KR20110119061A - Human adipocyte conditioned media extract derived from adipose stem cells having hair growth-promoting effects and uses thereof - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A pharmaceutical composition containing a conditioned medium for preventing alopecia is provided to induce skin tissue regeneration and hair growth. CONSTITUTION: A pharmaceutical composition for preventing alopecia or inducing hair growth contains a conditioned medium prepared by culturing human adipose-derived stem cells in a serum-free medium and filtering. The hair growth is induced by topical application or intradermal injection on a lesion. A therapeutic agent for treating alopecia contains the pharmaceutical composition as an active ingredient. A therapeutic agent for treating atrichia contains the pharmaceutical composition as an active ingredient.

Description

양모 효과를 가지는 인간 지방유래 줄기세포의 조건 배지 및 이의 용도{Human adipocyte conditioned media extract derived from adipose stem cells having hair growth-promoting effects and uses thereof}Human adipocyte conditioned media extract derived from adipose stem cells having hair growth-promoting effects and uses approximately}

본 발명은 양모효과를 가지는 인간 지방유래 줄기세포의 배양액 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인간 지방유래 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양한 후, 여과를 하여 얻은 조건 배지를 유효성분으로 함유하는 탈모예방 또는 양모유도용 약학 조성물, 상기 약학 조성물을 탈모부위 또는 무모 부위에 국소적으로 도포 또는 피내주사하여 양모를 유도하는 방법, 상기 약학 조성물을 유효성분으로 포함하는 탈모 치료제 및 무모증 치료제에 관한 것이다.The present invention relates to a culture medium of human fat-derived stem cells having a wool effect and its use, and more particularly, to cultivate human fat-derived stem cells in a serum-free medium, and then, containing the conditioned medium obtained by filtration as an active ingredient. A pharmaceutical composition for preventing or preventing hair loss, a method of inducing wool by topically applying or intradermal injection of the pharmaceutical composition to a hair loss site or a hair loss site, and a hair loss treatment agent and alopecia treatment agent comprising the pharmaceutical composition as an active ingredient will be.

최근 높아진 미용에 대한 관심 때문에 탈모증의 치료에 대한 대중의 관심 또한 높아지고 있다. 탈모증(alopecia)이란 비정상적으로 털이 많이 빠지는 증상을 말하며, 대게는 머리털이 많이 빠지는 증상을 말한다. 모발은 발생, 성장, 퇴화 및 휴지기의 주기를 가지는데 휴지기에 있는 모발이 하루에 보통 50 내지 100개 정도가 정상적으로 빠지는 것으로 알려졌다. Due to the recent increased interest in beauty, the public's interest in the treatment of alopecia is also increasing. Alopecia refers to abnormal hair loss, and usually hair loss. Hair has a period of development, growth, degeneration and resting periods, and it is known that about 50 to 100 hairs fall out normally in the resting period.

탈모증의 원인에는 여러 가지가 있는데, 산모의 출산 후 후유증, 스트레스, 갑상선기능항진증(hyperthyroidism) 또는 갑상선기능저하증(hypothyroidism), 과도한 다이어트, 철 결핍(iron deficiency), 항암치료 후유증, 남성호르몬성 탈모(androgenetic alopecia) 및 두피백선과 같은 피부병 등이 알려져 있다. There are many causes of alopecia: maternal sequelae, stress, hyperthyroidism or hypothyroidism, excessive diet, iron deficiency, chemo sequelae, and male hormone loss ( skin diseases such as androgenetic alopecia) and scalp ringworm are known.

탈모의 치료법으로 현재 가장 많이 사용하는 방법은 프로페시아(propecia)의 경구투여 및 미녹시딜(minoxidil)의 국소적 도포와 같은 약물요법이며, 그외에 수술적 방법으로 자기 자신의 모발을 이용하여 이식하는 자가모발이식이 널리 알려져 있다. 프로페시아는 합성 안티안드로젠(anti-androgen)으로서, 테스토스테론(testosterone)을 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT)으로 전환시키는 효소인 5-알파 환원효소(5-alpha reductase)를 억제한다. 상기 약물은 원래 양성 전립선비대증(benign prostatic hyperplasia) 및 전립선암(prostate cancer)의 치료에 사용되어 왔으며, 그 후에 남성호르몬성 탈모에도 효과가 있는 것으로 알려져 1997년 남성형 탈모치료제로 미국 식품의약국의 승인을 받았다. 하지만, 프로페시아를 지속적으로 복용할 경우 남성에서 발기부전(erectile dysfunction) 및 성기능 장애와 같은 부작용이 있을 수 있으며, 임산부 및 가임기 여성의 피부에 흡수될 경우 태아의 웅성생식기 기형을 초래할 수도 있는 것으로 알려졌다. 미녹시딜은 혈관확장제 및 탈모증의 치료에 쓰이며, 부작용으로는 두피 가려움증이 있다. 상기 약물요법에 의한 치료는 투여할 당시에는 효과가 나타나지만 치료가 중단되면 탈모가 다시 진행되는 것으로 밝혀졌다. 자가모발이식 또한 반영구적이라는 장점이 있지만, 비교적 많은 비용이 소모된다는 단점이 있다. Currently, the most commonly used method for the treatment of hair loss is drug therapy such as oral administration of propecia and topical application of minoxidil. In addition, self-grown hair transplanted using its own hair by surgical method Transplantation is widely known. Propecia is a synthetic anti-androgen that inhibits 5-alpha reductase, an enzyme that converts testosterone to dihydrotestosterone (DHT). The drug was originally used for the treatment of benign prostatic hyperplasia and prostate cancer, after which it is known to be effective for androgenetic alopecia and was approved by the US Food and Drug Administration as a treatment for masculine hair loss in 1997. Received. However, continuous doses of propecia may cause side effects such as erectile dysfunction and sexual dysfunction in men, and may be caused by male genital malformation of the fetus when absorbed into the skin of pregnant women and women of childbearing age. Minoxidil is used for the treatment of vasodilators and alopecia, and side effects include scalp itching. The treatment with the pharmacotherapy was effective at the time of administration, but it was found that hair loss proceeds again when the treatment is stopped. Self hair transplantation also has the advantage of being semi-permanent, but has the disadvantage of relatively high cost.

