KR20110115858A - A recombinant bacillus velezensis strain and a composition for controlling phytopathogenic fungi and hamful insect pests by using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 cry1Ac 유전자 발현 벡터 pHT1K-1Ac로 형질전환시킨 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주 및 이를 유효성분으로 함유하는 식물병원균과 곤충 해충을 동시에 저해할 수 있는 살충제 방제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주는 식물병원성균에 대해 높은 항균 활성나타내는 동시에 곤충 해충에 대한 저해 활성 또한 우수하여 하나의 작물에서 유해 곤충 해충과 식물병원성균에 의한 질병을 동시에 저해하는데 이용할 수 있으며, 상기 균주의 배양액 및 수득된 세포 모두를 통합 작물 보호용으로 개별 생물학적 저해제로서 독립적으로 사용할 수있는 효과가 있다The present invention relates to a recombinant Bacillus veletensis strain transformed with cry1Ac gene expression vector pHT1K-1Ac and a composition for controlling insecticides capable of simultaneously inhibiting phytopathogens and insect pests containing the same as an active ingredient, according to the present invention. Recombinant Bacillus veletensis strains exhibit high antimicrobial activity against phytopathogenic bacteria and also excellent inhibitory activity against insect pests, and thus can be used to simultaneously inhibit harmful insect pests and diseases caused by phytopathogenic bacteria in a single crop. Both cultures and cells obtained can be used independently as individual biological inhibitors for integrated crop protection.
Description
본 발명은 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주 및 이를 이용한 식물병원균 및 곤충 해충 방제용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 cry1Ac 유전자 발현 벡터 pHT1K-1Ac로 형질전환시킨 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주 및 이를 유효성분으로 함유하는 식물병원균과 곤충 해충을 동시에 저해할 수 있는 살충제 방제용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a recombinant Bacillus veletensis strain and a composition for controlling phytopathogens and insect pests using the same, and more specifically, to a recombinant Bacillus veletensis strain transformed with cry1Ac gene expression vector pHT1K-1Ac and the active ingredient The present invention relates to a composition for controlling insecticides capable of simultaneously inhibiting phytopathogens and insect pests.
종래 바실러스 속 균주는 항체, 효소 및 미생물 살충제의 생산과 같은 산업적 생물공학에서 이용하는데 고려되어 왔다. 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)와 같은 몇몇 바실러스 속 균주가 작물 진균성 질병에 대한 생물학적 저해제로 사용하기 위해 광범위하게 연구된 바 있다. 예를 들어, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주는 뽕잎 탄저병(mulberry anthracnose)을 야기시키는 탄저병균(Colletotrichum dematium)에 대해 활성인 일곱 가지의 항진균 화합물(이투린)을 생산하는 것으로 나타났다. 또한 바실러스 리체니포르미스 균주도 벼도열병을 야기시키는 벼도열병균(Magnaporthe grisea)에 대해 살균 활성을 나타내는 길항 리포펩티드(서펙틴)을 생산하는 것으로 나타났다. 바실러스 서브틸러스 균주 또한 붉은곰팡이(Fusarium graminearum)에 의해 야기되는 붉은곰팡이병(Fusarium head blight disease)에 대해 저해 활성을 갖는 것으로 나타난 바 있다. 더욱이 바실러스 서브틸러스로부터 클로닝된 항진균 키티나아제 유전자가 무 묘종에서 모잘록병(damping-off)을 야기시키는 식물병원균인 라이족토니아균(Rhizoctonia solani)에 대해 저해 활성을 보인다고 보고된 바 있다. Conventional Bacillus strains have been considered for use in industrial biotechnology such as the production of antibodies, enzymes and microbial pesticides. Several strains of the genus Bacillus, such as Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis and Bacillus amyloliquefaciens , have been widely used as biological inhibitors for crop fungal diseases. Has been studied. For example, the Bacillus amyloliquifaciens strain has been shown to produce seven antifungal compounds ( yurrin ) that are active against Colletotrichum dematium , causing mulberry anthracnose. Bacillus licheniformis strains have also been shown to produce antagonistic lipopeptides ( suspectin ) that exhibit bactericidal activity against Magnaporthe grisea , which causes rice febrile disease. Bacillus subtilis strains have also been shown to have inhibitory activity against Fusarium head blight disease caused by red fungus ( Fusarium graminearum ). Furthermore, it has been reported that antifungal chitinase genes cloned from Bacillus subtilis show inhibitory activity against phytopathogen Rhizoctonia solani , which causes damping-off in radish seedlings.
2005년 루이즈-가르시아(Ruiz-Garc) 등은 두 가지 신규한 계면활성제-생산 박테리아인 바실러스 속 CR-502T 및 CR-14b 균주를 동정하고, 이들을, 스페인 남부 벨레즈(V) 강에서 분리하였다는 연유로, 신규 바실러스 벨레첸시스 속(Bacillus velezensis sp. nov.) 균주로 명명하였다. 상기 바실러스 벨레첸시스 균주는, 표현형과 화학분류적 특성 및 계통발생학적 특이성을 바탕으로, 신규한 바실러스 속 균주로 분류되었다. 하지만 그럼에도 바실러스 벨레첸시스 속 균주는 바실러스 서브틸러스, 바실러스 모자벤시스 및 바실러스 아밀로리퀴페시엔스 균주와 매우 밀접한 관련이 있다. 실제, 최근의 보고 중 하나에서 바실러스 벨레첸시스 균주와 바실러스 아밀로리퀴페시엔스 균주 사이에서 표현형 특징적 특성의 결여, 16S rDNA 및 gyrB 유전자 서열 상동성 및 DNA-DNA 혼성을 바탕으로 바실러스 벨레첸시스 균주가 바실러스 아밀로리퀴페시엔스의 헤테로형 유사체라고 보고된 바 있다. 바파나(Bafana) 등은 최근 독성 및 발암성 화합물인 다이렉트 레드 18 아조 염료[Direct Red 28 (DR28) azo dye]를 탈색시킬 수 있는 아조환원효소(azoreductase)를 생산하는 바실러스 벨레첸시스 균주에 대해 보고하였다. In 2005, Ruiz-Garc et al identified two novel surfactant-producing bacteria, Bacillus CR-502 T and CR-14b strains, which were isolated from the Belize (V) river in southern Spain. For this reason, it was named as a novel strain of Bacillus velezensis sp. Nov. The Bacillus veletensis strains were classified as novel Bacillus sp. Strains, based on phenotypic, chemical classification and phylogenetic specificity. Nevertheless, the strains of the genus Bacillus veletensis are very closely related to the Bacillus subtilis, Bacillus mavensis and Bacillus amyloliquipeciens strains. Indeed, in one of the recent reports, the Bacillus veletensis strain is based on lack of phenotypic characteristic properties between the Bacillus veletensis strain and the Bacillus amylolyquipeciens strain, 16S rDNA and gyrB gene sequence homology and DNA-DNA hybridization. Has been reported to be a heterotype analogue of Bacillus amyloliquipeciens. Bafana et al. Have recently described a strain of Bacillus veletensis that produces azoreductases that can decolorize toxic and carcinogenic compounds, Direct Red 28 (DR28) azo dyes. Reported.
