KR20110103009A

KR20110103009A - 세포내 타겟 분자의 탐지를 위한 자성 형광 나노입자 이미징 프로브

Info

Publication number: KR20110103009A
Application number: KR1020100022103A
Authority: KR
Inventors: 김순학
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2010-03-12
Filing date: 2010-03-12
Publication date: 2011-09-20
Also published as: KR101418628B1

Abstract

본 발명은 세포내 타겟 분자 이미징을 위해 사용할 수 있는 자성 형광 나노입자 이미징 프로브, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 타겟 분자 탐지용 조성물 및 이를 이용한 생체 또는 시료의 영상 수득 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 자성 형광 나노입자 이미징 프로브는 세포 내 타겟 분자의 존재에 따라 형광 신호의 온-오프가 조절되는 방식을 취하고 있어, 특이적인 타겟 바이오마커의 동정 또는 세포 내 유전자의 평가, 세포발달 및 질환진단/치료평가를 위해 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 자성 나노입자를 기반으로 한 본 발명에 따른 자성 형광 나노입자 이미징프로브는 인 비트로 및 인 비보에서의 타겟 분자의 탐지에 따른 광학적 이미지뿐만 아니라 자기공명영상을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 자성 형광 나노입자 이미징 프로브를 이용하면, 살아있는 대상체에서의 비침범적이고 반복적인 분석이 가능해진다.

Description

세포내 타겟 분자의 탐지를 위한 자성 형광 나노입자 이미징 프로브{Magnetic fluorescent nanoparticle imaging probes for detecting intracellular target molecules}

본 발명은 세포내 타겟 분자 이미징을 위해 사용할 수 있는 자성 형광 나노입자 이미징 프로브에 관한 것이다.

22 개의 뉴클레오티드로 구성된 비코딩 소 RNA 분자인 MicroRNAs (miRNAs, miRs)는 세포의 증식 및 분화를 포함한 다양한 생물학적 과정에 연관되어 있다. 신경 발달과 관련된 다양한 miRNA가 마이크로어레이 및 노던 블롯 분석을 이용함으로써 동정된 바 있다[L. Smirnova, et al., Eur. J. Neurosci. 2005, 21, 1469.; A. M. Krichevsky, et al., Stem Cells 2006, 24, 85.]. 최근, 본 발명자들은 광학적 유전자 이미징 시스템을 이용하여 신경- 및 암-특이적 miRNA 생성(biogenesis)의 인 비보 이미징을 최초로 보고한 바 있다[H. J. Kim, et al., J. Nucl. Med. 2008, 49, 1686.; H. J. Kim, et al., Mol. Imaging Biol. 2008, 11, 71.; J. Y. Lee, et al., J. Nucl. Med. 2008, 49, 285.; M. H. Ko, et al., FEBS J. 2008, 275, 2605.]. 살아있는 세포 내에서 내재적인 miRNA 발현 패턴을 모니터링하기 위해, 생물발광 리포터 유전자의 30개의 UTR(untranslated region)에 위치한 성숙한 miRNA의 완전하게 상보적인 서열이 개별적인 miRNA를 추적하여 성숙 miRNA의 발현 패턴을 조사하기 위해 널리 사용되어 왔다[H. J. Kim, et al., J. Nucl. Med. 2008, 49, 1686.; X. Cao, et al., Genes Dev. 2007, 21, 531.; A. J. Giraldez, et al., Science 2005, 308, 833.]. 그러나, 그러한 리포터에 기반한 miRNA 탐지는 miRNA가 타겟 mRNA에 결합하고 불안정화시킬 때, 시그널-오프 시스템을 나타낸다. 이 경우, 관찰된 시그널-오프 데이터가 인 비보에서의 miRNA 발현 또는 세포 사멸을 의미하는 것인지 결정하기가 어렵다. 그러므로, miRNA와 같은 세포내 타겟 분자의 탐지를 위한 시그널-온 시스템을 개발할 필요가 있다.

세포막 단백질 또는 수용체를 타겟팅하는 형광 표지된 리간드의 이미징 시그널은 세포의 외부의 경계에서의 리간드와 그들의 타겟과의 결합 친화성에 오로지 의존적이다. 그러나, 세포내 타겟에 대해 사용되는 형광 프로브의 시그널은 그들의 타겟에 대한 상호작용이 있던 없던 간에 세포내의 프로브의 존재 때문에 매우 막연하다. 세포내 타겟을 이미징하는 이러한 문제점을 극복하기 위해, 무형광 염료인 블랙 홀-퀀칭(black hole-quenching (BHQ)) 분자 또는 4-(디메틸아미노아조)벤젠 -4-카복실산(DABCYL)을 포함하는 앱타머를 포함하여, 최근 개발된 이미징 프로브인 단일쇄 또는 이중쇄 DNA를 갖는 분자 비콘(molecular beacon)은 형광 나노입자 다음에 컨쥬게이트되도록 디자인되어 있다. 이는 타겟의 부재시 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET)에 의해 형광물질의 형광을 소거하기 위해 사용되며, 서열-특이적 결합된 타겟의 존재시 퀀처로부터의 분리에 의해 형광신호가 회복된다 [Y. Li, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008, 373, 457.; W. Tan, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2004, 8, 547.; X. Mao, et al., Chem. Commun. 2009, 3065.] 분자 비콘에 기초한 개발된 퀀처-기반의 분자-타겟팅 시스템은 세포내 타겟 단백질의 탐지 및 살아 있는 세포 내 mRNA의 분포에 대한 향상된 이해를 위한 좋은 방법을 제공해 준다[N. Nitin, et al., Nucleic Acids Res.2004, 32, e58.1.; M. M. Mhlanga, et al., Nucleic Acids Res. 2005, 33, 1902.]. Peng 등은 mRNA 수준에서 다양한 암-연관 유전자를 타겟팅함에 의한 분자 비콘 프로브를 이용한 세포내 분자 이미징에 대해 보고하였다[X. H. Peng, et al., Cancer Res. 2005, 65, 1909.].

나노기술에서의 최근 진보는 생물의약 및 나노이미징 분자에서의 치료 및 진단 과정 양자와 관련하여, 폭넓은 적용을 가능하도록 이끌어 주었다[Y. Liu, et al., Int. J. Cancer 2007, 120, 2527.; S. P. Leary, C. Y. Liu, M. L. Yu, C. Apuzzo, Neurosurgery 2006, 58, 1009.; P. Sharma, et al., Adv. Colloid Interface Sci. 2006, 16, 123.]. 광학 및 방사성핵종 프로브를 구비한 많은 멀티모달 분자 이미징 프로브(multimodal molecular imaging probes)가 살아있는 대상체에서의 비침범적인 바이오이미징을 위한 강력한 도구로서 출현되고 있다[W. Cai, X. Chen, Small 2007, 3, 1840.]. 양자점 및 자성 나노입자와 같은 나노크기의 물질들은 암-특이적 펩타이드를 이용하여 인 비보에서 암의 확산 범위를 탐지하기 위한 유용한 이미징 정보를 제공한다[W. Cai, et al., Nano Lett. 2006, 6, 669.; P. C. Wu, et al., Bioconjugate Chem. 2008, 19, 1972.]. 최근, 로다민-코팅된 코발트 페라이트 자성 형광(MF) 입자가 멀티모달 이미지 획득을 위해 사용된 바 있는데; 이 기술은 바이오이미징프로브로서 세포의 인 비트로 추적뿐만 아니라 인 비보 추적을 위해서도 매우 적합하다[T. J. Yoon, et al., Small 2006, 2, 209.], 이 듀얼 MF 이미징 프로브는 중심 코어 내의 코발트 페라이트와 실리카 쉘로 코팅된 형광 염료로 구성되어 있는데, 이는 케이징 효과(caging effect)에 의한 개선된 형광성, 광표백(photobleaching)에 대한 광안정성 및 낮은 독성에 기인한 개선된 생체적합성 특성들을 갖도록 한다[T. J. Yoon, et al., Small 2006, 2, 209.; J. S. Kim, et al., Toxicol. Sci. 2006, 89, 338.].

본 발명은 타겟 분자의 탐지를 위해 유용하게 사용될 수 있는, 새로운 자성 형광 나노입자 이미징 프로브를 제공하고자 한다.

본 발명은 형광물질(fluorophore) 및 생체적합성 물질을 포함하는 코팅층을 갖는 자성 나노입자; 및 상기 코팅층에 결합되어 있고 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 핵산 프로브 및 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하고 형광제어물질(quencher)이 결합되어 있는 올리고머가 혼성화되어 있는 분자 비콘을 포함하는 타겟 분자의 탐지를 위한 자성 형광 나노입자 이미징 프로브를 제공한다.

