KR20110119374A - 일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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정민
정지화
조연수
배현옥
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울산대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 신규한 비만의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 일산화탄소는 소포체 스트레스에 의한 미폴딩 단백질 반응으로부터 유도되는 렙틴 저항성을 감소 또는 개선시킬 수 있는 효과가 있으며, 특히 PERK(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase)의 인산화를 증가시키고, 소포체 스트레스 유도물질에 의해 억제된 렙틴 유도성 STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)의 인산화를 회복시키는 효과가 있으므로 상기 일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체는 렙틴 저항성에 의해 발생하는 비만을 예방 또는 치료하는 목적으로 사용할 수 있다.

Description

일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising carbon monoxide or carbon monoxide donor for preventing or treating obesity}
본 발명은 비만의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 렙틴 저항성을 개선하는 효과가 있는 일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
최근 경제적 성장과 산업구조의 변화로 식생활이 개선되고 신체 활동량이 감소되면서 과체중과 비만체형의 발생빈도가 높아지고 있다. 비만이 우리나라 사람의 고민으로 등장한 것은 그렇게 오래되지 않았으며 과거에는 비만이 풍족한 생활의 상징이었으나 요즘은 당뇨병, 동맥경화, 심장병 등 성인병의 가장 큰 원인이라는 사실이 밝혀지면서 건강관리를 위한 가장 중요한 쟁점이 되고 있다.
비만이란 열량의 섭취와 소비의 불균형으로 발생하는 대사성 질환이며 과잉된 열량으로 인해 지방 조직이 비정상적으로 증가된 상태를 말한다(Kopelman 및 Stock, 1998). 특히, 남자는 체지방이 체중의 25％, 여자는 체중의 30％ 이상일 때 비만으로 보며, 임상적으로는 BMI(Body Mass Index: 체질량지수)가 25.0 내지 30.0를 과체중으로 정의하고 있으며 30.0 이상인 경우를 비만으로 정의한다.
이러한 비만의 원인으로는 앞서 기술한 바와 같이 고지방 및 고열량의 식생활, 바쁜 사회적 환경에 따른 운동 부족, 내분비 이상 등 환경적 요인이 있을 수 있으며, 이 외에도 유전적 요인을 들 수 있는데(Frankel 및 Scho가, 1996), 이 중 비만의 50 내지 70% 정도가 환경적 요인에 의한 것으로 알려져 있고, 나머지가 유전적 요인에 의한 것으로 알려져 있다.
한편, 정상 상태에서의 식욕은 말초에서 유래한 인자들에 의하여 조절을 받는데, 그 중 대표적인 것이 렙틴과 인슐린이다(Schwartz 등, Nature, 404:661-671, 2000). 체중이 증가하면 혈중의 렙틴과 인슐린 농도가 증가하며, 섭식 중추인 시상하부에 작용하여 식욕을 억제하고, 에너지 소모를 촉진함으로써 증가한 체중을 원상 복귀하도록 한다. 에너지 균형을 조절하는 이러한 정상적인 피드백 시스템은 체중 증가를 예방하는 일종의 보호 기전이나, 비만증에서는 피드백 시스템이 적절하게 작용하지 않기 때문에 비만증이 악화되고 동반 질환을 야기하게 된다(Kopelman 등, Nature , 404:635-643, 2000).
렙틴(leptin)은 지방세포에 의해 분비되며, 시상하부에 작용하여 음식 섭식을 줄이고, 에너지 소비를 자극함으로써 체지방의 양을 감소시키는 작용을 가지는 가장 대표적인 호르몬으로 알려져 있다(Halaas 등, Science, 269:543-546, 1995). 또한, 렙틴 또는 렙틴 수용체의 결핍은 인간과 동물에서 심한 비만증과 과식증의 발생을 초래하고 있어 렙틴이 정상적인 식욕 및 체중 유지에 매우 중요한 인자라고 할 수 있다(Montague 등, Nature, 387:903-908, 1997; Clement 등, Nature, 392:398-401, 1998).
그러나 대부분 비만증을 가진 사람의 혈액에서 렙틴의 농도가 증가되어 있는 현상이 종종 확인되고 있어 렙틴의 부족 보다는 렙틴에 대한 저항성이 비만을 야기하는 원인 기전으로 새롭게 제시되고 있다(Maffei 등, Nat ., Med ., 1:1155-1161, 1995; Fredrich 등, Nat ., Med ., 1:1311-1314, 1995). 특히, 비만증에서 렙틴 감수성이 저하되는 기전으로는 섭식 중추인 시상하부 신경세포에서 렙틴의 신호 전달이 약해지거나, 중추신경계 내로 렙틴 수송의 감소가 제안된 바 있다(Halaas 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 94:8878-8883, 1997; Banks, Curr . Pharm . Des ., 7:125-133, 2001). 따라서 비만인 사람들에게 있어 렙틴을 비만치료에 사용하기 위해서는 렙틴 저항성의 개선이 필수적이라고 할 수 있다.
또한, 비만을 치료하기 위해 사용되고 있는 비만 치료제로는 현재 3가지의 범주, 즉 식욕 억제제, 체내 에너지 대사 촉진제 및 소화 흡수 억제제로 구분되어 있으며, 식욕을 억제하는 약리 기전을 이용하는 대표적인 비만 치료제로서 리덕틸(Reductil™, 애보트사, 미국)을 들 수 있고, 체내 에너지를 촉진하는 약리 기전을 이용하는 대표적인 비만 치료제로서는 엑소리제(Exorise™,아코파마사, 프랑스)를 들 수 있으며, 지방의 소화 흡수를 억제하는 약리기전을 이용하는 대표적인 비만 치료제로서는 제니칼(Xenical™, 로슈제약회사, 스위스)을 들 수 있으나, 이러한 치료제 역시 비만의 근본 원인이라고 할 수 있는 렙틴 저항성의 치료에는 그 효과가 미미하다. 따라서 최근에는 렙틴 민감성이 우수한 약제를 통해 비만을 치료하고자 하는 시도가 이루어지고 있다.
