JP2012524758A

JP2012524758A - 急性骨髄性白血病の治療方法

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Publication number: JP2012524758A
Application number: JP2012506504A
Authority: JP
Inventors: ローウェンベルグ，ボブ; ラフレンシス，モイツァ; バルク，ペーター，ヤコビュス，マリア; サン，スー，ミン
Original assignee: Erasmus University Medical Center
Current assignee: Erasmus University Medical Center
Priority date: 2009-04-22
Filing date: 2010-04-22
Publication date: 2012-10-18
Also published as: US20120088811A1; BRPI1016182A2; CN102421899A; KR20110138414A; CA2759597A1; EP2243833A1; MX2011010610A; EA201101531A1; EP2421968A1; WO2010122109A9; WO2010122109A1

Abstract

本発明は、分子医薬の分野に属し、急性骨髄性白血病の治療方法を提供する。これらの方法は、in vitroにおけるマイクロＲＮＡ−９／９^＊の過剰発現がミエロイド分化をブロックする点において、マイクロＲＮＡ−９およびマイクロＲＮＡ−９^＊が疾患の原因に関するという所見に基づく。特に、マイクロＲＮＡ−９／９^＊は、急性骨髄性白血病における白血病性形質転換において役割を果たしていることが見出された。

Description

本発明は、分子医薬の分野に属し、急性骨髄性白血病の治療方法を提供する。これらの方法は、in vitroにおけるマイクロＲＮＡ−９／９^＊の過剰発現がミエロイド分化をブロックする点において、マイクロＲＮＡ９および／またはマイクロＲＮＡ９^＊（マイクロＲＮＡ−９／９^＊）が疾患の原因に関するという所見に基づく。特に、マイクロＲＮＡ−９／９^＊は、急性骨髄性白血病における白血病性形質転換において役割を果たしていることが見出された。

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、分化のさまざまな段階でブロックされている造血前駆細胞の制御不能なクローナル伸長によって特徴付けられる、極めてヘテロジニアスな悪性疾患である。様々な、臨床生態および予後は、たとえば、ｔ（１５；１７）、ｔ（８；２１）、ｉｎｖ（１６）、１１ｑ２３、３ｑ２６の異常のような体細胞遺伝学的異常およびモノソーマル核型（１〜３）、ならびに様々な遺伝子変異によって主に決定される。顕著な例は、ヌクレオホスミン１（ＮＰＭ１）、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体（ＦＬＴ３−インターナルタンデムデュプリケイション（ＩＴＤ））およびＣＣＡＡＴ結合転写因子ＣＥＢＰＡにおける変異である（４〜７）。これらの後天性の遺伝子異常は、共存する可能性があり、白血病の発生に相乗的に協働していると考えられている。

ＡＭＬの病因は、最終的に造血前駆細胞の悪性転換を導く、細胞の分化、増殖、およびアポトーシスに影響を与える複数の段階からなるプロセスである。病因の概念は、おそらくほとんどの場合複数であり、少なくとも２つ該当することが白血病性形質転換のために必要である。遺伝子異常の第１カテゴリ（クラス１）は、増殖性シグナルの恒常的活性化をもたらし、ＲＡＳ、ＦＬＴ３、およびｃ−ＫＩＴのようなシグナル伝達分子に関する。転写因子を含む染色体の病変ｔ（８；２１）またはｉｎｖ（１６）がもたらす融合遺伝子の形成のような、第２タイプの病変（クラス２）は、ミエロイド分化のブロックをもたらす。マウスモデルにおける様々な研究は、ＡＭＬの発生における遺伝的逆行制御（genetic deregulation）の両者のタイプが協働することを確立した。

ＡＭＬにおいて異常に発現する遺伝子について豊富な情報がある。通常、ＡＭＬおよびその臨床的サブグループの診断は、まとめて分類子と称される遺伝子プロファイルの発現に基づく。

最近では、ＡＭＬにおけるマイクロＲＮＡ発現プロファイリングも、非常に特徴的なマイクロＲＮＡの発現プロファイルを示すことが明らかにされた（８）。

マイクロＲＮＡは、転写後に遺伝子発現を制御する小さな非コードＲＮＡの一種である（９）。それらは、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）における配列と塩基対を形成することによって遺伝子発現を制御し、それによって翻訳の抑制またはそれらの標的ｍＲＭＡ転写産物の分解を誘導する。今日、４００以上のマイクロＲＮＡがヒトにおいて記載されているが、これらの調節性非コードＲＮＡの正確な機能は、大部分が不明瞭なままである。

異なって発現するマイクロＲＮＡは、特定のＡＭＬの遺伝子型を特徴付けるようである。マイクロＲＮＡ−１５５、マイクロＲＮＡ−２１、およびｌｅｔ−７のような数種の確立された発癌性および腫瘍抑制性マイクロＲＮＡは、ＡＭＬの特定の遺伝的サブタイプに関連付けられるようである（８）。

Lu et al.（１０）は、マイクロＲＮＡの遺伝子活性のパターンがヒトの癌の数種類を区別することができることを示した。彼らは、新規のビーズベースフローサイトメトリーのマイクロＲＮＡ発現プロファイリング法によってマイクロＲＮＡをコードする２１７遺伝子の活性を測定した。したがって、マイクロＲＮＡの特性は、癌を分類することができる可能性がある。この知見は、癌を生成する元の組織の種類を判別することができ、元の組織の種類に基づいて治療方針を導くことができる可能性がある。Lu et al.は、正常組織に比較して腫瘍におけるマイクロＲＮＡの一般的な下方制御を認めた。