본 발명에서 있어서, 상기 핵산 프로브에 포함되어 있는 “타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역”타겟 분자의 일부분과 상보적인 서열을 가져 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다. 예를 들어, 상기 “타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역”은 타겟 분자의 일부분과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상 상보적인 서열을 갖는 것일 수 있다. 만일 타겟 분자가 단백질인 경우, 상기 “타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역”은 핵산 프로브로서 작용하는 앱타머에 있어서 타겟 분자인 단백질과 혼성화될 수 있는 영역을 의미한다. 상기 "타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역"은 타겟 분자에 따라 적절히 그 길이를 조절할 수 있으며, 특정 길이로 한정될 필요가 없다. 예를 들어, 타겟 분자가 miRNA인 경우 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역은 22개 내외의 뉴클레오타이드로 구성될 수 있으나, 타겟 분자가 mRNA나 단백질인 경우 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역은 그보다 짧거나 더 길 수 있다.

상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하고 형광제어물질이 결합되어 있는 올리고머에 있어서, 형광제어물질은 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역의 일 말단에 결합되어 있되, 핵산 프로브가 자성 형광 나노입자의 코팅층에 결합되는 일 말단쪽에 형광제어물질이 근접하게 위치할 수 있도록 디자인된다.

한편, 본 발명의 자성 형광 나노입자 이미징 프로브는 상기 핵산 프로브와 타겟 분자와의 혼성화가 상기 핵산 프로브와 형광제어물질이 결합되어 있는 올리고머와의 혼성화에 비해 보다 잘 이루어지도록 설계할 수 있다. 핵산 프로브와 타겟 분자와의 혼성화가 잘 이루어져야만 형광제어물질이 결합되어 있는 올리고머가 떨어져 나가게 될 수 있기 때문이다.

이를 위해, 한 구체예에서는, 타겟 분자가 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역이, 타겟 분자가 형광제어물질이 결합되어 있는 올리고머와 혼성화될 수 있는 영역에 비해 크게 설계하여, 타겟 분자의 존재시 상기 핵산 프로브와 혼성화되어 있던 올리고머가 쉽게 떨어져 나갈 수 있도록 한다. 또한, 타겟 분자가 존재하지 않을 때 핵산 프로브와 혼성화되어 있던 올리고머가 떨어져 나가는 것을 방지하기 위해 핵산 프로브와 올리고머 간의 혼성화는 적어도 40℃에서는 안정하도록 설계할 수 있다.

한 구체예에서, 상기 핵산 프로브의 일 말단에 링커가 추가로 포함되어 있는 자성 형광 나노입자 이미징 프로브가 제공된다. 상기 링커는 핵산 프로브가 자성 형광나노입자의 코팅층에 결합될 수 있는 기능기를 도입하기 용이하도록 하기 위해 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 링커는 4 내지 10개의 짧은 핵산 서열을 갖는 뉴클레오타이드일 수 있다. 이 경우, 상기 올리고머는 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역 외에도 링커와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하도록 변형될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 형광-나노입자-기반의 분자 비콘을 합성하기 위해, 한쪽 말단에 자성 나노입자 코팅층에 결합될 수 있는 기능기를 갖는, 부분적으로 이중 가닥인 올리고뉴클레오티드를 디자인하였다. 도 1을 참고하면, 이 분자 비콘(30)은 자성 형광나노입자의 코팅층에 결합될 수 있는 기능기(도면에 미도시, 링커(42)의 앞부분에 존재함)를 포함하는 링커(42) 및 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역(44)을 포함하는 핵산 프로브(40), 및 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역(54)을 포함하고 형광제어물질(52)이 결합되어 있는 올리고머(50)를 포함한다. 하기 실시예에서는 자성 형광나노입자의 코팅층에 결합될 수 있는 기능기(도면에 미도시, 링커(42)의 앞부분에 존재함)를 용이하게 도입할 수 있도록 링커(42)를 이용하였다. 이러한 분자 비콘은 코팅층 상에 존재하는 기능기와 핵산 프로브 상에 존재하는 기능기가 형성하는 결합을 통해 자성 형광 나노입자에 컨쥬게이트된다. 이렇게 되면, 형광제어물질이 자성 형광 나노입자에 근접하게 위치하게 되므로 자성 형광 나노입자가 나타내는 형광이 퀀칭되게 된다.

즉, 형광제어물질이 결합되어 있는 올리고머가 타겟 분자의 부재시에는 자성 형광 나노입자에 결합되어 있는 핵산 프로브와 혼성화되어 있으므로 형광제어물질에 의해 형광이 나타나지 않게 된다. 반면, 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 타겟 분자(60)가 존재할 경우 상기 분자 비콘(30)의 핵산 프로브(40)는 형광제어물질(52)이 결합되어 있는 올리고머(50) 대신 타겟 분자(60)와 혼성화되므로 자성 형광 나노입자의 형광을 퀀칭하던 형광제어물질(52)이 결합되어 있는 올리고머(50)가 떨어져 나가 다시 형광을 발하게 된다.

요약하면, 본 발명에 따른 자성 형광 나노입자 이미징 프로브는 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 타겟 분자가 존재하지 않을 때에는 시그널-오프 되어 있다가, 타겟 분자가 본 발명의 자성 형광 나노입자 이미징 프로브와 결합하게 되면 시그널-온 되는 분자 탐지 시스템을 제공한다.

따라서 이러한 본 발명의 자성 형광 나노입자 이미징 프로브를 이용하면 탐지하고자 하는 타겟 분자의 존재 여부를 형광 신호의 on-off를 통해 확인하고, 이를 형광 이미지를 나타냄과 동시에 MR 이미지로도 나타낼 수 있게 된다.

비록, 하기 실시예에서는 자성 형광나노입자의 코팅층에 결합될 수 있는 기능기(도면에 미도시, 링커(42)의 앞부분에 존재함)를 용이하게 도입할 수 있도록 링커(42)를 이용하였지만, 본 발명의 분자 비콘의 구성에 있어서 링커(42)가 반드시 필요한 것은 아니다. 링커(42)가 존재하지 않다고 하더라도 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역(44)의 일말단에 코팅층과 결합할 수 있는 기능기를 갖도록 개질하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서, 자성 나노입자(nanoparticles)는 자성을 가지고, 직경이 1nm 내지 1000nm, 바람직하게는 2nm 내지 100nm인 입자라면 제한 없이 사용될 수 있다. 한편, 자성 나노입자에 생체적합성 코팅층이 존재하는 점, 그리고 생체 면역 시스템을 고려하면 상기 자성 형광 나노입자 이미징 프로브의 직경은 10nm 내지 200nm일 수 있다.

한 구체예에서, 자성 나노입자는 금속 물질(metal material), 자성 물질(magnetic material), 또는 자성 합금(magnetic alloy)일 수 있다.

상기 금속 물질은 특별히 제한되지는 않으나 Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

상기 자성 물질 역시 특별히 제한되지는 않으나, Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'₂O₄,및 M_pO_q (M 및 M'은 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, p 및 q는 각각 식 "0 < P = 3" 및 "0 < q = 5" 를 만족한다.)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

또한 상기 자성 합금 역시 특별히 제한되지는 않으나, CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

또한, 본 발명의 자성 형광 나노입자에 포함되는 상기 형광 물질은 생체 이미징에 사용할 수 있는 형광 물질이면 어떠한 것이든 가능하다. 한 구체예에서, 상기 형광물질은 이에 제한되는 것은 아니나, 로다민과 그의 유도체, 플루오레신과 그의 유도체, 쿠마린과 그의 유도체, 아크리딘과 그의 유도체, 피렌과 그의 유도체, 에리트로신과 그의 유도체, 에오신과 그의 유도체, 및 4-아세트아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'디설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 형광 물질을 보다 구체적으로 예시하면 다음과 같다:

로다민 및 그의 유도체 : 6-카복시-X-로다민 (ROX), 6-카복시로다민 (R6G), 리사민 로다민 B 설포닐 클로라이드, 로다민 (Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 설포로다민 B, 설포로다민 101, 설포로다민 101의 설포닐 클로라이드 유도체(Texas Red), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카복시로다민 (TAMRA), 테트라메틸 로다민, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), 리보플라빈, 로졸산, 터븀 킬레이트 유도체, Alexa 유도체, Alexa-350, Alexa-488, Alexa-547, Alexa-647;