종래 바실러스 벨레첸시스 균주와 관련하여 대한민국 등록특허 제10-0882021호 “왕겨를 함유한 배지에서 바실러스 베레첸시스 A-68 균주의 생산방법” 및 제10-0738007호 “신규 미생물 바실러스 베레첸시스 Ａ-68 및 그의 용도”에 섬유소 분해효소를 생산하는 바실러스 베레첸시스 A-68 균주(Bacillus velezensis A-68; 기탁번호 KACC 91178P)를 왕겨 또는 미강을 이용하여 액상배양방법으로 생산함으로써 증식속도를 증가시켜 경제적으로 섬유소 분해효소를 대량생산함으로써 섬유소 분해효소의 생산성을 향상시키는 방법이 개시되어 있다.In relation to the conventional Bacillus veletensis strains, Republic of Korea Patent No. 10-0882021 "Method for producing Bacillus berechensis A-68 strains in the medium containing chaff" and 10-0738007 "New microorganism Bacillus Berethensis A -68 and its use "to increase the growth rate by producing Bacillus velezensis A-68 (Bacillus velezensis A-68; Accession No. KACC 91178P) by the liquid culture method using chaff or rice bran The present invention discloses a method for improving the productivity of fibrinase by mass production of fibrinase.
또한, 대한민국 등록특허 제10-0781300호 “신규한 바실러스속 미생물균주를 이용한 딸기 시들음병 방제용 미생물제제 및 그 제조방법”에 딸기 시들음병 방제용 미생물제제 또는 생육촉진 미생물제제의 유효성분으로 함유되는 것을 특징으로 하는 딸기 시들음병 방제용 미생물제제로서 바실러스 벨레첸시스(Bacillus velezensis) BS87(균주기탁번호 KACC 91217P)가 개시되어 있다. In addition, the Republic of Korea Patent No. 10-0781300 "microbial agent for the control of strawberry wilt disease using a new Bacillus microbial strain and its manufacturing method" is characterized in that it is contained as an active ingredient of microbial agent for controlling strawberry wilt disease or growth promoting microbial agent. Bacillus velezensis BS87 (Bacterial cycle accession number KACC 91217P) is disclosed as a microbial agent for controlling strawberry wilting disease.
그러나 1종 이상의 바실러스 벨레첸시스 균주가 계면활성 분자를 생산한다고 나타났음에도 불구하고, 식물병원성균에 대한 바실러스 벨레첸시스 균주의 항진균 활성을 상술한 연구는 행해진 바 없다.However, although one or more Bacillus veletensis strains have been shown to produce surfactant molecules, the above studies have not been conducted on the antifungal activity of Bacillus veletensis strains against phytopathogenic bacteria.
한편, 바실러스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 균주는 바실러스 속 균주의 일종으로 산업적으로 흔히 사용되고 있다. 예를 들어, 바실러스 투린기엔시스 균주는 농업 및 임업 곤충 해충을 저해하는데 널리 이용되고 있으며, 이들의 살충 단백질 유전자(cry 군) 또한 곤충-저항성 도입 작물(Bt 작물)을 생산하는데 이용되고 있다. 바실러스 투린기엔시스 살충 단백질 Cry1Ac은 잘 알려진 Cry 단백질로서, 인시류 유충에 대해 높은 살충 활성을 나타낸다. 상기 단백질은 배추좀나방(diamondback moth; Plutella xylostella)에 대해 단지 2 ng/ml 범위의 LC50 값은 가지며, 인시류 해충에 대한 Cry1Ac의 독성 스펙트럼은 매우 넓은 것으로 알려져 있다. Cry1Ac 단백질 발현 모백터인 pHT1K는 pHT3101에서 유래한 최소-크기의 벡터이며(바실러스 투린기엔시스 내지 플라스미드 pHT3101을 기재로 함), pHT3101를 이용한 외래 유전자(Cry1Aa)의 발현이 확인되었다. 또한 이전에 pHT1030 유래 플라스미드의 분리 안정성에 대한 연구가 행해진 바 있다. 상기의 연구에 따르면, 선택력(selective pressure)을 가하지 않은 상태로 30 세대 후, pHT1030 유래 플라스미드가 30℃에서 바실러스 서브틸러스 균주 내에서 안정하였다(<10% 분리 빈도). On the other hand, Bacillus thuringiensis strain ( Bacillus thuringiensis ) strain is a kind of Bacillus genus strain is commonly used industrially. For example, Bacillus thuringiensis strains are widely used to inhibit agricultural and forestry insect pests, and their pesticidal protein genes ( cry group) are also used to produce insect-resistant transgenic crops (Bt crops). The Bacillus thuringiensis insecticidal protein Cry1Ac is a well known Cry protein and exhibits high pesticidal activity against the larvae of the species. The protein has an LC 50 value in the range of only 2 ng / ml for diamondback moth ( Plutella xylostella ), and the toxicity spectrum of Cry1Ac against anthropogenic pests is known to be very broad. PHT1K, a Cry1Ac protein expression parent vector, is a minimal-sized vector derived from pHT3101 (based on Bacillus thuringiensis to plasmid pHT3101) and expression of foreign gene (Cry1Aa) using pHT3101 was confirmed. In addition, previous studies on the separation stability of the pHT1030-derived plasmid. According to the above study, after 30 generations without applying selective pressure, the pHT1030 derived plasmid was stable in Bacillus subtilis strains at 30 ° C. (<10% isolation frequency).
