 비번역된 영역(3'UTR)에서의 서열과 염기 쌍을 형성하여 그의 표적 mRNA 전사물의 번역을 억제하거나 분해를 유도함으로써 유전자 발현을 조절한다. 지금까지, 400개 이상의 마이크로RNA가 인간에서 설명되어 왔지만, 이러한 조절 비코딩 RNA의 정확한 기능은 매우 불분명한 채로 있다.
차등 발현된 마이크로RNA는 특정한 AML 유전자형을 특징화하는 것으로 보인다. 몇몇 확립된 종양발생 및 종양 억제자 마이크로RNA, 예컨대 마이크로RNA-155, 마이크로RNA-21 및 let-7은 AML의 특이적 유전적 아형과 결합되는 것으로 보인다(8).
루(Lu) 등은 마이크로RNA 유전자 활성의 패턴이 몇몇 종류의 인간 암들을 구별지을 수 있다는 것을 입증하였다(10). 이들은 새로운 비드-계 유세포분석 마이크로RNA 발현 프로파일링 방법에서 마이크로RNA를 암호화하는 217개의 유전자의 활성을 측정하였다. 따라서, 마이크로RNA 형은 암 분류를 가능하게 할 수 있다. 이러한 발견으로 인해, 암을 발생시키는 원시 조직 유형을 결정하고, 원시 조직 유형을 기준으로 한 치료 과정을 표적화하도록 허용할 수 있다. 루 등은 정상 조직과 비교하여 종양에서 마이크로RNA의 전반적인 하향조절을 관찰하였다.
더 나아가, 이들은 마이크로RNA 발현 프로파일을 사용하여 불완전하게 분화된 종양을 성공적으로 분류할 수 있었지만, 동일한 샘플에 적용하는 경우 전령 RNA 프로파일은 매우 부정확하였다. 이러한 발견은 암 진단시 마이크로RNA 프로파일링의 잠재성을 강조한다.
최근의 연구는 AML의 마이크로RNA 발현 형과 (세포)유전의 하위세트 간의 관계를 입증하였다(8, 11, 12). 더 나아가, 마이크로RNA-233, -128a -128b 및 let7b를 함유하는 마이크로RNA 발현 형이 급성 림프모구 백혈병 ALL로부터 AML을 정확하게 구별할 수 있다는 것을 입증하였다(13).
마이크로RNA-191 및 -199a의 증가된 발현은 AML의 한 연구에서 열등한 생존과 관련되었다(12).
세포유전적 정상 AML의 마이크로RNA 형은 부정적 예후에 대한 전조인 것으로 확인되었다(14).
또 다른 연구는 let-7/miR-98 클러스터가 일반적으로 하향조절되는 반면, 마이크로RNA-21, 마이크로RNA-155, 마이크로RNA-181b, 마이크로RNA-221 및 마이크로RNA-222는 고형 및 혈액작용 종양에서 종종 상향조절된다는 것을 입증하였다(15).
첸(Chen) 및 그의 동료는 최초로 정상 마우스 골수로부터 마이크로RNA를 클로닝하고, 조혈 조직에서 우선적으로 발현되는 마이크로RNA-223, -142 및 -181을 발견하였다. 마이크로RNA-233은 CD34+ 조혈 전구세포(HPC)에서 낮은 수준으로 발현되는 것으로 밝혀졌고, 이러한 발현은 과립구를 향한 골수성 분화 동안 증가되었다.
이러한 연구 및 다른 연구가 AML의 진단을 위해 중요한 정보를 제공함에도 불구하고, 이들 연구는 AML의 신규한 치료법을 위한 통찰을 제공하지 못하는데, 왜냐하면 이들 연구가 특정 유전자 또는 마이크로RNA의 과다발현 또는 불충분발현이 부수적인 현상인지 또는 질병의 병인에 기여하는지를 확립하지 못하였기 때문이다.
최근에, 단지 몇몇 문헌에서 암 치료에서 마이크로RNA의 관련성을 대두시켰다. 몇몇 암에 관련된 단백질인 과다 c-myc를 생성하도록 변경된 마우스 연구는 miRNA 17-92 폴리시스트론이 암 발병에 영향을 미친다는 것을 입증하였다. 림프종 세포에서 발견되는 마이크로RNA의 유형을 과잉 생성하도록 유전공학 처리된 마우스는 50일 내에 질병이 발병되었고, 2주 후에 죽었다. 반면, 과잉 마이크로RNA가 없는 마우스는 100일에 걸쳐 생존하였다(17). 이러한 연구는 비코딩 RNA, 구체적으로 마이크로RNA가 종양 형성을 조절할 수 있고, 잠재적인 인간 종양유전자로서 마이크로RNA-17-92 클러스터를 관련시킨다는 것을 보여준다.
t(2;11)에 직접 연결된, 마이크로RNA-125b 과다발현은 백혈병 유발시 이러한 마이크로RNA의 기능을 수반하는 시험관내 골수성 세포 분화를 폐기하는 것으로 보인다(18).
마우스 골수에서 마이크로RNA-155의 과다발현은 골수성 신생물의 병리학적 특징을 갖는 과립구/단핵구 개체군을 확장시킨다(19).