플루오레세인 및 그의 유도체 : 5-카복시플루오레세인 (FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인 (DTAF), 2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카복시플루오레세인 (JOE), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, QFITC (XRITC), 플루오레스카민(fluorescamine), IR144, IR1446, 말라카이트 그린 이소티오시아네이트, 4-메틸움벨리페론, 오르토 크레졸 프탈레인, 니트로티로신, 파라로자닐린, 페놀 레드, B-피코에리트린, o-프탈디알데히드;

쿠마린 및 그의 유도체 : 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린 (AMC, 쿠마린 120), 7-아미노-4-트리플루오로메틸쿠마린 (쿠마린 151), 시아노신, 4'-6-디아미니디노-2-페닐인돌 (DAPI), 5',5''-디브로모피로갈롤-설폰프탈레인 (Bromopyrogallol Red), 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아나토페닐)-4-메틸쿠마린 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트, 4-(4'-디이소티오시아나토디하이드로-스틸벤-2,2'-디설폰산, 4,4'-디이소티오시아나토스틸벤-2,2'-디설폰산, 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-설포닐 클로라이드 (DNS, dansyl chloride), 4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL) 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-이소티오시아네이트 (DABITC);

아크리딘 및 그의 유도체 : 아크리딘, 아크리딘 이소티오시아네이트, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산 (EDANS), 4-아미노-N-[3-비닐설포닐)페닐]나프탈이미드-3,5디설포네이트(LuciferYellow VS), N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드, Brilliant Yellow;

피렌 및 그의 유도체 : 피렌, 피렌 부티레이트, 숙신이미딜 1-피렌 부티레이트, Reactive Red 4 (Cibacron^® Brilliant Red 3B-A);

에리트로신 및 그의 유도체 : 에리트로신 B, 에리트로신 이소티오시아네이트, 에티듐;

에오신 및 그의 유도체 : 에오신, 에오신 이소티오시아네이트;

4- 아세트아미도 -4'- 이소티오시아나토스틸벤 -2,2' 디설폰산 .

한편, 형광물질(fluorophore) 및 생체적합성 물질을 포함하는 코팅층에 사용되는 생체적합성 물질은 생체적합성 물질로서 당업계에 공지된 것이면 어떠한 것이든 사용할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 생체적합성 물질은 실리카, 폴리머, 지질 및 덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것일 수 있다. 상기 생체적합성 물질들은 보다 나은 생체적합성을 제공하기 위해 개질될 수 있다. 예를 들어, 실리카에 폴리머를 도입하여 사용하거나, 폴리머에 지질을 결합하여 사용하는 것이 가능하다. 생체적합성 폴리머의 구체적인 예로는, 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스 등의 바이오폴리머나, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산)) (PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트) (PHBV), 폴리다이옥산온 (PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄) (PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)] (PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린 (PAN) 등과 같은 화학적 폴리머를 사용할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 생체적합성 물질은 실리카일 수 있다. 다른 구체예에서, 생체적합성 물질은 폴리에틸렌글리콜과 같은 폴리머일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 생체적합성 코팅층은 예를 들어, 알킬 트라이메틸암모늄 할라이드(alkyl trimethylammonium halide)를 포함하는 양이온 계면활성제; 올레산 (oleic acid), 라우르산(lauric acid), 또는 도데실산(dodecylic acid)과 같은 포화 또는 불포화 지방산, 트리옥틸포스핀 옥사이드(trioctylphosphine oxide: TOPO), 트리옥틸포스핀(trioctylphosphine: TOP), 또는 트리부틸포스핀(tributylphosphine)과 같은 트리알킬포스핀 또는 트리알킬포스핀옥사이드, 올레익아민(oleic amine), 트리옥틸아민(trioctylamine), 또는 옥틸아민(octylamine)과 같은 알킬아민(alkyl amine), 또는 알킬티올(alkyl thiol)을 포함하는 중성 계면활성제; 및 소디움 알킬 설페이트 (sodium alkyl sulfate), 또는 소디움 알킬 포스페이트 (sodium alkyl phosphate)을 포함하는 음이온 계면활성제를 포함할 수 있다.

본 발명의 자성 형광 나노입자 이미징 프로브에 사용될 수 있는 형광제어물질은 당업계에 형광제어물질로서 알려진 것이라면 어떠한 것이든 사용가능하다. 이러한 형광제어물질은 이에 제한되는 것은 아니나, 4-(디메틸아미노)아조벤젠-4-카복실산(DABCYL) 또는 4-(디메틸아미노)아조벤젠 설폰산(DABSYL)를 이용할 수 있다. 또한, Biosearch Technologies, Inc로부터 입수가능한 Black Hole Quencher(BHQ)라는 상표로서 판매되고 있는 BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3 등 또는 Amersham Biosciences로부터 입수가능한 Eclipse를 사용할 수도 있다.

한편, 본 발명의 자성 형광 나노입자 이미징 프로브로 탐지가능한 타겟 분자의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 한 구체예에서, 상기 타겟 분자는 microRNA, mRNA 또는 단백질일 수 있다. 본 발명의 하기 실시예에서는 타겟 분자로서 microRNA를 대상으로 하여 이를 탐지할 수 있는 자성 형광 나노입자 이미징 프로브를 설계하고, 이를 제조하여 microRNA를 탐지한 결과를 보여주고 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 타겟 분자가 단백질일 경우 이를 탐지할 수 있는 핵산 프로브로서 적당한 앱타머를 합성하고 이를 자성 형광 나노입자 이미징 프로브로 도입하여 특정 단백질을 탐지할 수도 있다.

한편 본 발명에 따른 자성 형광 나노입자 이미징 프로브에 다른 진단 프로브를 도입할 경우 다중 진단 프로브로 사용될 수 있다. 예를 들면, 자성 형광 나노입자 이미징 프로브에 T1 자기공명 영상 진단 프로브를 결합시키면 T2 자기공명영상 및 T1자기공명영상 진단을 동시에 진행할 수 있으며, 형광물질 외에도 추가의 광학 진단 프로브를 결합시키면 자기공명 영상과 형광물질에 의한 광학 이미징외에도 다른 방식의 광학 이미징을 동시에 할 수 있으며, CT 진단 프로브를 결합시키면 자기공명영상과 CT 진단을 동시에 할 수 있다. 또한 방사선 동위원소와 결합시키면 자기공명영상과 PET, SPECT 진단을 동시에 할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 T1 자기공명 영상 진단 프로브, 광학 진단 프로브, CT 진단 프로브 및 방사선 동위원소로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브를 추가로 포함하는 자성 형광 나노입자 이미징 프로브를 제공한다. 이들 프로브는 사용되는 프로브의 작용기나 소수성/친수성 특징에 따라 자성 형광 나노입자 이미징 프로브에 결합하거나 코팅층에 봉입하여 사용할 수 있다.

예컨대, 상기 T1 자기공명 영상 진단 프로브로는 Gd 화합물, Mn화합물 등을 포함하고, 광학 진단 프로브로는 양자점을 포함하며, CT 진단 프로브로는 I (요오드) 화합물, 금 나노 입자를 포함하고, 방사선 동위원소로는 In, Tc, F 등을 포함한다.

본 발명의 자성 형광 나노입자 이미징 프로브는 엔도사이토시스 또는 트랜스펙션에 의해 세포내로 도입될 수 있다.

한 구체예에서, 상기 자성 형광 나노입자 이미징 프로브에는 추가로 세포내 전달 리간드가 결합되어 있을 수 있다. 세포내 전달 리간드는 본 발명의 자성 형광 나노입자 이미징 프로브가 세포 막 또는 추가적인 세포내 기관 막을 쉽게 통과할 수 있도록 도와주는 물질을 말한다. 예컨대, 이러한 세포내 전달 리간드로는 단백질 전달 도메인(protein transduction domain), 막투과 도메인(transmembrane domain) 또는 세포 침투 펩타이드(cell penetrating peptide)를 이용할 수 있다. 이들 세포내 전달 리간드 및 이를 이미징 프로브에 도입하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.

또한, 상기 형광 나노입자 이미징 프로브에는 추가로 세포 또는 조직 타겟팅 리간드가 결합되어 있을 수 있다. 세포 또는 조직 타겟팅 리간드는 본 발명의 형광 나노입자 이미징 프로브가 원하는 표적 핵산 분자가 존재하는 조직 또는 세포 내로 도입될 수 있도록 유도해 주는 역할을 할 수 있다. 이러한 세포 또는 조직 타겟팅 리간드로는 항체, 앱타머, 펩타이드 등을 이용할 수 있으며, 세포나 조직의 유형에 따른 특이적 마커나 이에 대해 결합할 수 있는 타겟팅 리간드, 그리고 이러한 타겟팅 리간드를 이미징 프로브에 도입하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명은 또한 자성 나노입자 상에 형광물질(fluorophore) 및 생체적합성 물질을 포함하는 코팅층을 형성하고; 상기 코팅층 상에, 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 핵산 프로브 및 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하고 형광제어물질(quencher)이 결합되어 있는 올리고머가 혼성화되어 있는 분자 비콘을 결합시키는 것을 포함하는 타겟 분자의 탐지를 위한 자성 형광 나노입자 이미징 프로브의 제조 방법을 제공한다.