한편, 헴 옥시게나제-1(HO-1)은 헴의 분해의 제1단계를 촉매하는 작용을 한다. HO-1은 산화에 의하여 b-형 헴 분자의 α-메소 탄소 가교를 절단하여 동일 몰량의 빌리베르딘 IXa, 일산화탄소(CO) 및 유리 철을 생성시킨다. 이후, 빌리베르딘은 빌리베르딘 리덕타제를 통하여 빌리루빈으로 전환되고, 유리 철은 페리틴내로 격리된다.
헴 옥시게나제-1에 의해 발생되는 일산화탄소는 생체 내에서 중요한 신호 분자로서 밝혀진 바 있으며(Verma et al., Science 259: 381-384, 1993), 특히, 일산화탄소는 뇌내 뉴런의 메신저 분자로서(Id.), 시상하부내의 뉴로-내분비 조절인자로서 작용한다는 내용이 보고된 바 있다(Pozzoli et al., Endocrinology 735: 2314-2317, 1994). 또한, 이러한 일산화탄소는 평활근 이완제로 작용하고(Utz et al., Biochem Pharmacol . 47: 195-201, 1991; Christodoulides et al., Circulation 97: 2306-9, 1995), 혈소판 응집을 억제하는 활성이 있으며(Mansouri et al., Thromb Haemost . 48: 286-8, 1982), 저농도의 일산화탄소의 흡입은 염증을 억제하는 효과가 있는 것으로 밝혀진 바 있다.
그러나 아직까지 이러한 헴 옥시게나제-1에 의해 발생되는 일산화탄소가 비만을 억제하는 효과가 있다는 내용에 대해서는 전혀 보고된 바 없다.
따라서 본 발명의 목적은 렙틴 저항성을 효과적으로 감소 또는 개선함을 통해 비만을 예방 또는 치료할 수 있는 신규한 약학적 조성물을 제공하는 것으로서, 일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 일산화탄소는 헴옥시게나제(heme oxygenase)-1에 의해 발생하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 일산화탄소 공급체는 RuCO(Ruthenium Carbon Monoxide), CORM-1(Mn2CO10 :manganese decacarbonyl), CORM-3( Ru(CO)(3)Cl(glycinate)) 및 CORM-A1(sodium boranocarbonate)으로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 일산화탄소는 렙틴 저항성(Leptin resistance)을 개선시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 렙틴 저항성은 소포체(ER) 스트레스에 의해 유발된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 렙틴 저항성의 개선은 일산화탄소에 의한 PERK(protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase)의 인산화를 통해 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 소포체(ER) 스트레스는 TG(thapsigargin), TM(tunicamycin) 및 호모시스테인(homocysteine)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나에 의해 유발되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 샤페론 활성 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 샤페론 활성 물질은 4-PBA(4-phenylbutyric acid) 또는 TUDCA(tauroursodeoxycholic acid)일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 일산화탄소는 소포체 스트레스에 의한 미폴딩 단백질 반응으로부터 유도되는 렙틴 저항성을 감소 또는 개선시킬 수 있는 효과가 있으며, 특히 PERK(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase)의 인산화를 증가시키고, 소포체 스트레스 유도물질에 의해 억제된 렙틴 유도성 STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)의 인산화를 회복시키는 효과가 있으므로 상기 일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체는 렙틴 저항성에 의해 발생하는 비만을 예방 또는 치료하는 목적으로 사용할 수 있다.
도 1a는 SK-N-AS-OB-RB 세포에 20uM의 RuCO를 처리하고 각 시간별(30분, 60분 및 120분)로 배양한 후, 웨스턴 블럿을 통해 p-PERK, PERK, p-eIF2a, eIF2a, GRP78 및 CHOP 단백질의 발현양을 확인한 것을 나타낸 것이며 , 이때 GRP78 및 CHOP 단백질 발현 확인은 RuCO 처리후 18시간 동안 배양한 다음 웨스턴 블럿을 수행한 것이다.
도 1b 및 1c는 SK-N-AS-OB-RB 세포에 TG(1uM) 또는 TM(2ug/ml)를 처리하고 각 시간별(30분, 60분 및 120분)로 배양한 후, 웨스턴 블럿을 통해 p-PERK, PERK, p-eIF2a, eIF2a, GRP78 및 CHOP 단백질의 발현양을 확인한 것을 나타낸 것이며, 이때 GRP78 및 CHOP 단백질 발현 확인은 RuCO 처리후 18시간 동안 배양한 다음 웨스턴 블럿을 수행한 것이다.
도 2a는 CHO-K1-OB-RB 세포에 TG 1uM, TM 2ug/ml, RuCO 20uM, TM 2ug/ml+RuCO 20uM 및 TG 1uM+RuCO 20uM을 각각 처리한 후, 4시간 배양한 다음, 웨스턴 블럿을 통해 렙틴 수용체의 발현을 확인한 것을 나타낸 것이며, 대조군으로는 렙틴 수용체가 발현되지 않은 CHO-K1 세포를 사용하여 웨스턴 블럿을 수행한 것이다.
도 2b는 CHO-K1 세포에 대해서는 IL-6(25ng/ml) 및 렙틴(10ug/ml)을 각각 처리하였고, CHO-K1-OB-RB 세포에 대해서는 렙틴을 1, 5, 10ug/ml의 농도로 각각 처리한 후, 웨스턴 블럿을 통해 STAT3 및 p-STAT3의 발현양을 각각 확인한 것이다.
도 2c는 CHO-K1-OB-RB 세포에 TG 1uM, TM 2ug/ml, RuCO 20uM 및 렙틴(10ug/ml)을 각각 처리한 다음, 웨스턴 블럿을 통해 p-STAT3의 발현양을 확인한 것이다.