さらに、彼らは、マイクロＲＮＡの発現プロファイルを用いて低分化腫瘍を分類することができたが、同じ試料に適用した場合において、メッセンジャーＲＮＡのプロファイルは非常に不正確であった。これらの知見は、癌診断におけるマイクロＲＮＡプロファイリングの潜在的可能性を強調する。

最近の研究は、マイクロＲＮＡの発現特性と、ＡＭＬの（細胞）遺伝学的サブセット（８、１１、１２）との間の関連付けを示した。さらに、マイクロＲＮＡ−２３３、−１２８ａ、−１２８ｂ、およびｌｅｔ７ｂを含むマイクロＲＮＡ発現特性は、急性リンパ芽球性白血病ＡＬＬからＡＭＬを正確に区別できることが明らかにされた（１３）。

マイクロＲＮＡ−１９１および−１９９ａの発現増加は、あるＡＭＬ研究における低い生存率と関連していた（１２）。

細胞遺伝学的に正常なＡＭＬのマイクロＲＮＡ特性は、予後不良を予測することが確認された（１４）。

別の研究では、ｌｅｔ−７／ｍｉＲ−９８クラスタが一般的に下方制御されていることを示したが、マイクロＲＮＡ−２１、マイクロＲＮＡ−１５５、マイクロＲＮＡ−１８１ｂ、マイクロＲＮＡ−２２１、およびマイクロＲＮＡ−２２２は、固体および血液腫瘍の両者おいて高頻度に上方制御されている（１５）。

Chenら（１６）は、初めて、正常なマウスの骨髄からマイクロＲＮＡをクローニングし、マイクロＲＮＡ−２２３、−１４２、および−１８１が造血組織に優先的に発現していることを見出した。マイクロＲＮＡ−２３３は、ＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣｓ）において低レベルで発現され、この発現は、顆粒球への骨髄系分化の間に増加することが見出された。

これらの研究、および他の研究がＡＭＬの診断のための重要な情報を提供しているという事実にも関わらず、それらはＡＭＬの新規な治療についての知見を提供していない。なぜなら、特定の遺伝子または特定のマイクロＲＮＡの、過剰発現または過小発現が、付帯徴候であるか、または疾患の病因に寄与しているのかが確立されていないためである。

最近、ごくわずかの出版物が、癌の治療におけるマイクロＲＮＡの関連性について掲載した。過剰のｃ−ｍｙｃ（数種の癌に関与するタンパク質）を生成するために改変されたマウスの研究は、ｍｉＲＮＡ１７−９２ポリシストロンが癌の発生において効果を有することを示している。リンパ腫細胞において余剰の種類のマイクロＲＮＡを生成するために設計されたマウスは、５０日以内に発症し、２週間後に死亡した。これに対して、余剰のマイクロＲＮＡのないマウスは１００日以上生存した（１７）。これらの研究は、非コードＲＮＡ、特にマイクロＲＮＡは、腫瘍形成を調節し、マイクロＲＮＡ１７−９２クラスタに潜在的なヒト癌遺伝子として影響を与えることができることを示している。

ｔ（２；１１）に直接結合するマイクロＲＮＡ−１２５ｂの過剰発現は、白血病の誘発において、このマイクロＲＮＡの機能を意味する、in vitroにおける骨髄細胞の分化を抑止するようである（１８）。

マウス骨髄におけるマイクロＲＮＡ−１５５の過剰発現は、骨髄性腫瘍の特徴的な病理学的特徴とともに顆粒球／単球集団をエクスパンドした（１９）。

ＡＭＬにおいて、マイクロＲＮＡ−１５５の上方制御は、ＦＬＴ３−ＩＴＤと称される、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）キナーゼ受容体の遺伝子における変異に関連付けられる。

最近の研究では、ＭＬＬ融合タンパク質によるマイクロＲＮＡ−１９６ｂの発現増加が、細胞の増殖能力、および細胞の生存の増加と同様にin vitroにおける分化の部分的ブロックを介してＡＭＬの発生に寄与することが示唆された（２０）。

別の研究では、２種類のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ−１７−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−２０ａ）は、細胞増殖を制御するＥ２Ｆ１タンパク質を抑制することが見出された。

Johnnidis et al.（２１）は、マウスの機能喪失型アレルを用いて、マイクロＲＮＡ−２２３が、骨髄前駆細胞の増殖を促進する転写因子であるＭｅｆ２ｃを標的とすることによって、前駆細胞増殖および顆粒球分化を負に制御することを明らかにした。

マイクロＲＮＡ−２２３、ＣＥＢＰＡ、およびＮＦ１ａの自動制御型である急性前骨髄球性白血病細胞株型を用いることが提案された（２２）。さらに、ＰＵ．１が、マウスにおけるマイクロＲＮＡ−２２３転写を活性化することが見出された。

細胞株ＨＬ６０の単球／マクロファージ分化の間において顕著に異なって発現するマイクロＲＮＡが同定された（２４）。さらに、細胞株型（２５、２６）から得られた非常に限られたデータは、初代ヒト細胞を用いる正常な骨髄系分化の間におけるマイクロＲＮＡの発現プロファイルにおいて利用できる（２７）。

機能的研究は、ｌｅｔ−７／ｍｉＲ−９８が、ＲＡＳ（２８）およびｖ−ｍｙｃ骨髄球腫症ウイルス性癌遺伝子相同体（ＭＹＣ）（２９）を負に制御するが、一方、マイクロＲＮＡ−２１は、プログラムされた細胞死４（ＰＤＣＤ４）（３０）ならびにホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）（３１）を負に制御することを明らかにした。

これらの知見にもかかわらず、癌の治療、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療のために、更なるより具体的な標的が依然として必要である。