한국공개특허 제2008-0097593호에는 인간 지방조직 유래 성체줄기세포 및 모낭세포를 함유하는 세포치료제가 개시되어 있으며, 한국등록특허 제10-0771171호에는 모낭 줄기세포를 유효성분으로 하는 대머리 치료용 조성물이 개시되어 있다. Korean Patent Laid-Open Publication No. 2008-0097593 discloses a cell therapeutic agent containing adult stem cells and hair follicle cells derived from human adipose tissue, and Korean Patent No. 10-0771171 discloses a composition for treating baldness using hair follicle stem cells as an active ingredient. Is disclosed.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 인간 지방유래 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양한 후, 여과를 통해 얻은 조건 배지가 표피 및 진피의 구성세포인 불사화 케라틴 형성세포 및 인간 진피유두세포를 효과적으로 증식시키는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.The present invention is derived from the above requirements, the present inventors incubated in human serum-derived stem cells in serum-free medium, and then the conditioned medium obtained through filtration is immortalized keratin forming cells and constituent cells of the epidermis and dermis; The present invention has been found to effectively propagate human dermal papilla cells, thus completing the present invention.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 인간 지방유래 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양한 후, 여과를 하여 얻은 조건 배지를 유효성분으로 함유하는 탈모예방 또는 양모유도용 약학 조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a pharmaceutical composition for hair loss prevention or wool induction containing the culture medium obtained by filtration after culturing human adipose derived stem cells in serum-free medium.

또한, 본 발명은 상기 약학 조성물을 탈모부위 또는 무모 부위에 국소적으로 도포 또는 피내주사하는 것을 특징으로 하는 양모를 유도하는 방법을 제공한다. The present invention also provides a method for inducing wool, wherein the pharmaceutical composition is topically applied or intradermal injection to the hair loss site or hair loss site.

또한, 본 발명은 상기 약학 조성물을 유효성분으로 포함하는 탈모 치료제를 제공한다. The present invention also provides a hair loss treatment agent comprising the pharmaceutical composition as an active ingredient.

또한 본 발명은 상기 약학 조성물을 유효성분으로 포함하는 무모증 치료제를 제공한다. In another aspect, the present invention provides a therapeutic agent for alopecia comprising the pharmaceutical composition as an active ingredient.

본 발명의 인간 지방유래 줄기세포의 조건 배지는 피부조직의 재생 및 양모를 유도하는 활성을 가지므로 탈모증의 치료와 예방에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.Conditional medium of the human adipose derived stem cells of the present invention is expected to be effectively used for the treatment and prevention of alopecia because it has the activity of inducing regeneration and wool of skin tissue.

