KR20110107127A - 변형된 인간 ｉｇｆ－1／ｅ 펩티드에 대한 항체 - Google Patents

변형된 인간 ｉｇｆ－1／ｅ 펩티드에 대한 항체 Download PDF

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Abstract

고특이성 항체는 변형된 인간 IGF-1 단백질 (예로서, hIGF-1/Ea 3mut) 및 내인성 인간 IGF-1 단백질을 구별할 수 있다. 이러한 항체는 hIGF-1 또는 hIGF-2와의 교차 반응성을 거의 갖지 않거나, 전혀 갖지 않는다. 상기 항체는 또한 설치류 IGF-1 또는 IGF-2와의 교차 반응성을 거의 갖지 않거나, 전혀 갖지 않는다. 본 항체는 인간 또는 동물에게 투여된 IGF-1/E 펩티드의 약동학적 성질 (PK) 및 약력학적 성질 (PD)을 평가하는데 사용될 수 있다. 포획 항체로서 본 발명의 항체를 사용하는 샌드위치 ELISA가 시료 중 돌연변이체 IGF-1/E를 정량할 수 있다.

Description

변형된 인간 ＩＧＦ－1／Ｅ 펩티드에 대한 항체{ANTIBODIES TO MODIFIED HUMAN IGF-1/E PEPTIDES}
본 발명은 일반적으로 면역글로불린, 항체 및 그의 단편에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 변형된 인간 인슐린-유사 성장 인자 1 단백질에 면역특이적으로 결합하는 항체의 제조 및 용도에 관한 것이다.
인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-1, 소마토메딘)은 근비대증을 유도하고, 골격근 위축을 차단하는 작은 단일 쇄 단백질이다. IGF-1은 처음에는 IGF-1/E 전구체 (여기서, E는 성숙 IGF-1 단백질의 C-말단에 존재하는 신장 펩티드이다)로서 인체에서 합성된다. 성숙 IGF-1은 처음에는 3개의 공지된 스플라이스 변이체 mRNA들 중 하나에 의해 코딩된다. 각 mRNA의 오픈 리딩 프레임은 특정 IGF-1 mRNA에 따라, 70개의 아미노산으로 이루어진 IGF-1 부분과 C-말단의 특정 신장 (E) 펩티드 (이는 Ea, Eb, 또는 Ec일 수 있다)를 함유하는 전구체 단백질을 코딩한다. C-말단의 E 펩티드는 후에 IGF-1 성숙체로서 절단되어 진다.
변형된 재조합 인간 IGF-1/E 단백질은 작제된 바 있으며, 이는 PCT 특허 출원 공보 WO 2007/146689에 기재되어 있다. 이러한 변형된 IGF-1/E 펩티드의 반감기는 더 길고, 안정성이 증가되어 있으며, 저해성 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP)에 대한 친화도이 감소되어 있고, 야생형 IGF-1에 비해 효능이 증가되어 있다. 일례의 변형된 인간 IGF-1/E 단백질은 hIGF-1/Ea 3mut이다 (도 1 참조). "3mut"라고 명시된 것은 하기: (1) G1, P2, 및 E3 결실; (2) Arg37의 Ala로의 돌연변이 (R37A); 및 (3) R71 및 S72 결실이라는 3개의 변형 세트를 갖는 hIGF-1-E-펩티드 전구체를 의미한다. 이러한 hIGF-1/E 3mut 펩티드가 골격근 위축 치료용의 잠재적인 신규 약물로서 제안된다.
그러나, 야생형 펩티드와 변형된 hIGF-1/E 펩티드는 서로서로 전장의 펩티드 쇄 상의 별개의 위치 3곳에서 단지 1개 또는 2개의 아미노산만이 차이를 보이기 때문에 (도 1) 상기 약물 후보물질에 대한 약동학적 성질 (PK) 및 약력학적 (PD) 성질을 평가하는 것은 어려운 일이다. 상업적으로 이용가능한 항체 중 내인성 hIGF-1을 검출하지 못하면서도 hIGF-1/Ea 3mut 펩티드를 인식하는 항체는 없다.
본 발명의 요약
본 발명은 변형된 인간 IGF-1 단백질 (예로서, hIGF-1/Ea 3mut) 및 내인성 인간 IGF-1 단백질을 구별하는 고특이성 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 hIGF-1 또는 hIGF-2와의 교차 반응성을 거의 갖지 않거나, 전혀 갖지 않는다. 본 발명의 항체는 또한 설치류 IGF-1 또는 IGF-2와의 교차 반응성을 거의 갖지 않거나, 전혀 갖지 않는다. 본 항체는 인간 또는 동물에게 투여된 IGF-1/E 펩티드의 약동학적 성질 (PK) 및 약력학적 성질 (PD)을 평가하는데 유용하다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항체는 펩티드 GPTLCGAELV (서열 1)에는 면역특이적으로 결합하지만, 펩티드 GPETLCGAELV (서열 2)에는 면역특이적으로 결합하지 못한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 펩티드 PAKSAVRAQR (서열 6)에는 면역특이적으로 결합하지만, 펩티드 PTKAARSIRAQR (서열 7)에는 면역특이적으로 결합하지 못한다.
따라서, 본 발명은 항체 QC1, QC2, QQ2, QQ5, 및 QQ6을 제공한다.
본 항체는 모노클로날 항체이거나 폴리클로날 항체일 수 있다. 이는 적합한 포유동물, 예로서, 마우스, 토끼, 염소, 말, 낙타, 또는 상어를 면역화함으로써 생산될 수 있다.
추가로, 본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마, 상기 항체를 코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터, 예를 들면, 발현 벡터 뿐만 아니라, 상기 벡터로 형질전환된 세포도 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본 발명은 또한 하이브리도마 DSM ACC3028, DSM ACC3026, DSM ACC3027, DSM ACC3024 및 DSM ACC3025 (이는 2009년 11월 10일자로, 독일 데-38124 브라운슈바이크 인호펜스트리트 7베에 소재하는 DSMZ에 기탁됨)를 제공하는데, 상기 하이브리도마는 각각 항체 QC1, QC2, QQ2, QQ5 및 QQ6을 발현시키는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 변형된 재조합 인간 IGF-1/E 펩티드의 약동학적 성질 (PK)/약력학적 성질 (PD)의 관계를 평가하는 생분석 측정법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 본 측정법은 방사면역분석법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 예로서, 임상 전 시료 및 임상 시료 중 돌연변이체 IGF-1/E 단백질을 정량하는 분석법인 샌드위치 ELISA (여기서, 본 발명의 항체는 면역흡착제 (포획 항체)로서 사용된다)이다. 이러한 적용에 있어서, 본 항체는 분석적으로 검출가능한 시약, 예로서, 방사성 동위 원소, 형광 분자 또는 효소로 표지화될 수 있다.
추가로, 본 발명의 항체는 예를 들면, 친화도 크로마토그래피에 의해 다량의 IGF-1/E 3mut 펩티드를 정량하는데 사용된다. 따라서, 본 발명의 항체는 근 위축을 치료하는 약제를 상업적 규모로 정제하는데 유용하다.
하나의 실시태양에서, 상기 기술된 방법에 사용되는 항체는 QC1, QC2, QQ2, QQ5 및 QQ6으로 구성된 목록으로부터 선택된다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명의 항체
정의. 본 명세서에서 사용되는 특정 용어에 관한 정의는 하기에서 제공한다. 기타 다른 용어에 관한 용어는 문헌 [Illustrated Dictionary of Immunology , 2nd Edition , Cruse, J.M. and Lewis, R.E., eds. (CRC Press, Boca Raton, Florida, 1995)]에서 살펴볼 수 있다.
대상체(들)에게 제제 또는 약물을 투여하는 것은 자기-투여 및 또다른 개체에 의해 이루어지는 투여를 포함한다. 또한, 기술된 바와 같은 의학적 상태에 대한 각종 치료 방식 또는 예방 방식은 "실질적"이라는 의미를 포함하고자 하며, 이는 전체적인 치료 또는 예방 뿐만 아니라, 그러한 치료 또는 예방까지는 미치지 못하는 치료 또는 예방도 포함하는 것으로 하며, 여기서, 몇몇 생물학적으로나 의학적으로 관련된 결과가 이루어진다는 것을 이해하여야 한다.
