KR20110125224A

KR20110125224A - 신규한 ｇｐ41 항원

Info

Publication number: KR20110125224A
Application number: KR1020117019770A
Authority: KR
Inventors: 실뱅 플뢰리; 니콜라스 뮤즈; 마리-가엘 로저
Original assignee: 마이메틱스 코포레이션
Priority date: 2009-02-06
Filing date: 2010-02-08
Publication date: 2011-11-18
Also published as: EP2393510A1; AP2011005854A0; MX2011007703A; AU2010210071A1; EA201190096A1; US20110311615A1; EA021191B1; CA2750058A1; US8765137B2; ZA201105396B; BRPI1008671A2; CN102307592A; WO2010089400A1; AP3595A; KR101756202B1; UA108469C2; CA2750058C

Abstract

본 발명은 식 N-L-C로 표시되는 3개의 인접한 세그먼트 N, L 및 C를 포함하며, gp41의 N-나선 영역(N), gp41의 C-나선 영역(C) 및 상기 N-나선과 C-나선 사이에 위치한 합성 링커를 포함하는 연결 루프(L)를 포함하는, 변이 폴리펩타이드로서, 상기 링커는, 프로토타입의(prototypic) HIV-1 HxB2 클레이드(Clade) B 분리 균주를 기준으로 한 번호 체계에 따라, gp41의 593번에서 617번까지의 아미노산들을 치환하고 있으며, 상기 폴리펩타이드는 칼베올린-1을 중화하는 98.6 D 에피토프를 포함하지만, 2F5 및 4E10 에피토프, 융합 펩타이드를 포함하진 않으며, 상기 폴리펩타이드는 인간 인터루킨 2(IL-2)와 최소한의 면역 교차 반응성을 가지는 것을 특징으로 하는, 변이 폴리펩타이드에 관한 것이다.

Description

신규한 ＧＰ41 항원{NOVEL GP41 ANTIGENS}

본 발명은 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1)에 대한 면역 반응 유도에 적합한 HIV-1의 외막 당단백질인 gp41의 수계 매질내 안정화된 가용성 형태, 상기 gp41을 포함하는 약학 조성물, 인간 면역결핍 바이러스 및/또는 HIV 관련 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다.

HIV-1은 외부에 위치한 당단백질(gp210)과 막관통 당단백질(gp41)로 단백질 분해에 의해 절단되는, 160 kDa의 외막 당단백질(gp160) 전구체를 코딩하고 있다.

gp120 당단백질은, 당단백질의 성숙형 외막에서 비공유적 상호작용을 통해 gp41 엑토도메인과 조합된 상태로 존재한다. 천연 HIV-1의 외막 당단백질은 주로 바이러스 막의 표면에서 삼량체로 존재하는데, 이는 gp120 서브유닛 3개와 gp41 서브유닛 3개로 구성되어 있으며, gp41 막관통 영역에 의해 바이러스에 고정되거나 또는 감염된 세포막에 고정된다.

gp120이 CD4 수용체에 결합되면, 다수의 케모카인 수용체들(CXCR4, CCR5...) 중 하나와의 상호작용을 촉진시키는 구조적인 변화가 유도되는 것으로 확인되고 있다. 이러한 결합 현상은 gp41의 입체구조적 변화를 촉발시킨다. 특히, X선 결정학과 핵 자기 공명을 통한 연구에서, 바이러스 외막 당단백질 gp41이 적어도 3가지의 구조를 취하는 것으로 나타났는데, 그 구조는 천연 구조(스파이크), 융합전 준안정형 구조(prefusogenic metastable conformation)와, 타겟 세포의 막에의 HIV-1 바이러스 입자의 결합 등의 현상이 발생된 다음, 융합전 준안정형 구조에서 변환되는, 열 안정성의 융합유도성 "3개의 헤어핀" 구조이다.

그리하여, gp120이 세포 보조수용체에 결합하게 되면, gp41은 융합전 형태에서 융합유도 형태로 변환되게 된다.

gp41의 선형 구조(linear organization)는 융합 단백질, 엑토도메인(N-말단의 2개의 코일이 꼬인 형태(coiled-coil), 이황화 결합된 루프 영역 및 C-말단의 알파-나선 세그먼트)과 막관통 도메인으로 구성된다.

gp41의 융합 유도형 6-나선 번들에서, 3개의 N-말단 나선은 삼중 코일드-코일 형태를 형성하고 있으며, 3개의 C-말단 나선은 반대쪽에서 상기 코일드-코일 표면 상의 3개의 소수성홈(groove) 안으로 팩킹(packing)되어 있다. 이러한 나선-헤어핀 구조는 gp41의 융합-활성형 구조이다. gp41 엑토도메인의 막관통 고정체(transmembrane anchor)와 융합 펩타이드가 각각 바이러스와 타겟 세포 막에 임베디드되어 있기 때문에, 융합 유도형 헤어핀 구조 형성으로 인해 2개의 막은 공배치(colocalization)되게 되고, 그로 인해 막 융합에 대한 에너지 장벽을 넘어서게 된다.

HIV-1의 외막 당단백질은, 수용체-매개의 입체 구조 변화를 통해 바이러스 막과의 융합을 조장하며, 이것은 비리온과 감염된 세포 모두에서 표면 상에 발현되기 때문에, 백신-유도성 중화 항체 반응에 대한 유일한 현실적인 바이러스 타겟이다. 초기에는 HIV-1의 단량체 gp120과 유도체들이 주요 백신 후보물질로 간주되었다. 그러나, HIV-120은 매우 가변적이며, 임상 분리된 HIV-1에 대한 중화 항체를 도출하는데 무력한 면역원인 것으로 거듭 입증되고 있다. gp120 단량체에 의해 만들어진 항체들 중 몇 개만 HIV-1의 조합된 외막 당단백질 삼량체에 효과적으로 결합할 뿐이다.

반면, gp41은 우수한 면역원성 당단백질로서, 반드시 HIV에 감염된 모든 개체들에서 항체 형성을 유도한다.

gp41의 엑토도메인은 HIV-1의 외막에서 가장 보존적인 영역이며, 그렇지 않은 막 단백질들은 매우 밀접하게 관련된 분리주들 간에도 상당한 유전자 다양성을 보이고 있다.

또한, gp41은 HIV-1 비리온의 입체 구조와 감염성 유지에 중요한 역할을 담당한다.

6개의 나선 번들(융합 유도성 형태)과 프리헤어핀(융합전 형태) 구조를 표적으로 하는 항체들은 특정 조건에서 융합을 중지시킨다. gp41의 프리헤어핀과 6개의 나선 번들 입체 구조에 접근성을 가지고 있는 항체들은 gp41 매개 융합을 저해할 수 있을 것이다. 아울러, 6개의 나선 번들은 매우 안정적인 구조이다.

이러한 사실들로 인해, gp41의 6개의 나선은, 변형된 형태든 아니든 간에, 약물 및 백신 개발에 매력적인 타겟으로 여겨지고 있다.

US 6,455,265에서는, 일부 gp41 유도체들이 HIV 레트로바이러스 감염과 관련된 병리학적 작용을 예방하기 위한 백신 획득에 특히 유효할 수 있다고 입증하였는데, 단 해당 폴리펩타이드는 바이러스 외막과 일부 자가-단백질에 대한 차별적인 면역 반응을 달성하기 위해 항원성이 변형된 에피토프를 가지고 있는 것이었다.

보다 정확하게는, 레트로바이러스 외막의 보존된 면역우세(immunodominant) 영역이, 특히 gp41 레트로바이러스 외막의 경우에서, 유해한 자가면역학적 현상의 원인일 수 있는 것으로 확인되었다. gp41의 특정한 면역우세 영역들이, 인간 면역 시스템의 일부 단백질, 특히 인터루킨 2(IL-2)의 특정 영역에 대해 3차원 구조에 유사성을 가지고 있으며 및/또는 교차-반응성을 나타내는 것으로 확인되었다.

이에, US 6,455,265에서는, 바이러스 외막 단백질과 인간 면역 시스템의 단백질, 특히 IL-2에 대해 차별적인 면역 반응을 달성하기 위해, 외막 단백질의 대상 에피토프(concerned epitope)의 항원성을 변형시켜 수득한 변이 폴리펩타이드를 제안하였다.

WO 2005/01033에서는, HIV-1의 천연 gp41 단백질의 하나 이상의 항원성 영역을 포함하는 변이 폴리펩타이드를 언급하였다.

일반적으로, 합성 gp41은 감염시킨 베큘로바이러스나 포유류 세포에서 생산될 수 있지만, 수율이 E. coli를 이용하는 경우 보다 낮다. 또한, 베큘로바이러스나 포유류 세포에서의 당화는 인간 세포에서의 당화와 다르며, 당화가 단백질의 면역원성에 필수적인 것은 아니다. gp41은 실제 당화되지 않은 상태에서도 면역원성이 우수하다.

그러나, E. coli에서 생산되는 gp41의 전장 또는 그보다 짧은 길이의 재조합 HIV-1 엑토도메인은 일반적으로 중성 pH의 수계 매질내에서 불용성의 침전물(gp41의 삼량체 형태의 응집)을 형성한다.

중화 활성이 없는 항체 생성을 유발하는 면역우세 영역은 배제시킬 수 있지만, 전반적인 면역원성 활성을 유지하는 대상 에피토프에 면역 반응을 집중시키기 위해서는, 주요 gp41 영역은 유지하고 있는, gp41 단백질을 다량 생산할 필요가 있다.

그러나, HIV 감염, 특히 HIV 1형 감염에 대해 다각도의 면역 반응을 유도할 수 있는 백신도 필요한 실정이다. 또한, 예컨대 클레이드(clade) C 균주와 같이, 비-클레이드 B 백신도 필요하다.

아울러, 교차-클레이드 저해를 가능하게 하는 광범위한 저해 스펙트럼을 가진 백신의 개발도 요구된다.

HIV-1 감염에 대해 선천성, 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있는 백신도 요구된다.

점막 표면 수준 및/또는 혈액 수준에서 HIV 감염에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 백신도 요구된다.

HIV의 점막을 통한 도입과 점막 하 초기 세포 감염을 방해할 수 있는, 점막 IgA 및/또는 항체 및/또는 전신 IgA 및/또는 IgG 항체 유도에 적합한 백신도 요구된다.

트랜스사이토시스(transcytosis) 및 ADCC(항체 의존형 세포의 세포독성)와 같은 다양한 기전을 이용한, 점막 조직, 예컨대 질 점막 조직을 통한 HIV의 도입을 저해 또는 낮추는데 적합한 백신도 요구된다.

본 발명의 과제는 전술한 필요성을 모두 충족시키는 것이다.

본 발명은 보다 엄밀하게는 gp41 단백질의 안정화된 수용성(hydrosoluble) 형태를 제시하는 것이다.

본 발명자들은, 예기치 않게도, gp41 유도체의 가용성과 안정성을 증가시킨다는 측면에서, 인간 면역 시스템의 일부 단백질과의 임의의 면역우세적 교차 반응, 루프의 소수성을 현저히 감소시키면, 면역원성 반응성의 변화 없이도, gp41의 가용성 삼량체 형태를 형성시킬 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 또한, 바람직한 비제한적인 구현예에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 쉽게 정제되며, 인간 면역결핍 바이러스에 대해 면역 반응을 유도하는데 적합한 비히클, 예컨대 비로솜(virosome)에 부착된다.

본 발명의 제1 목적은, 특히 동일한 비로솜 입자의 외면에 부착 또는 연결되고 나면, 수계 매질내에서 가용성을 유지하면서, 단량체 또는 올리고머 형태로 개선된 안정성을 가지는, 다른 변이 폴리펩타이드를 설계하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 비로솜-유사 입자와 접합시, 천연 HIV 바이러스 멤브레인 및/또는 임의의 HIV 감염된 세포의 멤브레인 상에서의, gp41 단백질의 배치/제시를 모방하는, 다른 변이 펩타이드를 설계하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, HIV에 대한 예방학적 치료제로서 가능성 있는 후보물질이 될 수 있는, 유효한 항원성, 아마도 면역원성을 가진, 다른 변이 펩타이드를 설계하는 것이다. 이에, 본 발명의 대상은 임의의 항원성 및/또는 면역원성 화합물, 또는 이러한 다른 변이 펩타이드를 포함하는 조성물이다.

본 발명의 다른 목적은, 특히, 다양한 서브타입들 중에서도 HIV의 교차-클레이드 변이체, 예컨대 HIV의 클레이드 B 및 클레이드 C에 대해, 전신 IgG(혈액) 및 아마도 상보적인 점막 IgA를 효과적으로 생성시키는, 다른 변이 폴리펩타이드를 설계하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, HIV에 대한 방어 항체를 효과적으로 생성시키며, 그렇지 않다면, 비-중화 항체는 거의 만들지 않거나, 또는 gp41의 보존된 영역에 대해 양호하게 또는 최적으로 집중되는 항체 반응을 일으키는, 다른 변이 펩타이드를 설계하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 점막 경계를 통과하는 바이러스의 전이를 차단하거나 및/또는 세포 감염을 저해하여, HIV-1 감염을 예방할 수 있는, 다른 변이 펩타이드를 설계하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 지질화될 수 있는, 즉 C-말단에 적합한 지질이 직접 또는 간접적으로 조합되어 있으며, 동일 펩타이드의 임의의 비로솜 접합체의 산업화/생산에 적합한 생산력을 갖춘, gp41 단백질 유사 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 비로솜 유사 입자에 연결, 즉 외면에 부착될 수 있으며, 동일 펩타이드의 임의의 비로솜 접합체의 산업화/생산에 적합한 생산력을 갖춘, gp41 단백질 유사 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면은, 식 N-L-C로 표시되는 3개의 인접한 세그먼트 N, L 및 C를 포함하며, gp41의 N-나선 영역(N), gp41의 C-나선 영역(C) 및 상기 N-나선 영역과 C-나선 영역 사이에 위치하는 합성 링커를 포함하는 연결 루프(L)를 포함하는, 변이 폴리펩타이드를 제공하며, 상기 링커는 프로토타입의(prototypic) HIV-1 HxB2 클레이드 B 분리 균주를 기준으로 하는 번호 체계에 따라 gp41의 593번에서 617번까지의 아미노산들을 치환하며, 상기 폴리펩타이드는 칼베올린-1을 중화하는 98.6 D 에피토프를 포함하나 2F5 및 4E10 에피토프, 융합 펩타이드를 포함하지 않으며, 인터루킨 2(IL-2)에 대해 최소한의 면역 교차 반응성을 가진다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드는 이하 "gp41 유래 항원", "본 발명에 따른 gp41" 또는 "rgp41"로 다르게도 지칭된다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드는 거의 대부분 N-나선과 C-나선 간의 천연적인 상호작용 형태를 유지하며, 실질적으로 이의 면역 반응성을 변화시키지 않으면서도 상기 변형된 폴리펩타이드를 가용적이며 안정적인 삼량체 형태로 만드는 소수성을 띈다.