상기 분자 비콘과 코팅층과의 결합은 자성 나노입자의 코팅층 상에 존재하는 기능기와 분자 비콘의 핵산 프로브 상에 도입된 기능기 간의 공유결합을 통해 이루어질 수 있다.

자성 나노입자의 코팅층에는 핵산 프로브 상에 도입된 기능기와 결합할 수 있는 기능기가 존재한다. 이러한 기능기는 코팅층 상에 본래 존재하거나, 핵산 프로브가 결합될 수 있는 기능기를 갖도록 적절하게 코팅층을 개질할 수 있다. 코팅층 상에 존재하는 기능기의 종류는 핵산 프로브에 도입된 기능기를 어떠한 것으로 선택하느냐에 따라 달라질 수 있다. 즉, 코팅층 상에 존재하는 기능기와 핵산 프로브 상에 도입된 기능기는 서로 결합을 형성할 수 있도록 공지의 기능기 결합예로부터 선택될 수 있다. 이러한 공지의 기능기 결합예 중 대표적인 예를 하기 표 1에 나타내었다.

I	II	III
R-NH₂	R'-COOH	R-NHCO-R'
R-SH	R'-SH	R-SS-R
R-OH	R'-(에폭시기)	R-OCH₂C(OH)CH₂-R'
RH-NH₂	R'-(에폭시기)	R-NHCH₂C(OH)CH₂-R'
R-SH	R'-(에폭시기)	R-SCH₂C(OH)CH₂-R'
R-NH₂	R'-COH	R-N=CH-R'
R-NH₂	R'-NCO	R-NHCONH-R'
R-NH₂	R'-NCS	R-NHCSNH-R'
R-SH	R'-COCH₂	R'-COCH₂S-R
R-SH	R'-O(C=O)X	R-OCH₂(C=O)O-R'
R-(아지리딘기)	R'-SH	R-CH₂CH(NH₂)CH₂S-R'
R-CH=CH₂	R'-SH	R-CH₂CHS-R'
R-OH	R'-NCO	R'-NHCOO-R
R-SH	R'-COCH₂X	R-SCH₂CO-R'
R-NH₂	R'-CON₃	R-NHCO-R'
R-COOH	R'-COOH	R-(C=O)O(C=O)-R' + H₂O
R-SH	R'-X	R-S-R'
R-NH₂	R'CH₂C(NH² ⁺)OCH₃	R-NHC(NH² ⁺)CH₂-R'
R-OP(O² ^-)OH	R'-NH₂	R-OP(O² ^-)-NH-R'
R-CONHNH₂	R'-COH	R-CONHN=CH-R'
R-NH₂	R'-SH	R-NHCO(CH₂)₂SS-R'
I 또는 II: 코팅층 상에 존재하는 기능기 또는 핵산 프로브 상에 도입된 기능기 III: I과 II의 반응에 따른 결합예

한 구체예에서, 상기 코팅층 상에 존재하는 기능기는 -COOH, -CHO, -NH₂, -SH, -CONH₂, -PO₃H, -PO₄H, -SO₃H, -SO₄H, -OH, -술포네이트, -니트레이트, -포스포네이트, -숙신이미딜기, -말레이미드기 및 -알킬리로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

한 구체예에서, 상기 핵산 프로브에 도입된 기능기는 -NH₂, -COOH, -COH, -NCO, -NCS, -COCH₂, -SH, -CON₃ 및 -CH₂C(NH² ⁺)OCH₃로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

한 구체예에서, 상기 코팅층 상에 존재하는 기능기는 -COOH이고, 상기 핵산 프로브에 도입된 기능기는 -NH₂일 수 있다. 즉, 표면에 -COOH를 갖는 코팅층에 5' 말단에 -NH₂를 갖는 핵산 프로브를 결합시킴으로써 핵산 프로브의 한 말단을 자성 형광 나노입자에 연결시킬 수 있게 된다.

상기 코팅층 상에 존재하는 기능기와 핵산 프로브에 도입된 기능기 간의 결합은 공지의 가교제를 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 가교제는 이에 제한되는 것은 아니나, N-에틸-N’디메틸아미노프로필 카보디이미드(N-ethyl-N’dimethylaminopropyl carbodiimide), 1,4-디이소티오시아나토벤젠(1,4-Diisothiocyanatobenzene), 1,4-페닐린 디이소시아네이트(1,4-Phenylene diisocyanate), 1,6-디이소시아나토헥산(1,6-Diisocyanatohexane), 4-(4-말레이미도페닐)뷰트릭산 노말-하이드록시숙신이미드 에스터(4-(4-Maleimidophenyl)butyric acid N-hydroxysuccinimide ester), 포스겐(Phosgene solution), 4-(말레이미도)페닐 이소시아네이트(4-(Maleinimido)phenyl isocyanate), 1,6-헥산디아민(1,6-Hexanediamine), 파라-니트로페닐클로로포르메이트(p-Nitrophenyl chloroformate), 노말-하이드록시숙신이미드(N-Hydroxysuccinimide), 1,3-디사이클로헥실카르보이미드(1,3-Dicyclohexylcarbodiimide), 1,1′-카르보닐디이미다졸(1,1′-Carbonyldiimidazole), 3-말레이미도벤조익산 노말-하이드록시숙신이미드 에스터(3-Maleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester), 에틸렌디아민(Ethylenediamine), 비스(4-니트로페닐)카르보네이트(Bis(4-nitrophenyl) carbonate), 숙시닐 클로라이드(Succinyl chloride), N-(3-디메틸아미노프로필)-N′-에틸카르보이미드 하이드로클로라이드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride), N,N′-디숙신이미딜 카르보네이트(N,N′-Disuccinimidyl carbonate), N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), 및 숙시닉 언하이드라이드(sucinic anhydride) 로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 이러한 결합 반응은 당업계에 공지된 적절한 용매 중에서 수행될 수도 있다.

또한, 본 발명은 상기 자성 형광 나노입자 이미징 프로브를 포함하는 타겟 분자 탐지용 조성물을 제공한다. 앞서 설명한 바와 같이 본 발명의 자성 형광 나노입자 이미징 프로브는 인 비보 또는 인 비트로에서 세포 내 타겟 분자 탐지하고 이를 이미징하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 타겟 분자 탐지용 조성물은 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함할 수 있다. 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물은 또한 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명에 따른 타겟 분자 탐지용 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.

본 발명의 타겟 분자 탐지용 조성물의 다른 바람직한 양태는 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 타겟 분자 탐지용 조성물을 생체 또는 시료에 투여하고;

상기 생체 또는 시료로부터 자성 형광 나노입자 이미징 프로브에 의해 발산되는 신호를 감지하여 영상을 수득하는 것을 포함하는 생체 또는 시료의 영상 수득 방법을 제공한다.

상기에서 사용된 용어 “시료”는 진단하고자 하는 대상으로부터 분리한 조직 또는 세포를 의미한다. 또한 상기 타겟 분자 탐지용 조성물을 생체 또는 시료에 주입하는 단계는 의약 분야에서 통상적으로 이용되는 경로를 통해 투여될 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하고 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 국부 경로를 통하여 투여할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 자성 자성 형광 나노입자 이미징 프로브에 의해 발산되는 신호를 감지하기 위해서 자기공명영상 장치(MRI)와 광학 이미징의 이용이 바람직하다.