"항체"라는 용어는 예로서, 변형된 IGF-1/E 펩티드 상에서는 관찰되지만, 야생형 IGF에서는 관찰되지 않는 에피토프, 예를 들면, 펩티드 A 및 펩티드 C 항원의 에피토프 (이 둘 모두 하기에서 기술한다)와 같은 에피토프에 특이적으로 결합하고 그를 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 그의 단편으로부터 유래된 프레임워크 부위를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 용어 항체를 사용하는 것은 단일 쇄 전 항체를 비롯한 전 항체와 그의 항원 결합 단편을 포함한다는 것을 의미한다. "항체"라는 용어는 단일 쇄 항체를 비롯한 항원 결합 항체 단편을 포함하며, 이는 가변 부위만을 포함할 수 있거나, 하기 폴리펩티드 요소들: 항체 분자의 힌지 부위, CH1, CH2, 및 CH3 도메인 모두 또는 그 일부와 함께 조합된 가변 부위를 포함할 수 있다. 또한, 가변 부위와, 힌지 부위, CH1, CH2, 및 CH3 도메인의 임의의 조합물도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 결합제로서 유용한 항체-관련 분자로는 예를 들면, Fab, Fab', 및 F(ab')2, Fd, 단일 쇄 Fv (scFv), 단일 쇄 항체, 이황화 결합된 Fv (sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예로서 (i) VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 부위에서 이황화 가교에 의해 결합된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 것인 dAb 단편 (문헌 [Ward et al., Nature 341:544-546, 1989]); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 부위 (CDR)를 포함한다. "항체"라는 용어는 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv를 포함한다 (예로서, 문헌 [Hollinger & Hudson, Nature Biotechnology , 23, 9, 1126-1136 (2005)] 참조). 일단 유발되고 나면, 항체는 키메라화되거나 인간화될 수 있다. 예를 들면, 키메라 항체를 생성하기 위해서는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 가변 부위를 인간 불변 부위에 연결시킬 수 있다 (예로서, 미국 특허 번호 제4,816,567호 (캐빌리(Cabilly) 등) 참조). 인간화된 항체를 생성하기 위해서는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 CDR 부위를 인간 프레임워크 내로 삽입시킬 수 있다. 예로서, 미국 특허 번호 제5225539호 (윈터(Winter)), 미국 특허 번호 제5530101호; 제5585089호; 제5693762호; 및 제6180370호 (퀸(Queen) 등)을 참조한다. 이에 대한 대안으로, 항체의 항원 결합부는 예로서, 피브로넥틴 III형 (Fn3)과 같은 폴리펩티드에 기초하여 스패폴드 내로 이식될 수 있다 (미국 특허 번호 제6,703,199호, 상기 문헌에는 피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디가 기재되어 있다). 항원 결합부는, 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께 한쌍의 항원 결합 부위를 형성하는 한쌍의 탠덤 Fv 세그먼트 (VH-CH1-VH-CH1)를 포함하는 단일 쇄 분자로 혼입될 수 있다 (문헌 [Zapata et al., Protein Eng . 8(10):1057-1062(1995)]; 및 미국 특허 번호 제5,641,870호).
"생물학적 시료"라는 용어는 살아있는 세포로부터 유래되거나, 그와 접촉한 시료 물질을 의미한다. "생물학적 시료"라는 용어는 대상체로부터 단리된 조직, 세포, 및 생물학적 유체 뿐만 아니라, 대상체 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함하는 것으로 한다.
"에피토프"라는 용어는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 의미한다. 에피토프는 일반적으로 예로서, 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자로 이루어진, 화학적으로 활성인 표면기로 구성되고, 일반적으로는 특정의 3차원의 구조적 특징 뿐만 아니라, 특정 전하적 특징을 갖는다. 입체형태 에피토프와 비입체형태 에피토프의 경우, 변성 용매의 존재하에서는 입체형태 에피토프에는 결합하지만, 비입체형태 에피토프에는 결합하지 않는 결합 성질이 상실된다는 점에서 상기 두 에피토프는 구별된다.
"면역학적으로 반응성인 조건"이라는 용어는 항원의 특정 에피토프에 대하여 생성된 항체가, 상기 항체가 실질적으로 모든 다른 에피토프에 결합하는 것보다 검출가능하게 더 큰 정도로, 일반적으로는 배경 결합보다 적어도 2배 더 큰 정도로, 바람직하게는, 배경보다 적어도 5배 더 큰 정도로 상기 에피토프에 결합할 수 있도록 하는 조건을 의미한다. 면역학적으로 반응성인 조건은 항체 결합 반응의 포맷에 따라 달라지며, 이는 전형적으로 면역분석법 프로토콜에서 사용되는 조건이다. 면역분석법 포맷 및 조건에 대한 설명에 관해서는 문헌 [Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988)]을 참조한다.
본원에서 사용되는 바, "면역특이적으로"라는 용어는 오직 단 하나의 항원 결정기하고만 반응할 수 있는 개개 항체 결합 부위의 능력을 의미한다. 항체의 결합 부위는 분자의 Fab 부위에 위치하고, 이는 중쇄 및 경쇄의 초가변 부위로부터 구성된다. 항체의 결합 친화도은 단일 항원 결정기와 항체 상의 단일 결합 부위 사이의 반응 강도이다. 이는 항원 결정기와 항체의 결합 부위 사이에 작용하는 인력과 척력의 총합이다. 본원에서 사용되는 바, IgG 항체에 대하여 "고친화도"이라는 용어는 표적 항원에 대하여 KD가 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 또는 10-11 M 이하인 항체를 의미한다. 그러나, "고친화도" 결합은 다른 항체 이소형에 대해서는 달라질 수 있다. 예를 들면, IgM 이소형에 대한 "고친화도" 결합은 KD가 10-7 M 이하, 또는 10-8 M 이하인 항체를 의미한다. "모노클로날 항체"라는 용어는 상기 항체를 생산하는 방법이 아닌, 임의의 진핵 클론, 원핵 클론, 또는 파지 클론을 비롯한 단일의 클론으로부터 유래된 항체를 의미한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대하여 단일의 결합 특이성 및 친화도을 나타낸다. 모노클로날 항체는 예로서, 하이브리도마, 재조합, 및 파지 디스플레이 기술을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 매우 다양한 기법을 사용하여 제조할 수 있다.
"폴리클로날 항체"라는 용어는 적어도 2개의 상이한 항체를 생산하는 세포주로부터 유래된 항체 시료를 의미한다. 본 용어를 사용하는 것은 항원의 다른 에피토프 또는 부위에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 적어도 2개의 항체로 구성된 시료를 포함한다.
"폴리펩티드," "펩티드," 및 "단백질"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합에 의해서 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 중합체, 즉, 펩티드 동배체를 의미한다. 폴리펩티드는 단쇄 폴리펩티드 (보편적으로는 펩티드, 당펩티드 또는 올리고머로 지칭됨), 및 장쇄 폴리펩티드 (일반적으로는 단백질로 지칭됨), 둘 모두를 지칭한다. 폴리펩티드는 20개의 유전자-코딩된 아미노산 이외의 아미노산을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 예로서, 번역 후 프로세싱과 같은 천연 공정에 의해서, 또는 당업계에 잘 알려져 있는 화학적 변형 기법에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함한다. 그러한 변형은 기본 서적 및 더욱 상세하게는 단행본 뿐만 아니라, 다행본 연구 문헌에 잘 기재되어 있다. 특히, 변형된 IGF-1/E 단백질은 PCT 특허 출원 공보 WO 2007/146689에 기재되어 있는 변형된 IGF-1/E 단백질 중 임의의 것 뿐만 아니라, 그의 2차적으로 변형된 단백질 (당화된, PEG화된 단백질 등)일 수 있다.
예로서, 세포, 또는 핵산, 단백질 또는 벡터와 관련하여 사용될 때, "재조합"이라는 용어는 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입에 의해서, 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해서 변형되었다거나, 또는 물질이 상기와 같이 변형된 세포로부터 유래된 것을 가리킨다. 특히, 재조합 IGF-1/E 단백질은 PCT 특허 출원 공보 WO 2007/146689에 기재되어 있는 재조합 IGF-1/E 단백질 중 임의의 것 뿐만 아니라, 그의 2차적으로 변형된 단백질 (당화된, PEG화된 단백질 등)일 수 있다.
"단일 쇄 항체" 또는 "단일 쇄 Fv (scFv)"라는 용어는 Fv 단편의 두 도메인, VL 및 VH로 이루어진 항체 융합 분자를 의미한다. Fv 단편의 두 도메인, VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해서 코딩되지만, 이들은 재조합 방법의 사용으로 VL 및 VH 부위가 쌍을 이루어 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해서 연결됨으로써 단일 쇄 Fv (scFv)로도 알려져 있는 1가 분자를 형성할 수 있다. 예로서, 문헌 ([Bird et al., Science 242: 423-426(1988)]; 및 [Huston et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 85:5879-5883(1988)])을 참조한다. 상기 단일 쇄 항체는 용어 "항체" 단편에 관한 언급에 포함되며, 이는 재조합 기법에 의해, 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다.
"특이 결합"이란 용어는 적어도 10-6 M의 결합 친화도로 본 발명의 항체와 (본원에 기술된 펩티드 (펩티드 A, 펩티드 B, 또는 펩티드 C) 또는 상기 펩티드를 포함하는 단백질 상의) 에피토프 사이에 이루어지는 접촉을 의미한다. 바람직한 결합제는 적어도 약 10-7 M, 및 바람직하게는 10-8 M 내지 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 또는 10-12 M의 친화도로 결합한다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 항체는 표지화될 수 있다. 표지화된 항체는 매우 다양한 표지를 사용하는 매우 다양한 측정법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 항체와 관심의 대상이 되는 에피토프 사이의 항체-항원 복합체 형성을 검출하는 것은 검출가능한 물질을 항체에 부착시킴으로써 촉진될 수 있다. 적합한 검출 수단은 예로서, 방사선핵종, 효소, 보조효소, 형광 물질, 화학발광체, 색소원, 효소 기질 또는 보조인자, 효소 저해제, 보결기 복합체, 자유 라디칼, 입자, 염료 등과 같은 표지를 사용하는 것을 포함한다. 적합한 효소의 예로는 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린스테라제를 포함하고; 적합한 보결기 복합체의 예로는 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인; 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예로는 루미놀이 있고; 생체발광 물질의 예로는 루시퍼라제, 루시페린, 및 에쿼린을 포함하고; 적합한 방사성 물질의 예로는 125I, 131I, 35S, 또는 3H를 포함한다.
본 발명의 예시적인 항체는 하기 표 A 및 B에 개시되어 있다.
