KR20110117454A

KR20110117454A - Method for production of carotenoids and chlorophylls from chlorella using pressurized liquids

Info

Publication number: KR20110117454A
Application number: KR1020100036920A
Authority: KR
Inventors: 판철호; 차광현; 정상훈; 구송이; 송대근
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2010-04-21
Filing date: 2010-04-21
Publication date: 2011-10-27

Abstract

본 발명은 클로렐라에서 아임계 유기 용매 추출 기술을 이용하여 카로티노이드 및 클로로필을 생산하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 아임계 용매를 이용한 추출 방법은, 클로렐라로부터 카로티노이드 및 클로로필과 같은 지용성 성분을 극성이 높은 유기용매를 사용하여 높은 효율로 추출할 수 있도록 하고, 추출과정에서 활성물질의 파괴를 막아 유해부산물의 생성을 억제할 수 있는 우수한 효과를 가짐으로, 클로렐라에서 카로티노이드 및 클로로필을 효율적으로 생산하는 방법에 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to a method for producing carotenoids and chlorophyll using subcritical organic solvent extraction technology in Chlorella, specifically, an extraction method using a subcritical solvent, Fat-soluble components such as carotenoids and chlorophyll can be extracted from chlorella with high efficiency using highly polar organic solvents, Since it has an excellent effect of preventing the destruction of active substances in the extraction process to suppress the formation of harmful by-products, it can be usefully used in the method for efficiently producing carotenoids and chlorophyll in chlorella.

Description

Method for production of carotenoids and chlorophylls from chlorella using pressurized liquids}

본 발명은 클로렐라에서 아임계 상태의 용매를 이용하여 카로티노이드 및 클로로필을 생산하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing carotenoids and chlorophyll using a subcritical solvent in chlorella.

녹황색 채소류에 다량 분포하고 있는 카로티노이드(carotenoid)와 클로로필(chlorophyll)은 항염증, 항산화 활성이 뛰어난 것으로 밝혀져 있으며 최근에는 이들 유도체로부터 강한 암 예방 효능이 검증된 바 있다. 현재 국내 개별 인정형 기능성 식품 시장에서 루테인(lutein), 라이코펜, 아스타잔틴과 같은 카로티노이드가 기능성 원료로서 인정받은 상태이며, 클로로필 또한 기능성 지표성분으로 식약청에서 분석방법 및 기준을 고시하고 있다. 그러나 국내에서 인정받은 대다수의 기능성 원료들이 외국에서 수입된 값비싼 원료를 이용하고 있어, 새로운 기술을 이용한 카로티노이드 및 클로로필의 생산 기술이 필요한 실정이다.
Carotenoid and chlorophyll, which are widely distributed in green and yellow vegetables, are anti-inflammatory, It has been shown to have excellent antioxidant activity and recently, strong cancer prevention efficacy has been demonstrated from these derivatives. Lutein, currently in the domestic individual certified functional food market Carotenoids such as lycopene and astaxanthin are recognized as functional ingredients, Chlorophyll is also a functional indicator, and the KFDA announces analytical methods and standards. However, since most of the functional raw materials recognized in Korea use expensive raw materials imported from abroad, the production technology of carotenoids and chlorophyll using new technology is required.

클로렐라(chlorella)는 녹조류로 담수 중에 증식하는 단세포 식물로, 분류학상 Chlorophycea 강, Chlorococcum 목, Chlorella 속에 속한다. 이들은 보통 연못이나 호수 등 담수에서 생육하며, 직경 2 ~ 10 um의 구형 단세포 조류로 하나의 세포는 현미경으로만 볼 수 있는 정도이다. 생식은 무성생식으로 증식하고 물, 공기, 질소와 인산 등의 식물 성장 요소가 있으면 빛과 이산화탄소를 이용한 독립 영양적 성장 증식을 한다는 점이 생물학적으로 가장 큰 특징으로, 이는 산업적 대량 배양 공정에서 가장 중요하게 고려되는 사항이다. 클로렐라는 필수 아미노산 조성이 좋은 고 단백질 식품으로 총 아미노산 함량은 쇠고기에 비하여 월등히 높으며 단백질, 지질, 식이섬유, 비타민류와 무기질에 관하여 다른 식품과 비교할 수 없을 만큼 영양학적으로도 균형 잡힌 식품이다. 클로렐라는 현재 사료과 식품의 1, 2차적 목적으로 사용되어 영양학적 우수성이 확인되었고, 항암 활성 외의 3차적 식품으로서 기능성의 탐색이 활발히 진행 중에 있다. 특히 최근 연구에 의하면 클로렐라에카로티노이드와 클로로필이 다량 존재하고 있으며 카로티노이드 성분 중 눈 건강 기능성에 도움을 줄 수 있는 루테인의 함량이 특별히 많음이 밝혀진 바 있다. 이제까지 클로렐라에 대한 연구는 산업적 생산을 위한 대량 배양에 초점이 맞춰져 있었으며 클로렐라로부터 생리 활성 물질을 효과적으로 생산하는 가공 기술에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 우리 나라의 경우, 배양기를 통해 생산된 클로렐라 제품이 대기업을 중심으로 활성화되어 있고 클로렐라 생산에 있어 세계적인 경쟁력을 가지고 있으므로, 클로렐라로부터 새로운 생리 활성 물질을 추출하여 제품의 부가가치를 높일 수 있는 기술의 개발이 더욱 필요하다고 할 수 있다.
Chlorella, a green algae, is a single-celled plant that grows in freshwater and belongs to the genus Chlorophycea, Chlorococcum, and Chlorella. They usually grow in fresh water, such as ponds and lakes, and are spherical single-cell algae with a diameter of 2 to 10 um, one cell visible only under a microscope. Reproductive proliferation is abiotic reproduction and biologically the most important feature is that if there is plant growth factors such as water, air, nitrogen and phosphoric acid, independent nutritional growth and growth using light and carbon dioxide, which is the most important in the industrial mass culture process This is considered. Chlorella is a high-protein food with a good essential amino acid composition. Its total amino acid content is much higher than beef, and it is nutritionally balanced in terms of protein, lipids, dietary fiber, vitamins and minerals. Chlorella is currently used for primary and secondary purposes in feeds and foods, confirming its nutritional excellence, and actively searching for functionality as a tertiary food other than anticancer activity. In particular, recent studies have revealed that chlorellaecarotenoids and chlorophyll are present in large amounts, and carotenoids have a particularly high content of lutein, which can help eye health functionality. Until now, research on chlorella has been focused on mass cultivation for industrial production, and research on processing technology for effectively producing physiologically active substances from chlorella is insufficient. In Korea, since chlorella products produced through incubators are active around large corporations and have global competitiveness in chlorella production, the development of technology to increase the added value of products by extracting new bioactive substances from chlorella It is more necessary.