本発明者は、正常な造血前駆細胞と比較してＡＭＬにおいて異常発現する、候補マイクロＲＮＡを同定した。マイクロＲＮＡ−９／９^＊は、ＡＭＬ試料の膨大な数において強く過剰発現し、形質転換の過程に積極的に関与しているようである。

さらに、本発明者は、マイクロＲＮＡ−９／９^＊が、急性骨髄性白血病の治療のための魅力的な標的を提供することを見出した。本発明者の実験は、マイクロＲＮＡ−９／９^＊が、in vitroにおいてマウス成長因子依存性の骨髄系細胞株３２Ｄにおける顆粒球への分化のブロックを誘導することを示している。このことによって、マイクロＲＮＡ−９／９^＊とその標的との間の結合を妨げることによって急性骨髄性白血病を効果的に治療することができる可能性があるとの結論が導かれる。

したがって、本発明は、ＡＭＬの治療方法であって、マイクロＲＮＡ−９／９^＊とその標的との間の結合に相互作用することができる化合物を活性成分として含む、治療用組成物が、それを必要とする患者に投与される方法に関する。

本発明者は、マイクロＲＮＡ−９／９^＊が、急性骨髄性白血病ＡＭＬにおける白血病性形質転換において役割を果たすことを見出した。

本明細書において、ｍｉＲＮＡ９／９^＊は、マイクロＲＮＡ９および／またはマイクロＲＮＡ９^＊を示すために用いられる。

マイクロＲＮＡは、１８〜２５ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡであり、前駆体分子から生成される。マイクロＲＮＡは、ゲノムにコードされ、核内リボヌクレアーゼＩＩＩであるＤｒｏｓｈａおよび二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質であるＰａｓｈａ／ＤＧＣＲ８によって、１以上の前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅマイクロＲＮＡ）に核内で処理されるｐｒｉマイクロＲＮＡと称される一次転写物としてＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される（３２、３３）。細胞質において、さらにＤｉｃｅｒとして知られている別のリボヌクレアーゼＩＩＩが、ｐｒｅマイクロＲＮＡを二本鎖である２３ヌクレオチドの成熟マイクロＲＮＡに処理する。この二本鎖マイクロＲＮＡ（３４）は、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる鎖（マイクロＲＮＡ鎖）と、通常分解される相補鎖（マイクロＲＮＡ^＊鎖）とを含む。

また、成熟マイクロＲＮＡ^＊鎖も共発現する数種の例外がある。これはマイクロＲＮＡ−９の場合である。なぜなら、マイクロＲＮＡ−９^＊が通常に発現し、分解しないためである。

成熟したマイクロＲＮＡ−９および／またはマイクロＲＮＡ−９^＊を保有する機能的なＲＩＳＣは、ｍＲＮＡ分解、またはタンパク質翻訳の抑制のどちらももたらす、それらの標的遺伝子ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合することができる（３５、３６）。

マイクロＲＮＡ−９およびマイクロＲＮＡ−９^＊をコードする遺伝子は、１番ヒト染色体（ｍｉＲ−９−１）、５番ヒト染色体（ｍｉＲ−９−２）、および１５番ヒト染色体（ｍｉＲ−９−３）に位置している。これらの異なるマイクロＲＮＡ−９前駆体の処理後、大部分が相補的な成熟したマイクロＲＮＡ９（UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA、SEQ ID NO:1）と、マイクロＲＮＡ９^＊（AUAAAGCUAGAUAACCGAAAGU、SEQ ID NO:2）とが得られる。

マイクロＲＮＡ−９は脳に豊富であり、脳の発生および分化系列決定において重要であると思われる（３７、３８）。ゼブラフィッシュにおいて、マイクロＲＮＡ−９は、中脳後脳境界の決定のために重要である（３９）。マウス大脳皮質の発生において、マイクロＲＮＡ−９はカハールレチウス細胞の適切な分化に必要であると思われる（４０）。マイクロＲＮＡ−９は、ＲＥＳＴおよびＣｏＲＥＳＴを調節し、ハンチントン病において下方制御される（４１）。マイクロＲＮＡ−９は、レチノイン酸によってヒト神経芽細胞腫細胞株において上方制御され、主要な神経芽細胞腫の腫瘍において下方制御される（４２）。マイクロＲＮＡ−９の発現増加は、サブタイプＮＰＭｃ＋（Ramiro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2008) 105, 3945-3950）およびサブタイプ１１ｑ２３（Jongen-Lavrencic et al., Blood (2008) 111; 5078-5088）を有するＡＭＬ患者において示された。

ベータ細胞に発現しているマイクロＲＮＡ−９の発現増加は、グルコース刺激によるインスリン分泌を弱める（４３）。分泌機能の後者の混乱は、インスリンのエキソサイトーシスを負に調節する役割を果たしているＲａｂ３／Ｒａｂ２７因子であるｇｒａｎｕｐｈｉｌｉｎ（ＳＹＴＬ４）のレベルの増加と関連した。

また、マイクロＲＮＡ９は、気管支発癌の過程における連続した段階で異なって発現することが示された（４４）。Roccaro et al.（４５）は、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に特有のマイクロＲＮＡの特徴をマイクロＲＮＡ−９の発現低下と同定した。急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）におけるマイクロＲＮＡ−９の、メチル化および発現低下が、これらの患者の臨床結果と相互に関係することが最近報告された（４６）。

本発明者は、マイクロＲＮＡ−９およびマイクロＲＮＡ−９^＊の両者が、主要なヒトＡＭＬにおいて顕著に過剰発現されることを見出した。本発明者は、マイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）の重要性の分析を用いて目的変数あり分析を行った。