<표 A>
Figure pat00001
Figure pat00002
<표 B>
Figure pat00003
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 (i) CDRH1에 대한 서열 12, CDRH2에 대한 서열 13, 및 CDRH3에 대한 서열 14; (ii) CDRH1에 대한 서열 18, CDRH2에 대한 서열 19, 및 CDRH3에 대한 서열 20; (iii) CDRH1에 대한 서열 24, CDRH2에 대한 서열 25, 및 CDRH3에 대한 서열 26; (iv) CDRH1에 대한 서열 30, CDRH2에 대한 서열 31, 및 CDRH3에 대한 서열 32; 또는 (v) CDRH1에 대한 서열 36, CDRH2에 대한 서열 37, 및 CDRH3에 대한 서열 38을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 (i) CDRL1에 대한 서열 15, CDRL2에 대한 서열 16, 및 CDRL3에 대한 서열 17; (ii) CDRL1에 대한 서열 21, CDRL2에 대한 서열 22, 및 CDRL3에 대한 서열 23; (iii) CDRL1에 대한 서열 27, CDRL2에 대한 서열 28, 및 CDRL3에 대한 서열 29; (iv) CDRL1에 대한 서열 33, CDRL2에 대한 서열 34, 및 CDRL3에 대한 서열 35; 또는 (v) CDRL1에 대한 서열 39, CDRL2에 대한 서열 40, 및 CDRL3에 대한 서열 41을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 (i) CDRH1에 대한 서열 12, CDRH2에 대한 서열 13, CDRH3에 대한 서열 14, CDRL1에 대한 서열 15, CDRL2에 대한 서열 16, 및 CDRL3에 대한 서열 17; (ii) CDRH1에 대한 서열 18, CDRH2에 대한 서열 19, CDRH3에 대한 서열 20, CDRL1에 대한 서열 21, CDRL2에 대한 서열 22, 및 CDRL3에 대한 서열 23; (iii) CDRH1에 대한 서열 24, CDRH2에 대한 서열 25, CDRH3에 대한 서열 26, CDRL1에 대한 서열 27, CDRL2에 대한 서열 28, 및 CDRL3에 대한 서열 29; (iv) CDRH1에 대한 서열 30, CDRH2에 대한 서열 31, CDRH3에 대한 서열 32, CDRL1에 대한 서열 33, CDRL2에 대한 서열 34, 및 CDRL3에 대한 서열 35; 또는 (v) CDRH1에 대한 서열 36, CDRH2에 대한 서열 37, CDRH3에 대한 서열 38, CDRL1에 대한 서열 39, CDRL2에 대한 서열 40, 및 CDRL3에 대한 서열 41을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 서열 42, 서열 44, 서열 46, 서열 48, 또는 서열 50을 포함하는 VH 쇄를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 서열 43, 서열 45, 서열 47, 서열 49, 또는 서열 51을 포함하는 VL 쇄를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 (i) 서열 42를 포함하는 VH 쇄 및 서열 43을 포함하는 VL 쇄; (ii) 서열 44를 포함하는 VH 쇄 및 서열 45를 포함하는 VL 쇄; (iii) 서열 46을 포함하는 VH 쇄 및 서열 47을 포함하는 VL 쇄; (iv) 서열 48을 포함하는 VH 쇄 및 서열 49를 포함하는 VL 쇄; 또는 (v) 서열 50을 포함하는 VH 쇄 및 서열 51을 포함하는 VL 쇄를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 서열 52, 54, 56, 58, 또는 60에 의해 코딩된 VH 쇄를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 서열 53, 55, 57, 59, 또는 61에 의해 코딩된 VL 쇄를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 (i) 서열 52에 의해 코딩된 VH 쇄 및 서열 53에 의해 코딩된 VL 쇄; (ii) 서열 54에 의해 코딩된 VH 쇄 및 서열 55에 의해 코딩된 VL 쇄; (iii) 서열 56에 의해 코딩된 VH 쇄 및 서열 57에 의해 코딩된 VL 쇄; (iv) 서열 58에 의해 코딩된 VH 쇄 및 서열 59에 의해 코딩된 VL 쇄; 또는 (v) 서열 60에 의해 코딩된 VH 쇄 및 서열 61에 의해 코딩된 VL 쇄를 포함한다.
폴리펩티드
본 발명은 서열 GPTLCGAELV (서열 1), CPAKSAVRAQR (서열 5) 또는 PAKSAVRAQR (서열 6)을 포함하거나, 그로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 상기 폴리펩티드는 본 발명에 따른 항체를 유발시키는데 유용하다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 거대 폴리펩티드의 일부를 형성할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드는 추가의 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산 측면에 위치할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 비천연적으로 발생된 환경에서 제공되며, 즉, 상기 폴리펩티드는 그의 천연적으로 발생된 환경으로부터 분리된다. 특정 실시태양에서, 본 폴리펩티드는 대조군에 비하여 폴리펩티드가 강화된 조성물 중에 존재한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게 단리된 또는 실질적으로 단리된 형태로 제공되며, 즉, 본 폴리펩티드는 기타 다른 발현된 폴리펩티드가 실질적으로 존재하지 않는 조성물 중에 존재하며, 이에 실질적으로 존재하지 않는다는 것은 폴리펩티드가 조성물의 75중량％ 미만, 바람직하게는 50중량％ 미만, 및 더욱 바람직하게는 10중량％ 미만 (예를 들어, 5중량％)이 기타 다른 발현된 폴리펩티드로 구성된다는 것을 의미한다.
핵산
본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 예시적인 핵산은 서열 1-51에 기술된 폴리펩티드들 중 어느 하나를 코딩하는 핵산을 포함한다. 추가의 예시적인 핵산 서열은 서열 52-61에 개시된 것이다. 핵산은 전 세포 중에, 세포 용해물 중에 존재할 수 있거나, 부분적으로 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태의 핵산일 수 있다. 당업계에 잘 알려져 있는 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩법, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 기타 방법을 비롯한 표준 기법에 의해서 핵산이 기타 다른 세포 성분들 또는 기타 다른 오염 물질, 예를 들면 기타 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제되었을 경우에, 핵산은 "단리된" 것이거나, "실질적으로 순수하게 만들어진" 것이다. 문헌 [F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York]을 참조한다. 본 발명의 핵산은 예를 들면, DNA 또는 RNA일 수 있으며, 인트론 서열을 포함할 수 있거나, 포함하지 않을 수 있다. 하나의 실시태양에서, 핵산은 cDNA 분자이다. 핵산은 벡터, 예로서, 파지 디스플레이 벡터, 또는 재조합 플라스미드 벡터 중에 존재할 수 있다. 본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학적 기법을 사용함으로써 수득할 수 있다. 예로서, 본원에 기술된 항체와 같은 하이브리도마에 의해서 발현된 항체의 경우, 상기 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭법 또는 cDNA 클로닝 기법에 의해서 수득할 수 있다.
트랜스펙토마를 생산하는 모노클로날 항체의 생성
일단 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산을 수득하고 나면, 본 발명의 항체는 또한 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이 (예로서, 문헌 [Morrison, S. (1985) Science 229:1202]), 예를 들면, 재조합 DNA 기법 및 유전자 형질감염 방법의 조합법을 사용함으로써 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산될 수 있다.
예를 들면, 항체, 또는 그의 항체 단편을 발현시키기 위하여 일부의 또는 전장의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학적 기법 (예로서, 관심의 대상이 되는 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용한 cDNA 클로닝)에 의해 수득할 수 있고, 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동적으로 연결되도록 DNA를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 이와 관련하여, "작동적으로 연결"이라는 용어는 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그의 의도된 기능적 역할을 다할 수 있도록 항체 유전자가 벡터로 결찰되는 것을 의미하고자 한다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 화합성인 것이 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터로 삽입될 수 있거나, 또는 더욱 전형적으로는 두 유전자 모두 같은 발현 벡터로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법 (예로서, 항체 유전자 단편 상의 상보적인 제한 부위와 벡터의 결찰, 또는 제한 부위가 존재하지 않을 경우에는 둔단 결찰)에 의해 발현 벡터로 삽입된다. 본원에 기술된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 부위는, VH 세그먼트가 벡터 내의 CH 세그먼트(들)에 작동가능하게 연결되고, VL 세그먼트가 벡터 내의 CL 세그먼트에 작동가능하게 연결될 수 있도록, 이미 원하는 이소형의 중쇄 불변 부위 및 경쇄 불변 부위를 코딩하고 있는 발현 벡터 내로 상기 본원에 기술된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 부위를 삽입함으로써 항체 이소형의 전장의 항체 유전자를 생성하는데 사용될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 항체 쇄 분비를 촉진시키는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 신호 펩티드가 항체 쇄 유전자의 아미노 말단 프레임 내에 연결될 수 있도록 항체 쇄 유전자는 벡터로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드이거나 이종 신호 펩티드 (즉, 비면역글로불린 단백질로부터 유래된 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 쇄 유전자 이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 포함한다. "조절 서열"이라는 용어는 프로모터, 인핸서, 및 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 기타 다른 발현 제어 요소 (예로서, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 한다. 그러한 조절 서열은 예로서, 문헌 [Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990)]에 기재되어 있다. 조절 서열 선택을 포함한, 발현 벡터 디자인은 형질전환시키고자 하는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질 발현 수준 등의 이러한 인자에 따라 달라질 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 조절 서열로는 포유동물 세포에서 고수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예로서, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 심미안 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예로서, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)), 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 별법으로, 비바이러스성 조절 서열, 예로서, 유비퀴틴 프로모터 또는 P-글로빈 프로모터가 사용될 수 있다. 또한 추가로, 상이한 공급원으로부터의 서열로 구성된 조절 요소, 예로서, SRa 프로모터 시스템은 SV40 조기 프로모터로부터의 서열과 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1형의 장쇄 말단 반복부를 포함한다 (문헌 [Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472]).
