KR20110135938A - 매트릭스 메탈로프로테이나제(ｍｍｐ)2 및 ｍｍｐ9를 억제하기 위한 화합물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 MMP2 및 MMP9의 특이적인 억제제 및 면역억제시 이들의 용도에 관한 것이다.
Description
관련 출원의 전후 참조
본 출원은 2009년 2월 13일자로 출원된 미국 가특허원 제61/152,512호의 35 U.S.C.§ 119(e)하의 이익을 주장하며, 상기 가 특허출원은, 이의 전문이 여기에 참조로 포함되어 있다.
정부 이익의 기술
본 발명은 국립보건원에 의해 지정된 승인번호 제NHLBI RO1 HL081350-03호에 의거 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 억제제 및 이들의 사용 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 MMP2 및 MMP9의 억제제 및 면역억제에 있어서 이들의 용도에 관한 것이다.
관련 분야의 기술
세포외 매트릭스내 세포의 특이적인 상호과정은 유기체의 정상적 기능을 위해 중요하다. 세포외 매트릭스의 변경은 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)라고 불리는 아연-의존성 엔도펩티다제의 계열에 의해 수행된다. 당해 변경은 자궁, 배아발생, 상처 치유 및 혈관형성에서 기관 발달, 배란, 태아 착상과 같은 각종 세포 과정에서 수행된다[참조: Massova, L; Kotra, L. P.; Fridman, R.; Mobashery, S., FASEBJ. 1998, 12, 1075; Forget, M.-A.; Desrosier, R. R.; Beliveau, R. Can., J. Physiol. Pharmacol. 1999, 77, 465-480]. MMP는 젤라티나제, 콜라게나제, 스트로멜라이신, 막-유형 MMP 및 매트릴라이신의 5개의 주요 효소 그룹으로 이루어진다. 정상 조직 기능에서 MMP의 활성은 일련의 복잡한 자이모겐 활성화 과정 및 매트릭스 메탈로프로테이나제의 단백질 조직 억제제("TIMPs")에 의한 억제에 의해 엄격하게 조절된다[참조: Forget, M.-A.; Desrosier, R. R.; Beliveau, R. Can., J. Physiol. Pharmacol. 1999, 77, 465-480; Brew, K.; Dinakarpandian, D.; Nagase, H., Biochim. Biophys. Acta 2000, 1477, 267-283. Westermarck, J.; Kahari, V. M., FASEB J. 1999, 13, 781-792]. 조절 과정이 실패하는 경우, 과도한 MMP 활성은 종양, 관절염 및 결합 조직병, 심혈관병, 염증 및 자가면역병에서 암 성장, 종양 전이, 혈관형성과 관련된다[참조: Massova, L; Kotra, L. P.; Fridman, R.; Mobashery, S., FASEB J. 1998, 12, 1075; Forget, M.-A.; Desrosier, R. R.; Beliveau, R. Can., J. Physiol. Pharmacol. 1999, 77, 465-480; Nelson, A. R.; Fingleton, B.; Rothenberg, M. L.; Matrisian, L. M., J. Clin. Oncol. 2000, 18, 1135]. 인간 젤라티나제 MMP2 및 MMP9에 대한 활성의 증가된 수준은 종양 전이의 과정과 연루되어 있다[참조: Dalberg, K.; Eriksson, E.; Enberg, U.; Kjellman, M.; Backdahl, M., World J. Surg. 2000, 24, 334-340. Salo, T.; Liotta, L. A.; Tryggvason, K. J., Biol. Chem. 1983, 258, 3058-3063. Pyke, C; Ralfkiaer, E.; Huhtala, P.; Hurskainen, T.; Dano, K.; Tryggvason, K., Cancer Res. 1992, 52, 1336-1341. Dumas, V.; Kanitakis, J.; Charvat, S.; Euvrard, S.; Faure, M.; Claudy, A., Anticancer Res. 1999, 19, 2929-2938]. 그 결과, MMP 억제제(예를 들면, MMP2 및 MMP9)의 선택이 크게 고려되고 있다.
또한, 이례적인 MMP2 수준이 폐암 환자에서 검출되어 왔는데, 여기서, 혈청 MMP2 수준은 정상의 혈청 값과 비교하여 질병의 IV 단계 및 명백하게 전이된 환자에서 현저히 상승하였다(참조: 본원에 참조로 인용된 문헌, Garbisa et al., 1992, Cancer Res., 53: 4548). 또한, MMP9의 혈장 수준은 결장 및 유방암 환자에서 상승되었음이 관측되었다(참조: 본원에서 참조로 인용한 문헌, Zucker et al., 1993, Cancer Res. 53: 140).
젤라티나제 MMP는 종양의 성장 및 확산에서 가장 친밀하게 관여하는 것으로 밝혀졌다. 젤라티나제의 발현 수준은 악성에서 상승되며, 젤라티나제는 종양 전이를 유발하는 기저 막을 붕괘시킬 수 있음이 알려졌다. 고형 종양의 성장에 요구되는 혈관형성은 또한 최근에 이의 병리학에 대해 젤라티나제 성분을 가지는 것으로 밝혀졌다. 더우기, 젤라티나제가 죽상경화증과 관련된 플라크 파열(plaque rupture)에 관여한다는 것을 제시하는 증거가 존재한다. MMP에 의해 매개된 다른 증상은 재협착, MMP-매개된 골감소증, 중추신경계의 염증병, 피부 노화, 종양 성장, 골관절염, 류마티스 관절염, 패혈성 관절염, 각막 궤양, 비정상적인 상처 치유, 골병, 단백뇨, 대동맥 동맥류병(aneurysmal aortic disease), 외상 관절 손상에 이은 변성 연골 손실, 신경계의 탈수초병, 간경화, 신장의 사구체병, 태막의 조기 파열, 염증성 창자병, 치주병, 노화 관련 황반 변성, 당뇨병성 신경병증, 증식성 유리체망막병증, 미숙아망막병증, 눈 염증, 원추각막, 소그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 근시, 눈 종양, 눈 혈관형성/신생-혈관화 및 각막 이식거부이다. 최근 고찰을 위해서는, 다음을 참조한다: (1) Recent Advances in Matrix Metalloproteinase Inhibitor Research, R. P. Beckett, A. H. Davidson, A. H. Drummond, P. Huxley and M. Whittaker, Research Focus, Vol. 1, 16-26,(1996), (2) Curr. Opin. Ther. Patents (1994) 4(1): 7-16, (3) Curr. Medicinal Chem. (1995) 2: 743-762, (4) Exp. Opin. Ther. Patents (1995) 5(2): 1087-110, (5) Exp. Opin. Ther. Patents (1995) 5(12): 1287-1196. 염증 과정에서 MMP 관여는 문헌(참조: W. Parks et al., Nature Reviews: Immunology, 2004, 4:617-629)에서 고찰된다.
MMP의 몇가지 경쟁적 억제제가 최근에 알려져 있다. MMP의 이들 억제제는 활성의 억제를 위한 활성 부위 아연의 킬레이트화를 이용한다. 이의 일반적인 특성으로 인하여, MMP에 대한 이들 경쟁적인 억제제는 아연에 의존한 많은 생물학적 경로에 영향을 미치며 또한, 흔히 이들의 임상용으로 주요 장애가 있는 숙주에 대해 유독성이다[참조: Greenwald, R. A. Ann. N. Y. Acad. ScL 1999, 575, 413-419; (a) Michaelides, M. R.; Curtin, M. L. Curr. Pharm. Des. 1999, 5, 787-819. (b) Beckett, R. P.; Davidson, A. H.; Drummond, A. H.; Huxley, P.; Whittaker, M. Drug Disc. Today 1996, 1, 16-26]. 따라서, 공지된 경쟁적인 억제제보다 하나 이상의 특이적인 MMP에 대해 선택성이 더 큰 MMP의 억제제를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 방법은 바람직하게는 네가티브한 장기간의 부작용을 포함하지 않을 것이 바람직하다.
면역조절인자는 홍반 루푸스 및 당뇨병과 같은 전신계 자가면역병, 및 면역결핍성 질병을 치료하는 데 유용한 것으로 밝혀졌다. 또한, 면역조절인자는 암의 면역치료요법 또는 외부 기관 또는 이식체, 예를 들면, 신장, 심장 또는 골수내 다른 조직의 거부를 예방하는데 유용할 수 있다.
FK506, 무라밀산 디펩타이드 유도체, 레바미솔, 니리다졸, 옥시수란, 플라길 및 인터페론, 인터루킨, 류코트리엔, 코르티코스테로이드 및 사이클로스포린의 그룹으로부터의 다른 것들을 포함하는 각종의 면역조절인자 화합물이 발견되었다. 그러나, 이들 화합물의 대다수는 바람직하지 않은 부작용 및/또는 높은 독성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 새로운 면역조절인자 화합물이 바람직하지 않은 부작용을 최소화하면서 특수 분야에서 광범위한 면역조절인자 기능을 제공하기 위해 요구되고 있다.
따라서, 면역억제제 약물 및 MMP 억제제의 독성을 고려해 볼 때 MMP의 조절곤란이 관련될 수 있는 면역-매개된 질환의 효과적인 치료를 위한 방법 및 화합물에 대한 당해 분야에서의 요구가 남아있다. 본 발명은 이들 및 다른 이점을 제공한다.
본 발명의 하나의 국면은 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 이식 환자에게 투여함을 포함하여, T 세포의 동종항원-유도된 증식을 감소시키는 방법을 제공한다
[화학식 I]
상기 화학식 I에서,
m은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며;
p는 1, 2 또는 3이고;
X는 -O-, -S-, -CH2- 또는 직접 결합이며;
Y는 -C(O)- 또는 -S(O)2-이고;
Z는 -O- 또는 -S-이며;
R1은 각 경우에 동일하거나 상이하고, 독립적으로 알킬, 알케닐, 아르알킬, 할로알킬, 할로겐, -OR8 또는 -NR9R10이고;
R2는 각 경우에 동일하거나 상이하고, 독립적으로 알킬, 알케닐, 아르알킬, 할로알킬, 할로겐 -OR8 또는 -NR9R10이며;
R3 및 R4는 각각 동일하거나 상이하며 독립적으로 수소 또는 알킬이고;
R5, R6 및 R7은 각각 동일하거나 상이하며 독립적으로 수소 또는 알킬이며;
R8은 수소, 알킬, 알케닐, 또는 아릴이고;
R9 및 R10은 각각 동일하거나 상이하며 독립적으로 수소 또는 알킬이다.
본 발명의 방법의 하나의 양태에서, 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 Ia의 화합물이다.
[화학식 Ia]
본 발명의 방법의 추가의 양태에서, 화합물은 SB-3CT이다:
[화합물 SB-3CT]
본 발명 방법의 다른 추가의 양태에서, 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 Ib 또는 Ic의 화합물이다:
[화학식 Ib]
[화학식 Ic]
본 발명 방법의 특정한 양태에서, 이식 환자는 폐 이식 환자이다. 본 발명의 방법의 다른 양태에서, T 세포는 CD4+ T 세포이다. 추가의 양태에서, 본 방법은 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물을 이식 환자에게 장기을 기증하는 장기 기증자에게 장기를 수거 하기 전에 투여함을 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 국면은 이식 환자 또는 이식이 요구되는 환자에게 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 투여함을 포함하여, 상기 환자에서 콜라겐에 대해 면역 반응을 억제하는 방법을 제공한다.
특정한 양태에서, 화학식 I의 화합물은 본원에 기술된 바와 같은 화학식 Ia, Ib 또는 Ic의 화합물이다. 당해 방법의 추가의 양태에서, 화합물은 SB-3CT이다. 다른 양태에서, 이식 환자는 폐 이식 환자이다.
본 발명의 다른 측면은 이식 환자에게 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물을 투여함을 포함하여, 이식 결과를 개선시키는 방법을 제공한다. 특정한 양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 Ia, Ib, Ic 또는 SB-3CT의 화합물이다. 하나의 양태에서, 본 방법은 장기를 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물을 이식 환자에게 장기을 기증하는 장기 기증자에게 장기를 수거 하기 전에 투여함을 추가로 포함한 다. 본 방법의 특정한 양태에서, 이식 환자는 폐 이식 환자이다.
본 발명의 또 다른 국면은 면역 반응의 억제가 요구되는 환자에게 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 투여함을 포함하여, 상기 환자에서 면역 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 면역 반응의 억제가 요구되는 환자는 자가면역병을 지니고 있다. 이와 관련하여, 장기 이식(심장, 폐, 간, 신장, 췌장, 다수-내장 이식, 조혈 줄기 세포) 후 동종면역-유도된 자가면역성; 콜라겐 혈관병(전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 베게너 육아종증, 공피증), 다발경화증, 인슐린 의존성 당뇨병, 복강병, 염증성 창자병, 궤양 대장염, 크론병(Crohn's disease), 전신 홍반 루푸스, 건선 및 인슐린-의존성 당뇨병(제1형)을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 특정의 자가면역병이 본원에서 고려된다. 하나의 특수 양태에서, 이를 필요로 하는 환자는 천식 또는 T 세포 매개된 폐병을 지닌다. 특정한 양태에서, 면역 반응은 CD8+ T 세포 반응 또는 CD4+ T 세포 반응을 포함한다. 하나의 양태에서, 조절성 T 세포는 화학식 I의 화합물에 의해 억제되지 않는다. 추가의 양태에서, 환자는 고형 장기 이식 환자이다.
본 발명의 또 다른 국면은 이식 환자에게 치료학적 유효량의 매트릭스 메탈로프로테이나제 2 및 9를 선택적으로 억제할 수 있는 화합물을 투여함을 포함하여, 동종항원-유도된 증식을 감소시키는 방법을 제공한다.
여전히 본 발명의 추가의 국면은 면역 반응의 억제가 요구되는 환자에게 매트릭스 메탈로프로테이나제 2 및 9를 선택적으로 억제할 수 있는 치료학적 유효량의 화합물을 투여함을 포함하여, 상기 환자에서 면역 반응을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 국면은 면역억제제의 용량을 감소시키는 것이 요구되는 환자에게 면역억제제의 투여 전에 또는 투여와 동시에 유효량의 화학식 I의 화합물을 투여함을 포함하여, 상기 환자에서 면역억제제의 투여량을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 측면은 면역 반응을 억제하는 것이 요구되는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물을 공지된 면역억제제(면역억제성 약물)과 함께 투여함을 포함하여, 상기 환자에서 면역 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 이와 관련하여, 사이클로스포린 A, FK506, 라파마이신, 코르티코스테로이드, 푸린 길항제(아자티오프린 및 미코페놀레이트 포함), 캄파쓰 및 항-림프세포 글로불린과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 특정의 다수의 면역억제제가 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 국면은 콜라겐 V에 대한 면역 반응을 감소시키는 것이 요구되는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물을 유효량의 콜라겐 V 또는 이의 내성 단편과 함께 투여함을 포함하여, 콜라겐 V에 대한 면역 반응을 감소시키는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 환자는 폐 이식이 요구되는 환자 또는 폐 이식 환자이다. 추가의 양태에서, 콜라겐 V 또는 이의 내성 단편은 경구적으로 또는 정맥내 투여된다.
본 발명의 추가의 측면은 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물(여기서, 특정한 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 화학식 Ia, Ib, Ic 또는 SB-3CT)을 포함하여, 이식 환자에서 T 세포의 동종항원-유도된 증식을 감소시키기 위한 조성물을 제공한다. 특정한 양태에서, 이 조성물은 폐 이식 환자에서 T 세포의 동종항원-유도된 증식을 감소시키기 위한 것이다. 추가의 양태에서, T 세포는 CD4+ T 세포이다. 특정한 양태에서, 이 조성물은 이식 환자에게 장기를 기증하는 장기 기증자에 있어서 장기를 수거 하기 전에 사용된다.
본 발명의 다른 국면은 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물(여기서, 특정한 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 화학식 Ia, Ib, Ic 또는 SB-3CT)을 포함하여, 이식 환자 또는 이식이 요구되는 환자에서 콜라겐에 대한 면역 반응을 억제시키기 위한 조성물을 제공한다. 하나의 양태에서, 이식 환자는 폐 이식 환자이다.
본 발명의 추가의 국면은 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물(여기서, 특정한 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 화학식 Ia, Ib, Ic 또는 SB-3CT)을 포함하여, 이식 결과를 개선시키기 위한 조성물을 제공한다. 이와 관련하여, 하나의 양태에서, 본 조성물은 장기 이식 전에 장기 기증자에 대해 사용된다. 특정한 양태에서, 이식 환자는 폐 이식 환자이다.
본 발명의 추가의 국면은 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물(여기서, 특정한 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 화학식 Ia, Ib, Ic 또는 SB-3CT)을 포함하여, 면역 반응을 억제하는 것이 요구되는 환자에서 면역 반응을 억제하기 위한 조성물을 제공한다. 특정한 양태에서, 면역 반응을 억제하는 것이 요구되는 환자는 장기 이식 후 동종면역-유도된 자가면역성, 콜라겐 혈관병 및 다발경화증으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 자가면역병을 지닌다. 하나의 양태에서, 면역 반응을 억제하는 것이 요구되는 환자는 천식 또는 T-세포 매개된 폐병을 지닌다. 특정한 양태에서, T 세포 반응은 CD8+ T 세포 반응이다. 하나의 특수 양태에서, CD8+ T 세포 반응은 항원-특이적인 반응이다. 추가의 양태에서, 면역 반응은 항원-특이적인 반응일 수 있는 CD4+ T 세포 반응을 포함한다. 특정한 양태에서, 본 조성물은 조절성 T 세포를 억제하지 않는다. 특정한 양태에서, 본 조성물은 고형 장기 이식 환자에서 사용된다.
본 발명의 추가의 국면은 매트릭스 메탈로프로테이나제 2 및 9를 선택적으로 억제할 수 있는 치료학적 유효량의 제제를 포함하는, T 세포의 동종 항원-유도된 증식을 감소시키기 위한 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 국면은 매트릭스 메탈로프로테이나제 2 및 9를 선택적으로 억제할 수 있는 치료학적 유효량의 제제를 포함하는, 면역 반응 억제가 요구되는 환자에서 면역 반응을 억제하기 위한 조성물을 제공한다. 이와 관련하여, 면역 반응은 항원-특이적인 면역 반응일 수 있다.
본 발명의 또 다른 국면은 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물을 면역억제제와 함께 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서, 면역억제제의 투여량은 화학식 I의 화합물의 부재하에서 일반적으로 사용된 투여량과 비교하여 감소된다.
본 발명의 추가의 국면은 유효량의 화학식 I의 화합물을 공지된 면역억제제와 함께 포함하는, 환자에서 면역 반응을 억제하기 위한 조성물이다. 이와 관련하여, 면역 반응은 항원-특이적인 면역 반응일 수 있다. 특정한 양태에서, 공지된 면역억제제는 하나 이상의 사이클로스포린 A, FK506, 라파마이신, 코르티코스테로이드, 푸린 길항제, 캄패쓰 및 항-림프세포 글로불린을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 국면은 콜라겐 V에 대한 면역 반응 감소가 요구되는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물을 유효량의 콜라겐 V, 또는 이의 내성 단편과 함께 투여함을 포함하여, 콜라겐 V에 대한 면역 반응을 감소시키기 위한 조성물을 제공한다. 특정한 양태에서, 환자는 폐 이식이 요구되는 환자 또는 폐 이식 환자이다. 다른 양태에서, 콜라겐 V 또는 이의 내성 단편은 경구적으로 또는 정맥내 투여된다.
본 발명의 다른 국면은 이식 환자에서 T 세포의 동종항원-유도된 증식을 감소시키거나, 이식 환자 또는 이식이 요구되는 환자에서 콜라겐에 대한 면역 반응을 억제하거나, 이식 결과를 개선시키거나, 이식이 요구되는 환자에서 면역 반응을 억제하거나, 또는 콜라겐 V에 대한 면역 반응을 감소시키는 것이 요구되는 환자에서 콜라겐 V에 대한 면역 반응을 감소시기 위한 의약의 제조에서 화학식 I의 화합물(여기서, 화합물은 화학식 Ia, Ib, Ic 또는 SB-3CT일 수 있다)을 포함하는 조성물의 용도이다.
본 발명은, MMP2 및 MMP9가 T 세포내에서 세포내적으로 존재하여 T 세포 활성화를 조절한다는 예상치않았던 발견을 중심으로 한다. 따라서, 본 발명은 MMP2 및 MMP9의 표적화된 억제에 의해 면역 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 일반적으로 MMP2 및/또는 MMP9를 선택적으로 억제함으로써 면역 반응 억제가 요구되는 대상체에서 면역 반응을 억제하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 MMP2 및/또는 MMP9를 선택적으로 억제함으로써 T 세포 반응을 억제하기 위한 방법에 관한 것이다.
매트릭스 메탈로프로테이나제 2 및 9
MMP2 및 MMP9의 상승된 발현은 흔히 결장직장 종양, 위장 암종, 췌장 암종, 유방암, 경구암, 흑색종, 악성 신경아교종, 연골육종 및 위장 샘암종을 포함하는 침입성 및 종양원성 암에서 흔히 발견된다. 수준은 또한 악성 별아교세포종, 암종 수막염 및 뇌 전이에서 증가된다. MMP는 기저막 및 간질 결합 조직, ECM(세포외 매트릭스)의 성분 둘다에 의해 침입성 암에서 종양 진행 및 전이를 촉진한다. 콜라겐 IV는 ECM의 주요 성분이다. ECM의 다른 성분들은 라미닌-5, 프로테오글리칸, 엔탁틴 및 오스테오넥틴을 포함한다. MMP2 및 MMP9는 콜라겐 IV 및 라미닌-5를 효율적으로 분해함으로써 전이성 암 세포가 기저 막을 통해 이주하도록 한다[참조: Kundu GC, Patil DP. MMP2(매트릭스 메탈로펩티다제 2(젤라티나제 A, 72kDa 젤라티나제, 72kDa 제IV형 콜라게나제) Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. October 2005].
