KR20110135708A

KR20110135708A - 대장균 ｏ157:ｈ7 검출을 위한 배지 조성물

Info

Publication number: KR20110135708A
Application number: KR1020100055581A
Authority: KR
Inventors: 유상렬; 강동현; 박상현
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2010-06-11
Filing date: 2010-06-11
Publication date: 2011-12-19
Also published as: KR101109565B1

Abstract

본 발명은 대장균 O157:H7 선택 분별용 배지 조성물에 있어서, 탄소원으로 β-D-겐티오비오스(β-D-gentiobiose)를 포함하고, 담즙산염을 0.35~0.65 g/L 함유하며, 항생제를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 대장균 O157:H7 선택 분별용 배지 조성물에 관한 것으로, 손상을 입은 대장균 O157:H7의 회복을 도와 품질 안전성 확인 시 놓칠 수 있는 손상을 입은 대장균 O157:H7의 검출이 가능하고, 대장균 O157:H7과 분별이 되지 않던 주요한 균인 하프니아 얼베이(H. alvei)의 분별이 가능하여 대장균 O157:H7이 아닌 균을 대장균 O157:H7로 판단되는 오류를 감소시킨다.

Description

대장균 Ｏ157:Ｈ7 검출을 위한 배지 조성물{Medium composition for selection of Escherichia coli O157:H7}

본 발명은 대장균 O157:H7의 선택 분별을 위한 배지 조성물에 관한 것이다.

대장균 O157:H7은 그람 음성의 통성 혐기성 세균으로, 간균 형태를 나타내고, 식중독을 일으키는 주된 병원성 균이다. 미국의 경우, 매년 73,000 건의 대장균 O157:H7 감염이 보고되고 있으며, 주된 감염 증상으로는 출혈성 설사, 대장염, 용혈성 요독 증후군 등이 있다.

주요한 감염 경로는 식품인데, 간, 쇠고기에 의한 감염이 대표적이라 할 수 있다. 식품을 통한 감염이 대량 발생하기 때문에 식품 제조 공정 과정에서 대장균 O157:H7을 효과적으로 검출해 내는 것은 식품의 품질 관리와 안전성 유지에 필수적인 요소라고 할 수 있다.

식품 제조 과정에서 대장균 O157:H7을 가장 쉽고, 간편하게 검출해 낼 수 있는 방법은 선택 분별 배지를 이용한 방법이다. 최근 들어 리얼타임 PCR(real time PCR) 등을 이용한 검출 방법이 계속하여 발전하고 있으나, 특별한 교육이나 장비 없이도 사용 가능한 선택 분별 배지가 여전히 현장에서 가장 많이 사용되고 있다. 한편, 기존에 대표적으로 사용되어 오던 대장균 O157:H7의 선택 분별 배지로는 SMAC 배지(Sorbotol MacConkey medium), CT-SMAC 배지{셀픽심(cefixime)과 텔룰루산염(tellurite)가 첨가된 SMAC 배지}가 있다.

그런데, 상기와 같은 선택 분별 배지는 하기와 같은 단점이 각각 있다.

먼저, SMAC 배지는 선택성이 많이 떨어지는 단점이 있다. SMAC 배지는 탄소원으로 솔비톨을 포함하는데, 대장균 O157:H7은 솔비톨을 탄소원으로 이용하지 못하기 때문에 산을 생성하지 못하고, 콜로니(colony)가 중성 상태로 남아 있게 된다. 이로 말미암아 대장균 O157:H7은 배지 내의 pH 지시약에 의해 무색을 띄게 되고, 솔비톨을 이용하는 다른 균은 붉은 색을 띄게 되어 대장균 O157:H7과 다른 균들을 구별할 수 있다. 하지만, 식품상에는 대장균 O157:H7 외에 솔비톨을 탄소원으로 이용하지 못하는 하프니아 얼베이(Hafnia alvei), 프로테우스종(Proteus spp.), 프로비덴시아종(Providencia spp.), 에로모나스종(Aeromonas spp.) 및 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii) 등의 균들이 존재하기 때문에, 이러한 균들은 SMAC 배지 상에서 무색을 띔으로써, 대장균 O157:H7과 구분할 수 없는 콜로니(colony)를 형성하여 혼선을 주기도 한다.