항체 쇄 유전자 및 조절 서열 이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예로서, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예로서, 복제 기점) 및 선별가능한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선별하는 것을 촉진시킨다 (예로서, 미국 특허 번호 제4,399,216호, 제4,634,655호 및 제5,179,017호 (3개 모두 악셀(Axel) 등)). 예를 들면, 전형적으로 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 예로서, G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 선별가능한 마커 유전자로는 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭에 사용되는 dhfr-숙주 세포에서 사용) 및 neo 유전자 (G418 선별용)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)를 표준 기법에 의해 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 다양한 형태의 "형질감염"이라는 용어는 예로서, 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등과 같이, 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 도입하는데 보편적으로 사용되는 매우 광다양한 기법을 포함하고자 한다. 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 본 발명의 항체를 발현시키는 것은 이론적으로는 가능한 것이다. 진핵 세포, 및 특히, 포유동물 세포가 원핵 세포보다는 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 조립하고 분비할 수 있는 가능성이 더욱 크기 때문에, 진핵 세포, 및 특히, 포유동물 숙주 세포에서의 항체 발현에 대해 논의한다. 항체 유전자의 원핵성 발현은 고수율로 활성 항체를 생산하는데에는 비효과적인 것으로 보고되었다 (문헌 [Boss, M.A. and Wood, C. R., 1985 Immunology Today 6:12-13]).
본 발명의 재조합 항체를 발현시키기 위한 포유동물 숙주 세포로는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (DHFR 선별가능 마커 (예로서, 문헌 [R.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621]에 기재)와 함께 사용되는 dhfr-CHO 세포 (문헌 [Urlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재) 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포, 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포를 사용하는 경우의 또다른 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에서 제시된 바 있는 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입하였을 때, 항체가 숙주 세포에서 발현될 수 있고, 숙주 세포가 성장하는 배양 배지로 항체가 분비될 수 있도록 하는 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체를 생산한다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용함으로써 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
진단 방법/치료 방법
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 항체는 시료 중 변형된 IGF-1/E의 농도를 측정하는 각종 측정법에서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은
(i) 변형된 IGF-1/E를 투여받은 환자로부터 혈액 시료를 수득하는 단계; 및
(ii) 본 발명의 항체를 사용하여, 상기 시료 중 변형된 IGF-1/E를 검출하는 단계를 포함하는, 환자에서 변형된 IGF-1/E 단백질의 수준을 측정하는 방법을 제공한다.
변형된 IGF-1/E의 수준은, 예로서, 공지된 양의 변형된 IGF-1/E를 사용하여 검정 곡선을 설정하고, 시험 시료를 사용하여 얻은 결과를, 검정 마커를 사용하여 얻은 결과와 비교하는 것과 같은 표준 기법을 사용함으로써 정량화될 수 있다 (예로서, 실시예 참조).
환자에서 변형된 IGF-1/E 단백질의 수준을 측정할 수 있게 됨으로써 의사는 또한 치료 효과를 달성하는데 필요한 적절한 투여량도 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한
(i) 변형된 IGF-1/E를 투여받은 환자로부터 혈액 시료를 수득하는 단계;
(ii) 본 발명의 항체를 사용하여, 상기 시료 중 변형된 IGF-1/E를 검출하는 단계; 및
(iii) 환자의 혈액 시료 중 변형된 IGF-1/E의 수준이 예정된 수준보다 낮을 경우, 추가 용량의 상기 변형된 IGF-1/E를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 변형된 IGF-1/E의 최적의 용량 유지를 필요로 하는 환자에서 변형된 IGF-1/E를 최적의 용량으로 유지시키는 방법도 제공한다.
특정 경우에 있어서, 혈액 시료를 미리 환자로부터 수득해 놓을 수 있다는 것에 주의한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체를 사용하여, 환자로부터 수득된 혈액 시료 중 변형된 IGF-1/E를 검출하는 단계를 포함하는, 환자에서 변형된 IGF-1/E 단백질의 수준을 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한
(i) 본 발명의 항체를 사용하여, 변형된 IGF-1/E를 투여받은 환자로부터 유래된 혈액 시료 중 변형된 IGF-1/E를 검출하는 단계; 및
(ii) 환자의 혈액 시료 중 변형된 IGF-1/E의 수준이 예정된 수준보다 낮을 경우, 추가 용량의 상기 변형된 IGF-1/E를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 변형된 IGF-1/E의 최적의 용량 유지를 필요로 하는 환자에서 변형된 IGF-1/E를 최적의 용량으로 유지시키는 방법도 제공한다.
본 발명을 통해서는 또한 변형된 IGF-1/E의 생산을 모니터할 수 있다. 따라서, 올바른 형태의 변형된 IGF-1/E가 생산되었는지를 확인하기 위해 시료를 생산 공장으로부터 수득할 수 있고, 이를 본 발명의 항체로 프로빙할 수 있다.
본 발명은 또한
(i) 본 발명의 항체를 사용하여, 변형된 IGF-1/E를 사전에 투여받은 환자로부터 수득한 혈액 시료 중 변형된 IGF-1/E의 혈청 농도를 측정하는 단계; 및
(ii) hIGF-1/Ea 3mut의 혈청 농도가 예정된 최적 수준보다 낮다면, 추가의 변형된 IGF-1/E를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 근육병을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
상기 기술된 실시태양에서, 변형된 IGF-1/E는 hIGF-1/Ea 3mut이거나, WO 2007/146689에 기재되어 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 변형된 IGF-1/E는 WO 2007/146689의 실시예 1에 기재되어 있는 것 (상기 문헌에서는 서열 8로 지칭되고, 본원에서는 1번 변형된 IGF-1/E로 지칭됨), 또는 WO 2007/146689의 실시예 45에 기재되어 있는 것 (상기 문헌에서는 서열 53으로 지칭되고, 본원에서는 2번 변형된 IGF-1/E로 지칭됨)일 수 있다.
단백질 정제
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 항체는 변형된 IGF-1/E (즉, 근 위축 치료용 약제)를 상업적 규모로 정제하는데 사용될 수 있다 (즉, 근 위축 치료용 약제로 사용될 수 있다). 예를 들면, 본 발명의 항체는 변형된 IGF-1/E를 정제하기 위한 친화도 크로마토그래피에서 사용될 수 있다.
재조합 폴리펩티드의 정제 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 이는 친화도 크로마토그래피 정제 기법 등을 포함한다 (일반적으로, 문헌 [Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982)] 참조). 또한, 문헌 [Bailon et al., An Overview of Affinity Chromatography , Humana Press (2000)]도 참조한다. 생물요법용 단백질의 상업적 규모의 정제를 위한 친화도 크로마토그래피 방법 (예로서, 막에 기반하는 친화도 기법)이 당업계에 알려져 있다. 문헌 [Brandt et al., Bio / Technology 6:779-782 (1988)]을 참조한다.
바람직하게, 상기 방법에 의해 정제된 변형된 IGF-1/E는 hIGF-1/Ea 3mut이거나, WO 2007/146689에 기재되어 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 변형된 IGF-1/E는 WO 2007/146689의 실시예 1에 기재되어 있는 것 (상기 문헌에서는 서열 8로 지칭되고, 본원에서는 1번 변형된 IGF-1/E로 지칭됨), 또는 WO 2007/146689의 실시예 45에 기재되어 있는 것 (상기 문헌에서는 서열 53으로 지칭되고, 본원에서는 2번 변형된 IGF-1/E로 지칭됨)일 수 있다.
등가물
본 발명의 하나 이상의 실시태양에 관한 상세한 설명은 상기의 첨부된 명세서에 기술되어 있다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명을 실시하거나 시험하는데 사용될 수 있기는 하지만, 바람직한 방법 및 물질을 이제 기술한다. 본 발명의 기타 다른 특징, 목적, 및 이점은 명세서 및 특허청구범위로부터 자명해질 것이다. 일반적으로 효소 반응 및 정제 단계는 제조사의 설명서에 따라 실시된다. 기법 및 방법은 일반적으로 당업계 및 각종 일반 참고 문헌 상의 종래 방법에 따라서 실시된다. 일반적으로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 2d Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)] (이는 본 문서 전역에서 제공된다)를 참조한다.
본 발명은, 본 발명의 각개 측면에 대한 단일의 예시적인 일례인 것으로 의도되는, 본 출원에 기술된 특정 실시태양으로 제한하고자 하는 것은 아니다. 당업자에게는 자명한 바와 같이, 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어남 없이 본 발명은 다수로 수정 및 변형될 수 있다. 본원에서 열거한 방법과 기기 이외에도, 본 발명의 범주 내의 기능적으로 등가인 방법과 기기도 상기 설명으로부터 당업자에게는 자명할 것이다. 그러한 수정 및 변형도 첨부된 특허청구범위의 범주 내로 포함시키고자 한다. 본 발명은 첨부된 특허청구범위가 부여하는 등가물의 전체 범주에 따라 상기 특허청구범위에 의해서만 제한되는 것으로 한다.
도 1은 hIGF-1, hIGF-1/Ea wt, hIGF-1/Ea 3mut, 및 hIGF-2의 아미노산 서열 서열이다. hIGF-1/E wt와 hIGF-1/E 3mut 사이의 아미노산 차이는 굵은체로 강조하여 표시되어 있다. 서열 중 점선 표시는 결손 서열을 나타낸다. 하기 기술하는 동물 면역화를 위한 항원으로서 선택된 hIGF-1/Ea 3mut로부터의 펩티드는 밑줄체로 표시되어 있다.