도 1은 인간 진피유두세포(human dermal papilla cells)를 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지 및 지방세포-조건 배지로 처리한 후, MTT 분석법에 의한 세포증식의 측정결과를 나타낸다. 분리된 인간 지방유래 줄기세포(adipose tissue-derived stem cells, ADSCs)는 9, 12 및 15일 동안 α-MEM에서 유지되었다. 인간 지방유래 줄기세포에서 지방세포로의 분화는 지방세포분화배지(인슐린, 덱사메사손, 이소부틸-메틸-크산틴(isobutyl-methyl-xanthine) 및 인도메사신)에 의해 9, 12 및 15일 동안 유도되었다. 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지 및 분화된 지방세포-조건 배지는 무혈청 α-MEM에서 48시간 배양 후 각각 수집되었다. 인간 진피유두세포는 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지 및 지방세포-조건 배지에서 배양되었고, 24시간 및 48시간 후 MTT 분석법에 의해 세포의 증식이 측정되었다. 48시간 동안 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지를 처리한 군에서 인간 진피유두세포의 증식이 유의적으로 증가하였고, 반면에 지방세포-조건 배지의 처리는 증식을 억제하였다. 스튜던트 T 검정이 통계적 분석에 이용되었고, 모든 결과들은 적어도 3번 이상의 독립적인 실험을 통한 평균으로 나타내었다. 또한 각각의 독립적인 실험들을 위해 인간 지방유래 줄기세포의 다른 공급원(sources)이 사용되었다. *: p < 0.05 에서 음성대조군에 대한 유의성 검정, d: 각 배지에서의 처리기간.
도 2는 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지 처리 후, 인간 진피유두세포에서 신호전달 단백질들의 발현 변화를 나타낸다. 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지 처리 후, 인산화된 Akt의 발현은 미세하게 증가하였고, 인산화된 Erk의 발현은 명확하게 증가하였다.
도 3은 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지 처리 후, 인간 진피유두세포의 세포주기 및 세포주기 관련 단백질을 분석한 결과를 나타낸다. 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지는 세포주기의 조절을 통해 인간 진피유두세포의 증식을 증가시켰다. 48시간의 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지의 처리는 대조군에 비해 S기의 증가 및 G1기 정체(arrest)의 감소를 야기시켰다(상단). 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지 처리 24시간 후, Cyclin D 및 CDK2의 발현은 명확하게 상향조절(up-regulation) 되었다(하단). CNT: 대조군, ADSC-CM: 인간 진피유두세포에 처리한 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지.
도 4는 불사화 케라틴 형성 세포에 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지를 처리한 후, 불사화 케라틴 형성 세포의 증식을 MTT 분석법으로 측정한 결과를 나타낸다. 불사화 케라틴 형성세포를 24시간 동안 스타빙(starving)한 후, 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지에 48시간 동안 배양한다. 이어서 MTT 분석법에 의해 세포의 증식을 측정하였다. 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지의 처리는 10 내지 30%의 농도에서 유의적으로 불사화 케라틴 형성 세포의 증식을 증가시켰다. 모든 결과들은 적어도 3번 이상의 독립적인 실험을 통한 평균으로 나타내었다. 또한 각각의 독립적인 실험들을 위해 인간 지방유래 줄기세포의 다른 공급원(sources)이 사용되었다. 스튜던트 T 검정이 통계적 분석에 이용되었다. *: p < 0.05 에서 음성대조군에 대한 유의성 검정.
도 5는 남성(n=5, 평균나이=34.8세)의 후두부에서 수집한 ex vivo 성장기 모발(anagen hair organ)에서 모발성장에 대한 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지의 영향을 나타낸다. 12.5%의 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지가 Williams E 배지에 첨가되어 졌다. 음성 대조군으로서 1/2 부피의 α-MEM이 Williams E 배지에 혼합되어졌으며 양성 대조군으로서 미녹시딜(minoxidil) 1 mM이 Williams E 배지에 첨가되어졌다. 12.5%의 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지를 처리한 군에서 유의적인 모간 신장(hair shaft elongation)이 관찰되었다. 결과 수치(values)는 각 성장 조건당 15개 이상의 모낭(hair follicle)의 누적 성장(cumulative growth)을 6일 동안 측정하여 평균±표준오차로 나타내었다. 스튜던트 T 검정이 통계적 분석에 이용되었다. 5개의 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지가 5명의 남성 두피 샘플에 임으로 각각 적용되었다. *: p < 0.05 에서 음성대조군에 대한 유의성 검정.
도 6은 C3H/HeN 누드마우스에서 인간 지방유래 줄기세포에 의한 모발 성장 자극을 나타낸다. 7주령 C3H/HeN 누드마우스를 이용하여 모발성장의 유도가 측정되었으며 모낭들은 휴지기로 동질화(synchronization)되었다. 인간 지방유래 줄기세포(5 x 105 cells) 및 대조군인 PBS(phosphate buffered saline)가 9일 동안 3일 간격으로 마우스의 등쪽 피부에 피내주사(intradermal injection) 되었다. 모발의 성장은 첫 번째 주사 후 12주 동안 측정되었다. 그 결과 PBS를 처리한 대조군에 비해 인간 지방유래 줄기세포를 처리한 군에서 모발성장이 증가한 것을 관찰하였다. 국소적인 적용을 한 군에서는 피부의 흡수율을 높이기 위해 0.2 mm 메소롤러(mesoroller; Moohan, Korea)를 처리 전에 10회 사용하였다. 모발성장 자극효과는 피부의 다크닝(darkening)에 의해 측정되었다. 12주 후, 대조군에 비해 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지를 국소적으로 적용한 군에서 모발성장이 증가되었다.
도 7은 대조군 및 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지를 처리한 C3H/HeN 누드마우스의 등쪽 피부에 대한 H&E 염색 결과를 나타낸다. 조직학적 평가는 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지의 첫 번째 국소적인 적용 2 및 4주 후에 수행되었다. 그 결과 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지 처리 4주 후에 모낭의 수가 증가된 것을 관찰하였다. Figure 1 shows the results of measurement of cell proliferation by MTT assay after treatment of human dermal papilla cells with human adipose derived stem cell-condition medium and adipocyte-condition medium. Isolated human adipose tissue-derived stem cells (ADSCs) were maintained in α-MEM for 9, 12 and 15 days. Differentiation of human adipose derived stem cells into adipocytes was carried out for 9, 12 and 15 days by adipocyte differentiation media (insulin, dexamethasone, isobutyl-methyl-xanthine and indomesacin). Induced. Human adipocyte-derived stem cell-condition medium and differentiated adipocyte-condition medium were collected after 48 hours of incubation in serum-free α-MEM, respectively. Human dermal papilla cells were cultured in human adipose derived stem cell-condition medium and adipocyte-condition medium, and cell proliferation was measured by MTT assay after 24 and 48 hours. Proliferation of human dermal papilla cells was significantly increased in the group treated with human adipose derived stem cell-conditioned medium for 48 hours, whereas treatment with adipocyte-conditioned medium inhibited proliferation. Student's T test was used for statistical analysis and all results were averaged over at least three independent experiments. In addition, different sources of human adipose derived stem cells were used for each independent experiment. *: significance test for negative control at p <0.05, d: duration of treatment in each medium.
Figure 2 shows the expression changes of signaling proteins in human dermal papilla cells after human adipose derived stem cell-condition medium treatment. After treatment with human adipose derived stem cell-condition medium, the expression of phosphorylated Akt was slightly increased and the expression of phosphorylated Erk was clearly increased.
Figure 3 shows the results of analyzing the cell cycle and cell cycle-related proteins of human dermal papilla cells after treatment with human adipose derived stem cell-condition medium. Human adipose derived stem cell-conditioning medium increased the proliferation of human dermal papilla cells through regulation of the cell cycle. Treatment with 48 hours of human adipose derived stem cell-condition medium resulted in an increase in S phase and a decrease in G1 arrest compared to the control (top). Twenty four hours after treatment with human adipose derived stem cell-conditioned media, the expression of Cyclin D and CDK2 was clearly up-regulated (bottom). CNT: control, ADSC-CM: human adipose derived stem cell-conditioned medium treated with human dermal papilla cells.
Figure 4 shows the results of measuring the proliferation of immortalized keratin forming cells by MTT assay after treatment of immortalized keratin forming cells with human adipose derived stem cell-condition medium. Immortalized keratinocytes are starved for 24 hours and then incubated in human adipose derived stem cell-conditioned medium for 48 hours. The proliferation of the cells was then measured by MTT assay. Treatment of human adipose derived stem cell-conditioned media significantly increased proliferation of immortalized keratin forming cells at concentrations of 10-30%. All results are averaged over at least three independent experiments. In addition, different sources of human adipose derived stem cells were used for each independent experiment. Student's T test was used for statistical analysis. *: Significance test for negative control at p <0.05.
5 shows ex collected from the back of the head of a male (n = 5, mean age = 34.8 years old). vivo hair growth (anagen hair organ) of human adipose derived stem cells for hair growth - conditions shows the influence of the media. 12.5% of human adipose derived stem cell-conditioning medium was added to Williams E medium. As a negative control, 1/2 volume of α-MEM was mixed in Williams E medium and 1 mM minoxidil was added to Williams E medium as a positive control. Significant hair shaft elongation was observed in the groups treated with 12.5% of human adipose derived stem cell-conditioned medium. The resulting values were expressed as mean ± standard error, measured over 6 days of cumulative growth of at least 15 hair follicles for each growth condition. Student's T test was used for statistical analysis. Five human adipose derived stem cell-conditioned media were randomly applied to five male scalp samples, respectively. *: Significance test for negative control at p <0.05.
6 shows hair growth stimulation by human adipose derived stem cells in C3H / HeN nude mice. Induction of hair growth was measured using 7-week-old C3H / HeN nude mice and hair follicles were synchronised during the resting phase. Human adipose derived stem cells (5 × 10 5 cells) and a control group, PBS (phosphate buffered saline), were injected intradermally into the dorsal skin of mice every three days for 9 days. Hair growth was measured 12 weeks after the first injection. As a result, it was observed that the hair growth was increased in the group treated with human adipose derived stem cells compared to the control group treated with PBS. In the topical application group, 0.2 mm mesoroller (Moohan, Korea) was used 10 times before treatment to increase skin absorption. Hair growth stimulating effects were measured by darkening of the skin. After 12 weeks, hair growth was increased in the group to which the human adipose derived stem cell-condition medium was applied topically compared to the control group.
FIG. 7 shows H & E staining results on the dorsal skin of C3H / HeN nude mice treated with control and human adipose derived stem cell-conditioned media. Histological evaluation was performed 2 and 4 weeks after the first topical application of human adipose derived stem cell-condition medium. As a result, it was observed that the number of hair follicles increased after 4 weeks of human adipose derived stem cell-condition medium treatment.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 지방유래 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양한 후, 여과를 하여 얻은 조건 배지(conditioned medium)를 유효성분으로 함유하는 탈모예방 또는 양모유도용 약학 조성물을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention is a pharmaceutical composition for preventing hair loss or induction of wool containing a conditioned medium obtained by culturing human adipose derived stem cells in a serum-free medium, followed by filtration. To provide.