본 발명의 내용에서, 2F5 에피토프는 다양한 HIV-1 초기 분리주들에서 광범위한 중화 활성을 가지는 인간 2F5 항체에 의해 인지되는 gp41의 특정 영역이다(Trkola A. et al., 1995, J. Virol., 69, pp6609-6617, 도 1). 이 단일클론 항체는 분자의 막관통 영역에 인접한 gp41의 엑토도메인내에 위치되어 있는 상대적으로 보존된 16개의 아미노산 선형 서열(NEQELLELDKWASLWN, 서열번호 7) 중 6개의 아미노산으로 구성된 코어 에피토프를 인지한다(Parker et al., 2001, J. Virol., 75, pp 10906-10911).

4E10 인간 단일클론 항체는 2F5 에피토프에 바로 인접한 카르복시 말단 위치인 gp41의 막관통 근위 영역에 대해 특이성을 가지며, 또한 광범위한 중화 활성을 가진다(Zwick et al., 2001, J. Virol., 75, pp 10892-10905, 도 1).

98.6D 에피토프는 gp41의 클러스터 II 영역에 위치하고 있으며, Gorny M. K. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., 86, pp 1624-1628 및 Xu J.-Y.et al., 1991, J. Virol., 65, pp 4832-4838에서 언급된 바와 같이 98.6D 인간 단일클론 항체에 의해 인지된다.

칼베올린-1 결합 도메인은 gp41에서 CBD1 펩타이드(SLEQIWNNMTWMQWDK, 서열번호 8)에 해당된다(Benferhat et al., 2009, Mol. Immunol. 46(4), pp 705-712). 융합 펩타이드는 gp41의 아미노-말단 영역에 해당되며, 코일드-코일 형태가 형성된 다음에 노출된다. 이 영역이 타겟 세포의 막으로 들어가, 바이러스와 세포막의 융합을 일으키게 되는데, 이 영역은 gp41의 세포외 부분에서 512번부터 539번 까지이다(Quintana et al., 2005, JCI; 도 1).

본 발명에서, 폴리펩타이드는 gp41-삼량체를 형성할 수 있으며, 천연 gp41 항원성을 유지하고 있으며, IL-2에 대한 최소한의 교차 반응성을 나타낸다. 이러한 교차 반응성은, 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법, 예컨대 gp41-ELISA 및 gp41-돗 블롯 방법으로 측정할 수 있다. 이러한 측정 방법의 예는 후에 설명된다(실시예 3 참조, 도 2).

본 발명에서, "천연 gp41 항원성을 유지한다" 또는 "이의 면역원성 활성의 변화 없이"라는 표현은, 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 거의 야생형 gp41과 동일한 수준의 항원성 및/또는 면역원성 활성을 가진다는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드를 구성하고 있는 N 및 C 세그먼트들은 실험 균주와 일차 분리주 등의 HIV-1 및 HIV-2 균주를 비롯한 HIV의 모든 gp41 단백질로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 세그먼트들은 HIV-1 균주로부터 유래되며, 특히 서열번호 1로 나타낸 바와 같이, HIV1 HxB2 균주로부터 유래된다.

다수개의 gp41 단백질에 대한 뉴클레오티드 서열과 펩타이드 서열이 공지되어 있으며, 예컨대 http://www.hiv.lanl.gov/ 인터넷 사이트에서 이용가능하며, 또한, 상응하는 로스 앨러모스 알라모드 목록서(HIV Sequence Compendium 2005 Leitner T, Foley B, Hahn B, Marx P, McCutchan F, Mellors J, Wolinsky S, and Korber B, Eds., published by Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, NM, LA-UR 06-0680)에 기재되어 있다.

전술한 및/또는 청구항에서 하나 이상의 보존적인 돌연변이(실질적으로 면역원성에는 변화가 없음)가 이루어진, 모든 서열도 상기한 정의에 포괄된다.

아미노산의 번호는 도 1에 나타낸 gp41 단백질(아미노산 서열은 서열번호 1로 나타냄)의 서열을 기준으로 매겨진다.

보다 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 17 또는 서열번호 18로 나타낸 서열이다.

본 발명의 다른 측면에서, 폴리펩타이드는 또한 하나 이상의 스페이서 펩타이드 세그먼트 S를 포함한다. 구체적인 측면에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 19 또는 서열번호 20으로 표시되며, 이들 각각은 M0 또는 M1으로 명명된다.

상기 스페이서 서열은, 보다 양호한 접합, 예컨대 폴리펩타이드를 캐리어, 예컨대 비로솜에 연결시켜, 이러한 그래프팅이 행해지는 반응성 아미노산에게 보다 우수한 접근성을 부여하는데 이용할 수 있다.

특히, 이러한 그래프팅이 행해지는 아미노산(들)을 비로솜의 막으로부터 더 멀어지게 한다.

상기 스페이서 세그먼트, 예컨대 아미노산 서열의 구성은, 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 생산 공정을 보조하기 위해 설계될 수도 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 상기 스페이서 세그먼트는 전체 폴리펩타이드의 정제 단계에 참여할 수 있는 히스티딘 잔기를 포함할 수 있다(하기 실시예 1 참조).

상기 스페이서 펩타이드는 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 C-말단부에서 서열번호 9, 10, 11 또는 12에 기술된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.

또한, 상기 스페이서 서열은 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 면역원성에 관여할 수도 있다.

바람직한 구현예에서, N 세그먼트는 HIV-1 HxB2 프로토타입 분리주를 기준으로 한 번호 체계에 따라 gp41의 540번에서 592번의 아미노산들이며, C 세그먼트는 HIV-1 HxB2 프로토타입 분리주를 기준으로 한 번호 체계에 따라 gp41의 618번에서 664번의 아미노산들이다.

바람직한 구현예에서, N 세그먼트는 서열번호 13 또는 14로 표시되는 서열이며, 및/또는 C 세그먼트는 서열번호 15로 표시되는 서열이다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 L 단편은 서열번호 16으로 표시되는 서열이다.

본 발명의 폴리펩타이드는 삼량체를 형성할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 수계 매질에서 안정적인 삼량체를 형성하는 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 수계 조성물에 관한 것이다.

특히 하기 청구항에 의해 규정되는 본 발명은 앞서 명시되었거나 언급된 것과 등가인 폴리펩타이드, 특히 본 발명의 실시에 적합한 다른 추가적인 항원과 관련하여 후술하는 이의 유사체를 포함한다.

본 발명의 내용에서, "gp41-유래의 항원에 대한 이의 유사체"는 상기 gp41-유래 항원의 아미노산 서열과 실질적인(85% 이상, 특히 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상) 아미노산 서열 동일성 또는 상동성(즉, 예컨대 동일한 패밀리, 유사한 극성 또는 전하를 가진 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 잔기)을 가지며, 특히 gp41 단백질에 대한 면역글로불린의 항원 결합부가 유사하거나 보존된 생물 특성을 가지는, 펩타이드를 지칭하는 것으로 의도된다.

상기 언급된 특징들에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 용액 중에 가용성인 삼량체를 형성한다.

이처럼, 본 발명은 다른 측면에서, 수계 매질에서 삼량체를 형성하는 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 수계 조성물에 관한 것이다. 상기 수계 조성물에서, 상기 삼량체는 안정적이다.

본 발명에 따른 펩타이드의 올리고머, 예컨대 삼량체 상태는 겔 여과, 예컨대 3000 - 600,000 달톤을 분리하는 FPLC와 같은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있는 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명의 펩타이드에 의해 형성되는 삼량체의 안정성은, 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 수계 조성물을 냉동-해동하는 사이클을 반복 실시하는 방법과 같이 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있는 기법으로 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드는, 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있는, 임의의 통상적인 또는 표준적인 화학 합성 또는 유전자 조작 기법에 의해 수득한다.

한가지 방법으로서, 폴리펩타이드는 화학 합성에 의해 제조되며, 이는 하나의 서열 형태로 합성되거나 또는 이후에 서로 연결될 서브-서열들 몇개로 합성될 수 있다. 화학 합성은 고상 또는 용액 중에서 수행될 수 있는데, 이러한 2가지 합성 기법들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 이러한 기법들은 특히 Atherton and Shepard in "Solid phase peptide synthesis" (IRL press Oxford, 1989), Houbenweyl in "Methoden der organischen Chemie" [Methods in Organic Chemistry] published by E. Wunsch Vol. 15-1 and 11, Stuttgart, 1974, P. E. Dawson et al . (Science 1994; 266(5186), pp776-779); G G Kochendoerfer et al. (1999; 3(6), pp 665-671 ); P E Dawson et al. (2000, 69, Annu. Rev. Biochem., pp 923-960)에 기술되어 있으며, 이들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

다른 방법으로서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 유전자 조작 기법을 이용하여 제조된다. 본 발명에 따른 상기 폴리펩타이드를 유전자 조작으로 제조하는 경우, NH2 말단에 첫번째 개시 코돈의 번역에 해당되는 추가적인 메티오닌 잔기가 포함될 수 있다.

이러한 기법들은 Maniatis et al ., Molecular Cloning: a molecular manual, old Spring Harbor, 1989에 상세하게 기술되어 있다. 통상적으로, PCR 기법을 이용하여, 발현 벡터에 삽입할 수 있는 형태로 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열이 제조된다. 대상 서열을 포함하는 상기 발현 벡터를 이용하여, 이 후 대상 서열을 발현할 수 있는 숙주 세포에 형질전환한다. 그 후, 제조되는 폴리펩타이드는 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있는 통상적인 크로마토그래피 기법을 이용하여 배양 배지로부터 분리한다. 정제 단계에서는, 바람직하게는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용한다. 전형적으로, 세포는 배양 종료 후 원심분리에 의해 회수하고, 임의의 적합한 수단에 의해 파괴시키기 위해 중성 완충액 중에 취한다. 그 후, 세포 용혈물을 원심분리하여 가용성 물질을 불용성 물질들로부터 분리한다. 원심분리하여 수득한 상층액과 펠렛을 SDS-PAGE 분석하여, 폴리펩타이드가 가용성인지 아닌지를 확인한다. 펩타이드가 불용성인 경우, 우레아, 구아니딘 또는 임의의 다른 가용화제가 포함된 완충액을 이용하여 용해시킨다. 이러한 단계에서 원심분리를 실시하면, 크로마토그래피에 방해가 될 수 있는 찌꺼기와 그외 불용성 산물들을 제거할 수 있다. 다음 단계는, 예컨대 대상 폴리펩타이드에 혼입될 수 있는 링커 세그먼트 L에, 복수의 히스티딘 잔기가 존재하는 경우, 금속 킬레이트 타입으로 되어 있을 수 있는, 친화성 컬럼 상에, 용해시킨 분자를 주입하는 단계로 구성된다. 친화성 정제를 수행할 수 있는 시스템은 면역친화성, cibachron blue 상에서의 친화성 등과 같이 실제 매우 다양할 수 있다. 이 단계에서, 폴리펩타이드는 SDS-PAGE 전기영동 후 코마시 블루 염색한 것을 비색법으로 측정할 수 있는 바와 같이, 80% 이상, 특히 90% 이상에 가까운 순도를 나타낸다. 밴드의 농도를 측정하여, 순도를 정량할 수 있다. 또한 순도는 역상 HPLC에 의해, 다양한 피크의 면적을 측정함으로써 측정할 수 있다. 폴리펩타이드를 더욱 정제하기 위해, 추가적인 크로마토그래피 단계를 추가할 수 있으며, 예컨대 겔 여과 및 역상 크로마토그래피가 언급될 수 있다.

다른 구현예에서, 본 발명은 또한 전술한 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 DNA/RNA 및 이중 가닥 DNA/RNA 분자를 모두 포함한다.

본 발명의 특정 측면에서, 본 발명에 따른 rgp41을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 21 또는 28로 표시된다.

본 발명의 범위에 포함되는, 변이 폴리펩타이드를 코딩하는, 추가적인 DNA 서열은, 본 명세서에 기술된 유전자 코드와 폴리펩타이드 서열을 기초로, 당해 기술 분야의 당업자라면 쉽게 제조할 수 있다. 대응되는(counterpart) RNA 서열에서는 T를 U로 치환하여 제조할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 유전자 코드의 축중으로 인해, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자, 특히 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드 서열들 간에 서열 차이가 있을 수 있다는 것을 쉽게 인식할 것이다.

반대로, 당해 기술 분야의 모든 당업자라면 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 특히 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드들 간에, 역시 유전자 코드 축중 측면에서, 서열 차이가 있을 수 있다는 것을 인지할 것이다.