아임계 용매 추출 기술은 천연물로부터 생리 활성 물질을 효과적으로 추출해 내기 위해 도입된 가공 기술이다. 추출시 어느 정도의 압력을 가하면 추출 용매의 끓는점을 높일 수 있는데 이를 이용하여 대기압하에서 용매의 끓는점보다 높은 온도인 아임계 상태에서 물질의 추출을 진행할 수 있어 추출 효율을 높이고 새로운 활성 물질을 추출해낼 수 있는 가공기술이다. 최근 아임계 용매를 이용한 추출 기술이 천연물 추출에 효과적임이 보고되어, 미세조류에서 아임계 추출 기술을 이용하여 카로티노이드 및 항산화 물질 추출에 대한 연구가 진행되고 있으나, 클로렐라 종에서 아임계 용매 추출 기술을 이용하여 카로티노이드 및 클로로필 추출에 관한 연구는 전무한 실정이다.
Subcritical solvent extraction technology is a processing technology introduced to effectively extract physiologically active substances from natural products. A certain amount of pressure can be applied to the extraction to increase the boiling point of the extraction solvent, which can be used to extract the material in subcritical conditions at temperatures higher than the boiling point of the solvent under atmospheric pressure, thereby improving extraction efficiency and extracting new active substances. Processing technology. Recently, extraction techniques using subcritical solvents have been reported to be effective for extracting natural products, and studies on carotenoid and antioxidant extraction using subcritical extraction techniques in microalgae have been conducted, but subcritical solvent extraction techniques have been used in chlorella species. There is no research on carotenoid and chlorophyll extraction.

지용성 물질인 카로티노이드(carotenoid)와 클로로필(chlorophyll)을 추출하기 위해 일반적으로 사용되는 아세톤, 헥산 등의 친유성 용매는 유독성을 나타내므로 식품 산업에서 사용을 금지 또는 제한하는 규제 영역에 속한다. 이를 극복하기 위해 상대적으로 안정한 용매인 에탄올을 사용할 경우 강한 친유성 성질을 나타내지 않기 때문에 카로티노이드 및 클로로필을 추출하는 데 있어 높은 효율성을 나타내지 못한다. 클로렐라에는 카로티노이드와 클로로필이 다량 함유되어 있지만 클로렐라 원말을 그대로 섭취할 경우 두꺼운 클로렐라의 세포벽과 이들 활성 성분의 친유성으로 인해 소화 흡수가 되지 않는 문제가 있다. 특히 클로렐라의 구성 성분 중 50% 이상이 수용성 물질인 단백질이기 때문에 클로렐라로부터 지용성 활성 물질을 추출할 경우 이러한 수용 성분이 함께 추출되도록 함으로써 총 추출량을 증가시킬수 있도록 하는 접근이 필요하다. 클로렐라로부터 추출물을 제조하는 것과 관련된 대한민국 공개 특허 10-0827422-0000와 10-0657637-0000에서 물을 사용하여 클로렐라의 수용성 활성 성분을 추출하는 방법들에 대해 제시하고 있지만, 이 방법을 사용할 경우 지용성 성분인 카로티노이드와 클로로필은 추출될 수 없으므로 클로렐라로부터 지용성 성분인 카로티노이드와 클로로필 추출을 위한 새로운 방법이 요구되는 실정이다.
Lipophilic solvents such as acetone and hexane, which are commonly used to extract carotenoids and chlorophylls, which are fat-soluble substances, are toxic and thus belong to the regulatory area that prohibits or restricts their use in the food industry. In order to overcome this problem, ethanol, which is a relatively stable solvent, does not exhibit strong lipophilic properties and thus does not exhibit high efficiency in extracting carotenoids and chlorophyll. Chlorella contains a large amount of carotenoids and chlorophyll, but when ingested as raw chlorella, there is a problem in that digestive absorption is not possible due to the lipophilic properties of the cell walls of the thick chlorella and their active ingredients. In particular, since more than 50% of the components of chlorella are proteins that are water-soluble substances, when the fat-soluble active substance is extracted from chlorella, an approach is required to increase the total extraction amount by allowing such water-soluble components to be extracted together. Korean Patent Publication Nos. 10-0827422-0000 and 10-0657637-0000 relating to the preparation of extracts from chlorella describe methods for extracting the water-soluble active ingredient of chlorella using water, but when using this method Since phosphorus carotenoids and chlorophyll cannot be extracted, a new method for extracting soluble carotenoids and chlorophyll from chlorella is required.

또한 클로렐라 내에는 클로로필라아제 효소가 존재하는데 100℃ 이상의 열처리로 해당 효소를 불활성화시키지 않을 경우 가공 과정에서 페오포르바이드(pheophorbide)라는 독성 클로로필 부산물(식약청에 규제하고 있는 물질)이 다량 생성되므로 끓는점이 낮은 아세톤, 헥산과 같은 유기 용매로 추출시에는 이러한 독성 물질이 생성된다는 문제점이 있다. 미세 조류로부터 카로티노이드 중 루테인을 생산하는 특허인 미국 공개 특허 US-0196893은 유기 용매를 사용하여 클로로필라아제가 작용할 수 있는 온도 범위(70℃)에서 물질을 추출하는 방법을 다루고 있다. 이 방법은 클로렐라에 적용시 추출 효율이 낮아 경제성이 떨어지고, 추출 과정에서 독성 물질인 페오포르바이드가 생성되어 카로티노이드와 클로로필의 동시 생산이 힘들며, 비누화를 통한 카로티노이드 정제에만 이용 가능한 것이기 때문에 이를 극복할 수 있는 기술이 요구되는 실정이다.
In addition, there is a chlorophyllase enzyme in the chlorella, but if the enzyme is not inactivated by a heat treatment of 100 ° C. or higher, a large amount of toxic chlorophyll by-products (a substance regulated by KFDA) are generated during processing. When extracted with organic solvents such as acetone and hexane, there is a problem that such toxic substances are produced. US Published Patent US-0196893, a patent for producing lutein in carotenoids from microalgae, deals with the extraction of materials in a temperature range (70 ° C.) in which chlorophyllase can operate using an organic solvent. When applied to chlorella, the extraction efficiency is low and economic efficiency is reduced, and during the extraction process, the toxic substance pheophorbide is generated, which makes it difficult to simultaneously produce carotenoids and chlorophyll, and is only available for purification of carotenoids through saponification. Skills are required.

이에, 본 발명자들은 클로렐라로부터 활성 물질 추출을 위한 용매를 선별하고, 아임계 추출법이 다른 추출법에 비해 카로티노이드 및 클로로필에 대한 추출효율이 현저히 높음을 확인하고, 독성 물질인 페오포르바이드 α가 생성되지 않음을 확인하였으며, 아임계 추출 기술을 이용하여 클로렐라에서 지용성 물질인 카로티노이드 및 클로로필을 추출하는 최적 조건을 확립하였을 뿐 아니라, 이를 통해 추출된 카로티노이드 및 클로로필 성분이 다른 추출법에 의해 추출된 성분에 비해 우수한 항산화 효능을 유지하고 있음을 확인하여, 클로렐라로부터 아임계 유체를 이용하여 카로티노이드 및 클로로필을 생산하는 방법을 확립함으로써, 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors screened a solvent for extracting the active substance from chlorella, and confirmed that the subcritical extraction method has a significantly higher extraction efficiency for carotenoids and chlorophyll than other extraction methods, and no toxic substance pheophorbide α is produced. In addition to establishing optimal conditions for extracting soluble carotenoids and chlorophyll from chlorella using subcritical extraction technology, the extracted carotenoids and chlorophyll extracts were superior to those extracted by other extraction methods. The present invention was completed by establishing a method for producing carotenoids and chlorophyll from chlorella using subcritical fluid from the chlorella.