자기공명영상 장치는 강력한 자기장 속에 생체를 넣고 특정 주파수의 전파를 조사하여 생체조직에 있는 수소 등의 원자핵에 에너지를 흡수시켜 에너지가 높은 상태로 만든 후, 상기 전파를 중단하여 상기 수소 등의 원자핵 에너지가 방출되게 하고 이 에너지를 신호로 변환하여 컴퓨터로 처리하여 영상화한 장치이다. 상기 자기 공명 영상 장치는 T2 스핀-스핀 이완 자기 공명영상 장치일 수 있다. 한편, 광학 이미징을 위해서는 공초점현미경, 형광현미경, 생체용광학장비 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 자성 형광 나노입자 이미징 프로브는 세포 내 타겟 분자의 존재에 따라 형광 신호의 온-오프가 조절되는 방식을 취하고 있어, 특이적인 타겟 바이오마커의 동정 또는 세포 내 유전자의 평가, 세포발달 및 질환진단/치료평가를 위해 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 자성 나노입자를 기반으로 한 본 발명에 따른 자성 형광 나노입자 이미징프로브는 인 비트로 및 인 비보에서의 타겟 분자의 탐지에 따른 광학적 이미지뿐만 아니라 자기공명영상을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 자성 형광 나노입자 이미징 프로브를 이용하면, 살아있는 대상체에서의 비침범적이고 반복적인 분석이 가능해진다.

도 1은 핵산 프로브 및 상기 형광제어물질이 결합되어 있는 올리고머가 혼성화되어 있는 본 발명의 분자 비콘을 모식화한 도면이다.
도 2는 핵산 프로브와 타겟 분자가 혼성화되어 있는 상태를 모식화한 도면이다.
도 3은 상기 도 1의 분자 비콘이 컨쥬게이션되어 있는 자성 형광 나노입자 이미징 프로브의 핵산 프로브가 타겟 분자의 존재시 상기 형광제어물질이 결합되어 있는 올리고머와 분리되고 타겟 분자와 혼성화되는 과정을 모식화한 도면이다.
도 4a는 MF 입자(좌) 및 miR124a 비콘이 도입된 MF 입자(우)의 사진이고, 도 4b는 MF 입자(레인 1) 및 miR124a 비콘이 도입된 MF 입자(레인 2)의 전기영동 결과를 보여주며, 도 4c는 miR124a 비콘의 농도에 의존적으로 MF 입자의 형광 신호가 퀀칭됨을 보여주는 그래프이며, 도 4d는 miR124a 비콘이 도입된 MF 입자가 miR124a의 농도에 의존적으로 형광 강도가 증가함을 보여주는 그래프이다.
도 5는 P19 세포의 신경 분화 여부에 따른 면역형광 염색 결과를 보여주는 사진이다.
도 6a는 내생적인 성숙 miR124a 발현이 P19 세포의 신경 분화의 유도 후 점진적으로 증가함을 보여주는 qRT-PCR 결과이고, 도 6b는 MF-miR124a 비콘의 P19 세포로의 도입에 따른 내생적인 miR124a 발현 변화를 형광 강도 변화를 통해 관찰한 결과를 나타낸 그래프이며, 도 6c는 P19세포의 신경 분화 동안의 MF-miR124a 비콘이 나타내는 형광 변화를 보여주는 공초점 레이져 스캐닝 현미경 관찰 사진이다.
도 7은 다양한 농도의 MF-miR124a 비콘을 P19세포 이입한 후 농도에 비례하여 T2 Weighted MR 시그널이 감소하는 결과를 보여준다.
도8은 생체에서 MF-miR124a 비콘을 이용하여 P19세포 분화에 따른 miR-124a 생체광학영상화 결과를 보여준다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[ 실시예 ]

하기 실시예를 통해 나타낸 모든 데이터는 평균±표준오차로서 표현하였으며, Student's t-test를 이용하여 계산하였다. 하기 도면에 표기된 * 및 **는 각각 P<0.05 및 P<0.005의 통계적 유의도로 평가하였음을 나타낸다.

실시예 1: 자성 형광( MF ) 나노입자과 컨쥬게이트된 miR124a -반응성 분자 비콘의 제조

(1) miR124a -반응성 분자 비콘의 제조

타겟 분자로서 miR124a를 탐지할 수 있는 특이적인 MF-miR124a 비콘을 아민-카복실 반응에 의해 제작하였다.

먼저, miR124a와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 핵산 프로브를 제작하였다. 이를 위해, 성숙 miR124a의 상보적인 뉴클레오티드의 5’말단에 수개의 랜덤 링커 시퀀스(TTC GCT GT)와 연결시키고, 다시 5’말단에 아미노기를 결합시켰다.

상기 핵산 프로브와 혼성화되며, 형광제어물질로서 Black Hole Quencher 1(BHQ1; Bionics, Inc, Korea)이 결합되어 있는 올리고머를 제작하였다. 전체 miR124a 비콘은 다음과 같다.

5’NH₂-TTC GCT GTt ggc att cac cgc gtg cct taa-3

3’BHQ1-GCG ACA ACC GT-5

(2) 형광물질( fluorophore )을 포함하는 생체적합성 코팅층을 갖는 자성 형광( MF ) 나노입자(MNP@SiO2( RITC )- PEG / COOH )의 제조

나노입자를 Biterials (Korea)로부터 구매하여 T. J. Yoon, et al., Small 2006, 2, 209.에서 기술한 바와 같이 MNP@SiO2(RITC)-PEG/COOH를 제조하였다. 요약하면, 코발트 페라이트 자성 코어를 폴리비닐피롤리돈(PVP;Sigma, St. Louis, MO, USA)과 함께 인큐베이션한 후, PVP-안정화된 입자를 4000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 수득하였다. RITC(로다민 B 이소티오시아네이트, 여기/방출=555/578nm)로 개질된 트리메톡시실란을 PVP-안정화된 코발트 페라이트 입자로 주입하였다. 암모니아 용매를 첨가함으로써 중합을 유도하여 RITC (나노입자 당 4×10³)가 도입된 실리카-코팅된 자성 나노입자를 생성하였다(크기: 대략 50 nm, 유체역학적 직경(hydrodynamic diameter): 58.1 nm). 카복실 모이어티(나노입자 당 4.4×10⁴) 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)(나노입자 당 1×10⁴, 500 g mol^-1)를 MNP@SiO2(RITC)의 표면에 도입하여 MNP@SiO2(RITC)-PEG/COOH를 형성하였다.

(3) 자성 형광( MF ) 나노입자와 miR124a -반응성 분자 비콘의 컨쥬게이션

카복실 MF 나노입자와 miR124a 비콘(농도: 20 mM) 과의 공유결합적인 컨쥬게이션은 이들에 N-에틸-N’-디메틸아미노프로필카보디이미디(EDC)를 가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 아민과 카복실 그룹 간의 커플링 효율을 향상시킴으로써 수행되었다 [M.K. So, et al., Nat . Protoc . 2006, 1, 1160]. MF 입자: miR124a beacon: EDC의 반응 비율은 1:3:200였다. 상기 반응물을 15000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여, 컨쥬게이션되지 않은 유리 miR124a 비콘과 EDC를 제거한 후, 트리스 버퍼 용액 (10mM Tris-HCl, pH 7.4)으로 수회 세척하였다. 짧게 초음파 분해(sonication)를 수행한 후, 최종적인 컨쥬게이션된 산물을 보레이트 버퍼 용액(10mM sodium borate, pH 7.4; Sigma, St. Louis, MO, USA) 을 이용하여 혼합하였다. 구 모양의 MF 입자는 수용액에 균질하게 분산되었으며, TEM을 이용하여 측정한 유체역학적 직경(hydrodynamic diameter)은 약 58.1 nm였다. 도 4a는 MF 입자(좌) 및 miR124a 비콘이 도입된 MF 입자(우)의 TEM 사진을 보여준다. miR124a 비콘에서 miR124a 비콘 올리고는 2% 우라닐 아세테이트로 염색되어 검은색 화살표로 표시된 부분와 같이 어두운 프레임으로 나타난다.

한편, MF 입자 및 miR124a 간의 컨쥬게이션 패턴을 검증하기 위해, MF 입자 및 miR124a 비콘이 도입된 MF 입자를 각각 0.5% 아가로즈 겔에 로딩하고 겔 전기영동을 수행하였다. 그 결과, 도 4b에 볼 수 있는 바와 같이, MF 입자(레인 1) 및 miR124a 비콘이 도입된 MF 입자(레인 2)의 크기가 차이 나는 것을 확인할 수 있다.

miR124a 비콘이 퀀칭을 시키는 최적의 농도를 조사하기 위해, MF 입자의 농도는 고정시키고(100pmol), miR124a 비콘의 농도는 증가시키면서 실온에서 1시간 도안 인큐베이션하면서 퀀칭 효율을 시험하였다. 그 결과, 도 4c에서 볼 수 있는 바와 같이, miR124a 비콘의 농도에 의존적으로 MF 입자의 형광 신호가 퀀칭되었다.