이러한 차이들이 앞서 및/또는 아래에서 구체적으로 언급된, 제조되는 폴리펩타이드의 구조/입체 구조, 및/또는 기능(들) 및/또는 특성을 실질적으로 바꾸지 않는 한, 이러한 모든 차이는 본 발명의 내용(들)과 첨부된 청구항에 포함된다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열은 화학적으로 직접 합성한다(Young L and Dong Q., 2004,-Nucleic Acids Res., Apr 15;32(7), Hoover,D.M. and Lubkowski,J. 2002,. Nucleic Acids Res., 30, Villalobos A, et al., 2006. BMC Bioinformatics, Jun 6;7:285).

이렇게 수득한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은, 폴리펩타이드 서열을 선택적으로 변형된 형태로, 통상적인 세포 시스템에서 발현시킬 수 있는, 임의의 적정 벡터에 공지된 방식으로 도입할 수 있다.

그렇게 수득한 폴리뉴클레오티드 서열은, 숙주 세포에 형질전환시켜 도입된 서열을 발현(예, 전사 및 번역)시키기 위하여, 숙주 세포에 도입할 수 있다. 벡터로는 플라스미드, 파지 등이 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열이 유도성이거나 아닐 수 있는 강력한 프로모터의 통제 하에 위치되는 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 사용가능한 프로모터의 예로는 T7 RNA 중합효소 프로모터를 들 수 있다. 발현 벡터에는 암피실린, 테트라사이클린 또는 그외 인간에서 사용하기 적합한 항생제 내성 유전자 등의 선별 마커가 포함될 수 있다. 다른 예로, 형질전환된 세포는 영양요구성 마커나 또는 임의 종류의 항생제를 사용하지 않는 선별 수단(숙주 게놈에 대한 미리 넉-아웃되어진 필수 유전자의 보완)을 이용하여 선별할 수 있다.

사용가능한 발현 벡터의 예들로는 플라스미드 pET21b, pET30 (Novagen), 효모 벡터, 박테리아 벡터, 바이러스 벡터, 예컨대 베큘로바이러스 및 폭스바이러스 벡터가 있다.

본 발명의 폴리펩타이드의 발현과 정제를 강화하기 위해, 폴리펩타이드를 융합 단백질과 같이 변형된 형태로 발현시킬 수 있으며, 분비 신호 뿐만 아니라 추가적인 이종의 기능성 영역을 포함시킬 수 있다. 예컨대, 숙주 세포에서의 안정성과 영속성을 개선시키기 위해, 추가적인 아미노산, 특히 하전된 아미노산으로 구성된 영역을 폴리펩타이드의 N-말단에 추가할 수 있다.

또한, 본 발명의 대상은 전술한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터이다.

상기 벡터는 본 발명의 또 다른 대상인 숙주 유기체를 형질전환시키는데 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 전술한 발현 벡터와 함께 통상적으로 사용되는 모든 숙주 세포, 예컨대 E. coli, BL21 (DE3), BLR(DE3), origami 2(DE3), 바실러스 또는 그외 그람 양성 숙주, 예컨대 락토코커스 락티스, 호모, 베큘로바이러스 및 진핵 세포, 예컨대 CHO 또는 Vero를 사용할 수 있다. 바람직한 세포 발현 시스템은 E. coli, 예컨대 BL21 (DE3)이다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 접합체를 다룬다.

구체적인 측면에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 비로솜-유사 소낭(vesicle)과 접합된다.

비로솜 유사 소낭

본 발명에 적합한 비로솜 유사 소낭은 하나 이상의 비로솜 지질을 포함하며, 바람직하게는 융합 막 특성을 가진다.

일 구현예에서, 본 발명의 비로솜 유사 소낭은 단일 층상 지질 이중층(unilamellar lipid bilayer)을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 비로솜 유사 소낭은 이중 층상(bilamellar) 또는 다중 층상(multilamellar) 소낭일 수 있다.

일 구현예에서, 비로솜 유사 소낭은 일반적으로 직경 50 - 600 nm, 특히 직경 100 - 300 nm, 및 특히 200 - 400 nm를 가질 수 있다.

본 발명의 비로솜 유사 비히클은 평균 직경 약 150 nm의 구형의 단일 층상 소낭일 수 있다. 비로솜 유사 비히클은 융합 특성이 있거나 없는 바이러스 막 단백질, 또는 이의 단편이 지질 이중층에 통합된 상태로 구성된다.

"융합 단백질 또는 이의 단편"이라는 표현은, 비로솜 유사 소낭막과 타겟 세포의 생물막 간에 융합 반응을 유도 및/또는 증가시킬 수 있는 단백질 또는 이의 단편을 지칭한다.

예컨대, 융합 단백질은 헴어글루티닌(HA)와 같은 인플루엔자 막 당단백질일 수 있다.

일 구현예에서, 구별되는 융합 특징을 나타낼 수 있는 2가지 이상의 상이한 융합 단백질 또는 이의 단편을 사용할 수 있다. 다른 구현예에서, 구별되는 융합 특징은, 예컨대 온도, 이온 농도, 산성도, 세포 타입 및 조직 타입 특이성에 대한 상이한 민감도일 수 있다.

일 구현예에서, 비로솜 유사 소낭은 2가지의 다른 온도에서 융합을 매개하는 융합 단백질을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 여러가지 바이러스 균주 유래의 헴어글루티닌(HA)을 사용하여 비로솜 유사 소낭을 구축할 수 있다. 예를 들면, X-31 및 PR8/34 비리온으로부터 유래한 HA 분자는 상이한 온도에서 구별되는 2가지 융합 반응에 대해 촉매 작용을 할 수 있다.

상이한 융합 특징들을 가지는 융합 단백질들은 여러가지 인플루엔자 균주로부터 유래하거나, 또는 융합 단백질은 구내염 바이러스(VSV) E1 단백질, 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus: SFV) 외막 단백질 복합체 또는 센다이 바이러스 F 단백질 등의 그외 바이러스로부터 유래할 수 있다.

비로솜 유사 소낭의 막에 커플링되는 항원은 엔도솜 내부에서 분해되어, MHC II 수용체에 의해 면역계에 제시될 수 있다. 비로솜의 루멘 내부에 함유된 항원은 막 융합에 의해 항원-제시 세포의 세포졸로 이동되어, 세포졸에서 분해될 수 있으며, 그런 후, 이는 MHC I 항원으로 제시될 수 있다. 비로솜에 의해 전달된 항원의 교차-제시도 이루어질 수 있다.

따라서, 비로솜 유사 소낭은 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도할 수도 있다.

특히, 비로솜 유사 소낭은 분비성 IgA 뿐만 아니라 IgG 또는 IgM과 같이, IgA 항체의 생산을 유도할 수도 있을 것이다. 제조 프로토콜은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 적합한 비로솜 제조 방법은, 예컨대, WO 2004/045582 또는 EP 0　538 437, EP 1　633　395, EP 1594466에 기술되어 있으며, 이들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 비로솜 유사 소낭은 비로솜 소낭으로부터 또는 비로솜 소낭과 리포좀 소낭의 융합으로 제조되는 소낭으로부터 수득할 수 있다.

비로솜 소낭의 제조는 예컨대 Stegmann et al., EMBO J. 6, 1987, no. 9, 2651-9, 또는 de Jonge et al., Biochim. Biophys. Acta, 1758, 2006, 527-539와 같이, 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 모든 방법으로 수행할 수 있으며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 비로솜 소낭은, 예컨대, 무손상 인플루엔자 바이러스를 옥타에틸렌글리콜 모노-N-도데실 에테르(OEG)로 용해하고, 뉴클레오캡시드를 침강시키고(바이러스 당단백질과 지질은 상층액에 잔류될 것임), 소수성수지(Bio-Beads SM2)를 이용하여 상층액으로부터 디터전트를 제거한 후, 오리지날 바이러스막 지질과 바이러스막의 당단백질로 재구축할 수 있다(Stegmann T, et al., EMBO J. 6, 1987 2651-9).

또한, 비로솜은 바이러스 막을 단쇄 인지질로 용해하고, 뉴클레오캡시드를 침강시킨 후(바이러스 막의 당단백질과 지질만 상층액 잔류됨), 투석하여 상층액내 단쇄 지질을 제거함으로써, 오리지날 바이러스 막으로 재구축할 수 있다.

디터전트나 단쇄 인지질을 이용하여 바이러스를 용해시키고, 뉴클레오캡시드를 상기와 같이 제거한 후, 디터전트나 단쇄 인지질에 용해된 항원 또는 보강제를, 디터전트나 단쇄 지질을 제거하기 전에, 상층액에 첨가함으로써, 형성되는 비로솜 안에 상기 항원 또는 보강제를 혼입시킬 수 있다. 마찬가지로, 디터전트나 단쇄 인지질에 용해된 지질을 상층액에 첨가하여, 비로솜 막에 포함시킬 수 있다. 여러가지 바이러스로부터 유래된 융합 단백질을 포함하는 비로솜 소낭의 제조는, 디터전트나 단쇄 지질을 제거하기 전에, 전술한 바와 같이 용해시킨 바이러스 막이 포함된 상층액을 혼합하거나 또는 상기 상층액에 정제된 융합 단백질을 첨가함으로써, 수행할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 비로솜 유사 소낭은 비로솜 소낭을 리포좀 소낭과 융합하여 수득할 수도 있다.

따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 비로솜 유사 소낭은 비로솜 지질과 리포좀 지질을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 비로솜 유사 소낭은 양이온성 지질, 합성 지질, 당지질, 인지질, 글리세로포스포리피드, 글리코스핑고리피드 유사 갈락토실세라미드, 스핑고리피드, 콜레스테롤 및 이의 유도체로부터 선택되는 지질로 구성되는 지질 이중층을 포함할 수 있다.

인지질은 특히 포스파티딜콜린, 스핑고마이엘린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드 산, 카르디올리핀 및 다양한 지방 아실 조성을 갖는 포스파티딜이노시톨을 포함할 수 있다.

양이온성 지질은, DOTMA (N-[I-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드), DOTAP (N-[I-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드, DODAC (N,N-디올레일-N,N,-디메틸암모늄 클로라이드), DDAB(디도데실디메틸암모늄 브로마이드) 및 스테아릴아민 또는 그외 지방족 아민 등으로부터 선택할 수 있다.

본 발명에 사용되는 지질은 엔도좀의 막 파괴를 쉽게 하기 위한 헬퍼 지질로서 널리 사용되고 있는 DOPE(디올레오일포스파티딜 에탄올아민)과 혼합된 소형 단일 층상 리포좀(unilamellar liposome)으로 제형화할 수 있다.

다른 구현예에서, 또한, 소낭의 경직성 및/또는 밀폐성을 향상시키기 위해, 공-유화제를 사용할 수 있다. 공-유화제의 예로 콜레스테롤 및 유도체, 예컨대 콜레스테롤 설페이트와 같이 하전되거나 중성의 콜레스테롤 에스테르; 예컨대 식물 유래의 스테롤 벡본을 가진 유도체, 예컨대 피토스테롤(시토스테롤, 시그마스테롤); 세라마이드; 및 이의 혼합물을 언급할 수 있다.

비로솜 또는 이의 내용물은 저장시 가수분해되거나 물리적으로 분해될 수 있다. 일 구현예에서, 비로솜은 장기간의 보관을 위해, 동결 건조에 의해 보존시키고, 사용 전에 수용액으로 재구성할 수 있다. 동결건조하기 전에, 동결건조하는 동안 및 재구성시에, 비로솜의 완전성 유지를 보조하기 위해, 이눌린과 같은 동결보호제를 첨가할 수 있다(Wilschut, J. et al., J. Liposome Res. 17, 2007, 173-182). 바람직하게는, 분무 동결-건조를 적용한다(Amorij, J.P. et al. Vaccine 17, 2007, 8707-17).

본 발명의 비로솜 유사 소낭은 추가적으로 특정 세포 또는 조직으로 소낭을 타겟팅하는 표적 모이어티를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 비로솜 유사 소낭은 이 소낭을 특정 세포나 조직으로 향하게 하는 표적 모이어티를 더 포함할 수 있다.

적절한 표적 모이어티는 세포 표면 수용체, 케모카인, 사이토카인, 성장 인자, 항체 또는 항체 단편, 인테그린과 같은 유착 분자에 상보적인 특이성이나 특이적인 전하를 가진 펩타이드 서열 중에서 선택할 수 있다. 표적 모이어티는 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 모든 기법에 의해 상기 소낭에 통합시키거나 또는 소낭의 지질 이중층에 부착시킬 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 비로솜 유사 소낭의 외면에 위치되는 항원은:

- 상기 비로솜 유사 소낭의 지질과 공유 결합되거나, 또는

- 상기 비로솜 유사 소낭의 지질 이중층에 펩타이드 막관통 도메인에 의해 삽입될 수 있다.

일 구현예에서, 항원은 비로솜 내에 함유될 수 있다.

본 발명의 항원의 변형 및 비로솜 유사 소낭의 외면에 상기 변형된 항원을 교차-연결하는 방법은 WO 2004/078099에 기술된 바와 같을 수 있다.

일 구현예에서, 항원은 지질 또는 인지질과의 교차-연결에 의해 비로솜 유사 소낭의 외면에 공유 결합될 수 있다. 다른 구현예에서, 항원은 탄수화물과의 교차-연결에 의해 비로솜 유사 소낭의 외면에 공유 결합될 수 있다. 일 구현예에서, 공유 결합된 항원은 C-말단에 위치된 하나 이상의 교차-연결된 잔기를 포함할 수 있다.

예컨대, 교차-연결되는 잔기는 시스테인(Cys) 또는 라이신(Lys) 중에서 선택할 수 있다. 다른 구현예에서, 공유 결합되는 항원은 상기 C-말단에 위치된 교차-연결된 잔기와 대응되는 C-말단 항원 끝부분 사이에 하나 이상의 스페이서 잔기를 더 포함할 수 있다.