본 발명은 클로렐라로부터 아임계 용매 추출 기술을 이용하여 생리 활성 물질인 카로티노이드 및 클로로필을 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
The present invention provides a method for efficiently producing phytoactive carotenoids and chlorophyll using subcritical solvent extraction techniques from chlorella.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 In order to achieve the above object, the present invention

1) 클로렐라를 아임계 상태의 유기용매로 추출하여 추출물을 제조하는 단계; 및1) extracting chlorella with an organic solvent in a subcritical state to prepare an extract; And

2) 상기 단계 1)의 추출물에서 카로티노이드를 분리하는 단계를 포함하는, 클로렐라에서 아임계 유기 용매를 이용하여 카로티노이드를 생산하는 방법을 제공한다.2) provides a method for producing carotenoids using a subcritical organic solvent in chlorella, comprising the step of separating the carotenoids from the extract of step 1).

또한, 본 발명은 In addition,

2) 상기 단계 1)의 추출물에서 클로로필을 분리하는 단계를 포함하는, 클로렐라에서 아임계 유기 용매를 이용하여 클로로필을 생산하는 방법을 제공한다.
2) providing a method for producing chlorophyll using a subcritical organic solvent in chlorella, comprising the step of separating the chlorophyll from the extract of step 1).

본 발명에 따른 아임계 용매 추출은 에탄올을 아임계 상태로 만들어 극성을 떨어뜨림으로 인해 지용성 물질인 카로티노이드와 클로로필을 동시에 효과적으로 추출할 수 있고, 고온의 높은 에너지를 사용함으로써 추출 효율이 낮은 클로렐라 소재로부터 단시간 내에 카로티노이드 및 클로로필의 다량 추출이 가능하게 하며, 독성물질인 페오포르바이드가 생성되지 않을 뿐 아니라, 질소 가스의 주입을 통해 산화되기 쉬운 카로티노이드와 클로로필을 안정된 형태로 추출할 수 있으므로, 일반 추출법에 비해 클로렐라에서 기능성 카로티노이드 및 클로로필의 생산에 효과적으로 이용될 수 있다.
Subcritical solvent extraction according to the present invention can effectively extract the soluble carotenoids and chlorophyll soluble chlorine due to lowering the polarity by making the ethanol into a subcritical state, from the chlorella material having a low extraction efficiency by using high energy of high temperature It is possible to extract a large amount of carotenoids and chlorophyll in a short time, and not only a toxic substance pheophorbide is generated, but also carotenoids and chlorophyll which are easily oxidized through the injection of nitrogen gas can be extracted in a stable form. In comparison, it can be effectively used for the production of functional carotenoids and chlorophyll in chlorella.

도 1은 클로렐라로부터 용매별 추출 효율을 비교하여 그래프로 나타낸 그림이다.
도 2는 추출 종류에 따른 클로렐라 내 카로티노이드 및 클로로필의 추출량을 표로 나타낸 그림이다.
도 3은 아임계 추출 온도에 따른 페오포르바이드 α의 함량 측정 결과를 그래프로 나타낸 그림이다.
도 4는 클로렐라로부터 아임계 용매 추출시 카로티노이드 및 클로로필의 최적 추출 온도와 추출 시간, 추출량을 표로 나타낸 그림이다.
도 5는 클로렐라로부터 추출 종류에 따른 추출물의 항산화 효능을 비교하여 분석한 그래프를 나타낸 그림이다.1 is a graph showing a comparison of extraction efficiency for each solvent from chlorella.
2 is a carotenoid in chlorella according to the type of extraction and This table shows the extraction amount of chlorophyll.
3 is a graph showing a result of measuring the content of pheophorbide α according to the subcritical extraction temperature.
Figure 4 shows carotenoids and subcritical solvent extraction from chlorella Optimal extraction temperature and extraction time of chlorophyll, The figure shows the extraction amount as a table.
Figure 5 is a graph showing the analysis by comparing the antioxidant efficacy of the extract according to the extraction type from chlorella.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 The present invention

상기 단계 1)의 클로렐라는 클로렐라 불가리스 또는 클로렐라 피레노이도사 등을 포함하여 식용 가능한 클로렐라는 모두 사용가능하다. 또한, 상기 클로렐라는 배양액 자체를 용매와 혼합한 형태로 추출될 수 있으며, 건조 과정을 거친 후 분말 형태로 추출되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The chlorella of step 1) can be used as edible chlorella, including chlorella vulgaris or chlorella pyrenoidosa. In addition, the chlorella may be extracted in a form in which the culture solution itself is mixed with a solvent, it is preferably extracted in a powder form after the drying process, but is not limited thereto.

상기 단계 1)의 아임계 상태는 대기압부터 3000 psi의 가압조건에서 이루어지는 것이 바람직하고, 1500 내지 3000 psi의 가압 조건에서 이루어지는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 추출 용매의 물리적 특성에 따라 아임계 상태가 유지되는 조건하에서 압력 조건을 다르게 설정할 수 있다.The subcritical state of step 1) is preferably made under a pressurized condition of 3000 psi from atmospheric pressure, and more preferably made under a pressurized condition of 1500 to 3000 psi, but is not limited thereto. The pressure conditions can be set differently under the condition that the state is maintained.

상기 단계 1)의 유기 용매는 물, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 아세톤, 에틸아세테이드, 에테르, 디클로로메탄 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 에탄올을 이용하는 것이며, 80 내지 90%의 에탄올 수용액을 이용하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 에테르 및 디클로로메탄은 100℃이하에서 추출에 이용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The organic solvent of step 1) is preferably any one selected from the group consisting of water, ethanol, methanol, isopropanol, acetone, ethyl acetate, ether, dichloromethane and hexane, more preferably using ethanol Most preferably, 80 to 90% aqueous ethanol is used, but not always limited thereto. The ether and dichloromethane is preferably used for extraction at 100 ° C or less, but is not limited thereto.

상기 단계 1)의 추출물은 110℃ 내지 150℃의 온도에서 추출하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 카로티노이드 중 루테인은 145℃ 내지 149℃에서 추출하는 것이 바람직하고, 148.2℃에서 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 카로티노이드 중 베타-카로틴은 115℃ 내지 118℃에서 추출하는 것이 바람직하고, 116.8℃로 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The extract of step 1) is preferably extracted at a temperature of 110 ℃ to 150 ℃, but is not limited thereto. Lutein of the carotenoids is preferably extracted at 145 ℃ to 149 ℃, more preferably at 148.2 ℃, but is not limited thereto. Among the carotenoids, beta-carotene is preferably extracted at 115 ° C. to 118 ° C., more preferably at 116.8 ° C., but is not limited thereto.