본 발명의 약학 조성물에서, 상기 조건 배지는 바람직하게는 인간 지방유래 줄기세포를 무혈청 α-MEM(modified Eagle medium)에서 40 내지 60시간 동안 배양한 후, 원심분리한 다음 0.2 내지 0.25μm 필터로 여과를 하여 얻을 수 있으며, 더욱 바람직하게는 인간 지방유래 줄기세포를 무혈청 α-MEM(modified Eagle medium)에서 48시간 동안 배양한 후, 원심분리한 다음 0.22μm 필터로 여과를 하여 얻을 수 있다.In the pharmaceutical composition of the present invention, the condition medium is preferably cultured in human adipose derived stem cells in serum-free modified eagle medium (α-MEM) for 40 to 60 hours, centrifuged and then 0.2 to 0.25μm filter It can be obtained by filtration, more preferably, human adipose derived stem cells can be obtained by incubating for 48 hours in serum-free α-MEM (modified Eagle medium), followed by centrifugation and filtration with a 0.22 μm filter.

본 발명의 약학 조성물에서, 상기 조건 배지는 인간 진피유두세포(human dermal papilla cell)와 인간 케라티노세포(human keratinocytes)의 증식을 증가시킴으로써 두피 및 모발성장을 촉진할 수 있다.In the pharmaceutical composition of the present invention, the condition medium may promote scalp and hair growth by increasing the proliferation of human dermal papilla cells and human keratinocytes.

상기 줄기세포란 여러 종류의 조직 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화 세포를 말하며, 배반포(blastocyst)의 내세포괴(inner cell mass)로부터 분리되는 배아줄기세포(embryonic stem cell) 및 성체 조직으로부터 분리되는 성체줄기세포(adult stem cell)로 크게 분류할 수 있다. 성체줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 성체 조직으로부터 유래된 다분화능(mutipotency)을 갖는 미분화세포를 말하며, 예를 들어, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방, 제대혈 등의 다양한 성체세포로부터 유래될 수 있다. The stem cells refer to undifferentiated cells having the ability to differentiate into various types of tissue cells, and are separated from embryonic stem cells and adult tissues separated from the inner cell mass of the blastocyst. It can be broadly classified into adult stem cells. Adult stem cells refer to undifferentiated cells having mutipotency derived from adult tissues of mammals including humans, preferably humans. For example, various stem cells such as bone marrow, blood, brain, skin, fat, umbilical cord blood, etc. Can be derived from adult cells.

상기 인간 지방유래 줄기세포는 인간의 지방조직으로부터 분리된 일종의 성체줄기세포이다. 지방조직의 획득은 통상적으로 시행되는 지방흡입(liposuction) 과정에서 부수적으로 얻을 수 있어 충분한 양의 줄기세포를 용이하게 얻고 배양할 수 있다는 장점이 있으며, 또한 골수 채취에 비해 안전성이 우수하다. The human adipose derived stem cells are a kind of adult stem cells isolated from human adipose tissue. Acquisition of adipose tissue can be obtained incidentally in the process of liposuction, which is conventionally performed, and thus has an advantage of easily obtaining and culturing a sufficient amount of stem cells, and is also superior in safety to bone marrow harvesting.