AML에서, 마이크로RNA-155의 상향조절은 키나아제 수용체 Fms-유사 티로신 키나아제-3(Flt3)의 유전자, 이른바 FLT3-ITD의 돌연변이와 관련된다.
최근 연구에서, MLL 융합 단백질에 의한 마이크로RNA-196b의 증가된 발현은 증가된 세포 증식 용량 및 생존뿐만 아니라 시험관내 분화의 부분적 차단을 통해 AML의 발병에 기여하는 것으로 제시되었다(20).
또 다른 연구는 마이크로RNA의 두 가지 유형(miRNA-17-5p 및 miRNA-20a)이 E2F1 단백질을 억제하여 세포 증식을 조절한다는 것을 발견하였다.
조니디스(Johnnidis) 등은 대립유전자 기능이 손실된 마우스를 사용하여, 마이크로RNA-223이 Mef2c, 즉 골수성 전구세포 증식을 촉진하는 전사 인자를 표적화함으로써 전구세포 증식 및 과립구 분화를 음성적으로 조절한다는 것을 입증하였다(21).
급성 전골수성 백혈병 세포주 모델을 사용하여, 마이크로RNA-223, CEBPA 및 NF1A의 자동조절 모델이 제시되어 왔다(22). 더 나아가, PU.1은 마우스에서 마이크로RNA-223 전사를 활성화시키는 것을 발견하였다(23).
세포주 HL60의 단핵구/대식세포 분화 동안 현저하게 차등 발현된 마이크로RNA가 식별되었다(24). 세포주 모델로부터 얻은 결과 외에도(25, 26), 일차 인간 세포를 사용하는 정상 골수성 분화 동안의 마이크로RNA 발현 프로파일에 대해서 매우 제한된 데이터를 이용할 수 있다(27).
기능적인 연구는 let-7/miR-98이 RAS(28) 및 v-myc 골수구종증 바이러스 종양유전자 동족체(MYC)(29)를 음성적으로 조절하는 반면, 마이크로RNA-21은 세포예정사 4(PDCD4)(30) 및 포스파타제 및 텐신 동족체(PTEN)(31)를 음성적으로 조절한다는 것을 입증하였다.
이러한 발견에도 불구하고, 암의 치료, 특히 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료를 위해 추가적이고 보다 특이적인 표적에 대한 필요성이 존재한다.
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본 발명자들은 정상 조혈 전구세포와 비교하여 AML에서 비정상 발현되는 후보 마이크로RNA를 식별하였다. 마이크로RNA-9/9*는 많은 양의 AML 샘플에서 강하게 과다발현되는 것으로 보이고, 전환 과정에 활성적으로 관여한다.
또한, 본 발명자들은 마이크로RNA-9/9*가 급성 골수성 백혈병의 치료를 위한 흥미로운 표적을 제공한다는 것을 발견하였다. 본 발명자들의 실험은, 마이크로RNA-9/9*가 시험관내 뮤린 성장 인자 의존성 골수성 세포주 32D에서 과립구 분화시 차단을 유도한다는 것을 입증하였다. 이로 인해, 마이크로RNA-9/9*와 그의 표적 간의 결합을 방해함으로써 급성 골수성 백혈병이 효과적으로 치료될 수 있는 것으로 결론지을 수 있다.
따라서, 본 발명은 마이크로RNA-9/9*와 그의 표적 간의 결합과 상호작용할 수 있는 화합물을 활성 성분으로서 포함하는 치료 조성물을 치료가 필요한 환자에게 투여하는, AML을 치료하는 방법에 관한 것이다.
도 1: 마이크로RNA-9는 일차 인간 AML에서 현저하게 과다발현된다.
SDS 2.3 소프트웨어(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems))를 사용하여 실시간 RT-PCR에 의해 얻은 마이크로RNA-9 발현 데이터를 분석하였다. 몇몇 snRNA(소 핵 RNA) 발현의 기하 평균을 내부 정규화를 위해 사용하였다. 비교 상대 정량화 방법인 2-ddCt를 사용하여, 정상 CD34+ 세포와 비교하여 AML에서 마이크로RNA-9의 상대 발현(배수 변화)을 계산하였다. 마이크로RNA-9의 상대 발현(배수 변화)은 코호트(수평 축)에서 모든 215개의 AML 샘플에 대해 수직 축에 존재하였다.
도 2: 마이크로RNA-9는 일차 인간 AML에서 현저하게 과다발현된다.
SDS 2.3 소프트웨어(어플라이드 바이오시스템스)를 사용하여 실시간 RT-PCR에 의해 얻은 마이크로RNA-9 발현 데이터를 분석하였다. RNU48의 발현을 내부 정규화를 위해 사용하였다. -dCt 값에 의해 표시되는 내부 대조군에 대한 발현이 코호트(수평 축)에서 모든 215개의 AML 샘플에 대해 상이한 과립구 돌연변이 단계에 대한 수직 축에 존재하였다.
도 3: 마이크로RNA-9*는 일차 인간 AML에서 현저하게 과다발현된다.
SDS 2.3 소프트웨어(어플라이드 바이오시스템스)를 사용하여 실시간 RT-PCR에 의해 얻은 마이크로RNA-9* 발현 데이터를 분석하였다. RNU24 및 RNU66 발현의 기하 평균을 내부 정규화를 위해 사용하였다. -dCt 값에 의해 표시되는 miR-9*의 내부 대조군에 대한 발현이 코호트(수평 축)에서 모든 215개의 AML 샘플에 대해 수직 축에 존재하였다.