PicTar 데이터베이스(http://pictar.bio.nyu.edu)로부터 정보를 얻은 22개의 뉴클레오타이드로 구성된 성숙 miR124a를 합성하여, MF-miR124a 비콘의 miR124a 결합 영역에 혼성화될 수 있는지, 그리고 MF-miR124a 비콘에서의 형광 신호가 성숙 miR124a의 존재시 밝아질 수 있는지를 시험하였다. 각기 다른 농도의 성숙 miR124a(100, 300, 500pmol)로 마이크로튜브 내의 MF-miR124a 비콘의 형광 강도를 시험한 결과, 도 4d에서 볼 수 있는 바와 같이, miR124a의 농도에 의존적으로 형광 강도가 증가하였다. 그러나, 돌연변이 또는 아무 가치없는 화합물로 처리한 경우에는 형광신호는 계속적으로 퀀칭된 상태를 유지하였다. 이들 결과는 miR124a에 대한 MF-miR124a 비콘의 특이성을 제시해주었다.

실시예 2: 신경발생 동안의 miR124a 발현에 따른 MF - miR124a 비콘의 형광 활성 향상 확인

(1) P19 세포의 배양

MF-miR124a 비콘을 이용하여 신경발생 동안의 뉴런-특이적 miR124a 발현에 의한 신경세포의 분화를 관찰하기 위해, P19 세포를 선택하였다. 실험에 사용된 마우스 배아 기형암종(teratocarcinoma) 세포주인 P19 세포는 5% CO2-습윤 챔버 내의 7.5% 송아지 혈청(bovine calf serum) (Gibco) 및 2.5% FBS (Cellgro, Herndon, VA, USA), 페니실린(10 UmL_1; Invitrogen, Grand Island, NY, USA), 및 스트렙토마이신(10 mgmL_1; Invitrogen)이 보충된 a-MEM(a-modified minimum essential medium)(Gibco, Grand Island, NY, USA) 중에서 키웠다.

(2) P19 세포의 신경세포 분화 유도 및 면역형광 염색에 의한 분화 확인

P19 세포의 신경세포 분화 유도를 위해 단층 배양 방법[J. Pachernik, et al., Physiol . Res. 2005, 54, 115]을 이용하였다. 젤라틴-코팅된 플레이트 상에서 P19 세포를 1% 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄(ITS; Gibco), 페니실린(10 UmL^-1), 및 스트렙토마이신 (10 mgmL^-1)을 함유하는 DMEM/F12 (Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지 중에서 배양하고, 5×10^-7 M의 all-trans-RA (Sigma, St. Louis, MO, USA)로 처리하였다. P19 분화 배지는 새로운 RA-함유 배지로 매 2일마다 교체하였다. 상기 단층 분화 방법을 이용하여 신경 분화를 유도한 지 6일 후, 신경돌기가 자라난 패턴을 관찰할 수 있었다.

P19 세포의 신경 분화는 면역형광 염색에 의해 확인되는 MAP2(microtubule-associated protein-2)와 같은 특이적인 신경세포 마커를 이용하여 검증하였다. 미분화된 P19 세포는 또한 줄기세포 마커인 oct4 항체를 이용하여 확인하였다. 면역형광 염색을 위해, 먼저 P19 세포를 4% 포름알데히드로 20분 동안 또는 밤새 고정했다. 그런 다음 그들을 각각 PBS로 10분 동안 3회 세척하고, 인큐베이션하는 동안 약하게 쉐이킹했다. 블로킹 및 투과화 과정은 20% 정상 염소 혈청 반응 혼합물(normal goat serum reaction mixture) 및 0.2% Triton X-100를 세포에 60분 동안 가하는 것으로 동시에 수행하였다. Oct-4 또는 MAP2 단백질이 1:1000로 희석된 항-Oct-4 항체(Chemicon, Millipore, Watford, UK) 또는 항-MAP2 항체(Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany)에 의해 탐지되었으며, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 각 10분 동안 3차례 세척한 후, Alexa Fluor 2차 항체 컨쥬게이트를 가하고, 상기 혼합물을 90분 동안 인큐베이션하였다. P19 세포를 커버슬립으로 옮기고, DAPI(Vector Laboratories, Inc., CA, USA)를 함유하는 수성 마운팅 용액으로 마운팅하였다. 그 결과, 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, P19세포에 retinoic acid (RA)를 처리한 후 6일째 stem cell biomaker이 Oct4 유전자의 발현은 현격히 줄고, 반면 신경세포 분화 마커인 MAP2 유전자 발현은 증가됨을 통해 P19세포가 RA에 의해 신경세포로 분화가 유도됨을 확인할 수 있었다.

(3) 성숙 miR124a 를 탐지하기 위한 qRT - PCR 분석

P19세포의 신경세포 분화 동안의 성숙 miR124a 발현 패턴을 평가하기 위해, RA로 처리한 P19 세포의 신경세포로의 분화 전과 후의 small RNA 추출물을 이용하여 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 분석을 수행하였다.

먼저, 뉴클라아제가 없는 물로 추출한 전체 small RNA를 mirVana miRNA 분리 키트 (Ambion, Austin, TX, USA)를 이용하여 매 분화 시점에서 P19 세포로부터 분리하였다. 신경세포 분화 동안 성숙 miR124a의 카피수를 조사하기 위해, mirVana qRT-PCR 프라이머 세트(Ambion)와 mirVana qRT-PCR miRNA 탐지 키트(Ambion)를 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 성숙 miR124a 수준은 SYBR Premix Ex Taq (2×) (Takara, Japan)으로 iCycer (Bio-Rad)를 이용하여 PCR 증폭에 의해 검증하였다(95℃에서 3분, 95℃에서 15초, 60℃에서 30초, 40회의 증폭 사이클). U6 snRNA 프라이머 세트(Ambion, Austin, TX, USA)는 내재적 대조군으로서 사용되었다.

그 결과, 도 6a에서 볼 수 있는 바와 같이, 내생적인 성숙 miR124a 발현은 P19 세포의 신경 분화의 유도 후 점진적으로 증가함을 확인할 수 있었다.

(4) MF - miR124a 비콘의 P19 세포로의 도입에 따른 내생적인 miR124a 발현 변화 조사

MF-miR124a 비콘을 미분화 및 분화된 P19 세포 내로 도입시켜, 신경세포의 분화 동안의 내생적인 miR124a 발현에 대해 조사하였다.

P19 세포를 젤라틴이 선코팅되어 있는 6-웰 플레이트에 분주하고, 멸균 커버 슬립으로 덮었다. 세포를 인산-완충 식염수(PBS)로 2회 세척하였다. MF-miR124a 비콘을 미분화 및 분화된 P19 세포에 트랜스펙션시키고, 37.8℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. MF 입자의 크기는 엔도사이토시스에 의한 수동적 세포내 도입에 적합한 것으로 확인된 바 있다[J.S. KIM, et al., J. vet . Sci . 2006, 7, 321]. 비교를 위해, miR124a 비콘이 도입되지 않은 MF 입자 또한 각각의 세포 그룹으로 또한 도입되었다. 인 비트로 형광 분석을 위해, MF-miR124a 비콘으로 트랜스팩션된 세포를 PBS로 헹군 후 트립신 처리에 의해 수확하였다. 수집된 세포를 어두운 96-웰 마이크로플레이트로 옮긴 후, 그들의 형광 강도를 Varioskan Flash 마이크로플래이트 리더기(Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland)로 측정하였다.

그 결과, 도 6b에서 볼 수 있는 바와 같이, 신경세포 분화 동안 점진적으로 발현이 증가된 성숙 miR124a가 MF-miR124a 비콘의 miR124a 결합 영역에 붙어, 비콘의 백본으로부터 퀀처 올리고를 분리시키고, 이와 동시에 형광을 점진적으로 증가시킴을 확인할 수 있었다. 신경세포 분화 3일 및 6일 후, 미분화된 P19세포와 비교하여 형광 활성이 각각 약 42.3% 및 84.1% 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 항-miR124a(miR124a 저해제, 100pmol)를 신경세포 분화 6일 후의 P19 세포에 전처리한 결과, MF-miR124a 비콘의 퀀칭 상태가 유지되는 것을 관찰할 수 있었다.