상기 인간 지방유래 줄기세포는 줄기세포 배양용 배지, 예를 들어 혈청 배지를 이용하여 통상의 방법으로 배양될 수 있다. 바람직하게는 인간 지방유래 줄기세포를 10% 소태아혈청을 함유하는 α-modified Eagle medium에서 배양한 후, 최종적으로 무혈청 α-modified Eagle medium에서 배양함으로써, 획득되는 배양액 중의 단백질 함량을 높일 수 있다. 상기 무혈청 배지 단계는 지방조직으로부터 분리한 줄기세포를 특정의 극한 환경에 노출시킴으로서 분화를 최소화함과 더불어 줄기세포가 분비하는 단백질을 배양액으로부터 최대한 많이 회수할 수 있게 한다.The human adipose derived stem cells may be cultured in a conventional manner using a stem cell culture medium, for example, a serum medium. Preferably, the human adipose derived stem cells may be cultured in an α-modified Eagle medium containing 10% fetal bovine serum, and then finally cultured in a serum-free α-modified Eagle medium to increase the protein content in the obtained culture. . The serum-free medium step minimizes the differentiation by exposing the stem cells isolated from adipose tissue to a specific extreme environment, and enables the recovery of as much protein as possible from the culture medium.

본 발명의 조건 배지를 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition comprising the conditional medium of the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.

본 발명의 조건 배지의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.The pharmaceutical dosage forms of the conditioned medium of the present invention may be used in the form of their pharmaceutically acceptable salts, and may be used alone or in combination with other pharmaceutically active compounds as well as in a suitable collection.

본 발명에 따른 조건 배지를 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 조건 배지를 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition comprising the conditioned medium according to the present invention may be in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method. Can be formulated and used. Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition comprising the conditioned medium include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium Various compounds or mixtures, including silicates, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like. When formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, and such solid preparations may include at least one excipient such as starch, calcium carbonate and sucrose in the extract. ) Or lactose, gelatin and the like are mixed. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. . Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories. As the non-aqueous solvent and suspending agent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.

본 발명의 조건 배지의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조건 배지는 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위을 한정하는 것은 아니다.Preferred dosages of the conditioned medium of the present invention vary depending on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. However, for the desired effect, the conditioned medium of the present invention is preferably administered at 0.0001 to 100 mg / kg, preferably at 0.001 to 100 mg / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.

본 발명의 조건 배지는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 국소적 도포 또는 피내주사에 의해 투여될 수 있다.Conditional media of the invention can be administered to mammals, such as mice, mice, livestock, humans, and the like by a variety of routes. All modes of administration can be expected, for example by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, topical application or intradermal injection.

또한, 본 발명은 상기 약학 조성물을 탈모부위 또는 무모 부위에 국소적으로 도포 또는 피내주사하는 것을 특징으로 하는 양모를 유도하는 방법을 제공한다. 상기 투여 형태는 바람직하게는 국소적 도포 또는 피내주사일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The present invention also provides a method for inducing wool, wherein the pharmaceutical composition is topically applied or intradermal injection to the hair loss site or hair loss site. The dosage form may preferably be topical application or intradermal injection, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 상기 약학 조성물을 유효성분으로 포함하는 탈모 치료제 및 무모증 치료제를 제공한다.In addition, the present invention provides a hair loss treatment and alopecia treatment comprising the pharmaceutical composition as an active ingredient.

본 발명의 탈모 치료제 및 무모증 치료제는 남성호르몬성 탈모증 및 폐경 또는 난소제거 수술 후 발생할 수 있는 여성형 탈모증에 대한 치료를 위하여 두피에 적용할 수 있을 뿐만 아니라 발모를 필요로 하는 신체 부위라면 어디나 적용할 수 있다.The hair loss treatment agent and alopecia treatment agent of the present invention can be applied not only to the scalp for the treatment of androgenetic alopecia and gynecologic alopecia that may occur after menopause or ovarian removal surgery, but also to any part of the body that needs hair growth. have.

본 발명의 탈모 치료제 및 무모증 치료제에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. Pharmaceutically acceptable carriers included in the hair loss treatment and hair loss treatment of the present invention are conventionally used in the preparation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, Gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, It is not limited to this.

본 발명의 탈모 치료제 및 무모증 치료제는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. The hair loss treatment agent and the alopecia treatment agent of the present invention are in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient, according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. It may be prepared by or incorporated into a multi-dose container, and may further include a dispersant or stabilizer.

본 발명의 탈모 치료제 및 무모증 치료제는 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 발모 유도 약물요법 또는 수술요법 등과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행요법을 실시하였을 경우 극대화된 효과를 나타낼 수 있다.
The hair loss treatment agent and the alopecia treatment agent of the present invention may be used as a single therapy, but may also be used in combination with other conventional hair growth-inducing drug therapy or surgical therapy, and when combined with such a therapy, may exhibit an maximal effect.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

실시예Example 1: 인간 지방유래 줄기세포( 1: human adipose derived stem cells ( ADSCsADSCs )의 배양 및 조건 배지(Culture and condition medium ( ConditionedConditioned media)의 수집 collection of media)