도 3a는 SK-N-AS-OB-RB 세포에 4-PBA(5mM) 또는 RuCO(20uM)을 2시간 전처리하고 TM 2ug/ml을 4시간 처리한 다음, 다시 렙틴(10ug/ml)으로 15분간 세포들을 자극시킨 후, 웨스턴 블럿을 통해 STAT3 및 p-STAT3의 발현양을 각각 확인한 사진과 STAT3의 인산화 정도를 막대 그래프로 각각 비교하여 나타낸 것이다.
도 3b는 SK-N-AS-OB-RB 세포에 각 농도별로 RuCO(5, 10, 20uM)를 2시간 전처리하고, 2ug/ml의 TM을 4시간 처리한 다음, 렙틴(10ug/ml)으로 15분간 세포들을 자극시킨 후, 웨스턴 블럿을 통해 STAT3 및 p-STAT3의 발현양을 각각 확인한 사진과 STAT3의 인산화 정도를 막대 그래프로 각각 비교하여 나타낸 것이다.
도 4a는 SK-N-AS-OB-RB 세포에 IRE1 siRNA(50nM)을 도입시키고 36시간 배양한 다음, 웨스턴 블럿을 통해 IRE1a의 발현정도를 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 4b는 SK-N-AS-OB-RB 세포에 IRE1 siRNA(50nM)을 도입시키고 36시간 배양한 다음, 2ug/ml의 TM을 4시간 처리한 다음, 렙틴(10ug/ml)으로 15분간 세포들을 자극시킨 후, 웨스턴 블럿을 통해 p-STAT3 및 STAT3의 발현양을 각각 확인한 사진과 STAT3의 인산화 정도를 막대 그래프로 각각 비교하여 나타낸 것이다.
도 5a 및 5b는 SK-N-AS-OB-RB 세포에 각각 렙틴(10ug/ml), 렙틴(10ug/ml)+TM(2ug/ml), 렙틴(10ug/ml)+TM(2ug/ml)+RuCO(20uM)를 처리한 후, 웨스턴 블럿을 통해 p-PERK, PERK, p-STAT3, STAT3, p-eIF2a 및 eIF2a의 발현양을 확인한 사진 및 PERK의 인산화 정도와 eIF2a의 인산화 정도를 막대 그래프로 각각 비교하여 나타낸 것이다.
본 발명은 일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
일산화탄소(CO)는 생물에서 독성 및 치사율을 갖는 기체 분자로 알려져 있다(Haldane, Biochem . J. 21: 1068-1075; 및 Chance 등, 1970, Ann . NY Acad Sci . 174: 193-204). 그러나 최근 보고되고 있는 자료들에 의하면, 일산화탄소가 세포내 및 생물학적 과정에서 여러 반응에 조절 인자로서 작용하며, 특히 뉴런 전송을 매개하고(Verma 등, supra 및 Xhuo 등, Science 260: 1946-1950), 혈관운동 긴장을 조절하는 등(Morita & Kourembanas, 1995, J. Clin. Invest. 96: 2676-2682.; Morita 등, 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: -1479; 및 Goda 등, 1998, J. Clin. Inv. 101: 604-12)의 역할을 담당하는 것으로 밝혀지고 있다.
따라서 이러한 일산화탄소에 대한 생체 내에서의 생리학적 활성에 대한 연구가 현재 활발히 진행되고 있는데, 본 발명에서는 일산화탄소가 렙틴 저항성을 감소시키는 작용을 통해 비만을 예방 또는 치료하는 활성이 있다는 사실을 최초로 규명하였다.
본 발명에 따른 일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물은 렙틴 저항성을 개선 또는 감소시킬 수 있는 특징이 있다.
본 발명에서 상기 “렙틴 저항성”이란, 포만감을 자극하는 호르몬인 렙틴의 효율이 떨어져, 더 많은 렙틴이 필요한 상태를 말하는 것으로서, 비만의 경우 이러한 렙틴 저항성이 종종 관찰된다.
렙틴 저항성 기전은 아직까지 완전히 규명되어 있지 않지만, 렙틴이 지방세포에서 분비되면 시상하부의 렙틴 수용체와 결합하며 그 신호가 세포내로 전달되는 과정에서 각 단계의 결함들이 원인인 것으로 예측되고 있다. 한편, 최근에는 소포체 스트레스에 의한 미폴딩 단백질 반응(unfolded protein response; UPR)이 렙틴 저항성과 관련되어 있다는 내용이 보고된 바 있는데, 일 연구진의 연구결과에 따르면, 마우스를 대상으로 한 연구에서 비만 마우스는 소포체(ER)의 스트레스가 증가한 상태로 관찰되었고, 이는 비만이 발생할 경우, 소포체가 위축되어 제대로 기능을 발휘하지 못한다는 사실을 보여주는 것으로서, 소포체 스트레스와 미폴딩 단백질 반응은 렙틴의 작용을 억제하는 원인이 되며, 결국 렙틴 저항성을 유발시키는 것으로 나타났다.
한편, 세포내에서 소포체는 진핵세포에서 발견되는 세포소기관의 하나로서 소포세관(tubule), 소포(vesicle) 및 시스터나(cisterna)가 그물모양으로 이루어진 세포소기관을 말한다. 소포체의 기본 구조 및 구성은 비록 핵막의 연장(내막계, Endomembrane System)이지만 일반적인 세포막과 비슷하고, 그 기능은 단백질을 만들어서 세포 내외로 전달하는 역할을 하며, 세포막의 일부가 될 단백질을 비롯하여 세포 밖으로 분비될 단백질들이 여기에서 합성되고, 그 외로 칼슘을 저장하거나, 단백질의 글라이코실화(glycosylation), 이황화결합(disulfide bond) 등이 소포체에서 일어난다.