상기 단계 1)의 추출물은 20분 이상 추출하는 것이 바람직하고, 20분 내지 40분 이내에 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 카로티노이드 중 루테인은 33분 내지 35분 이내에 추출하는 것이 바람직하고, 34.6분 동안 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 카로티노이드 중 베타-카로틴은 24분 내지 26분 이내에 추출하는 것이 바람직하고, 25.1분 동안 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. The extract of step 1) is preferably extracted for 20 minutes or more, more preferably within 20 to 40 minutes, but is not limited thereto. Lutein in the carotenoids is preferably extracted within 33 to 35 minutes, more preferably for 34.6 minutes, but is not limited thereto. Beta-carotene in the carotenoids is preferably extracted within 24 to 26 minutes, more preferably for 25.1 minutes, but is not limited thereto.

상기 단계 1)의 아임계 추출시 압력 처리는 무반응성 기체의 주입을 통해 이루어지는 것이 바람직하고, 질소 또는 헬륨인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.In the subcritical extraction of step 1), the pressure treatment is preferably performed through injection of non-reactive gas, more preferably nitrogen or helium, but is not limited thereto.

상기 단계 2)의 분리는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용함이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 상기 단계 2)의 카로티노이드는 루테인 및 제아잔틴과 같은 크산토필과 베타-카로틴 및 리코핀과 같은 카로틴을 모두 포함하는 것이 바람직하고, 루테인 또는 베타-카로틴을 포함하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
Separation of step 2) is preferably performed using high performance liquid chromatography (HPLC), but is not limited thereto. The carotenoid of step 2) may contain carotenoids such as lutein and zeaxanthin and carotene such as beta-carotene and lycopene. It is preferable to include all, more preferably include lutein or beta-carotene, but is not limited thereto.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris KMCC C-024)를 배양하고, 원심분리를 통해 수집된 클로렐라 세포를 동결 건조하여 클로렐라 시료를 제조하였다.In a particular embodiment of the invention, Chlorella vulgaris (Chlorella vulgaris KMCC C-024) was cultured, and chlorella samples were prepared by freeze drying the chlorella cells collected through centrifugation.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 클로렐라로부터 카로티노이드 및 클로로필과 같은 활성 물질을 얻기 위한 최적의 추출용매를 확인하기 위하여, 클로렐라에 물, 아세톤, 헥산 또는 에탄올을 첨가하여 침지한 후, 각 용매에서 추출된 활성 물질의 추출효율에 대한 비교실험을 수행하였고, 그 결과, 에탄올, 특히 80 ~ 90% 에탄올 수용액의 사용이 추출에 바람직함을 알 수 있었다(도 1 참조).In addition, in a specific embodiment of the present invention, in order to identify the optimal extraction solvent for obtaining active substances such as carotenoids and chlorophyll from chlorella, chlorella is immersed by adding water, acetone, hexane or ethanol, and then A comparative experiment on the extraction efficiency of the extracted active substance was carried out. As a result, it was found that the use of ethanol, in particular, 80 to 90% aqueous ethanol solution is preferable for extraction (see FIG. 1).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 클로렐라에서 추출방법에 따른 생리 활성 물질의 추출효율을 비교하기 위하여, 침지법, 증류법 및 아임계 추출법을 각각 이용하여 추출 후 각 생리 활성 물질의 추출효율을 비교하였고, 그 결과, 아임계 추출시 추출 시간이 가장 짧았음에도 불구하고, 카로티노이드 및 클로로필의 추출 효율이 가장 높은 것을 확인하였고, 특히, 카로티노이드 중 베타-카토틴의 추출 효율이 크게 증가되었으며, 클로로필은 아임계 추출시 침지법에 비해 2배 이상 많은 양이 추출되었음을 확인하였다(도 2 참조). 이를 통해, 클로렐라에서 카로티노이드 및 클로로필 추출시 다른 추출법에 비해 아임계 추출 방법을 이용할 때, 가장 높은 추출효율을 나타냄을 확인하였다.In addition, in a specific embodiment of the present invention, in order to compare the extraction efficiency of physiologically active substances according to the extraction method in chlorella, the extraction efficiency of each physiologically active substance after extraction using the immersion method, distillation method and subcritical extraction method, respectively As a result, the extraction efficiency of carotenoids and chlorophyll was the highest, even though the extraction time was shortest during subcritical extraction. In particular, the extraction efficiency of beta-carotene among the carotenoids was greatly increased, and chlorophyll was not. It was confirmed that more than twice the amount extracted compared to the immersion method in the critical extraction (see Fig. 2). Through this, when carotenoid and chlorophyll extraction in chlorella, it was confirmed that the highest extraction efficiency when using a subcritical extraction method compared to other extraction methods.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 아임계 추출법을 이용한 클로렐라 추출이 추출과정에서 유해 부산물의 생성을 억제할 수 있는지 확인하기 위하여, 다양한 온도에서 아임계 추출 실험을 수행하고, 이를 통해 얻어진 추출물에서 페오포르바이드를 검출하였고, 그 결과, 60℃ 및 85℃에서 추출할 경우에는 추출 시간이 증가할수록 페오코르바이드 α가 더 많이 생성되는 반면, 110℃ 및 135℃에서 추출할 경우, 추출 시간에 관계없이 페오포르바이드 α가 생성되지 않음을 확인하였고, 이를 통해, 110℃ 이상의 온도에서 클로로필라아제가 불활성화된다는 결과를 얻을 수 있었다(도 3 참조). 이를 통해, 클로렐라에서 아임계 추출 방법을 이용하여 카로티노이드 및 클로로필을 추출할 경우, 독성 물질인 페오포르바이드가 제거된 상태의 추출물을 얻을 수 있음을 확인하였다.In addition, in a specific embodiment of the present invention, in order to check whether chlorella extraction using subcritical extraction can inhibit the formation of harmful by-products during the extraction process, subcritical extraction experiments are performed at various temperatures, Pheophorbide was detected, and as a result, when extracting at 60 ° C and 85 ° C, more pheocorbide α is produced as the extraction time increases, while extracting at 110 ° C and 135 ° C is related to extraction time. It was confirmed that without the pheophorbide α is generated, through this, it can be obtained that the chlorophyllase is inactivated at a temperature of 110 ℃ or more (see Figure 3). Through this, it was confirmed that when carotenoid and chlorophyll were extracted by using a subcritical extraction method in chlorella, an extract in which pheofofide, a toxic substance was removed, was obtained.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 클로렐라에서 카로티노이드 및 클로로필을 아임계 용매를 이용하여 추출시 가장 효율적으로 생산할 수 있는 최적의 조건을 확립하기 위하여, 다양한 온도 및 시간에서 아임계 추출을 수행하였다. 그 결과, 루테인, 베타-카로틴 및 클로로필 α,β의 최적 추출 온도 및 시간을 각각 148.2℃, 34.6분, 116.8℃, 25.1분, 173.4℃, 14.7분 및 169.9℃, 3.4분으로 확립하였고, 최적 조건을 통해 루테인 3.70 mg, 베타-카로틴 0.67 mg, 클로로필 α 10.83 mg 및 클로로필 β 6.81 mg으로 추출되었음을 확인하였으며(도 4 참조), 카로티노이드는 클로로필보다 온도에 민감하여 150℃ 이하의 온도에서 20분 이상 추출하고, 클로로필은 카로티노이드에 비해 비교적 높은 온도에서 단시간 추출하는 것이 효율적임을 확인하여, 이를 통해, 클로렐라에서 카로티노이드 및 클로로필의 아임계 추출 최적 조건을 확립하였다.In addition, in a specific embodiment of the present invention, subcritical extraction was performed at various temperatures and times in order to establish optimal conditions for producing carotenoids and chlorophyll in chlorella using subcritical solvent most efficiently. As a result, the optimum extraction temperature and time of lutein, beta-carotene and chlorophyll α, β were established at 148.2 ° C., 34.6 minutes, 116.8 ° C., 25.1 minutes, 173.4 ° C., 14.7 minutes and 169.9 ° C., 3.4 minutes, respectively. It was confirmed that the extracted lutein 3.70 mg, beta-carotene 0.67 mg, chlorophyll α 10.83 mg and chlorophyll β 6.81 mg (see Fig. 4), carotenoids are more sensitive to the temperature than chlorophyll extracted more than 20 minutes at a temperature below 150 ℃ In addition, chlorophyll was found to be efficient extraction for a short time at a relatively high temperature compared to carotenoids, thereby establishing the optimal conditions for the subcritical extraction of carotenoids and chlorophyll in chlorella.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 아임계 추출이 카로티노이드 및 클로로필의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 추출된 각 성분에서 Trolox Equivalent Antioxidant Capacity(TEAC) 분석을 통해 항산화능을 측정하였다. 그 결과, 침지법 및 증류법에 비해 아임계 추출시 얻어진 카로티노이드 및 클로로필이 더 높은 항산화 활성을 보이고, 아임계 추출 온도가 85℃ 이상일 때, 카로티노이드 및 클로로필에 의한 총 항산화 효능이 높게 유지되는 것을 확인하였고(도 5 참조), 이를 통해, 본 발명의 조건에 따라 클로렐라에서 아임계 추출법에 의해 얻어진 카로티노이드 및 클로로필은 다른 추출법에 비해 더 높은 항산화 효능을 보이고, 그 기능성을 유지하고 있음을 확인하였다.
In addition, in a specific embodiment of the present invention, in order to determine the effect of subcritical extraction on the activity of carotenoids and chlorophyll, the antioxidant capacity was measured through Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) analysis in each extracted component. As a result, it was confirmed that the carotenoid and chlorophyll obtained during subcritical extraction showed higher antioxidant activity than the immersion and distillation methods, and that the total antioxidant efficacy by carotenoid and chlorophyll was maintained higher when the subcritical extraction temperature was 85 ° C or higher. (See FIG. 5) Through this, it was confirmed that the carotenoids and chlorophyll obtained by the subcritical extraction method in chlorella according to the conditions of the present invention showed higher antioxidant efficacy and maintained its functionality than other extraction methods.