(5) 내재화된 MF 입자의 공초점 현미경 관찰

신경생성 동안의 miR124a의 세포내 발현의 인 비트로 형광 이미지를 얻기 위해, MF-miR124a 비콘의 공초점 현미경 촬영을 P19 세포의 신경세포로의 유도 동안 수행하였다. 먼저, P19 세포를 3.7% 포름알데히드 용액(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 고정시킨 후, PBS로 10분 동안 3회 헹구었다. 4’,6-디아미디노-2-페닐인돌디하이드로클로라이드 (DAPI) 용액을 함유하는 마운팅 배지(Vector Laboratories, Inc., CA, USA)를 가한 후 6-웰 플레이트로부터 커버 슬립을 글래스 슬라이드 위로 옮기고, 이를 공초점 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 도 6b에서 본 정량적인 형광 결과와 유사하게, 도 6c에 나타낸 공초점 레이저 스캐닝 현미경 결과는 P19세포의 신경 분화 동안의 MF-miR124a 비콘의 놀라운 형광 변화를 보여주었다. 미분화된 P19세포에서는, 성숙 miR124a가 거의 발현되지 않기 때문에 세포 내에서 MF-miR124a의 형광 신호가 거의 탐지되지 않았다. 대조적으로, 신경세포로의 분화 유도 3일 및 6일 후에는, 성숙 miR124a의 높은 발현에 기인하여 유의하게 강한 형광 밝기가 P19 세포에서 명확하게 관찰되었다. 또한, 신경세포 분화 6일 후 관찰된 MF-miR124a의 형광신호는 항-miR124a의 처리 후 본래의 퀀칭된 상태로 되돌아갔다. 이러한 결과는 형광 나노입자에 컨쥬게이트된 miR124a 비콘이 매우 높은 특이성으로 세포내 miRNA의 이미지를 성공적으로 제공해 줄 수 있음을 증명한다.

실시예 3: MF - miR124a 비콘을 이용한 신경 분화의 인 비보 모니터링

(1) MF -124a 비콘의 세포내 자성성질 조사

MF-miR124a 비콘을 함유하는 세포의 인 비보 추적을 모니터하기 위해, 세포 내 miR124a 비콘이 컨쥬게이트된 MF 입자의 자성적 특성을 P19 세포로 비콘을 이동시킴으로써 평가하였다. MF-miR124a의 농도가 증가함에 따라 자성 신호 강도가 점진적으로 감소하는 것이 관찰되었다. 도 7은 다양한 농도의 MF-miR124a 비콘을 P19세포 이입한 후 농도에 비례하여 T2 Weighted MR 시그널이 감소하는 결과를 보여준다. 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 특이적인 relaxivity는 53.39mM^-1 s^- ¹ 였다. 자기공명영상(MRI)에 의해 P19 세포의 인 비보 세포 추적에 더하여, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 의해 유도되는 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 플라스미드 구조체를 형광 강도의 인 비보 정상화(normalization)을 위한 내부 대조군으로서 P19 세포 내로 miR124a 비콘과 함께 트랜스펙션시켰다. 그 결과 생체에서 이입된 P19세포 존재위치를 MRI로 확인하였고, 아울러 루시퍼라아제 리포터유전자에 의해 좌/우측 대퇴부에 동일한 세포의 수가 생체에 이입되었고 생존함을 확인할 수 있었다.

(2) P19 세포를 로딩한 PLLA 스캐폴드의 생체 이식

한편, P19 세포가 생체 내에서 안정적으로 자리잡는 것을 돕기 위해, 폴리-L-락틱산(PLLA) 스캐폴드를 이용하였다. PLLA 스캐폴드는 S. J. Lee (Ewha Womans University College of Pharmacy)로부터 제공받았다. 섬유성 PLLA 스캐폴드는 방적된 PLLA 마이크로파이버로부터 wet-spin을 이용하여 이용하여 제조하였다. P19 세포를 분주하기 이전에, PLLA 스캐폴드를 70% 이소프로필 알코올을 이용하여 밤새 멸균시키고 PBS로 3회 헹구었다. 세포 분주 전 PLLA 스캐폴드를 P19 배양 배지로 12시간 동안 인큐베이션하였다. 폴리-L-락틱산(PLLA) 스캐폴드의 사용은 MF-miR124a 비콘이 도입된 세포에서의 더 나은 형광 활성을 얻고, T2 MR 스캐닝에서 흰색 영역으로 관찰되는 스캐폴드 내부의 위-양성 배경 자기 공명(MR) 신호를 감소시켰다 [D. W. Hwang, et al., J. Nucl.Med. Mol. Imaging 2008, 35, 1887.].

인 비보 신경세포 유도를 위해, miR124a 비콘을 포함하는 5×10⁶ 개의 P19 세포를 PBS로부터 수확하고, 10×10^-7M RA로 재현탁시킨 후, PLLA 스캐폴드 내로 도입하였다. P19-스캐폴드 복합체를 누드 마우스(수컷 BALB/c, 7 주령)의 양쪽 허벅지와 오른쪽 어깨의 피하조직으로 이식하였다.

(3) 인 비보 형광 이미지의 획득

P19-스캐폴드 복합체의 이식 3일 후, 형광 이미지를 위해, 동물을 케타민(Ketalar, Panpharma, Fougeres, France)/자일라진 (Rompun, Bayer Pharma, Puteaux, France) 용액(2:1,50 mL)으로 마취시켰다. 마우스를 Maestro in vivo imaging system (CRi Inc., Woburn, MA, USA)을 이용하여 스캐닝하였다. 광학적 이미징은 그린 필터 세트(503-555 nm, band-pass filter; 580 nm, long-pass filter)를 이용하여 수행하였다. 카메라를 이용하여 일정 노출 시간(1초)에서 캡쳐된 이미지를 획득하였다. Maestro software 2.6을 이용한 자기형광 보정을 위해, MF-miR124a 비콘이 도입된 누드 마우스로부터 획득된 형광 신호 및 자기형광 신호에서의 슈도-컬러 형광 이미지를, 정상 마우스로부터 순수한 자기형광 신호 스펙트럼을 획득한 후 스펙트럼을 혼합하지 않음으로써 만들어 냈다. MF-miR124a 비콘이 도입된 마우스에 대해 혼합된 스펙트럼으로부터 자기형광 스펙트럼을 제외시킴으로써 MF-miR124a을 가지고 있는 마우스에서의 각각의 로다민 형광 스펙트럼을 획득하였다. 도 8a는 이식된 P19세포에 함께 이입된 CMV-Firefly luciferase 광학영상벡터가 오른쪽(신경분화유도)대퇴부와 왼쪽대퇴부(신경분화전)에서 동일한 광학신호를 통해 동일한 세포가 이입되었고 살아 있다는 것을 확인한 결과를 보여준다. 또한, 도 8b는 P19 세포 이식 후 2일째 오른쪽대퇴부에서 신경분화에 의해 miR-124a가 증가 됨에 따라 MF-miR124a 비콘의 생체광학영상 신호가 왼쪽보다 증가됨을 확인한 결과를 보여준다.도 8b에서 볼 수 있는 바와 같이, 이식 3일 후, 신경세포 분화를 위해 RA로 처리된 마우스의 오른쪽 허벅지에서의 형광 이미지가 RA를 처리하지 않은 왼쪽 허벅지의 형광 이미지와 비교할 때 P19 세포에서의 세포내 miR124a의 높은 발현에 기인하여 증가된 형광 이미지를 탐지할 수 있었다. ROI(Quantitative region of interest) 분석에 따르면, 비처리된 군의 형광 활성과 비교하여 RA-처리된 군에서 대략 82.8%의 형광 회복이 확인되었다.

(4) 인 비보 생물발광 이미지의 획득

한편, 생물발광 이미지를 위해, 노즈콘(nose cone)을 통해 1 L min^-1의 유속의 2% 이소플루란이 포함된 O₂ 가스로 마우스를 진정시키고, 3 mg/0.1 mL/마우스 루시퍼라아제 기질 루시페린을 복강내로 주사하여 생물발광 이미지를 획득하였다. 동물을 CCD 카메라(Xenogen, CA, USA)가 설치된 IVIS-200 imaging system으로 옮겼다. 생물발광 이미지는 15분 동안 빛을 모으고 통합하여 획득하였다.

그 결과, 형광활성과 유사한 생물발광 활성이 양쪽 허벅지 부위에서 발견되었으며, 이는 도 8a 및 8b에서 보여준 형광 신호의 향상이 세포 수의 차이에 기인한 것이 아님을 나타낸다.