상기 “소포체 스트레스”란 잘못 접힌(misfolding) 단백질들의 축적 및 응집, 특정 단백질의 비정상적인 과다발현, 글라이코실화 반응 등의 정상적인 단백질 번역후 과정의 억제 등에 의해 세포가 받게 되는 스트레스를 말하며, 이와 같은 소포체 스트레스에 의해 일련의 미폴딩 단백질 반응(UPR)이 나타나게 된다. 그러나 세포내에서 세포가 소포체 스트레스로 인해 UPR 현상이 보이게 되면, 여러 가지 샤페론 단백질들이 발현되어 소포체 내의 비정상적으로 접혀진 단백질의 접힘을 조절하고, 비정상적으로 접혀진 단백질의 분해에 관여하는 분해 효소들의 발현이 증가되어 세포가 스트레스 하에서도 정상적으로 기능할 수 있도록 해준다. 하지만, 소포체 스트레스가 과도하거나 지속되면 세포사멸(apoptosis)이 유도된다.
또한, 포유동물 세포에서 미폴딩 단백질 반응(UPR)은 소포체 막에 존재하는 세 종류의 소포체 스트레스 센서인 IRE1, PERK 및 ATF6에 의해 유도되는데, IRE1의 kinase/RNase 기능은 소포체 스트레스에 의해 활성화되어 Xbp-1 mRNA의 스플라이싱(splicing)을 유도하고, 이를 통해 활성을 가진 Xbp-1 전자조절 인자가 만들어진다. Xbp-1은 다시 BiP를 포함한 소포체 샤페론의 발현 유도를 통해 소포체 내부 단백질의 폴딩 능력을 향상시킨다. PERK의 경우, 번역개시인자(translation initiation factor)인 eIF2α의 인산화를 유도하여 단백질 합성을 감소시키는 한편, ATF4와 같은 특정 전사조절 인자의 생성 증가를 통해 UPR 유전자 발현을 유도한다. 또한, ATF6는 proteolytic 절단에 의해 세포질 도메인(cytoplasmic domain)이 방출됨으로써 활성을 가진 전자조절인자로 작용하여 UPR 유전자 발현을 유도한다.
이에 본 발명자들은 일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체가 비만의 원인이 되는 소포체 스트레스로 인한 렙틴 저항성을 감소 또는 개선시킬 수 있는 효과가 있는지를 조사하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 소포체 스트레스 유발물질 및 일산화탄소 공급체인 RuCO를 렙틴 수용체가 발현되는 세포에 각각 처리한 다음, 세포내에서 PERK 및 인산화-PERK 단백질의 발현양과 eIF2a 및 인산화-eIF2a 단백질의 발현양을 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과, 소포체 스트레스 유발물질 및 일산화탄소 공급체가 처리된 세포들 모두에서 처리 시간에 비례하여 PERK 및 eIF2a의 인산화가 증가되는 것으로 나타났다(도 1a 내지 도 1c 참조).
또한, 소포체 스트레스 유발물질을 처리할 경우, UPR에 의해 조절되는 샤페론 단백질인 GRP78(glucose-reguated protein 78) 및 CHOP의 발현이 증가되는 것으로 나타났다. 따라서 상기 결과를 통해 소포체 스트레스 물질을 처리할 경우, 세포내에서 소포체 스트레스에 의해 미폴딩 단백질 반응 상태가 유도됨을 확인할 수 있었으며, 동시에 샤페론 단백질의 발현도 증가된다는 사실을 확인할 수 있었다.
반면, 일산화탄소 공급체인 RuCO를 처리하였을 경우에는 PERK 및 eIF2a의 인산화가 증가되었으나, GRP78 및 CHOP의 발현에는 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 일산화탄소 공급체로부터 발생되는 일산화탄소가 PERK를 인산화 시킬 수 있다는 사실을 확인함으로써 상기 일산화탄소가 PERK의 활성을 통해 소포체 스트레스 유도성 렙틴 저항성에 영향을 줄 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
한편, 섭식 조절 중추인 시상하부의 신경세포에는 신호 전달 기능을 가진 장형(long form)의 렙틴수용체인 OB-RB가 풍부하게 발현되고 있으며, 렙틴은 특히 궁상핵(arcuate nucleus)에 존재하는 섭식 조절 뉴로펩타이드를 생산하는 뉴우런에 작용하여 식욕 촉진 작용을 가진 neuropeptide Y(NPY)/Agouti related peptide (AGRP)의 생산을 억제하고, 식욕 억제 작용을 가진 POMC(proopiomelanocortin) /CART(coccain amphetamine regulated transcript)의 생산을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 렙틴 신호전달계로 알려져 있는 대표적인 것으로는 JAK2( janus kinase-2)/STAT3(signal transduction activated transcript-3) 신호전달계가 있는데, 이는 렙틴이 OB-RB에 결합하면 인산화된 JAK2가 OB-RB에 결합하고, 연이어 STAT3가 인산화되고, 인산화된 STAT3는 핵으로 이동하여 전사 조절 작용을 한다. 또한, STAT3 활성화에 있어서 OB-RB의 특정 부위가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는데, 즉, OB-RB의 1138번째 타이로신(tyrosine)을 세린(serine)으로 치환시킨 생쥐에서는 심한 비만증과 과식증이 발생한다는 결과를 통해 STAT3 활성화가 렙틴의 식욕 및 체중 감소 효과를 매개하는 중요한 신호전달 과정임을 알 수 있다.
또한, 렙틴 저항성을 가진 비만 생쥐의 뇌실로 렙틴을 투여하면 시상하부 궁생핵에 선택적으로 STAT3 인산화가 감소됨이 보고된 바 있는데, 이러한 결과를 통해 시상하부 신경세포 특히 궁상핵의 신경세포에서 렙틴에 의한 STAT3 활성화의 장애가 렙틴 저항성의 중요한 기전으로 유추되고 있으며, 최근 비만증을 가진 설치류의 시상하부에서 JAK2/STAT3 신호전달계의 억제인자로 알려진 SOCS-3(suppressor of cytokine signaling-3)의 발현이 상승되어 있고, 시상하부에 SOCS-3 발현을 억제시킨 생쥐에서 렙틴 감수성이 증가하며, 비만증 발생이 억제된 결과가 보고된 바 있다.