MMP는 또한 많은 폐병에서 매트릭스 리모델링을 조절하는 것으로 공지되어 있다. 위스타-교토(Wistar-Kyoto) 랫트 모델에서의 실험을 폐 이식 전 및 후에 MMP 억제제로 처리한 랫트에 대해 유도된 허혈 재관류 손상을 갖는 세계적인 MMP 억제제 COL-3으로 처리한 랫트와 비교하였다(참조: Iwata, T. et al. 2008 Transplantation 85:417). 이들 결과는, 허혈 재관류 손상이 성장-관련된 종양유전자/CINC-1-의존성 호중구 유입을 유도하였으며, 종양 괴사 인자-알파를 상향조절하였음을 나타내었다. MMP2 및 MMP9의 유도(4 및 24 시간째)는 기관지폐포 세척액 및 폐 간질내에서 검출된 항원성 콜라겐(V)과 관련되었다. COL-3을 사용한 처리는 염증 인자를 감소시켰으며 기관지폐포 세척액내 항원성 콜라겐(V)의 보다 낮은 수준을 초래하였다. 폐 수거전 기증자 폐 및 이식 후 수용체에서 MMP를 억제하는 것은 산소화를 개선시키고 동종이식체내로의 다형핵백혈구 유입을 감소시켰다.
폐 이식의 랫트 모델로부터의 증거는 세계적인 억제제와 비교하여 특이적 MMP 억제제의 이점을 나타낸다. 특히, 실험들은, 메탈로프로테이나제(TIMP-1 및 TIMP-2)의 조직-억제제가 기증자 항원 및 제V형 콜라겐(거부 반응에 포함된 자가항원)에 대한 지연된 고감작성 반응에 있어 차등적인 효과를 가짐을 나타내지만 거부 병리학의 발병에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. COL-3과는 대조적으로, 세계적인 MMP 억제제는 지연된 유형의 고감작성을 억제하였지만, 또한 종양 괴사 인자-알파 및 인터루킨-1 베타의 국소적 생산을 억제하였다. COL-3은 거부 병리학을 방지하지 않았지만, 이는 이식 후 증식 질환을 제안하는 이식체내 B 세포 과다형성을 유도하였다.
본 발명 전에, 세포내적으로 작용하여 면역 세포 기능을 조절하는 MMP의 능력은 알려져 있지 않았다. 생체내에서 세계적인 MMP 억제제를 사용하여 MMP를 비특이적으로 차단하는 것은 랫트 폐 이식 모델에서 동종항원 및 자가항원-유도된 T 세포 증식을 하향 조절하였으며(참조: Iwata, T., et al. 2008 Transplantation 85:417), 이는, MMP 활성이 거부 반응의 발병기전에 관여될 수 있음을 제안한다.
MMP2 및 MMP9 아미노산 및 폴리뉴클레오타이드 서열은 진뱅크(GENBANK) 또는 스위스프롯(SWISSPROT)과 같은 데이타베이스내에 널리 이용가능하다. 대표적인 서열은 진뱅크 수탁번호 제AK310314호[gi:164692100], 제AK312711호[gi:164690513], 및 스위스프롯 제P08253호(01-FEB-1991, 서열 버젼 2)(MMP2) 및 제NM_004994호[gi:74272286], 제AAD37404호[gi:5002294], 및 제NP_004985호[gi:74272287] (MMP9)에서 찾을 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 인식되는 바와 같이, 이들은 대표적인 서열이며 MMP2 및 MMP9의 다른 서열 변이체는 특정의 각종 공지의 데이타베이스 중에서 찾을 수 있으며 본 발명에 의한 표적화된 억제를 위해 고려된다.
따라서, 본 발명은 MMP2 및 MMP9를 억제하기 위한 방법 및 화합물을 제공한다. 특히, 본 발명은, MMP2 및 MMP9가 T 세포내에 세포내적으로 존재하여 T 세포 활성화를 조절한다는 발견에 중심을 두고 있다. 또한, 본 발명은 동종항원 및 자가항원-유도된 T 세포 증식을 억제하는 이들의 특이적인 작용에 의해 면역억제성 약물로서 사용될 수 있는 MMP2- 및 MMP9-특이적인 억제제를 제공한다.
SB-3CT 유도체의 일반적인 기술
일반적으로, 본원에 기술된 방법에 적합한 MMP 억제제는 전형적으로 3개의 분절을 포함하는 구조를 갖는다: (1) 거대 소수성 포켓인 P1' 소부위와 상호작용하는 소수성 영역(예를 들면, 비페닐 잔기); (2) 수소 결합을 통해 단백질 골격상의 아미드에 결합하는 수소 결합 공여체 영역(예를 들면, 설폰 또는 카보닐 잔기); 및 (3) 친핵성 첨가에 민감하고 배위 결합을 통해 활성 부위에서 Zn2+에 결합할 수 있는 친핵성 영역(예를 들면, 티이란 또는 에폭사이드 환).
적합한 MMP는 예를 들면, 본원에 이의 전문이 인용된 제WO06/036928호에 기술된 것들을 포함한다.
화학식 I
특정의 구체 양태에서, 본원에 기술된 방법에 적합한 화합물은 화학식 I로 나타낸다.
[화학식 I]
상기 화학식 I에서:
m은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며;
p는 1, 2 또는 3이고;
X는 -O-, -S-, -CH2- 또는 직접 결합이며;
Y는 -C(O)- 또는 -S(O)2-이고,
Z는 -O- 또는 -S-이며;
R1은 각 경우 동일하거나 상이하며 독립적으로 알킬, 알케닐, 아르알킬, 할로알킬, 할로겐 -OR8 또는 -NR9R10이고;
R2는 각 경우 동일하거나 상이하며 독립적으로 알킬, 알케닐, 아르알킬, 할로알킬, 할로겐 -OR8 또는 -NR9R10이며;
R3 및 R4는 각각 동일하거나 상이하며 독립적으로 수소 또는 알킬이고;
R5, R6 및 R7은 각각 동일하거나 상이하며 독립적으로 수소 또는 알킬이며;
R8은 수소, 알킬, 알케닐 또는 아릴이고;
R9 및 R10은 각각 동일하거나 상이하며, 독립적으로 수소 또는 알킬이다.
본원에 기술된 화합물의 약제학적으로 허용되는 염도 또한 고려된다.
정의
"알킬"은 탄소 및 수소 원자 단독으로 이루어지고, 불포화도가 없으며, 탄소 원자수가 1 내지 15인 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 쇄 라디칼을 말한다. 특정한 양태에서, 알킬은 1 내지 8개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 알킬은 단일 결합에 의해 분자의 나머지에 부착되며, 예를 들면, 메틸(Me), 에틸(Et), n-프로필, 1-메틸에틸(이소-프로필), n-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸에틸(t-부틸), 3-메틸헥실, 2-메틸헥실, 등이다. 명세서에서 달리 상세하게 기술하지 않는 한, 알킬 그룹은 다음 치환체 중 하나 이상에 의해 임의 치환될 수 있다: 할로, 시아노, 니트로, 옥소, 티옥소, 트리메틸실라닐, -ORa, -OC(O)-Ra, -N(Ra)2, -C(O)Ra, -C(O)ORa, -C(O)N(Ra)2, -N(Ra)C(O)ORa, -N(Ra)C(O)Ra, -N(Ra)S(O)tRa(여기서, t는 1 또는 2이다), -S(O)tORa(여기서, t는 1 또는 2이다) 및 -S(O)tN(Ra)2(여기서, t는 1 또는 2이다)(여기서, 각각의 Ra는 독립적으로 수소, 알킬, 할로알킬, 아릴 또는 아르알킬이다).
"알케닐"은 탄소 및 수소 원자 단독으로 이루어지고, 적어도 하나의 이중 결합을 함유하며 2 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 쇄 라디칼 그룹을 말한다. 특정한 양태에서, 알케닐은 2 내지 8개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 알케닐은 2 내지 4개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 알케닐은 단일 결합에 의해 분자의 나머지에 부착되며, 예를 들면, 에테닐(즉, 비닐), 프로프-1-에틸(즉, 알릴), 부트-1-에닐, 펜트-1-에닐, 펜타-1,4-디에닐 등이다. 명세서에서 달리 상세하게 기술하지 않는 한, 알케닐 그룹은 다음 치환체들중 하나 이상에 의해 임의 치환될 수 있다: 할로, 시아노, 니트로, 옥소, 티옥소, 트리메틸실라닐, -ORa, -OC(O)-Ra, -N(Ra)2, -C(O)Ra, -C(O)ORa, -C(O)N(Ra)2, -N(Ra)C(O)ORa, -N(Ra)C(O)Ra, -N(Ra)S(O)tRa(여기서, t는 1 또는 2이다), -S(O)tORa(여기서, t는 1 또는 2이다) 및 -S(O)tN(Ra)2(여기서, t는 1 또는 2이다)(여기서, 각각의 Ra는 독립적으로 수소, 알킬, 할로알킬, 아릴 또는 아르알킬이다).
"아릴"은 환 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 방향족 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭 탄화수소 환 시스템으로부터 유래한 라디칼을 말한다. 방향족 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭 탄화수소 환 시스템은 수소 및 탄소 원자수가 6 내지 8인 탄소 만을 함유하며, 여기서, 환 시스템내 환 중 적어도 하나는 완전히 불포화되어 있는데, 즉, 이는 후켈 이론(Huckel theory)에 따라서 사이클릭, 탈국재화된 (4n+2)π-전자 시스템을 함유한다. 아릴 그룹은 페닐, 플루오레닐 및 나프틸과 같은 그룹을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 명세서에서 달리 구체적으로 기술하지 않는 한, 용어 "아릴" 또는 접두사 "ar-"("아르알킬"에서와 같은)은 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 할로알킬, 시아노, 니트로, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아르알킬 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의 치환된 아릴 라디칼을 포함함을 의미한다.
"아르알킬"은 분자식 -Rb-아릴(여기서, Rb는 알킬렌 쇄이다)의 라디칼을 말하며, 이는 탄소 및 수소 만으로 이루어지고, 불포화도를 함유하지 않으며 탄소원자수가 1 내지 12인, 분자의 나머지를 라디칼 그룹에 연결하는 직쇄 또는 측쇄의 2가 탄화수소 쇄, 예를 들면, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, n-부틸렌, 등을 말한다. 알킬렌 쇄는 단일 결합을 통해 분자의 나머지에 및 단일 결합을 통해 라디칼 그룹에 부착되어 있다. 분자의 나머지 및 라디칼 그룹에 대한 알킬렌 쇄의 부착 점은 알킬렌 쇄내 하나의 탄소 또는 쇄내 특정의 2개의 탄소를 통해 이루어질 수 있다. 예시적인 아르알킬은 벤질, 디페닐메틸 등을 포함한다. 아르알킬 라디칼의 알킬렌 쇄 부분은 알킬에 대해 위에 기술된 바와 같이 임의 치환될 수 있다. 아르알킬 라디칼의 아릴 부분은 아릴 그룹에 대해 위에서 기술한 바와 같이 임의 치환될 수 있다.
"할로겐"은 브로모, 클로로, 플루오로 또는 요오도를 말한다.
"할로알킬"은 위에서 정의한 바와 같이, 하나 이상의 할로 라디칼에 의해 치환된, 위에서 정의한 바와 같은 알킬 라디칼, 예를 들면, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 1-플루오로메틸-2-플루오로에틸, 트리클로로메틸 등을 말한다. 할로알킬 라디칼의 알킬 부분은 알킬 그룹에 대해 위에서 정의한 바와 같이 임의 치환될 수 있다.
화학식 I의 화합물의 아속:
특정한 양태에서, X는 -O-이고, Y는 -S(O)2-이며 Z는 -S-이고; 화학식 I의 화합물은 화학식 Ia의 화합물로 나타낼 수 있다:
[화학식 Ia]
화학식 Ia의 추가의 양태에서, m은 0이고, n은 0이며, p는 1이고, R3, R4, R5, R6 및 R7은 각각 수소이고, 화학식 Ia는 SB-3CT이다:
[SB-3CT] 
특정의 다른 양태에서, X는 -S-이고, Y는 -S(O)2-이며 Z는 -S-이고; 화학식 I의 화합물은 화학식 Ib의 화합물로 나타낼 수 있다:
[화학식 Ib]
특정의 다른 양태에서, X는 -CH2-이고, Y는 -S(O)2-이며 Z는 -S-이고; 화학식 I의 화합물은 화학식 Ic의 화합물로 나타낼 수 있다:
[화학식 Ic]
화학식 I, Ia 내지 Ic의 화합물의 제조 방법:
화학식 Ia 내지 Ic의 화합물을 포함하는 화학식 I의 화합물은 다음의 일반적인 반응도식에 따라 제조할 수 있다:
기타 MMP2 및 MMP9 억제제
유전자 발현 또는 단백질의 활성에서 MMP2 및/또는 MMP9 활성을 억제하는 본 발명의 화합물 또는 제제는 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 다수의 수단이 무작위적인 올리고뉴클레오타이드 및 올리고펩타이드의 발현을 포함하는, 각종 유기 화합물 및 바이오 분자의 무작위적인 및 직접적인 합성에 이용가능하다. 이와는 달리, 세균, 진균, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물의 라이브러리가 이용가능하거나 용이하게 생산될 수 있다. 또한, 천연의 또는 합성적으로 생산된 라이브러리 및 화합물은 통상의 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 용이하게 변형시킬 수 있으며, 조합 라이브러리를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 공지된 약리학적 제제는 또한 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화 등과 같은 직접적이거나 무작위한 화학적 변형에 적용시켜 구조적 유사체를 생산할 수 있다. 새로운 잠재적인 치료제를 또한 합리적인 약물 설계 또는 컴퓨터 모델화와 같은 방법을 사용하여 창조할 수 있다.
본 발명에 따른 MMP2 및/또는 MMP9를 억제하는데 사용하기 위한 제제는 화합물, 조성물 또는 분자의 "라이브러리" 또는 수집으로부터 스크리닝할 수 있다. 이러한 분자는 전형적으로 당해 분야에 "소 분자"로서 공지되고 분자량이 105 달톤 미만, 바람직하게는 104 달톤 미만, 여전히 보다 바람직하게는 103 달톤 미만인 화합물을 포함한다. 예를 들어, 시험 화합물의 라이브러리의 구성원은 정제된 MMP2 및/또는 MMP9와 접촉시키거나 이에 투여하거나 생체내에서 본원에 기술된 바와 같은 쥐 또는 랫트 모델과 같은 적절한 동물 모델에서 투여할 수 있다. MMP2 및/또는 MMP9를 억제할 수 있는 것으로 확인된 화합물은, 본원에 기술된 바와 같은 질병의 치료를 허용하므로, 치료학적 목적을 위해서 및 면역억제제로서의 치료학적 용도를 위해 유용할 수 있다.
MMP2 및/또는 MMP9를 억제하는 제제는 또한 다수의 반응 용기 속에서 수행된 다수의 소정 화학 반응에 따라 제조된 합성제를 바람직하게 포함하는 조합 라이브러리의 구성원으로서 제공될 수 있다. 예를 들면, 다수의 출발 화합물은 하나 이상의 고체-상 합성을 사용하여 제조될 수 있으며, 무작위적 혼합 방법으로 기록되고 제공된 성분이 반응 조건의 다수의 수열 및/또는 조합을 추적 가능하게 하는 반응 스플릿(split) 기술로 기록될 수 있다. 수득되는 생성물은 펩타이드의 합성적 조합 라이브러리(참조: 예를 들면, 제PCT/US91/08694호, 제PCT/US91/04666호) 또는 본원에 제공된 바와 같은 소 분자를 포함할 수 있는 다른 조성물(참조: 예를 들면, 제PCT/US94/08542호, 유럽 특허 제0774464호, 미국 특허 제5,798,035호, 미국 특허 제5,789,172호, 미국 특허 제5,751,629호)과 같은 교호적인 선택 및 합성 과정이 수반되어 스크리닝될 수 있는 라이브러리를 포함한다. 당해 분야의 통상의 기술자들은, 이러한 라이브러리의 다양한 모음이 확립된 공정에 따라 제조되고, 본 분야에 공지된 스크리닝 방법을 사용하여 시험될 수 있음을 인식할 것이다.
본 발명의 MMP2 및/또는 MMP9를 억제하는 제제 및 화합물은 또한 MMP2 및/또는 MMP9 폴리펩타이드에 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 항체는 본 발명의 폴리펩타이드의 활성을 생체내에서 억제하거나 차단하기 위한 조절제로서 기능할 수 있다. 이와는 달리 또는 추가로, 항체는 MMP2 및/또는 MMP9의 내인성 활성을 위해, 또는 조절제로서, 상기 폴리펩타이드의 정제를 위해, 시료내에서 상기 폴리펩타이드의 활성 수준을 분석하기 위해 및/또는 상기 폴리펩타이드의 발현을 분석하기 위해 스크린내에서 사용할 수 있다. 이러한 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있으며, 일반적으로 MMP2 및/또는 MMP9에 특이적이다. 특정한 양태내에서, 항체는 폴리클로날이다.
항체는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 기술 중의 어느 것에 의해서도 제조될 수 있다(참조: 예를 들면, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 하나의 이러한 기술에서, SPL 폴리펩타이드 또는 이의 항원 부위를 포함하는 면역원은 바람직하게는 하나 이상의 부스터 면역화를 혼입하는 소정의 스케쥴에 따라서, 적합한 동물(예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼, 양 및 염소)내로 초기의 주입된다. 토끼를 사용하는 것이 바람직하다. 면역원성을 증가시키기 위해, 면역원을 예를 들면, 글루타르알데하이드 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 연결시킬 수 있다. 주사에 이어서, 동물을 주기적으로 방혈시켜 MMP2 및/또는 MMP9에 결합하는 폴리클로날 항체를 함유하는 후-면역 혈청을 수득한다. 이후에, 폴리클로날 항체는 예를 들면, MMP2 및/또는 MMP9 폴리펩타이드, 또는 적합한 고체 지지체에 커플링된 이의 항원 부위를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 이러한 항혈청으로부터 정제할 수 있다. 이러한 폴리클로날 항체는 스크리닝 목적 및 웨스턴 블롯을 위해 직접 사용할 수 있다.
보다 상세하게는, 성인 토끼(예를 들면, NZW)는 1mL의 용적 속에 완전한 프루언드 보조제(Freund's adjuvant)(1:1 v/v) 속에 유화시킨 정제된(예를 들면, 니켈-컬럼을 사용하여) SK 또는 SPL 폴리펩타이드 10㎍으로 면역화시킬 수 있다. 면역화는 적어도 6개의 상이한 피하 부위에서 주사를 통해 달성할 수 있다. 후속적인 면역화를 위해, 5㎍의 MMP2 또는 MMP9 폴리펩타이드를 완전한 플루언드 보조제 속에 유화시키고 동일한 방식으로 주사할 수 있다. 면역화는, 적합한 혈청 항체 역가가 달성(통상적으로 총 약 3개의 면역화)될 때까지 지속시킬 수 있다. 토끼를 면역화 직전에 방혈시켜 전-면역 혈청 및 이후 각각의 면역화 후 7 내지 10일 째에 수득한다.
특정한 양태에서, 모노클로날 항체가 바람직할 수 있다. 모노클로날 항체는 예를 들면, 문헌(참조: Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976)의 교시내용 및 이에 대한 개선점을 사용하여 제조할 수 있다. 요약하면, 이들 방법은 바람직한 특이성(즉, 목적한 폴리펩타이드와의 반응성)을 갖는 항체를 제조할 수 있는 무한증식 세포주의 제조를 포함한다. 이러한 세포주는 예를 들면, 위에서 기술한 바와 같이 면역화시킨 동물로부터 수득된 비장 세포로부터 생산할 수 있다. 이후에, 비장 세포를 예를 들면, 흑생종 세포 융합 파트너, 바람직하게는 면역화된 동물과 동계인 것과의 융합에 의해 무한증식시킨다. 예를 들어, 비장 세포 및 흑생족 세포를 비이온성 세제와 함께 수분 동안 합한 후 하이브리드 세포의 성장을 보조하지만 흑색종 세포는 보조하지 않는 선택 배지 상에서 저 밀도로 플레이팅할 수 있다. 바람직한 선택 기술은 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 선택을 사용한다. 충분한 시간, 일반적으로 약 1 내지 2주 후, 하이브리드 콜로니가 관측된다. 단일 콜로니를 선택하고 폴리펩타이드에 대한 결합 활성에 대해 시험한다. 높은 반응성 및 특이성을 갖는 하이브리도마가 바람직하다.
모노클로날 항체는 성장하는 하이브리도마 콜로니의 상층액으로부터 분리할 수 있다. 또한, 마우스와 같은 적합한 척추동물 숙주의 복강내로 하이브리도마 세포주의 주사와 같이 수율을 향상시키기 위한 각종 기술을 사용할 수 있다. 이후에, 모노클로날 항체는 복수액 또는 혈액으로부터 수거할 수 있다. 오염물을 크로마토그래피, 겔 여과, 침전 및 추출과 같은 통상의 기술로 항체로부터 제거할 수 있다.