종래 바실러스 투린기엔시스의 살충 활성을 이용하기 위하여, cry 유전자를 다른 박테리아, 예를 들어, 식물 엽면에 자연적으로 이식하고 있는 슈도모나스 속, 시아노박테리아 속, 리조비움 속 및 바실러스 속에 전이시켜왔다. 이와 같은 시도는 작물 산지에서 Cry 단백질의 살충 활성의 내구성과 지속성을 개선시킬 수 있다. Cry1Ab가 전이된 토종 바실러스 서브틸러스 및 바실러스 리체니포르미스 균주는 성공적으로 독성을 발현시켰고, 토마토 잎 표면 상에서 45일 이상 생존하였다. 또한 종래 바실러스 투린기엔시스의 효능을 증진시키고 호스트 스펙트럼(host spectrum)을 확장시키기 위해, 동일한 표적에 대해 보다 큰 독성을 갖거나 다른 곤충 종에 대해 독성이 있는 다른 cry 유전자를 바실러스 투린기엔시스 균주에 직접 전이시킨 바 있다. In order to exploit the pesticidal activity of Bacillus thuringiensis, cry genes have been transferred to other bacteria, for example, Pseudomonas genus, cyanobacteria genus, Rizobium genus and Bacillus sp. Such attempts can improve the durability and persistence of the pesticidal activity of Cry protein in crop production. Native Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis strains with Cry1Ab metastases successfully developed toxicity and survived over 45 days on tomato leaf surfaces. In addition, to further enhance the efficacy of the Bacillus thuringiensis and expand the host spectrum, other cry genes with greater toxicity to the same target or to other insect species may be transferred to the Bacillus thuringiensis strain. It was transferred directly.
또한 바실러스 투린기엔시스 균주(CMB26)는 식물병원성균인 고추탄저병균(Collectotrichum gloeosporioides)을 억제하는 펜기신 유사(fengycin-like) 리포펩티드를 생산하는 것으로 나타났으며, 최 등은 일본인 대변 시료에서 분리된 네 가지 바실러스 투린기엔시스 균주가 보리 흰가루병(barley powdery mildew)에 대해 강력한 활성을 보인다고 보고한 바 있다. 또한 몇몇 연구가 항균성 화합물, 예를 들어, 엔토모신(entomocin) 및 쯔비터마이신(zwittermicin)에 중점을 둔 바도 있다. 그러나 이러한 연구들은 단지 바실러스 투린기엔시스 균주의 항진균 활성을 제시하고 있지 상기 균주의 이중 활성에 대해서는 상세히 논의하지는 않았다.In addition, Bacillus thuringiensis strain (CMB26) has been shown to produce penycin-like lipopeptides that inhibit the phytopathogenic bacterium Collectotrichum gloeosporioides , Choi et al. Four Bacillus thuringiensis strains have been reported to exhibit potent activity against barley powdery mildew. Some studies have also focused on antimicrobial compounds such as entomocin and zwittermicin. However, these studies only suggest antifungal activity of Bacillus thuringiensis strains and do not discuss the dual activity of these strains in detail.
지금까지 알려진 바에 따르면, 본 발명은 바실러스 벨레첸시스의 본래 항진균 활성을 유지하면서도 Cry1Ac 단백질을 바실러스 벨레첸시스 균주에서 발현시킬 수 있음을 나타낸 최초의 보고이다.To date, the present invention is the first report showing that the Cry1Ac protein can be expressed in Bacillus veletensis strains while maintaining the original antifungal activity of Bacillus veletensis.
본 발명에서는 바실러스 투린기엔시스 Cry1Ac 유전자를 도입시켜 형질전환시킨 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주가 도열병(Magnaporthe grisea), 벼잎집무늬마름병(Rhizotonia solani), 토마토 잿빛곰팡이병(Phytophthora infestans) 및 밀 붉은녹병(Puccinia recondita)을 포함한 몇몇 식물 질병에 대해 높은 항진균 활성(70% 이상의 저해 효능)을 나타내는 동시에 곤충 해충을 동시에 저해할 수 있음을 확인하고 본 발명에 이르게 되었다.In the present invention, the recombinant Bacillus veletensis strain transformed by introducing the Bacillus thuringiensis Cry1Ac gene is transformed into Magnaporthe grisea , Rhizotonia solani , Tomato gray mold ( Phytophthora infestans ), and wheat red rust. Puccinia recondita ) has been shown to show high antifungal activity (more than 70% of inhibitory effect) against some plant diseases, while simultaneously inhibiting insect pests and led to the present invention.
따라서 본 발명의 목적은 cry1Ac 유전자 발현 벡터 pHT1K-1Ac로 형질전환시킨 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a recombinant Bacillus veletensis strain transformed with cry1Ac gene expression vector pHT1K-1Ac.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주를 유효성분으로 함유하는 식물병원균과 곤충 해충을 동시에 저해할 수 있는 살충제 방제용 조성물을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a pesticide control composition capable of simultaneously inhibiting phytopathogens and insect pests containing the recombinant Bacillus veletensis strain as an active ingredient.
상기와 같은 본 발명의 목적은 cry1Ac 유전자를 보유한 바실러스 투린기엔시스 발현 벡터 pHT1K-1Ac를 바실러스 벨레첸시스 S3-5 균주에 도입시켜 신규한 재조합 벨레첸시스 균주를 제조하고, 상기 균주의 식물병원성균에 항진균 활성과 곤충해충에 대한 살충 활성 평가함으로써 본 발명에 따른 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주가 식물병원성균에 항진균 활성과 곤충해충에 대한 살충 활성을 동시에 발휘할 수 있음을 확인함으로써 달성되었다.
An object of the present invention as described above is to introduce a Bacillus thuringiensis expression vector pHT1K-1Ac containing cry1Ac gene into Bacillus veletensis S3-5 strain to prepare a novel recombinant veletensis strain, phytopathogenic bacteria of the strain By evaluating antifungal activity and insecticidal activity against insect pests, the recombinant Bacillus veletensis strain according to the present invention was achieved by confirming that the antifungal activity against phytopathogenic bacteria and insecticidal activity against insect pests can be exerted simultaneously.