도 4: 정상 인간 과립구형성에서 마이크로RNA-9/9* 발현.
SDS 2.3 소프트웨어(어플라이드 바이오시스템스)를 사용하여 실시간 RT-PCR에 의해 얻은 마이크로RNA-9 및 miR-9* 발현 데이터를 분석하였다. RNU48의 발현을 내부 정규화를 위해 사용하였다. -dCt 값에 의해 표시되는 내부 대조군에 대한 발현이 상이한 과립구 돌연변이 단계에 대한 수직 축에 존재하였다.
도 5: 32D 세포주에서 마이크로RNA-9/9*의 과다발현은 골수성 분화의 차단을 유도한다.
GFP(녹색 형광 단백질) 리포터를 함유하는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 마이크로RNA-9/9* 또는 대조군 벡터를 뮤린 골수성 백혈병 세포주(32D)로 형질도입하였다. 높은 GFP 발현을 갖는 세포를 분류하고 증식/분화 분석에 사용하였다. 마이크로RNA-9/9*의 과다발현은 IL-3 보충 배지에서 성장하는 32D 세포의 증식 용량에 대해 어떠한 영향도 주지 않았다. 그러나, G-CSF 함유 배지에서 이들을 성장시킬 경우, 마이크로RNA-9/9* 형질도입된 세포는 계속 증식하였지만 대조군 벡터와 함께 형질도입된 세포는 성장이 감소하였다.
도 6 내지 11: 일차 인간 AML 세포의 증식에 대한 마이크로RNA-9* 억제제의 음성적 효과
miR-9* 또는 대조군 억제제에 대한 LNA(잠금 핵산)계 안티센스 억제제를, 150mM의 농도를 사용하여 형질감염시킴으로써 새롭게 단리된 AML 모세포로 도입시켰다. AML 야생형 모세포 또는 대조군- 및 miR-9* 억제제로 형질감염된 세포의 증식을 [3H] 티미딘 도입 분석을 3회 사용하여 다양한 사이토카인 자극 조건하에 측정하였다. 상이한 AML 환자로부터의 2개의 독립적인 샘플(샘플 I 및 II)은 대조군 억제제 및 야생형 대조군 세포와 비교할 경우 miR-9*에 대한 억제제로 치료시 세포 증식이 감소되는 것으로 나타났다.
본 발명은 마이크로RNA-9/9*가 급성 골수성 백혈병 AML의 백혈병 전환에 일정한 역할을 한다는 것을 발견하였다.
본원에서 사용되는 용어 "miRNA 9/9*"는 마이크로RNA 9 및/또는 마이크로RNA 9*를 나타내고자 한다.
마이크로RNA는 18 내지 25개의 뉴클레오타이드를 갖는 단일 가닥 RNA이고, 전구체 분자로부터 생성된다. 마이크로RNA는 게놈에서 암호화되고, 핵 RNase III, 드로샤(Drosha) 및 이중 가닥 RNA 결합 단백질, 파샤(Pasha)/DGCR8에 의해 하나 이상의 전구체-마이크로RNA(프레-마이크로RNA)로 핵에서 처리되는 프라이-마이크로RNA로 불리는 일차 전사물로서 RNA 폴리머라제 II에 의해 전사된다. 세포질에서, 다이서(Dicer)로서 공지된 다른 RNase III은 이중 가닥 23-뉴클레오타이드 성숙 마이크로RNA에서 프레-마이크로RNA를 추가로 처리한다. 이러한 마이크로RNA 중복 부위는 RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)로 혼입되는 가닥(마이크로RNA 가닥) 및 보통 분해되는 상보성 가닥(마이크로RNA* 가닥)을 포함한다(34).
성숙 마이크로RNA* 가닥이 또한 동시 발현된다는 몇몇 예외 상황이 존재한다. 이는 마이크로RNA-9를 갖는 경우인데, 마이크로RNA-9*가 또한 일반적으로 발현되고 분해되지 않기 때문이다.
성숙 마이크로RNA-9 및/또는 마이크로RNA-9*를 갖는 기능성 RISC는 그의 표적 유전자 mRNA의 3'UTR에 결합하여 mRNA 분해 또는 단백질 번역 억제를 일으킬 수있다(35, 36).
마이크로RNA-9 및 마이크로RNA-9*를 암호화하는 유전자는 인간 염색체 1(miR-9-1), 5(miR-9-2) 및 15(miR-9-3)에 위치한다. 이러한 상이한 마이크로RNA-9 전구체의 처리시에, 대부분의 상보성 성숙 마이크로RNA-9(UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA, 서열 식별 번호: 1) 및 마이크로RNA-9*(AUAAAGCUAGAUAACCGAAAGU, 서열 식별 번호: 2)가 유도된다.