(5) 인비보 T2 -강조 MR 이미지의 획득

형광 활성이 MFmiR124a 비콘을 포함하는 세포로부터 기인한 것인지 확인하기 위하여, 마우스의 양쪽 허벅지 및 오른쪽 어깨로부터 T2-강조 MR 이미지를 얻었다. MFmiR124a 비콘의 다양한 농도에서의 T2-강조 MR 이미지는 1.5-T MR imager (GE Medical Systems, Milwaukee, WI, USA)를 이용하여 animal coil box 내에서 획득하였다. MRI 실험동안, 동물을 케타민/자일라진(2:1, 50 mL) 용액으로 마취시키고, 그들의 호흡과 체온을 직장 서미스터(rectal thermistor)를 이용하여 모니터링하였다. 누드 마우스의 인 비보 MRI를 또한 1.5-T whole-body MR scanner (GE Medical Systems, Milwaukee, WI, USA)로 수행하여 T2 axial 이미지를 획득하였다. 이 때, repetitive time (TR)과 echo time (TE)에 대한 sequence parameters는 각각 1400 및 55.8 ms이었다. 도 8c에서 볼 수 있는 바와 같이, 이식전 영역과 비교하여, MF-miR124a 비콘이 도입된 P19 세포를 포함하는 PLLA 스캐폴드가 이식된 양쪽 허벅지에서 어두운 신호가 명백하게 가시화되었다. 빈 스캐폴드만이 이식된 오른쪽 어깨에서는 이식 전과 후 모두에서 자성 신호가 관찰되지 않았다. 인 비보 형광 이미지가 MF-miR124a 비콘에 의해 획득된 것인지를 확인하기 위해 이식된 PLLA 스캐폴드를 조심스럽게 분리해냈다. 도 8d에서 볼 수 있는 바와 같이, 분화전의 P19 세포만을 갖는 스캐폴드에서의 형광 활성과 비교하여 분화 후의 P19 세포가 도입된 PLLA 스캐폴드에서 탐지된 형광 활성이 더 밝았다. 어깨 및 양쪽 허벅지로부터 분리된 스캐폴드의 정량적인 ROI 분석은 왼쪽 허벅지의 비처리군의 형광 활성과 비교하여 RA 처리군에서의 형광 회복이 대략 91.2%에 달하는 것으로 나타났다. 뿐만 아니라, 분리된 스캐폴드 군으로부터 유사한 형광 패턴이 P19-스캐폴드 복합체의 동결 절편에서도 발견되었는데, 이는 RA-비처리된 복합체에 비해 RA-처리된 복합체에서 더 강한 형광 신호를 나타냄을 보여준다.

이상 살펴본 바와 같이, 형광 신호를 튜닝할 수 있는 분자 비콘은 특이적 타겟 바이오마커의 동정을 위해 또는 세포내 유전자의 평가를 위해 매우 특이적인 분자 이미징 바이오센서로서 이용할 수 있을 것이다. 또한, 나노입자-기반의 분자 비콘을 사용하면 세포내 분자 타겟팅을 위해 내생적 타겟 분자뿐만 아니라, 살아있는 대상체에서의 신경세포 관련 타겟 분자의 탐지에 의한 신경 분화 패턴을 관찰할 수도 있다. 본 기술은 살아있는 대상체에서의 비침범적인 정보를 제공하며 반복적인 분석을 허용해 준다. 또한, 신경 분화 패턴의 탐지를 위한 miRNA 특이적 분자 비콘 이미징 시스템은 유전자 수준에서의 신경학적 장애의 진단을 위한 유효한 방법이 될 수 있는 잠재력을 가지고 있다.

Claims

형광물질(fluorophore) 및 생체적합성 물질을 포함하는 코팅층을 갖는 자성 나노입자; 및
상기 코팅층에 결합되어 있고 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 핵산 프로브 및 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하고 형광제어물질(quencher)이 결합되어 있는 올리고머가 혼성화되어 있는 분자 비콘을 포함하는
타겟 분자의 탐지를 위한 자성 형광 나노입자 이미징 프로브.
제1항에 있어서,
상기 자성 나노입자는 금속 물질, 자성 물질, 또는 자성 합금인 자성 형광 나노입자 이미징 프로브.
제2항에 있어서,
상기 금속 물질은 Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상인 자성 형광 나노입자 이미징 프로브.
제2항에 있어서,
상기 자성 물질은 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'₂O₄,및 M_pO_q (M 및 M'은 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, p 및 q는 각각 식 “0 < p =3”및 “0 < q =5”을 만족한다.)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상인 자성 형광 나노입자 이미징 프로브.
제2항에 있어서,
상기 자성 합금은 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상인 자성 형광 나노입자 이미징 프로브.
제1항에 있어서,
상기 형광 물질은 로다민과 그의 유도체, 플루오레신과 그의 유도체, 쿠마린과 그의 유도체, 아크리딘과 그의 유도체, 피렌과 그의 유도체, 에리트로신과 그의 유도체, 에오신과 그의 유도체, 및 4-아세트아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'디설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 자성 형광 나노입자 이미징 프로브.
제1항에 있어서,
상기 생체적합성 물질은 실리카, 폴리머, 지질 및 덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것인 자성 형광 나노입자 이미징 프로브.
제1항에 있어서,
타겟 분자가 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역이, 타겟 분자가 형광제어물질이 결합되어 있는 올리고머와 혼성화될 수 있는 영역에 비해 큰 자성 형광 나노입자 이미징 프로브.
제1항에 있어서,
상기 핵산 프로브의 일 말단에 링커가 추가로 포함되어 있는 자성 형광 나노입자 이미징 프로브.
제1항에 있어서,
상기 형광제어물질은 4-(디메틸아미노)아조벤젠-4-카복실산(DABCYL), 4-(디메틸아미노)아조벤젠 설폰산(DABSYL) , BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3 및 ECLIPSE 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 자성 형광 나노입자 이미징 프로브.
제1항에 있어서,
상기 타겟 분자가 microRNA, mRNA 또는 단백질인 자성 형광 나노입자 이미징 프로브.
제1항에 있어서,
상기 자성 형광 나노입자 이미징 프로브에 T1 자기공명 영상 진단 프로브, 광학 진단 프로브, CT 진단 프로브 및 방사선 동위원소로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브가 추가로 도입되어 있는 자성 형광 나노입자 이미징 프로브.
제1항에 있어서,
상기 자성 형광 나노입자 이미징 프로브에 추가로 세포내 전달 리간드가 결합되어 있는 것인 자성 형광 나노입자 이미징 프로브.
제11항에 있어서,
상기 세포내 전달 리간드는 단백질 전달 도메인(protein transduction domain), 막투과 도메인(transmembrane domain) 또는 세포 침투 펩타이드(cell penetrating peptide)인 형광 나노입자 이미지 프로브.
제1항에 있어서,
상기 형광 나노입자 이미징 프로브에 추가로 세포 또는 조직 타겟팅 리간드가 결합되어 있는 것인 형광 나노입자 이미징 프로브.
자성 나노입자 상에 형광물질(fluorophore) 및 생체적합성 물질을 포함하는 코팅층을 형성하고;
상기 코팅층 상에, 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 핵산 프로브 및 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하고 형광제어물질(quencher)이 결합되어 있는 올리고머가 혼성화되어 있는 분자 비콘을 결합시키는 것을 포함하는
타겟 분자의 탐지를 위한 자성 형광 나노입자 이미징 프로브의 제조 방법.
제16항에 있어서,
상기 분자 비콘과 코팅층과의 결합은 코팅층 상에 존재하는 기능기와 분자 비콘의 핵산 프로브 상에 도입된 기능기 간의 공유결합을 통해 이루어지는 것인 자성 형광 나노입자 이미징 프로브의 제조 방법.
제17항에 있어서,
상기 코팅층 상에 존재하는 기능기는 -COOH, -CHO, -NH₂, -SH, -CONH₂, -PO₃H, -PO₄H, -SO₃H, -SO₄H, -OH, -술포네이트, -니트레이트, -포스포네이트, -숙신이미딜기, -말레이미드기 및 -알킬리로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 자성 형광 나노입자 이미징 프로브의 제조 방법.
제17항에 있어서,
상기 핵산 프로브 상에 도입된 기능기는 -NH₂, -COOH, -COH, -NCO, -NCS, -COCH₂, -SH, -CON₃ 및 -CH₂C(NH² ⁺)OCH₃로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 자성 형광 나노입자 이미징 프로브의 제조 방법..
제17항에 있어서,
상기 코팅층 상에 존재하는 기능기는 -COOH이고, 상기 핵산 프로브 상에 도입된 기능기는 -NH₂인 자성 형광 나노입자 이미징 프로브의 제조 방법..
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 자성 형광 나노입자 이미징 프로브를 포함하는 타겟 분자 탐지용 조성물.
제21항의 조성물을 생체 또는 시료에 투여하고;
상기 생체 또는 시료로부터 형광 나노입자 이미징 프로브에 의해 발산되는 신호를 감지하여 영상을 수득하는 것을 포함하는 생체 또는 시료의 영상 수득 방법.