도 2는 펩티드 A 면역화로부터 생성된 hIGF-1/E 3mut-특이 마우스 모노클로날 항체의 활성을 보여주는 차트 세트이다. 세포 배양물 상등액을 하이브리도마 클론 QC1 (A) 및 QC2 (B)로부터 수집하고, hIGF-1, hIGF-1/Ea wt, hIGF-1/Ea 3mut, hIGF-2, mIGF-1, 또는 mIGF-2로 코팅된 마이크로역가 웰로 희석시켰다. 플레이트에 결합된 항체를 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 폴리클로날 염소 항-마우스 IgG 항체에 의해 검출하였다.
도 3은 펩티드 B 면역화로부터 생성된 hIGF-1/E 3mut-반응성 마우스 모노클로날 항체의 활성을 보여주는 차트 세트이다. 모노클로날 항체를 하이브리도마 클론 BP1 (A, mg/ml) 및 BP2 (B, mg/ml)로부터 생산하고 정제하고, hIGF-1, hIGF-1/E wt, hIGF-1/E 3mut, hIGF-2, mIGF-1, 또는 mIGF-2로 코팅된 마이크로역가 웰로 1:10-1:100,000의 비율로 희석시켰다. 플레이트에 결합된 항체를 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 폴리클로날 염소 항-마우스 IgG 항체에 의해 검출하였다.
도 4는 펩티드 C 면역화로부터 생성된 hIGF-1/E 3mut-특이 마우스 모노클로날 항체의 활성을 보여주는 차트 세트이다. 세포 배양물 상등액을 하이브리도마 클론 QQ2 (A), QQ5 (B) 및 QQ6 (C)로부터 수집하고, hIGF-1, hIGF-1/E wt, hIGF-1/E 3mut, hIGF-2, mIGF-1, 또는 mIGF-2로 코팅된 마이크로역가 웰로 희석시켰다. 플레이트에 결합된 항체를 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 폴리클로날 염소 항-마우스 IgG 항체에 의해 검출하였다.
도 5는 펩티드 C 면역화로부터 생성된 모노클로날 항체의 샌드위치 ELISA 분석법을 보여주는 차트 세트이다. 상이한 농도의 hIGF-1/Ea 3mut, hIGF-1/Ec 3mut, 당화된 hIGF-1/Ea 3 mut, 및 hIGF-1 펩티드를, QQ2 (A), QQ5 (B) 및 QQ6 (C)으로 코팅된 마이크로역가 웰에 첨가하였다. 플레이트에 결합된 IGF-1 펩티드를, 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 모노클로날 마우스 항-hIGF-1 항체를 사용하여 검출하였다.
실시예
펩티드 A에 대하여 유발된 항체. 펩티드 A인 GPTLCGAELV (IGF-1/E 3mut의 aa 1-10) (서열 1)를 사용하여 마우스를 면역화시킴으로써 2개의 모노클로날 항체를 생성하였다 (표 1 참조). QC1 및 QC2에 의해 인식되는 에피토프는 야생형 hIGF-1과 mIGF-1 서열인 GPETLCGAELV (서열 2)와 단 하나의 아미노산만이 상이하다. 바이오벤치 및 아비 프로 3.0(Biobench and Abie Pro 3.0)을 사용한 단백질 구조 분석에서 상기 펩티드는 낮은 표면 확률(surface probability)과 낮은 항원 지수를 갖는 것으로 제안되었지만, 동물 면역화를 위해 상기 펩티드를 선택하였다.
Figure pat00004
(1) (양성 클론의 경우) 재조합 hIGF-1/E 3mut; (2) (음성 클론의 경우) 재조합 hIGF-1/E wt 단백질; (3) (음성 클론의 경우) 재조합 hIGF-2; 및 (4) (음성 클론의 경우) 재조합 mIGF-2 단백질을 사용하여 하이브리도마를 스크리닝하였다.
hIGF-1/E 3mut를 사용하여 ELISA에 의해 측정한 결과, 5마리의 마우스로부터 펩티드 A-KLH 접합체로 3회에 걸쳐 면역화시킨 후의 항혈청 역가 범위는 1:500 내지 1:16,000이었다. 최대 반응자인 3번 마우스로부터 약 1,000개의 하이브리도마가 생성되었고, 그중 4개는 hIGF-1/E 3mut와는 강력한 반응성을 나타내지만, hIGF-1/E wt, hIGF-1, hIGF-2, mIGF-1, 및 mIGF-2와는 반응성을 나타내지 않거나, 단지 약한 반응성을 나타내는 것으로 관찰되었다. hIGF-1/E 3mut-반응성 하이브리도마 4개 모두를 계대배양하고, 각각 독립된 하이브리도마로부터 유래된 것인 최종 계대배양물 2개, QC1 (7B9C6) 및 QC2 (8B7A2)를 선택하고, hIGF-1/E 3mut에 특이적인 모노클로날 항체를 생산한다는 것을 ELISA에 의해 확인하였다 (도 2, 표 1).
2개의 mAb, QC1 (7B9C6) 및 QC2 (8B7A2)는 hIGF-1/E 3mut에 대해 고도의 특이성을 나타내며, 임상 전 시료 및 임상 시료 중 변형된 재조합 인간 IGF-1/E 펩티드를 정량하는 샌드위치 ELISA에서 면역흡착제 (포획 항체)로서 사용될 수 있다. 2개의 mAb, QC1 (7B9C6) 및 QC2 (8B7A2)를 발현하는 하이브리도마는 각각 수탁 번호 DSM ACC3028 및 DSM ACC3026하에 DSMZ에 기탁되어 있다.
펩티드 B에 대하여 유발된 항체. 펩티드 B인 CGDRGFYFN-KPTGYGSS (hIGF-1/E 3mut의 aa 17-33) (서열 3)를 사용하여 마우스를 면역화시킴으로써 2개의 모노클로날 항체를 생성하였다 (표 1 참조). 상기 펩티드는 높은 표면 확률과 높은 항원 지수를 갖는다는 이유로 선택하였다. 그러나, hIGF-1과 hIGF-1/E 3mut는 상기 부위에서 동일한 서열을 갖는다. 따라서, 상기 펩티드에 대하여 생성된 항체는 하기 단백질: hIGF-1, hIGF-1/E wt, 및 hIGF-1/E 3mut 모두를 인식한다. 추가로, mIGF-1 및 hIGF-1은 상기 부위에서 단 하나의 아미노산 차이를 보인다.
Figure pat00005
(1) (양성 클론의 경우) 재조합 hIGF-1/E 3mut; (2) (음성 클론의 경우) 재조합 hIGF-2; (3) (음성 클론의 경우) 재조합 mIGF-1; 및 (4) (음성 클론의 경우) 재조합 mIGF-2 단백질을 사용하여 하이브리도마를 스크리닝하였다.
펩티드 B에 대한 마우스의 면역 반응은 강력하였다. 5마리의 마우스로부터 펩티드 B-KLH 접합체로 4회에 걸쳐 면역화시킨 후의 항혈청 역가 범위는 1:1,000 내지 >1:32,000이었다. 최대 반응자인 5번 마우스로부터 약 1,000개의 하이브리도마가 생성되었고, 그중 21개는 hIGF-1, hIGF-1/E wt, 및 hIGF-1/E 3mut와는 강력한 반응성을 나타내지만, hIGF-2, mIGF-1 및 mIGF-와는 약한 반응성을 나타내는 것으로 관찰되었다. 13개의 하이브리도마 모두를 계대배양하였다. 각각 독립된 하이브리도마로부터 유래된 것인 최종 계대배양물 2개, BP1 (2F11D8) 및 BP2 (3C5D10)를 선택하고, hIGF-1, hIGF-1/E wt, 및 hIGF-1/E 3mut와 결합하는 모노클로날 항체를 생산한다는 것을 확인하였다 (도 3, 표 1).
2개의 mAb, BP1 (2F11D8) 및 BP2 (3C5D10)는 hIGF-1과 hIGF-1/E 3mut, 이 둘 모두를 인식하고, hIGF-2 및 mIGF-1 및 mIGF-2와 교차 결합한다. 그럼에도 불구하고, 이러한 mAb는 IGF-1 연구에 유용할 수 있다.
펩티드 C에 대하여 유발된 항체. 펩티드 C인 CPAKSAVRAQR (hIGF-1/E 3mut의 aa 65-74 + 접합에 사용되는 N-말단 C 포함) (서열 5)을 사용하여 마우스를 면역화시킴으로써 3개의 모노클로날 항체를 생성하였다 (표 1 참조). 상기 hIGF-1/E 3mut 펩티드는 높은 표면 확률과 높은 항원 지수를 갖는다는 이유로 선택하였다. 이는 성숙 hIGF-1과 돌연변이체 E 에피토프 사이의 인접 부위에 걸쳐 있다.
Figure pat00006
(1) (양성 클론의 경우) 재조합 hIGF-1/E 3mut; (2) (음성 클론의 경우) 재조합 hIGF-1; (3) (음성 클론의 경우) 재조합 hIGF-1/E wt; (4) (음성 클론의 경우) 재조합 mIGF-1; (5) (음성 클론의 경우) 재조합 mIGF-2 단백질을 사용하여 하이브리도마를 스크리닝하였다.
5마리의 마우스로부터 펩티드 A-KLH 접합체로 4회에 걸쳐 면역화시킨 후의 항혈청 역가 범위는 1:400 내지 1:3,200이었다. 최대 반응자인 4번 마우스로부터 약 1,000개의 하이브리도마가 생성되었고, 그중 188개는 표준 ELISA에서 hIGF-1/E 3mut와는 반응성을 나타내었지만, hIGF-1과는 반응성을 나타내지 않는 것으로 관찰되었다. 188개의 하이브리도마 중 20개를 계대배양하였다. 각각 독립된 하이브리도마로부터 유래된 것인 최종 계대배양물 3개, QQ2 (2C10B7), QQ5 (6H6G11) 및 QQ6 (7B1H12)을 선택하고, hIGF-1/E 3mut는 인식하지만 hIGF-1은 인식하지 못하는 모노클로날 항체를 생산한다는 것을 확인하였다 (도 4, 표 1). 그러한, 이러한 mAb는 hIGF-1/E wt와 교차 결합하였다.