마이크로RNA-9는 뇌에 풍부하고, 뇌 발달 및 계통 결정에 중요한 것으로 보인다(37, 38). 제브라피시에서, 마이크로RNA-9는 중뇌-후뇌 경계 한정을 위해 중요하다(39). 마우스 피질 발달시에, 마이크로RNA-9는 카잘-레트지어스(Cajal-Retzius) 세포의 적절한 분화에 필수적인 것으로 보인다(40). 마이크로RNA-9는 REST 및 CoREST를 조절하고, 헌팅톤 질병을 하향조절한다(41). 마이크로RNA-9는 레티노산에 의해 인간 신경모세포종 세포주에서 상향조절되고, 일차 신경모세포종 종양을 하향조절한다(42). 마이크로RNA9의 증가된 발현은 아형 NPMc+를 갖는 AML 환자(문헌[Ramiro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2008) 105, 3945-3950]) 및 아형 11q23(문헌[Jongen-Lavrencic et al., Blood (2008) 111; 5078-5088])에서 설명되어 왔다.
베타 세포에서 발현되는 마이크로RNA-9의 증가된 발현은 글루코스-자극 인슐린 방출을 손상시킨다(43). 분비 기능의 후 교란은 인슐린 세포외유출에 대해 음성 조절 역할을 하는 그라뉴필린(granuphilin)(SYTL4) Rab3/Rab 27 효과기의 수준 증가와 관련된다.
또한, 마이크로RNA-9는 기관지 발암 과정에서 연속적인 단계로 차등 발현되는 것으로 보인다(44). 로카로(Roccaro) 등은 마이크로RNA-9의 발현이 감소된 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia)에 특이적인 마이크로RNA 형을 식별하였다. 최근에, 급성 림프모구 백혈병(ALL)에서 과메틸화 및 마이크로RNA-9의 감소된 발현은 이들 환자의 임상적 결과와 상관되는 것으로 보고되었다(46).
본 발명자들은 마이크로RNA-9 및 마이크로RNA9*가 둘 다 일차 인간 AML에서 현저하게 과다발현된다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 마이크로어레이 유의성 분석(SAM)을 사용하여 통제되는 분석을 수행하였다.
모든 AML 샘플의 마이크로RNA 발현을 정상 골수 CD34+ 세포의 마이크로RNA 발현 패턴과 비교하였다. 가장 구별되는 마이크로RNA 중 하나는 마이크로RNA-9 및 마이크로RNA-9*였고, 둘 다 AML에서 100배 이상 상향조절된 것으로 나타났다. 이러한 것을 마이크로RNA-9에 대해서 도 1에 나타내었고, 마이크로RNA 9 및 9*에 대해서 도 2 및 3에 나타내었다. 마이크로RNA-9*에 대해 얻은 결과를 마이크로RNA 9에 대해 얻은 결과와 동일하지 않은지를 비교하였다.
또한, 본 발명자들은 마이크로RNA-9 및 마이크로RNA9*가 정상 골수형성 동안 매우 낮은 수준으로만 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 정상 골수로부터 고도로 정제된 세포 개체군에서 골수성 발달 동안 및 정상 인간 CD34+ 세포의 시험관내 골수성 분화 분석 동안 발현을 평가하여, 조혈 분화시 마이크로RNA-9 및 마이크로RNA9*의 역할을 연구하였다.
두 가지 접근법을 사용할 경우, 마이크로RNA-9 및 마이크로RNA-9*의 발현은 골수성 전구세포에서 정량 RT-PCR 분석의 검출 수준에 있었고, 과립구 분화가 전골수세포, 후골수세포를 통해 성숙 중성구로 진행하도록 유지되었다. 이를 도 4에 나타내었다.
이러한 데이터는 마이크로RNA-9 및 마이크로RNA-9*가 정상 골수성 분화시 기능을 갖지 않는 것을 보여준다. 본 발명자들은 상술한 바와 같이 AML에서 마이크로RNA-9/9*의 비정상 발현이 AML의 분화 단계를 반영한다기 보다 오히려 백혈병 유발과 관련되는 것으로 결론지었다. 또한, 본 발명자들은 32D 세포(뮤린 골수성 백혈병 세포주)의 골수성 분화시에 및 시험관내 일차 뮤린 골수 세포에서 miRNA-9/9*가 차단을 유도하는 것을 발견하였다. 이러한 목적으로, 마이크로RNA-9/9*는 32D 세포주로 레트로바이러스성 형질도입된다. 이러한 세포주는 인터류킨-3(IL-3)이 배지에 첨가되는 경우 증식되지만 IL3이 과립구 집락 자극 인자(G-CSF)로 대체되는 경우 중성구를 향해 분화될 수 있는 것으로 공지되어 있다. 32D 세포의 혈액세포학(사이토스핀(cytospin)) 세포 염색을 사용하여, 본 발명자들은 IL-3 조건하에서 분화를 차단하고, G-CSF 조건하에서 영구 세포 증식을 차단하는 것을 관찰하였다(도 5). 또한, 마이크로RNA-9 및 마이크로RNA-9*를 일차 뮤린 골수 세포로 도입시켰다. 마이크로RNA-9/9* 과다발현은 유세포분석에 의해 밝혀진 바와 같이 시험관내 성숙 중성구(CD11b + Gr1 + 세포)의 수를 감소시켰다. 이는 32D 세포주에서의 본 발견을 보강한다.