이에 본 발명자들은 일산화탄소가 렙틴 수용체의 발현에 영향을 미치는지 확인하기 위해 렙틴 수용체가 발현되는 세포에 대해 소포체 스트레스 유도물질, 일산화탄소 공급체 및 소포체 스트레스 유도물질+일산화탄소 공급체를 각각 처리한 후, 세포내에서 렙틴 수용체의 발현을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과, 모든 실험군에서 렙틴 수용체의 발현에는 아무런 변화가 없는 것으로 나타났으며, 나아가 소포체 스트레스 유도물질 및 일산화탄소 공급체를 각각 처리한 세포에서 인산화된 STAT3를 관찰할 수 없었고, 단지 렙틴을 처리한 군에서만 STAT3의 인산화를 관찰할 수 있었다(도 2a 내지 2c 참조).
또한, 본 발명자들은 일산화탄소가 소포체 스트레스에 의한 UPR에 의해 발생하는 렙틴 저항성을 차단, 감소 또는 개선하는 활성이 있는지를 조사하기 위해, 본 발명에 일실시예에서 렙틴 수용체가 발현되는 세포를 대상으로 일산화탄소 공급체인 RuCO 또는 화학적 샤페론인 4-PBA를 각각 처리한 후, 소포체 스트레스 유도물질을 처리한 다음, 렙틴으로 세포를 자극하였다.
그 결과, 렙틴만을 처리한 경우에는 STAT3의 인산화가 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 월등히 증가한 것으로 나타났으며, 반면 소포체 스트레스 유도물질을 처리한 군에서는 STAT3의 인산화 현저히 감소되어 렙틴 저항성이 유발된 것으로 나타났다. 한편, RuCO 또는 4-PBA을 전 처리한 세포의 경우에는 STAT3의 인산화가 소포체 스트레스 유도물질을 처리한 군에 비해 증가한 것으로 나타났으며(도 3a 참조), RuCO의 처리 농도가 증가할수록 STAT3의 인산화는 더욱 증가하는 것으로 나타났다(도 3b 참조).
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 일산화탄소가 직접적으로 STAT3을 인산화시킬 수는 없으나, 소포체 스트레스에 의해 유도되는 렙틴 저항성을 개선하여 렙틴 신호전달을 회복시킬 수 있다는 사실을 알 수 있었으며, 특히 UPR에 의한 렙틴 저항성을 개선하여 비만을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
나아가 본 발명자들은 본 발명에 따른 일산화탄소의 렙틴 저항성 개선 효과가 UPR 반응에서 소포체 스트레스의 또 다른 센서인 IRE1a와 관련이 있는지를 조사하기 위해 IRE1a siRNA를 사용하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 렙틴 수용체가 발현되는 세포주에 IRE1a siRNA을 도입시켜 세포내에서 IRE1a의 유전자 발현을 억제시키고 소포체 스트레스 유도물질 및 렙틴을 처리한 결과, IRE1a siRNA을 처리하지 않은 군의 경우에는 렙틴 저항성이 관찰된 반면, IRE1a siRNA을 처리한 군의 경우에는 렙틴 유도의 STAT3의 인산화가 유지됨과 동시에 렙틴 저항성이 감소, 즉, 개선되는 것으로 나타났다(도 4b 참조).
또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 일산화탄소 유도물질은 PERK 및 elF2a의 인산화를 증가시키는 활성이 있으며(도 5a 참조), 소포체 유도 물질에 의해 발생하는 렙틴 저항성 기작에서 STAT3의 인산화를 회복시키는 기작을 통해 렙틴 저항성을 개선하는 활성이 있다는 사실을 알 수 있었다(도 5b 참조).
그러므로 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 일산화탄소의 경우, PERK의 인산화 유도를 통해 STAT3의 활성을 조절함에 따라 렙틴 저항성을 감소 또는 개선할 수 있으며, 나아가 렙틴 저항성에 의한 비만을 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
따라서 본 발명은 일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 “일산화탄소(CO)"는 액체 형태로 압출된 또는 수용액에 용해된 기체상인 분자 일산화탄소로 정의할 수 있으며, “일산화탄소를 포함하는 조성물”은 이를 필요로 하는 개체에 처리 또는 투여되어질 수 있는 일산화탄소를 함유하는 기체 또는 액체 조성물을 말한다.
또한, 본 발명에서 상기 일산화탄소는 헴옥시게나제(heme oxygenase)-1에 의해 발생하는 것일 수 있다.
상기 헴옥시게나제(HO)는 헴의 분해시 최초 단계 및 속도 제한 단계를 촉매화하여 동일한 몰의 비리베르딘 IXa, 일산화탄소(CO) 및 철을 생산시키며, 헴옥시게나제는 3개의 이소형태, 즉, 고도 유도성인 HO-1 및 항상 발현되는 HO-2와 HO-3가 존재한다(Choi 등, E. J. Bioch . 247: 725-732). 이중, HO-1의 경우, 헴이 주된 기질임에도 불구하고, 중금속, 사이토카인, 호르몬, 엔도톡신 및 열충격을 비롯한 다양한 비-헴 제제들 또한 HO-1 발현의 강한 유도자로 알려져 있다. 이러한 HO-1 유도자의 다양성은 HO-1의 헴 분해시의 역할에도 불구하고, HO-1이 세포내에서 향상성을 유지하는 생체 기능도 담당한다는 추측을 추가적으로 지지해 준다. 더욱이, HO-1은 과산화수소, 글루타티온 고갈자, UV 방사, 엔도톡신 및 과산소증을 비롯한 산화적 스트레스를 유발하는 다양한 제제에 의해서도 강하게 유도될 수 있다.