한편, CT-SMAC 배지는 항생제를 첨가함으로써 SMAC 배지보다 뛰어난 선택성을 나타낸다. 하지만 항생제의 첨가는 열이나 낮은 pH 환경에 의해 손상을 입은 대장균 O157:H7의 회복을 돕지는 못한다. 이는 실제로 죽지 않은 대장균 O157:H7을 죽은 것으로 판단하게 되는 오류를 야기한다. 손상을 입은 대장균 O157:H7은 좋은 환경 상태가 되면 다시 독성을 나타낼 수 있기 때문에 이러한 오류는 위생상 치명적인 결과를 야기할 수 있다.

따라서, 대장균 O157:H7과 다른 균들과의 선택 분별능을 높이고, 손상을 입은 대장균 O157:H7의 회복을 잘 도와줄 수 있는 새로운 선택 분별 배지의 개발이 필요한 실정이다.

이에 본 발명은 상기의 문제점을 극복할 수 있는 새로운 대장균 O157:H7 선택 분별용 배지를 개발하여 제공하는데 그 목적이 있다.

상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 대장균 O157:H7 선택 분별용 배지 조성물에 있어서, 탄소원으로 β-D-겐티오비오스(β-D-gentiobiose)를 포함하고, 담즙산염을 0.35~0.65 g/L 함유하며, 항생제를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 대장균 O157:H7 선택 분별용 배지 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명의 과제의 해결 수단에 대해 상세히 설명하고자 한다.

기존의 CT-SMAC 배지는 항생제 첨가로 말미암아 SMAC 배지보다 뛰어난 선택성을 보인다. 하지만 항생제의 첨가는 열이나 낮은 pH 환경에 의해 손상을 입은 대장균 O157:H7의 회복을 돕지는 못한다. 손상을 입은 대장균 O157:H7은 좋은 환경 상태가 되면 다시 독성을 나타낼 수 있기 때문에 열이나 낮은 pH 환경에 의해 일시적으로 손상을 입은 대장균 O157:H7은 반드시 검출해 내야 한다. 하지만, 기존의 CT-SMAC 배지를 사용할 경우 실제로 죽지 않은 대장균 O157:H7을 죽은 것으로 판단하는 오류를 야기할 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 항생제를 사용하지 않으며, 배지에 함유되는 선택물질인 담즙산염(bile salts)의 양을 0.15%에서 0.035~0.065%로 감소하여 첨가한다. 이는 담즙산염(Bile salts)이 손상을 입은 대장균 O157:H7의 회복을 저해하는 것으로 알려져 있기 때문인데, 담즙산엽의 함량을 감소시킴으로써 대장균 O157:H7의 회복을 도와 검출해 낼 수 된다. 이때, 0,035%보다 낮은 농도로 첨가하면 선택성이 떨어지고, 0.065%보다 높은 농도로 첨가하면 손상을 입은 대장균의 회복이 더디어 바람직하지 않다.

한편, 대장균 O157:H7 선택 분별용 배지에 있어서, 선택물질인 담즙산염(bile salts)의 양을 감소하는 것은 손상을 입은 대장균 O157:H7의 회복을 효과적으로 도울 수는 있으나, 선택성이 낮아지는 문제점을 발생시킬 수 있다. 이러한 선택성 저하의 문제점을 보완하기 위하여, 본 발명은 탄소원으로 β-D-겐티오비오스(β-D-gentiobiose)를 첨가한다. β-D-겐티오비오스(β-D-gentiobiose)는 기존의 대장균 O157:H7의 선택 분별 배지에는 사용된 적이 없는 물질로 본 발명에서 배지 상에 처음으로 첨가하는 물질이다.

본 발명에서 β-D-겐티오비오스(β-D-gentiobiose)는 SMAC 배지 상에서 대장균 O157:H7과 구별이 되지 않는 주요한 균 중의 하나인 하프니아 얼베이(H. alvei)의 구별을 가능토록 하는데, 대장균 O157:H7은 β-D-겐티오비오스(β-D-gentiobiose)를 탄소원으로 이용하지 않지만, 하프니아 얼베이(H. alvei)는 β-D-겐티오비오스(β-D-gentiobiose)를 탄소원으로 이용하여 산을 생성한다.