G-CSF를 사용하는 분화 분석 동안 여러 시점에서(제 0 일, 제 3 일, 제 7 일, 제 10 일 및 제 15 일) 사이토스핀 염색을 수행하였다. 대조군 벡터와 함께 형질도입된 32D 세포는 제 0 일째에 모세포로부터 제 7 일째에 완전한 성숙 과립구로 분화되었다. 흥미롭게도, 마이크로RNA-9/9*와 함께 형질도입된 32D 세포에서, 분화가 차단되는 것으로 관찰되었는데, 이는 제 7 일째 및 모든 그 뒤의 시점에서 성숙 과립구가 관찰되지 않았기 때문이다.
또한, 마이크로RNA-9/9*를 일차 뮤린 골수 세포로 도입시켰다. 레트로바이러스 벡터를 사용한 마이크로RNA-9/9* 과다발현은 면역표현형에 의해 시험된 시험관내 성숙 중성구(CD11b + Gr1 + 세포)의 비율을 감소시켰다.
본 발명자들은 일차 인간 AML 세포를 miRNA 9* 억제제와 접촉시킴으로써 일차 인간 AML 세포의 증식을 억제할 수 있었다. 이는 도 6 내지 11에 나타난다. mi-9*에 대한 LNA(잠금 핵산)계 안티센스 억제제 또는 대조군 억제제를, 150mM의 농도를 사용하여 형질감염시킴으로써 새롭게 단리된 AML 모세포로 도입시켰다. AML 야생형 모세포 또는 대조군- 및 miR-9* 억제제로 형질감염된 세포의 증식을, [3H] 티미딘 도입 분석을 3회 사용하여 다양한 사이토카인 자극 조건하에 측정하였다. 여러 환자로부터 얻은 2개의 독립적인 AML 샘플은 대조군 억제제 및 야생형 대조군 세포와 비교할 경우 miR-9*에 대한 억제제로 치료시 세포 증식이 감소되는 것으로 나타났다.
요약하면, 마이크로RNA-9/9* 과다발현은 기능적 표현형, 즉 골수성 분화의 차단을 유발한다는 것을 발견하였다. 이러한 결과에 기초하여, 본 발명자들은 마이크로RNA-9/9*가 AML에서 백혈병 전환에 일정한 역할을 하는 것으로 결론지었다. 또한, 본 발명자들은 마이크로RNA-9/9* 억제제가 실제로 AML 모세포의 증식을 효과적으로 차단한다는 것을 입증할 수 있었다. 게다가, 이러한 억제제는 AML에서 세포 증식 억제를 위한 효과적인 치료 화합물임을 입증하였다. 즉, 마이크로RNA-9 또는 마이크로RNA-9*의 그의 표적으로의 결합을 방해하는 화합물은 AML의 치료에 유용할 수 있다.
상술한 발견은 마이크로RNA-9/9*와 그의 세포 표적과의 상호작용의 방해를 가능하게 하여, AML의 치료 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 마이크로RNA-9 또는 9*와 그의 표적 간의 결합과 상호작용할 수 있는 화합물을 활성 성분으로서 포함하는 치료 조성물을 치료가 필요한 환자에게 투여하는, AML을 치료하는 방법을 제공한다.
다르게는, 상기 방해는 마이크로RNA-9/9* 전사 수준일 수 있고/있거나 세포에서 성숙 마이크로RNA-9/9*의 수준이 감소되도록 처리될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 마이크로RNA-9/9*, 바람직하게는 성숙 마이크로RNA-9 또는 9*의 세포 수준을 감소시킬 수 있는 화합물을 활성 성분으로서 포함하는 치료 조성물을 치료가 필요한 환자에게 투여하는, AML을 치료하는 방법에 관한 것이다.
이는 전구체 마이크로RNA-9 또는 9*의 전사 또는 처리를 방해하는 화합물을 제공함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 바람직하게는 본 발명은 상기 화합물이 전구체 마이크로RNA-9/9*의 전사 또는 처리를 방해할 수 있는 것인, 상기 기재된 방법에 관한 것이다.
마이크로RNA-9 및/또는 마이크로RNA-9*와 그의 표적의 상호작용을 방해할 수 있는 화합물은 당해 분야에 공지되어 있다. 이들은 두 개의 범주일 수 있다: 첫 번째로는, 결합 부위 또는 표적을 차단하고, 이를 마이크로RNA-9/9*에 대해 도달하기 어렵게 만듦으로써 결합을 방해하는 화합물 유형이 있고, 두 번째로는 마이크로RNA-9/9*가 그의 표적에 결합하지 못하도록 마이크로RNA-9/9*에 결합하는 화합물 유형이 있다.
첫 번째 유형의 화합물은 이들이 각 표적에 특이적이도록 개발될 수 있다. 이는 마이크로RNA-9/9*의 RNA 표적의 서열이 공지되어 있고, 상보성 뉴클레오타이드를 용이하게 개발할 수 있으므로, 당업자에게 통상적인 절차이다.
이러한 화합물을 개발하기 위해서, 당업자는 마이크로RNA - 표적 인식 원리를 알아야 한다. 이는 문헌[Brennecke et al., PLOS Biology, (2005) 3(3) e85; 0404-0418]에 기재되어 있다. 또한, miRNA-시드(seed) 및 보존에 기초한 잠재성 마이크로RNA 표적의 예측을 위해, 인실리코 알고리즘에 기초한 몇몇 웹 사이트가 이용가능하다(www.targetscan.org; www.pictart.org; www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/predicting). 이와 관련하여, 마이크로RNA-9 및 마이크로RNA-9*가 동일한 시드 서열을 공유하지 않기 때문에 이들이 완전히 상이한 표적 세트를 조절한다는 것을 주목하는 것이 중요하다.