MMP2 및/또는 MMP9에 특이적으로 결합하는 항체는, 당해 항체가 약 104 M-1 이상, 바람직하게는 약 105 M-1 이상, 보다 바람직하게는 약 106 M-1 이상 및 여전히 보다 바람직하게는 약 107 M-1 내지 109 M-1 이상의 Ka로 폴리펩타이드에 결합하는 경우 특이적인 결합을 통해 상기 폴리펩타이드와 상호작용할 수 있다. 항체 및 이들이 결합하는 폴리펩타이드와 같은 결합 파트너의 친화성은 통상의 기술, 예를 들면, 문헌[참조: Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660 (1949) 및 in Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Cell Biology, 둘다 메사추세츠 보스톤 소재의 존 윌리 앤드 손스, 인코포레이티드(John Wiley & Sons, Inc.)에 의해 발표됨]에 기술된 것들을 사용하여 용이하게 측정할 수 있다.
위에서 나타낸 바와 같이, 본 발명은 MMP2 및/또는 MMP9 폴리펩타이드의 발현(전사 또는 해독), 안정성 및/또는 활성을 변경하는 제제 또는 화합물을 제공한다. 이러한 조절제를 확인하기 위해, 특정의 다양한 스크리닝이 수행될 수 있다. 후보 조절제는 식물, 진균 또는 화학물질, 소분자 또는 무작위적인 펩타이드의 라이브러리와 같은 각종 공급원으로부터 잘 공지된 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 본 발명의 MMP2 또는 MMP9 폴리펩타이드에 결합하는 항체, 및 MMP2 및/또는 MMP9 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 안티-센스 폴리뉴클레오타이드를 MMP2 및 MMP9를 억제하기 위해 본 발명의 방법에서 사용할 수 있으며 면역억제제로서 기능할 수 있다. 특정한 양태에서, 이러한 억제제는 최소의 부작용을 가지며 무독성이다. 일부 적용을 위해, 세포를 침투할 수 있는 제제가 바람직하다.
MMP2 및/또는 MMP9를 억제하는 제제는, 비록 이들이 유기 분자, 바람직하게는, 분자량이 50 달톤 이상 및 약 2,500 달톤 미만인 소 유기 화합물이라고 해도, 다수의 화학적 부류를 포함한다. 억제제는 단백질과의 구조적 상호작용 특히, 수소결합에 필수적인 기능성 그룹을 포함하며, 전형적으로 적어도 아민, 카보닐, 하이드록실 또는 카복실 그룹, 바람직하게는 2개 이상의 작용성 화학 그룹을 포함한다. 억제제는 흔히 하나 이상의 상기 기능성 그룹으로 치환된 사이클릭 탄소 또는 헤테로사이클릭 구조 및/또는 방향족 또는 폴리방향족 구조를 포함한다. 후보 제제는 또한 펩타이드, 사카라이드, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 이의 유도체, 구조적 유사체 또는 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 바이오 분자 중에서 발견된다.
MMP2 및/또는 MMP9 활성을 억제하는 제제는 본원에 기술되어 있고 또한, 본 양태에 따라 사용하기 위한 추가의 적합한 제제는 본원에 소개된 문헌에 기술된 것과 같은 통상의 방법에 따라 확인할 수 있다. 예를 들어, MMP2 및/또는 MMP9 활성을 검출하는 방법은 본원의 실시예에 기술되어 있다. MMP 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자의 생산 및 이로부터 MMP 폴리펩타이드의 생산을 위한 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 MMP2 및 MMP9 활성을 억제하는 제제에 대한 화합물 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 또한 상업적으로 이용가능하다[참조: 예를 들면, R&D Systems, Minneapolis, MN; Calbiochem®(EMD/Merck, Darmstadt, Germany]. 분자 생물학 방법과 관련된 양태에 있어서 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 공지된 조성물 및 방법은 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et al. (1993 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA); Maniatis et al. (1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY] 등에 기술되어 있다. 본원에 명백하게 제공된 것으로서 특정한 양태는 임의로 다른 면역억제제와 같은 하나 이상의 추가의 제제와 함께, SB-3CT와 같은 MMP2 및/또는 MMP9를 억제하는 제제를 투여함을 포함하여 대상체에서 면역 기능을 조절하는 방법을 기술한다.
본원에서 또한 제공된 것으로서, 특정의 고려되는 양태는 MMP2 및/또는 MMP9 활성을 감소시키는 제제를 투여함으로써 대상체에서 면역 기능을 억제하는 방법에 관한 것이며, 이는 특정한 양태에서 단백질에 직접 결합함으로써 MMP2 및/또는 MMP9 활성을 감소시키는 제제를 포함할 수 있지만, 특정의 다른 양태에서, MMP2 및/또는 MMP9 활성을 감소시키는 제제를 예를 들면, MMP 활성에 영향을 발휘하는 다른 세포 분자 성분과 상호작용시킴으로써 간접적으로 수행할 수 있다. 특정의 고려된 성분들은 단백질의 감소된 발현 수준을 유발함으로써 MMP2 및/또는 MMP9 활성을 감소시킬 수 있는 제제에 관한 것이다. MMP2 및/또는 MMP9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 기술하는 풍부한 기재내용 및 이들을 측정하는 방법은 GENBANKTM 및 SWISSPROTTM, 및 PubMed를 포함하는 공공의 데이타베이스에서 찾을 수 있다[참조: 또한, Cancer Res. 68(21), 9096-9104(2008), Biomed Khim. 2008 Sep-Oct; 54(5):555-60; Cancer Invest. 2008 Dec; 26(10):984-9; Oncol Rep. 2002 May-Jun; 9(3):607-11]. 숙련가에 의해 용이하게 익숙한 바와 같이, 예를 들면, 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA(pH 8.0)의 용액속에서의 예비 세척; 50 내지 65℃에서 5X SSC로 밤새 하이브리드화에 이어; 65℃에서 20분 동안 0.1% SDS를 함유하는 2X, 0.5X 및 0.2X SSC 각각을 사용한 2회 세척일 수 있는, 온화한 스트링전시 조건하에서 하이브리드화하는 뉴클레오타이드와 같은 MMP2 및/또는 MMP9를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 뉴클레오타이드가 본원에서 고려된다.
특정의 관련 양태에 따라서, 감소된 MMP2 및/또는 MMP9 발현 수준을 유발하는 제제는 MMP2 및/또는 MMP9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, MMP2 또는 MMP9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 특이적으로 분해하는 리보자임, MMP2 및/또는 MMP9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 방해할 수 있는 소 방해 RNA, 또는 MMP2 및/또는 MMP9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자에 작동적으로 연결된 조절 성분의 활성을 변경시키는 제제에 특이적으로 하이브리드화하는 안티센스 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 본원에 기재되고 당해 분야에 공지된 것으로서, 이러한 핵산 서열-계 제제는 통상의 방법을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다.
암호화 서열(예를 들면, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, siRNA 또는 리보자임)의 적어도 일부에 대해 상보성인 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 MMP2 및/또는 MMP9-암호화 유전자 발현을 조절할 수 있다. 안티센스 제제로서 사용하기 위한 siRNA 및 리보자임, 및 이들의 표적화된 전달을 위한 유전자를 암호화하는 DNA의 확인은 당해 분야에 잘 공지된 방법을 포함한다. 예를 들어, 이러한 올리고뉴클레오타이드의 바람직한 특성, 길이 및 기타 특성은 잘 공지되어 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 설폰, 설페이트, 케틸, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스페이트 에스테르와 같은 연결, 및 다른 이러한 연결을 사용함으로써 내인성 뉴클레오분해 효소에 의한 분해를 견디도록 설계된다[참조: 예를 들면, Agrwal et al., Tetrahedron Lett. 28:3539-3542(1987); Miller et al., J. Am. Chem. Soc. 93:6657-6665(1971); Stec et al., Tetrahedron Lett. 26:2191-2194(1985); Moody et al., Nucl. Acids Res. 12:4769-4782(1989); Uznanski et al., Nucl. Acids Res.(1989); Letsinger et al., Tetrahedron 40:137-143(1984); Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 54:367-402(1985); Eckstein, Trends Biol. Sci. 14:97-100(1989); Stein In: Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, Ed, Macmillan Press, London, pp. 97-117(1989); Jager et al., Biochemistry 27:7237-7246(1988)].
안티센스 폴리뉴클레오타이드는 mRNA 또는 DNA등의 핵산에 서열-특이적인 방식으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드이다. 상보성 서열을 갖는 mRNA에 결합하는 경우, 안티센스는 mRNA의 해독을 방지한다[참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,168,053호(Altman et al.); 미국 특허 제5,190,931호(Inouye), 미국 특허 제5,135,917호(Burch); 미국 특허 제5,087,617호(Smith), 및 덤브벨(dumbbell) 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 기술하는, Clusel et al.(1993) Nucl . Acids Res . 21:3405-3411]. 삼합체 분자는 공선형(colinear) 삼합체 분자를 형성함으로써 전사를 방지하는 이합체 DNA에 결합하는 일본쇄 DNA 쇄(single DNA strands)를 말한다[참조: 예를 들면, 이합체 DNA 상에 표적 부위에 결합하는 합성 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 방법을 기술하는, 미국 특허 제5,176,996호(Hogan et al.)].
특히 유용한 안티센스 뉴클레오타이드 및 삼합체 분자는 MMP2 및/또는 MMP9 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 또는 mRNA의 센스 쇄에 상보성이거나 이에 결합하는 분자 또는 내인성 MMP2 및/또는 MMP9의 발현과 관련된 어떠한 다른 과정을 매개함으로써 MMP2 및/또는 MMP9 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA의 해독의 억제가 영향받도록 하는 단백질이다. 안티센스 RNA로 전사될 수 있는 cDNA 작제물은 또한 세포 또는 조직내로 도입시켜 안티센스 RNA의 생산을 촉진할 수 있다. 안티센스 기술은 폴리머라제, 전사 인자 또는 다른 조절 분자의 결합의 방해를 통해 유전자 발현을 조절하는데 사용할 수 있다[참조: Gee et al., In Huber and Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co. (Mt. Kisco, NY; 1994)]. 이와는 달리, 안티센스 분자는 MMP-암호화 유전자의 조절 영역(예를 들면, 프로모터, 인핸서 또는 전사 개시 부위)과 하이브리드화하고, 또한 유전자의 전사를 차단하거나; 리보소옴에 대한 전사의 결합을 억제함으로써 해독을 차단하도록 설계될 수 있다.
본 발명은 또한 MMP2 및/또는 MMP9-암호화 핵산 서열-특이적인 리보소옴의 사용을 고려한다. 리보자임은 mRNA등의 RNA 기질을 특이적으로 분해함으로써 특이적인 억제 또는 세포 유전자 발현과의 방해를 초래하는 RNA 분자이다. RNA 쇄의 분해 및/또는 연결에 포함된 리보자임의 적어도 5개의 공지된 부류가 존재한다. 리보자임은 특정의 RNA 전사체에 특이적으로 표적화될 수 있으며 이러한 전사체를 촉매적으로 분해할 수 있다[참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,272,262호; 미국 특허 제5,144,019호; 및 미국 특허 제5,168,053호, 제5,180,818호, 제5,116,742호 및 제5,093,246호(Cech et al.)]. 특정의 MMP2 및/또는 MMP9 mRNA-특이적인 리보자임, 또는 이러한 리보자임을 암호화하는 핵산을 숙주 세포내로 전달하여 MMP2 및/또는 MMP9 유전자 발현을 억제할 수 있다. 따라서, 리보자임은 진핵세포 바이러스 프로모터와 같은 진핵세포 프로모터에 연결된 리보자임을 암호화하는 DNA에 의해 숙주 세포로 전달됨으로써 핵내로 도입시, 리보자임이 직접 전사될 것이다. 리보자임 표적으로서 사용하기 위한 MMP2 및/또는 MMP9-암호화 mRNA의 특히 유용한 서열 영역은 BLAST 또는 MegAlign와 같은 당해 분야에 공지된 통상의 서열 정렬 기구를 사용하여 발견할 수 있으며, 바람직하게는 특수 세포내에 존재할 수 있는 다른 전사된 서열과 관련된 MMP2 및/또는 MMP9-암호화 mRNA에 대해 독특한 서열 스트레치(stretch)일 수 있다.
특정의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 변형시켜 생체내에서 안정성을 증가시킬 수 있다. 가능한 변형은 5' 및/또는 3' 말단에서 플랭킹 서열의 첨가; 골격내에서 포스포디에스테르 연결보다는 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸의 사용; 및/또는 이노신, 퀘오신 및 위부토신등의 비전통적인 염기, 및 아세틸메틸-, 티오- 및 아데닌, 사이티딘, 구아닌, 티민 및 우리딘의 다른 변형된 형태의 혼입을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
RNA 간섭(RNAi)은 특이적인 전령 RNA(mRNA)의 분해를 초래함으로써 mRNA에 의해 암호화된 바람직한 표적 폴리펩타이드의 발현을 감소시키는 이본쇄 RNA에 의해 수행된 폴리펩타이드 서열-특이적인, 전사후 유전자 사일런싱 메카니즘이다[참조: 예를 들면, WO 99/32619; WO 01/75164; U.S. 6,506,559; Fire et al., Nature 391:806-11 (1998); Sharp, Genes Dev. 13:139-41 (1999); Elbashir et al. Nature 411:494-98 (2001); Harborth et al., J. Cell Sci. 114:4557-65 (2001)]. 포유동물(인간 포함)과 같은 고등 진핵세포내에서 특이적인 폴리펩타이드의 발현을 간섭하는 "소 간섭 RNA(siRNA) 또는 DNP-RNA 폴리뉴클레오타이드가 고려된다[참조: 예를 들면, Karagiannis and El-Osta, 2005 Cancer Gene Ther. May 2005, PMID: 15891770; Chen et al., 2005 Drug Discov. Today 10:587; Scherr et al., 2005 Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 8:262; Tomari and Zamore, 2005 Genes Dev. 19:517; 또한, 예를 들면, 문헌: Tuschl, 2001 Chembiochem. 2:239-245; Sharp, 2001 Genes Dev. 15:485; Bernstein et al., 2001 RNA 7:1509; Zamore, 2002 Science 296:1265; Plasterk, 2002 Science 296:1263; Zamore 2001 Nat. Struct. Biol. 8:746; Matzke et al., 2001 Science 293:1080; Scadden et al., 2001 EMBO Rep. 2:1107; Hutvagner et al., Curr. Opin. Gen. Dev. 12:225-32 (2002); Elbashir et al., 2001; Nykanen et al., Cell 107:309-21 (2001); Bass, Cell 101:235-38 (2000)); Zamore et al., Cell 101:25-33 (2000)]. 길이가 약 18 내지 27개 뉴클레오타이드 염기 쌍인 이본쇄 RNA를 사용한 인간 및 기타 포유동물 세포의 형질감염은 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 전령 RNA(mRNA)에 의해 암호화된 특수 폴리펩타이드의 발현을 서열-특이적인 방식으로 간섭한다[참조: 제WO 01/75164호; Elbashir et al., 2001; Elbashir et al., Genes Dev. 15:188-200 (2001)); Harborth et al., J. Cell Sci. 114:4557-65 (2001); Carthew et al., Curr. Opin. Cell Biol. 13:244-48 (2001); Mailand et al., Nature Cell Biol. Advance Online Publication (Mar. 18, 2002); Mailand et al. 2002 Nature Cell Biol. 4:317].
위에서 주목한 바와 같이, 특정한 양태에서, 감소된 MMP2 및/또는 MMP9 발현 수준을 유발하는 제제는 MMP2 및/또는 MMP9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자에 작동적으로 연결된 조절 성분의 활성을 변경시킬 수 있다. 대표적인 예로써 및 제한하지 않고, 이들 및 관련 양태는 MMP2 및/또는 MMP9-암호화 유전자의 전사를 억제하거나 억압함으로써 MMP2 및/또는 MMP9 활성을 하향-조절할 수 있는 적합한 제제를 고려하며, 당해 제제는 MMP2 및/또는 MMP9 유전자 전사의 기능적 차단제에 대해 스크리닝하기 위한 당해 분야에서 허용된 방법을 사용하여 용이하게 확인할 수 있다.
사용 방법
본 발명의 방법은, 면역 반응을 억제하는 것이 바람직할 수 있는 각종 질병 세팅의 문맥에서 사용할 수 있다. 본 발명은, MMP2 및 MMP9가 세포내부로 존재하여 T 세포 활성화를 조절한다는 예상치못한 발견을 중심으로 한다. 따라서, 본 발명은 MMP2 및 MMP9의 표적화된 억제에 의해 면역 반응을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 환자에게 본원에 기술된 화합물과 같은 MMP2- 및/또는 MMP9-특이적 억제제를 치료학적 유효량으로 투여함으로써 MMP2 및/또는 MMP9를 특이적으로 억제함에 의해 면역 반응 억제가 요구되는 환자 또는 대상체에서 면역 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 이와 관련하여, 본 발명은 장기 이식(심장, 폐. 간, 신장, 췌장, 다수-내장 이식, 조혈 줄기 세포) 후 동종면역-유도된 자가면역성; 콜라겐 혈관병(전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 베게너 육아종증, 공피증), 류마티스 관절염, 다발경화증, 인슐린 의존성 당뇨병, 애디슨병, 복강병, 만성 피로 증후군, 염증성 창자병, 궤양성 대장염, 크론병, 섬유근통, 전신 홍반 루푸스, 건선, 소그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 갑상선기능항진증/그레이브스병(Graves disease), 갑상선기능저하증/하시모토병, 인슐린-의존성 당뇨병(제1형), 중증근육무력증, 자궁내막증, 공피증, 악성 빈혈, 굳파스처 증후군(Goodpasture syndrome), 베게너병, 사구체신염, 재생불량빈혈, 발작성야간혈색뇨, 골수형성이상증후군, 특발저혈소판자색반병, 자가면역 용혈빈혈, 에반스 증후군(Evan's syndrome), 제VIII 인자 억제제 증후군, 전신성 혈관염, 피부근염, 다발근육염 및 류마티스열을 포함하나, 이에 한정되지 않는 특정의 각종 자가면역병 중의 어느 하나에서 면역 반응을 억제하는데 사용될 수 있다.
본원에서 제공된 방법은 또한 천식, 특발성 폐 섬유증, 장기에서 섬유성 질환, 인공호흡기-유도된 폐 손상, 허혈성 재관류 손상, 오존 폐 손상, 척수 손상과 같은 손상, 만성 폐쇄성 폐병(COPD), 스티븐스 존슨 증후군, 및 헤르페스 단성 바이러스 뇌염과 같은 질병 셋팅에서 면역 반응을 감소시키기 위해 고려된다.
본 발명은 고형 장기 이식 셋팅에서 동종항원 유도된 T 세포 증식을 감소시키는 방법을 제공한다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법은 폐, 심장, 신장, 간, 췌장 및 장 이식을 포함하나, 이에 한정되지 않는 특정의 고형 장기 이식의 맥락에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 이식 환자에게 치료학적 유효량의 MMP2- 및/또는 MMP9-특이적 억제제를 투여함을 포함하여, T 세포의 동종항원-유도된 증식을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 특정한 양태에서, 상기 억제제는 본원에 기술된 화학식 I의 화합물 또는 다른 관련 화합물, 또는 MMP2 및/또는 MMP9의 발현을 하향 조절하는 siRNA 분자, 또는 MMP2 및/또는 MMP9의 활성을 차단하는 항체를 포함한다. 특정한 양태에서, 본 발명은 장기를 수거 하기 전에, 본원에 기술된 것들과 같은, 치료학적 유효량의 MMP2 및/또는 MMP9-특이적 억제제를, 이식 환자에게 장기를 기증하는 장기 기증자에게 투여하기 위해 제공된다. 이것은 또한
동종항원 -유도된 반응을 감소시킨다.
추가의 양태에서, 본 발명은 이식 환자 또는 이식을 필요로 하는 환자에게 유효량의 MMP2 및/또는 MMP9의 특이적 억제제를 투여함을 포함하여 상기 환자에서 콜라겐에 대한 면역 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 특정한 양태에서, 이식 환자는 폐 이식 수용자이다. 본 발명의 관련 양태에서, 특정 셋팅에서, MMP2 및/또는 MMP9의 특이적 억제제를 콜라겐 V의 투여와 함께 경구적으로, 정맥내 또는 본원에 기술된 다른 경로에 의해 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 또한 이식 환자에게 본원에 기술된 화합물과 같은 치료학적 유효량의 MMP2- 및/또는 MMP9-특이적 억제제를 투여함을 포함하여, 이식 결과를 개선시키는 방법을 제공한다. 특정의 양태에서, 장기 수거 하기 전에, 치료학적 유효량의 MMP2 및/또는 MMP9 억제제, 예를 들면, 본원에 기술된 화합물을 이식 환자에게 장기을 기증하는 장기 기증자에게 투여하는 것이 바람직할 수 있다. "결과를 개선시키는"은 이식체의 내성을 개선시키고, 이식 거부 또는 이식 대 숙주병을 감소시키고, 이식 후 이식체의 산소화를 방지하는 것을 의미한다.