따라서, 배지에 첨가되어 있는 pH 지시약에 의하여 하프니아 얼베이(H. alvei)와 대장균 O157:H7은 다른 색의 콜로니(colony)를 형성하여 배지 상에서 구별 가능한 것이다.

한편, 바람직하게 본 발명의 대장균 O157:H7 선택 분별용 배지 조성물은 pH에 따라 색이 변하는 pH 지시약을 추가로 포함하고 있는 것이 좋은데, 상기에서 설명한 바와 같이 pH 지시약에 의하여 하프니아 얼베이(H. alvei)와 대장균 O157:H7을 배지 상에서 용이하게 구별할 수 있기 때문이다.

한편, 바람직하게 본 발명의 대장균 O157:H7 선택 분별용 배지 조성물 펩톤(peptone), 염화나트륨(sodium chloride), 아가(agar) 및 뉴트럴레드(neutral red)를 포함하는 것이 좋고, 더욱 바람직하게 본 발명의 대장균 O157:H7 선택 분별용 배지 조성물은, 펩톤(peptone) 11~19.5 g/L, D-솔비톨(D-sorbitol) 7~13 g/L, 담즙산염(bile salts) 0.35~0.65 g/L, 염화나트륨(sodium chloride) 3.5~6.5 g/L, 아가(agar) 10.5~19.5 g/L, 뉴트럴레드(neutral red) 0.02~0.04 g/L 및 β-D-겐티오비오스(β-D-gentiobiose) 3.5~6.5 g/L의 함량으로 조성되는 것이 좋다.

본 발명에서 개발한 대장균 O157:H7 선택 분별용 배지 조성물은 기존에 사용되어 오던 배지에 비해 손상을 입은 대장균 O157:H7의 회복을 도와 검출될 수 있게 하기 때문에, 식품의 안전성 확인 시 놓칠 수 있는 손상을 입은 대장균 O157:H7의 검출을 가능토록 한다.

또한, 본 발명은 새로운 탄소원인 β-D-겐티오비오스(β-D-gentiobiose)의 첨가로 말미암아 기존의 배지에서 대장균 O157:H7과 분별이 되지 않던 주요한 균인 하프니아 얼베이(H. alvei)의 분별을 가능토록 하기 때문에, 대장균 O157:H7이 아닌 다른 균을 대장균 O157:H7로 판단하는 오류를 감소시키고, 추가 확인 실험에 필요한 시간과 인력, 비용도 감소시키는 효과를 발휘한다.

도 1은 기존의 SMAC 배지 상에서 분별이 되지 않는 하프니아 얼베이(H. alvei)와 대장균 O157:H7의 콜로니(colony) 모습을 보여 주는 도이다.
도 2는 본 발명의 배지에서 색으로 분별 가능한 하프니아 얼베이(H. alvei)와 대장균 O157:H7의 콜로니(colony) 모습을 보여 주는 도이다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

실시예 1: 본 발명의 대장균 O157:H7 선택 분별용 배지 조성물 제조

15.5 g/L 펩톤(peptone), 10 g/L D-솔비톨(D-sorbitol), 0.5 g 담즙산염(bile salts), 5 g/L 염화나트륨(sodium chloride), 15 g/L 아가(agar), 0.03 g/L 뉴트럴레드(neutral red), 5 g/L β-D-겐티오비오스(β-D-gentiobiose)로 조성하여 실시예 1의 배지를 제조하였다.

실시예 1은 기존에 사용되어 오던 SMAC 배지의 조성을 변형한 것으로, 담즙산염(bile salts)의 양을 0.05 %로 줄이고, 탄소원으로 β-D-겐티오비오스(β-D-gentiobiose)을 첨가함에 특징이 있다.

실험예 1: 열과 낮은 pH에 의하여 손상 입은 대장균 O157:H7을 CT-SMAC 배지와 본 발명의 실시예 1 배지에 접종한 후, 대장균 O157:H7 회복 정도 비교

상기 실시예 1에서 제조한 배지와 기존에 사용되어 오던 CT-SMAC 배지 사이의 손상을 입은 대장균 O157:H7의 회복 정도에 대한 비교 실험을 실시하였다.