본 발명은 cry1Ac 유전자 발현 벡터 pHT1K-1Ac로 형질전환시킨 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주 KCTC11641BP를 제공하는 것이다.The present invention provides a recombinant Bacillus veletensis strain KCTC11641BP transformed with cry1Ac gene expression vector pHT1K-1Ac.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주를 유효성분으로 함유하는 식물병원균과 곤충 해충을 동시에 저해할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.In addition, another object of the present invention is to provide a composition capable of simultaneously inhibiting phytopathogens and insect pests containing the recombinant Bacillus veletensis strain as an active ingredient.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주를 통해 저해할 수 있는 식물병원성균은 벼도열병(rice blast; RCB, M. grisea), 벼잎집무늬마름병(rice sheath blight; RSB, R. solani), 토마토잿빛곰팡이병(tomato gray mold; TGM, B. cinerea), 토마토역병(tomato late blight; TLB, P. infestans), 밀붉은녹병(wheat leaf rust; WLR, P. recondita), 보리 흰가루병(barley powdery mildew; BPM, Erysiphe graminis), 및 고추탄저병(red pepper anthracnose; PAN, Collectotrichum gloeosporioides)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에 알려진 다른 식물병원성 균에 적용시킬 수도 있다.In the present invention, the phytopathogenic bacteria that can be inhibited through the recombinant Bacillus veletensis strains are rice blast (RCB, M. grisea ), rice sheath blight (RSB, R. solani ) , Tomato gray mold (TGM, B. cinerea ), tomato late blight (TLB, P. infestans ), wheat leaf rust (WLR, P. recondita ), barley flour (barley) powdery mildew (BPM, Erysiphe graminis ), and red pepper anthracnose (PAN, Collectotrichum gloeosporioides ), but are not limited thereto, and may be applied to other phytopathogenic bacteria known in the art.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주를 통해 저해할 수 있는 곤충 해충은 배추좀나방(Plutella xylostella), 이화명나방(striped stem borer; Chilo suppressalis), 벼혹나방(rice leaf folder; Cnaphalocrocis medinalis), 왕담배나방 (Helicoverpa armigera), 양배추은무늬밤나방 (Trichoplusia ni) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에 알려진 다른 곤충 해충에 적용시킬 수도 있다.In the present invention, the insect pests that can be inhibited through the recombinant Bacillus veletensis strains include Plutella xylostella , Striped stem borer ( Chilo suppressalis ), Rice leaf folder ( Cnaphalocrocis medinalis ) , Helicoverpa armigera , cabbage pattern moth ( Trichoplusia ni ), but are not limited thereto, and may be applied to other insect pests known in the art.
본 발명에서는 살충성 바실러스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 결정 단백질의 발현을 통해 항균 및 살충 활성을 갖는 신규한 재조합 균주 바실러스 벨레첸시스(Bacillus velezensis)를 제조하기 위하여, 최소 대장균-바실러스 투린기엔시스 셔틀 벡터(pHT1K)의 내생 프로모토를 저해함으로써 바실러스 투린기엔시스 cry1Ac 유전자를 보유한 바실러스 투린기엔시스 발현 벡터(pHT1K-1Ac)를 생성시켰다. 이어서, 전기천공법을 이용하여 상기 벡터를 도열병(Magnaporthe grisea), 벼잎집무늬마름병(Rhizotonia solani), 토마토 잿빛곰팡이병(Phytophthora infestans) 및 밀 붉은녹병(Puccinia recondita)을 포함한 몇몇 식물병원성균에 대해 높은 항균 활성을 나타내는 바실러스 벨레첸시스로 도입시켰다. 이렇게 제조된 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주를 cry1Ac-특이적 프라미머를 이용한 PCR로 확인하였다. 또한 상기 재조합 균주는 대략 130 kDa 크기의 단백질과 바실러스 투린기엔시스와 유사한 부아포 봉입체(parasporal inclusion body)를 생산하였다. 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주에 대한 in vivo 항균 활성 분석 결과, 상기 균주가 야생형 벨레첸시스와 동일한 수준의 항균 활성을 보유한 것으로 나타났다. 더욱이 야생형 바실러스 벨레첸시스 균주가 어떠한 살충 활성도 나타내지 않은 반면, 상기 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주는, 비록 재조합 바실러스 투린기엔시스 균주에 비해 낮기는 하였지만, 인시류 해충, 배추좀나방(Plutella xylostella)에 대해 높은 살충 활성을 나타내었다. In the present invention, in order to prepare a novel recombinant strain Bacillus velezensis having antibacterial and insecticidal activity through the expression of the insecticidal Bacillus thuringiensis crystalline protein, the minimum E. coli-Bacillus thuringiensis shuttle By inhibiting the endogenous promoto of the vector (pHT1K), a Bacillus thuringiensis expression vector (pHT1K-1Ac) carrying the Bacillus thuringiensis cry1Ac gene was generated. Subsequently, electroporation was used to identify the vector against several phytopathogenic bacteria, including Magnaporthe grisea , Rhizotonia solani , Tomato phytophthora infestans , and Wheat rust ( Puccinia recondita ). It was introduced into Bacillus veletensis showing high antibacterial activity. The recombinant Bacillus veletensis strain thus prepared was identified by PCR using cry1Ac -specific primers. The recombinant strain also produced a protein of approximately 130 kDa size and a parasporal inclusion body similar to Bacillus thuringiensis. In vivo antimicrobial activity analysis of recombinant Bacillus veletensis strains showed that the strain had the same level of antimicrobial activity as wild type veletensis. Moreover, while the wild type Bacillus veletensis strain did not show any pesticidal activity, the recombinant Bacillus veletensis strain, although lower than that of the recombinant Bacillus thuringiensis strain, was resistant to the species of P. erythropoie , Plutella xylostella . It showed high pesticidal activity.
본 발명에 따른 바실러스 벨레첸시스 균주의 표적 작물 스펙트럼에 따르면, 예를 들어 매우 유해한 벼 해충인 줄무늬 줄기 나비좀(striped stem borer; Chilo suppressalis)에 대한 식이 혼합 생물검정에서 LC50 값은 19.4 ng/mg이었고, 혹명나방(rice leaf folder; Cnaphalocrocis medinalis)에 대한 LC50 값은 21 ng/mg이었다. 이러한 Cry1Ac 단백질의 특이성은 벼 논에 보다 더 이용가능할 수 있음을 제시한다.According to the target crop spectrum of the Bacillus veletensis strain according to the invention, LC 50 values in the dietary mixed bioassay for, for example, the stripped stem borer ( chilo suppressalis ), a very harmful rice pest, are 19.4 ng / mg and LC 50 values for the rice leaf folder (Cnaphalocrocis medinalis) were 21 ng / mg. The specificity of this Cry1Ac protein suggests that it may be more available for rice paddies.
결론적으로, 이러한 결과는 본 발명에 따른 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주를 하나의 작물에서 유해 곤충 해충과 식물 진균성 질환을 동시에 저해하는데 이용할 수 있다는 사실을 보여준다. 더욱이 상기 균주의 배양액 및 수득된 세포 모두를 통합 작물 보호용으로 개별 생물학적 저해제로서 독립적으로 사용할 수도 있다.
In conclusion, these results show that the recombinant Bacillus veletensis strain according to the present invention can be used to simultaneously inhibit harmful insect pests and plant fungal diseases in one crop. Furthermore, both the cultures and the cells obtained of the strains may be used independently as individual biological inhibitors for integrated crop protection.