인간 지방유래 줄기세포(ADSC)는 이전에 기재된 바와 같이 배양되어졌다(Lee et al., 2004, Cell Physiol biochem 14, 311-324). 인간 지방유래 줄기세포는 평균나이 43.8세의 여성 5명으로부터 지방흡입(liposuction)에 의해 획득된 피하지방조직(subcutaneous adipose tissue)으로부터 수집하였다. 인간 지방유래 줄기세포는 상기 피하지방조직에 제1형 콜라겐 분해효소(collagenase type I, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) 0.075%를 37℃에서 45분간 처리한 후, 70μm 메쉬 필터(mesh filter)로 여과하여 분리되었고, 이어서 상기 여과물질을 α-modified Eagle medium (α-MEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 혼합하고 원심분리하였다. 획득된 펠렛부 즉, 인간 지방유래 줄기세포 분획(fraction)을 세척한 후, 1200×g 에서 5분 동안 원심분리하였고, 이어서 10%의 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 함유하는 α-MEM에 상기 분획물을 재부유하여 37℃ 5% CO2에서 배양하였다. 인간 지방유래 줄기세포에서 지방세포로의 분화(adipogenic differentiation)는 인슐린(insulin), 덱사메사손(dexamethasone), 이소부틸-메틸-크산틴(isobutyl-methyl-xanthine), 및 인도메사신(indomethacin)에 의해 9 내지 15일 동안 유도되었다. Human adipose derived stem cells (ADSC) were cultured as previously described (Lee et al., 2004, Cell Physiol biochem 14, 311-324). Human adipose derived stem cells were collected from subcutaneous adipose tissue obtained by liposuction from five women of average age 43.8 years. Human adipose derived stem cells were treated with 0.075% of collagen type I (collagenase type I, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) for 45 minutes at 37 ° C. in a subcutaneous fat tissue, followed by a 70 μm mesh filter ( The filtrate was separated by filtration through a mesh filter, and the filtrate was then mixed with α-modified Eagle medium (α-MEM; Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) and centrifuged. The obtained pellets, i.e., human adipose derived stem cell fractions, were washed and centrifuged at 1200 x g for 5 minutes, followed by α- containing 10% fetal bovine serum (FBS). The fractions were resuspended in MEM and incubated at 37 ° C. 5% CO 2 . Adipogenic differentiation from human adipocyte-derived stem cells to insulin, dexamethasone, isobutyl-methyl-xanthine, and indomethacin By 9-15 days.

상기 배양세포로부터 조건 배지(conditioned media, CM)를 수확하기 위하여, 인간 지방유래 줄기세포(5 × 105 cells)와 성숙한 지방세포(adipocytes)를 무혈청(serum-free) α-MEM에서 배양하였다. 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지(ADSC-CM)와 지방세포-조건 배지(adipocyte-CM)를 배양 48시간 후에 수집하였고, 수집한 조건 배지들은 원심분리한 다음 0.22 μm의 시린지 필터(syringe filter)로 여과하였다.
In order to harvest the conditioned media (CM) from the cultured cells, human adipose derived stem cells (5 × 10 5 cells) and mature adipocytes (adipocytes) were cultured in serum-free α-MEM. . Human adipocyte-derived stem cell-condition medium (ADSC-CM) and adipocyte-condition medium (adipocyte-CM) were collected after 48 hours of culture, and the collected condition medium was centrifuged and then 0.22 μm syringe filter. Was filtered.

실시예Example 2: 인간  2: human 진피유두세포Dermal papilla cells (( humanhuman dermaldermal papillapapilla cellscells ) 및 ) And 불사화Immortalization 케라틴 형성 세포의 증식( Proliferation of keratinocytes proliferationproliferation ) 및 세포주기 분석) And cell cycle analysis

모발의 주기변화는 표피와 진피 성분들의 빠른 리모델링(remodeling)을 포함하므로, 배양된 인간 진피유두세포(human dermal papilla cells, hDPCs) 및 불사화 케라틴 형성세포(immortalized keratinocyte; HaCaT cell)의 증식(proliferation)을 조사하였다. 인간 진피유두세포와 불사화 케라틴 형성 세포는 10% 소태아혈청을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Invitrogen-Gibco-BRL)에서 배양되었다. 상기 세포의 증식은 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지를 처리한 후, 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide를 이용한 MTT 분석법(assay)에 의해 측정되었다. 또한 각각의 독립적인 실험들을 위해 인간 지방유래 줄기세포의 다른 공급원(sources)이 사용되었다. 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지를 25, 50 및 75%의 농도로 처리한 군에서는 인간 진피유두세포의 증식이 최대 130%까지 증가된 반면, 지방세포-조건 배지의 첨가는 증식을 억제하였다(도 1).Periodic changes in hair include rapid remodeling of epidermal and dermal components, thus proliferation of cultured human dermal papilla cells (hDPCs) and immortalized keratinocytes (HaCaT cells). ) Was investigated. Human dermal papilla cells and immortalized keratinocytes were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Invitrogen-Gibco-BRL) containing 10% fetal bovine serum. The proliferation of the cells was treated by human adipose derived stem cell-conditioning medium, followed by MTT assay using 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide. Was measured. In addition, different sources of human adipose derived stem cells were used for each independent experiment. In the groups treated with human adipocyte-derived stem cell-conditioned media at concentrations of 25, 50 and 75%, proliferation of human dermal papilla cells was increased by up to 130%, while addition of adipocyte-conditioned medium inhibited proliferation ( 1).

기초가 되는 메카니즘을 명확하게 하기 위해, 세포의 증식과 관련있는 신호전달 단백질들이 웨스턴 블롯(Western blot)에 의해 분석되었다. 인산화된Akt(pAkt; Ser473, Cell Signaling Tech., Inc., MA), Akt(Cell Signaling Tech., Inc., MA) 및 인산화된 Erk(pErk; Thr202/Tyr204, Cell Signaling Tech., Inc., MA)에 대한 1차 항체가 사용되었다. 웨스턴 블롯의 결과에서, 인산화된 Akt의 발현 수준(level)은 총(total) Akt에 비해 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지 처리 24 및 48시간 후에 증가하였다. 인산화된 Erk 발현 또한 총 Erk의 발현이 변하지 않은 동안, 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지 처리에 따라 확연하게 증가하였다(도 2). To clarify the underlying mechanism, signaling proteins involved in cell proliferation were analyzed by Western blot. Phosphorylated Akt (pAkt; Ser473, Cell Signaling Tech., Inc., MA), Akt (Cell Signaling Tech., Inc., MA) and Phosphorylated Erk (pErk; Thr202 / Tyr204, Cell Signaling Tech., Inc., Primary antibodies against MA) were used. In the results of the Western blot, the expression level of phosphorylated Akt increased 24 and 48 hours after human adipose derived stem cell-condition medium treatment compared to total Akt. Phosphorylated Erk expression also increased significantly following human adipose derived stem cell-condition medium treatment, while the expression of total Erk did not change (FIG. 2).