면역억제 약물은 독성이 높은 것으로 잘 알려져 있다. 스테로이드 약물은 십여년간 사용되어 왔으며 이들의 부작용은 잘 알려져 있다. 연장된 스테로이드 치료요법에서 모든 환자에게 예상될 수 있는 부작용은 골다공증, 몸통 비만증, 손상된 상처 치유, 감염 및 어린이의 성장 정지를 포함한다. 이따금 발생하는 부작용은 근육병, 고혈압, 고지질혈증, 진성 당뇨병 및 백내장을 포함한다. 심각한 부작용으로 진행될 수 있으므로 환자 모니터링이 요구된다. 이들은 녹내장, 두개내압 상승, 장 천공 및 궤양을 포함한다.
중증근육무력증(MG), 류마티스 관절염(RA), 전신홍반루푸스(SLE), 다발경화증(MS) 및 소아 관절염과 같은 자가면역병을 흔히 우선 코르티코스테로이드로 처리하는 경우, 스테로이드에 대해 치료저항성이 되며 이후 아자티오프린, 메토트렉세이트 및 사이클로포스파미드를 포함하는 독성 약물의 사용이 증가한다. 아자티오프린의 주요 효과는 DNA 합성을 억제함으로써 T 및 B 림프세포의 수를 저하시키는 것이다. 그 외에 아자티오프린은 혼합된 림프구 반응 및 면역글로불린 생산을 억제하지만, 지연된 유형의 과민성(hypersensitivity)에 지속적으로 영향을 미치지 않는다. 아자티오프린의 주요 부작용은 범혈구감소증, 특히 림프구감소증 및 과립백혈구감소증이다. 그 결과적으로, 바이러스, 진균, 미코박테리아 및 원충 감염의 위험이 증가된다. 림프망 악성종양의 증가된 비율이 신장 이식 환자에서 보고되었으나, RA 환자에서는 보고되지 않았다.
메토트렉세이트는 엽산 합성을 억제하며 세포독성이어서, 골수를 억제한다. RA에 대해 사용된 낮는 투여량에서, 메토트렉세이트는 다수의 림프구를 감소시키지 않으나, IgM 및 IgG가 감소된다. 부작용은 폐렴, 오심, 위연동기능항진, 입 궤양, 백혈구감소증, 혈소판감소증, 및 간 생검에 의해서만 진단될 수 있는 간 섬유증의 형태를 포함한다.
사이클로포스파미드는 또한 RA 치료요법에 사용된다. 이는 간에서 DNA를 교차-연결하는 화합물로 대사된다. 사이클로포스파미드는 낮은 투여량에서도 관측되는 심각한 독성을 갖는 세포독성이다. 이는 B- 및 T-림프구의 수를 감소시키고, 면역글로불린 농도를 감소시키며 분열성 자극에 대한 B-세포 반응성을 감소시킴으로써 RA에 영향을 미친다. 모발 손실, 감염 및 심각한 오심이 일반적이다. 연장된 투여시, 환자는 증가된 비율로서 악성 종양으로 발전한다.
사이클로스포린은 백혈구 세포를 억제하지 않지만 강력한 면역조절 약물이고 류마티스 관절염을 치료하는데 효과적이다. 그러나, 중요한 부작용은 신장 독성이다.
CD4에 대한 모노클로날 항체가 자가면역병에 사용되어 왔으나, 이들은 비특이적 면역억제를 유발한다. 새로운 치료요법으로 T-림프구에 대한 특이적 유발 항원의 초기 제시를 간섭하는 것이 추천되어 왔다[참조: Wraith et al., Cell (1989) 57:709-715].
금 염, 항말라리아, 설파살라진 및 페니실라민을 포함하는 다른 약물이 RA에서 특이적으로 사용되어 왔다. 금 염은 근육내로 제공되며 이들의 효과는 수개월 동안 관찰되지 않을 수 있다. 금 치료의 부작용은 골수 무형성, 사구체신염, 폐 독성, 혈관 운동 반응 및 염증성 발적을 포함한다. 항말라리아는 림프구의 수를 감소시키지 않고 면역계에서 여러가지 부작용을 나타낸다. 항말라리아의 가장 심각한 부작용은 망막 색소 침착, 발진 및 위장연동이상항진을 포함한다. 설파살라진은 RA에서 이의 효과에 기여하는 여러가지 효과를 나타내지만, 이는 다수의 부작용을 가진다. 페니실라민은 RA에서 성공적으로 사용되었으나; 이의 다수의 부작용이 이의 용도를 제한하였다. 페니실라민은 중증근육무력증 및 SLE를 포함하는 다른 자가면역병을 유발하는 것으로 보고되었다.
환자가 동종이식체(다른 인간 또는 다른 공급원으로부터 이식된 조직)를 제공받는 경우, 이들의 면역계는 면역억제제 약물의 투여 부재시 동종이식체를 신속하게 파괴시킬 수 있다. 신장, 심장, 폐, 피부, 골수, 각막 및 간을 포함하는, 다수의 상이한 장기 및 조직이 현재 이식되고 있다. 이식 환자에서 흔히 사용된 약물은 사이클로스포린, 아자티오프린, 라파마이신, FK506과 같은 기타 마크롤라이드, 프레드니손, 메틸프레드니솔론, CD4 항체 및 사이클로포스파미드를 포함한다. 흔히 이들 약물은 자가면역병 환자에게 보다는 이식 환자에게 더 장기간 동안 및 더 높은 투여량으로 제공되어야 한다. 따라서, 이들 약물(위에서 논의한)로부터의 부작용은 이식 환자에 있어서는 더 일반적이고 심각할 수 있다.
요약하면, 면역억제 약물은 독성이 높은 것으로 잘 공지되어 있다. MMP2 및/또는 MMP9 억제제에 의한 치료와 조합함으로써 요구되는 투여량을 감소시키는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 MMP2 및/또는 MMP9에 대해 특이적인 억제제의 투여와 사이클로스포린, 타클로리무스(FK506), 시롤루무스(라파마이신), 메토트렉세이트, 아자티오프린, 머캅토푸린, 세포독성 항생제, 예를 들면, 닥티노마이신, 미토마이신 C, 블레오마이신 및 미트라마이신, 사이클로포스파미드, 퓨린 유사체, 글루코코르티코이드, 항체(예를 들면, 항-CD20, 항-CD3 및 항-L-2 수용체), 인터페론, TNF 결합 단백질 및 미코페놀레이트와 같은 각종 공지된 면역억제 약물중의 어느것의 투여를 조합함으로써 필요한 독성 면역억제제의 투여량을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 MMP2 및/또는 MMP9의 특이적 억제제를 다른 면역억제 약물을 포함하는 다른 공지된 치료요법과 조합하여 투여함으로써 면역 반응을 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다.
본원에서 사용되는 "면역 반응"은 T 세포, B 세포, 대식세포 및 수지 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 면역계의 세포를 활성화시킴으로써 특수 세포의 특수 작용체 기능(들)을 유도하는 것을 말한다. 작용체 기능은 항원의 제시, 증식 사이토킨의 분비, 항체의 분비, 조절성 및/또는 부착 분자의 발현, 활성화 분자의 발현, 및 세포분해를 유도하는 능력을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 면역계의 특정의 T 세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 조절성 T 세포, 동종-반응성 T 세포, 항원-특이적 T 세포, 기억 T 세포와 같이, 본원에 사용된 것으로서 "면역 반응"의 일부일 수 있다. 당해 분야의 숙련가에 의해 인식되는 바와 같이, 면역계의 세포는 세포 표면 마커, 사이토킨 발현 패턴 또는 작용체 기능의 발현 패턴에 의해 확인되거나, 정제되거나 또한 달리 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 "면역 반응을 감소 또는 억제하는"은 면역계의 성분(예를 들면, 사이토킨) 또는, 면역계의 성분이 특성화된 활성을 감소시킴을 의미한다. 예로써, 대상체의 면역 반응의 억제는 존재하는 억제제 또는 조절성 T 림프구의 수를 증가시키고, 대상체내에서 억제제 또는 조절성 T 림프구에 의한 면역억제 인자의 분비를 증가시키고, 대상체내에 존재하는 세포독성 T 림프구의 수를 감소시키고, 대상체내에 세포독성 T 림프구의 세포독성 활성을 감소시키며, 항체의 양을 감소시키고, 상보체 단백질의 양을 감소시키며, 상보체 단백질의 세포와 상호작용하는 능력을 감소시키는 등을 포함한다. 따라서, "감소하는" 또는 "억제하는"은, 면역계의 특정의 면역조절성 사이토킨 또는 특정 세포, 예를 들면, 조절성 T 세포의 활성 또는 양을 증가시킴을 의미할 수 있다.
면역 반응에서 변화를 측정하기 위한 분석 및 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 면역계의 성분들은 문헌[참조: Current Protocols in Immunology , Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001 John Wiley & Sons, NY, NY)]에 기술된 것과 같은, 당해 분야에 공지된 특정의 다수의 분석을 사용하여 각종 사이토킨 수준을 측정함으로써 면역계 성분들 전신계적으로(예를 들면, 말초 혈액으로부터) 또는 국소적으로(예를 들면, 비장 세포, 림프구 세포, 종양, MALT, GALT 등) 측정할 수 있다. 사이토킨에 대해 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하여 사이토킨의 발현을 검출하고 측정하기 위한 각종 프로토콜이 당해 분야에 공지되어 있다. 예는 효소-결합된 면역흡착 분석(ELISA), ELISPOT, 세포내 사이토킨 염색 분석(ICS), 방사면역분석(RIA), 형광성 활성화된 세포 분류(FACS), 및 세포-계 분석(예: IL-2 의존성 T 세포 분석)을 포함한다. 제공된 폴리펩타이드에서 2개의 비-방해 에피토프에 대해 반응성인 모노클로날 항체를 이용하는 2개 부위-모노클로날-계 면역분석이 일부 적용에 바람직할 수 있지만, 경쟁적 결합 분석 또한 사용할 수 있다. 이들 및 다른 분석은 특히 문헌[참조: Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn.) and Maddox, D. E. et al. (1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216)]에 기술되어 있다.
면역 반응의 작용체 기능에 있어서 증가 및 감소를 측정하기 위한 각종 세포 분석은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있으며 예를 들면, 문헌[참조: Current Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001 John Wiley & Sons, NY, NY)]에 잘 공지되어 있다. 이들은 증식 분석, 세포독성 T 세포 분석(예를 들면, 크롬 방출 또는 유사한 분석), 세포내 사이토킨 염색 분석, ELISPOT, 및 특정한 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 또는 RT-PCR 계 분석을 사용하는 유전자 발현 분석을 포함한다. 본원에 기술된 방법을 실시하는데 유용할 수 있는 일반적인 분석 및 기술은 또한 예를 들면, 문헌[참조: Methods Ausubel et al. (2001 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY); Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY); Maniatis et al. (1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY)] 등에서 찾을 수 있다. 특이적 항체 또는 항체들의 항체 생산의 측정을 또한 사용하여 면역 반응 및 이에 대한 변화를 측정할 수 있다.
일반적으로, 면역 반응을 감소시키거나 억제하는 것은 체액성 반응 및/또는 세포 반응에 있어서의 감소를 포함하나, 본원에서 또한 주목한 바와 같이, 이러한 세포에 의해 생산된 조절성 또는 억제제 T 세포 및/또는 사이토킨의 수 및/또는 활성에 있어서의 증가를 포함할 수 있다. 면역 반응의 이러한 "억제" 또는 "감소"는 당해 분야에 공지되고 본원에서 기술된 기술을 사용하여 측정된 바와 같이, 하나 이상의 적절한 면역 세포(T 세포, B 세포, 항원-제시 세포, 수지 세포 등)의 수준 또는 하나 이상의 이들 면역 세포의 활성(CTL 활성, 헬퍼 T 림프구(HTL) 활성)에 있어서, 특정의 통계적으로 현저한 감소(또는 경우에 따라, 조절성 또는 억제제 T 세포에서의 증가), 사이토킨 분비, 사이토킨 분비의 프로파일에 있어서의 변화 등을 포함한다.
특정의 양태에서, 면역 반응의 억제는 MMP2 및/또는 MMP9 억제제가 투여된 대상체에서 1.5 내지 5배의 항원-특이적인 또는 동종반응성 T 세포 활성에 있어서의 감소를 포함한다. 또 다른 양태에서, 면역 반응의 억제는 본원에서 기술된 것으로서 MMP2 및/또는 MMP9 억제제를 투여한 대상체에서 약 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 15, 16, 17, 18, 19, 20배 이상의 항원-특이적이거나 동종반응성인 T 세포 활성에 있어서의 감소를 포함한다.
추가의 양태에서, 면역 반응의 억제는 본원에서 기술된 바와 같은 MMP2 및/또는 MMP9 억제제가 투여된 대상체에서 1.5 내지 5배의 헬퍼 T 세포의 증식과 같은 항원-특이적이거나 동종반응성인 HTL 활성에 있어서의 감소를 포함한다. 다른 양태에서, 면역 반응의 억제는 본원에서 기술된 것으로서 MMP2 및/또는 MMP9 억제제가 투여된 대상체에서 약 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 15, 16, 17, 18, 19, 20배 이상의 항원-특이적인 또는 동종반응성 HTL 활성에 있어서의 감소를 포함한다. 이와 관련하여, HTL 활성에 있어서의 억제는 인터페론-감마(IFN-γ), 인터루킨-1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF), 또는 기타 사이토킨과 같은 하나 이상의 특수한 사이토킨의 생산에 있어서의 감소를 포함할 수 있다.
추가의 양태에서, 면역 반응의 억제는 본원에서 기술된 것으로서 MMP2 및/또는 MMP9 억제제가 투여된 대상체에서 1.5 내지 5배의 세포독성 T 세포의 증식과 같은 항원-특이적이거나 동종반응성인 CTL 활성에 있어서의 감소를 포함한다. 다른 양태에서, 면역 반응의 억제는 본원에서 기술된 것으로서 MMP2 및/또는 MMP9 억제제가 투여된 대상체에서 약 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 15, 16, 17, 18, 19, 20배 이상의 항원-특이적이거나 동종반응성인 CTL 활성에 있어서의 감소를 포함한다. 이와 관련하여, CTL 활성에 있어서의 억제는 당해 분야에 공지된 적절한 분석(예를 들면, 크롬 방출 분석; 세포내 사이토킨 염색 분석, ELISPOT)에 의해 측정된 것으로서 CD8+ T 세포의 세포독성 활성에 있어서의 감소를 포함할 수 있다.
추가의 양태에서, 면역 반응의 감소 또는 억제는 본 발명의 방법에 의해 MMP2 및/또는 MMP9 억제제가 투여된 대상체에서 1.5 내지 5배의 특이적인 항체 생산에 있어서의 감소를 포함한다. 다른 양태에서, 면역 반응의 감소 또는 억제는 본 발명의 방법에 의해 MMP2 및/또는 MMP9 억제제가 투여된 대상체에서 약 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 15, 16, 17, 18, 19, 20배 이상의 특이적인 항체 생산에 있어서의 감소를 포함한다.
본 발명의 특정한 양태에서, 본 발명의 MMP2 및/또는 MMP9 억제제의 투여는 조절성 T 세포에 영향을 미치지 않는다. 조절성 T 세포는 본원에 기술된 바와 같은 분석을 사용하여 측정할 수 있으며 세포 표면 마커 발현에 의해 확인될 수 있다. 특히, 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 전통적으로, T 조절성 세포는 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+, 및 FoxP3+ 표현형[참조: 예를 들면, Woo, et al., J Immunol. 2002 May 1;168(9):4272-6; Shevach, E.M., Annu. Rev. Immunol. 2000, 18:423; Stephens, et al., Eur. J. Immunol. 2001, 31:1247; Salomon, et al, Immunity 2000, 12:431; and Sakaguchi, et al., Immunol. Rev. 2001, 182:18]을 가진다. 다른 마커가 또한 조절성 T 세포의 확인 및 정량화에 유용할 수 있다[참조: 예를 들면, Inflamm Allergy Drug Targets. 2008 Dec;7(4):217-23].
본원에서 사용된 대상체는 특정의 포유동물을 말한다. 특정의 양태에서, 대상체는 인간 환자이다. 추가의 양태에서, 대상체는 마우스, 랫트, 개, 고양이, 비-인간 영장류, 돼지 또는 기타 실험 동물일 수 있다. 특정의 양태에서, 대상체는 면역억제성 치료요법이 요구되는 인간 환자, 이식이 요구되는 환자 또는 이식 환자이다.
당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 인식되는 바와 같이, 다른 측정을 사용하여 이식 거부, GVHD 또는 숙주 대 이식체 질병에 있어서의 감소, 자가면역 증후군에 있어서의 감소 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 면역 반응의 임상적 징후와 같은 면역 반응의 억제 또는 감소를 측정할 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명의 MMP2 및 MMP9 억제제 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 순수한 형태 또는 적절한 약제학적 조성물로서의 투여는 유사한 유용성을 제공하기 위한 제제의 특정의 허용되는 투여 방식으로 수행할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 화합물을 적절한 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합함으로써 제조할 수 있으며, 고체, 반-고체, 액체 또는 기체형의 제제, 예를 들면, 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 연고, 용액, 좌제, 주사제, 흡입제, 겔제, 미세구 및 에어로졸로 제형화할 수 있다. 그 외에 다른 약제학적으로 활성인 성분(다른 면역억제제 포함) 및/또는 염, 완충제 및 안정화제와 같은 적합한 부형제가 조성물내에 존재할 수 있지만 요구되지는 않는다.
투여는 경구, 비경구, 비강, 정맥내, 피내, 피하 또는 국소를 포함하는 각종의 상이한 경로로 달성할 수 있다. 바람직한 투여 방식은 치료되거나 예방될 상태의 특성에 의존한다. 투여 후 면역 반응 또는 이러한 반응의 임상적 징후의 발생을 감소시키거나, 억제하거나, 예방하거나, 또는 지연시키는 양은 효과적인 것으로 고려된다.
특정의 양태에서, 투여된 양은 본원의 어느 곳에서 기술된 바와 같이 감소된 면역 활성을 야기하는데 충분하다. 정확한 투여량 및 치료 기간은 치료되는 질병의 함수이며 공지된 시험 프로토콜을 사용하거나 당해 분야에 알려진 모델 시스템에서 조성물을 시험하여 이로부터 추론함으로써 경험적으로 측정할 수 있다. 조절된 임상 시험이 또한 수행될 수 있다. 투여량은 또한 완화될 증상의 중증도에 따라 변할 수 있다. 약제학적 조성물은 일반적으로 제형화되어 바람직하지 않은 부작용을 최소화하면서 치료학적으로 유용한 효과를 발휘하기 위해 투여된다. 이 조성물은 1회 투여될 수 있거나 시간 간격으로 투여될 다수의 보다적은 투여량으로 분할될 수 있다. 어떠한 특수 대상체의 경우, 특정 투여량 섭생이 필요한 개인에 따라 시간에 걸쳐 조절될 수 있다.
본 발명의 화합물은 면역억제 섭생, 방사선 치료요법, 화학치료요법, 이식, 경구 콜라겐 치료요법, 면역치료요법, 호르몬 치료요법, 광역학적 치료요법 등과 같은 다른 공지된 치료와 함께 또는 단독으로 투여될 수 있다.
따라서, 이들 및 관련된 약제학적 조성물의 대표적인 투여 경로는 경구, 국소, 경피, 흡입, 비경구, 설하, 볼내, 직장, 질내 및 비강내를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "비경구"는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 이에 함유된 활성 성분이 조성물을 환자에게 투여시 생물학적으로 이용 가능하도록 하기 위해 제형화된다. 대상체 또는 환자에게 투여될 조성물은 하나 이상의 단위 투여량 단위의 형태를 취하며, 여기서, 예를 들면, 정제는 단일 용량 단위일 수 있고, 에어로졸 형태의 본 발명의 화합물의 용기는 다수의 투여량 단위를 가질 수 있다. 이러한 투여형태를 제조하는 실제 방법은 공지되어 있거나, 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다[참조: 예를 들면, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)]. 투여될 조성물은 어떠한 경우에도 본 발명의 교시내용에 따라 목적한 질병 또는 증상을 치료하기 위해, 치료학적 유효량의 본 발명의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 함유할 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 고체 또는 액체의 형태일 수 있다. 하나의 국면에서, 담체(들)은 조성물이 예를 들면, 정제 또는 산제형일 수 있도록 입자화된다. 담체(들)은 액체일 수 있으며, 조성물은 예를 들면, 경구 오일, 주사가능한 액체 또는 예를 들면, 흡입 투여에 유용한 에어로졸일 수 있다.
경구 투여를 위해 의도한 경우, 약제학적 조성물은 바람직하게는 고체 또는 액체형이며, 여기서, 반-고체, 반-액체, 현탁제 및 젤 형태가 고체 또는 액체로서 본원에서 고려되는 형태내에 포함된다.
경구 투여용 고체 조성물로서, 약제학적 조성물은 분말제, 과립제, 압축 정제, 환제, 캅셀제, 츄잉검, 웨이퍼(wafer) 또는 유사한 형태로 제형화될 수 있다. 이러한 고체 조성물은 통상적으로 하나 이상의 불활성 희석제 또는 식용가능한 담체를 함유한다. 그 외에 하나 이상의 다음 성분들이 존재할 수 있다: 카복시메틸셀룰로즈, 에틸 셀룰로즈, 미세결정성 셀룰로즈, 검 트라가칸트 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분, 락토즈 또는 덱스트린과 같은 부형제, 알긴산, 알긴산 나트륨 알기네이트, 프리모겔, 옥수수 전분 등과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로텍스와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화규소와 같은 활제(glidant); 슈크로즈 또는 사카린과 같은 감미제; 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 풍미와 같은 풍미제; 및 착색제.