본 발명에 따른 cry1Ac 유전자 발현 벡터 pHT1K-1Ac로 형질전환시킨 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주는 식물병원성균에 대해 높은 항균 활성나타내는 동시에 곤충 해충에 대한 저해 활성 또한 우수하여 하나의 작물에서 유해 곤충 해충과 식물병원성균에 의한 질병을 동시에 저해하는데 이용할 수 있으며, 상기 균주의 배양액 및 수득된 세포 모두를 통합 작물 보호용으로 개별 생물학적 저해제로서 독립적으로 사용할 수있는 효과가 있다.
Recombinant Bacillus veletensis strain transformed with cry1Ac gene expression vector pHT1K-1Ac exhibits high antibacterial activity against phytopathogenic bacteria and also has excellent inhibitory activity against insect pests in one crop. It can be used to simultaneously inhibit diseases caused by pathogenic bacteria, and there is an effect that both the culture medium and the obtained cells of the strain can be used independently as individual biological inhibitors for integrated crop protection.
도 1은 Cry1Ac 단백질 발현 벡터 pHT1K-1Ac로 형질전환된 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주의 PCR 분석 결과(A)와 SDS-PAGE 분석 결과(B)를 나타낸 도이다. 폐쇄 및 개방 화살표는 각각 cry1Ac 유전자-특이적 PCR 산물과 발현된 Cry1Ac 단백질을 지시하고, 예상된 PCR 산물의 크기는 507 bp이다.
도 2는 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주의 주사전자현미경 사진(A)과 투과전자현미경 사진(B)이다. 좌측 컬럼은 바실러스 벨레첸시스 S3-5 균주를 나타내고, 우측 컬럼은 이를 형질전환시킨 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주를 나타내며, 크기 바는 1 mm (A) 및 200 nm (B)를 나타내고, 백색 및 개방 화살표는 Cry1Ac 봉입체를 나타낸다.
도 3은 일곱 가지 진균 식물병원성균에 대한 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주의 In vivo 항진균 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 배추좀나방에 대한 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주의 살충 활성을 나타낸 그래프이다. 사망률은 처리한 지 48시간 후 측정하였다. 1 is a diagram showing the results of PCR analysis (A) and SDS-PAGE analysis (B) of a recombinant Bacillus veletensis strain transformed with the Cry1Ac protein expression vector pHT1K-1Ac. The closed and open arrows indicate the cry1Ac gene-specific PCR product and the expressed Cry1Ac protein, respectively, and the expected PCR product size is 507 bp.
2 is a scanning electron micrograph (A) and transmission electron micrograph (B) of a recombinant Bacillus veletensis strain. The left column represents the Bacillus veletensis S3-5 strain, the right column represents the recombinant Bacillus veletensis strain transformed thereto, the size bar represents 1 mm (A) and 200 nm (B), white and open Arrows indicate Cry1Ac inclusion bodies.
Figure 3 is a graph showing the in vivo antifungal activity of recombinant Bacillus veletensis strain against seven fungal phytopathogenic bacteria.
Figure 4 is a graph showing the insecticidal activity of recombinant Bacillus veletensis strain against Chinese cabbage moth. Mortality was measured 48 hours after treatment.
이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 참고로 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1 : 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주의 제조Example 1 Preparation of Recombinant Bacillus Velensis Strain
본 실시예에서는 바실러스 속 균주에서 Cry1Ac 단백질을 발현시키기 위해, 하기에서와 같이 바실러스 서브틸러스와 바실러스 투린기엔시스의 형질전환에 통상적으로 이용되고 있는 프로토콜을 약간 변형한 전기천공법을 이용하여 바실러스 벨레첸시스 균주에 발현 벡터 pHT1K-1Ac를 도입시켜 형질전환시켰다. In this example, Bacillus Veletjen using a slightly modified electroporation method to express the Cry1Ac protein in the Bacillus sp. Strain, which is commonly used for transformation of Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis. The cis strain was transformed by introducing the expression vector pHT1K-1Ac.
상기 발현 벡터 pHT1K-1Ac는, 최소 대장균-바실러스 투린기엔시스 셔틀 벡터에서 내생 프로모터의 저해 하에 바실러스 투린기엔시스의 살충성 cry1Ac 유전자로 구성된 것이며, 바실러스 벨레첸시스 균주는 바실러스 벨레첸시스 S3-5 분리균을 한국화학연구원(Korea Research Institute of Chemical Technology) 김진철 박사로부터 제공받았다.The expression vector pHT1K-1Ac is composed of the insecticidal cry1Ac gene of Bacillus thuringiensis under the inhibition of the endogenous promoter in a minimal Escherichia coli-Bacillus thuringiensis shuttle vector, and the Bacillus veletensis S3-5 isolate The bacteria were provided by Dr. Jin-Chul Kim from the Korea Research Institute of Chemical Technology.
우선 상기 바실러스 벨레첸시스 S3-5 균주를 37℃로 3일 동안 TBS 액체배지 (tryptic soy broth)에서 배양하고, 0.025% 트윈 20으로 세척하였다. 바실러스 벨레첸시스 S3-5 분리균에서 형질전환용 세포(electrocompetent cell)를 생성시키기 위해, 밤새 배양한 바실러스 벨레첸시스 배양액의 10배 희석액을 PY 염 배지(펩톤 0.9%, 효모 추출물 0.5%, NaCl 0.5%, pH 7.0)에서 4 시간 동안 배양하였다. 이로부터 형질전환용 세포를 얻어 세척용 완충액(0.5M 자당, 0.01M MgCl2·6H2O, 0.01 M 말레산, pH 6.5) 30 mL로 세척하고, 재원심분리한 다음, 세척용 완충액 1mL에 재현탁시켰다. 상기 형질전환용 세포(200 μl)를 벡터 DNA 1μg과 혼합하고, 바이오-레드 젠 펄서(Bio-Rad Gene Pulser)를 이용하여 전압 2 kV, 저항 100 Ω 및 전기용량 25 μF의 조건으로 0.2-cm 전기천공 큐벳(Bio-Rad, U.S.A.)에서 충격(single-shocked)을 가하였다. 1 mL PY 배지에서 3 시간 동안 37℃에서 상기에서 전기천공된 세포를 회수하고, 에리쓰로마이신-보충(25 μg/ml) PY 아가 플레이트 상에 도말하였다. 형질전환된 바실러스 콜로니들에 대해 48시간 동안 후-형질전환 실험을 수행하였다.First, the Bacillus veletensis S3-5 strain was incubated in TBS liquid medium (tryptic soy broth) for 3 days at 37 ℃, washed with 0.025
실험예 1 : 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주로 Cry1Ac의 형질전환 평가Experimental Example 1 Evaluation of Transformation of Cry1Ac with a Recombinant Bacillus Velensis Strain
종래 작물 진균 질병에 대한 사전 활성 분석에서, 바실러스 벨레첸시스 S3-5 균주가 효과적인 작용제임이 밝혀진 바 있다. 이에 바실러스 벨레첸시스 S3-5 균주를 Cry1Ac 발현 벡터로 형질전환시키기 전에, 그람-양성균용 항생제(TSB 배지 중 25 mg/mL 에리쓰로마이신)에 대한 바실러스 벨레첸시스 S3-5 균주의 감응성을 조사하였다. 바실러스 벨레첸시스 S305 균주는 에리쓰로마이신에 대해 전혀 저항성을 나타내지 않았다. 또한 상 대조 현미경 분석 하에서 바실러스 벨레첸시스 S3-5 균주의 어떠한 세포에서도 봉입 구조물 또는 입자-유사 구조물이 검출되지 않았다. Prior activity assays for conventional crop fungal diseases have shown that Bacillus veletensis S3-5 strains are effective agents. Therefore, before transforming the Bacillus veletensis S3-5 strain with a Cry1Ac expression vector, the sensitivity of the Bacillus veletensis S3-5 strain against Gram-positive bacteria antibiotics (25 mg / mL erythromycin in TSB medium) was determined. Investigate. The Bacillus veletensis S305 strain showed no resistance to erythromycin. In addition, no inclusion structures or particle-like structures were detected in any cells of the Bacillus veletensis S3-5 strain under phase control microscopy.