적절한 스페이서 잔기는, 예컨대 GIy (글리신), Ala (알라닌), Ser (세린), Asp (아스파르테이트), Lys (라이신), GIn (글루타민), His (히스티딘), He (이소루신) 및 Leu (루신) 잔기들 중에서 선택할 수 있다. 스페이서 잔기 2 - 12개, 특히 3 - 10개, 보다 구체적으로는 4 - 8개를 연결시켜, 스페이서 서열을 만들 수 있다. 적합한 스페이서 서열은 예컨대 Gly-Gly 또는 Lys- GIy로부터 선택할 수 있다.

비로솜 유사 소낭의 표면에 항원을 교차-결합시키는 것은, 예컨대 양쪽성 PEG 유도체, 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜세린, 콜레스테롤 또는 이의 혼합을 이용함으로써, 쉽게 지질 이중층에 통합시켜, 수행할 수 있다. 본 발명의 비로솜 유사 소낭의 지질에 항원을 교차-결합시키는 것은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 모든 방법에 의해 수행할 수 있다.

교차-결합은 액체 용액 중에서 수행할 수 있으며, 지질-펩타이드 접합체를 이후에 비로솜 유사 소낭 안에 넣을 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 예컨대 이중 기능성 숙시네이트 링커, 특히 [감마]-말레이미도부티르산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 또는 N-[감마]-말레이미도부티릴옥시-숙신이미드-에스테르에 의해, 본 발명의 소낭 지질에 항원을 연결할 수 있다.

항원, 항원이 연결된 지질, 인지질 및 보강제는, 전술한 바와 같이. 바이러스를 디터전트나 단쇄 인지질로 용해시킨 다음 뉴클레오캡시드를 제거한 후에 수득되는 상층액에 첨가할 수 있다. 그런 후, 전술한 바와 같이, 예컨대 Bio-Beads SM-2 (Biorad), Amberlyte XM을 이용한 디터전트 제거 또는 투석에 의한 단쇄 인지질의 제거를 통해, 비로솜을 형성시킬 수 있다.

놀랍게도, 상기에서 수득되는 임의의 접합체는 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 구조/입체 구조, 성질, 기능(들), 특히 삼량체화 능력을 실질적으로 바꾸지 않는다.

놀랍게도, 상기 접합체, 즉 상기 폴리펩타이드는, 수계 매질에 용해시, 용해된 상태로 유지되며 안정적이다. 즉, 수계 매질에 용해되어 있는 상기 접합체를 포함하는 수계 조성물은 자명하게 본 발명에 포함된다.

이러한 측면에 따른 다른 측면에서, 본 발명은, 이의 화학적/물리적 형태가 무엇이든, 및/또는 약리학적 보강제 또는 부형제가 무엇이든 상관없이, 본 발명에 따른 임의의 gp41 폴리펩타이드를 일반적으로 포함하는 약학 조제물에 관한 것이다.

다른 구현예에서, 약학 조제물은 활성 성분으로서 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 또는 전술한 접합체, 또는 본 발명의 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 발현 벡터를 하나 이상 포함한다.

이러한 약학 조제물은 본 발명에 따른 수계 조성물을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 용도로, 다양한 수계 매질, 예컨대 물, 완충화된 물, 0.4% 염수, 0.3% 글리신, 히알루론산 등을 사용할 수 있다. 약학 조제물은 통상적으로 잘 알려져 있는 멸균 기법으로 멸균시키거나 또는 필터를 이용하여 멸균할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조제물은 사용을 위해 포장하거나, 동결건조시킬 수 있으며, 동결건조된 조제물은 투여하기 전에 멸균 용액과 조합된다. 본 발명에 따른 약학 조제물은 대략적인 생리적 상태에 따라, 약리학적으로 허용가능한 보조 물질, 예컨대 pH 조절제, 완충화제, 삼투성 조절제(tonicity adjusting agent), 습윤제 등, 예컨대 특히 소듐 아세테이트, 소듐 락테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올 아민 올레이트를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조제물은 폴리펩타이드, 이의 삼량체, 이의 접합체 및 추가적인 gp41 유래 항원을 필요한 환자를 치료하기 위한 유효량으로 포함할 수 있다. 상기 추가적인 gp41 항원은 본 발명의 폴리펩타이드와는 구별된다. 보다 구체적인 구현예에서, 상기 추가적인 항원은 접합체 형태이며, 특히 비로솜에 결합된 상태이다.

유효량은, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 접합체가 단독으로 또는 다른 첨가제와 함께 원하는 반응을 자극할 수 있는 양이다. 유효량은 투여 경로, 1회 투여 또는 다중 투여, 환자의 연령, 신체 상태, 키, 체중 등의 개별 환자의 파라미터, 질병의 단계 등의 다양한 인자에 따라 결정된다. 이러한 인자들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 일반적인 실험 이상의 실험 없이도 파악할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 약학 조제물은 본 발명의 폴리펩타이드, 이의 삼량체 또는 이의 접합체를 단독으로 또는 전술한 바와 같이, 하나 이상의 보강제와 함께 포함할 수 있다.

상기 항원은 본 발명에 따른 rgp41들 중 하나 이상과 구분/상이하다. 또한, 상기 항원은 상기 비로솜에 포함되는 것, 특히 HA와 구분된다.

추가적인 항원은, 예컨대 HIV-1 HxB2 프로토타입 분리주 클레이드 B를 기준으로 한 번호 체계에 의거하여, 540-592 단편 및 618-664 단편과 구분/상이한, gp41 단백질의 임의 파트 및 gp41 단백질, 전체 또는 이의 유사체이다.

상기 추가적인 항원은 임의의 HIV-1 클레이드로부터 기원될 수 있으며, 바람직한 구현예에서, 상기 추가적인 항원은 클레이드 B 또는 클레이드 C의 gp41로부터 기원한다.

일 구현예에서, 본 발명의 추가적인 항원으로서 적합한 gp41-유래 항원은 타겟 세포의 세포막에 대한 융합 유도 특성을 가지지 않는다.

일 구현예에서, 상기 gp41-유래 항원은 비로솜 또는 비로솜 유사 입자를 포함하는 본 발명에 따른 접합체와 관련하여 상기에 기술된 바와 같이, 비로솜 유사 소낭의 외면에 공유 결합된다.

일 구현예에서, 상기 gp41-유래 항원은 P1으로 불리우는 펩타이드이다. 펩타이드 P1은 바이러스가 타겟 세포와 상호작용하기 전에 바이러스 입자의 표면에 위치된 HIV 외막 단백질 엑토도메인 gp41에 존재하는 아미노산 서열이다. 예를 들어, HIV-1 HxB2 균주에서, 이 서열은 HIV-1 HxB2 프로토타입 분리주 클레이드 B 균주를 기준으로 한 번호 체계에 따라, 아미노산 649번에서 683번까지로 구성된다.

바람직한 구현예에서, 상기 P1 펩타이드는 전체가 또는 일부가 서열번호 2, 3, 6에 기술되어 있으며, 또한 WO2007/099446에 기술된 이의 유사체로 언급되며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명에 적합한 P1 항원의 예로, 예컨대 서열번호 4 또는 5에 기술된 3개의 아미노산 L-G-C 또는 L-S-C 스페이서가 C-말단 위치에 첨가된 펩타이드 P1 서열을 생각할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 약학 조제물은 면역요법, 특히 예방학적 면역요법에 사용된다.

본 발명의 약학 조제물은 이를 필요로 하는 환자를 치료하는데 유효한 함량으로 본 발명의 폴리펩타이드 또는 접합체를 포함한다.

다른 구현예에서, 전술한 약학 조제물은 면역요법, 특히 예방학적 면역요법에 사용할 수 있다.

다른 구현예에서, 본 발명에 따른 약학 조제물은, 면역치료에 동시에, 각각 또는 순차적으로 사용하기 위한 조합된 조제물로서, 본 발명에 따른 상기 폴리펩타이드 또는 상기 접합체와는 구별되는, 추가적인 항원을 포함할 수 있다.

이에 대한 다른 측면에서, 본 발명은 또한 인간 면역결핍 바이러스(HIV)의 gp41에 대하여 후천적인 면역 반응 및/또는 선천적인 면역 반응을 유도하도록 의도된 약제를 제조하기 위한, 본 발명에 따른 gp41 폴리펩타이드, 접합체 또는 발현 벡터 하나 이상의 용도에 관한 것이다.

바람직한 구현예에서, 사용되는 gp41 폴리펩타이드는 서열번호 19 또는 20으로 표시되며, 이는 비로솜에 결합된다.

다른 구현예에서, 본 발명은, 인간 면역결핍 바이러스의 gp41 단백질에 대하여 후천적인 면역 반응 및/또는 선천적인 면역 반응을 유도하도록 의도된 약제를 제조하기 위한, 접합체 형태, 더 바람직하게는 비로솜 형태인, 본 발명에 따른 하나의 폴리펩타이드, 삼량체, 발현 벡터 또는 접합체, 및 추가적인 항원의 용도에 관한 것이며, 상기 추가적인 항원은 바람직하게는 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6이다.

이러한 약학 조제물은 일반적으로 약리학적으로 허용가능한 농도의, 염, 완충화제, 항산화제, 보존제, 혼용가능한 담체, 하기에 기술된 보강제와 선택적으로 그외 치료 제제를 포함할 수 있다.

보강제

일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 접합체의 면역자극 효과는, 아마도 상기 폴리펩타이드 또는 접합체를 하나 이상의 보강제와 조합함으로써 증가시킬 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 비로솜 유사 소낭의 면역자극 효과는 상기 비로솜 유사 소낭에 하나 이상의 보강제를 조합하여 더욱 증가시킬 수 있다.

상기 보강제는 소낭의 지질 이중층 안에 캡슐화 및/또는 통합되거나, 및/또는 상기 소낭과 자유롭게 조합될 수 있다.

일 구현예에서, 비로솜 유사 소낭은 선천적인 면역 반응 및/또는 후천적인 면역 반응으로부터 선택되는 면역 반응을 증대 및/또는 매개하는 하나 이상의 보강제를 추가로 포함할 수 있다.

이용가능한 보강제는 항원 제시 세포(APC), 대식세포를 활성화하거나 및/또는 특정 세트의 림프구를 자극함으로써, 면역학적 반응을 강화할 수 있다.

본 발명에서 채택할 수 있는 보강제는 수지상 세포(DC), T 세포, B 세포 또는 그외 항원 제시 세포 내에서, 상에서 발현되는, 병원체 인지 수용체(PRR)를 활성화하는데 적합한 모든 리간드일 수 있다.

뉴클레오티드-결합성 올리고머화 도메인(NOD) 수용체 경로를 활성화시키는 리간드가 본 발명의 목적에 적합할 수 있다. 이러한 리간드로 적합한 보강제는, 무라밀 디펩타이드 유도체(muramyl dipeptide derivative)를 들 수 있다. 또한, Toll 유사 수용체(TLR)를 활성화하는 리간드도 본 발명의 목적에 사용할 수 있다. 이러한 수용체들은 PRR 패밀리에 속하며, DC, 대식 세포, 비만 세포 및 호중구 등의 다양한 선천적인 면역 세포 상에서 널리 발현된다.

TLR을 활성화시키는 리간드의 예로, TLR4의 경우 모노포스포릴 리피드 A, 3-0-탈아세틸화된 모노포스포릴 리피드 A, E. coli 유래의 LPS, 탁솔, RSV 융합 단백질 및 숙주 열 충격 단백질 60과 70을 들 수 있으며, TLR2의 경우, N-팔미토일-S-2,3(비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(라이실)₃-라이신, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 펩티도글리칸, 결핵균(M. tuberculosis)의 지단백질, 사카로마이세스 세레비지애(Sacharomyces cerevisiae)의 자이모산 및 포르피로모나스 긴기발리스(P. gingivalis)의 고도로 정제된 LPS를 들 수 있으며, TLR3의 경우, dsRNA를 들 수 있으며, TLR5의 경우, 플라젤린을 들 수 있고, TLR7의 경우 이미다조퀴놀린과 같은 합성 화합물을 들 수 있으며, TLR9의 경우, CpG가 다수 포함된 특정 DNA 유형을 들 수 있다. 본 발명에 유용한 그외 보강제로는 T 헬퍼 에피토프를 들 수도 있다.

T 헬퍼 에피토프는, 항원 제시 세포(APC)의 세포내 이입 경로(endocytic pathway)를 통해 단백질 분해에 의한 파괴 및 프로세스를 겪은 외인성 단백질로부터 일반적으로 파생되는 펩타이드이다. 이러한 세포에서, 주조직적합성 복합체 II형(MHC II)은 엔도좀내 그러한 펩타이드와 조합하게 된다. APC의 표면으로 이송된 이러한 컴플렉스는 T 림프구 CD4의 특이적인 T 세포 수용체와 상호작용하여, 이의 활성화를 유도할 수 있다. 헬퍼 에피토프에 의한, T 세포 반응은 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 Th1 및/또는 Th2 타입일 수 있다.

Th-지향성 반응의 에피토프의 예로는, pan DR 헬퍼 T 세포 에피토프(PADRE)를 들 수 있다. 이 에피토프는 친화성이 높은 가장 일반적인 HLA-DR 분자에 결합하여, 강력한 면역원으로 작용하도록 조작된 것이다. PADRE HTL 에피토프는 세포성 면역 반응을 자극하도록 설계된 백신의 효능을 증대시키는 것으로 확인되었다(Alexander J. et al., Immunol Res. 18, 1998, 79-92).