약제학적 조성물이 캅셀제, 예를 들면, 젤라틴 캅셀제의 형태인 경우, 이는 상기한 유형의 물질 외에, 폴리에틸렌 글리콜 또는 오일과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다.
약제학적 조성물은 액체, 예를 들면, 엘릭서제, 시럽제, 액제, 유제 또는 현탁제의 형태일 수 있다. 액체는 2개의 예로서 경구 투여용 또는 주사에 의한 전달용일 수 있다. 경구 투여용으로 의도된 경우, 바람직한 조성물은 본 발명의 화합물 외에, 하나 이상의 감미제, 방부제, 염료/착색제 및 풍미 증진제를 함유한다. 주사로 투여하도록 의도된 조성물에서, 하나 이상의 계면활성제, 방부제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 완충제, 안정화제 및 등장성 제제가 포함될 수 있다.
본 발명의 액체 약제학적 조성물은, 이들이 액제, 현탁제 또는 다른 유사 형태인 것에 상관없이, 하나 이상의 다음 보조제를 포함할 수 있다: 주사용수, 염수 용액, 바람직하게는 생리학적 염수, 링거액(Ringer's solution), 등장성 염화나트륨과 같은 멸균 희석제, 용매 또는 현탁화 매질로서 제공될 수 있는 합성의 모노 또는 디글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매와 같은 고정 오일; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항세균제; 아스코르브산 또는 아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제 및, 염화나트륨 또는 덱스트로즈와 같은 강직성 조절용 제제. 비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 투여량 바이알 속에 봉입시킬 수 있다. 생리학적 염수가 바람직한 보조제이다. 주사가능한 약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균성이다.
비경구 또는 경구 투여용으로 의도된 본 발명의 액체 약제학적 조성물은, 적합한 용량이 수득되도록 일정량의 본 발명 화합물을 함유하여야 한다. 전형적으로, 이러한 양은 조성물내 본 발명의 화합물의 적어도 0.01%이다. 경구 투여용으로 의도된 경우, 당해 양은 조성물의 0.1 내지 약 70 중량%로 변할 수 있다. 특정의 경구 약제학적 조성물은 본 발명의 화합물을 약 4% 내지 약 75% 함유한다. 본 발명에 따른 특정의 약제학적 조성물 및 제제는, 비경구 용량 단위가 본 발명의 희석 전에 화합물을 0.01 내지 10중량% 함유하도록 제조된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 국소 투여용으로 의도될 수 있으며, 각 경우에, 담체는 적합하게는 액제, 유제, 연고 또는 겔 베이스(base)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 베이스(base)는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 석유, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 밀납, 광 오일, 물 및 알코올등의 희석제, 및 유화제 및 안정화제. 증점제는 국소 투여용 약제학적 조성물내에 존재할 수 있다. 경피 투여용으로 의도된 경우, 본 조성물은 경피용 패취 또는 이온이동법 장치를 포함할 수 있다. 국소 제형은 약 0.1 내지 약 10% w/v(단위 용적당 중량)의 본 발명의 화합물 농도를 함유할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 예를 들면, 직장 내에서 용융하여 약물을 방출할 좌제 형태의 직장 투여용으로 의도될 수 있다. 직장 투여용 조성물은 적합한 비자극성 부형제와 같은 유지성 베이스를 함유할 수 있다. 이러한 베이스는 라놀린, 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약제학적 조성물은 고체 또는 액체 용량 단위의 물리적 형태를 변형시키는 각종 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 활성 성분 주변의 피복 쉘을 형성하는 물질을 포함할 수 있다. 피복 쉘을 형성하는 물질은 전형적으로 불활성이며, 예를 들면, 당, 쉘락(shellac) 및 기타 장 피복제 중에서 선택될 수 있다. 이와는 달리, 활성 성분은 젤라틴 캅셀 속에 포장될 수 있다.
고체 또는 액체형의 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 화합물에 결합함으로써 화합물의 전달을 보조하는 제제를 포함할 수 있다. 이러한 용량으로 작용할 수 있는 적합한 제제는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 단백질 또는 리포좀을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 에어로졸로서 투여될 수 있는 용량 단위로 이루어질 수 있다. 용어 "에어로졸"은 콜로이드 특성의 것들로부터 가압된 포장으로 이루어진 시스템까지 범위의 각종 시스템을 나타내기 위해 사용된다. 전달은 액화되거나 압착된 가스에 의해 또는 활성 성분을 분배하는 적합한 펌프 시스템에 의해 이루어질 수 있다. 본 발명의 화합물의 에어로졸은 활성 성분(들)을 전달하기 위하여, 단일상, 2-상, 또는 3-상 시스템으로 전달될 수 있다. 에어로졸의 전달은 함께 키트를 형성할 수 있는 필수적인 용기, 활성화제, 밸브, 소용기 등을 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 과도한 실험없이 바람직한 에어로졸을 측정할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 분야에 익히 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 주사로 투여하도록 의도된 약제학적 조성물은 본 발명의 화합물을 멸균된 증류수와 결합하여 용액을 형성하도록 함으로써 제조할 수 있다. 계면활성제는 균질한 용액 또는 현탁액의 형성을 촉진하기 위해 가해질 수 있다. 계면활성제는 본 발명의 화합물과 비-공유결합적으로 상호작용하여 수성 전달 시스템에서 화합물의 용해 또는 균질한 현탁을 촉진시키는 화합물이다.
본 발명의 화합물, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염은 사용된 특정 화합물의 활성; 이 화합물의 대사 안정성 및 작용 기간; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 방식 및 시간; 배출율; 약물 조합; 특수 질환 또는 증상의 중증도; 및 치료요법 처리 중인 대상체를 포함하는 각종 인자에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 치료학적으로 효과적인 1일 투여량은 (70kg 체중의 포유동물의 경우) 약 0.001 mg/kg(즉, 0.07 mg) 내지 약 100 mg/kg(즉, 7.0 g)이고; 바람직하게는 치료학적 유효량은 (70 kg 체중의 포유동물의 경우) 약 0.01 mg/kg(즉, 0.7 mg) 내지 약 50 mg/kg(즉, 3.5 g)이며; 보다 바람직하게는 치료학적 유효량은 (70 kg 체중의 포유동물의 경우) 약 1 mg/kg(즉, 70 mg) 내지 약 25 mg/kg(즉, 1.75 g)이다.
본 발명의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 또한 하나 이상의 다른 치료제의 투여와 동시에, 투여 전에, 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 이러한 조합 치료요법은 본 발명의 화합물 및 하나 이상의 추가의 활성제를 함유하는 단일 약제학적 투여량 제형의 투여, 및 본 발명의 화합물과 각각의 활성제의 이의 자신의 별도의 약제학적 투여량 제형으로의 투여를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 화합물 및 다른 활성제는 환자에게 정제 또는 캅셀제와 같은 단일의 경구 용량 조성물과 함께, 또는 별도의 경구 투여량 제형으로 투여된 각각의 제제와 함께 투여될 수 있다. 별도의 투여량 제형이 사용되는 경우, 본 발명의 화합물 및 하나 이상의 추가의 활성제는 필수적으로 동시에, 즉, 동시에 또는 별도의 시차적인 시간에, 즉, 연속적으로 투여될 수 있으며; 조합 치료요법은 이들 섭생을 모두 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명의 화합물은 장기 이식과 관련된 자가면역병 또는 질환과 같이, 본원에 기술된 바와 같은 질병 또는 질환에 영향받은 개인에게 투여될 수 있다. 인간 질병의 치료를 위해 생체내 사용하기 위해, 본원에 기술된 화합물은 일반적으로 투여 전에 약제학적 조성물내로 혼입된다. 약제학적 조성물은 본원에 기술된 하나 이상의 화합물을 본원에 또한 기술된 바와 같은 생리학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함한다. 약제학적 조성물을 제조하기 위해서는, 유효량의 하나 이상의 화합물을 특수 투여 방식에 적합한 것으로 당해 분야의 숙련가에게 공지된 특정의 약제학적 담체(들) 또는 부형제와 혼합한다. 약제학적 담체는 액체, 반-액체 또는 고체일 수 있다. 비경구, 피내, 피하 또는 국소 적용을 위해 사용된 액제 또는 현탁제는 예를 들면, 멸균 희석제(예를 들면, 물), 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항미생물제(예를 들면, 벤질 알코올 및 메틸 파라벤); 항산화제(예를 들면, 아스코르브산 및 아황산나트륨) 및 킬레이트제(예를 들면, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)); 완충제(예를 들면, 아세테이트, 시트레이트 및 포스페이트)를 포함할 수 있다. 정맥내 투여되는 경우, 적합한 담체는 생리학적 염수 또는 인산염 완충된 염수(PBS), 및 글루코즈, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 이의 혼합물과 같은 증점제 및 가용화제를 함유하는 용액을 포함한다.
본원에서 기술된 화합물은 신체로부터 신속한 제거에 대해 이를 보호하는 담체, 예를 들면, 시간 방출형 제형 또는 피복제를 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 담체는 임플란트 및 미세봉입된 전달 시스템과 같은 서방성 제형, 및 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산 및 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 것들과 같은 생분해성, 생혼화성 중합체를 포함한다.
도 1은 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 차등적인 MMP9 mRNA 및 단백질 발현을 도시한다. 순수한 비장 A) CD4+ 및 B) CD8+ T 세포를 항-CD3 항체(1㎍/ml)의 존재 또는 부재하에서 배양시켰다. RNA를 분리하고, 합성된 cDNA 및 mRNA 발현 수준을 정량적 RT PCR로 측정하였다. 데이타를 β-액틴에 대해 표준화하였다. 데이타는 3회 수행된 2개의 별개의 실험을 대표한다. C) CD4+ 및 CD8+ T 세포 분해물 및 상층액의 젤라틴 자이모그람 분석. 데이타는 4회의 별도의 실험들 중의 하나를 대표한다.
도 2는 항-CD3 유도된 T 세포 증식을 방지한 광범위한 스펙트럼 및 특이적인 MMP 억제를 도시한다. 순수한 비장 CD4+ T 세포를 A) 1,10 페난트롤린(0.001-0.1μM) 또는 B) COL-3 (1-100μM)로 처리하였다. C) CD4+ 및 D) CD8+ T 세포를 SB3CT (5-25μM) 또는 비히클(DMSO + PEG, CRPMI 속에 유사하게 희석됨)로 처리하고 항-CD3 항체(0.5㎍/ml)의 존재하에서 72시간 동안 배양하였다. E) CD4+ 및 F) CD8+ SB3CT 처리된 T 세포를 항-CD3 및 외인성 쥐 IL-2의 존재하에서 72시간 동안 배양하였다. T 세포 증식을 3H 티미딘 혼입으로 측정하였다. 데이타는 3회 수행한 3회 실험의 평균 ±를 나타낸다. #p<0.05, *p<0.001.
도 3은 MMP2, MMP9 및 MMP2/9 결핍성 CD4 T 세포가 변경된 증식 활성을 나타냄을 도시한다. 야생형 및 A) MMP2-/- CD4+, B) MMP9-/- CD4+, C) MMP2/9-/- CD4+, D) MMP9-/- CD8+ T 세포를 항-CD3 항체(0.5㎍/ml)의 존재하에 72시간 동안 배양하였다. T 세포 증식을 3H 티미딘 혼입으로 측정하였다. 데이타는 3회 수행된 3개의 별개 실험의 평균 SD±를 나타낸다. #p=0.02, *p=0.006, **p<0.001.
도 4는 MMP 결핍성 또는 억제가 칼슘 플럭스(calcium flux)를 감소시킴을 도시한다. A) CD4+ 또는 B) CD8+ T 세포를 야생형 및 MMP9-/- 마우스로부터 분리하였다. C-D) CD8+ T 세포를 SB3CT (10μM) 또는 비히클(DMSO + PEG, CRPMI 속에서 유사하게 희석됨)로 처리하였다. A-C) 세포를 칼슘 부재하에서 또는 D) 칼슘을 함유 배지에서 배양하고 항-CD3 항체(10㎍/ml)로 자극하였다. 칼슘 플럭스를 실시간으로 100초 동안 측정하였다. 데이타는 3회 수행된 3회의 별도 실험 중 하나를 나타낸다.
도 5는 MMP 결핍 또는 억제가 NFATc1 및 CD25 발현을 변경시킴을 도시한다. A-B) CD4+ T 세포를 야생형, MMP2-/- 및 MMP9-/- 마우스로부터 분리하였다. C-D) CD4+ T 세포를 SB3CT (5-20μM) 또는 비히클(DMSO + PEG, CRPMI 속에 유사하게 희석됨)으로 처리하였다. 세포를 항-CD3 항체(1μ/ml)의 존재 또는 부재하에서 배양하였다. NFATc1 및 CD25 발현 수준을 정량적 RT PCR로 측정하였다. 데이타는 3회 수행된 3회의 별도 실험을 나타낸다. #p<0.05, ##p<0.01, *p<0.001.
도 6은, MMP9 억제가 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 IL-2 및 IFN-γ 발현을 하향-조절함을 도시한다. A-B) CD4+ T 세포를 야생형 및 MMP9-/- 마우스로부터 분리하였다. C-D) 야생형 CD4+ T 세포를 SB3CT(10μM) 또는 비히클(DMSO + PEG, CRPMI 속에 유사하게 희석됨)로 다양한 시점동안 처리하였다. E-F) CD8+ T 세포를 야생형 및 MMP9-/- 마우스로부터 분리하였다. G-H) CD8+ T 세포를 SB3CT(10μM)로 다양한 시점 동안 처리하였다. 세포를 항-CD3 항체(1㎍/ml)의 존재 또는 부재하에서 배양하였다. IL-2 및 IFN-γ mRNA 및 단백질 발현을 정량적 RT PCR 및 혈구계산 비드 분석으로 각각 측정하였다. 데이타는 3회 수행한 3회의 별도 실험을 나타낸다. *p<0.001.
도 7은, MMP9 억제가 조절성 T 세포 기능을 유도하지 않음을 나타낸다. 야생형, MMP9-/- 및 SB3CT (10μM) 또는 비히클(DMSO + PEG, CRPMI 속에 유사하게 희석됨) 처리된 CD4+ T 세포를 항-CD3(0.5㎍/ml)의 존재 또는 부재하에서 배양하였다. A-B) Foxp3 발현을 정량적 RT PCR로 측정하였다. C) 세포 배양 상층액을 수집하고 혈구분석 비드 분석에 의해 IL-10 단백질 발현에 대해 분석하였다. D) CD4+25- 또는 E) CD4+25+ T 세포를 SB3CT(10μM)로 처리하고 신선한 CD4+25-T 세포를 사용하여 항-CD3 (0.5㎍/ml)의 존재하에 다양한 비로 배양하였다. 패널 A 및 -C로부터의 데이타는 3회 수행된 1개 실험을 나타낸다. 패널 D-E로부터의 데이타는 3회 수행된 3개의 별도 실험을 나타낸다. #p<0.01, *p<0.001.
도 8은, 증식능에 있어서 SB3CT 처리된 항원-특이적인 T 세포(OT-I) 디스플레이 장애를 도시한다. A) OTI Tg CD8+T 세포를 SB3CT(5-20μM) 또는 비히클(DMSO + PEG, CRPMI 속에서 유사하게 희석됨)으로 처리하고 OVA-펄스처리된 항원 제시 세포 세포(APC)의 존재하에서 72시간 동안 배양하였다. 데이타는 3회 수행된 2개의 별도 실험을 나타낸다. #p<0.05, *p<0.001 B) 입양 전달(adoptive transfer)7일 후에, CC10-OVA (CC10) 또는 비-형질도입(B6) 마우스로부터의 BAL 유액을 분석하고 BAL 속에 존재하는 전체 세포를 정량화하였다. C) 호중구를 GR1으로 염색하고 유동 세포분석법을 이용하여 분석하였다. ** 자극된 야생형 세포와 비교한 것으로서 p<0.01. 처리 그룹 당 n=10마리 마우스(CC10) 및 처리 그룹당 5마리의 대조군 마우스(B6).
도 9는, 항원-특이적인 CD8+ 작용체 T 세포 매개된 폐 손상의 쥐 모델을 도시한다. A) CD8+Thy1.1+ T 세포를 SB3CT(10μM) 또는 비히클(DMSO + PEG, CRPMI 속에서 유사하게 희석됨)의 입양 전달 이후 마우스 폐로부터 분리하였다. B) CC10-OVA 마우스의 폐로부터 CD8+Thy1.1+ T 세포내 CD25 발현. * p<0.01처리 그룹당 n=9마리 마우스(CC10) 및 처리 그룹 당 5마리의 대조군 마우스(B6).
도 10은, MMP 억제(SB3CT) 또는 부재(MMP9 결핍성)에 대한 반응시 T 세포 활성화에 있어서 차이점의 개략도를 도시한다. 정상 세포 조건하에서 TCR 자극(1) 후, NFAT(5), CD25(6) 및 IL-2(8) 발현의 상향-조절을 초래함으로써 CD25 세포 표면 발현 및 IL-2의 결합을 허용하여 세포 활성화를 초래하는, (2) 칼슘 플럭스(3,4)에 있어서의 증가를 포함하는 많은 시그날링 현상의 상향-조절이 존재한다. MMP9의 부재하에서, NFAT 발현이 하향-조절되어도 칼슘 플럭스는 현저히 상승한다. 결과적으로 NFAT 발현에 있어서의 감소는 CD25 및 IL2 발현에 있어서의 감소를 초래하는 반면, 조절 경로, Foxp3 및 IL-10가 상향-조절됨으로써 세포 활성화가 감소된다.
도 11은, CD4+ 및 CD8+ MMP9-/- T 세포의 표현형 분석을 도시한다. 순수한 비장 A) CD4+ 및 B) CD8+ T 세포를 야생형(실선 개방 막대그래프) 및 MMP9 결핍성(사선 개방 막대그래프) 마우스로부터 분리하였다. 세포를 항-CD3 항체(0.5㎍/ml)의 존재하에 24시간 동안 배양하였다. 세포를 수집하고 CD45RO, CD69, CD25, CD44, CD40L, CD62L, CTLA-4의 표면 발현을 유동 세포분석법으로 분석하였다. 사선 막대그래프는 동형 대조군을 나타낸다. 데이타는 2개의 별도의 실험 중 하나를 나타낸다.
도 2는 항-CD3 유도된 T 세포 증식을 방지한 광범위한 스펙트럼 및 특이적인 MMP 억제를 도시한다. 순수한 비장 CD4+ T 세포를 A) 1,10 페난트롤린(0.001-0.1μM) 또는 B) COL-3 (1-100μM)로 처리하였다. C) CD4+ 및 D) CD8+ T 세포를 SB3CT (5-25μM) 또는 비히클(DMSO + PEG, CRPMI 속에 유사하게 희석됨)로 처리하고 항-CD3 항체(0.5㎍/ml)의 존재하에서 72시간 동안 배양하였다. E) CD4+ 및 F) CD8+ SB3CT 처리된 T 세포를 항-CD3 및 외인성 쥐 IL-2의 존재하에서 72시간 동안 배양하였다. T 세포 증식을 3H 티미딘 혼입으로 측정하였다. 데이타는 3회 수행한 3회 실험의 평균 ±를 나타낸다. #p<0.05, *p<0.001.
도 3은 MMP2, MMP9 및 MMP2/9 결핍성 CD4 T 세포가 변경된 증식 활성을 나타냄을 도시한다. 야생형 및 A) MMP2-/- CD4+, B) MMP9-/- CD4+, C) MMP2/9-/- CD4+, D) MMP9-/- CD8+ T 세포를 항-CD3 항체(0.5㎍/ml)의 존재하에 72시간 동안 배양하였다. T 세포 증식을 3H 티미딘 혼입으로 측정하였다. 데이타는 3회 수행된 3개의 별개 실험의 평균 SD±를 나타낸다. #p=0.02, *p=0.006, **p<0.001.
도 4는 MMP 결핍성 또는 억제가 칼슘 플럭스(calcium flux)를 감소시킴을 도시한다. A) CD4+ 또는 B) CD8+ T 세포를 야생형 및 MMP9-/- 마우스로부터 분리하였다. C-D) CD8+ T 세포를 SB3CT (10μM) 또는 비히클(DMSO + PEG, CRPMI 속에서 유사하게 희석됨)로 처리하였다. A-C) 세포를 칼슘 부재하에서 또는 D) 칼슘을 함유 배지에서 배양하고 항-CD3 항체(10㎍/ml)로 자극하였다. 칼슘 플럭스를 실시간으로 100초 동안 측정하였다. 데이타는 3회 수행된 3회의 별도 실험 중 하나를 나타낸다.
도 5는 MMP 결핍 또는 억제가 NFATc1 및 CD25 발현을 변경시킴을 도시한다. A-B) CD4+ T 세포를 야생형, MMP2-/- 및 MMP9-/- 마우스로부터 분리하였다. C-D) CD4+ T 세포를 SB3CT (5-20μM) 또는 비히클(DMSO + PEG, CRPMI 속에 유사하게 희석됨)으로 처리하였다. 세포를 항-CD3 항체(1μ/ml)의 존재 또는 부재하에서 배양하였다. NFATc1 및 CD25 발현 수준을 정량적 RT PCR로 측정하였다. 데이타는 3회 수행된 3회의 별도 실험을 나타낸다. #p<0.05, ##p<0.01, *p<0.001.