全てのＡＭＬ試料のマイクロＲＮＡの発現は、正常な骨髄ＣＤ３４＋細胞のマイクロＲＮＡの発現パターンと比較された。最も区別されたマイクロＲＮＡの１つは、マイクロＲＮＡ−９およびマイクロＲＮＡ−９^＊であり、両者はＡＭＬにおいて１００倍以上上方制御されたようであった。このことは、マイクロＲＮＡ−９について図１に示され、マイクロＲＮＡ９および９^＊は、図２および図３に示される。マイクロＲＮＡ−９^＊について得られた結果は、マイクロＲＮＡ９について得られた結果と同一でない場合は、同程度であった。

さらに、本発明者は、マイクロＲＮＡ−９およびマイクロＲＮＡ−９^＊が、通常の骨髄造血の間において、発現していないか、または非常に低いレベルで発現していることを見出した。本発明者は、正常な骨髄から高度に精製された細胞集団における骨髄の発生を通して、および正常なヒトＣＤ３４＋細胞のin vitroにおける骨髄分化アッセイの間、その発現を評価する点について、造血分化におけるマイクロＲＮＡ−９およびマイクロＲＮＡ−９^＊の役割を調べた。

両者のアプローチを用いて、マイクロＲＮＡ−９およびマイクロＲＮＡ−９^＊の発現は、骨髄前駆細胞における定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイの検出レベルとし、顆粒球の分化が、前骨髄球、後骨髄球を介して成熟した好中球へ分化が進むようにとどめた。このことは、図４に示す。

これらのデータは、マイクロＲＮＡ−９およびマイクロＲＮＡ−９^＊は、通常の骨髄分化において機能を有していないことを示している。本発明者は、上述したように、ＡＭＬにおけるマイクロＲＮＡ−９／９^＊の異常発現は、ＡＭＬの分化段階を反映するよりも白血病の誘発に関連付けられると結論付けた。また、本発明者は、ｍｉＲＮＡ−９／９^＊が、in vitroにおいて、３２Ｄ細胞（マウス骨髄性白血病細胞株）および主要なマウス骨髄細胞の骨髄分化のブロックを誘導することを見出した。その目的のために、マイクロＲＮＡ−９／９^＊は、３２Ｄ細胞株にレトロウイルス性に形質導入された。この細胞株は、インターロイキン−３（ＩＬ−３）が培地に添加された場合に増殖するが、ＩＬ−３が顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）で置き換えられた場合は好中球へ分化することができないことが知られている。３２Ｄ細胞の細胞染色にヘマトサイトロジー（サイトスピン）を用いて、本発明者は、ＩＬ−３条件下における分化、およびＧ−ＣＳＦ条件下における細胞の持続性増殖のブロックを認めた（図５）。さらに、マイクロＲＮＡ−９およびマイクロＲＮＡ−９^＊も、初代マウス骨髄細胞に導入された。マイクロＲＮＡ−９／９^＊過剰発現は、フローサイトメトリーによって定義されるような、in vitroにおける成熟した好中球（ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１＋細胞）の数の減少をもたらした。このことは３２Ｄ細胞株における本発明者の知見を裏付ける。

サイトスピン染色は、Ｇ−ＣＳＦによる分化アッセイの間における様々な時点（０、３、７、１０、１５日目）で行われた。コントロールベクターを形質導入された３２Ｄ細胞は、０日目に芽細胞から分化し、７日目に完全に成熟顆粒球になった。興味深いことに、マイクロＲＮＡ−９／９^＊によって形質導入された３２Ｄ細胞において、７日目以降の全ての時点において成熟顆粒球が認められなかったので、本発明者は分化のブロックを認めた。

さらに、マイクロＲＮＡ−９／９^＊が、初代マウス骨髄細胞に導入された。in vitroにおいて成熟した好中球（ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１＋細胞）の割合の減少をもたらすレトロウイルスベクターを用いるマイクロＲＮＡ−９／９^＊の過剰発現は、イムノフェノタイピングによって試験された。

本発明者は、ｍｉＲＮＡ９^＊の阻害剤とそれらを接触させることによって、初代ヒトＡＭＬ細胞の増殖を抑制することができた。このことは、図６〜図１１に示されている。ｍｉＲ−９^＊に対するアンチセンス阻害剤またはコントロール阻害剤に基づくＬＮＡ（ロックド核酸）は、１５０ｍＭの濃度を用いたトランスフェクションによって、新鮮な単離されたＡＭＬ芽球細胞に導入された。ＡＭＬの野生型芽球細胞、またはコントロール阻害剤およびｍｉＲ−９^＊阻害剤によってトランスフェクトされた細胞の増殖は、[３Ｈ]チミジン取り込みアッセイを３重に用いて、様々なサイトカインの刺激条件下において測定された。異なる患者から得られた２つの独立したＡＭＬ試料は、コントロール阻害剤と野生型コントロール細胞と比較して、ｍｉＲ−９^＊に対する阻害剤によって処置された細胞増殖の減少を示した。

要約すると、本発明者は、マイクロＲＮＡ−９／９^＊の過剰発現が、機能表現型、すなわち骨髄分化のブロックをもたらすことを見出した。これらの結果に基づいて、本発明者は、マイクロＲＮＡ−９／９^＊は、ＡＭＬにおける白血病性形質転換において役割を果たしていると結論付けた。また、本発明者は、マイクロＲＮＡ−９／９^＊阻害剤が、実際にＡＭＬの芽球細胞の増殖を効果的にブロックすることを示すことができた。それとともに、これらの阻害剤は、ＡＭＬにおける細胞増殖を抑制するための効果的な治療用化合物であることが判明する可能性がある。一方、マイクロＲＮＡ−９またはマイクロＲＮＡ−９^＊のそれらの標的への結合を妨げる化合物は、ＡＭＬの治療に有用であるかもしれない。