다음으로 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지를 처리한 인간 진피유두세포의 세포주기 분석이 유세포 분석기(FACScan flow cytometer, Beckton-Dickinson, CA)를 사용하여 수행되었다. G1기 정체(G1 arrest)를 시키기 위해, 인간 진피유두세포(3.2 × 105 cells/dish)은 스타빙(starving) 되어졌고, 이어서 배지는 무혈청 배지 또는 50%의 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지로 교체되어 48시간 동안 배양되었다. FACS 세포주기분석 결과에서, 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지의 처리는 인간 진피유두세포의 세포성장기(G1)는 감소시킨 반면, DNA 합성기(S) 및 유사분열기(G2-M)는 증가시켰다(도 3, 상단). 이어서 수행한 웨스턴 블롯에서, p21, p27 및 CDK4의 발현은 변화되지 않았지만(데이타 미제시), 세포주기와 관계되는 중요한 분자인 cyclin D1(Serotec, UK) 및 CDK2(Santa Cruz biotechnology)는 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지 처리 24시간 후에 명확히 상향조절(up-regulation) 되었다(도 3, 하단). 상기 결과들은 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지가 세포주기의 조절을 통하여 인간 진피유두세포의 증식을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 게다가 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지는 Erk 및 Akt 신호전달 경로를 활성화함으로써 진피유두세포의 생존과 증식을 촉진하는 것으로 나타난다. 진피 유두의 크기는 모발의 성장주기(hair growth cycle)와 밀접하게 관계되어 있으며, 진피 유두의 세포수는 모발 성장기(anagen phase)에서 증가한다고 보고되어 있다(Elliott et al., 1999, J Invest Dermatol 113, 873-877). 또한, 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지는 불사화 케라틴 형성 세포의 증식을 10 내지 30%의 농도에서 유의적으로 촉진한다(도 4).
Next, cell cycle analysis of human dermal papilla cells treated with human adipose derived stem cell-conditioning medium was performed using a flow cytometer (FACScan flow cytometer, Beckton-Dickinson, CA). To derive G1 arrest, human dermal papilla cells (3.2 × 10 5 cells / dish) were starved, then the medium was serum-free medium or 50% human adipose derived stem cell-conditions. It was replaced with medium and incubated for 48 hours. In FACS cell cycle analysis, treatment with human adipose derived stem cell-conditioning medium decreased the cell growth phase (G1) of human dermal papilla cells, while increasing the DNA synthesizer (S) and mitosis (G2-M) ( 3, top). In subsequent western blots, the expression of p21, p27 and CDK4 was unchanged (data not shown), but important molecules related to the cell cycle, cyclin D1 (Serotec, UK) and CDK2 (Santa Cruz biotechnology), were derived from human fat. It was clearly up-regulated 24 hours after stem cell-condition medium treatment (FIG. 3, bottom). The results indicate that human adipose derived stem cell-conditioning medium increases the proliferation of human dermal papilla cells through regulation of the cell cycle. In addition, human adipose derived stem cell-conditioning media have been shown to promote dermal papilla cells survival and proliferation by activating Erk and Akt signaling pathways. It is reported that dermal papilla size is closely related to hair growth cycle, and dermal papilla cell number is reported to increase in the anagen phase (Elliott et al., 1999, J Invest Dermatol 113, 873-877). In addition, human adipose derived stem cell-conditioned media significantly promoted proliferation of immortalized keratinocytes at concentrations of 10-30% (FIG. 4).

실시예Example 3: 모간 신장( 3: hair shaft kidney ( hairhair shaftshaft elongationelongation )에 대한 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지Adipose derived stem cell-condition medium 의of 효과 분석 Effect analysis

인간 지방유래 줄기세포-조건 배지가 현저한 유사분열(mitogenic) 효과를 나타내므로, 모간 신장(hair shaft elongation)에 대한 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지의 효과가 조사되었다. 5명의 남성(평균나이 34.8세, 한 명당 70 내지 80개의 모낭)으로부터 수집된 총 370개의 성장기 모낭(anagen hair follicles)이 하이드로코티손(hydrocortisone) 10 ng/mL, 인슐린 10 g/mL, L-글루타민 2 mM 및 페니실린 100 U/mL을 함유하는 Williams E 배지(Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)에서 37℃, 5% CO2 조건하에 배양되었다. Williams E 배지에 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지를 12.5%, 25%, 37.5% 또는 50% 수준으로 첨가한 후, 6일 동안 배양하였다. 그 결과, 12.5% 처리군에서 모낭의 길이가 대조군에 비해 40%까지 유의적으로 신장되었으며, 이는 미녹시딜(minoxidil) 1 mM로 처리한 양성 대조군보다 더 높았다(도 5).
Since human adipose derived stem cell-conditioned media exhibited a significant mitogenic effect, the effect of human adipose derived stem cell-conditioned media on hair shaft elongation was investigated. A total of 370 anagen hair follicles collected from five men (mean age 34.8 years, 70 to 80 follicles per person) were 10 ng / mL hydrocortisone, 10 g / mL insulin, and L-glutamine 37 ° C., 5% CO 2 in Williams E medium (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) containing 2 mM and penicillin 100 U / mL Incubated under conditions. Human adipose derived stem cell-condition medium was added to Williams E medium at 12.5%, 25%, 37.5% or 50% levels and then cultured for 6 days. As a result, the length of hair follicles in the 12.5% treatment group significantly increased to 40% compared to the control group, which was higher than the positive control group treated with 1 mM of minoxidil (FIG. 5).