또한, 본 발명은 In addition,

2) 상기 단계 1)의 추출물에서 클로로필을 분리하는 단계를 포함하는, 클로렐라에서 아임계 유기 용매를 이용하여 클로로필을 생산하는 방법을 제공한다.2) providing a method for producing chlorophyll using a subcritical organic solvent in chlorella, comprising the step of separating the chlorophyll from the extract of step 1).

상기 단계 1)의 추출물은 150℃ 내지 180℃의 온도에서 추출하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 클로로필 중 클로로필 α는 172℃ 내지 175℃에서 추출하는 것이 바람직하고, 173.4℃에서 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 클로로필 중 클로로필 β는 168℃ 내지 171℃에서 추출하는 것이 바람직하고, 169.9℃로 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The extract of step 1) is preferably extracted at a temperature of 150 ℃ to 180 ℃, but is not limited thereto. Chlorophyll α in the chlorophyll is preferably extracted at 172 ° C to 175 ° C, more preferably at 173.4 ° C, but is not limited thereto. Chlorophyll β in the chlorophyll is preferably extracted at 168 ° C to 171 ° C, more preferably at 169.9 ° C, but is not limited thereto.

상기 단계 1)의 추출물은 15분 이내에 추출하는 것이 바람직하고, 2분 내지 15분 이내에 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 클로로필 중 클로로필 α는 13분 내지 15분 이내에 추출하는 것이 바람직하고, 14.7분 동안 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 클로로필 중 클로로필 β는 2분 내지 4분 이내에 추출하는 것이 바람직하고, 3.4분 동안 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. The extract of step 1) is preferably extracted within 15 minutes, more preferably within 2 to 15 minutes, but is not limited thereto. Chlorophyll α in the chlorophyll is preferably extracted within 13 to 15 minutes, more preferably for 14.7 minutes, but is not limited thereto. Chlorophyll β in the chlorophyll is preferably extracted within 2 to 4 minutes, more preferably for 3.4 minutes, but is not limited thereto.

상기 단계 2)의 분리는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용함이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 상기 단계 2)의 클로로필은 클로로필α 및 클로로필 β를 비롯하여 이들의 분해 산물인 페오피틴 α,β, 및 피로페오피틴 α,β를 포함하는 것이 바람직하고, 클로로필 α, 클로로필 β, 페오피틴 α 및 피로페오피틴 α를 포함하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
Separation of step 2) is preferably performed using high performance liquid chromatography (HPLC), but is not limited thereto. The chlorophyll of step 2) may include chlorophyll α and chlorophyll β, and their decomposition products, pheophytin α, β And pyrofepitin α, β, and more preferably, but not limited to, chlorophyll α, chlorophyll β, pheophytin α, and pyrofepitinα.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 클로렐라로부터 활성 물질 추출을 위한 용매를 선별하고, 아임계 추출법이 다른 추출법에 비해 카로티노이드 및 클로로필에 대한 추출효율이 현저히 높음을 확인하고, 독성 물질인 페오포르바이드 α가 생성되지 않음을 확인하였으며, 아임계 추출 기술을 이용하여 클로렐라에서 지용성 물질인 카로티노이드 및 클로로필을 추출하는 최적 조건을 확립하였을 뿐 아니라, 이를 통해 추출된 카로티노이드 및 클로로필 성분이 다른 추출법에 의해 추출된 성분에 비해 우수한 항산화 효능을 유지하고 있음을 확인하여, 클로렐라로부터 아임계 유체를 이용하여 카로티노이드 및 클로로필을 생산하는 방법을 확립하였다.
In a specific embodiment of the present invention, the solvent for extracting the active substance from the chlorella is selected, and the subcritical extraction method has a significantly higher extraction efficiency for carotenoids and chlorophyll compared to other extraction methods, toxic substance pheophorbide α is In addition to establishing suboptimal conditions for extracting soluble carotenoids and chlorophylls from chlorella using subcritical extraction techniques, the extracted carotenoids and chlorophyll components were extracted from other extraction methods. As a result, it was confirmed that the antioxidant activity was maintained, and thus, a method of producing carotenoids and chlorophyll from chlorella using subcritical fluid was established.