QQ2, QQ5 및 QQ6에 의해 인식되는 에피토프는 PAKSAVRAQR (aa 65-74) (서열 6)이다. 이러한 3개의 mAb, QQ2 (2C10B7), QQ5 (6H6G11) 및 QQ6 (7B1H12)은 hIGF-1/E 3mut를 인식하고, hIGF-1/E wt와 교차 결합하지만, hIGF-1과는 결합하지 않는다. 이러한 mAb는 각각 각종 변형된 재조합 인간 IGF-1/E 펩티드를 정량하는 샌드위치 ELISA에서 면역흡착제 (포획 항체)로서 사용될 수 있다. 3개의 mAb, QQ2 (2C10B7), QQ5 (6H6G11) 및 QQ6 (7B1H12)을 발현하는 하이브리도마는 각각 수탁 번호 DSM ACC3027, DSM ACC3024 및 DSM ACC3025 하에 DSMZ에 기탁되어 있다.
Figure pat00007
본 발명의 항체 제조 방법
일반 항체 제조 방법. 정의된 항원 (예로서, 펩티드 A, 펩티드 B, 또는 펩티드 C)에 대한 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 제조하는 방법들 다수가 당업계에 공지되어 있다. 문헌 [Harlow & Lane, Antibodies , A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988)] 및 상기 문헌에서 인용되는 기타 다른 참고 문헌들을 참조한다.
동물 면역화, 하이브리도마 스크리닝 및 mAb 생산. BALB/c 마우스 5마리로 이루어진 군들을 각각의 KLH에 접합되어 있는 선택된 펩티드로 면역화시켰다. (1) 재조합 hIGF-1/E 3mut; (2) 재조합 hIGF-1/E wt; (3) 재조합 hIGF-1; (4) 재조합 hIGF-2; (5) 재조합 mIGF-1; 및/또는 (6) 재조합 mIGF-2를 사용하여 표준 ELISA에 의해 하이브리도마를 스크리닝하고, 원하는 특이성을 갖는 하이브리도마를 선별하고, 3회에 걸쳐 계대배양하고 재스크리닝하였다. 단백질 A 친화도 칼럼을 사용하여 최종적으로 선별된 하이브리도마의 세포 배양물 상등액으로부터 모노클로날 항체를 정제하였다.
3개의 항원 펩티드 (펩티드 A, 펩티드 B 및 펩티드 C)를 화학적으로 합성하고, 중국 상하이 GL 바이오켐 (상하이) 리미티드(GL Biochem (Shanghai) Ltd.)에서 HPLC 정제하였다. 펩티드 순도는 질량 분광법에 의해 분석한 바, 면역등급 (약 85％)인 것으로 측정되었다. 이러한 펩티드는 C 잔기를 함유하였으며, 피어스(Pierce) (카탈로그 번호 77605)로부터 구입한 키트를 사용하여 상기 펩티드를 말레이미드 활성화 KLH에 접합시켰다.
6-8주령된 BALB/c 마우스를 사용하여 항체를 생성하였다. 면역 반응을 유도하기 위하여 5마리의 마우스로 이루어진 군에 (1차 주사의 경우) CFA 중 50 ㎍의, 3개의 항원 펩티드-KLH 접합체 각각을 피하 주사하고, (2차 및 3차 주사의 경우) IFA 중 25 ㎍의 각 항원을 피하 주사하였다. 어떤 애주번트도 사용하지 않고, 25 ㎍의 항원을 복강내로 주사함으로써 최종적으로 추가 접종하여 면역화시켰다. 면역화 스케줄은 하기와 같았다:
0일째: 면역화 이전 출혈; 1차 항원 주사
26일째: 2차 항원 주사
52일째: 3차 항원 주사
63일째: 시험 출혈; 항혈청 역가 ELISA
69일째: 최종 추가 접종 주사
73일째: 비장절제술
ELISA에 의해 면역화 이후의 항원-특이 항체 발생에 대하여 조사하였다. Nunc-Immuno 미세역가 플레이트를 탄산나트륨-중탄산나트륨 완충액 (피어스, 카탈로그 번호 28382) 중 1 ㎍/ml의 hIGF-1/E 3mut, hIGF-1/E wt, hIGF-1, hIGF-2, mIGF-1, 또는 mIGF-2로 코팅하고, 일련의 희석으로 희석된 면역 전 및 항혈청 및/또는 하이브리도마 상등액 시료와 함께 인큐베이션시키고, 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 폴리클로날 염소 항-마우스 IgG 항체 (시그마(Sigma), 카탈로그 번호 A0168)에 이어, BM 블루 PO-기질 (로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics) 카탈로그 번호 1.484.281)을 사용하여 발색시킴으로써 항원 결합 마우스 IgG를 검출하였다. 2.0 M H2SO4로 퍼옥시다제 반응을 종결시킨 후, 450 nm에서 미세역가 플레이트를 판독하고, 소프트웨어 SoftMax Pro v5.2(몰레큘라 디바이스(Molecular Devices))를 사용하여 ELISA 데이타를 분석하였다. 결과는 도 2-4에 제시되어 있다.
면역화된 마우스로부터 단리된 비장 세포를 표준 방법을 사용하여 비분비성 골수종 Sp2/0-Ag14 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성하였다. ELISA 분석법을 실시함으로써 hIGF-1/E 3mut 펩티드에 특이적인 하이브리도마를 동정하였다.
선별된 하이브리도마를 무혈청 성장 배지 (시그마, 카탈로그 번호 24621C-500)로 적합화시켰다. 표준 방법에 따라 단백질 A 친화도 칼럼에 의해서 하이브리도마 상등액으로부터 모노클로날 항체를 정제하고, 투석을 통해 PBS로 교환하였다. 써던 바이오테크(Southern Biotech) (카탈로그 번호 5300-05)로부터 구입한 마우스 IgG 이소형 분석용 키트를 사용하여 정제된 항체의 이소형을 결정하였다.
항원-특이 하이브리도마는 제한 희석법에 의해서 3회에 걸쳐 계대배양하였다 (그리고, ELISA에 의해 재스크리닝하였다).
펩티드 A, 펩티드 B 및 펩티드 C로 면역화시켜 생성된 항체에 대한 결과는 상기 기술되어 있다.
본 발명의 항체 사용 방법
시료 중 변형된 IGF -1/E를 검출하는 면역분석법. 본 발명은 생물학적 시료 (예로서, 혈액, 혈청, 세포, 조직) 중의 변형된 IGF-1/E 단백질, 또는 변형된 IGF-1/E 단백질을 투여받은 개체로부터 유래된 변형된 IGF-1/E 단백질을 측정하는 진단 분석법을 제공한다. 예로서, 경쟁적 분석법과 같은 진단 분석법은 공통 결합 파트너 상에 있는 제한된 갯수의 결합 부위에 대하여 시험 시료 분석물과 경쟁할 수 있는 표지된 유사체 ("추적자")의 능력에 의존한다. 일반적으로 결합 파트너를 경쟁 전후로 불용성화시킨 후, 결합 파트너에 결합한 추적자와 분석물을 비결합 추적자와 분석물로부터 분리한다. (결합 파트너가 사전에 불용성화된 경우에는) 가만히 따라냄으로써, 또는 (결합 파트너가 경쟁적 반응 이후에 침전한 경우에는) 원심분리함으로써 분리한다. 마커 물질의 양에 의해 측정된 바, 시험 시료 분석물의 양은 결합된 추적자의 양과 반비례한다. 공지된 양의 분석물을 사용하여 용량-반응 곡선을 작성하고, 시험 결과와 비교하여 시험 시료 중에 존재하는 분석물의 양을 정량적으로 측정한다. 효소가 검출가능한 마커로서 사용되는 경우, 이러한 분석법을 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)이라 명명한다. 상기 분석법, 특히 ELISA 시험 형태의 분석법은 임상 환경에서, 그리고 통상의 혈액 스크리닝에 상당히 응용된다. 면역분석법 포맷과 조건에 관한 설명에 대해서는 문헌 [Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988)]을 참조한다.
본 발명의 면역분석법은 진단 분석법, 예후 분석법, 약물 유전체학, 및 임상 시험 모니터가 예후 (예측) 목적으로 사용되는 예측 의학 분야에서 유용하다.
본 항체의 모노클로날 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 분석법. 펩티드 C에 대하여 생성된 3개의 mAb인 QQ2, QQ5, 및 QQ6 각각을 포획 항체로서 사용하였고, 상업적으로 이용가능한 IGF-1 mAb는 검출 시약으로서 사용하였으며, 또한 QQ2, QQ5, 및 QQ6의 특이성을 조사하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 3개의 mAb 모두 hIGF-1/Ea 3mut, hIGF-1/Ec 3mut 및 당화된 hIGF-1/Ea 3mut에는 결합하였지만, hIGF-1 펩티드에는 결합하지 않았다. hIGF-1 농도가 10 nM에까지 달하는 경우에도 QQ2, QQ5, 또는 QQ6 중 어느 것도 hIGF-1에는 결합하지 않았다 (도 5).