실시예Example 4:  4: 생체내(in vivo)에서In vivo 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지의 양모효과 분석 Wool Effect Analysis of Human Adipose-derived Stem Cell-Conditioning Medium

7주령 수컷 C3H/HeN 누드마우스(n=48, Orient Bio, Korea)의 등쪽 피부의 털을 면도하고 모낭을 휴지기(telogen stage)로 동질화(synchronization)하였다. 이어서 인간 지방유래 줄기세포(5 x 105 cells/50 mL PBS) 또는 PBS(phosphate buffered saline)를 9일 동안 3일 간격으로 등쪽 피부에 피내주사(intradermal injection)하였다. 동시에 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지 1 mL 또는 대조군 배지를 다른 C3H 마우스의 등에 국소적으로 도포하였다. 그 결과, 인간 지방유래 줄기세포를 피내주사한 C3H/HeN 누드마우스의 모낭은 휴지기에서 성장기로의 전환이 대조군에 비해 빨리 유도되었으며(도 6, 상단), 조건 배지를 국소도포한 군에서는 모발의 성장이 촉진됨을 발견하였다(도 6, 하단). 또한 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지를 처리한 마우스의 등쪽 피부를 조직학적으로 살펴보았을 때 모낭의 수가 증가함을 발견하였다(도 7). 상기 결과들은 국소적으로 주사된 인간 지방유래 줄기세포 및 인간 지방유래 줄기세포-조건 배지가 생체내(in vivo)에서 모발의 성장을 촉진할 수 있다는 것을 가리킨다. 인간 지방유래 줄기세포에서 분비되는 인자가 모발성장에 다소간 치료 잠재성을 가지는 것으로 생각된다. The hair of the dorsal skin of 7-week-old male C3H / HeN nude mice (n = 48, Orient Bio, Korea) was shaved and the hair follicles were synchronized to the telogen stage. Subsequently, human adipose derived stem cells (5 × 10 5 cells / 50 mL PBS) or PBS (phosphate buffered saline) were intradermal injection into the dorsal skin every three days for 9 days. At the same time 1 mL of human adipose derived stem cell-condition medium or control medium was applied topically to the back of other C3H mice. As a result, the hair follicles of C3H / HeN nude mice injected with human adipose derived stem cells were induced in the transition from the resting phase to the growth phase compared to the control group (Fig. 6, top). It was found that growth was promoted (FIG. 6, bottom). In addition, when the histological examination of the dorsal skin of the mouse treated with human adipose derived stem cell-conditioning medium was found to increase the number of hair follicles (Fig. 7). The results indicate that topically injected human adipose derived stem cells and human adipose derived stem cell-conditioning media can promote hair growth in vivo. Factors secreted by human adipose derived stem cells are thought to have some therapeutic potential for hair growth.

본 발명의 결과들은 인간 지방유래 줄기세포가 인간 진피유두세포의 증식을 증가시킴으로서 모발성장을 촉진하며, 표피세포에서도 세포주기의 조절 및 모발주기의 성장기(anagen phase)를 활성화함으로써 가능하게 한다는 것을 나타낸다. 따라서 인간 지방유래 줄기세포의 합리적인 조작은 모발성장촉진을 위한 하나의 좋은 수단으로 생각된다. The results of the present invention indicate that human adipose derived stem cells promote hair growth by increasing the proliferation of human dermal papilla cells, and are also possible in epidermal cells by regulating the cell cycle and activating the anagen phase of the hair cycle. . Therefore, rational manipulation of human adipose derived stem cells is considered as a good means for promoting hair growth.

Claims (6)

인간 지방유래 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양한 후, 여과를 하여 얻은 조건 배지(conditioned media)를 유효성분으로 함유하는 탈모예방 또는 양모유도용 약학 조성물.After culturing human adipose derived stem cells in a serum-free medium, hair loss prevention or wool-inducing pharmaceutical composition comprising a conditioned media (conditioned media) obtained by filtration as an active ingredient. 제1항에 있어서, 상기 조건 배지는 인간 지방유래 줄기세포를 무혈청 α-MEM(modified Eagle medium)에서 40 내지 60시간 동안 배양한 후, 원심분리한 다음 0.2 내지 0.25μm 필터로 여과를 하여 얻은 것을 특징으로 하는 탈모예방 또는 양모유도용 약학 조성물.According to claim 1, The conditioned medium is obtained by incubating human adipose derived stem cells in serum-free modified Eagle medium (40-60 hours), centrifuged and filtered with a 0.2 to 0.25μm filter Hair loss prevention or wool-inducing pharmaceutical composition, characterized in that. 제1항에 있어서, 상기 조건 배지는 인간 진피유두세포(human dermal papilla cell)와 인간 케라티노세포(human keratinocytes)의 증식을 증가시킴으로써 두피 및 모발성장을 촉진하는 것을 특징으로 하는 탈모예방 또는 양모유도용 약학 조성물.The method of claim 1, wherein the condition medium promotes scalp and hair growth by increasing the proliferation of human dermal papilla cells and human keratinocytes. Pharmaceutical composition for. 제1항의 약학 조성물을 탈모부위 또는 무모 부위에 국소적으로 도포 또는 피내주사(intradermal injection)하는 것을 특징으로 하는 양모를 유도하는 방법.The method of claim 1, wherein the pharmaceutical composition of claim 1 is applied topically or intradermal injection to the hair loss site or the hair loss site. 제1항의 약학 조성물을 유효성분으로 포함하는 탈모 치료제.Hair loss treatment comprising the pharmaceutical composition of claim 1 as an active ingredient. 제1항의 약학 조성물을 유효성분으로 포함하는 무모증 치료제.A hair loss treatment agent comprising the pharmaceutical composition of claim 1 as an active ingredient.
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