우선, 열에 의한 손상은 대장균 O157:H7을 미리 60℃로 가열된 완충액에서 1분 30초 처리함으로써 이루어졌다.

다음으로, 낮은 pH에 의한 손상은 대장균 O157:H7을 1%의 젖산(lactic acid)에서 10분 처리함으로써 이루어졌다.

상기와 같은 조건에서 처리된 대장균 O157:H7을 실시예 1 배지와 CT-SMAC 배지에 희석하여 도말하였다. 이때, 대조군으로 일반 영양 배지로 사용되는 트립닉소이(tryptic soy) 배지에 대장균 O157:H7을 희석 도말하였다.

트립틱소이(tryptic soy) 배지는 손상을 입은 대장균 O157:H7을 잘 회복시킨다는 가정 하에 실시예 1의 배지와 CT-SMAC 배지의 균수를 비교하였다.

단위: log₁₀ CFU/ml

배지	열 처리 (60℃에서 1분 30초)	산 처리 (1% 젖산(lactic acid)을 10분 처리)
트립틱소이(Trypic soy) 배지	7.41 ± 0.07	7.80 ± 0.04
실시예 1의 배지	7.08 ± 0.03	5.82 ± 0.30
CT-SMAC 배지	5.13 ± 0.30	3.40 ± 0.41

측정결과(표 1), 실시예 1의 배지는 CT-SMAC 배지에 비해 열처리 또는 산처리에 의해 손상된 대장균 O157:H7의 회복 정도가 우수함을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 배지에 β-D- 겐티오비오스(β-D-gentiobiose)의 첨가에 따른 하프니아 얼베이( H. alvei )와 대장균 O157 : H7 의 분별능 측정 실험

SMAC 배지에 실제 식품 시료를 희석 도말하여 대장균 O157:H7과 같이 무색의 콜로니(colony)를 띄는 균을 분리 동정하였다. 그 결과, 하프니아 얼베이(H. alvei)가 주된 균임을 확인하였고, 분리된 하프니아 얼베이(H. alvei)를 이용하여 배지 상에서 실험을 하였다.

도 1은 기존의 SMAC 배지 상에서 분별이 되지 않던 대장균 O157:H7과 하프니아 얼베이(H. alvei)의 콜로니(colony) 모습에 대한 도이다. 두 균 모두 SMAC 배지 상에서 무색을 나타내기 때문에 분별을 할 수 없었다.

도 2는 상기 실시예 1의 배지 상에서 대장균 O157:H7과 하프니아 얼베이(H. alvei)의 콜로니(colony) 모습에 관한 것으로, 하프니아 얼베이(H. alvei)는 붉은 색 콜로니(colony)를 나타냄으로써, 대장균 O157:H7의 무색 콜로니(colony)와 분별이 가능하였다.

Claims

대장균 O157:H7 선택 분별용 배지 조성물에 있어서,
탄소원으로 β-D-겐티오비오스(β-D-gentiobiose)를 포함하고, 담즙산염을 0.35~0.65 g/L 함유하며, 항생제를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 대장균 O157:H7 선택 분별용 배지 조성물.
제1항에 있어서,
상기 대장균 O157:H7 선택 분별용 배지 조성물은,
pH에 따라 색이 변하는 pH 지시약을 추가로 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 대장균 O157:H7 선택 분별용 배지 조성물.
제1항에 있어서,
상기 대장균 O157:H7 선택 분별용 배지 조성물은,
펩톤(peptone), 염화나트륨(sodium chloride), 아가(agar) 및 뉴트럴레드(neutral red)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 대장균 O157:H7 선택 분별용 배지 조성물.
제3항에 있어서,
상기 대장균 O157:H7 선택 분별용 배지 조성물은,
펩톤(peptone) 11~19.5 g/L, D-솔비톨(D-sorbitol) 7~13 g/L, 담즙산염(bile salts) 0.35~0.65 g/L, 염화나트륨(sodium chloride) 3.5~6.5 g/L, 아가(agar) 10.5~19.5 g/L, 뉴트럴레드(neutral red) 0.02~0.04 g/L 및 β-D-겐티오비오스(β-D-gentiobiose) 3.5~6.5 g/L의 함량으로 조성되는 것을 특징으로 하는 대장균 O157:H7 선택 분별용 배지 조성물.