도 6은, MMP9 억제가 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 IL-2 및 IFN-γ 발현을 하향-조절함을 도시한다. A-B) CD4+ T 세포를 야생형 및 MMP9-/- 마우스로부터 분리하였다. C-D) 야생형 CD4+ T 세포를 SB3CT(10μM) 또는 비히클(DMSO + PEG, CRPMI 속에 유사하게 희석됨)로 다양한 시점동안 처리하였다. E-F) CD8+ T 세포를 야생형 및 MMP9-/- 마우스로부터 분리하였다. G-H) CD8+ T 세포를 SB3CT(10μM)로 다양한 시점 동안 처리하였다. 세포를 항-CD3 항체(1㎍/ml)의 존재 또는 부재하에서 배양하였다. IL-2 및 IFN-γ mRNA 및 단백질 발현을 정량적 RT PCR 및 혈구계산 비드 분석으로 각각 측정하였다. 데이타는 3회 수행한 3회의 별도 실험을 나타낸다. *p<0.001.
도 7은, MMP9 억제가 조절성 T 세포 기능을 유도하지 않음을 나타낸다. 야생형, MMP9-/- 및 SB3CT (10μM) 또는 비히클(DMSO + PEG, CRPMI 속에 유사하게 희석됨) 처리된 CD4+ T 세포를 항-CD3(0.5㎍/ml)의 존재 또는 부재하에서 배양하였다. A-B) Foxp3 발현을 정량적 RT PCR로 측정하였다. C) 세포 배양 상층액을 수집하고 혈구분석 비드 분석에 의해 IL-10 단백질 발현에 대해 분석하였다. D) CD4+25- 또는 E) CD4+25+ T 세포를 SB3CT(10μM)로 처리하고 신선한 CD4+25-T 세포를 사용하여 항-CD3 (0.5㎍/ml)의 존재하에 다양한 비로 배양하였다. 패널 A 및 -C로부터의 데이타는 3회 수행된 1개 실험을 나타낸다. 패널 D-E로부터의 데이타는 3회 수행된 3개의 별도 실험을 나타낸다. #p<0.01, *p<0.001.
도 8은, 증식능에 있어서 SB3CT 처리된 항원-특이적인 T 세포(OT-I) 디스플레이 장애를 도시한다. A) OTI Tg CD8+T 세포를 SB3CT(5-20μM) 또는 비히클(DMSO + PEG, CRPMI 속에서 유사하게 희석됨)으로 처리하고 OVA-펄스처리된 항원 제시 세포 세포(APC)의 존재하에서 72시간 동안 배양하였다. 데이타는 3회 수행된 2개의 별도 실험을 나타낸다. #p<0.05, *p<0.001 B) 입양 전달(adoptive transfer)7일 후에, CC10-OVA (CC10) 또는 비-형질도입(B6) 마우스로부터의 BAL 유액을 분석하고 BAL 속에 존재하는 전체 세포를 정량화하였다. C) 호중구를 GR1으로 염색하고 유동 세포분석법을 이용하여 분석하였다. ** 자극된 야생형 세포와 비교한 것으로서 p<0.01. 처리 그룹 당 n=10마리 마우스(CC10) 및 처리 그룹당 5마리의 대조군 마우스(B6).
도 9는, 항원-특이적인 CD8+ 작용체 T 세포 매개된 폐 손상의 쥐 모델을 도시한다. A) CD8+Thy1.1+ T 세포를 SB3CT(10μM) 또는 비히클(DMSO + PEG, CRPMI 속에서 유사하게 희석됨)의 입양 전달 이후 마우스 폐로부터 분리하였다. B) CC10-OVA 마우스의 폐로부터 CD8+Thy1.1+ T 세포내 CD25 발현. * p<0.01처리 그룹당 n=9마리 마우스(CC10) 및 처리 그룹 당 5마리의 대조군 마우스(B6).
도 10은, MMP 억제(SB3CT) 또는 부재(MMP9 결핍성)에 대한 반응시 T 세포 활성화에 있어서 차이점의 개략도를 도시한다. 정상 세포 조건하에서 TCR 자극(1) 후, NFAT(5), CD25(6) 및 IL-2(8) 발현의 상향-조절을 초래함으로써 CD25 세포 표면 발현 및 IL-2의 결합을 허용하여 세포 활성화를 초래하는, (2) 칼슘 플럭스(3,4)에 있어서의 증가를 포함하는 많은 시그날링 현상의 상향-조절이 존재한다. MMP9의 부재하에서, NFAT 발현이 하향-조절되어도 칼슘 플럭스는 현저히 상승한다. 결과적으로 NFAT 발현에 있어서의 감소는 CD25 및 IL2 발현에 있어서의 감소를 초래하는 반면, 조절 경로, Foxp3 및 IL-10가 상향-조절됨으로써 세포 활성화가 감소된다.
도 11은, CD4+ 및 CD8+ MMP9-/- T 세포의 표현형 분석을 도시한다. 순수한 비장 A) CD4+ 및 B) CD8+ T 세포를 야생형(실선 개방 막대그래프) 및 MMP9 결핍성(사선 개방 막대그래프) 마우스로부터 분리하였다. 세포를 항-CD3 항체(0.5㎍/ml)의 존재하에 24시간 동안 배양하였다. 세포를 수집하고 CD45RO, CD69, CD25, CD44, CD40L, CD62L, CTLA-4의 표면 발현을 유동 세포분석법으로 분석하였다. 사선 막대그래프는 동형 대조군을 나타낸다. 데이타는 2개의 별도의 실험 중 하나를 나타낸다.
실시예
실시예 1
MMP9은 CD4+ 및 CD8+ T 세포내에서 발현된다.
T 세포 활성화에 있어서 MMP의 역활을 조사하기 위해, MMP9의 mRNA 및 단백질 발현 패턴을 세포 분해물 속에서 측정하고 정량적 RT PCR 및 기질 자이모그래피를 각각 사용하여 활성화된 쥐 비장 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 세포 분해물 및 조건화된 배지 속에서 측정하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 자극되지 않은 CD4+ (도 1A) 및 CD8+(도 1B) T 세포내 MMP9 mRNA 발현의 검출가능한 수준이 존재한다. 항-CD3 항체 자극에 이어서, 비록 CD8+ 전사체 수준이 더 알려져 있다고 해도, 세포 집단 둘다에서 MMP9 mRNA 전사체 수준이 증가하였다. MMP9 단백질 발현의 분석(도 1C)은 처리되지 않은 CD4+ 및 CD8+ T 세포 분해물에서 pro-MMP9의 증가된 발현을 나타내었다. 항-CD3 항체를 사용한 자극에 이어서, pro-MMP9 발현은 T 세포 분해물 속에서 약간 감소되고 활성 MMP9는 상층액 속에서 발현된다.
실시예 2
항-CD3-유도된 T 세포 증식을 방지하는 광범위한 스펙트럼의 MMP 억제
T 세포 활성화에 있어서 MMP9의 효과를 측정하기 위하여, 증식 분석을 이용하였으며, 여기서, T 세포는 1,10-페난트롤린(비-특이적인 아연 킬레이터, 0.001-0.1μM) 및 COL-3(1-100μM)으로 6시간 동안 처리한 후, 가용성 항-CD3 항체로 72시간 동안 자극시켰다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, 0.001μM의 1,10-페난트롤린으로 처리한 T 세포는 처리하지 않은 항-CD3 항체 자극된 세포와 유사한 증식 반응을 나타낸 반면, 보다 높은 투여량은 증식 반응을 현저히 방지하였다(p<0.001). 고 페난트롤린 농도에서 관측한 억제 효과는 세포가 처리 후 생존가능하므로 독성으로 인한 것이 아니었다. 1μM의 COL3로 처리한 T 세포는 처리되지 않은 대조군과 유사한 증식 반응을 나타내었다. 그러나, 보다 높은 투여량에 대한 반응시 T 세포 증식에 있어서 투여량-의존된 감소가 있었다(도 2b)(p<0.001). 결론적으로, 이들 데이타는, 광범위한 스펙트럼 MMP 억제가 항-CD3 항체-유도된 T 세포 증식을 방지하며, 이는 T 세포 활성화에 있어서 MMP의 중요한 역활을 제안한다.
실시예 3
항 CD3-유도된 T 세포 증식을 방지하는 MMP2 및 MMP9의 고 선택적 억제
광범위한 스펙트럼 MMP 억제제(MMPI)를 이용한 이전의 연구들은 시그날링 현상과 관련된 다른 비-MMP에 있어서 특이성 및 부정적인 효과의 결여를 보고하여 왔다(참조: Sandler et al., 2005). 따라서, 위에서 기술한, T 세포 증식에 있어서 COL-3 및 1,10-페난트롤린의 효과는 non-MMP 관련 활성에 기인할 수 있다. 이러한 제한을 피하기 위하여, 고 선택성 MMP2 및 MMP9(젤라티나제) 억제제, SB-3CT를 이용하였다. 당해 억제제는 MMP2 및 MMP9의 활성 부위에서 효소-의존성 과정시 형질전환되어(참조: Brown et al., 2000; Toth et al., 2000) 강력한 결합 억제를 초래한다(참조: Forbes et al., 2009). T 세포 증식에 있어서 젤라티나제-특이적인 억제의 효과를 시험하기 위해, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 야생형 C57BL/6 마우스로부터 분리하고 SB-3CT로 처리한 다음, 가용성 항-CD3 항체의 존재하에서 배양하였다. 특히, SB-3CT 처리된 CD4+(도 2C) 및 CD8+(도 2D) T 세포는 비히클-처리된 세포와 비교하여 항-CD3 항체 자극에 대한 반응시 증식에 있어서 투여량-의존적인 감소를 나타내었다. 또한, 단백질 수준에 있어서 젤라티나제 억제를 입증하기 위하여, MMP9 단백질 발현을 젤라틴 자이모그래피로 측정하였다. 당해 실험은, MMP9 발현이 SB-3CT(10 μM)로 처리한 후 CD8+ T 세포에서 감소되었음을 입증하였다.
따라서, 본원의 실시예에 기술된 데이타는, SB-3CT-유도된 세포독성 또는 무반응이 증식에 있어서 관측된 효과를 설명할 수 있다는 가능성을 크게 고조시킨다. 그러나, 조기 세포 사멸을 검출하기 위해 사용된, 트립판 블루 배제와 아넥신 V 염색은, 세포 생존능이 SB-3CT로 처리한 후 90% 보다 큼을 나타내었으며, 이는, 증식능에 있어서의 감소가 세포 사멸에 기인하지 않음을 제안한다. SB-3CT 처리가 T 세포 무반응을 유도하였는지를 평가하기 위하여, T 세포 증식 분석을 이용하였으며, 여기서, 내인성 IL-2를 비히클 또는 가용성 항-CD3 항체의 존재하에 배양된 SB-3CT-처리된 T 세포에 가하였다. 도 2E-F에 나타낸 바와 같이, IL-2의 첨가는 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 증식 반응의 부분적 회복을 유도하지만, SB-3CT의 농도가 증가함에 따라, 증식은 투여량-의존적 방식으로 감소하기 시작한다. 이들 데이타는, 외인성 IL-2가 부분적으로 T 세포 증식을 회복하였음을 나타내며, T 세포에 있어서의 증식의 젤라티나제 억제제-유도된 억제에 있어서의 무반응의 가능한 역활을 제안한다.
실시예 4
젤라티나제 결핍성 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 감소되는 증식
SB-3CT는 MMP2 및 MMP9를 매우 선택적으로 억제한다(참조: Brown et al., 2000; Toth et al., 2000). 따라서, 당해 억제제의 효과는 MMP2 또는 MMP9의 차단에 기인할 수 있다. T 세포 활성화에 있어서 각각의 MMP의 역활을 구별하기 위해, 항-CD3 유도된 증식을 MMP2-/-, MMP9-/-, 또는 MMP2/9-/- 마우스로부터의 CD4+ T 세포내에서 시험하였다. 야생형 T 세포와 비교한 것으로서, MMP2-/- CD4+ T 세포는 단지 증식에 있어서 20% 감소를 나타낸 반면(도 3a), MMP9 결핍성은 증식에 있어서 80% 이상의 감소를 초래하였다(도 3b)(p<0.001). 또한, MMP2/9-/- 세포(이중 결핍성)의 증식은 MMP2-/- 또는 MMP9-/- CD4+ T 세포의 것에 대해 중간이었다(도 3c)(p=0.006). CD8+ T 세포가 또한 MMP9 결핍성에 의해 영향받았는지를 측정하기 위해, MMP9-/- 결핍성 CD8+ T 세포의 증식 능력을 시험하였다. 당해 결과는 T 세포 증식에 있어서 >85% 감소를 나타내었다(도 3d)(p<0.001). 이들 결과는, SB-3CT-처리한 세포에 있어서 앞서의 발견을 입증하며, MMP9가, MMP2보다 더 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식을 조절함을 나타낸다.
실시예 5
MMP9 결핍성 및 SB-3CT-처리된 T 세포내에서 증가되는 항-CD3 항체-유도된 칼슘 플럭스
증가된 세포내 칼슘 플럭스는 T 세포 수용체-매개된 T 세포 활성화후 조기 현상 중 하나이므로(참조: Hall and Rhodes, 2001; Zitt et al., 2004), 세포질세망(ER)로부터의 세포내 칼슘 방출에 있어서 MMP 억제의 효과를 이후에 시험하였다. MMP9 결핍성은 T 세포 증식에 있어서 가장 큰 효과를 가졌으므로, 항-CD3-유도된 세포내 칼슘 플럭스를 MMP9-/- CD4+ 및 CD8+ T 세포내에서 시험하였다. 평행 연구를 수행하여 SB-3CT로 처리한 야생형 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 시험하였다. 예측치 않게도, MMP9-/- CD4+ 및 CD8+ T 세포는 야생형 대조군 T 세포와 비교한 것으로서, ER로부터의 방출에 상응하는 보다 큰 세포내 칼슘 플럭스를 나타내었다(도 4a-b). MMP9-/- T 세포에 나타낸 결과와 유사하게, SB-3CT 처리는 또한 ER로부터의 칼슘의 방출에 상응하는 세포내 칼슘 플럭스를 증가시켰다(도 4c). 항-CD3 항체 유도된 칼슘 플럭스에 있어서 젤라티나제 억제의 증가를 추가로 시험하기 위해, 배지내 외인성 칼슘의 존재가 SB-3CT 처리이후 칼슘의 유입을 변경시키는지를 측정하였다. 항-CD3 처리된 야생형 CD8+ T 세포를 칼슘 함유 배지의 존재하에서 항온처리하였다. 예측한 바와 같이, 칼슘의 존재하에서, ER로부터의 칼슘 방출에 있어서 증가가 있을 뿐 아니라(도 4d), 항-CD3 항체 자극 후 SB-3CT-처리된 세포내에서 외인성 칼슘의 놀라운 유입이 있었다. 이와 함께, 이들 결과는, MMP9가 항-CD3-유도된 활성화에 대한 반응시 정상 T 세포에서 세포내 칼슘 유입을 하향 조절함을 입증한다.
실시예 6
MMP2- 및 MMP9-결핍성 또는 SB- 3CT-처리된 T 세포에서 변경된 NFATc1 및 CD25 mRNA 발현
칼슘 시그날링에 이어서, 활성화된 T 세포(NFAT) 핵 전좌의 핵 인자는 T 세포 활성화 및, IL-2Rα(CD25) 및 IL-2 발현의 전사를 촉진하는데 있어 중요하다(참조: Yoshida et al., 1998). 활성화된 T 세포내에서 NFAT 및 CD25 mRNA 발현에 있어 젤라티나제 결핍성 및 SB-3CT 처리의 효과를 조사하였다. 따라서, 데이타는, CD4+ 및 CD8+ T 세포가 유사하게 반응하는 것을 나타내므로, CD4+ T 세포를 이러한 일련의 분석에서 사용하였다. MMP2-/- 및 MMP9-/- CD4+ T 세포를 항-CD3 항체 및 NFATc1으로 자극시키고 CD25 사이토킨 전사체를 정량적 RT PCR로 분석하였다. 놀랍게도, MMP2-/- 및 MMP9-/- CD4+ T 세포는 야생형 대조군 T 세포와 비교하여, 항-CD3 항체 자극 후에 NFATc1 수준을 발현하는 이들의 능력에 있어 현저한 결함을 나타내었다(도 5a). NFATc1의 손상된 유도와 일치하여, NFATc1에 의존성인, CD25 전사체의 발현은 또한 두가지 세포 유형에서 현저히 감소하였고, 이러한 감소는 MMP9-/- T 세포에서 가장 컸다(도 5B).
이들 연구를 또한 SB-3CT 처리에 의한 젤라티나제 억제 후 CD4+ T 세포에서 수행하였다. SB-3CT 처리는 비히클 처리된 T 세포와 비교하여, 투여량-의존적 방식으로 NFATc1 및 CD25 전사체 발현을 방지하였다(각각 도 5c 및 5d). 이와 함께, 둘다 젤라티나제 억제 또는 부재에 대한 반응시, 둘다가 세포내적으로 조절되는, NFAT 및 CD25 mRNA 발현에서 관측된 감소는, 젤라티나제가 세포내 기질을 표적화함으로써 T 세포 활성화를 조절하여 T 세포 활성화를 방지할 수 있음을 제안한다.
실시예 7
MMP9-/- 및 SB-3CT-처리된 야생형 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에서 손상된 사이토킨 전사체 및 단백질 발현
IL-2 및 IFN-γ는 CD4+ 및 CD8+T 세포 속에서 항-CD3 활성화에 대한 반응시 생산된다. 따라서, 젤라티나제 억제 또는 MMP9 결핍성의 역활이 이들 사이토킨의 발현시 측정되었다. 특히, MMP9에 있어서 유전적 결핍성은 CD4+(도 6a-b) 및 CD8+ (도 6e-f) T 세포내에서 각각 IL-2 및 IFN-γ의 전사체 및 단백질 발현을 현저하게 하향 조절하였다. 젤라티나제 억제의 효과는 IL-2 및 IFN-γ 단백질의 발현 및 동일한 세포 유형에서 전사체 발현시 각종 시점에서 시험하였다. 비록 IL-2 전사체 발현이 SB3CT를 사용한 치료에 대한 반응시 시간에 걸쳐 증가하였지만, 단백질 발현은 하향 조절되었다(도 6c, d). 유사한 경향이 SB-3CT-처리된 세포내 IFN- γ에 대해 관측되었다(도 6g, 6h).
실시예 8
조절성 T 세포 기능을 유도하지 않는 젤라티나제 억제
연구들은, 조절성 T 세포(Tregs)가 항-CD3 항체 자극 후 IL-2를 증식시키거나 생산할 수 없지만, IL-10을 분비하거나 NFAT 발현을 억제하는 포크헤드(forkhead) 전사체 인자(참조: Thornton and Shevach, 1998)의 상향 조절에 의해 증식성 반응 및 사이토킨 생산을 억제할 수 있음을 나타낸다. MMP9-결핍성 또는 SB-3CT-처리된 T 세포가 Treg 특성을 나타내었는지를 측정하기 위하여, foxp3 mRNA 및 IL-10 단백질 발현을 항-CD3 자극에 대한 반응에서 시험하였다. Foxp3 전사체 수준은 항-CD3 항체로 자극시킨 MMP2-/- 및 야생형 세포와 비교하여 MMP9-/- CD4+ T 세포내에서 현저히 증가하였다(도 7a). 또한, foxp3 전사체는 SB-3CT에 대한 반응시 증가하였다(도 7b). foxp3과 유사하게, IL-10 단백질 발현은 MMP2-/- 및 MMP9-/- CD4+ T 세포에서 증가하였다(도 7C). 총괄적으로, 이들 데이타는, 젤라티나제 억제 또는 결핍성이 조절 기능을 가진 T 세포를 초래할 수 있음을 제안한다.
젤라티나제 억제가 조절성 T 세포 기능을 유도하는지를 직접 시험하기 위해, CD4+25- T 세포를 SB-3CT로 처리하고 조사된 항원 제시 세포(APC)의 존재하에 처리되지 않은 CD4+25-T 세포와 함께 다양한 비율로 72시간 동안 공-배양하였다. 도 7d에 나타낸 바와 같이, 각각의 비에서 SB-3CT 처리는 T 세포 증식을 50% 까지 억제하였다. 그러나, SB-3CT-처리된 세포의 비가 증가함에 따라, T 세포 증식 또한 증가하며, 이는, SB-3CT 처리가 조절성 T 세포 기능을 유도하지 않음을 제안한다.
Treg 기능이 SB-3CT 처리에 대한 반응에 영향을 미치는지를 측정하기 위해, CD4+25+ T 세포(Tregs)를 SB-3CT로 처리하고 억제제 분석에서 상기 나타낸 바와 같이 각종 비율로 공-배양하였다. CD4+25+ T 세포는 이들의 억제 기능을 유지하였다(도 7e). 그러나, 중요한 것은, SB-3CT-처리된 CD4+25+ T 세포가 어느정도 변경된 억제능을 나타내었으며, 이들의 억제 특성을 나타내기 위해 보다 처리된 세포를 요구한다는 것이다. 이와 함께, 이들 데이타는, MMP9 억제가 Foxp3 및 IL-10의 증가된 발현에도 불구하고 조절성 T 세포의 메카니즘을 유도하지 않음을 제안한다. 그러나, 이들 데이타는, Foxp3 및 IL-10 발현에서 MMP9 관여를 제안한다.