上述のような知見は、マイクロＲＮＡ−９／９^＊とそれらの細胞性標的との相互作用を妨げることができ、それによってＡＭＬの治療方法を提供する。したがって、本発明は、マイクロＲＮＡ−９または９^＊とそれらの標的との間の結合を妨げることができる化合物を活性成分として含む治療組成物が、それを必要とする患者に投与されることを特徴とする、ＡＭＬの治療法を提供する。

別の方法では、治療介入は、細胞における、成熟したマイクロＲＮＡ−９／９^＊のレベルが減少するような、マイクロＲＮＡ−９／９^＊の転写および／またはプロセッシングのレベルであってもよい。このため、本発明は、成熟したマイクロＲＮＡ９および／またはマイクロＲＮＡ９^＊の細胞レベルを減少させることができる化合物を活性成分として含む治療組成物が、それを必要とする患者に投与されることを特徴とする、ＡＭＬの治療方法にも関する。

このことは、マイクロＲＮＡ−９／９^＊前駆体の転写またはプロセッシングを妨げることができる化合物を提供することによって達成されてもよい。したがって、本発明は、上述したように、化合物がマイクロＲＮＡ−９／９^＊前駆体の転写またはプロセッシングを妨げることができる方法に関する。

マイクロＲＮＡ−９および／またはマイクロＲＮＡ−９^＊と、それらのターゲットとの相互作用を妨げることができる化合物は、当該分野で知られている。それらは、結合部位または標的をブロックすることによって結合を妨げ、マイクロＲＮＡ−９／９^＊を接触できなくする化合物の第１クラスと、マイクロＲＮＡ−９／９^＊がそれらの標的に結合することを防ぐためにマイクロＲＮＡ−９／９^＊に結合する化合物の第２クラスとの２つのカテゴリに分けることができるかもしれない。

化合物の第１クラスは、それらが、それぞれの標的に対して特異的であるように開発されてもよい。このことは当業者にとって常套手段である。なぜなら、マイクロＲＮＡ−９／９^＊のＲＮＡ標的の配列は知られており、相補的ヌクレオチドは容易に開発することができるからである。

このような化合物を開発するために、当業者は、マイクロＲＮＡの原則（ターゲットの認識）を意識しておく必要がある。これらは、Brennecke et al., PLOS Biology, (2005) 3(3) e85; 0404-0418に詳述されている。また、ｍｉＲＮＡ−seedおよび保存に基づく潜在的なマイクロＲＮＡ標的の予測のために、数種のウェブに基づくin silicoアルゴリズムも利用できる（www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/predicting; www.pictart.org www.targetscan.org）。マイクロＲＮＡ−９およびマイクロＲＮＡ−９^＊が完全に異なる標的の組合せ調節する点に注意することが重要である。なぜなら、それらは同一のseed配列を共有していないためである。

マイクロＲＮＡ−９および／またはマイクロＲＮＡ−９^＊と、それらの標的との相互作用を妨げることができる化合物の第２カテゴリは、マイクロＲＮＡ−９／９^＊に結合し、全てのマイクロＲＮＡ９または９^＊へのそれらの結合を妨げる化合物のクラスである。

好ましい実施形態では、マイクロＲＮＡ−９および／またはマイクロＲＮＡ−９^＊と、それらの標的との相互作用を妨げることのできる化合物は、成熟したマイクロＲＮＡ−９または９^＊の配列について本質的に相補的なヌクレオチド配列、特に配列番号１および配列番号２に示される配列を含む化合物である。好ましくは、このような化合物は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上のヌクレオチドのような、少なくとも６つの連続したヌクレオチドに本質的に相補的である。このような化合物は、マイクロＲＮＡ−９／９^＊のそれらの標的への結合を防ぐために、生理学的条件下においてマイクロＲＮＡ−９／９^＊に効率的にハイブリダイズする。好ましくは、前記化合物は、マイクロＲＮＡ−９またはマイクロＲＮＡ−９^＊全体にハイブリダイズする。

このような化合物は、当該技術分野において公知であり、市販されている。このような化合物のよく知られた例は、ａｎｔａｇｏｍｉｒ（Exiqon）とａｎｔｉｍｉｒ（Dharmacon）と呼ばれている。

マイクロＲＮＡ−９／９^＊のseed配列は、標的認識に重要である。Seed配列は、成熟マイクロＲＮＡの５’における位置２から始まる少なくとも６つのヌクレオチドから構成される。それは３’方向にさらに延長することができるが、通常、８ヌクレオチド以上を含まないと考えられる。したがって、成熟したマイクロＲＮＡ−９のseed領域は、ヌクレオチド配列CUUUGG、CUUUGGU、またはCUUUGGUUを含む。成熟したマイクロＲＮＡ９^＊のseed領域は、ヌクレオチド配列UAAAGC、UAAAGCU、またはUAAAGCUAを含む。

したがって、本発明は、好ましくは、マイクロＲＮＡ−９またはマイクロＲＮＡ−９^＊のseed配列と相互作用することができる化合物に関する。好ましくは、このような化合物は、生理的条件下においてseed配列にハイブリダイズすることができる。マイクロＲＮＡ−９／９^＊のseed配列について本質的に相補的なヌクレオチド配列を有する化合物が好ましい。