ELISA 분석을 위해 일련의 희석으로 희석된 항혈청 및 하이브리도마 상등액 시료로부터 얻은 평균 OD 값을 유사하게 처리된 면역전 혈청 및 세포 성장 배지의 평균 OD 값과 각각 비교하였다. 항혈청 또는 하이브리도마 상등액 시료의 OD 값이 음성 대조군의 OD 값보다 적어도 2배 더 높을 경우, 상기 항혈청 또는 하이브리도마 상등액 시료는 코팅된 항원과 반응성인 것으로 간주하였다.
"단리된" 또는 정제된" 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부에는 본 발명의 항체가 유래된 것인 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질이나 기타 다른 오염 폴리펩티드가 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성된 경우에는 화학적 전구체 또는 기타 다른 화학 물질이 실질적으로 없다. 예를 들면, 단리된 hIGF-1/E에는 본 제제의 진단학적 또는 치료학적 사용을 간섭하는 물질이 없을 것이다. 그러한 간섭 물질로는 효소, 호르몬, 및 기타 다른 단백성 및 비단백성 용질을 포함할 수 있다.
항체 선택성 평가
1번 또는 2번 변형된 IGF-1/E를 동물 내로 투여한 후, 본 발명에 따른 항체를 사용하여 변형된 IGF-1/E를 회수함으로써 wt 인간 IGF와 비교되는 변형된 IGF-1/E에 대한 항체의 선택성을 확인하였다. 동물에게 투여된 원래의 양보다 더 많은 양의 변형된 IGF-1/E가 회수되었다면, 이는 비특이 결합 (즉, wt IGF에의 결합)을 나타내는 것이다.
7마리의 원숭이와 7마리의 개로부터 유래된 혈청 시료를 80 ng/ml의 1번 돌연변이체 IGF, 또는 200 ng/ml의 2번 돌연변이체 IGF로 스파이킹(spiking)하고, 6마리의 래트로부터 유래된 혈청을 30 ng/ml의 1번 돌연변이체 IGF로 스파이킹하였다. 1번 돌연변이체 IGF에 대한 항체 QQ2 또는 2번 돌연변이체 IGF에 대한 항체 QQ5를 사용하여 돌연변이체 IGF의 농도를 분석하였다.
2가지 항체 모두에 대하여 동일한 방식으로 분석법을 수행하였다. 2.5 ㎍/㎕ 농도의 항체 (QQ2 또는 QQ5) 100 ㎕를 사용하여 96 웰 플레이트를 코팅하고, 밤새도록 방치하였다. 이어서, 웰을 300 ㎕의 차단 완충액으로 2회에 걸쳐 세척하고, 300 ㎕의 세척 완충액으로 4회에 걸쳐 세척하였다. 측정용 완충액을 사용하여 혈청 시료를 1:10으로 희석하고, 100 ㎕의 대조군 (농도 10-3000 ng/ml)을 플레이트에 첨가하면서, 각 시료를 100 ㎕씩도 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 실온에서 4시간 동안 진탕시키면서 인큐베이션시켰다.
이어서, 100 ㎕의 비오티닐화된 항-인간 IGF-1을 첨가하고 (농도는 측정용 완충액 중 75 ng/ml), 플레이트를 RT에서 추가로 1시간 동안 진탕시키면서 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 상기 기술된 바와 같이 4회에 걸쳐 세척하였다.
100 ㎕의 스트렙트아비딘-HRP 접합체 (100 ng/ml)를 첨가하고, 플레이트를 RT에서 추가로 30분 동안 진탕시키면서 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 상기 기술된 바와 같이 4회에 걸쳐 세척하였다.
이어서, 100 ㎕의 TMB 기질을 각 웰에 첨가하고, 10분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 100 ㎕의 종결 용액을 첨가하고, 30분 이내에 450 nm에서의 광학 밀도를 판독하였다.
대조군을 사용하여 검정 곡선 (제시하지 않음)을 플로팅하였다.
항체 QQ2에 대한 결과
Figure pat00008
Figure pat00009
Figure pat00010

항체 QQ5에 대한 결과
Figure pat00011
Figure pat00012
특이성/선택성은 시료 중에 기타 다른 유사 성분 및/또는 비관련 성분이 존재하는 조건하에서 분석물을 측정하고 구별할 수 있는 분석 방법의 능력이다. 이는 생물학적 기질에 첨가되고, 그로부터 회수된 분석물의 양을 측정하여 얻은 정확도를 평가함으로써 조사한다. 특이성/선택성에 대한 표적 허용 기준은 평가된 기질 중 적어도 80％에 대하여 허용가능한 회수율이 수득되는 것으로 한다. 본 발명의 경우, 허용가능한 회수율은 75-125％로 정의되었다. 조사된 개개 기질들 모두가 허용 기준에 포함되어 있었기 때문에 본 발명자들은 본 방법을 특이성이며 선택성이 있는 것으로 간주하였다.
DSMZ DSMACC3024 20091110 DSMZ DSMACC3025 20091110 DSMZ DSMACC3026 20091110 DSMZ DSM3027 20091110 DSMZ DSMACC3028 20091110
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> ANTIBODIES TO MODIFIED HUMAN IGF-1/E PEPTIDES <130> PAT052787A <150> <151> <160> 61 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified IGF-1 peptide <400> 1 Gly Pro Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val 1 5 10 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified IGF-1 peptide <400> 3 Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Ser <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Cys Gly Pro Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Ser <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> modified IGF-1 peptide <400> 5 Cys Pro Ala Lys Ser Ala Val Arg Ala Gln Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> modified IGF-1 peptide <400> 6 Pro Ala Lys Ser Ala Val Arg Ala Gln Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Pro Thr Lys Ala Ala Arg Ser Ile Arg Ala Gln Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 1 5 10 15 Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 20 25 30 Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys 35 40 45 Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 50 55 60 Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65 70 <210> 9 <211> 86 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 1 5 10 15 Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 20 25 30 Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys 35 40 45 Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 50 55 60 Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp 65 70 75 80 Met Pro Lys Thr Gln Lys 85 <210> 10 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> hIGF-1/Ea triple mutant <400> 10 Gly Pro Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val 1 5 10 15 Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser 20 25 30 Ser Ser Arg Ala Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu Lys 50 55 60 Pro Ala Lys Ser Ala Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp Met Pro Lys 65 70 75 80 Thr Gln Lys <210> 11 <211> 83 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr 1 5 10 15 Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala 20 25 30 Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala 50 55 60 Lys Ser Ala Arg Asp Val Ser Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn 65 70 75 80 Phe Pro Arg <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Phe Trp Met Gln 1 5 10 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Thr Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Ser Asn Asp Gly Pro Thr Gly Phe Gly Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Ile Gln Ser Tyr Asn Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met Gln 1 5 10 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Ser Asn Asp Gly Ser Leu Gly Tyr Gly Met Asp Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Gln Gln Ser Tyr Asn Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Gly Asp Gly Phe Thr Asp Tyr Val Ile Asp 1 5 10 <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Val Ile Asn Leu Gly Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Ser Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Val Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Trp Ala Tyr Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr 1 5 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Gly Tyr Asp Phe Ser Asp Tyr Val Ile Asp 1 5 10 <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31 Val Ile Asn Leu Gly Ser Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Arg 1 5 10 15 Gly <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 Ser Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Val Trp Phe Gly Tyr 1 5 10 <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35 Gln Gln Phe Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr 1 5 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 36 Gly Tyr Asp Phe Ser Asp Tyr Val Ile Asp 1 5 10 <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Val Ile Asn Leu Gly Ser Gly Val Thr Lys Tyr Asn Glu Ile Phe Thr 1 5 10 15 Gly <210> 38 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 Ser Thr Ile Phe Tyr Asp Tyr Asp Val Trp Phe Gly Ser 1 5 10 <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 39 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Gly Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 40 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 41 Gln Gln Phe Tyr Asp Tyr Pro Arg Thr 1 5 <210> 42 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 42 Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Phe Trp 20 25 30 Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Thr Gln Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Gln Leu Ser Phe Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ser Asn Asp Gly Pro Thr Gly Phe Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 43 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 43 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Ile Gln 85 90 95 Ser Tyr Asn Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 44 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 44 Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp 20 25 30 Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Gln Leu Ser Asn Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Ser Asn Asp Gly Ser Leu Gly Tyr Gly Met Asp Ser Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 45 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 45 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ser Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Asn Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 46 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 46 Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr Ser 1 5 10 15 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Gly Phe Thr Asp Tyr Val 20 25 30 Ile Asp Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Val Ile Asn Leu Gly Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 50 55 60 Asp Lys Ser Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Leu Thr Pro Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Glu Ser Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Val Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Val Ala 115 120 <210> 47 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Asp Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Tyr Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 48 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 48 Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr Ser 1 5 10 15 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Ser Asp Tyr Val 20 25 30 Ile Asp Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Val Ile Asn Leu Gly Ser Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Arg 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Gln