이하, 본 발명의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.It will be described below in detail by Examples and Experimental Examples of the present invention.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following Examples and Experimental Examples are merely illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following Examples and Experimental Examples.

<< 실시예Example 1> 클로렐라 시료 제조 1> Chlorella Sample Preparation

클로렐라(Chlorella vulgaris KMCC C-024)는 한국 해양 미세조류 은행에서 입수하였고, 아쿠아넷(Aquanet.co., 경남 통영)에서 배양되었다. 클로렐라 바이오매스(biomass)는 멸균 증류수로 두 번 세척하고, 원심 분리를 통해 분리하였고, 이를 통해 수집된 클로렐라 세포는 진공 동결 건조기(일신 랩, 한국)를 이용하여 동결 건조한 후 클로렐라 시료를 제조하였고, 빛이 차단한 진공 상태에서 추출시까지 보관하였다.
Chlorella vulgaris KMCC C-024) was obtained from the Korea Marine Microalgae Bank and was incubated in Aquanet (Aquanet.co., Tongyeong, Gyeongnam). Chlorella biomass (biomass) was washed twice with sterile distilled water, separated by centrifugation, and the collected chlorella cells were lyophilized using a vacuum freeze dryer (ILSIN, Korea) to prepare chlorella samples, It was stored until extraction in a vacuum blocked light.

<< 실험예Experimental Example 1> 클로렐라로부터 카로티노이드 및 클로로필을 얻기 위한 최적 추출용매 확인 1> Identification of optimal solvent for obtaining carotenoids and chlorophyll from chlorella

클로렐라로부터 카로티노이드 및 클로로필과 같은 활성 물질을 얻기 위한 최적의 추출용매를 확인하기 위하여, 상기 <실시예 1>에서 제조된 클로렐라 시료 1 g에 물, 아세톤, 헥산 또는 에탄올(50, 60, 70, 80, 90 및 100%)을 50 ml씩 첨가하고 상온에서 6시간 동안 침지한 후, 각 용매에서 추출된 활성 물질의 추출효율에 대한 비교실험을 수행하였다.In order to identify the optimal extraction solvent for obtaining active substances such as carotenoids and chlorophyll from chlorella, 1 g of chlorella sample prepared in Example 1 was added with water, acetone, hexane or ethanol (50, 60, 70, 80). , 90 and 100%) were added each 50 ml and soaked for 6 hours at room temperature, and then a comparative experiment was performed on the extraction efficiency of the active material extracted from each solvent.

그 결과, 클로렐라에 에탄올을 추출용매로 이용하였을 때, 추출효율이 높게 나타남을 확인하였고, 특히 90% 에탄올을 추출용매로 이용하였을 때 가장 우수한 추출 효율을 나타내었고(도 1), 이를 통해, 클로렐라에서 추출 용매로 90% 에탄올을 선택하였다.
As a result, it was confirmed that when ethanol was used as the extraction solvent in chlorella, the extraction efficiency was shown to be high, and especially when 90% ethanol was used as the extraction solvent, it showed the best extraction efficiency (Fig. 1). 90% ethanol was selected as the extraction solvent.

<< 실험예Experimental Example 2> 클로렐라에서 추출방법에 따른 생리 활성 물질의 추출효율 비교 2> Comparison of Extraction Efficiency of Biologically Active Substances in Chlorella According to Extraction Methods

클로렐라에서 추출방법에 따른 생리 활성 물질의 추출효율을 비교하기 위하여, 침지법, 증류법 및 아임계 추출법을 각각 이용하여 추출 후 각 생리 활성 물질의 추출효율을 비교하였다.In order to compare the extraction efficiencies of physiologically active substances according to the extraction method in chlorella, the extraction efficiencies of the physiologically active substances after extraction were compared using immersion method, distillation method and subcritical extraction method.

구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 제조된 클로렐라 시료 1 g에 90% 에탄올을 추출용매로 하여, 6시간 동안 용매에 그대로 담가두는 침지법과 대기압하에서 에탄올을 가열하여 2시간 동안 추출하는 증류법을 동시에 수행하였다. 아임계 추출은 상기 <실시예 1>에서 제조된 클로렐라 시료 1 g에 90% 에탄올을 추출용매로 하여, 1,500 psi의 압력하에서 160℃ 온도에서 30 분간 추출하였다. 각 추출반응 후, 추출 용액의 부피를 50 ml로 동일하게 조정하고 이 중 1 ml을 취하여 카로티노이드 및 클로로필의 분석에 이용하여 각 활성 물질의 추출효율을 비교하였다. 카로티노이드, 클로로필의 분석을 위해 고속크로마토그래피를 수행하였다. 이동상으로는 터트뷰틸메틸에테르와 메탄올을 사용하였으며 분당 1 mL의 유속으로 총 60분 동안 100% 메탄올부터 90% 터트뷰틸메틸에테르까지 그래디언트 법으로 분석하였다. 카로티노이드는 445nm 파장에서 분석을 수행하였고, 클로로필은 660nm 파장에서 수행하였다. 루테인, 베타카로틴, 클로로필, 페오포르바이드, 페오피틴 표준품은 시그마 혹은 와코 케미칼에서 구입하였으며 루테인, 베타카로틴은 2 - 200 ppm의 구간에서 표준곡선을 구하였으며 클로로필 산물들은 5 - 500 ppm의 구간에서 표준곡선을 구하였다. Specifically, 1 g of chlorella sample prepared in <Example 1> using 90% ethanol as an extraction solvent, dipping method of dipping for 2 hours by immersion method soaked in a solvent for 6 hours and extraction of ethanol under atmospheric pressure for 2 hours. Was performed. Subcritical extraction was carried out for 30 minutes at a temperature of 160 ℃ under a pressure of 1,500 psi using 90% ethanol as an extraction solvent to 1 g of Chlorella samples prepared in Example 1. After each extraction reaction, the volume of the extraction solution was adjusted to 50 ml equally, and 1 ml of this was taken and used for the analysis of carotenoids and chlorophyll to compare the extraction efficiency of each active substance. High speed chromatography was performed for the analysis of carotenoids, chlorophyll. Tertbutylmethylether and methanol were used as mobile phases and were analyzed by gradient method from 100% methanol to 90% tertbutylmethylether for a total of 60 minutes at a flow rate of 1 mL per minute. Carotenoids were analyzed at 445 nm wavelength and chlorophyll was performed at 660 nm wavelength. Lutein, beta-carotene, chlorophyll, pheophorbide, and pheophytin were purchased from Sigma or Waco Chemical. Lutein and beta-carotene were obtained from 2 to 200 ppm and chlorophyll products were from 5 to 500 ppm. Standard curves were obtained.