마이크로RNA-9 및/또는 마이크로RNA-9*와 그의 표적과의 상호작용을 방해할 수 있는 화합물의 두 번째 부류는 마이크로RNA-9 또는 9*에 결합하여 이들이 임의의 마이크로RNA-9 또는 9* 표적에 결합하는 것을 방지하는 화합물의 유형이다.
바람직한 실시양태에서, 마이크로RNA-9 및/또는 마이크로RNA-9*와 그의 표적과의 상호작용을 방해할 수 있는 화합물은 성숙 마이크로RNA-9 또는 9*의 서열, 보다 특히 서열 식별 번호: 1 및 서열 식별 번호: 2에 나타난 서열에 본질적으로 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 화합물이다. 바람직하게는, 이러한 화합물은 6개 이상의 연속 뉴클레오타이드, 예컨대 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 이상의 뉴클레오타이드에 본질적으로 상보성이다. 이러한 화합물은 마이크로RNA-9/9*가 그의 표적에 결합하는 것을 방지하도록 생리적 조건하에서 마이크로RNA-9/9*에 효과적으로 하이브리드화된다. 바람직하게는, 상기 화합물은 마이크로RNA-9 또는 마이크로RNA-9* 전체에 하이브리드화된다.
이러한 화합물은 당해 분야에 공지되어 있고, 심지어 시판된다. 공지되어 있는 이러한 화합물의 예는 안타고미어(antagomir)(엑시콘(Exiqon)) 및 안티미어(antimir)(다르마콘(Dharmacon))로 불린다.
마이크로RNA-9/9*의 시드 서열은 표적 인식에 있어 중요하다. 시드 서열은 성숙 마이크로RNA의 5'의 위치 2에서 시작하는 6개 이상의 뉴클레오타이드로 구성된다. 이는 3' 방향으로 더욱 연장될 수 있지만, 일반적으로 8개 이하의 뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 고려된다. 따라서, 성숙 마이크로RNA-9의 시드 영역은 뉴클레오타이드 서열 CUUUGG, CUUUGGU 또는 CUUUGGUU를 포함한다. 성숙 마이크로RNA-9*의 시드 영역은 뉴클레오타이드 서열 UAAAGC, UAAAGCU 또는 UAAAGCUA를 포함한다.
그러므로, 본 발명은 바람직하게는 마이크로RNA-9 또는 마이크로RNA-9*의 시드 서열과 상호작용할 수 있는 화합물에 관한 것이다. 바람직하게는, 이러한 화합물은 생리적 조건하에서 시드 서열에 하이브리드화될 수 있다. 마이크로RNA-9/9*의 시드 서열에 본질적으로 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 화합물이 바람직하다.
이러한 화합물 및 추가의 화합물은 공지된 기법, 예를 들면 마이크로RNA-9 또는 9*가 후보 야생형 및 돌연변이된 표적의 3'UTR에 결합하게 하는 레닐라 루시퍼라제(Renilla Luciferase) 분석을 사용하여 용이하게 발견될 수 있다. 또한, 본 발명에 유용한 추가의 화합물은 후보 마이크로RNA9/9* 표적의 단백질 수준을 시험할 수 있고, 억제 화합물과 함께 과다발현된 마이크로RNA9/9*를 갖거나 갖지 않은 세포와 비교할 수 있는 면역블로팅(웨스턴 분석(Western assay))에 의해 발견될 수 있다. 따라서, 본 발명은 AML의 치료를 위해 마이크로RNA-9/9*와 그의 표적 간의 결합과 상호작용할 수 있는 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 AML의 치료를 위해 마이크로RNA-9/9*의 세포 수준을 감소시킬 수 있는 화합물에 관한 것이다.
요약하면, 본 발명은 AML의 치료를 위해 마이크로RNA-9 및/또는 마이크로RNA-9*와 그의 표적 간의 결합과 상호작용할 수 있는 화합물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 AML의 치료를 위한 마이크로RNA-9/9*에 결합할 수 있는 화합물, 보다 구체적으로 마이크로RNA-9 및/또는 마이크로RNA-9*에 결합할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 화합물에 관한 것이다. 뉴클레오타이드 서열은 단백질 핵산(PNA) 또는 잠금 핵산(LNA), 또는 핵산 또는 핵산 결합 서열의 임의의 다른 형태를 포함하는 서열일 수 있다.
즉, 본 발명은 마이크로RNA-9/9*의 그의 표적으로의 결합을 방해할 수 있는 화합물을 치료가 필요한 환자에게 투여함을 포함하는, AML의 치료 방법에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 화합물은 성숙 마이크로RNA-9 또는 마이크로RNA-9*의 서열에 본질적으로 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이러한 화합물은 6개 이상, 바람직하게는 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드를 갖는 균주로 구성될 수 있다. 보다 더 긴 스트레치의 뉴클레오타이드가 또한 적합하다.