このような化合物および付加化合物は、たとえば、マイクロＲＮＡ−９または９^＊が、候補である野生型および変異した標的の３’ＵＴＲに結合することができるウミシイタケルシフェラーゼアッセイのような、公知の技術を用いて容易に見出すことができる。また、本発明において有用な付加化合物は、阻害性化合物と組み合わせたマイクロＲＮＡ−９／９^＊の過剰発現の有無にかかわらず、候補マイクロＲＮＡ−９／９^＊標的のタンパク質レベルを細胞において検討し、比較することができるイムノブロッティング（ウェスタンアッセイ）によって見出すことができる。したがって、本発明は、マイクロＲＮＡ−９／９^＊と、それらの標的との間の結合と相互作用することができる、ＡＭＬの治療のための化合物にも関する。また、本発明は、マイクロＲＮＡ−９／９^＊の細胞レベルを減少させることができる、ＡＭＬの治療のための化合物に関する。

要約すると、本発明は、マイクロＲＮＡ−９および／またはマイクロＲＮＡ−９^＊と、それらの標的との間の結合に相互作用することができる、ＡＭＬの治療のための化合物に関する。より詳細には、本発明は、ＡＭＬの治療のための化合物であって、前記化合物がマイクロＲＮＡ−９／９^＊に結合することができ、特にマイクロＲＮＡ−９および／またはマイクロＲＮＡ−９^＊に結合することができるヌクレオチド配列を含む化合物に関する。ヌクレオチド配列は、タンパク核酸（ＰＮＡ）またはロックド核酸（ＬＮＡ）または核酸もしくは核酸結合配列の全ての形態を含む配列であってもよい。

一方、本発明は、その標的へのマイクロＲＮＡ−９／９^＊の結合を妨げることのできる化合物が、このような治療を必要とする患者に投与される、ＡＭＬの治療方法に関する。

好ましい実施形態において、化合物は、成熟したマイクロＲＮＡ−９またはマイクロＲＮＡ−９^＊の配列について本質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。そのような化合物は、少なくとも６ヌクレオチド、好ましくは、７、８、９、または１０ヌクレオチドのストレインから構成されてもよい。また、ヌクレオチドのさらに長い伸長も可能である。

好ましくは、化合物はseed配列に結合する。このことは、seed配列にハイブリダイズする配列、すなわち、成熟マイクロＲＮＡの５’末端の２番目のヌクレオチドから始まるマイクロＲＮＡ−９および／またはマイクロＲＮＡ−９^＊配列の少なくとも６ヌクレオチドについて本質的に相補的な配列を含む配列によって達成されてもよい。このような化合物は、マイクロＲＮＡに非常に良好な結合特性を示したので、好ましく、マイクロＲＮＡ−９および／またはマイクロＲＮＡ−９^＊と共通の７、８、９、１０、またはそれ以上のヌクレオチドを含む化合物とよく似ている。

この点において、「本質的に相補的」という用語は、配列が、７０、８０、８５、９０、または、たとえば９５％もしくは１００％のように９０％以上のような、６０％以上の配列相同性を示すことを意味する。

成熟したマイクロＲＮＡ−９は、ヌクレオチド配列UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA（SEQ ID NO:1）を有しており、成熟したマイクロＲＮＡ−９^＊は、ヌクレオチド配列AUAAAGCUAGAUAACCGAAAGU（SEQ ID NO:2）を有する。

さらに好ましい実施形態において、化合物は、マイクロＲＮＡ−９および／またはマイクロＲＮＡ−９^＊の配列全体に本質的に相補的な配列を含む。

時には、本発明にかかる治療または化合物から最も恩恵を受けるであろう患者のみを治療することが好ましい。その点では、好ましくは、マイクロＲＮＡ−９またはマイクロＲＮＡ−９^＊の発現レベルが増加することによって特徴付けられるＡＭＬ患者が治療される。好ましくは、ＡＭＬサブグループに由来するそれらの患者は、ヘテロジニアスなＡＭＬコホート内において最も高いマイクロＲＮＡ−９およびマイクロＲＮＡ−９^＊の上方制御を示すので、ＮＰＭ１突然変異または１１ｑ２３異常によって特徴付けられる。ｔ（８；２１）、−５／−７、およびＣＥＢＰＡ変異を有するＡＭＬの患者のサブグループは、これらの患者において、マイクロＲＮＡ−９／９^＊は、他のＡＭＬに比較して、下方制御される（Jongen-Lavrencic et al., Blood 2008）ので、そのような治療のための幾分劣った候補かもしれない。

当業者は、ＡＭＬの関連するサブグループを区別するための方法（細胞遺伝学的解析および分子診断）を認識している。この点におけるマイクロＲＮＡ−９／９^＊の、上昇したレベルまたは増加したレベルは、正常レベル、すなわち、ＡＭＬではない正常な個体の集団におけるマイクロＲＮＡ−９／９^＊のレベルより高いマイクロＲＮＡのレベルと表す。