상기에서 실시예 1에서 얻어진 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주를 에리쓰로마이신(erythromycin)(25 μg/ml)를 보충한 TSB 배지에서 배양하였다.The recombinant Bacillus veletensis strain obtained in Example 1 above was cultured in TSB medium supplemented with erythromycin (25 μg / ml).
단백질 결정체를 형성하지 않는(acrystalliferous) 바실러스 투린기엔시스 Cry-B 균주를 pHT1K-1Ac에 의한 전기천공에 이은 Cry1Ac 단백질의 발현을 위한 대조 균주로 이용하였다. 바실러스 투린기엔시스 Cry-B 형질전환체를 에리쓰로마이신을 보충한 영양 아가 플레이트 상에서 5일 동안 28℃로 배양한 후, 곤충 생물검정을 위한 양성 대조군으로 이용하였다.A Bacillus thuringiensis Cry-B strain that did not form protein crystals (acrystalliferous) was used as a control strain for expression of Cry1Ac protein following electroporation by pHT1K-1Ac. Bacillus thuringiensis Cry-B transformants were incubated at 28 ° C. for 5 days on nutrient agar plates supplemented with erythromycin and used as positive controls for insect bioassay.
상기 바실러스 벨레첸시스 형질전환체에서 발현 벡터가 바실러스 벨레첸시스 균주 내로 도입된 사실을 확인하기 위하여, PCR로 확인하였으며, PCR 산물을 DNA 서열 분석법으로 검증하였다(도 1A 참조)In order to confirm that the expression vector in the Bacillus veletensis transformant was introduced into the Bacillus veletensis strain, it was confirmed by PCR, and the PCR product was verified by DNA sequencing (see FIG. 1A).
cry1Ac-특이적 프라이머 세트[Cry1Ac 정방향 프라이머(5'-TCACTTCCCATCGACATCTACG-3') 및 Cry1-type 정상 역방향 프라이머 Cry1-3 (5'-ATCACTGAGTC GCTTCGCATGTTTGACTTTCTG-3')]를 이용하여 사이클 파라미터(95℃로 5분; 95℃로 30초 동안 30 사이클; 50℃로 30초; 72℃로 1분; 및 72℃로 5분)에 따라 PCR을 수행하였다. PCR을 위한 템플릿(template)으로, 바실러스 벨레첸시스 배양약 1 mL를 ddH2O로 2회 세척하고, 100℃로 10분 동안 끓인 후, 최종 상등액을 사용하였다. 증폭된 분획을 DNA 염기순서분석법으로 확인하였다. 형질전환체에 도입된 Cry1Ac 단백질의 발현을 0.025% 트윈 20으로 3회 세척한 3-일 배양액을 12% SDS-PAGE로 검출하여, 130 kDa의 단백질을 검출하였다(도 1B 참조).
Cycle parameters (5 at 95 ° C.) using the cry1Ac -specific primer set [Cry1Ac forward primer (5′-TCACTTCCCATCGACATCTACG-3 ′) and Cry1-type normal reverse primer Cry1-3 (5′-ATCACTGAGTC GCTTCGCATGTTTGACTTTCTG-3 ′)] Minutes; 30 cycles at 95 ° C. for 30 seconds; 30 seconds at 50 ° C .; 1 minute at 72 ° C .; and 5 minutes at 72 ° C.). As a template for PCR, 1 mL of Bacillus veletensis culture was washed twice with ddH 2 O, boiled at 100 ° C. for 10 minutes, and the final supernatant was used. The amplified fractions were confirmed by DNA sequencing. Expression of the Cry1Ac protein introduced into the transformant was detected by 12% SDS-PAGE in a 3-day culture washed three times with 0.025
실험예 2 : 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주에서 Cry1Ac의 안정적 발현 평가Experimental Example 2 Stable Expression Evaluation of Cry1Ac in Recombinant Bacillus Velensis Strains
본 실험예에서는 본 발명에 따른 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주에서 Cry1Ac 단백질의 안정적 발현 여부를 평가하였다. 2~3-일 배양 세포 시료를 수득하여 0.025% 트윈 20으로 3회 세척하였다. 상기 세포를 초기에는 0.05 M 소듐 카코딜레이트 완충액(pH 7.2) 중의 2% 파라포름알데히드 및 2% 글루타르알데히드로 4℃에서 2시간 동안 고정시킨 후, 소듐 카코딜레이트 완충액으로 3회 세척하였다. 이어서, 1% 오스뮴 테트록사이드에서 4℃로 2 시간 동안 후-고정 처리를 수행하고, ddH2O로 간단히 2회 세척하였다. 이러한 시료를 0.5% 우라닐 아세테이트로 염색하고, 에탄올을 이용하여 에탄올의 농도를 증가시키면서 탈수시켰다. In this experimental example, the stable expression of Cry1Ac protein in the recombinant Bacillus veletensis strain according to the present invention was evaluated. A 2- to 3-day cultured cell sample was obtained and washed three times with 0.025
탈수 과정 후, 상기 시료를 실온에서 100% 헥사메틸디실라잔을 이용하여 건조하여 주사전자현미경 분석을 위한 시료를 준비하였다. 상기 시료를 금속 스텁에 마운트하고 금으로 코팅하였다. 투과전자현미경 분석을 위해 프로필렌 옥사이드에서 스퍼 수지(Spurr’ resin)의 침윤을 수행하고, 표본을 70℃에서 24시간 동안 스퍼 수지에 매립시켰다. 전자 현미경용 초박편 절단기(MT-X, RMC, Tucson, AZ, U.S.A.)를 이용하여 단면을 절단하고, 2% 우라닐 아세테이트 및 레이놀드 리드 시트레이트(Reynolds’ lead citrate)로 염색하였다. 바실러스 벨레첸시스 세포를 주사전자현미경(magnification ×20,000; JSM 5410LV, Jeol, Japan)과 투과전자현미경(magnification ×60,000; Libra 120, Carl Zeiss, Germany)으로 관찰하였다.After the dehydration process, the sample was dried using 100% hexamethyldisilazane at room temperature to prepare a sample for scanning electron microscope analysis. The sample was mounted on a metal stub and coated with gold. Infiltration of Spurr 'resin in propylene oxide was performed for transmission electron microscopy analysis and the specimen was embedded in Spur resin for 24 hours at 70 ° C. Cross sections were cut using ultra-thin cutters for electron microscopy (MT-X, RMC, Tucson, AZ, U.S.A.) and stained with 2% uranyl acetate and Reynolds' lead citrate. Bacillus veletensis cells were observed by scanning electron microscopy (magnification x 20,000; JSM 5410LV, Jeol, Japan) and transmission electron microscopy (magnification x 60,000;