일 구현예에서, 본 발명의 비로솜 유사 소낭과 함께 사용될 수 있는 보강제는, 알루미늄 염, 알루미늄 포스페이트 겔, 미코박테리움, 예컨대 BCG, 미코박테리움 백케이(M. Vaccae) 또는 코리네박테리움 파붐(corynebacterium parvum), 펩타이드, 키홀 임페트 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 인터루킨-2 (IL-2), IL-12, GM-CSF, 케모카인 패밀리 유래의 리간드, 예컨대 RANTES (Regulated upon Activation Normal T cell Expressed and Secreted), 그람 박테리아의 지단백질, 효모 세포벽 성분, 이중 가닥 RNA, 그람<"> 박테리아의 리포폴리사카라이드, 플라젤린, U가 풍부한 단일가닥의 바이러스 RNA, CpG를 함유한 DNA, 억제자 6f 사이토카인 시그널링 소형 간섭 RNA(SOCS siRNA), 멜리틴 유래 펩타이드, pan DR 에피토프(PADRE) 및 이의 혼합물 중에서 선택할 수 있다.

이러한 조제물에는, 일상적으로 약리학적으로 허용가능한 농도의, 염, 완충화제, 항산화제, 보존제, 혼용가능한 담체, 앞서 언급된 보강제와 선택적으로 그외 치료 제제가 포함될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 접합체는 백신 형태로 투여할 약학 조제물의 제조에 이용할 수 있다. 당해 기술 분야의 모든 면역화 프로토콜 표준을 사용할 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 따른 항원성 또는 면역성 조성물은 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 접합체 또는 삼량체를 포함한다.

이를 포함하는 본 발명에 따른 약학 조제물은 주입에 의해 전신으로 또는 점막 경로에 의해 국소적으로, 또는 이의 조합으로 투여할 수 있다.

주입 경로는, 예컨대 복막내, 진피내, 피하, 혈관내 또는 근육내 경로일 수 있다.

생식기-비뇨기 경로, 예컨대 질 경로, 위-장 경로, 항문 경로, 호흡기 경로, 상부 점막 조직(upper mucosal tissue), 구강-코 경로 및 이의 혼합과 같은, 임의의 점막 경로를 사용할 수도 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 약학 조제물은 정제, 캡슐제(각각 정시 방출(timed release) 및 서방형(sustained release) 제형을 포함함), 환제, 산제, 과립제, 엘릭시르제(elixir), 팅크제, 용액제, 현탁제, 시럽제 및 에멀젼제와 같은 경구 투약 형태로 제공된다.

이러한 형태들 모두 약학 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 과제는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 이의 접합체를 이용하여, 인간에서, HIV 바이러스에 대한, 전신 IgA 및 IgG 면역 반응 및/또는 점막의 IgA 및 IgG 면역 반응을 유도하는 것이다. 점막 IgA는 전신 IgA 및 분비형 IgA 반응과 혼성될 수 있다. 다른 구현예에서. 본 발명의 과제는, HIV 트랜스사이토시스(transcytosis)를, 특히 생식기-비뇨관, 위-장관, 항문 경로, 호흡기 경로, 상부 점막 조직, 구강-코 경로 및 이의 조합 등의 점막 수준에서 저해하거나 낮추는 것이다.

본 발명의 내용에서, "후천적인 면역 반응"은 면역계 구성 성분의 활성화에 의존적이며, 항원이나 병원체에 대한 특이성 및 기억이 내포된, 면역 반응을 지칭하는 의도로 사용된다.

이러한 반응은 항원이나 병원체에 매우 특이적일 수 있으며, 항원이나 병원체와 이차로 나중에 직면하였을 때 더 효율적이다. 이러한 후천적인 면역 반응은 T 세포 또는 B 세포와 같은 림프구의 활성화에 의존할 수 있다.

본 발명의 내용에서, "선천적인 면역 반응"이라는 표현은, 비특이적인 인지 시스템에 의존한 반응으로, 항원이나 병원체가 다시 침입하더라도 달라지지 않는 반응을 지칭하는 의도로 사용된다.

이러한 시스템은, 예컨대 단핵구, 대식세포, 천연 살상(NK) 또는 천연 살상 T(NKT) 세포 등의 면역 세포에 의지할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 접합체는 인간 면역결핍 바이러스의 gp41 단백질에 대해 후천적인 면역 반응 및/또는 선천적인 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은, 또한, 모두 본 발명에 따른, 본 발명의 gp41 폴리펩타이드, 이의 삼량체, 이의 접합체 또는 상기에서 정의된 수계 조성물을, 유효량으로 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 적어도 포함하는, HIV 감염에 대한 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다.

HIV의 치료 및/또는 예방 방법에 대한 일 구현예에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 접합체는, 전술한 바와 같이, 주입에 의해 투여되거나, 점막 경로에 의해 국소 투여되거나, 또는 이의 조합으로 투여된다.

상기한 점막 경로는 생식기-비뇨관, 위-장장, 항문 경로, 호흡기, 상부 점막 조직, 구강-코 경로 및 이의 조합으로부터 선택된다.

보다 구체적인 측면에서, 본 발명의 방법에서는, 폴리펩타이드는 전술한 바와 같이 gp41 유래 항원과는 구분되는 추가적인 항원과 조합하여 투여된다. 이와 같이, 바람직한 방법은, 하나 이상의, 서열번호 19 또는 20에 기술된 제1 gp41 유래 항원, 또는 이의 유사체, 및 서열번호 4 또는 5에 기술된 제2 gp41 유래 항원 또는 이의 유사체를 투여하는 단계를 적어도 포함한다.

다른 측면에서, 또한, 본 발명은, 접합체 형태, 보다 바람직하게는 본 발명의 비로솜 또는 비로솜 유사 소낭 형태인, 하나 이상의 제1 gp41 유래 항원과, 접합체 형태, 보다 바람직하게는 본 발명의 비로솜 또는 비로솜 유사 소낭 형태인, 하나 이상의 제2 gp41 유래 항원을 포함하며, 상기 제1 gp41 유래 항원과 상기 제2 gp41 유래 항원은 서로 상이한, 인간 면역결핍 바이러스의 gp41 단백질에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 키트에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 제1 gp41 유래 항원은 서열번호 19 또는 20의 펩타이드 또는 이의 유사체이고, 제2 gp41 유래 항원은 서열번호 4 또는 5의 펩타이드 또는 이의 유사체이다.

본 발명은 이하 실시예를 들어 더욱 이해될 것이나, 하기 실시예들은 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

도 1 : 클레이드 B, HxB2 균주의 HIV-1 외막 당단백질 gp41의 구조 도식도로서, 공지되어 있는 에피토프, 동정된 클러스터와 영역들이 표시되어 있다. ○은 불변 아미노산이고, 연회색 원은 고도고 보존된 아미노산이고, 중간 밝기의 회색 원은 중간 수준의 가변적인 아미노산이고, 검은 원은 다른 클레이드에 비해 하나의 클레이드에서 불변적인 아미노산과 현저하게 더 가변적인 아미노산이며, 이들은 진한 윤곽의 원들로 나타내었다. MPER 영역 부분은, 스펙트럼이 넓은 중화 항체 2F5와 4E10에 대한 에피토프를 포함하고 있으며, 본 발명의 P1 펩타이드에 존재하는 부분으로서, 좌측 하단에 나타나 있는데, 이 부분은 본 발명의 gp41 폴리펩타이드에는 없다. 본 발명의 gp41 단백질 구조체에서는, 클로스터 1의 아미노산이 링커로 치환된다.
도 2 : gp41에 대한 단일클론 항체인 MAb 98.6(좌)와 항-IL2 항체인 AF-202(우측)에 대한, 야생형 gp41 및 유도체의, 교차 반응성.
도 3 : gp41-비로솜 및 P1-비로솜을 근육내 주사하여 면역화한, 머카크 원숭이(원숭이 G2.1 - 2.6)의 혈청 샘플에서의 IgA를, 비로솜을 근육내와 코내 주사를 조합 실시하여 면역화한 머카크 원숭이(G3.1 - 3.6)의 혈청과, 비교하여 나타낸 것이다. 그룹 1 (G1.1-1.6, 위약)은 대조군으로, 이들 동물들은 HIV 항원이 미함유된 플레인 인플루엔자 비로솜을 근육내 주사하여 면역화하였다. 데이타는 24주에 수집한 혈청 데이타이며, 면역 전의 백그라운드(0주) OD 값을 24주의 OD 값에서 제하였다(w24-w0). 샘플 희석 1:300.
도 4 : gp41 비로솜과 P1 비로솜 혼합을 근육내 주사에 의해 면역화한 마커크 원숭이(원숭이 G2.1 - 2.6)의 혈청 샘플에서 측정한 IgG를, 비로솜을 근육내와 코내 주사를 조합 실시하여 면역화한 머카크 원숭이(G3.1 - 3.6)의 결과와, 비교하여 나타낸 것이다. 그룹 1 (G1.1-1.6, 위약)은 대조군으로, 인플루엔자 비로솜을 근육내 주사하여 면역화하였다. 데이타는 24주에 수집한 혈청 데이타이며, 면역 전의 백그라운드(0주) OD 값을 24주의 OD 값에서 제하였다(w24-w0). 샘플 희석 1:900.
도 5: SHIVSF162P3 클레이드 B를 질내 감염시키는 과정 중과 이후의 바이러스 혈증. 화살 표시는, 4번의 백신 접종을 모두 마치고, 한달 후에 개시한, 20-30 TCID₅₀로 질을 통해 13번 기회 감염시킨 것을 나타내며, 첫 감염시킨 이후의 경과 일을 사선으로 숫자로 표시하였다. 혈장내 바이러스의 로드(load)는 각각의 동물에 대해 선들로 나타내며, mL 당 2.5 x 10³카피수의 검출 한계는 직선으로 표시하였다. 기호가 있는 선들은 각 동물을 나타낸다. 그룹은 도 3 및 4와 같다.
도 6: 경부질(cervicovaginal) 분비물(CVS)에 의한 HIV의 상피 세포를 통과하는 트랜스사이토시스의 저해. 패널 A: HIV-1 균주 93BR029 (클레이드 B) 패널 B: HIV-1 균주 92BR025 (클레이드 C). ■: CVS 1:6 희석으로 사용, □: 1:10으로 사용. gp41에 대한 특이적인 IgA 항체가 없는 경우, HIV-1의 트랜스사이토시스 능력은 >100%로 효과적이었지만, 특이적인 IgA 항-gp41 항체의 존재시, 트랜스사이토시스를 CVS 1:6 희석에서 >40%로 낮출 수 있다.
도 7: IgA이 고갈되거나 고갈되지 않은, CVS 분비물에 의한, 상피 세포를 통한 트랜스사이토시스의 저해. ■: 고갈시킨 경우, ▨: 고갈시키지 않은 경우. CVS에 점막 IgA 항체가 포함되어 있는 경우, HIV-1의 트랜스사이토시스의 저해를 관찰할 수 있었다. CVS에서 IgA를 고갈시키면, 트랜스사이토시스의 저해가 없어졌다.
도 8: 패널 A: 백신접종하지 않은 원숭이에게, 균주 SHIV1157ipd3N4를 이용하여 클레이드 C 바이러스 기회 감염시킨 이후의 바이러스 혈증
패널 B: 클레이드 B 유래의 gp41 유래 항원의 비로솜을 백신 접종하고(실시예 6의 그룹 3), SHIV1157ipd3N4 균주를 이용하여 SHIV 클레이드 C를 기회 감염시킨 원숭이의 바이러스 혈증. 4번의 백신 접종을 수행한 후 8개월 후에, 동물에게 부스트 접종하고, 5주 후, 10-20 TCID₅₀으로 10번 질내 기회 감염시켰다. 혈장내 바이러스 로드는 각 동물에 대한 선으로 표시하고, 검출 한계는 mL 당 10³ 카피수이다.

실시예

실시예 1 :

분자 생물학적 방법에 의한, 서열번호 28 및 서열번호 21로 코딩되는 본 발명의 폴리펩타이드( rgp41 ) MO 및 M1 의 구축

a) 제 1 단계: gp41 - dloop (서열번호 27)의 구축

gp41-delta loop를 PCR로 구축하였다.

프라이머 설계

올리고뉴클레오티드 프라이머 gp41-Nde (서열번호 22) 및 올리고뉴클레오티드 프라이머 gp41-Bam1 (서열번호 23)를 사용하여, N-나선을 증폭시키고, 소수성 링커를 도입하였다. 이들 올리고뉴클레오티드 프라이머들은 각각 제한 효소 NdeI 및 BamHI 부위를 각각 도입하도록 설계되었다. 또한, 올리고뉴클레오티드 프라이머 gp41-Bam1은, 올리고펩타이드 링커 SGGRGGS (서열번호 16)를 도입하여, loop의 결손된 부분을 치환하게 설계되었다.

올리고뉴클레오티드 프라이머 gp41-Bam2 (서열번호 24)과 올리고뉴클레오티드 프라이머 gp41-XhoI (서열번호 25)을 사용하여 PCR로 gp41의 C-나선을 증폭하였다. 이들 올리고뉴클레오티드 프라이머들은 각각 BamHI과 XhoI 제한효소 부위를 도입하도록 설계되었다.

PCR 조건

상기 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 이용하여 PCR하여, gp41 매트릭스(서열번호 26)로부터 gp41dloop 폴리뉴클레오티드를 증폭하였다. 플라스미드는 0.5 ㎍/㎕로 사용하였고, 프라이머는 각각 10 μM로 사용하였고, dNTP는 각각 10 mM로 사용하였다. 증폭은, Finnzymes 사의 DNA 중합효소인 DyNazyme를 이용하여 수행하였다. 증폭은, 변성 단계: 94℃에서 5분으로 개시한 후, 94℃에서 1분(변성 단계) -> 60℃에서 1분(혼성화) -> 72℃에서 1분(연장)으로 이루어진 사이클을 30회 반복한 다음, 72℃에서 10분의 마지막 단계로 증폭을 종결지었다. 정제한 PCR 산물을 pET21b에 삽입하기 위해 NdeI (Ozyme, R0111S)과 XhoI (Ozyme, R0146S)로 절단하였다. NdeI과 XhoI으로 자른 pET21b 벡터(Novagen)를 추출하여 정제하였다. 라이게이션은 제조사의 설명에 따라 Quick ligation kit (New England Biolabs)를 이용하여 수행하여, pET21b- gp41dloop를 제조하였다.

pET21b-gp41dloop 산물을 DH5-α(Invitrogen)에 형질전환하였다.

b) 제 2 단계: M0 폴리펩타이드(본 발명의 rgp41)를 코딩하는 M0gp41C -dloop 클레이드 B(서열번호 28)의 구축

Phusion 중합효소 (Finnzymes)를 이용하여, 기질 GP41dloop (서열번호 27)에 대해 2번의 PCR을 수행하여, M0gp41C_CladeB 구조체를 수득하였다. 1차 반응은 프라이머 GP41B-C-D1 (서열번호 29)과 GP41B-C-R2 (서열번호 30)를 이용하여 수행하였다.