Val Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Ser Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Val Trp Phe Gly Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala 115 120 <210> 49 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Asp Ile Val Ile Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 85 90 95 Phe Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Arg Arg <210> 50 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 50 Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr Ser 1 5 10 15 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Ser Asp Tyr Val 20 25 30 Ile Asp Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Val Ile Asn Leu Gly Ser Gly Val Thr Lys Tyr Asn Glu Ile Phe Thr 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Gln Val Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Ser Thr Ile Phe Tyr Asp Tyr Asp Val Trp Phe Gly Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala 115 120 <210> 51 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Ile Val Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Gly 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Phe Tyr Asp Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Arg Arg <210> 52 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 52 gttcagcttc agcagtctgg ggctgagctg gcaagacctg gggcttcagt gaagttgtcc 60 tgcaaggctt ctggctacac gtttactggt ttctggatgc agtgggtaaa acagagacct 120 ggacagggtc tggaatggat tggggctatt tatcctggag atggtgatac taagtacact 180 cagaagttca agggcaaggc cacattgact gcagataaat cctccagcac agcctacatg 240 caactcagct tcttggcatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag atcaaacgat 300 ggccccacgg ggtttggtat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 gcc 363 <210> 53 <211> 342 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 53 gatattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagttgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaaaccacg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcaatg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcatacaatc ttataatctt 300 ccgtggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcaaaa gg 342 <210> 54 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 54 gtccagcttc agcagtctgg ggctgagctg gcaagacctg gggcttcagt gaagttgtcc 60 tgcacggcgt ctggctacac ctttactact tattggatgc agtgggtaaa acagaggcct 120 ggacagggtc tggaatggat tggggctatt tatcctggag atggtgatac tagatacact 180 cagaagttca agggcaaggc cacattgact gcagataaat cctccagcac agcctacatg 240 caactcagca acttggcatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcaag atcaaacgat 300 ggttctctgg ggtatggtat ggactcctgg ggtcaaggaa cctcggtcac cgtctcctca 360 gcc 363 <210> 55 <211> 342 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 55 gatattgtga tgacccagtc tccatcctcc ctggcggtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aatagtagaa cccgaaaaaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaagccagg acagtctcct aaactactga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctgtca gtttattatt gccagcaatc ttataatctt 300 ccgtggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcaaac gg 342 <210> 56 <211> 366 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 56 gtccagctgc agcagtctgg agctgaactg gtaaggcctg ggacttcagt gaaggtgtcc 60 tgcaaggctt ctggagacgg cttcactgat tacgtgatag actggataaa acagaggcct 120 ggacagggcc ttgagtggat tggagtgatt aatcttggaa gtgggactac taaatataat 180 gagaagttca aggacaagtc aacattgact gcagacaaat cctccagcac tgcctacatg 240 cagctcaaca gcctgacacc tgatgactct gcggtctatt tctgtgcaga gtcgaccatc 300 tactatgatt acgacgtctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt ctctgtctct 360 gtagcc 366 <210> 57 <211> 342 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 57 gatattgtga tgacacaaac tccatcctcc ctagatgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgacctgca agtccagtca gagccttttc tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct agactgctga tttactgggc atacactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttataattat 300 cctcggacgt tcggcggagg caccaagctg gaaatcaaac gg 342 <210> 58 <211> 366 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 58 gtgcagctga agcagtctgg acctgagctg gtaaggcctg ggacttcagt gaaggtgtcc 60 tgcaaggctt ctggatacga cttctctgat tacgttatag actgggtaaa acagaggcct 120 ggacagggcc ttgagtggat tggagtgatc aatcttggaa gtgatgtcac taaatacaat 180 gagaatttca ggggcaaggc aacattgact gcagacaaat cctccagtac tgcctacatg 240 caggtcagca gcctgacatc tgatgattct gcggtctatt tttgtgcaag atcgaccatc 300 tactatgatt acgacgtctg gtttggttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360 gcagcc 366 <210> 59 <211> 342 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 59 gacattgtga tcacccagac tccatcctcc ctaactgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgaactgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttatttct gtcagcaatt ttataactat 300 cctcggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcagac gg 342 <210> 60 <211> 366 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 60 gttcagcttc agcagtctgg aactgagttg gtaaggcctg ggacttcagt gaaggtgtcc 60 tgcaaggctt ctggatacga cttctctgat tacgtgatag actgggtcaa acagaggcct 120 ggacagggcc ttgagtggat tggagtgatc aatcttggaa gtggtgttac taaatacaat 180 gagattttca cgggcaaggc aacattgact gcagacaaat cctccagtac tgcctacatg 240 caggtcagca gcctgacatc tgatgactct gcggtctatt tctgtgcaag atcgaccatc 300 ttctatgatt acgacgtctg gtttggttcc tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360 gcagcc 366 <210> 61 <211> 342 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 61 gatattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctaactgtgt cagttggaga gaaggttatt 60 gtgaactgca agtccagtca gagcctttta tatggtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaatt ttatgactat 300 cctcggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcagac gg 342

Claims (19)

  1. 펩티드 GPTLCGAELV (서열 1)에는 면역특이적으로 결합하지만, 펩티드 GPETLCGAELV (서열 2)에는 면역특이적으로 결합하지 않는 항체.
  2. 펩티드 GPTLCGAELV (서열 1)를 포함하는 폴리펩티드에는 면역특이적으로 결합하지만, 펩티드 GPETLCGAELV (서열 2)를 포함하는 폴리펩티드에는 면역특이적으로 결합하지 않는 항체.
  3. 펩티드 PAKSAVRAQR (서열 6)에는 면역특이적으로 결합하지만, 펩티드 PTKAARSIRAQR (서열 7)에는 면역특이적으로 결합하지 않는 항체.
  4. 펩티드 PAKSAVRAQR (서열 6)을 포함하는 폴리펩티드에는 면역특이적으로 결합하지만, 펩티드 PTKAARSIRAQR (서열 7)을 포함하는 폴리펩티드에는 면역특이적으로 결합하지 않는 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, QC1 (하이브리도마 DSM ACC3028에 의해 발현), QC2 (하이브리도마 DSM ACC3026에 의해 발현), QQ2 (하이브리도마 DSM ACC3027에 의해 발현), QQ5 (하이브리도마 DSM ACC3024에 의해 발현) 및 QQ6 (하이브리도마 DSM ACC3025에 의해 발현)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, (i) CDRH1에 대한 서열 12, CDRH2에 대한 서열 13, CDRH3에 대한 서열 14, CDRL1에 대한 서열 15, CDRL2에 대한 서열 16, 및 CDRL3에 대한 서열 17; (ii) CDRH1에 대한 서열 18, CDRH2에 대한 서열 19, CDRH3에 대한 서열 20, CDRL1에 대한 서열 21, CDRL2에 대한 서열 22, 및 CDRL3에 대한 서열 23; (iii) CDRH1에 대한 서열 24, CDRH2에 대한 서열 25, CDRH3에 대한 서열 26, CDRL1에 대한 서열 27, CDRL2에 대한 서열 28, 및 CDRL3에 대한 서열 29; (iv) CDRH1에 대한 서열 30, CDRH2에 대한 서열 31, CDRH3에 대한 서열 32, CDRL1에 대한 서열 33, CDRL2에 대한 서열 34, 및 CDRL3에 대한 서열 35; 또는 (v) CDRH1에 대한 서열 36, CDRH2에 대한 서열 37, CDRH3에 대한 서열 38, CDRL1에 대한 서열 39, CDRL2에 대한 서열 40, 및 CDRL3에 대한 서열 41을 포함하는 항체.
  7. 제6항에 있어서,
    (i) 서열 42를 포함하는 VH 쇄 및 서열 43을 포함하는 VL 쇄;
    (ii) 서열 44를 포함하는 VH 쇄 및 서열 45를 포함하는 VL 쇄;
    (iii) 서열 46을 포함하는 VH 쇄 및 서열 47을 포함하는 VL 쇄;
    (iv) 서열 48을 포함하는 VH 쇄 및 서열 49를 포함하는 VL 쇄; 또는
    (v) 서열 50을 포함하는 VH 쇄 및 서열 51을 포함하는 VL 쇄를 포함하는 항체.
  8. 모두 DSMZ에 기탁되어 있는 DSM ACC3028, DSM ACC3026, DSM ACC3027, DSM ACC3024 및 DSM ACC3025로 이루어진 군으로부터 선택되는 하이브리도마.
  9. 서열 GPTLCGAELV (서열 1), CPAKSAVRAQR (서열 5) 또는 PAKSAVRAQR (서열 6)을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  10. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 제9항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
  11. 제10항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  12. 제11항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 변형된 인슐린-유사 성장 인자 1/E (IGF-1)를 검출하기 위한 개선된 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA).
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체에 의한 정제를 포함하여 개선이 이루어진, 변형된 인슐린-유사 성장 인자 1/E (IGF-1)를 용액으로부터 정제하기 위한 개선된 친화도 크로마토그래피 방법.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체를 사용하여 환자로부터 수득된 혈액 시료 중 변형된 IGF-1/E를 검출하는 단계를 포함하는, 환자에서 변형된 IGF-1/E 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  16. (i) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체를 사용하여, 변형된 IGF-1/E를 투여받은 환자로부터 유래된 혈액 시료 중 변형된 IGF-1/E를 검출하는 단계; 및
    (ii) 환자의 혈액 시료 중 변형된 IGF-1/E의 수준이 예정된 수준보다 낮은 경우, 추가 용량의 상기 변형된 IGF-1/E를 상기 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 변형된 IGF-1/E의 최적의 용량 유지를 필요로 하는 환자에서 변형된 IGF-1/E를 최적의 용량으로 유지시키는 방법.
  17. (i) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체를 사용하여, 변형된 IGF-1/E를 사전에 투여받은 환자로부터 수득한 혈액 시료 중 변형된 IGF-1/E의 혈청 농도를 측정하는 단계; 및
    (ii) hIGF-1/Ea 3mut의 혈청 농도가 예정된 최적 수준보다 낮은 경우, 추가의 변형된 IGF-1/E를 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 근육병을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법.
  18. 제13항 및 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 IGF-1/E가 WO 2007/146689에 기재되어 있는 것인 분석법 또는 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hIGF-1/Ea 3mut가 WO 2007/146689의 실시예 1에 기재되어 있는 것 (상기 문헌에서는 서열 8로 지칭되고, 본원에서는 1번 변형된 IGF-1/E로 지칭됨), 또는 WO 2007/146689의 실시예 45에 기재되어 있는 것 (상기 문헌에서는 서열 53으로 지칭되고, 본원에서는 2번 변형된 IGF-1/E로 지칭됨)으로부터 선택되는 것인 방법.
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