그 결과 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주에서 Cry1Ac 발현은 안정적이며, 바실러스 투린기엔시스에서 Cry 단백질 발현과 유사한 것으로 보인다. 전자 현미경 분석을 통해 바실러스 벨레첸시스 균주에서 부아포 봉입체(parasporal inclusion body)의 생산과 자가용해되고 포자형성된 세포가 관찰되었다. As a result, Cry1Ac expression is stable in recombinant Bacillus veletensis strain, and seems to be similar to Cry protein expression in Bacillus thuringiensis. Electron microscopic analysis showed the production of parasporal inclusion bodies and autolysed and sporulated cells in Bacillus veletensis strains.
주사 전자 현미경 분석에서, 작고 무정형인 봉입체-유사 구조물이 관찰되었다(도 2A 참조). 이들의 생산을 더 확인하기 위해, 포자형성된 세포의 단면을 투과 전자 현미경으로 분석하였다(도 2B 참조). 봉입체가 전형적인 바실러스 투린기엔시스 Cry1Ac 단백질 보다 작은 것으로 보이지만(~1 μm), 세포 내에 부아포 봉입체가 존재함이 확인되었다. In scanning electron microscopic analysis, small, amorphous inclusion body-like structures were observed (see FIG. 2A). To further confirm their production, cross sections of sporulated cells were analyzed by transmission electron microscopy (see FIG. 2B). Although the inclusion body appears to be smaller than the typical Bacillus thuringiensis Cry1Ac protein (˜1 μm), it was confirmed that there was a buffy inclusion inclusion within the cell.
본 발명자들은 상기와 같이 Cry1Ac 단백질이 안정적으로 발현됨이 확인된 재조합 벨레첸시스 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2010년 3월 2일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 11641BP를 부여받았다.
The inventors of the present invention deposited the recombinant Velethensis strain, which was stably expressed in the Cry1Ac protein, as of March 2, 2010, at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, and received the accession number KCTC 11641BP.
실험예 3 : 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주의 In Vivo 항진균 활성 분석Experimental Example 3 Analysis of In Vivo Antifungal Activity of Recombinant Bacillus Velensis Strains
본 실험예에서는 바실러스 벨레첸시스 S3-5 균주와 그로부터 유래된 재조합 균주를 일곱가지 진균 병원균: 벼도열병(rice blast; RCB, M. grisea), 벼잎집무늬마름병(rice sheath blight; RSB, R. solani), 토마토잿빛곰팡이병(tomato gray mold; TGM, B. cinerea), 토마토역병(tomato late blight; TLB, P. infestans), 밀붉은녹병(wheat leaf rust; WLR, P. recondita), 보리 흰가루병(barley powdery mildew; BPM, Erysiphe graminis), 및 고추탄저병(red pepper anthracnose; PAN, Collectotrichum gloeosporioides)에 대하여 평가하였다. In this experimental example, Bacillus veletensis S3-5 strains and recombinant strains derived therefrom were selected from seven fungal pathogens: rice blast (RCB, M. grisea ), rice sheath blight (RSB, R. solani ), tomato gray mold (TGM, B. cinerea ), tomato late blight (TLB, P. infestans ), wheat leaf rust (WLR, P. recondita ), barley powdery mildew (barley powdery mildew; BPM, Erysiphe graminis ), and red pepper anthracnose (PAN, Collectotrichum gloeosporioides ).
토마토(Lycopersicon seculentum Mil., cv. Seokwang), 보리(Hordeum sativum Jessen, cv. Dongburi), 및 밀(Triticum aestivum L., cv. Chokwang) 모종을 온실에서 25±5℃로 1-3주 동안 길렀다. 바실러서 벨레첸시스 배양액 희석액을 각 모종에 분무하고, 24시간 후 진균 포자를 접종하였다. 대조 식물군에는 0.025% 트윈 20을 분무하였다. 접종 후 3-7일 째 질병 증상을 평가하였다. 모든 처리는 생장용 챔버에서 2회 수행되었다. 질병 저해 비율(%)을 하기 식을 이용하여 계산하였다: Seedlings of tomatoes ( Lycopersicon seculentum Mil., Cv. Seokwang), barley ( Hordeum sativum Jessen, cv. Dongburi), and wheat ( Triticum aestivum L., cv. Chokwang) were grown in greenhouses at 25 ± 5 ° C. for 1-3 weeks. . The bacterium dilutions of the veletensis culture were sprayed onto each seedling and inoculated with the fungal spores after 24 hours. Control plants were sprayed with 0.025
저해 활성(%) = 100[(A-B)/A]Inhibitory Activity (%) = 100 [(A-B) / A]
여기서, A는 트윈 20 단독으로 처리한 유충에 대한 감염 면적을 나타내고, B는 바실러스 벨레첸시스 S3-5-처리 유충에 대한 감염 면적을 나타낸다.Here, A represents the area of infection for larvae treated with
바실러스 벨레첸시스 S3-5 균주는 M. grisea (RCB), R. solani (RSB), B. cinerea (TGM), P. infestans (TLB), 및 P. recondite (WLR)에 대해 높은 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 바실러스 벨레첸시스 S3-5 균주와 비교할 때, 본 발명에 따른 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주는 그와 비슷한 항진균 활성을 나타냈다(도 3 참조). 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주가 몇몇 병원균(예를 들어, M. grisea 및 C. gloeosporioides)에 대해서는 감소된 활성을 보였고 다른 병원균(예를 들어, B. cinerea 및 P. infestans)에 대해서는 증가된 활성을 보였음에도 불구하고, 이러한 결과는 바실러스 벨레첸시스 S3-5 균주의 원래 항균 활성이 바실러스 투린기엔시스 Cry1Ac의 도입 및 발현에 의해 영향을 받지 않았음을 나타내는 것이다.