主要なヒトＡＭＬにおいて、マイクロＲＮＡ−９は顕著に過剰発現される。ＳＤＳ２．３ソフトウェア（Applied Biosystems）は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって得られたマイクロＲＮＡ−９発現データを分析するために使用された。数種のｓｎＲＮＡｓ（小核ＲＮＡ）発現の幾何平均は、インターナルノーマライゼーションのために使用された。比較相対定量法、２−ｄｄＣｔは、正常なＣＤ３４＋細胞と比較して、ＡＭＬにおけるマイクロＲＮＡ−９の相対的発現（倍の変化）を計算するために使用された。マイクロＲＮＡ−９の相対的発現（倍の変化）は、コホート内の全ての２１５ＡＭＬ試料（横軸）に対して縦軸で表わされる。主要なヒトＡＭＬにおいて、マイクロＲＮＡ−９は顕著に過剰発現される。ＳＤＳ２．３ソフトウェア（Applied Biosystem）は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって得られたマイクロＲＮＡ−９の発現データを分析するために使用された。ＲＮＵ４８の発現は、インターナルノーマライゼーションのために使用された。−ｄＣｔ値によって表わされるインターナルコントロールに関する発現は、コホートにおける全ての２１５ＡＭＬ試料（横軸）の異なる顆粒球成熟の段階に対して縦軸に表わされる。主要なヒトＡＭＬにおいて、マイクロＲＮＡ−９^＊は顕著に過剰発現される。ＳＤＳ２．３ソフトウェア（Applied Biosystem）は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって得られたマイクロＲＮＡ−９^＊の発現データを分析するために使用された。ＲＮＵ２４およびＲＮＵ６６発現の幾何平均は、インターナルノーマライゼーションのために使用された。−ｄＣｔ値によって表わされる、ｍｉＲ−９^＊のインターナルコントロールに関する発現は、コホートにおける全ての２１５ＡＭＬ試料（横軸）に対して縦軸に表わされる。正常なヒト顆粒球におけるマイクロＲＮＡ−９／９^＊発現ＳＤＳ２．３ソフトウェア（Applied Biosystem）は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって得られたマイクロＲＮＡ−９およびｍｉＲ−９^＊発現データを分析するために使用された。ＲＮＵ４８の発現は、インターナルノーマライゼーションのために使用された。−ｄＣｔ値によって表わされるインターナルコントロールに関する発現は、異なる顆粒球成熟の段階に対して縦軸に表わされる。３２Ｄ細胞株におけるマイクロＲＮＡ−９／９^＊の過剰発現は、骨髄分化においてブロックを導く。マイクロＲＮＡ−９／９^＊またはコントロールベクターは、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）レポーターを含むレトロウイルスベクターを用いてマウス骨髄性白血病細胞株（３２Ｄ）に導入された。ＧＦＰを高発現した細胞は、選別され、増殖／分化アッセイにおいて使用された。マイクロＲＮＡ−９／９^＊の過剰発現は、ＩＬ−３添加培地において成長する３２Ｄ細胞の増殖能力に影響を与えない。しかし、それらをＧ−ＣＳＦを含む培地において増殖させると、マイクロＲＮＡ−９／９^＊形質導入された細胞は増殖を続けるが、コントロールベクターで形質導入された細胞は、増殖が減少した。初代ヒトＡＭＬ細胞の増殖におけるマイクロＲＮＡ−９^＊阻害剤の負の効果初代ヒトＡＭＬ細胞の増殖におけるマイクロＲＮＡ−９^＊阻害剤の負の効果初代ヒトＡＭＬ細胞の増殖におけるマイクロＲＮＡ−９^＊阻害剤の負の効果初代ヒトＡＭＬ細胞の増殖におけるマイクロＲＮＡ−９^＊阻害剤の負の効果初代ヒトＡＭＬ細胞の増殖におけるマイクロＲＮＡ−９^＊阻害剤の負の効果初代ヒトＡＭＬ細胞の増殖におけるマイクロＲＮＡ−９^＊阻害剤の負の効果図６〜図１１において、ｍｉＲ−９^＊に対するアンチセンス阻害剤またはコントロール阻害剤に基づくＬＮＡ（ロックド核酸）は、１５０ｍＭの濃度を用いたトランスフェクションによって、新鮮な単離されたＡＭＬ芽細胞に導入された。ＡＭＬ野生型芽細胞、またはコントロール阻害剤およびｍｉＲ−９^＊阻害剤でトランスフェクトされた細胞の増殖は、［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイを三重に使用して、様々なサイトカインの刺激条件下において測定された。異なるＡＭＬ患者（試料ＩおよびＩＩ）に由来する２つの独立した試料は、コントロール阻害剤および野生型コントロール細胞と比較して、ｍｉＲ−９^＊に対する阻害剤による処置によって細胞増殖の減少を示した。

実施例１：既知のマイクロＲＮＡ−９の標的であるｏｎｅｃｕｔ２（ＯＣ２）を用いる、新たな潜在的マイクロＲＮＡ−９抑制性化合物の活性試験
ルシフェラーゼアッセイ：Ｏｎｅｃｕｔ２（ＯＣ２）転写因子は、以前にマイクロＲＮＡ−９の標的として同定された（４３）。３’−ＵＴＲ−ＯＣ２−ｌｕｃコンストラクトを生成するために、ラットｏｃ２遺伝子の３’−ＵＴＲセグメントを、ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、ｐｓｉＣＨＥＣＫ−１プラスミド（Promega, Madison, WI）のマルチクローニングサイトに挿入した。このプラスミドのマルチクローニングサイトは、終止コドンと、人工的なポリアデニル化部位との間のウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の３’−ＵＴＲに位置する。ＰＣＲプライマーの配列は次のとおりである。センス：5' - GGATGTCTCGAGTGTTTTCTACAAAG - 3'（SEQ ID NO:3）。アンチセンス：5' - GAAGCAGCGGCCGTTGAGGCTCCTC - 3'（SEQ ID NO:4）。マイクロＲＮＡ−９−センサコンストラクトは、ｐｓｉＣＨＥＣＫ−１（Promega）のウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の３’−ＵＴＲにおける、アンチセンス方向にマイクロＲＮＡ−９成熟配列をクローニングすることによって得ることができる。