그 결과, 아임계 추출시 추출 시간이 가장 짧았음에도 불구하고, 카로티노이드 및 클로로필의 추출 효율이 가장 높은 것을 확인하였고, 특히, 카로티노이드 중 베타-카토틴의 추출 효율이 크게 증가되었고, 클로로필은 아임계 추출시 침지법에 비해 2배 이상 많은 양이 추출되었음을 확인하였다(도 2).As a result, despite the shortest extraction time during subcritical extraction, it was confirmed that the extraction efficiency of carotenoids and chlorophyll was the highest, in particular, the extraction efficiency of beta-carotene in the carotenoids was greatly increased, chlorophyll subcritical extraction It was confirmed that more than twice the amount extracted compared to the time dipping method (Fig. 2).

따라서, 클로렐라에서 카로티노이드 및 클로로필 추출시 침지법 및 증류법에 비해 아임계 추출 방법을 이용할 때, 가장 높은 추출효율을 나타냄을 확인하였다.
Therefore, it was confirmed that chlorella showed the highest extraction efficiency when subcritical extraction method was used compared to immersion method and distillation method when extracting carotenoid and chlorophyll.

<< 실험예Experimental Example 3> 3> 아임계Subcritical 추출시 독성물질 Toxic substances during extraction 페오포르바이드Peophorbide α의 제거 removal of α

아임계 추출을 이용한 클로렐라 추출의 추출과정에서 유해 부산물이 생성되는 지의 여부를 확인하기 위해, 다양한 온도에서 아임계 추출 실험을 수행하고, 이를 통해 얻어진 추출물에서 페오포르바이드를 검출하였다.In order to determine whether harmful by-products are generated during the extraction of chlorella extraction using subcritical extraction, subcritical extraction experiments were performed at various temperatures, and pheophorbide was detected in the extracts obtained.

구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 제조된 클로렐라 시료 1 g에 90% 에탄올을 추출용매로 하여, 1,500 psi의 압력하에서 추출 온도를 60, 85, 11, 135℃로 달리하여 30분간 추출한 다음, 얻어진 추출물에서 상기 <실험예 2>의 방법에 따라 페오포르바이드의 양을 측정하고, 이를 분석하였다.Specifically, 1 g of chlorella sample prepared in <Example 1> using 90% ethanol as the extraction solvent, and extracted for 30 minutes at 60, 85, 11, 135 ℃ different extraction temperature under a pressure of 1,500 psi, In the obtained extract, the amount of pheophorbide was measured and analyzed according to the method of <Experimental Example 2>.

그 결과, 60℃ 및 85℃에서 추출할 경우에는 추출 시간이 증가할수록 페오코르바이드 α가 더 많이 생성되는 반면, 110℃ 및 135℃에서 추출할 경우, 추출 시간에 관계없이 페오포르바이드 α가 생성되지 않음을 확인하였고, 이를 통해, 110℃ 이상의 온도에서 클로로필라아제가 불활성화된다는 결과를 얻을 수 있었다(도 3).As a result, when extracting at 60 ° C and 85 ° C, more pheocorbide α is produced as the extraction time increases, whereas when extracting at 110 ° C and 135 ° C, pheophorbide α is generated regardless of the extraction time. It was confirmed that not, through this, it was possible to obtain a result that the chlorophyllase is inactivated at a temperature of 110 ℃ or more (Fig. 3).

따라서, 카로티노이드와 클로로필의 아임계 추출시 필요한 최적 추출 온도는 110˚C 이상이므로 클로렐라에서 아임계 추출 방법을 이용하여 카로티노이드 및 클로로필을 추출할 경우, 독성 물질인 페오포르바이드가 제거된 상태의 추출물을 얻을 수 있음을 확인하였다.
Therefore, the optimal extraction temperature required for the subcritical extraction of carotenoids and chlorophyll is more than 110˚C, so when carotenoids and chlorophyll are extracted using the subcritical extraction method in chlorella, the extract of the toxic substance, pheophorbide, is removed. It was confirmed that it can be obtained.

<< 실험예Experimental Example 4> 카로티노이드 및 클로로필의 4> of carotenoids and chlorophyll 아임계Subcritical 추출시 최적 조건 확립 Establish optimal conditions for extraction

클로렐라에서 카로티노이드 및 클로로필을 아임계 용매를 이용하여 추출시 가장 효율적으로 생산할 수 있는 최적의 조건을 확립하기 위하여, 다양한 온도 및 시간에서 아임계 추출을 수행하였다.Subcritical extraction was performed at various temperatures and times in order to establish the optimal conditions for producing carotenoids and chlorophyll in chlorella most efficiently during extraction with a subcritical solvent.

구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 제조된 클로렐라 시료 1 g에 90% 에탄올을 추출용매로 하여, 1,500 psi의 압력하에서 시간을 8, 19, 30분으로 달리하고 온도는 50, 105, 160℃로 하여 총 13번의 아임계 추출을 수행하고, 추출에 적합한 최적 온도와 시간을 확인하기 위해 중심 합성 계획에 의한 반응 표면 분석을 수행하였다. 반응 표면 분석은 미니탭 소프트웨어를 이용하여 계획되었으며 50, 105, 160를 각각 코드1의 -1, 0, 1로 놓고 8분, 19분, 30분을 각각 코드 2의 -1, 0, 1로 놓아 (-1, -1), (-1, 1), (0, -1.414), (1, -1), (-1.414, 0), (0, 0,) (0, 0), (1.414, 0), (0, 0), (0, 1.414), (0, 0) (1, 1), (0, 0)의 순서로 13번의 아임계 추출을 수행한 후 프로그램을 이용하여 곡선화를 수행하였다.Specifically, 1 g of chlorella sample prepared in <Example 1> using 90% ethanol as the extraction solvent, the time was changed to 8, 19, 30 minutes under a pressure of 1,500 psi and the temperature is 50, 105, 160 ℃ A total of 13 subcritical extractions were performed, and response surface analysis by central synthesis scheme was performed to determine the optimum temperature and time for extraction. Response surface analysis was planned using Minitab software, with 50, 105, and 160 as -1, 0, and 1 for code 1 and 8, 19, and 30 minutes for -1, 0, and 1 for code 2, respectively. (-1, -1), (-1, 1), (0, -1.414), (1, -1), (-1.414, 0), (0, 0,) (0, 0), (1.414 13 subcritical extractions in order of (0), (0, 0), (0, 1.414), (0, 0) (1, 1), (0, 0) Was performed.

그 결과, 루테인, 베타-카로틴 및 클로로필 α,β의 최적 추출 온도 및 시간을 각각 148.2℃, 34.6분, 116.8℃, 25.1분, 173.4℃, 14.7분 및 169.9℃, 3.4분으로 확립하였고, 최적 조건을 통해 루테인 3.70 mg, 베타-카로틴 0.67 mg, 클로로필 α 10.83 mg 및 클로로필 β 6.81 mg으로 추출되었음을 확인하였고(도 4), 카로티노이드는 클로로필보다 온도에 민감하여 150℃ 이하의 온도에서 20분 이상 추출하고, 클로로필은 카로티노이드에 비해 비교적 높은 온도에서 단시간 추출하는 것이 효율적임을 확인하였다.As a result, the optimum extraction temperature and time of lutein, beta-carotene and chlorophyll α, β were established at 148.2 ° C., 34.6 minutes, 116.8 ° C., 25.1 minutes, 173.4 ° C., 14.7 minutes and 169.9 ° C., 3.4 minutes, respectively. It was confirmed that the extracted lutein 3.70 mg, beta-carotene 0.67 mg, chlorophyll α 10.83 mg and chlorophyll β 6.81 mg (Fig. 4), the carotenoids are more sensitive to temperature than chlorophyll and extracted more than 20 minutes at a temperature below 150 ℃ , Chlorophyll was found to be more efficient extraction of short time at a relatively high temperature than carotenoids.

