KR20110091074A

KR20110091074A - 사이클린-의존적 키나제 저해제로서 항암 활성을 지닌 인디루빈-3'-옥심 유도체

Info

Publication number: KR20110091074A
Application number: KR1020100010715A
Authority: KR
Inventors: 김용철; 김재일; 반수호; 정순영; 최수정; 이정은
Original assignee: 애니젠 주식회사; 광주과학기술원
Priority date: 2010-02-05
Filing date: 2010-02-05
Publication date: 2011-08-11
Also published as: US20120295948A1; JP2013518874A; ES2562820T3; JP5795004B2; US8859783B2; KR101180030B1; EP2531488A4; WO2011096676A3; EP2531488B1; WO2011096676A2; EP2531488A2

Abstract

본 발명은 사이클린-의존적 키나제 저해제로서 항암 활성을 지닌 인디루빈-3'-옥심 유도체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 사이클린-의존적 키나제(CDK) 저해제로 폐암 세포주, 섬유육종 세포주, 인간 결장암 세포주, 인간 백혈병 세포주, 인간 위암 세포주, 인간 비인두암 세포주, 인간 유방암 세포주 등 각종 암세포주에 탁월한 항암 활성을 지닌 신규한 5',5-치환 인디루빈-3'-옥심 유도체에 관한 것이다.

Description

사이클린-의존적 키나제 저해제로서 항암 활성을 지닌 인디루빈-3'-옥심 유도체{Indirubin-3'-oxime derivatives as potent cyclin dependent kinase inhibitors with anti-cancer activity}

본 발명은 사이클린-의존적 키나제 저해제로서 항암 활성을 지닌 인디루빈-3'-옥심 유도체에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 사이클린-의존적 키나제(CDK) 저해제로 폐암 세포주, 섬유육종 세포주, 인간 결장암 세포주, 인간 백혈병 세포주, 인간 위암 세포주, 인간 비인두암 세포주, 인간 유방암 세포주 등 각종 암세포주에 탁월한 항암 활성을 지닌 신규한 5',5-치환 인디루빈-3'-옥심 유도체에 관한 것이다.

사이클린-의존적 키나제(CDK)는 세포주기 진행, 신경세포 기능, 분화 및 아폽토시스의 조절에 관련되는 세린/트레오닌 키나제 그룹에 속한다. 그의 활성은 발현 수치가 다른 세포주기 동안 변동되는 대응 사이클린(cyclin)으로의 결합을 포함한 다수의 메커니즘에 의해 조절된다. 다른 CDK(사이클린 의존적 키나제)/사이클린 복합체가 G1, S, G2, Mrl 를 통해 각각의 세포주기 단계 동안 활성화된다. 초기 G1기의 CDK4/사이클린 D, CDK6/사이클린 D 및 후기 G1기의 CDK2/사이클린 E에 의한 망막모세포종 단백질(pRb)의 연속적 인산화는 전사 인자 단백질인 E2F(electro-aqoustic 2-factor)의 방출을 유발한다. 결국 E2F 단백질은 세포주기 S-기의 진입에 필요한 유전자 세트의 전사 활성화를 초래하게 된다. 이어서 CDK2가 DNA 복제의 후기 단계인 S-기 동안 사이클린 A에 의해 활성화되고, 지속적인 E2F 활성에 의해 유발된 아폽토시스를 방지하기 위해 시기 적절한 E2F 비활성화를 증진시킨다. 최종적으로 사이클린 A 또는 B와의 복합체 내의 CDK1은 G2/M 체크포인트의 조절 및 유사분열을 통한 세포 분열에서 역할을 지니는 것으로 판단된다.

세포주기 제어 이외에 다른 역할이 CDK2, 7, 8 및 8에 대해 측정된 바 있다. 예를 들어 CDK2/사이클린 E는 p53 매개된 DNA 손상 반응 경로에 중요하고, CDK7, 8 및 9는 RNA 중합효소의 인산화를 통한 전사 개시 및 연장 조절에 관련된다. 따라서 CDK는 여러 다른 메커니즘을 통해 세포 성장 및 생존에 영향을 미치고 CDK 활성의 적당한 조절은 다양한 세포 과정에 중요하다. 현재 사이클린 D 및 사이클린 E와 같은 사이클린의 비정상적인 높은 발현과 돌연변이에 의한 CDK의 조절해제가 많은 인간 종양에서 발생함이 인식되고 있다. 예를 들어 CDK2/사이클린 E 복합체의 발현 및 촉매 활성은 대장암, 난소암, 유방암 및 전립선암에서 증가되고 원발 종양 내 증가된 사이클린 E 발현은 유방암 환자의 불량한 생존률과 상관관계를 지닌다. 또한 CDK1/사이클린 B 복합체의 비정상적 발현은 전립선 선암종 및 폐암의 일부 경우에서도 관찰되었다.