바람직하게는, 상기 화합물은 시드 서열에 결합한다. 이는 시드 서열에 하이브리드화되는 서열에 의해 달성될 수 있다. 즉, 이는 성숙 마이크로RNA의 5' 말단에서 제 2 뉴클레오타이드로부터 출발하는 마이크로RNA-9 및/또는 마이크로RNA-9*의 서열의 6개 이상의 뉴클레오타이드에 본질적으로 상보성인 서열을 포함한다. 이러한 화합물은 마이크로RNA로의 결합성이 매우 우수하며, 따라서 이들은 바람직하고, 이들 대부분은 마이크로RNA-9 및/또는 마이크로RNA-9*와 공통으로 7, 8, 9 또는 10개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 화합물과 같다.
이와 관련하여 용어 "본질적으로 상보성"은 서열이 60% 이상, 예컨대 70, 80, 85, 90 또는 90% 이상, 예컨대 95% 또는 심지어 100%의 서열 상동성을 나타내는 것을 의미한다.
성숙 마이크로RNA-9는 다음의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다: UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA(서열 식별 번호: 1). 성숙 마이크로RNA-9*는 뉴클레오타이드 서열 AUAAAGCUAGAUAACCGAAAGU(서열 식별 번호: 2)를 갖는다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 상기 화합물은 마이크로RNA-9 및/또는 마이크로RNA-9*의 전체 서열에 본질적으로 상보성인 서열을 포함한다.
종종, 본 발명에 따른 화합물 또는 치료제로부터 큰 이익이 될 수 있는 환자들만 치료하는 것이 바람직하다. 이에 대하여, 바람직하게는 마이크로RNA-9 또는 마이크로RNA-9*의 증가된 발현 수준을 특징으로 하는 AML을 갖는 환자가 치료된다. NPM1 돌연변이 또는 11q23 이상을 특징으로 하는 AML 서브그룹으로부터의 환자는 이들 환자가 이질 AML 코호트 내의 마이크로RNA-9 및 마이크로RNA-9*의 최고 상향 조절을 나타내기 때문에 바람직하다. t(8;21), 5/-7 및 CEPBA 돌연변이를 갖는 AML 환자의 서브그룹은 이들 환자에서 마이크로RNA-9/9*가 그 밖의 AML과 비교할 경우 하향조절되기 때문에 상기 치료에 대해 다소 덜 적당한 후보일 수 있다(문헌Jongen-Lavrencic et al., Blood 2008]).
당업자는 AML의 관련 서브그룹을 구별하는 방법(세포유전학 분석 및 분자 진단)을 알고 있다. 이와 관련하여 상승되거나 증가된 수준의 마이크로RNA-9/9*는 정상 수준, 즉 AML이 없는 정상 개체의 개체군에서의 마이크로RNA-9/9*의 수준보다 높은 마이크로RNA의 수준을 지칭한다.
실시예
실시예 1: 공지된 마이크로RNA-9 표적 원컷2(OC2)를 사용한 새로운 잠재성 마이크로RNA-9 억제 화합물의 활성 시험
루시퍼라제 분석: 원컷2(OC2) 전사 인자는 이미 마이크로RNA-9의 표적으로 서 식별되었다(43). 3'-UTR-OC2-luc 구조체를 생성하기 위해, 래트 oc2 유전자의 3'-UTR 단편을 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭하였고, psiCHECK-1 플라스미드(미국 위스콘신주 매디손 소재의 프로메가(Promega))의 다중 클로닝 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드의 다중 클로닝 부위는 중지 코돈과 인공 폴리아데닐화 부위 사이의 레닐라 루시퍼라제 유전자의 3'-UTR에 위치한다. PCR 프라이머의 서열은 다음과 같다: 센스, 5'-GGATGTCTCGAGTGTTTTCTACAAAG-3'(서열 식별 번호: 3) 및 안티센스, 5'-GAAGCAGCGGCCGTTGAGGCTCCTC-3'(서열 식별 번호: 4). psiCHECK-1(프로메가)의 레닐라 루시퍼라제 유전자의 3'-UTR에서 안티센스 배향으로 마이크로RNA-9 성숙 서열을 클로닝함으로써 마이크로RNA-9-센서 구조체를 수득할 수 있다.
에펙텐(Effectene) 형질감염 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아겐(Qiagen))를 사용하여 플라스미드의 일시적 형질감염을 수행하였다. 마이크로RNA-9 및 대조군 마이크로RNA의 일시적 형질감염과 관련된 실험을, 100nM RNA 중복 부위를 사용하여 리포펙타민 2000(인비트로겐(Invitrogen))에 의해 수행하였다. 이중-루시퍼라제 리포터 분석 시스템(프로메가)에 의한 형질감염 후 2일 째에 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 각각 반딧불이 루시퍼라제 SV40 pGL3 프로모터(프로메가) 또는 레닐라 루시퍼라제 pRLCMV(pRLrenilla)를 갖는 3'-UTR-OC2-luc 및 마이크로RNA-9-센서 공동 형질감염을 정규화를 위해 사용할 수 있다.