본 발명에 따른 일산화탄소는 헴옥시게나제(heme oxygenase)-1 뿐만 아니라 헴옥시게나제(heme oxygenase)-1의 유도물질에 의해서도 발생될 수 있으며, 바람직하게는 헴옥시게나제-1에 의해 발생된 것일 수 있으며, 본 발명에서 상기 일산화탄소 공급체는 이에 제한되지는 않으나, RuCO(Ruthenium Carbon Monoxide), CORM-1(Mn2CO10 :manganese decacarbonyl), CORM-3(Ru(CO)(3)Cl(glycinate)) 및 CORM-A1(sodium boranocarbonate)으로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있고, 바람직하게는 RuCO(Ruthenium Carbon Monoxide)일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 일산화탄소는 렙틴 저항성(Leptin resistance)을 감소 또는 개선시킬 수 있는 특징이 있으며, 상기 렙틴 저항성은 산화적 스트레스의 한 종류인 소포체(ER) 스트레스에 의해 유발된 것일 수 있다.
또한, 상기 소포체(ER) 스트레스를 유발시킬 수 있는 물질로는 당업계에서 소포레 스트레스를 유발시키기 위해 사용할 수 있는 물질이라면 모두 사용가능하고, 바람직하게는 이에 제한되지는 않으나, TG(thapsigargin), TM(tunicamycin) 및 호모시스테인(homocysteine)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있다.
또한, 상기 렙틴 저항성의 감소 또는 개선은 본 발명의 일산화탄소에 의한 PERK(protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase)의 인산화를 통해 이루어지는 것일 수 있다.
나아가 본 발명에 따른 상기 비만의 예방 또는 치료용 조성물은 일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체 이외에도 소포체 내의 비정상적으로 접혀진 단백질의 접힘을 조절하는 작용을 하는 샤페론 활성 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 샤페론 활성 물질로는 4-PBA(4-phenylbutyric acid) 또는 TUDCA(tauroursodeoxycholic acid)를 사용할 수 있다.
그러므로 일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 비만, 특히 렙틴 저항성에 의한 비만을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 '치료'란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.
본 발명에 따른 상기 비만의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 비만의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
또한, 본 발명의 일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01 ㎍ 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ㎍ 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체의 비만 예방 또는 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 >
하기 기술된 실험들을 수행하기 위해 사용된 시약 및 세포 배양 조건은 다음과 같다.
시약
트리카보닐 디클로로류테늄(tricarbonyl dichlororuthenium) (II) 다이머(RuCO)는 시그마 알드리치사로부터 구입한 것을 사용하였으며, 렙틴은 R&D 시스템사(Minneapolis, MN(으로부터 구입하여 사용하였고, TG(thapsigargin)과 TM(tunicamycin)은 칼바이오켐(Grand island, NY)에서 구입한 것을 사용하였다. 또한, 항체로서 인산화(p)-PERK, PERK, eIF2a, CHOP, OB-R, STAT-3 및 beta-actin에 대한 항체들을 산타크루즈(캘리포니아)에서 구입하여 사용하였고, p-STAT3(Tyr705), p-eIF2a에 대한 항체는 세포 신호 테크놀러지사로부터 구입한 것을 사용하였으며, IRE1a에 대한 항체는 Novus biologicals로부터 구입하였고, GRP78에 대한 항체는 Stressgen(Ann Arobor, MI)로부터 구입하여 사용하였다. IRE1에 대한 si RNA는 산타크루즈사로부터 구입하여 사용하였고, 이외 기타 시약들은 모두 시그마 알드리치사로부터 구입한 것을 사용하였다.
세포 배양
차이니즈 햄스터 CHO-K1 세포는 열처리로 비활성화된 10% 소태아혈청을 포함하는 Ham's F-12 영양 배지를 사용하여 37℃, 5% 이산화탄소 및 95% 공기조건하에서 배앙하였고, 사람 신경모세포종(neuroblastoma cell)인 SK-N-AS 세포는 열처리로 비활성화된 10% 소태아혈청을 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% 이산화탄소 및 95% 공기조건하에서 배양한 것을 사용하였다.
< 실시예 1>
ER 스트레스 반응 하에서 일산화탄소의 PERK 활성 유도
본 발명자들은 ER 스트레스에 의해 유도되는 렙틴 저항성에서 일산화탄소의 영향을 확인하기 위하여, 먼저 상기 기술된 조건으로 배양된 CHO-K1 세포 및 SK-N-AS 세포에 TG(thapsigargin) 1uM, TM(tunicamycin) 2ug/ml 및 RuCO 20uM을 각각 처리하여 세포의 ER 스트레스를 유도한 뒤, 웨스턴 블럿을 수행하여 상기 세포내에서의 p-PERK, p-eIF2a, GRP78 및 CHOP의 발현정도를 측정하였다. 이때 상기 웨스턴 블럿은 TG, TM 또는 RuCO이 처리된 각 세포들을 세포용해액(150mM NaCl, 1.0% IGEPAL CA-630, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 50mM Tris, 단백질 분해 억제 효소 칵테일 및 인산화 억제효소 칵테일)으로 용해시킨 다음, 13000rpm으로 15분간 4℃로 원심분리하여 상층액을 수득하였고, BCA 단백질 분석 시약을 사용하여 수득한 단백질의 함량을 측정하였으며, laemmli 버퍼를 첨가한 후 5분간 열처리하였고, 각 샘플들을 동일한 양(50ug)으로 7.5~12%의 SDS-PAGE 상에서 전기영동 시킨 다음, 폴리(vinylidene difluoride) 막으로 단백질들을 이동시켰고, 상기 막은 5% nonfat milk 및 01% tween 20이 첨가된 PBS 용액(PBS-T) 으로 30분간 블록킹 시켰다. 이후, p-STAT3(1:1000), p-PERK(1:500), p-eIF2a(1:1000), IRE1(1:500), OB-R(1:500), GRP78(1:1000) 및 CHOP(1:500) 항체들을 1% nonfat milk을 함유하는 PBS-T 용액 상에서 3시간 동안 반응시켰고, PBS-T 용액으로 3번 세척하였다. 이후, 항체 반응이 완료된 막은 HRP(horseradish peroxidase) 결합된 이차 항체와 40분간 반응시킨 다음, PBS-T 용액으로 5회 세척하고, chemiluminescence 용액에 5분간 반응시킨 다음, x-레이 필름상에서 단백질 밴드들을 가시화시켰다. 이때 세기 측정을 위해 광학 밀도(gray-scale value of pixels:0~25)는 스키온 이미지 기기를 이용하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, ER 스트레스 유발 물질인 TG 또는 TM 세포에 처리한 결과, PERK 및 eIF2a의 인산화는 증가하는 것으로 나타났고, GRP78 및 CHOP의 발현도 증가하는 것으로 나타났다. 반면, 일산화탄소 유발물질인 RuCO을 세포에 처리하였을 경우, PERK 및 eIF2a의 인산화는 TG 또는 TM을 처리하였을 경우와 동일하게 증가하는 것으로 나타났으나, GRP78 및 CHOP의 발현에는 아무런 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 일산화탄소가 PERK 경로 활성을 통해 ER 스트레스 반응에 관여한다는 사실을 알 수 있었다.