2차 반응은 프라이머 GP41B-C-D1 (서열번호 29)과 GP41B-C-R1 (서열번호 31)을 이용하여 수행하였다.

Gp41C_CladeB 코딩 유전자를 pET30b (VWR, 69910-3)에 삽입하기 위해, PCR 양성 산물을 NdeI (Ozyme, R0111S) 및 XhoI (Ozyme, R0146S) 제한효소로 잘랐다. pET30b 벡터도 NdeI과 XhoI 제한효소 (Ozyme)로 잘랐다. Gp41C_CladeB 유전자에 해당되는 DNA 단편과, pET30b에 해당되는 DNA 단편을 (Macherey-Nagel 사의 추출 키트, 740　609　250을 이용하여) 추출 및 정제하였다. 이들 2개의 단편을 Quick ligation kit (New Englands Biolabs Inc, M2200S)를 이용하여 연결하였다. 라이게이션 혼합물 1 ㎕를 사용하여, E. coli DH5-α (Invitrogen, 12297-016)에 형질전환하였다. 형질전환체를 30 ㎍/mL의 카나마이신이 첨가된 LB 아가 플레이트에서 분리하였다. 분리한 콜로니는 30 ㎍/mL의 카나마이신이 첨가된 LB 배지 4 mL에 접종하였다. 37℃에서 180 rpm으로 교반하면서 밤새 배양하였다. Macherey-Nagel 사의 뉴클레오스핀 플라스미드 추출 키트, Ref. 740588-250을 이용하여 해당 프로토콜에 따라, 각각의 펠렛으로부터 DNA를 추출하였다. 이를 제한효소 절단으로 분석하고, T7prom (서열번호 32) 및 T7term (서열번호 33) 프라이머를 이용하여, 삽입체를 서열분석하였다.

M0gp41dloop-C CladeB의 전체 뉴클레오티드 서열을 확인하고, 서열번호 28로 나타내었다.

c) 제 3 단계: M1 폴리펩타이드(본 발명의 rgp41)를 코딩하는 M1gp41C -dloop clade B (서열번호 21)의 구축

PCR에 의해 M1gp41C-dloop clade B를 구축하였다. 매트릭스 Gp41dloopC_CladeB (서열번호 28)에 대해 Phusion 중합효소 (Finnzymes)를 이용한 2번의 PCR을 수행하여, M1gp41C-dloop clade B를 수득하였다.

1차 반응은 프라이머 GP41B-C-D1 (서열번호 29)과 GP41-C3-R1 (서열번호 34)로 수행하였다.

2차 PCR 반응을 수행하기 전에, 뉴클레오스핀 추출 키트(Macherey Nagel, 740609250)를 이용하여 정제를 수행하였고, 프라이머 GP41B-C-D1 (서열번호 29)과 GP41-C3-R2 (서열번호 35)를 사용하였다.

M1gp41dloop-C CladeB 코딩 유전자를 pET30b (VWR, 69910-3)에 삽입하기 위해, PCR 양성 산물을 NdeI (Ozyme, R0111S)과 XhoI (Ozyme, R0146S) 제한효소로 절단하였다. pET30b 벡터도 NdeI과 XhoI 제한효소 (Ozyme)로 절단하였다. M1gp41dloop-C CladeB 유전자에 해당되는 DNA 단편과 pET30b에 해당되는 DNA 단편을 (Macherey-Nagel 사의 추출 키트 740　609　250을 이용하여) 추출하고 정제하였다. 이들 2개의 단편을 Quick ligation kit (New Englands Biolabs Inc, M2200S)를 이용하여 연결하였다. 라이게이션 혼합물 1 ㎕를 사용하여, E. coli DH5-α (Invitrogen, 12297-016)에 형질전환하였다. 형질전환체를 30 ㎍/mL의 카나마이신이 첨가된 LB 아가 플레이트에서 분리하였다. 분리한 콜로니는 30 ㎍/mL의 카나마이신이 첨가된 LB 배지 4 mL에 접종하였다. 37℃에서 180 rpm으로 교반하면서 밤새 배양하였다. Macherey-Nagel 사의 뉴클레오스핀 플라스미드 추출 키트, Ref. 740588-250을 이용하여 해당 프로토콜에 따라, 각각의 펠렛으로부터 DNA를 추출하였다. 이를 제한효소 절단으로 분석하고, T7prom (서열번호 32) 및 T7term (서열번호 33) 프라이머를 이용하여, 삽입체를 서열분석하였다.

M1gp41dloop-C CladeB의 전체 뉴클레오티드 서열을 확인하고, 서열번호 21로 나타내었다.

실시예 2 : E. coli 에서 변이 폴리펩타이드의 생산

a) 형질전환

pET30b- M0gp41dloop-C Clade B 또는 pET30b- M1gp41dloop-C Clade B 플라스미드를 발현 균주 E. coli BLR (DE3)에 형질전환하였다. M1gp41dloop-C와 M0gp41dloop-C Clade B의 발현은 T7 프로모터에 의해 유도하였다.

b) 발현 검사

pET30b- M1gp41dloop-C CladeB 또는 pET30b- M0gp41dloop-C Clade B 플라스미드를 가지고 있는, E. coli BLR (DE3) 균주 6종을 30 ㎍/mL의 카나마이신이 첨가된 LB 배지에서 37℃에서 600 nm에서의 광학 밀도(spectrophotometer Jasco V-530)가 0.6이 될 때까지 배양하였다. 변형된 폴리펩타이드는 1 mM IPTG (이소프로필 BD-티오갈락토시드)로 유도하였고, 37℃에서 2시간 더 계속 배양하였다. 단백질의 발현은 SDS-4-12% PAGE에서 분리시켜 체크하였다.

c) 생산

1) 배양

BL21 (DE3)/ pET30b-M1gp41dloop-C CladeB 또는 (DE3)/ pET30b-M0gp41dloop-C CladeB 배양물은 600 nm에서의 광학 밀도가 0.6이 될 때까지, LB 배지에서 37℃에서 배양하였다. gp41-조작된 루프의 발현은 1 mM IPTG로 유도하였고, 37℃에서 2시간 더 계속 배양하였다. 배양물을 원심분리(Centrifuge Beckman Coulter Avanti J20XP, rotor JLA 8-1000, 4000 x g, 30분, 4℃)하고, 펠렛을 - 80℃에 보관하였다.

2) M0 또는 M1 rgp41 변이 폴리펩타이드의 추출

펠렛을 초음파처리 완충액 (40 mL의 Tris-HCl 50 mM pH8, NaCl 300 mM)에 재현탁하였다. 박테리아는 15분간 얼음/에탄올 상에서 초음파 처리(분쇄기 UP200S 진폭 80%, 계수 0.5)하여 파괴하였다. 그 후, 현탁물을 4℃에서 30분간 40 000 x g로 원심분리하여, 불용성 단백질(펠렛)로부터 가용성 단백질(상층액)을 분리하였다(Centrifuge Beckman Coulter Avanti J20XP, rotor JA20).

d) M1 rgp41 변이 폴리펩타이드의 정제

1) 친화성 크로마토그래피

M1 (M1gp41dloop-C CladeB에 의해 코딩됨, 서열번호 21)의 정제 제1 단계는, 플라스크 배양물 1 L 당 1 mL 매질의 컬럼 부피로 XK16/20 컬럼 (GE Healthcare)에 충전된 Ni Sepharose^TM 6 패스트 플로우 매질 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 특정 스페이서 펩타이드 S는 MO 또는 M1의 가용성 분획을 회수하기 위한 포획 단계로서 친화성 크로마토그래피를 이용할 수 있었다. 이는, 단백질의 낮은 생산성으로 인한 것이었다. 컬럼을 완충액 Na-포스페이트 50 mM pH7.5, NaCl 300 mM, 베타-머캅토에탄올 5 mM로 평형화하였다. Na-포스페이트 50 mM pH7.5, NaCl 300 mM, 베타-머캅토에탄올 5 mM, MgCl₂ 2 mM, 루펩틴(Leupeptine) 및 펩스타틴 0.1 mM 중의 M1 폴리펩타이드의 맑은 용액 샘플을 컬럼 상에 1 ml/분으로 주입하였다. 그런 후, 컬럼을 평형 완충액으로 헹군 다음, 용출 단계로 25 mM, 50 mM 및 150 mM의 이미다졸로 용출시켰다. M1 gp41은 완충액 Na-포스페이트 50 mM pH7.5, NaCl 300 mM, 베타-머캅토에탄올 5 mM, 이미다졸 300 mM을 4 mL/분으로 사용하여 용출시켰다. 친화성 크로마토그래피의 모든 분획에 Tween^®20을 최종 농도 0.05%로 첨가하고, 완충액 Na-포스페이트 50 mM pH7.5, NaCl 300 mM, TCEP 1 mM, Tween20 0.05% 중에서 느리게 자기 교반시키면서 4℃에서 밤새 투석하였다. 그런 후, 샘플을 Amicon 10kDa 농축 유닛 (Millipore)에서 원심분리하여, 3번 농축하였다.

2) 크기 배제 크로마토그래피

M1의 제2 정제 단계는 컬럼 부피 320 ml로 Superdex^TM 200 Prep 등급의 매질이 충진된 K26/60 컬럼 (GE Healthcare)을 이용한 크기 배제 크로마토그래피로 수행하였다. 컬럼을 완충액 Na-포스페이트 50 mM pH7.5, NaCl 300 mM, TCEP 1 mM, Tween20 0.05%로 평형화하였다. Na-포스페이트 50 mM pH7.5, NaCl 300 mM, TCEP 1 mM, Tween20 0.05% 중의 M1을 상기 컬럼에 1.5 ml/분으로 주입하고, 2.5 ml/분으로 평형 완충액으로 용출시켰다. 교정 곡선에 따라, 단백질은 가용성 삼량체로 용출되었다. 즉, M1 또는 M0의 C-말단 부분에 시스테인 잔기가 포함된 스페이서가 존재하더라도 단백질의 입체 구조 상태는 변형되지 않는다.

실시예 3 : 교차 반응성

니트로셀룰로스막에 4종의 단백질을 점적하였다: Tris 50 mM pH 8, NaCl 200 mM, Triton X-100 0.1%, 0.1 mg/ml 중의 wt gp41-HA (HA 테그가 융합된 천연 gp41(GenBank AF348176)), Tris 50 mM pH 8, NaCl 200 mM, glycerol 5%, 0.2 mg/ml 중의 Gp41-delta loop (서열번호 38, 클러스터 I에서 25개의 잔기가 서열번호 16의 링커로 치환되어, 도 1의 천연 gp41 단편과 상이함), Tris 50 mM pH 8, NaCl 200 mM, 이미다졸 200 mM, 글리세롤 5%, 0.2 mg/ml 중의 Gp41-조작된 loop (서열번호 37, 클러스터 I에서 12개의 잔기가 서열번호 16의 링커로 치환되어, 도 1의 천연 gp41 단편과 상이함), Tris 50 mM pH 8, NaCl 200 mM, 0.1 mg/ml 중의 인간 재조합 IL-2, 및 음성 대조군 (소 혈청 알부민), (도 2).

상기 막을 37℃에서 인큐베이션한 다음, 이를 20 ml의 PBS Tween 0.3%, 5% 밀크에 넣고 다시 1시간 교반하에 두었다. 여기에 98.6 D (영국 NIBSC 사의 항-GP41 인간 단일클론 항체) 및 AF-202 (R & D systems 상의 항-인간-IL-2 항체) 항체들을 각각 최종 농도 0.05 ㎍/ml 또는 0.5 ㎍/ml로, 20 ml의 PBS/Tween 20 0.3% - 5% 밀크 중에 첨가하여, 1시간 동안 교반하에 두었다. 항-IgG 퍼옥시다제 커플링된 항체를 적절한 농도로 20 ml의 PBS Tween 0.3%, 밀크 5% 중에 첨가하여 1시간 동안 교반한 다음, 블롯을 각각 15분간 PBS Tween 0.3%로 3번 헹구었다. 그런 후, 퍼옥시다제 활성을 시판되는 보강된 화학발광 키트(Amersham)를 이용하여 드러낸 후, 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 블롯을 코닥 필름에 노출시켰다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 천연 Gp41은 항-인간 IL-2 항체에 의해 강하게 인지되지만, 클러스터 I에서 잔기 25개를 치환하면 인간 항-IL-2 항체에 의한 단백질의 인지성은 사라지며, 클러스터 I에서 잔기 12개를 치환하면 인간 항-IL-2 항체에 의한 반응성은 일부 사라지며, 재조합 인간 IL-2는 예측한 바와 같이 AF-202 항-IL-2 항체에 의해 강하게 인지된다. 그러나, 잔기 12개 또는 25개를 링커로 치환하더라도 항-gp41 단일클론 항체 98.6의 인지에는 영향을 미치지 않았다.