실시예 9
항-CD3에 대한 반응시 CD4+ 및 CD8+ T 세포 표현형을 변경하는 MMP9 결핍성
T 세포 기원한 MMP9의 역활을 추가로 특성화하기 위하여, 표현형 연구를 유동 세포분석법을 사용하여 MMP9 부재(MMP9 결핍성)에 대한 반응시 T 세포에서 수행하였다. 7개의 T 세포 표면 활성화 마커의 패널을 평가하였다(참조: Baroja et al., 2002; Bourguignon et al., 2001; Feng et al., 2002; Irie-Sasaki et al., 2003; Ivetic and Ridley, 2004; Leo et al., 1999; Stauber et al., 2006). CD4+ 및 CD8+ T 세포는 야생형 및 MMP9-/- C57BL/6 마우스로부터 분리하였다. MMP9 결핍성 또는 상응하는 야생형 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 가용성 항-CD3 항체의 존재 또는 부재하에서 배양하고 다양한 마커에 대해 염색하였다. 야생형 CD4+ T 세포의 분석은 T 세포 활성화 마커 CD25, CD69, CD62L, CD44, CTLA-4, CD40L 및 CD45RO 모두의 증가된 표면 발현 수준을 나타내었다(도 11 및 표 1). 비교시, MMP9 결핍성 T 세포로부터의 CD4+ T 세포의 분석은 CD62L, CTLA-4 및 CD45RO의 증가된 표면 발현 수준을 나타내었다. CD44 및 CD40L 발현 수준은 야생형 세포와 비교하여 약하게 감소하였다. CD25 및 CD69 발현 수준은 둘다 현저히 방지되었다. 이들 데이타는, 야생형 CD4+ T 세포와 비교된 것으로서, MMP9 결핍성 CD4+ T 세포가 세포 표면 CD25 및 CD69의 현저히 보다 낮은 수준을 가지지만 보다 높은 수준의 CD45RO 및 CTLA-4를 발현함을 나타낸다.
| Wt CD4+ T 세포 |
MMP9-/- CD4+ T 세포 |
Wt CD8+ T 세포 | MMP9-/- CD8+ T 세포 |
|
| CD45RO | 17.90% | 98.20% | 5.00% | 5.40% |
| CD69 | 88.80% | 18.00% | 72.80% | 3.90% |
| CD25 | 92.80% | 31.60% | 63.80% | 11.90% |
| CD40L | 59.90% | 50.90% | 16.90% | 34.60% |
| CD44 | 97.60% | 77.50% | 20.10% | 24.00% |
| CTLA-4 | 62.30% | 96.20% | 14.90% | 25.10% |
| CD62L | 98.60% | 99.40% | 91.80% | 29.60% |
CD45RO, CD69, CD25, CD44, CD40L, CD62L, CTLA-4의 항-CD3 자극된 야생형 및 MMP9-/- CD4+ 및 CD8+ T 세포 표면 발현을 유동 세포분석법으로 분석하였다. 데이타는, 도 11에 나타낸 양성으로 염색된 세포의 퍼센트를 나타낸다. 데이타는 2개의 별도의 실험을 나타낸다.
야생형 CD8+ T 세포에서 세포 표면 발현의 분석은 CD25, CD62L 및 CD69에서 증가를 나타내었다(도 11 및 표 1). 또한, 비록 발현율이 20% 이하였지만 CD40L, CD44 및 CTLA-4가 발현되었다. CD45RO는 또한 매우 낮은 수준으로 발현되었으며, 5%를 넘지 않았다. 야생형 CD8+ T 세포와 비교하여 MMP9 결핍성 CD8+ T 세포의 분석은 CD69, CD25, CD62L의 낮은 발현 수준을 나타내었다. CD45RO 및 CD44 표면 발현 수준은 야생형 세포에서와 동일하게 유지되었다. CTLA-4 및 CD40L 표면 발현은 야생형 세포와 비교하여 약간의 상승을 나타낸다(도 11 및 표 1). NFAT 발현의 유도의 결여와 일치하여, CD25 발현은 MMP9-/- T 세포에서 항-CD3 자극에 대한 반응시 증가하지 않았다. 이와 함께, 이들 데이타는, CD4+ 및 CD8+ T 세포가 MMP9의 부재하에서 차등적 세포 표면 발현을 나타냄을 나타낸다.
실시예 10
항원 특이적인 CD8+ T 세포-유도된 폐 손상을 방지하는 젤라티나제 억제
데이타는, CD4+ 세포와 비교하여, CD8+ T 세포가 항-CD3에 대한 반응시 보다 높은 수준의 MMP9를 발현하며, 젤라티나제 억제 또는 결핍성이 세포 기능을 하향 조절함을 입증한다. 메도프(Medoff) 등은, 먼 기도 내피 세포가 CC10 프로모터의 조절하에서 OVA를 구성적으로 발현하는 쥐 모델(CC10-OVA 마우스)를 이미 보고하였다(참조: Medoff et al., 2005). OVA 특이적인 T 세포 수용체(OT-I)를 수용체 마우스의 폐내로 발현하는 주입시킨 활성화된 CD8+ T 세포는 심각한 세기관지주위 염증을 유도한다(참조: Medoff et al., 2005). 따라서, 생체내에서 CD8+ T 세포-기원한 젤라티나제의 역활을 시험하기 위하여, CC10-OVA 쥐 모델을 이용하여 CD8+ T 세포내 젤라티나제 억제가 폐 손상을 하향 조절할 수 있는지를 측정하였다(참조: Stripp et al., 1992). 폐 손상을 유도하기 위하여, CD8+ T 세포를 제I 부류 MHC H-2Kb에 결합되고 CC10-OVA 마우스의 폐내로 주입된 OVA 펩타이드 SIINFEKL에 대해 특이적인 TCR을 갖는 OT-1 형질도입 마우스로부터 분리하였다(참조: Carbone and Bevan, 1989).
선행 실시예에서의 연구는 항-CD3를 통한 폴리클로날 T 세포 활성화에 있어서 MMP의 효과를 시험하였다. SB-3CT에 의한 고도로 선택적인 젤라티나제 억제가 항원-특이적인 T 세포 증식 기능에 영향을 미치는지를 측정하기 위하여, OT-1 세포를 SB-3CT로 처리하고 펩타이드(SIINFEKL) 펄스화된 항원-제시 세포의 존재하에서, 방법들에 보고된 바와 같이 배양하였다. 도 8a에 나타낸 바와 같이, 처리되지 않거나 비히클-처리된 OT-I 형질도입 CD8+ T 세포는 OVA 펩타이드-펄스화된 항원 제시 세포에 반응하여 증식되었다. OT-I T 세포의 SB-3CT 처리는 OVA 펩타이드-펄스화된 항원 제시 세포에 대한 증식 반응을 완전히 방지하였다. OT-II 형질도입 마우스로부터의 CD4+ T 세포의 시험은 유사한 경향을 나타내었다. 이들 데이타는, 항-CD3를 통한 폴리클로날 활성화와 유사하게, 고도로 선택적인 젤라티나제 억제가 또한 CD8+ T 세포의 항원-특이적인 증식을 방지함을 입증한다.
젤라티나제 억제가 생체내에서 항원-특이적인 T 세포 매개된 폐 손상에 있어서의 효과를 가지는지를 측정하기 위해, 항-CD3 및 SB-3CT-처리된 OT-I CD8+ T 세포를 본원 및 선행 연구(참조: Medoff et al., 2005)에 기술된 바와 같이 OVA의 존재하에서 시험관내에서 활성화시켰다. 배양된 OT-I CD8+ T 세포를 기관내적으로 CC10-OVA 형질도입 또는 비-형질도입 야생형 C57BL/6 마우스의 폐내로 이전시켰다. 입양 전달 후 7일째에 기관폐포세척액내 전체 세포 축적의 분석은 SB-3CT-처리된(MMPI) 및 비히클 그룹에서 회수된 총 BAL 세포의 양에 있어서 차이가 없음을 나타내었다(도 8b). 그러나, 당해 모델의 손상의 마커인 호중구(Gr-1+)의 양(참조: Medoff et al., 2005)은 SB-3CT-처리된 그룹에서 현저히 감소하였다(도 8c)(p <0.01). OT-I 형질도입 마우스는 Thy1.1+이므로, Thy1.2+ 배경내에 존재하는, CC10-OVA 마우스내 형질전달된 세포내 트래킹의 수단을 제공한다. 다음에, 2개의 CC10-OVA 처리된 그룹(비히클 또는 SB-3CT) 사이에서 폐내 CD8+ Thy1.1+ T 세포의 축적에 있어서 차이점이 있는지를 측정하였다. SB-3CT를 사용한 처리는 폐 실질내 현저히 적은 CD8+ Thy1.1+(공여자) 세포를 초래하였다(도 9a)(p <0.01). 또한, 이들 세포중 보다 적은 수가 활성화 마커 CD25를 발현하였다(도 9b)(p <0.01).
젤라티나제-억제된 세포를 제공받은 CC10-OVA 마우스의 폐내 보다 적은 호중구 및 공여자 기원한 CD8+ T 세포는 덜 심각한 폐 손상을 제안한다. 실제로, 입양 전달 전 OT-I T 세포의 젤라티나제 억제는 H&E 염색에 의해 평가된 폐의 조직학에 의해 나타낸 바와 같이 혈관주위 및 기관지주위의 발달을 억제하였다.
논의
현재의 연구로부터의 데이타는, 특히, MMP9가 T 세포 활성화를 조절하는데 있어서 중요한 역활을 함을 나타낸다. 당해 결론은, MMP9 억제가 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 활성화를 현저히 악화시킴을 나타내는 데이타로부터 기원한다. 그러나, MMP9가 CD4+ T 세포와 비교하여 활성화된 CD8+에서 현저히 유도됨은 주목할 만하다. 현재의 연구에서, 광범위한 MMP 억제, MMP9-특이적인 억제, 및 또한 MMP9의 유전적 결핍성은 모두 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 폴리클로날 활성화-유도된 증식의 하향 조절을 초래한다. NFATc1 및 CD25 유전자 발현은 하향-조절된 반면, foxp3 유전자 발현 및 IL-10 단백질 발현 수준은 상승하였다. IL-2 및 IFN- γ 사이토킨 유전자 및 단백질 발현의 분석은 MMP9 억제 및 MMP9 결핍성에 반응하여 유전자 및 단백질 발현의 하향-조절을 나타내었다. 그러나, 젤라티나제 결핍성 또는 억제는 항-CD3를 통한 폴리클로날 자극에 반응하여 세포내 칼슘 방출에 있어서의 증가와 관련되어 있다(도 10). MMP9 억제가 T 세포 매개된 폐 손상의 정도를 악화시켰음은 생체내 모델에서 또한 입증되었다. 총괄적으로, 이들 데이타는 T 세포 활성화의 과정에서 T 세포 기원한 MMP9에 대한 역활을 명확히 나타낸다.
최근에, 동종이식 거부에 있어서 MMP의 기능적 역활 및 T 세포 동종반응성에 있어서 이들의 역활을 나타내기 위한 보고들이 시작되었다. 페르난데츠(Fernandez) 등은 기관지 동종이식 폐쇄성 기도 질환(OAD) 모델에서 MMP9-결핍성 숙주 마우스가 OAD로 발달되지 않았으나 향상된 T 동종반응성을 나타내었음을 보고하였다(참조: Fernandez et al., 2005). 그러나, 본 연구에서, MMP9 결핍성은 T 세포 증식을 현저히 방지하였음이 기술되어 있다. 이들 유사하지 않은 결과에 대한 한가지 이유는, OAD 모델에서, 다량의 T 세포(CD3+)가 동계 DC로 자극됨으로써 비-특이적인 T 세포 활성화를 유도하였다는 사실에 기인할 수 있다. 그러나, 본 연구에서, MMP9-결핍성 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 항-CD3 항체의 존재하에서 별도로 배양하여, 이들 2개의 세포 집단이 T 세포 활성화 과정에서 기능하는 방법의 개개의 조사를 허용하였다. T 세포 및 대식구는, 심각한 복합된 면역결핍성(SCID) 마우스 또는 리컴비나제 활성화 유전자 1-결핍성(RAG-/-)와 같은 유전적 T 세포 결핍성을 가진 마우스가 OAD로 발전되지 않는다는 것을 연구들에서 밝힌바와 같이(참조: Neuringer et al., 1998), OAD의 발달에 중요함이 보고되어 왔다(참조: Kelly et al., 1998; Neuringer et al., 2000). 이들 연구는, T 세포가 OAD의 발달에 중요하다는 강력한 증거를 제공하며 T 세포 기원한 MMP9가 당해 발달에 중요한 역활을 담당할 수 있음을 제안한다. 따라서, T 세포 기원한 MMP의 억제는 감소된 T 세포 활성화를 초래할 수 있으며, 이는 각종 병리학적 상태에 반응하여 보호 효과를 제공할 수 있다.
세포내 T 세포 시그날링 현상의 조사시, 젤라니타제 부재 또는 억제에 반응하여, T 세포가 ER로부터의 칼슘 방출 및 또한 항-CD3 항체 자극 후 외인성 칼슘 유입의 증가된 수준을 나타내었음이 본원에 기재되어 있다. 이들 발견은, MMP9 억제제 또는 MMP9 결핍성에 반응하여, 칼슘 유입에 있어서의 증가가, 세포가 효과적인 활성화 현상의 결여에 대해 보충하기 위해 시도하는 메카니즘일 수 있음을 제안하였다. 따라서, MMP9는 칼슘 매개된 현상의 강직 하향-조절인자로서 기능할 수 있다. 추가로 하단에서, 결과들은, NFAT 유전자 발현이 MMP9-결핍성 또는 SB-3CT 처리된 T 세포에서 억제되었음을 나타내었다.
T 세포 활성화에 있어서 전사 인자로서 NFAT의 중요성으로 인하여, NFAT 발현의 변경은 이들의 적절한 기능을 위한 NFAT 전좌에 의존하는 IL-2Rα(CD25) 및 IL-2와 같은 다른 NFAT-의존성 유전자의 발현을 변경시킨다. 실제로, MMP9-결핍성 및 SB-3CT 처리된 T 세포에서 CD25 mRNA에 있어서의 감소 및 표면 발현이 관측되었다. 이들 발견은, 젤라티나제 억제가 가능하게는 NFAT 전사를 억제함으로써 NFAT 활성화를 하향조절하며, 이는 궁극적으로 CD25 및 IL-2 발현을 감소시킴을 강력히 제안한다. CD25 발현에 있어서의 감소는, 세포 표면에 CD25가 거의 존재하지 않을 것임을 의미하며, 이는 IL-2에 결합하여 증식을 유도함으로써 T 세포 활성화를 방지하는데 유용한 다수의 수용체를 제한할 것이다. 이는, 외인성 IL-2의 첨가가 도 2에 나타낸 바와 같이 SB-3CT-처리된 세포에서 증식 반응을 회복하지 않은 이유를 설명할 수 있다. 당해 결과는, 젤라티나제 억제가 T 세포가 Treg 기능을 나타내도록 할 수 있음을 제안하므로, Treg에서 특징적으로 발견된 표적을 시험하였다. 예상치못하게도, foxp3 발현이 SB-3CT-처리된 및 MMP9-결핍성 T 세포에서 상승되었음이 관측되었다. Treg 계통을 입양하는 T 세포에서, IL-2 및 IFN-γ를 생산하기 위한 불능은 foxp3에 의한 전사 억압의 결과인 것으로 여겨진다(참조: Chen et al., 2006; Lee et al., 2008; Marson et al., 2007; Wu et al., 2006). 본 연구는 IL-2 및 IFN-γ의 감소된 수준을 입증하였다. 따라서, foxp3는 TCR 연결에 대한 반응하여 IL-2 및 IFN-γ 유전자 발현을 활성적으로 억제함으로써 T 세포 활성화에 있어서의 감소를 유발할 수 있다. IL-10은 Treg 및 Tr1 세포에 의해 분비된 특징적인 면역억제 사이토킨이므로, IL-10 단백질 발현을 MMP9-결핍성 T 세포에서 평가하여, IL-10이 항-CD3 항체를 사용한 자극 후 MMP9-결핍성 T 세포에서 평가하였다. 젤라티나제 억제는 조절성 T 세포 기능을 유도하지 않았다. 이들 결과는, MMP9의 억제가 조절성 T 세포 특징을 나타내지만 조절성 T 세포 기능은 나타내지 않는 새로운 IL-10 분비 T 세포 소세트의 발달을 초래함을 제안할 수 있다. 비록 MMP9 억제가 조절성 T 세포 기능을 유도하지 않았으나, Treg 기능은 MMP9 억제에 반응하여 변경되었다. 판(Pan) 등에 의한 보고는, 아연-핑거(zinc-finger) 전사 인자인, Eos가 Treg에서 foxp3-의존성 유전자 사일런싱을 매개함을 입증하였다(참조: Pan et al., 2009). 당해 기재내용에서, MMP9 억제는 Eos를 유도할 수 있으며, 이는 IL-2 및 IFN-γ의 fox3-의존성 억제를 매개함으로써 정상 T 세포 활성화시 감소를 유발할 수 있다.
생체내 젤라티나제 억제의 시험에서, CC10-OVA 마우스의 폐내 CD8+ Thy1.1+ T 세포의 존재에 있어서 현저한 감소가 관측되었으며, 이는, 젤라티나제 억제가 T 세포 이주에 영향을 미칠 수 있고/있거나 세포 활성화를 감소시킬 수 있음을 제안한다. 폐내 CD8+ Thy1.1+ T 세포에서 CD25 표면 발현의 추가의 분석은 감소된 세포 활성화를 제안하는 CD25 표면 발현에 있어서 현저한 감소를 나타내었다. 이들 결과는, 젤라티나제 억제에 반응하여 CD25 mRNA 및 세포 표면 발현에 있어서의 현저한 감소를 입증하는 시험관내 데이타와 유사하다. CC10-OVA 마우스의 폐로부터 수집한 폐 단면의 조직학적 분석은 비히클-처리된 OT-1 세포의 전달에 이은 증가된 혈관주위 및 핵주변 침윤물을 입증한다. 대조적으로, SB-3CT-처리된 OT-1 세포의 양자성 전달후, 단핵 세포 침윤이 최소였으며, 이는, MMP9 억제가 폐내 염증도를 약화시킴으로써 T 세포-매개된 폐 손상도를 현저히 손상시킴을 제안한다.
본 결과는, MMP9가 T 세포 활성화에 있어서 정의된 역활을 수행함을 강력하게 나타내며 당해 역활이 mRNA 및 단백질 발현의 조절에 의해 세포내에서 이루어짐을 제안한다.
본 연구는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 활성화하는데 있어서 기능성 T 세포-기원한 젤라니타제에 대한 중요 역활을 나타내며, 젤라티나제 억제가 기관 동종이식 거부 및 자가면역병과 같은 T 세포-의존성 질병의 치료를 위한 면역억제에 대해 새로운 시도일 수 있음을 제안한다.
본원의 실시예에 기술된 실험들은 하기 방법을 사용하여 수행하였다.
동물
6 내지 10주령의 암컷 Balb/c 및 C57BL/6 마우스를 하를란(Harlan)(인디아나 인디아나폴리스 소재)로부터 구입하거나 독립적으로 번식시켰다. MMP2 결핍성(MMP2-/-), MMP9 결핍성(MMP9-/-) 및 MMP2/MMP9 이중 결핍성(MMP2/9-/-) 마우스(C57BL/6 배경)[공급원: 베일러 칼리지 오브 메디신(Baylor College of Medicine), 텍사스 휴스턴 소재], CC10-OVA 마우스(C57BL/6 배경) 및 OT-1 TCR 형질도입 마우스(C57BL/6-Thy1.1 배경)을 또한 사용하였다(참조: Corry et al., 2004; Shilling et al.). 모든 마우스 연구는 동물 보호 시설 및 사용 안내서에 따라 수행하였다.
T 세포 분리
단일 세포 현탁액을 5 내지 7마리의 마우스의 비장으로부터 제조하였다. 적혈구 세포를 NH4Cl 분해 완충액으로 분해하였다. 이후에, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 마우스 CD4(L3T4) 및 CD8(CD8a-Ly2) 미세비드[제조원: 밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotech), 캘리포니아 아우부른 소재]를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 분리하였다. 유동 세포분석법으로 측정된, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 순도는 97 내지 99% 범위였다. 분리 프로토콜을 사용하여 C57BL/6 야생형 마우스, MMP2 결핍성, MMP9 결핍성, MMP2/9 결핍성, OT-I 형질도입 및 OT-II 형질도입 마우스로부터 T 세포를 분리하였다. 조절성 T 세포(Tregs)를 마우스 CD4+CD25+ 분리 키트(제조원: 밀테니이 바이오테크, 캘리포니아 아우부른 소재)를 사용하여 분리하였다. 유동 세포분석기로 측정한 Treg 세포 순도는 93%를 초과하였다. 나타낸 바와 같이, CD4-세포 분획은 γ-조사되었고(2000 라드) 항원 제시 세포로 사용되었다.