< 실시예 2>
렙틴 수용체의 발현 및 STAT3 의 인산화에 일산화탄소가 미치는 영향분석
ER 스트레스에 의해 발생하는 일산화탄소가 세포 내에서 렙틴 수용체의 발현 및 STAT3의 인산화에 미치는 영향을 조사하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 즉, 렙틴 수용체가 발현되는 세포인 CHO-K1-OB-RB 세포에 TG(thapsigargin) 1uM, TM(tunicamycin) 2ug/ml, RuCO 20uM, TM 2ug/ml+RuCO 20uM 및 TG 1uM+RuCO 20uM의 혼합액을 각각 처리한 후, 4시간 동안 배양하였다. 그런 뒤, 상기 실시예 1의 방법과 동일하게 웨스턴 블럿을 사용하여 렙틴 수용체의 발현 정도를 분석하였다. 또한, STAT3의 인산화 정도 분석은 CHO-K1-OB-RB 세포에 1, 5, 10ug/ml의 렙틴을 처리하였고, 대조군으로는 렙틴 수용체가 발현되지 않는 세포인 CHO-K1 세포에 IL-6(25ng/ml) 및 렙틴(10ug/ml)을 처리하였다. 이후 상기와 같이 처리된 각각의 세포에 대해 p-STAT3 및 STAT3 항체를 사용하여 상기 실시예 1와 동일한 방법으로 웨스턴 블럿을 수행하였다.
또한, 나아가 CHO-K1-OB-RB 세포에 TG 1uM, TM 2ug/ml, RuCO 20uM 및 렙틴(10ug/ml)을 각각 처리하고 상기와 같이 웨스턴 블럿을 수행하여 각 세포에서의 STAT3의 인산화 정도를 관찰하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, ER 스트레스 유발물질인 TG, TM, RuCO은 렙틴 수용체의 발현에 아무런 영향을 주지 않는 것으로 나타났고, 또한 렙틴 수용체가 발현되는 세포의 경우, 렙틴 처리에 의해 STAT3가 인산화되는 것으로 나타났으며, 인산화 정도는 처리한 렙틴의 농도에 비례하는 것으로 나타났다. 나아가 일산화탄소가 STAT3의 인산화에 미치는 영향을 확인하기 위해 렙틴 수용체가 발현되는 세포에 대해 일산화탄소 유발 물질들 및 렙틴을 각각 처리한 결과, 일산화탄소 유발물질인 TG, TM, RuCO을 처리한 군에서는 인산화된 STAT3를 관찰하지 못한 반면, 렙틴만을 처리한 군에서는 인산화된 STAT3를 관찰할 수 있었다.
따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 본 발명의 일산화탄소는 렙틴 수용체의 발현과 STAT3의 인산화에는 아무런 영향을 미치지 않는다는 사실을 알 수 있었다.
< 실시예 3>
ER 스트레스로 유도된 렙틴 저항성에 미치는 일산화탄소의 영향
상기 실시예 2를 통해 렙틴이 렙틴 수용체 발현 세포에서 STAT3의 인산화를 증가시킨다는 사실을 확인하였고, 반면, 일산화탄소의 경우에는 STAT3의 인산화에는 아무런 영향을 미치지 않음을 확인함에 따라, 본 발명자들은 렙틴 수용체가 발현되는 세포에서 ER 스트레스 동안 UPR(unfolded protein response)에 의해 유도되는 렙틴 저항성을 감소시킬 수 있는 작용을 하는지를 조사하였다.