次に、Effectene transfection kit（Qiagen, Valencia, CA）を用いてプラスミドの一過性のトランスフェクションが行われる。マイクロＲＮＡ−９およびコントロールマイクロＲＮＡの一過性トランスフェクションを伴う実験は、１００ｎＭのＲＮＡ二重鎖を用いてリポフェクトアミン２０００（Invitrogen）を用いて行うことができる。ルシフェラーゼ活性は、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Promega）によるトランスフェクションの２日後に測定される。３’−ＵＴＲ−ＯＣ２−ｌｕｃおよびマイクロＲＮＡ９−センサと、それぞれホタルルシフェラーゼＳＶ４０ｐＧＬ３プロモーター（Promega）またはウミシイタケルシフェラーゼｐＲＬＣＭＶ（pRLrenilla）とのコトランスフェクションは、ノーマライゼーションに使用することができる。

実施例２：既知のマイクロＲＮＡ−９^＊標的であるＲＥＳＴおよびＣｏＲＥＳＴを用いる、新たな潜在的マイクロＲＮＡ−９^＊阻害性化合物の活性試験
ルシフェラーゼアッセイ：標的であるＣｏＲＥＳＴは、以前にマイクロＲＮＡ−９^＊の標的として同定された（Packer et al., J. neurosci. 2008 (53) 14341-6）。３’−ＵＴＲ−ＣｏＲＥＳＴ−ｌｕｃコンストラクトを生成するために、遺伝子の３’−ＵＴＲのセグメントを、ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、ｐｓｉＣＨＥＣＫ−１プラスミド（Promega, Madison, WI）のマルチクローニングサイトに挿入した。このプラスミドのマルチクローニングサイトは、終止コドンと、人工的なポリアデニル化部位との間のウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の３’−ＵＴＲに位置する。ＰＣＲプライマーの配列は以下のとおりである。センス、CoREST 3'UTR 5' - GCATCTCGAGGTGACCCCAGGGTGGTTGCCAC -3'（SEQ ID NO:5）、および5' - CGATGCGGCCGCGAATGGATCACTGTTGCAGA -3'（SEQ ID NO:6）。マイクロＲＮＡ−９^＊センサのコンストラクトは、ｐｓｉＣＨＥＣＫ−１（Promega）のウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の３’−ＵＴＲにおけるアンチセンス方向にマイクロＲＮＡ−９^＊の成熟配列をクローニングすることによって得ることができる。

次に、Effectene transfection kit（Qiagen, Valencia, CA）を用いてプラスミドの一過性のトランスフェクションが行われる。マイクロＲＮＡ−９^＊およびコントロールマイクロＲＮＡの一過性トランスフェクションを伴う実験は、１００ｎＭのＲＮＡ二重鎖を用いてリポフェクトアミン２０００（Invitrogen）を用いて行うことができる。ルシフェラーゼ活性は、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Promega）によってトランスフェクションの２日後に測定される。３’−ＵＴＲ−ＯＣ２−ｌｕｃおよびマイクロＲＮＡ９^＊−センサと、それぞれホタルルシフェラーゼＳＶ４０ｐＧＬ３プロモーター（Promega）またはウミシイタケルシフェラーゼｐＲＬＣＭＶ（pRLrenilla）とのコトランスフェクションは、ノーマライゼーションに使用することができる。

実施例３：イムノブロット分析
ウエスタンブロット分析のために、細胞は、氷冷されたリン酸緩衝生理食塩水によって１回洗浄される必要があり、タンパク質抽出物は、前述されたように調製され（４３）、タンパク質１５μgは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥされ、ポリビニリデンジフルオリドメンブレン上にトランスファーされる。前記メンブレンは、０．１％のＴｗｅｅｎ２０および５％ミルクを含む緩衝液中で６０分間ブロックされ、その後ラットＯＣ２（アミノ酸３６〜３１１）に対する一次抗体（３２）とともに４℃で一晩インキュベートされた。免疫反応性バンドは、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した二次抗体とともに前記メンブレンを６０分間インキュベーションした後に化学発光基質（Amersham Biosciences）を用いて可視化する必要がある。

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Claims

マイクロＲＮＡ−９および／またはマイクロＲＮＡ−９^＊と、それらの標的との間の結合に相互作用することができることを特徴とする、ＡＭＬ治療のための化合物。
前記化合物は、マイクロＲＮＡ−９および／またはマイクロＲＮＡ−９^＊に結合することができるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の使用のための化合物。
前記化合物は、成熟したマイクロＲＮＡ−９および／またはマイクロＲＮＡ−９^＊の配列の少なくとも６個の連続したヌクレオチドについて本質的に相補的なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の使用のための化合物。
前記化合物は、マイクロＲＮＡ−９および／またはマイクロＲＮＡ−９^＊のseed配列について本質的に相補的なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
前記化合物は、生理的条件下において、成熟したマイクロＲＮＡ−９／９^＊にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
成熟したマイクロＲＮＡ−９および／またはマイクロＲＮＡ−９^＊の細胞レベルを減少させることができることを特徴とする、ＡＭＬ治療のための化合物。
前記ＡＭＬは、マイクロＲＮＡ−９またはマイクロＲＮＡ−９^＊の発現レベルの増加によって特徴付けられることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
前記ＡＭＬは、ＮＰＭ１変異または１１ｑ２３染色体異常によって特徴付けられるサブグループから選択されることを特徴とする請求項７に記載の使用のための化合物。
マイクロＲＮＡ−９および／またはマイクロＲＮＡ−９^＊とそれらの標的との間の結合に相互作用することができる化合物を活性成分として含む治療組成物が、それを必要とする患者に投与されることを特徴とする、ＡＭＬの治療方法。
成熟したマイクロＲＮＡ−９および／またはマイクロＲＮＡ−９^＊の細胞レベルを減少させることができる化合物を活性成分として含む治療組成物が、それを必要とする患者に投与されることを特徴とする、ＡＭＬの治療方法。