실시예 2: 공지된 마이크로RNA-9 * 표적 REST 및 CoREST를 사용하는 새로운 잠재성 마이크로RNA-9 * 억제 화합물의 활성 시험
루시퍼라제 분석: 표적 CoREST는 마이크로RNA-9*의 표적으로서 이미 식별되었다(문헌[Packer et al., J. neurosic. 2008(53) 14341-6]). 3'-UTR-CoREST-luc 구조체를 생성하기 위해, 유전자의 3'-UTR 단편을 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭하였고, psiCHECK-1 플라스미드(미국 위스콘신주 매디손 소재의 프로메가)의 다중 클로닝 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드의 다중 클로닝 부위는 중지 코돈과 인공 폴리아데닐화 부위 사이의 레닐라 루시퍼라제 유전자의 3'-UTR에 위치한다. PCR 프라이머의 서열은 다음과 같다: 센스, CoREST 3' UTR 5'-GCATCTCGAGGTGACCCCAGGGTGGTTGCCAC-3'(서열 식별 번호: 5) 및 5'-CGATGCGGCCGCGAATGGATCACTGTTGCAGA-3'(서열 식별 번호: 6). psiCHECK-1(프로메가)의 레닐라 루시퍼라제 유전자의 3'-UTR에서 안티센스 배향으로 마이크로RNA-9* 성숙 서열을 클로닝함으로써 마이크로RNA-9*-센서 구조체를 수득할 수 있다.
에펙텐 형질감염 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아겐)를 사용하여 플라스미드의 일시적 형질감염을 수행하였다. 마이크로RNA-9* 및 대조군 마이크로RNA의 일시적 형질감염과 관련된 실험을, 100nM RNA 중복 부위를 사용하여 리포펙타민 2000(인비트로겐)에 의해 수행하였다. 이중-루시퍼라제 리포터 분석 시스템(프로메가)에 의한 형질감염 후 2일 째에 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 각각 반딧불이 루시퍼라제 SV40 pGL3 프로모터(프로메가) 또는 레닐라 루시퍼라제 pRLCMV(pRLrenilla)를 갖는 3'-UTR-CoREST-luc 및 마이크로RNA-9*-센서 공동 형질감염을 정규화를 위해 사용할 수 있다.
실시예 3: 면역블로트 분석
웨스턴 블로트 분석을 위해, 빙냉 인산 완충 염수에서 세포를 1회 세척해야 하고, 단백질 추출물을 상술한 바와 같이 제조하였다(43). 단백질 15㎍을 SDS-PAGE에 적용하고, 폴리비닐리덴 다이플루오라이드 막으로 옮겼다. 막을 0.1% 트윈(Tween) 20 및 5% 우유를 함유하는 완충제에서 60분 동안 차단한 후, 래트 OC2(아미노산 36-311)에 대해 상승된 일차 항체로 4℃로 밤새 배양하였다(32). 양고추냉이 퍼옥시다제에 컨쥬게이트된 이차 항체로 60분 동안 막을 배양한 후 화학발광 기질(아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences))을 사용하여 면역반응성 밴드를 시각화해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Erasmus University Medical Center Rotterdam <120> METHOD FOR THE TREATMENT OF ACUTE MYELOID LEUKEMIA <130> 066 WO <140> PCT/EP2010/055355 <141> 2010-04-22 <150> EP09158496.1 <151> 2009-04-22 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> human <400> 1 ucuuugguua ucuagcugua uga 23 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> human <400> 2 auaaagcuag auaaccgaaa gu 22 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> rat <400> 3 ggatgtctcg agtgttttct acaaag 26 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> rat <400> 4 gaagcagcgg ccgttgaggc tcctc 25 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> rat <400> 5 gcatctcgag gtgaccccag ggtggttgcc ac 32 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> rat <400> 6 cgatgcggcc gcgaatggat cactgttgca ga 32

Claims (10)

  1. 마이크로RNA-9 및/또는 마이크로RNA-9*와 그의 표적간의 결합과 상호작용할 수 있는, 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료용 화합물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    마이크로RNA-9 및/또는 마이크로RNA-9*에 결합할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 화합물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    성숙 마이크로RNA-9 및/또는 마이크로RNA-9*의 서열의 6개 이상의 연속 뉴클레오타이드에 본질적으로 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 화합물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    마이크로RNA-9 및/또는 마이크로RNA-9*의 시드 서열에 본질적으로 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 화합물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    생리적 조건하에서 성숙 마이크로RNA-9/9*에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 화합물.
  6. 성숙 마이크로RNA-9 및/또는 마이크로RNA-9*의 세포 수준을 감소시킬 수 있는, AML의 치료용 화합물.
  7. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AML이 마이크로RNA-9 또는 마이크로RNA-9*의 증가된 발현 수준을 특징으로 하는 화합물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    AML이 NPM1 돌연변이 또는 11q23 염색체 이상을 특징으로 하는 서브그룹으로부터 선택되는 화합물.
  9. 마이크로RNA-9 및/또는 마이크로RNA-9*와 그의 표적 간의 결합과 상호작용할 수 있는 화합물을 활성 성분으로서 포함하는 치료 조성물을 치료가 필요한 환자에게 투여하는, AML의 치료 방법.
  10. 마이크로RNA-9 및/또는 마이크로RNA-9*의 세포 수준을 감소시킬 수 있는 화합물을 활성 성분으로서 포함하는 치료 조성물을 치료가 필요한 환자에게 투여하는, AML의 치료 방법.
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