Bacillus veletensis S3-5 strain shows high activity against M. grisea (RCB), R. solani (RSB), B. cinerea (TGM), P. infestans (TLB), and P. recondite (WLR). It is known. Compared with Bacillus veletensis S3-5 strain, the recombinant Bacillus veletensis strain according to the present invention showed similar antifungal activity (see FIG. 3). Recombinant Bacillus veletensis strains showed reduced activity against some pathogens (eg, M. grisea and C. gloeosporioides ) and increased activity against other pathogens (eg, B. cinerea and P. infestans ). Although shown, these results indicate that the original antimicrobial activity of the Bacillus veletensis S3-5 strain was not affected by the introduction and expression of Bacillus thuringiensis Cry1Ac.
실험예 4 : 배추좀나방(Experimental Example 4: Chinese cabbage moth ( Plutella xylostellaPlutella xylostella )에 대한 살충 활성 분석Insecticidal activity for
본 실험예에서는 배추좀나방(diamondback moth; Plutella xylostella)에 대한 본 발명에 따른 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주의 살충 활성을 확인하기 위하여, 배추좀나방 유충에 대한 생물검정을 수행하였다(도 4 참조). In this experimental example, in order to confirm the insecticidal activity of the recombinant Bacillus veletensis strain according to the present invention against the diamondback moth ( Plutella xylostella ), a bioassay was performed on the cabbage moth larvae (see FIG. 4). .
바실러스 벨레첸시스를 3일 동안 배양한 후, 1×107 CFU/cm2 의 연속 희석액으로 배추 잎(2×2 cm2) 디스크를 처리하였다. After incubating Bacillus veletensis for 3 days, the cabbage leaf (2 × 2 cm 2 ) discs were treated with a serial dilution of 1 × 10 7 CFU / cm 2 .
3령 유충(instar larvae) 10마리를 각각의 잎 표면에 도입하고, 2 일 동안 24 시간 간격으로 사멸 유충을 계수하여 사망률을 계산하였다. SoftTOX version 1.1 (Soft LabWare, U.S.A.)을 이용한 Probit 방법으로 LC50 값(median lethal concentration)을 계산하였다. 모든 분석은 25℃, 60-70% 습도에서 16시간/8시간 명암 주기로 3회 수행하였다. 음성 대조군으로, 바실러스 벨레첸시스 세포를 희석하는데 사용한 0.025% 트윈 20을 단독으로 사용하여 배추 잎에 처리하였다.Ten instar larvae were introduced on each leaf surface and mortality was calculated by counting dead larvae at 24 hour intervals for 2 days. LC 50 values (median lethal concentration) were calculated by Probit method using SoftTOX version 1.1 (Soft LabWare, USA). All analyzes were performed three times with a 16 hour / 8 hour contrast cycle at 25 ° C., 60-70% humidity. As a negative control, cabbage leaves were treated with 0.025
처리 한 지 24시간 후, 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주가 살충 활성을 나타내었고(1×107 CFU/cm2 농도에서 58.8% 사망률), 처리 48시간 후까지 증가하였다(1×104 CFU/cm2 농도에서 97.1% 사망률). 예상한 바와 같이, 형질전환되지 않은 바실러스 벨레첸시스 S3-5 균주는 배추좀나방 유충에 대해 어떠한 활성도 나타내지 않았다. 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주의 LC50 값(7.86×103 CFU/cm2)은 동일한 발현 벡터로 형질전환된 다른 재조합 바실러스 투린기엔시스 Cry-B 균주의 값(1.07×103 CFU/cm2) 보다 대략 7배 큰 값을 나타냈다(표 1 참조). 이러한 결과는 재조합 바실러스 벨레첸시스 균주가 살충성 Cry1Ac 단백질을 안정적으로 기능적으로 발현시킨다는 사실을 나타내는 것이다.After 24 hours of treatment, the recombinant Bacillus veletensis strain showed insecticidal activity (58.8% mortality at 1 × 10 7 CFU / cm 2 concentration) and increased up to 48 hours after treatment (1 × 10 4 CFU / cm 97.1% mortality at 2 concentrations). As expected, the untransformed Bacillus veletensis S3-5 strain did not show any activity against cabbage moth larvae. The LC 50 value (7.86 × 10 3 CFU / cm 2 ) of the recombinant Bacillus veletensis strain was the value (1.07 × 10 3 CFU / cm 2 ) of the other recombinant Bacillus thuringiensis Cry-B strain transformed with the same expression vector. The values were approximately seven times larger (see Table 1). These results indicate that recombinant Bacillus veletensis strains stably and functionally express the insecticidal Cry1Ac protein.
a 95% 신뢰한계 a 95% confidence limit
b 1 X 107 CFU/cm2 에서 6.1% 사망률
6.1% mortality at b 1 X 107 CFU / cm 2
Claims (4)
Recombinant Bacillus veletensis strain KCTC 11641BP transformed with cry1Ac gene expression vector pHT1K-1Ac.
Composition for the simultaneous inhibition of phytopathogens and insect pests containing the recombinant Bacillus veletensis strain KCTC 11641BP according to claim 1 as an active ingredient.
The method of claim 2, wherein the phytopathogenic bacteria that can be inhibited through the recombinant Bacillus veletensis strains are rice blast (RCB, M. grisea ), rice sheath blight (RSB, R. solani) ), Tomato gray mold (TGM, B. cinerea ), tomato late blight (TLB, P. infestans ), wheat leaf rust (WLR, P. recondita ), barley powdery mildew ( barley powdery mildew (BPM, Erysiphe graminis ), and red pepper anthracnose (PAN, Collectotrichum gloeosporioides ).
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