매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제(MMPI)의 제조
비-특이적인 MMP 억제제, 1,10-페난트롤린[제조원: 시그마(Sigma), 미주리, 세인트 루이스 소재]를 디페틸설폭사이드(DMSO) 속에서 1M 용액으로 재구성하고 RPMI, 400mM L-글루타민, 100 U 페니실린 스트렙토마이신[제조원: 기브코(Gibco), 캘리포니아 칼스바드 소재], 10% FCS[제조원: 하이클론(Hyclone), 유타 로간 소재], 및 5 x10-5 M 2-머캅토에탄올(제조원: 시그마, 미주리주 세인트 루이스 소재)로 구성된 완전 RPMI(cRPMI) 속에 0.001 내지 0.1μM로 희석시켰다. COL-3은 화학적으로 변형된 테트라사이클린 및 비-특이적인 MMP 억제제[제조원: 콜라게넥스 파마슈티칼스, 인코포레이티드(CollaGenex Pharmaceuticals, Inc.), 펜실바이아 뉴타운 소재]이다. COL-3을 DMSO 속에 1M 용액으로 재구성한 후 cRPMI 속에 1 내지 100μM로 희석시켰다. SB-3CT는 특이적인 메카니즘-계 MMP2/9 억제제이며 DMSO 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 속에 1M 용액으로 재구성한 후 cRPMI 속에서 0.0001 내지 1mM로 희석하였다.
T 세포 증식 분석
CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 야생형 Balb/c 또는 C57BL/6 마우스(1x106/ml)로부터 분리하고 나타낸 농도의 MMPI 또는 비히클 대조군과 함께 6시간 동안 배양하였다. 이후에 처리된 세포를 RPMI 속에서 3회 세척하고 항-CD3 항체(0.5-1㎍/ml, 제조원: 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 캘리포니아주 산 조세 소재)의 존재하에서 200μl의 cRPMI 중 96웰 플레이트 속에서 37℃로 72시간 동안 배양(1x105/웰)하고 앞서 보고한 바와 같이(참조: Sumpter et al., 2008) 수거하였다. 당해 일반화된 프로토콜을 사용하여 나타낸 각종의 분리 방법 및 처리 조건 후 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 T 세포 증식을 측정하였다. MMP 결핍성 평행 연구에서, MMP2-/-, MMP9-/-, MMP2/9-/- 마우스 및 한배새끼 대조군을 항-CD3 항체의 존재하에서 72시간 동안 배양하였다. 항원-특이적인 증식 분석에서, OT-II 형질도입 및 OT-I 형질도입 T 세포를 나타낸 농도의 SB-3CT 또는 비히클 대조군과 함께 6시간 동안 배양하고, RPMI 속에서 3회 세척하고 OVA-펄스화된(OTII: ova 펩타이드 및 OT-I: SIINFEKL 펩타이드) 항원 제시 세포(APC)의 존재하에서 72시간 동안 배양(1x105/웰)하였다. T 세포 억제인자 분석에서, C57BL/6 마우스로부터 분리한 CD4+25- 또는 CD4+25+ T 세포를 나타낸 농도의 SB-3CT 또는 비히클 대조군과 함께 6시간 동안 배양하였다. 세포를 RPMI 속에서 3회 세척하고 다양한 비율(처리된 : 비처리된)로 비처리된 CD4+25-T 세포가 들어있는 공-배양물 속에 γ-조사된 항원 제시 세포의 존재하에서 200μl의 cRPMI 속에서 37℃로 72시간 동안 가하고 앞서 보고한 바와 같이(참조: Sumpter et al., 2008) 수거하였다.
젤라틴 자이모그래피
세포를 분해하고 조건화된 배지 상층액을 수집하여, 4X 농축시키고 원심분리하여 세포 파괴물을 제거하고, 분석전 -80℃에서 저장하였다. 이후에, 시료를 앞서 보고한 바와 같이(참조: Yoshida et al., 2007) 자이모그래피로 적용하였다.
정량적 RT PCR에 의한 사이토킨 프로파일링
정제된 CD4+ T 세포를 나타낸 농도의 SB3-CT와 함께 6시간 동안 배양한 후 RPMI 1640으로 3회 세척하였다. 약물 또는 비히클-처리된 T 세포를 항-CD3 항체(0.5㎍/ml)와 함께 cRPMI 속에서 1 내지 12시간 동안 배양(1x106/ml)하였다. 세포를 수집하고 총 RNA를 RNeasy RNA 추출 키트[제조원: 퀴아젠, 인코포레이티드(Qiagen, Inc.), 캘리포니아 발렌시아가 소재]를 사용하여 분리하고 mRNA 발현 수준을 PerfeCTaTM SYBR Green FastMix, Low ROX[제조원: 퀀타 바이오사이언시스(Quanta Biosciences), 미들랜드 가이터스부르그 소재]를 사용하여 Applied Biosystems 7500 상에서 제조업자의 지시에 따라 검출하였다. 각각의 시료를 쥐 β-액틴에 대해 표준화하였다. 프라이머 서열을 설계하고 통상의 방법으로 최적화하여 공공의 서열을 기초로 각각의 사이토킨을 특이적으로 증폭시켰다.
혈구계산 비드 배열(CBA)에 의한 사이토킨 프로파일링
정제된 MMP9 결핍성 또는 SB-3CT-처리된(10μM) CD4+ T 세포를 6시간 동안 배양한 후 RPMI 1640으로 3회 세척하였다. MMP9 결핍성 또는 SB-3CT-처리된 T 세포를 항-CD3 항체(0.5㎍/ml)와 함께 cRPMI 속에서 1 내지 12시간 동안 배양(1x106/ml)하였다. 상층액을 수집하고 사이토킨 단백질 수준을 마우스 염증성 사이토킨 비드 배열 키트(Mouse Inflammatory Cytokine Bead Array Kit)(제조원: 비디 바이오사이언스, 캘리포니아 산 조세 소재)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 측정하였다.
세포내 칼슘 플럭스
칼슘 플럭스는 CD4+ 및 CD8+ 야생형, 또는 MMP9 결핍성 또는 SB-3CT-처리된(10μM) T 세포를 Fluo-4 NW 칼슘 분석 키트[제조원: 몰레큘러 프로브스(Molecular Probes), 캘리포니아 칼스바드 소재]를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 측정하였다. 이후에, 세포를 항-CD3 항체(10㎍/ml)로 자극시키고 Molecular Devices FlexStation I[제조원: 써니베일(Sunnyvale), 캘리포니아 소재] 상에서 300초 동안 실시간으로 판독하였다.
MMP9-/- T 세포의 세포 표현형
CD4+ 및 CD8+ T 세포를 야생형 및 MMP9 결핍성 마우스로부터 분리하였다. 각종 처리 조건에 이어서, 세포를 수집하고 FACs 완충제(PBS 중 10% BSA)로 세척하였다. 비-특이적 결합을 항-CD16/항-CD3 Ab[0.5㎍/well, 제조원: 이바이오사이언스(eBioscience), 캘리포니아 산 디에고 소재]가 보충된 FACs로 차단하였다. 이후에, 세포를 항-마우스 CD4-FITC, CD8-PE, CD25-PE, CD40L-PE, CD44-PE, CD45RO-FITC, CD62L-APC, CD69-FITC, 및 CTLA-4-PE 항체로 상응하는 동형 대조군(모두 이바이오사이언스로부터 입수)과 함께 염색하였다. 염색 후, 세포를 3% 파라포름알데하이드 용액 속에 고정시키고 유동 세포분석기에서 즉시 판독하였다. 생 게이트(live gate)에서 10,000개 세포로부터의 데이타를 FACScan 유동 세포분석기[제조원: 벡톤 디킨슨(Beckton Dickinson)]로 분석하였다. FCS Express[제조원: 드노보 소프트웨어(DeNovo Software), 캘리포니아 로스 앤젤레스 소재]를 추가의 분석을 위해 사용하였다.
OT-I Thy1.1
+
CD8
+
T 세포의 활성화 및 CC10-OVA 마우스내로의 입양 전달
림프절 및 비장을 Thy1.1+ OT-I 형질도입 마우스로부터 분리하고 비장 CD8+ T 세포를 위에서 기술한 바와 같이 분리하였다. 이후에, OT-I Thy1.1+ CD8+ T 세포를 10μM의 SB-3CT 또는 상응하는 비히클 대조군(DMSO + PEG)으로 6시간 동안 처리한 후, 배양 배지 속에서 3회 세척하였다. 5x107 γ-조사된 야생형 비장세포를 0.7㎍/ml의 OVA 펩타이드(SIINFEKL)가 보충된 30 ml의 10% DMEM 속에서 5분 동안 배양한 후, OT-1 Thy1.1+ CD8+ T 세포 (5x106), 항-CD28 항체(2㎍/ml), IL-2 (132.02 U/ml) 및 IL-12 (10ng/ml)를 첨가하였다. 3일째에, 세포를 나누어 추가의 IL-2 (25U/ml)을 30 ml의 최종 용적으로 보충하였다. 5일째에, 세포를 수거하고 입양 전달을 위해 CC10-OVA 마우스내로 제조하였다. 세포를 PBS 속에 재현탁시키고, 7.5x105 세포를 CC10-OVA 마우스의 폐내로 기관내적으로 주입시켰다.
입양 전달에 이어 CC10-OVA 마우스의 폐내에서 OT-I Thy1.1
+
CD8
+
T 세포의 확인
CC10-OVA 마우스의 폐를 관류시키고 SB-3CT- 또는 비히클 처리된 OT-I Thy1.1+ CD8+ T 세포의 입양 전달 후 10일째에 절개하였다. 폐를 빙상에서 미세하게 간 후, 37℃에서 5% 태아 송아지 혈청(FCS)이 들어있는 RPMI 배지 속에서 콜라게나제/디스파제(각각 0.2 mg/ml)로 25 ㎍/ml DNase의 존재하에서 60 내지 90분 동안 분해하였다. 세포를 70㎛ 세포 염색기를 통과시키고, 세척하고, 폐 림프세포를 밀도 원심분리로 분리하였다. 세포를 FACs 완충제(PBS 중 10% BSA) 속에 재현탁시키고 FACScan 유동 세포분석기(제조원: 벡크만 디킨슨) 상에서 즉시 분석하였다. FCS Express(제조원: 데노보 소프트웨어, 캘리포니아 로스 엔젤레스 소재)를 추가의 분석을 위해 사용하였다.
BAL에서 세포 소세트 확인
BAL을 비히클 및 SB-3CT-처리된 OT-1 Tg T 세포의 입양 전달 후 마우스 폐를 1.0ml의 멸균 1X PBS로 세척함으로써 야생형 및 CC10 마우스의 폐로부터 수집하였다. 이후에, 수집된 유체를 10분 동안 2000rpm으로 원심분리하였다. 세포 펠렛을 200μl의 멸균 1X PBS 속에 재현탁시켰다. 이후에, 세포를 항-GR1 항체로 염색하고 FACScan 유동 세포분석기(제조원: 벡톤 디킨슨) 상에서 즉시 분석하였다. FCS Express(제조원: 데노보 소프트웨어, 캘리포니아주 로스 앤젤레스 소재)를 추가의 분석을 위해 사용하였다.
조직학
폐를 관류시키고, 팽창시켜 천연의 완충된 포르말린으로 고정시켰다. 이후에, 단면을 파라핀 속에 봉매(embedding)하고, 단면화하며, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 영상을 올림푸스 현미경(Olympus microscope) 및 DP12 디지탈 카메라[제조원: 올림푸스(Olympus), 펜실바니아, 센터 밸리 소재]를 사용하여 20X에서 획득하였다.
통계적 분석
데이타를 프리즘(Prism) 4[그라파드 소프트웨어 포 윈도우스(GraphPad Software for Windows), 캘리포니아주 샌 디에고 소재] 또는 마이크로소프트 오피스 엑셀(Microsoft Office Excel 2007)[제조원: 마이크로소프트(Microsoft), 워싱톤 시애틀 소재]를 사용하여 쌍을 이룬 t-시험 또는 비모수적(nonparametric) t-시험을 사용한 변이의 2-방식 분석(2-way Analysis of Variance: ANOVA)에 의해 분석하였다.
참조 문헌
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미국 가특허원 제61/152,512호를 포함하나 이에 제한되지 않는 본 명세서에 언급되고/되거나 출원 데이타 시트에 나열된 상기 미국 특허, 미국 특허공개 공보, 미국 특허출원, 외국 특허, 외국 특허출원 및 비-특허 공보 모두는, 이들의 전문이 본원에서 참조로 인용된다.
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Claims (41)
- 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 이식 환자에서 T 세포의 동종항원-유도된 증식을 감소시키기 위한 조성물.
[화학식 I]
상기 화학식 I에서,
m은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며;
p는 1, 2 또는 3이고;
X는 -O-, -S-, -CH2- 또는 직접 결합이며;
Y는 -C(O)- 또는 -S(O)2-이고;
Z는 -O- 또는 -S-이며;
R1은 각 경우에 동일하거나 상이하고, 독립적으로 알킬, 알케닐, 아르알킬, 할로알킬, 할로겐, -OR8 또는 -NR9R10이고;
R2는 각 경우에 동일하거나 상이하고, 독립적으로 알킬, 알케닐, 아르알킬, 할로알킬, 할로겐 -OR8 또는 -NR9R10이며;
R3 및 R4는 각각 동일하거나 상이하며 독립적으로 수소 또는 알킬이고;
R5, R6 및 R7은 각각 동일하거나 상이하며 독립적으로 수소 또는 알킬이며;
R8은 수소, 알킬, 알케닐, 또는 아릴이고;
R9 및 R10은 각각 동일하거나 상이하며 독립적으로 수소 또는 알킬이다. - 제1항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 화학식 Ia의 화합물인 조성물:
[화학식 Ia]
- 제1항에 있어서, 화합물이 SB-3CT인 조성물.
[SB-3CT]
- 제1항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 화학식 Ib의 화합물인 조성물:
[화학식 Ib]
- 제1항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 화학식 Ic의 화합물인 조성물:
[화학식 Ic]
- 제1항에 있어서, 이식 환자가 폐 이식 환자인 조성물.
- 제1항에 있어서, T 세포가 CD4+ T 세포인 조성물.
- 제1항에 있어서, 이식환자에게 장기를 기증하는 장기 기증자에게서 장기를 수 거하기 이전에 사용되는 조성물.
- 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 이식 환자 또는 이식이 필요한 환자에서 콜라겐에 대한 면역 반응을 억제하기 위한 조성물:
[화학식 I]
상기 화학식 I에서,
m은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며;
p는 1, 2 또는 3이고;
X는 -O-, -S-, -CH2- 또는 직접 결합이며;
Y는 -C(O)- 또는 -S(O)2-이고;
Z는 -O- 또는 -S-이며;
R1은 각 경우에 동일하거나 상이하고, 독립적으로 알킬, 알케닐, 아르알킬, 할로알킬, 할로겐, -OR8 또는 -NR9R10이고;
R2는 각 경우에 동일하거나 상이하고, 독립적으로 알킬, 알케닐, 아르알킬, 할로알킬, 할로겐, -OR8 또는 -NR9R10이며;
R3 및 R4는 각각 동일하거나 상이하며 독립적으로 수소 또는 알킬이고;
R5, R6 및 R7은 각각 동일하거나 상이하며 독립적으로 수소 또는 알킬이며;
R8은 수소, 알킬, 알케닐, 또는 아릴이고;
R9 및 R10은 각각 동일하거나 상이하며 독립적으로 수소 또는 알킬이다. - 제9항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 화학식 Ia의 화합물인 조성물:
[화학식 Ia]
- 제9항에 있어서, 화합물이 SB-3CT인 조성물.
[SB-3CT]
- 제9항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 화학식 Ib의 화합물인 조성물:
[화학식 Ib]
- 제9항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 화학식 Ic의 화합물인 조성물.
[화학식 Ic]
- 제9항에 있어서, 이식 환자가 폐 이식 환자인 조성물.
- 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 이식 결과를 개선시키기 위한 조성물:
[화학식 I]
상기 화학식 I에서,
m은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며;
p는 1, 2 또는 3이고;
X는 -O-, -S-, -CH2- 또는 직접 결합이며;
Y는 -C(O)- 또는 -S(O)2-이고;
Z는 -O- 또는 -S-이며;
R1은 각 경우에 동일하거나 상이하고, 독립적으로 알킬, 알케닐, 아르알킬, 할로알킬, 할로겐, -OR8 또는 -NR9R10이고;
R2는 각 경우에 동일하거나 상이하고, 독립적으로 알킬, 알케닐, 아르알킬, 할로알킬, 할로겐, -OR8 또는 -NR9R10이며;
R3 및 R4는 각각 동일하거나 상이하며 독립적으로 수소 또는 알킬이고;
R5, R6 및 R7은 각각 동일하거나 상이하며 독립적으로 수소 또는 알킬이며;
R8은 수소, 알킬, 알케닐, 또는 아릴이고;
R9 및 R10은 각각 동일하거나 상이하며 독립적으로 수소 또는 알킬이다. - 제15항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 화학식 Ia의 화합물인 조성물:
[화학식 Ia]
- 제15항에 있어서, 화합물이 SB-3CT인 조성물.
[SB-3CT]
- 제15항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 화학식 Ib의 화합물인 조성물:
[화학식 Ib]
- 제15항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 화학식 Ic의 화합물인 조성물.
[화학식 Ic]
- 제15항에 있어서, 이식 환자에게 장기를 기증하는 장기 기증자에게서 장기 수거 전에 사용하기 위한 조성물.
- 제15항에 있어서, 이식 환자가 폐 이식 환자인 조성물.
- 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 면역 반응 억제가 요구되는 환자에서 면역 반응을 억제하기 위한 조성물:
[화학식 I]
상기 화학식 I에서,
m은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며;
p는 1, 2 또는 3이고;
X는 -O-, -S-, -CH2- 또는 직접 결합이며;
Y는 -C(O)- 또는 -S(O)2-이고;
Z는 -O- 또는 -S-이며;
R1은 각 경우에 동일하거나 상이하고, 독립적으로 알킬, 알케닐, 아르알킬, 할로알킬, 할로겐, -OR8 또는 -NR9R10이고;
R2는 각 경우에 동일하거나 상이하고, 독립적으로 알킬, 알케닐, 아르알킬, 할로알킬, 할로겐, -OR8 또는 -NR9R10이며;
R3 및 R4는 각각 동일하거나 상이하며 독립적으로 수소 또는 알킬이고;
R5, R6 및 R7은 각각 동일하거나 상이하며 독립적으로 수소 또는 알킬이며;
R8은 수소, 알킬, 알케닐, 또는 아릴이고;
R9 및 R10은 각각 동일하거나 상이하며 독립적으로 수소 또는 알킬이다. - 제22항에 있어서, 면역 반응 억제가 요구되는 환자가 장기 이식 후 동종면역-유도된 자가면역성, 콜라겐 혈관병 및 다발경화증으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 자가면역병을 갖는 조성물.
- 제22항에 있어서, 면역 반응 억제가 요구되는 환자가 천식을 갖는 조성물.
- 제22항에 있어서, 면역 반응 억제가 요구되는 환자가 T 세포 매개된 폐병을 갖는 조성물.
- 제22항에 있어서, 면역 반응이 CD8+ T 세포 반응을 포함하는 조성물.
- 제26항에 있어서, CD8+ T 세포 반응이 항원-특이적인 반응인 조성물.
- 제22항에 있어서, 면역 반응이 CD4+ T 세포 반응을 포함하는 조성물.
- 제28항에 있어서, CD4+ T 세포 반응이 항원-특이적인 반응인 조성물.
- 제22항에 있어서, 조절성 T 세포가 화학식 I의 화합물에 의해 억제되지 않는 조성물.
- 제22항에 있어서, 환자가 고형 장기 이식 환자인 조성물.
- 매트릭스 메탈로프로테이나제 2 및 9를 선택적으로 억제할 수 있는, 치료학적 유효량의 제제를 포함하는, T 세포의 동종항원-유도된 증식을 감소시키기 위한 조성물.
- 매트릭스 메탈로프로테이나제 2 및 9를 선택적으로 억제할 수 있는, 치료학적 유효량의 제제를 포함하는, 면역 반응 억제가 요구되는 환자에서 면역 반응을 억제하기 위한 조성물.
- 제33항에 있어서, 면역 반응이 항원-특이적인 면역 반응인 조성물.
- 유효량의 화학식 I의 화합물과 면역억제제를 포함하며, 여기서, 면역억제제의 유효 투여량은 화학식 I의 화합물의 부재하에서 일반적으로 사용된 유효 용량과 비교하여 감소된 조성물.
- 유효량의 화학식 I의 화합물과 공지된 면역억제제를 포함하는, 환자에서 면역 반응을 억제하기 위한 조성물.
- 제36항에 있어서, 면역 반응이 항원-특이적인 면역 반응인 조성물.
- 제36항에 있어서, 공지된 면역억제제가 사이클로스포린 A, FK506, 라파마이신, 코르티코스테로이드, 퓨린 길항제, 캄패쓰 및 항-림프구 글로불린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 조성물.
- 유효량의 화학식 I의 화합물과 유효량의 콜라겐 V 또는 이의 내성화 단편을 콜라겐 V에 대한 면역 반응 감소가 요구되는 환자에게 투여함을 포함하여, 콜라겐 V에 대한 면역 반응을 감소시키기 위한 조성물.
- 제39항에 있어서, 환자가 폐 이식이 요구되는 환자 또는 폐 이식 환자인 조성물.
- 제39항에 있어서, 콜라겐 V 또는 이의 내성화 단편이 경구로 또는 정맥내로 투여되는 조성물.
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