이를 통해, 클로렐라에서 카로티노이드 및 클로로필의 아임계 추출 최적 조건을 확립하였다.
This established the optimal subcritical extraction of carotenoids and chlorophyll in chlorella.

<< 실험예Experimental Example 5> 추출조건별 카로티노이드 및 클로로필의 항산화 효능( 5> Antioxidant Activity of Carotenoids and Chlorophyll by Extraction Conditions TEACTEAC ) 확인) Confirm

아임계 추출이 카로티노이드 및 클로로필의 활성에 미치는 영향을 확인하고, 각 추출법에서 분리된 물질의 활성을 비교하기 위하여, 추출된 각 성분에서 Trolox Equivalent Antioxidant Capacity(TEAC) 분석을 통해 항산화능을 측정하였다.In order to confirm the effect of subcritical extraction on the activity of carotenoids and chlorophyll and to compare the activity of the separated substances in each extraction method, the antioxidant activity was measured by Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) analysis in each extracted component.

구체적으로, 상기 <실험예 2>와 같은 방법과 같이 침지법 및 증류법으로 각 추출법에 의한 활성 물질을 분리하였고, 아임계 추출은 상기 <실시예 1>에서 제조된 클로렐라 시료 1 g에 90% 에탄올을 추출용매로 하여, 1,500 psi의 압력하에서 추출 온도를 35, 60, 85, 110, 135 및 160˚C로 달리하여 30분간 추출하였다. 이후, 고속 크로마토그래피를 통해 아임계 추출물 내의 카로티노이드 및 클로로필 성분을 각각 분리하고, 동시에 분리된 성분들의 ABTS(2, 2'-azino-bis 3'-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic acid) 라디컬 소거 효과를 확인하는 온라인 ABTS-고속 크로마토그래피 실험을 수행한 다음, 얻어진 결과를 표준 시료인 트롤록스(Trolox)와 비교하고, 각 성분의 항산화능을 트롤로스 당량(Trolox equivalent)으로 표시하였다. 온라인 ABTS 분석에는 3.5 mM의 인산칼슘으로 미리 라디칼 반응을 14시간 이상 유도한 2 mM ABTS용액을 이용하였으며, 고속 크로마토그래피를 통해 분리된 항산화 물질이 상기의 ABTS 용액과 반응하여 라디컬을 소거화는 정도를 734nm 파장에서 흡광도 분석에 의해 탐색하였다.Specifically, the active material by each extraction method was isolated by dipping and distillation as in the same manner as in <Experimental Example 2>, and subcritical extraction was performed by using 90% ethanol in 1 g of the chlorella sample prepared in <Example 1>. As the extraction solvent, the extraction temperature was extracted for 30 minutes at 35, 60, 85, 110, 135 and 160 ° C under a pressure of 1,500 psi. Thereafter, carotenoid and chlorophyll components in the subcritical extract were separated by high-speed chromatography, and the ABTS (2, 2'-azino-bis 3'-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic acid) radical scavenging effect of the separated components was simultaneously. After performing an online ABTS-high-speed chromatography experiment confirming the results, the results obtained were compared to a standard sample Trolox, and the antioxidant capacity of each component was expressed as Trolox equivalent. On-line ABTS analysis was performed using 2 mM ABTS solution, which induced a radical reaction of more than 14 hours in advance with 3.5 mM calcium phosphate. Antioxidants separated by high-speed chromatography reacted with the ABTS solution to eliminate radicals. The extent was explored by absorbance analysis at 734 nm wavelength.

그 결과, 침지법 및 증류법에 비해 아임계 추출시 얻어진 카로티노이드 및 클로로필이 더 높은 항산화 활성을 보이고, 아임계 추출 온도가 85℃ 이상일 때, 카로티노이드 및 클로로필에 의한 총 항산화 효능이 높게 유지되는 것을 확인하였다(도 5).As a result, it was confirmed that the carotenoid and chlorophyll obtained during subcritical extraction showed higher antioxidant activity than the immersion and distillation methods, and that the total antioxidant efficacy by carotenoid and chlorophyll was maintained higher when the subcritical extraction temperature was 85 ° C or higher. (FIG. 5).

따라서, 본 발명의 조건에 따라 클로렐라에서 아임계 추출법에 의해 얻어진 카로티노이드 및 클로로필은 다른 추출법에 의해 얻어진 카로티노이드 및 클로로필에 비해 더 높은 항산화 효능을 보이고, 그 기능성을 유지하고 있음을 확인하였다.
Accordingly, it was confirmed that the carotenoids and chlorophylls obtained by subcritical extraction in chlorella according to the conditions of the present invention showed higher antioxidant efficacy and retained their functionality as compared to the carotenoids and chlorophylls obtained by other extraction methods.

상기에서 보는 바와 같이, 본 발명의 아임계 유기 용매를 이용하여 클로렐라로부터 기능성 카로티노이드 및 클로로필을 효과적으로 생산하여 이를 기능성 식품의 원료로 유용하게 이용할 수 있다.As seen above, functional carotenoids and chlorophyll can be effectively produced from chlorella using the subcritical organic solvent of the present invention, which can be usefully used as a raw material for functional foods.

Claims

1) extracting chlorella with an organic solvent in a subcritical state to prepare an extract; And
2) producing a carotenoid using a subcritical organic solvent in chlorella, comprising the step of separating the carotenoid from the extract of step 1).

The method of claim 1, wherein the subcritical state is achieved through pressurization from 1,500 to 3000 psi from atmospheric pressure.

The method of claim 1, wherein the organic solvent is 80 to 90% ethanol aqueous solution.

The method of claim 1, wherein the extract is extracted at a temperature of 110 to 150 ° C. for 20 to 40 minutes.

The method of claim 1 wherein the carotenoid comprises lutein or beta-carotene.

The method of claim 1, wherein the subcritical extraction is through injection of non-reactive gas.

1) extracting chlorella with an organic solvent in a subcritical state to prepare an extract; And
2) a method of producing chlorophyll using a subcritical organic solvent in chlorella, comprising the step of separating chlorophyll from the extract of step 1).

8. The method of claim 7, wherein the subcritical state is through pressure from 1,500 to 3000 psi from atmospheric pressure.

8. The method of claim 7, wherein the organic solvent is 80 to 90% aqueous ethanol solution.

The method of claim 7, wherein the extract is characterized in that the extraction for 3 to 15 minutes at a temperature of 150 to 180 ℃.

8. The method of claim 7, wherein the chlorophyll comprises chlorophyll a, chlorophyll beta, pheophytin a and pyrofepitin a.

8. The method of claim 7, wherein the subcritical extraction is through injection of non-reactive gas.