실시예 4 : rgp41 폴리펩타이드의 가용성 테스트

본 발명에 따른 gp41 폴리펩타이드를 발현하는 E.coli 배양물을 15분간 4℃에서 4,000g로 원심분리하였다. 펠렛을 다량의 세포용해 완충액: 포스페이트 50 mM pH 7.5, NaCl 300 mM, MgCl₂ 2mM, 베타-머캅토에탄올 5 mM, 벤조나제 1 μM, 펩스타틴 1 μM, 루펩틴 1 μM에, OD 600 nm = 10이 되도록 현탁하였다. 이 용액을 30분간 4℃에서 인큐베이션하였다. 세포 용해는 3회 주기의 동결/해동으로 수행하였다. 가용성 단백질과 불용성 단백질을 30분간 4℃, 21000g에서 원심분리하여 분리하였다. 단백질 10 ㎕를, 4-12% SDS-PAGE 전기영동 후 코마시 블루로 염색하여, 발현 수준과 용해도 수준을 분석하였다. rgp41 폴리펩타이드는 상층액에 존재하는 것으로 확인되었다. 즉, 단백질은 가용성이다.

실시예 5 : E. Coli 에서 발현되어 외면 상에 gp41 폴리펩타이드를 제시하는 비로솜 유사 소낭의 제조 및 외면 상에서 합성 펩타이드를 제시하는 비로솜의 제조( P1 - 비로솜 )

기본적으로 WO 2007/099387에 기술된 바와 같이 비로솜 유사 소낭을 제조하였다. 간략하게는, 인플루엔자 A/Singapore/6/86 바이러스를 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 발육란에서 배양하여 베타-프로피오락톤으로 불활성화하였다. 바이러스를 포스페이트 완충화된 염수(PBS) 중의 100 mM 옥타에틸렌글리콜모노데실에테르(OEG)에 용해하고, 초원심분리에 의해 바이러스 뉴클레오캡시드를 제거하였다. 헴어글루틴 4 mg이 함유된 가용화된 막을 100 mM OEG가 포함된 PBS 2 ml에 용해시킨 난 포스파티딜콜린(PC) 32 mg 및 포스파티딜에탄올아민(PE) 8 mg과 혼합하였다. 인지질 및 헴어글루티닌 함유 용액을 상기와 같이 혼합하고, 1분간 초음파 처리하였다. 이 용액을 1시간 동안 100,000g로 원심분리하고, 바이러스 막 조제물/지질 혼합물을 여과에 의해 멸균하였다.

C-말단 부분에 스페이서와 시스테인 잔기가 있는 본 발명의 폴리펩타이드(서열번호 19)에, 말레이미도-숙신이미드 링커를 통해 포스파티딜에탄올아민(PE)의 위치 이성질체를 N-말단부에 하기와 같이 접합하였다.

포스파티딜에탄올아민(PE)을 메탄올에 용해하고, 0.1% (v/v) 트리에틸아민을 첨가하였다. 그런 다음, 용액을, 미리 디메틸설폭사이드(DMSO)(20 ml)에 용해시킨, 이형의 2가지 기능성을 갖춘 교차-링커 N-[감마]-말레이미도부티릴옥시-숙신이미드-에스테르(GMBS)(Pierce Chemical Company, Rockford, IL)와 혼합(비율 PE: GMBS = 5:1)하였다. 실온에서 30분간 인큐베이션한 다음, 스피드백 원심분리기에서의 진공 하에 1시간 동안 용매를 증발시켰다. 그 후, GMBS-PE를 100 mM 옥타에틸렌글리콜(OEG) (Fluka Chemicals, Switzerland)이 함유된 PBS(PBS-OEG) 1 ml에 용해하고, C-말단 위치에 시스테인 잔기를 가지고 있는 세그먼트 S를 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드(서열번호 19)를 첨가(비율 PE-GMBS:폴리펩타이드 = 5:1)하였다. 이 단계에서, 포스파티딜에탄올아민-GMBS의 말레이미드가 gp41의 유리형 C-말단 시스테인의 설프하이드릴기와 반응하게 된다. 30분간 인큐베이션한 후, 과량의 유리 시스테인을 첨가하여, 유리형 GMBS로 남아있는 것을 모두 퀀칭하였다(비율 시스테인:GMBS = 10:1).

지질-접합된 폴리펩타이드를, 전술한 바와 같이, 헴어글루티닌 mg 당 rgp41 1 mg의 비율의 헴어글루티닌-함유성 바이러스 막 조제물/지질 혼합물을 첨가하였고, SM-2 바이오비드(BioRad, Glattbrugg, Switzerland) 상에서 디터전트를 제거하여 rgp41-비로솜을 형성시켰다.

마찬가지로, 서열번호 5 (SQTQQGKNEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIKLSC (카르복시메틸(1,3-디팔미토일-글리세로-2-포스파티딜에탄올아미노))-OH의 아미노산 서열을 가지는, 지질-연결된 합성 펩타이드 P1을, 당해 기술 부야에 공지된 바와 같이, 고상 Fmoc에 의해 TFA 염 SQTQQGKNEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIKLS-하이드록실시스테인으로 합성하였고, 이를 브로모아세틸-포스파티딜에탄올아민을 이용하여 이의 C-말단에 있는 하이드록실시스테인을 통해 포스파티딜에탄올아민과 연결시켰다. 분취용 HPLC로 정제하고, 이온 교환에 의해 이의 아세테이트 염을 제조한 다음, 펩타이드를 동결건조한 후, PBS-OEG에 용해시켜, 바이러스 헴어글루티닌 mg 당 P1 5 mg 비율로 바이러스 막 조제물/지질 혼합물과 혼합하고, 디터전트를 제거하여, P1-비로솜을 만들었다.

실시예 6 : 본 발명의 rgp41 비로솜 유사 소낭 및 본 발명의 P1 - 비로솜을 포함하는 백신 조성물을 이용한 머카크의 면역화

전술한 바와 같이 rgp41 폴리펩타이드를 포함하는 비로솜 유사 소낭을 포함하는 백신 조성물과, 외표면에 위치한 gp41 유래의 항원 펩타이드 P1이 포함된 비로솜 유사 소낭을 포함하는 백신 조성물을 이용한, 머카크의 면역화를 하기와 같이 수행하였다.

평균 연령 약 5세의 암컷 머카크 5마리로 구성된 3개의 그룹을 사용하였다. 백신의 1차 투여하기 4주 전에, 머카크들 모두에게는 베타-프로피오락톤으로 불활성화한 인플루엔자 A Singapore 6/86을 근육내 주사(100 ml, 0,01 mg/ml)하였다. 그 후, 0, 7, 15 및 24주에, 비로솜 유사 소낭 수용액(P1 비로솜 40 mg 및 rgp41-비로솜 40 mg, 100 ml)을 이용한 머카크 백신 접종을 수행하였다. 그룹 1 (원숭이 G1.1 - G 1.6)에는 gp41 항원이 무첨가된 인플엔자 비로솜(위약)을 투여하였다. 그룹 2 (G2.1-2.6)에는 매번 백신 접종시 P1- 비로솜과 gp41-비로솜 둘다를, 근육내 백신 접종하였고, 그룹 3 (G3.1-3.6)에는 P1-비로솜과 gp41-비로솜 둘다를 근육내 백신 주사 2회(0주 및 7주) 실시한 다음, 스프레이제로서 코내 백신 접종(15주 및 24주)하였다. 그룹 3에서 동물 1마리(3.2)가 백신과는 무관한 이유로 죽었다.

각 백신 접종 시기에 혈청 샘플을 취하였다.

혈청내 총 IgA 및 IgG 항체 수준을 하기 ELISA 프로토콜에 따라 측정하였다. 중탄산 완충액 50 mM(pH 9.6) 중의 펩타이드 P1 (서열번호 5, 100 ng/100 ㎕/웰), 또는 본 발명의 rgp41 (서열번호 19, 100 ng/100 ㎕/웰)을 이용하여, ELISA 플레이트(Nunc)를 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 BSA 2% PBS Tween 0.1%로 포화시킨 다음, PBS-Tween 0,1% 완충액으로 헹구었다. PBS Tween 0.1%를 사용하여 IgA에 대해 1/300 또는 IgG에 대해 1/200으로 희석한 혈청을 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 PBS Tween 0.1% 완충액으로 헹구었다. 머카크 IgG를 검출하기 위해, 바이오틴이 커플링된 항-머카크 IgG 염소 항체(Rockland) (1/15000)를 사용한 다음 1/50,000으로 희석한 스트렙타비딘-HRP(Immunotech)과 인큐베이션하였다.

머카크 IgA를 검출하기 위해, 바이오틴이 커플링된 항-머카크 IgA 염소 항체(Rockland)(1/15 000)를 이용하고, 1/50 000 희석의 스트렙타비딘 HRP (immunotech)과 인큐베이션하였다.

2F5-IgA 단일클론 항체를 양성 대조군으로 사용하였는데, 항-인간 IgA 바이오틴-표지된 염소 Fab'2, (0.14 mg/ml 최종) (Caltag H 14015)와 인큐베이션한 다음, 스트렙타비딘-HRP (1/50,000)을 이용하여 검출하였다. 2F5-IgG 단일클론 항체를 양성 대조군으로 사용하였는데, 이를 바이오틴화된 항-인간 IgG 염소 Fab'2 (0.1 mg/ml 최종)(Rockland 609106123)와 인큐베이션한 다음, 스트렙타비딘-HRP (1/50,000)을 이용하여 검출하였다. 항체들은 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 비색 반응은 기질 TMB를 첨가하여 개시하였고, H₂PO₄ 1M을 첨가하여 정지시켰다. 광학 밀도(OD)를 450 nm에서 판독하였다.

그 결과는 도 3(혈청내 gp41-특이적인 IgA)과 도 4(혈청내 gp41-특이적인 IgG)에 나타낸다. 그 결과, 근육내 백신 접종받은 암컷 머카크의 경우 혈청내 특이적인 IgG 및 IgA 항-gp41 항체의 수준이 높은 것으로 나타났다. 즉, 면역화한 암컷 머카크의 혈액에서 IgG와 IgA 항체의 존재가 확인되었다. 이러한 결과는, IgA를 이용한 면역 반응을 본 발명의 백신으로 수득할 수 있음을 의미한다.

백신 접종이 점막 면역성을 유도하였는지를 조사하기 위해, 항생제 및 프로테아제 저해제가 포함된 3 ml PBS를 도입함으로써, 실시예 6의 백신 접종한 동물 모두로부터 24주에 자궁 경부-질 샘플을 취하였다. 이 샘플을 원심분리하여 찌꺼기를 제거하고, 분액하여 즉시 순간-동결시켜, -80℃에 보관하였다. 전술한 바와 같이 ELISA에 의해 점막 P1 항체를 측정하고, 동시에 클레이드 B 항-gp41 항체를 Tudor et al., 2009, Mucosal Immunol. 2, 412-426에 기재된 바에 따라 측정하였다. 결과는 표준 편차에 2배의 항체를 가지고 있는 동물의 수로 나타내었고, 이를 비슷한 방식으로 나타낸(표 1) 혈청 항체 측정값과 비교하였다. 원숭이 3.2의 혈청은 분석에서 제외시켰다.

		혈청			CVS
항원	항체	그룹 1	그룹 2	그룹 3	그룹 1	그룹 2	그룹 3
P1	IgA	0/6	2/6	0/5	0/6	3/6	4/5
P1	IgG	0/6	6/6	0/5
gp41	IgA	0/6	6/6	4/5	0/6	2/6	2/5
gp41	IgG	0/6	6/6	3/5	0/6	2/6	3/5

아울러, 심지어 점막 보강제가 첨가되지 않은 조건에서 근육내 주사로 백신 접종한 후에도, IgA와 IgG 항체가 생식기 관에서도 유도되었고, IgA는 장 구획에서도 검출되는 것으로 관찰되었다.

실시예 7 : 백신 접종받은 머카크의 이종 감염에 대한 방어

실시예 6의 원숭이에게 하기와 같이 생 바이러스를 기회 감염시켰다: 마지막 백신 접종하고 4주 후, 4 - 7일마다 13번 질내로 SHIVSF_162P3 저용량(20-30 TCID₅₀)을 도 5에 나타낸 바와 같이 감염시켰다. 이 키메라 simian/clade B 인간 면역결핍 바이러스는 벡본으로서 병원체 SIVmac239를 가지고 있으며, HIV-1SF162P3으로부터 유래된 env (gp120+gp41), tat, rev 및 vpu 유전자들이 포함되어 있다. 이 바이러스는, 본 발명의 gp41-구조체와 본 발명의 P1 펩타이드의 기원인 X4 트로픽 HxB2 균주와는 다르게 수용체 CCR5를 인지한다. 따라서, 상기한 감염은 이종 바이러스를 이용하여 이루어진다. 이 바이러스는 PBS 2 ml 중의 형태로 NIAID (National Institute of Allergy and Infectious diseases), NIH (National Institutes of Health) Bethesda, USA)로부터 제공받았다.

도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 백신 접종 받지 않은 원숭이(위약, 그룹 1)는 바이러스에 빠르게 감염되어, 예상한 바와 같이, 2주 이내에 혈장내 바이러스 최대 수준 거의 10⁶ - 10⁷카피수/ml에 도달하였다(Hessell, A.J. et al. Nat. Med. 15, 951-959). 그룹 2(근육내 백신 접종)의 경우, 원숭이 50%는 예방되었다. 그룹 3(근육내/코내 접종)의 경우에는, 동물들 모두 예방되었는데, 1마리(no. 3.3)는 반응이 지연되어, 약 1주일 동안 800 카피스/ml의 낮은 바이러스 혈증을 보였고, 나중에 음성이 되어, 이를 검증하기 위해, 샘플 분석을 더 낮은 검출 역치에서 반복 실시하였다(도 5). 그룹 3에서 동물 1마리가 감염과는 무관한 이유로 죽었다. 이러한 데이타는, 비록 그룹 3에서 낮은 전신 중화 항체 수준이 나타났음에도 불구하고, 백신 접종이 동물을 이종 감염으로부터 방어해준다는 것을 시사한다.