CDK2가 세포주기 진행 및 증식에 필요하지 않다는 보고가 있으나 최근 연구는 멜라닌세포 및 간세포가 증식 및 생존을 위해 CDK2에 의존적임을 나타내었다. 또한 CDK1 및 CDK2의 동시 결핍 조사는 CDK1 또는 CDK2 단독에 타겟되는 것과 비교시 종양 세포주의 항-증식에 증가된 효능을 제공함을 나타내었다. 더욱이 최근 증거는 특정 종양 세포가 증식을 위해 특이적 간기 CDK를 필요로 함을 나타낸다. 따라서 CDK 저해는 암 치료를 위한 흥미로운 반응으로서 종양 성장을 제어하는 효과적인 방법으로 인식된다.

현재 많은 저분자 CDK 저해제가 임상 시험 중이다. 이들 저해제는 키나제 ATP(아데노신 5'-트리포스페이트)-결합 사이트 내에서 ATP와의 경쟁에 의해 작용하는 평평한 작은 헤테로사이클이다. 이들 중 플라보피리돌(flavopyridol)은 임상적 조사가 진행된 첫 번째 CDK 저해제이다. R-로스코피틴(삼중치환된 퓨린 아날로그) 및 BMS-387032(아미노티아졸)는 CDK2/사이클린 E에 대해 선택적이고 PD-0332991(피리도피리미딘)은 CDK4/사이클린 D 및 CDK6/사이클린 D에 대해 매우 선택적이다. 비스-인돌 골격인 인디루빈 및 그의 유도체는 CDK, GSK-3β 및 오로라(aurora) 키나제와 같은 중요한 단백질 키나제에 반응하는 유효한 저해제로서 상당히 인식되고 있다.

본 발명자들은 대한민국 공개특허공보 제10-2005-77173호 '암세포주에 항암 활성을 지닌 인디루빈 유도체'에서 항-증식 및 CDK2 저해 활성을 위한 신규한 인디루빈 아날로그 시리즈를 개시한 바 있다. 상기 특허문헌에서는 여러 암세포주에 대한 항-증식 활성이 시험된 인디루빈 유도체 중 화학식 (Ⅳ)로 표시된 5'-브로모-5-니트로-인디루빈-3'-옥심이 여러 암세포주에 대한 가장 유효한 항-증식 효과를 나타내었고 5' 위치의 추가적인 치환은 5-니트로-인디루빈-3'-옥심 아날로그와 비교시 우수한 것으로 확인하였다.

그러나 상기 대한민국 공개특허공보 제10-2005-77173호에 개시된 화합물 이외의 인디루빈 골격의 5' 위치의 다양한 치환 효과를 설명하는 합성 및 생물학적 조사에 관한 보고는 아직 개시된 바 없다.

따라서 본 발명에서 본 발명자들은 분자 도킹 연구로 디자인된 신규한 5',5-치환 인디루빈-3'-옥심 아날로그의 디자인, 합성 및 CDK 저해 활성, 항-증식 활성 및 생체 내 항암 활성을 포함한 생물학적 조사를 행한 후 종래 상기 특허문헌에서 개시된 인디루빈 유도체보다 우수한 CDK 저해 활성, 항-증식 활성 및 생체 내 항암 활성을 지닌 신규한 5',5-치환 인디루빈-3'-옥심 유도체를 개발하고 본 발명을 완성하게 된 것이다.

본 발명의 해결하려는 과제는 분자 도킹 연구로 디자인된 신규한 5',5-치환 인디루빈-3'-옥심 아날로그의 디자인, 합성 및 CDK 저해 활성, 항-증식 활성 및 생체 내 항암 활성을 포함한 생물학적 측정을 통해 보다 우수한 CDK 저해 활성, 항-증식 활성 및 생체 내 항암 활성을 지닌 5',5-치환 인디루빈-3'-옥심 유도체를 개발코자 한 것이다.

본 발명의 목적은 하기 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 사이클린-의존적 키나제 저해제로서 항암 활성을 지닌 인디루빈-3'-옥심 유도체 화합물을 제공하는 것이다.

일반식 (Ⅰ)

상기 식에서 R₁은 F, Cl, OH 또는 CH₃이고,

R₂는 F, Cl 또는 NO₂이다.

또한 이때 상기 일반식 (Ⅰ)의 유도체 화합물 중 R₁은 OH, R₂는 NO₂임을 특징으로 하는 항암 활성을 지닌 인디루빈-3'-옥심 유도체 화합물이다.