이를 위해, 렙틴 수용체 발현 세포주인 SK-N-AS-OB-RB 세포에 단백질의 접힘을 도와주고, ER 스트레스로 유도되는 렙틴 저항성을 감소시킬 수 있는 화학적 샤페론인 4-PBA(4-phenylbutyric acid) 5mM 또는 RuCO 20uM을 2시간 동안 각각 처리한 후, TM 2ug/ml을 4시간 동안 각각 처리하고, 이후 렙틴(10ug/ml)을 15분 동안 각 세포에 처리하였다. 또한, 다른 실험군으로서, SK-N-AS-OB-RB 세포에 대해 RuCO을 각각 5, 10, 20uM의 농도로 2시간 동안 각각 처리하고, TM 2ug/ml을 4시간 동안 처리한 다음, 렙틴(10ug/ml)을 15분 동안 각 세포에 처리하였다. 이후 상기 세포들에서의 STAT3의 인산화 정도는 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일하게 웨스턴 블럿을 수행하여 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 4-PBA 또는 일산화탄소 유발물질을 처리한 세포의 경우, ER 스트레스 유발 물질에 의해 억제된 STAT3의 인산화를 다시 증가시키는 것으로 나타났고, STAT3의 인산화 증가는 처리 농도에 비례하는 것으로 나타났다. 이에 본 발명자들은 본 발명에 따른 일산화탄소는 ER 스트레스에 의한 렙틴 저항성을 감소 또는 개선시킬 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
< 실시예 4>
ER 스트레스로 유도된 렙틴 저항성에 미치는 IRE1 의 영향
본 발명자들은 상기 실시예 3을 통해 본 발명의 일산화탄소가 ER 스트레스로 유도되는 렙틴 저항성을 감소시킬 수 있다는 사실을 확인함에 따라 이러한 일산화탄소의 효과가 또 다른 ER 스트레스 인자인 IRE1에도 영향을 미칠 수 있는 지를 조사하였다. 이를 위해 IRE1 si RNA를 사용하였는데, 여기서 IRE1 단백질은 ER 스트레스시 인산화가 증가되고 다이머(dimer)형태를 이루는 것으로 알려진 바 있다. 먼저 상기 조사를 위해 렙틴 수용체 발현 세포주인 SK-N-AS-OB-RB 세포에서 IRE1 유전자의 발현 억제를 위해 IRE1 siRNA를 산타 크루즈사로부터 구입하여, 당업계에 공지된 리포펙타민 방법으로 세포에 도입시켰고, 대조군으로는 스크램블 siRNA을 사용하였다. 상기 방법으로 siRNA가 도입된 세포는 10% FBS를 함유하는 배지에서 36시간 동안 배양한 후, 2ug/ml의 TM을 세포에 처리하여 4시간 동안 배양한 다음, 다시 렙틴(10ug/ml)을 15분간 처리하였고, 이후 IRE1에 대한 항체를 사용하여 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일하게 웨스턴 블럿을 통해 STAT3의 인산화 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, IRE1 siRNA은 세포내로 잘 도입되어 IRE1의 유전자 발현을 효과적으로 억제함을 알 수 있었으며, IRE1 siRNA이 처리되지 않은 세포의 경우, ER 스트레스에 의해 유도되는 렙틴 저항성이 관찰된 반면, IRE1 siRNA에 의해 IRE1의 유전자 발현이 억제된 경우에서는 ER 스트레스에 의해 유도되는 렙틴 저항성이 감소되는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 IRE1이 ER 스트레스에 의해 유도되는 렙틴 저항성에 관여한다는 사실을 알 수 있었으며, 특히 IRE1의 발현 억제를 통해 렙틴 저항성을 감소시킬 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
< 실시예 5>
일산화탄소의 PERK 인산화를 통한 렙틴 저항성 개선 효과
나아가 본 발명자들은 일산화탄소가 PERK의 인산화를 통해 ER 스트레스로 유도된 렙틴 신호의 억제를 회복시킬 수 있는지를 조사하였는데, 이를 위해 렙틴 수용체가 발현되는 세포인 SK-N-AS-OB-RB 세포에 20uM의 RuCO를 2시간 전 처리하고, TM(2ug/ml)를 4시간 처리한 다음, 렙틴(10ug/ml)을 15분간 처리하였다. 이후, p-PERK, PERK, p-STAT3, STAT3, p-eIF2a 및 eIF2a에 대한 항체를 사용하여 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일하게 웨스턴 블럿을 수행하여 상기 단백질들의 발현 정도를 분석하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 일산화탄소 유발 물질인 RuCO를 처리하였을 경우, PERK 및 eIF2의 인산화를 증가시키는 것으로 나타났고, PERK 및 eIF2의 인산화 증가는 ER 스트레스 유발 물질인 TM 처리에 의한 것보다 더 우수한 것으로 나타났다. 반면, 렙틴만을 처리한 경우는 PERK 및 eIF2의 인산화에 아무런 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다(도 5a 참조). 또한, STAT3의 인산화 정도를 측정한 결과, 렙틴 처리시 STAT3의 인산화가 증가된 것으로 나타났으며, TM을 처리한 경우에는 소포체 스트레스가 유도되어 렙틴 저항성에 의해 STAT3의 인산화가 감소되는 것으로 나타났다. 반면, 상기 TM이 처리된 세포에 일산화탄소 유도물질인 RuCO를 처리한 경우에는 TM에 의해 억제된 STAT3의 인산화가 다시 회복되는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 일산화탄소가 PERK의 인산화를 촉진시켜 ER 스트레스에 의한 렙틴 신호의 억제를 회복시킬 수 있음을 알 수 있었고, 궁극적으로 렙틴 저항성을 감소 또는 개선함을 통해 비만을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (9)

  1. 일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 일산화탄소는 헴옥시게나제(heme oxygenase)-1에 의해 발생하는 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 일산화탄소 공급체는 RuCO(Ruthenium Carbon Monoxide), CORM-1(Mn2CO10 :manganese decacarbonyl), CORM-3(Ru(CO)(3)Cl(glycinate)) 및 CORM-A1(sodium boranocarbonate)으로 이루어진 군 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 일산화탄소는 렙틴 저항성(Leptin resistance)을 개선시키는 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 렙틴 저항성은 소포체(ER) 스트레스에 의해 유발된 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    렙틴 저항성의 개선은 일산화탄소에 의한 PERK(protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase)의 인산화를 통해 이루어짐을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 소포체(ER) 스트레스는 TG(thapsigargin), TM(tunicamycin) 및 호모시스테인(homocysteine)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 샤페론 활성 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 샤페론 활성 물질은 4-PBA(4-phenylbutyric acid) 또는 TUDCA(tauroursodeoxycholic acid)인 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물.
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012169654A1 (ja) * 2011-06-07 2012-12-13 学校法人慶應義塾 一酸化炭素（co）による脂肪酸、コレステロールの取り込み阻害
CN103445007A (zh) * 2013-06-21 2013-12-18 华南农业大学 牛磺熊去氧胆酸作为饲料添加剂在缓解鸡热应激方面的应用
KR101383416B1 (ko) * 2012-07-27 2014-04-08 울산대학교 산학협력단 일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하는 빈혈의 예방 또는 치료용 조성물
KR101398368B1 (ko) * 2011-03-16 2014-05-22 울산대학교 산학협력단 일산화탄소 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 포함하는 폐경기 증상의 예방 또는 치료용 조성물
WO2020238832A1 (zh) * 2019-05-28 2020-12-03 北京生命科学研究所 血红素氧合酶-1诱导剂及其应用

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