실시예 8: 트랜스사이토시스의 저해 및 교차- 클레이드 예방

백신 접종이 점막 면역성을 유도하였는지를 조사하기 위해, 실시예 6에 언급된 바와 같이 수득한 자궁 경부-질 샘플을, 종래에 기술된 바(Bomsel et al., 1997. Nat. Med. 3: 42-47)와 같이 수행한, HIV-1 트랜스사이토시스 저해 분석에 의해 분석하였다. 상피 세포를 통과하는 HIV-1 트랜스사이토시스와 항체에 의한 트랜스사이토시스의 중화를, 상단이 상피 단일층의 정단(내강: luminal) 표면을 덮고 있고 하단이 기저측면 표면을 덮고 있는, 2개의 독립된 챔버 사이에 인터페이스를 형성하고 있는 투과성 필터(0.45 ㎛ 포어 크기) 상에서 7일간 견고한 분극화된 단일층으로서 배양된 장 세포주인 HT 29에 대해 조사하였다. 트랜스사이토시스 실험 수행 전에, 상피 세포를 헹구고, 다시 RPMI, 글루타민 및 10% FCS에서 배양하였다. 그룹 1(위약) 또는 그룹 3(W24; i.m. + i.n. -상기 실시예 7 참조)의 경부-질 분비물(CVS) 샘플(1/12 및 1/6 희석)을 HIV-1 감염된 세포(1x10⁶ HIV-1 93BR029 바이러스 (HIV1 clade B) 또는 92BR025 바이러스 (HIV1 clade C) + PBMC (JRCSF 또는 원시 바이러스를 감염시킨 건강한 개체로부터 수득한 활성화된 PBMC의 감염 후 7일)와 실온에서 20분간 예비-배양하였다. 그런 후, 예비 배양한 HIV-1 감염된 세포를 정단 챔버에 넣었다. HIV-1 감염된 세포와 상피 세포 단일층이 접촉되면, HIV-1-비리온이 빠르게 발생되어, HIV 입자 내재화와 정단에서 상피 세포 단일층의 기저측면으로의 트랜스사이토시스가 이루어진다. 2시간 후, CVS에 의한 트랜스사이토시스의 저해는 시판 ELISA(Coulter, Villepinte, France)에 의한 기저측면 매질 중에서의 p24의 검출에 의해 검출하였다. 감염된 세포를 상피 세포와 접촉시킨 2시간 동안, 상피 단일층의 장벽 기능은 온전하게 유지되어, HIV-1 감염된 세포의 단일층 침투 또는 기저측면 챔버(1)내 HIV 감염된 세포의 전이는 방지된다. HIV-1의 트랜스사이토시스 결과는 도 6에 나타낸다. 분명히, 클레이드 B 바이러스의 트랜스사이토시스는 백신 접종받은 동물의 CVS에 의해 저해되었다. 그러나, 놀랍게도, 백신 접종은, HIV-1 각 대조군의 트랜스사이토시스 감소(교차-클레이드 예방)에 의해 입증된 바와 같이, 클레이드 C 바이러스에 대해 저해 활성을 유도하였는데, 이는 사용한 바이러스들 간에 아미노산 서열은 다르므로, 입체 구조적으로 공유되는 에피토프의 존재를 시사한다.

실시예 9 트랜스사이토시스는 백신 접종 받은 동물의 CVS 내 분비형 IgA 에 의해 저해된다

실시예 8에 언급된 바와 같은, 동물로부터 회수한 경부-질 분비물 샘플을, 바이오틴화된-항 머카크 IgA 항체와 인큐베이션하여, 다음과 같이 IgA를 고갈시켰다. 바이오틴화된 항-인간 IgA (Caltag, france)를 스트렙타비딘-아가로스(Pierde, France)에 1:3 중량비로 결합시키고, 커플링된 비드를 헹궈, 결합되지 않은 바이오틴화된 항-IgA를 제거하였다. 비드 30 ㎕를 4℃에서 CVS(1:6 희석)와 함께 밤새 회전시키고, 1000g로 10분간 원심분리하였다. 수득되는 상층액을 모우고, 스트렙타비딘-아가로스 비드(Pierde, France)와 인큐베이션하고, 원심 분리하여 비드를 제거하여, 분석하였다. 이렇듯 IgA-고갈된 샘플에 대해 실시예 8에 기술된 바와 같이 clade B 93BR029 바이러스를 이용하여 트랜스사이토시스 분석으로 테스트한 다음, IgA 고갈시키지 않은 샘플과 비교하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, IgA 고갈 후 HIV-1 트랜스사이토시스는 거의 또는 전혀 저해되지 않았는데, 이는 감염 예방에 있어서의 혈청 IgA 보다는 점막 IgA의 역할을 명확하게 입증해준다.

실시예 10: 생체내 교차- 클레이드 예방

상기에 나타낸 바와 같이, 분석을 통해 시험관내 교차-클레이드 트랜스사이토시스 저해가 관찰되어, 실시예 6의 그룹 3(클레이드 B 계열의 비로솜을 코내와 근육내 백신 접종한 경우)의 원숭이에게 클레이드 C 바이러스를 기회 감염시키기로 하였다. 비로솜을 마지막 백신 접종하고 1년 후에도, 원숭이들은 여전히 혈청 반응이 음성이었다. 이들에게 실시예 6에 기술된 바와 같이 근육내 주사로 다시 1회 백신 접종하고, 백신 접종한 지 5주 후에, 4-7일 간격으로 SHIV1157ipd3N4 (Clade C, tropism R5, Dr. Ruth Ruprecht, Dana Farber Cancer Institute, USA)을 10-20 TCID₅₀으로 10회 감염시켰다. 각 백신 접종시에, 혈액 샘플을 취하여 바이러스 혈증을 측정하였다. 채혈은 그 후 60일간 4-7일마다 행하였다(도 8). 도 8에 나타낸 바와 같이, 감염 후 처음 40일 동안에는 백신 접종 동물에서 감염은 관찰되지 않았다. 백신 접종하지 않은 대조군의 경우, 11일째에 6마리 중 5마리가 감염되었고, 60일째에는 동물들 모두 감염되었다. 백신 접종한 그룹의 경우, 실험을 지속한 120일 동안 5마리 중 2마리가 감염되지 않았고, 감염된 동물의 경우에도 대조군에 비해 상당히 지연되었다.

이러한 놀라운 데이타는 생체내 교차-클레이드 예방에 대한 명확한 증거를 제공한다.

SEQUENCE LISTING <110> Mymetics Corporation <120> Novel gp41 antigens <130> BR066824 <150> 61/202 215 <151> 2009-02-06 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu 1 5 10 15 Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp 20 25 30 Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu 35 40 45 Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile 50 55 60 Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu 65 70 75 80 Glu Gln Ile Trp Asn His Thr Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile 85 90 95 Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn 100 105 110 Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala 115 120 125 Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asn Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr 130 135 140 <210> 2 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P1 clade B without S <400> 2 Ser Gln Thr Gln Gln Glu Lys Asn 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gaggtggatc caatgctagt tggagtaata aatctctgga acagatttgg 240 aatcacacga cctggatgga gtgggacaga gaaattaaca attacacaag cttaatacac 300 tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg aacaagaatt attggaatta 360 gatctcgagc accaccacca ccaccactga 390 <210> 37 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Met Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn 1 5 10 15 Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val 20 25 30 Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr 35 40 45 Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Asp Gly Ser Ser Gly Gly Arg 50 55 60 Gly Gly Ser Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp 65 70 75 80 Asn His Thr Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr 85 90 95 Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys 100 105 110 Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Leu Glu His His His His His 115 120 125 His <210> 38 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Met Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln 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Claims

식 N-L-C로 표시되는 3개의 인접한 세그먼트 N, L 및 C를 포함하며, gp41의 N-나선 영역(N), gp41의 C-나선 영역(C) 및 상기 N-나선과 C-나선 사이에 위치한 합성 링커를 포함하는 연결 루프(L)를 포함하는, 변이 폴리펩타이드로서,
상기 링커는, 프로토타입의(prototypic) HIV-1 HxB2 클레이드(Clade) B 분리 균주를 기준으로 한 번호 체계에 따라, gp41의 593번에서 617번까지의 아미노산들을 치환하고 있으며,
상기 폴리펩타이드는 칼베올린-1을 중화하는 98.6 D 에피토프를 포함하지만, 2F5 및 4E10 에피토프, 융합 펩타이드는 포함하지 않으며,
상기 폴리펩타이드는 인간 인터루킨 2(IL-2)와 최소한의 면역 교차 반응성을 가지는 것을 특징으로 하는, 변이 폴리펩타이드.
제1항에 있어서,
식 N-L-C-S로 표시되는 S 단편(fragment)를 더 포함하며,
상기 S는 스페이서 단편인 것을 특징으로 하는 변이 폴리펩타이드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 N 세그먼트는 프로토타입의 HIV-1 HxB2 분리주를 기준으로 한 번호 체계에 따라, gp41의 540번에서 592번까지의 아미노산들인 것을 특징으로 하는 변이 폴리펩타이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 N은 서열번호 13 또는 14로 표시되는 것을 특징으로 하는 변이 폴리펩타이드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서, 상기 C 세그먼트는 프로토타입의 HIV-1 HxB2 분리주를 기준으로 한 번호 체계에 따라, gp41의 618번에서 664번까지의 아미노산들인 것을 특징으로 하는 변이 폴리펩타이드.
제5항에 있어서, 상기 C는 서열번호 15로 표시되는 것을 특징으로 하는 변이 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 L은 서열번호 16으로 표시되는 것을 특징으로 하는 변이 폴리펩타이드.
제2항에 있어서, 상기 S는 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 또는 서열번호 12로 표시되는 것을 특징으로 하는 변이 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 서열번호 17 또는 18로 표시되는 것을 특징으로 하는 변이 폴리펩타이드.
제2항에 있어서, 서열번호 19 또는 20으로 표시되는 것을 특징으로 하는 변이 폴리펩타이드.
제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 따른 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 폴리펩타이드는 수계 매질 중에서 삼량체를 형성하는 것을 특징으로 하는 수계 조성물.
제11항에 있어서, 상기 삼량체는 안정적인 것을 특징으로 하는 수계 조성물.
비로솜(virosome)에 접합된 제1항 내지 제10항 또는 제17항 중 어느 한항에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 접합체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제14항에 있어서, 서열번호 21 또는 서열번호 28로 표시되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제14항 또는 제15항에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩타이드.
제1항 내지 제10항 또는 제16항 중 어느 한항에 따른 폴리펩타이드 3개를 포함하는 삼량체.
하나 이상의 전사 프로모터, 제14항 또는 제15항에 따른 폴리뉴클레오티드 및 전사 종결인자를 포함하는 발현 벡터.
제18항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제1항 내지 제10항 또는 제16항 중 어느 한항에 따른 폴리펩타이드, 제13항에 따른 접합체, 또는 제17항에 따른 삼량체를 포함하는, 항원성 또는 면역원성 조성물.
제1항 내지 제10항 또는 제16항 중 어느 한항에 따른 폴리펩타이드, 제13항에 따른 접합체, 제17항에 따른 삼량체, 또는 제18항에 따른 발현 벡터를 포함하는 약학 조제물.
제21항에 있어서, 제1항 내지 제16항 중 어느 한항에 따른 폴리펩타이드와는 구분되는 추가적인 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조제물.
제22항에 있어서, 상기 추가적인 항원은 접합체 형태인 것을 특징으로 하는 약학 조제물.
제23항에 있어서, 상기 추가적인 항원은 비로솜과 접합된 것을 특징으로 하는 약학 조제물.
제21항 내지 제24항 중 어느 한항에 있어서, 상기 추가적인 항원은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 것을 특징으로 하는 약학 조제물.
제21항 내지 제25항 중 어느 한항에 있어서, 면역요법, 특히 예방학적 면역요법용인 것을 특징으로 하는 약학 조제물.
인간 면역결핍 바이러스의 gp41 단백질에 대해, 후천적인 면역 반응 및/또는 선천적인 면역 반응을 유도하기 위한 약제를 제조하기 위한,
제1항 내지 제10항 또는 제16항 중 어느 한항에 따른 하나 이상의 폴리펩타이드, 제17항에 따른 삼량체, 제18항에 따른 발현 벡터, 또는 제13항에 따른 접합체의 용도.
인간 면역결핍 바이러스의 gp41 단백질에 대해, 후천적인 면역 반응 및/또는 선천적인 면역 반응을 유도하기 위한 약제를 제조하기 위한,
접합체 형태, 더 바람직하게는 비로솜 형태의,
제1항 내지 제10항 또는 제16항 중 어느 한항에 따른 폴리펩타이드, 제17항에 따른 삼량체, 제18항에 따른 발현 벡터, 또는 제13항에 따른 접합체; 및 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 추가적인 항원의, 용도.
필요한 개체에게, 유효량의, 제1항 내지 제10항 또는 제16항 중 어느 한항에 따른 폴리펩타이드, 제17항에 따른 삼량체, 또는 제13항에 따른 접합체를 투여하는 단계를 적어도 포함하는, HIV 감염의 예방 및/또는 치료 방법.
제29항에 있어서, 상기 유효량은 주입에 의해 전신으로 투여되거나 및/또는 점막 경로에 의해 국소 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제30항에 있어서, 상기 점막 경로는 생식기-비뇨기 관, 위-장관, 항문 경로, 호흡기관, 상부 점막 조직(upper mucosal tissue), 구강-코 경로 및 이의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제29항 내지 제31항 중 어느 한항에 있어서, 상기 유효량은 상기 gp41 유래 항원과 구별되는 추가적인 항원과 조합 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.