또한 이때 상기 일반식 (Ⅰ)의 유도체 화합물 중 R₁은 F, R₂는 NO₂임을 특징으로 하는 항암 활성을 지닌 인디루빈-3'-옥심 유도체 화합물이다.

또한 이때 상기 일반식 (Ⅰ)의 유도체 화합물 중 ⅰ) R₁은 OH, R₂는 Cl인 인디루빈-3'-옥심 유도체 화합물; ⅱ) R₁은 OH, R₂는 F인 인디루빈-3'-옥심 유도체 화합물; ⅲ) R₁은 Cl, R₂는 NO₂인 인디루빈-3'-옥심 유도체 화합물; 또는 ⅳ) R₁은 CH₃, R₂는 NO₂인 인디루빈-3'-옥심 유도체 화합물임을 특징으로 하는 항암 활성을 지닌 인디루빈-3'-옥심 유도체 화합물이다.

또한 본 발명은 상기 일반식 (Ⅰ)의 인디루빈-3'-옥심 유도체는 폐암 세포주, 섬유육종 세포주, 인간 결장암 세포주, 인간 백혈병 세포주, 인간 위암 세포주, 인간 비인두암 세포주 또는 인간 유방암 세포주에 항암 활성을 지님을 특징으로 하는 것이다.

또한 본 발명은 유효 성분으로 상기 인디루빈-3'-옥심 유도체 화합물을 함유하고 약제학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 항암제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 효과는 분자 도킹 연구로 디자인된 신규한 5',5-치환 인디루빈-3'-옥심 아날로그의 디자인, 합성 및 CDK 저해 활성, 항-증식 활성 및 생체 내 항암 활성을 포함한 생물학적 측정을 통해 보다 우수한 CDK 저해 활성, 항-증식 활성 및 생체 내 항암 활성을 지닌 5',5-치환 인디루빈-3'-옥심 유도체를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명과 관련된 인디루빈 유도체의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 CDK2의 ATP 결합 사이트에 대한 2 및 11b의 결합 모드를 나타낸 것이다. 도 2(a)는 2와 키나제 아미노산 잔기 사이의 수소 결합(녹색 점선) 네트워크를 나타낸다. 2와 CDK2의 결합 모드는 CDK2 힌지(hinge) 영역과의 3개의 수소 결합, 옥심 모이어티와 Gln131의 카르보닐 산소 사이의 추가적인 수소 결합을 나타낸다. 또한 5-니트로기는 Lys33, Asp145의 측쇄와 염 가교를 형성한다. 도 2(b)는 CDK2와 2의 반 덴 발스 표면을 CPK 형태로 나타낸다. 5'-브로모기는 양으로 하전된 아미노산 잔기 Lys89를 제공하는 ATP 결합 포켓의 외부 수성 공간을 향해 돌출된다. 도 2(c)는 11b와 키나제 아미노산 잔기 사이의 수소 결합(녹색 점선) 네트워크를 나타낸다. 11b는 5'-하이드록시기와 Asp86의 카르복실산 사이에 추가적인 수소 결합을 형성한다. 도 2(d)는 ATP 결합 사이트 내에 결합된 11b와 CDK2의 분자 표면 설명을 나타낸다. 결합 표면 내에 놓인 일부 중요한 아미노산이 나타나 있다. 5'-하이드록시기는 외부 수성 공간을 향해 있다.
도 3은 1 μM 의 5',5-치환 인디루빈-3'-옥심 유도체의 CDK1, CDK2 활성 %를 나타낸 것이다. 인디루빈 유도체 시리즈는 실시예에 기재된 바와 같이 CDK1/사이클린 B, CDK2/사이클린 E 상의 그의 효과에 대해 1 μM에서 시험되었다. 또한 실험은 비교를 위해 5-니트로인디루빈-3'-옥심(1)으로도 수행되었다. 결과는 CDK1, CDK2 활성 %의 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표시되었다.
도 4는 10 μM의 11b, 12b의 키나제 패널 선별을 나타낸 것이다. 화합물 11b, 12b는 실시예에 기재된 바와 같이 수용체 티로신 키나제 및 세린/트레오닌 키나제를 포함한 더욱 다양한 키나제 패널에 대해 10 μM 농도에서 시험되었다. 결과는 키나제 활성 %의 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표시되었다. 1 μM 11b는 TrkA에 대해 9% 저해 활성을 나타내었고 2개의 세린/트레오닌 키나제인 Aurora A(1 μM) 및 IKKβ(10 μM) 및 수용체 티로신 키나제 TrkA(4 μM)에 대한 11b의 IC₅₀ 수치가 용량 반응 곡선으로부터 계산되었다.
도 5는 11b의 이종이식된 종양 성장의 저해를 나타낸 것이다. 도 5(a)에서 SD-래트는 RK3E-ras-Luc 세포(5 X 10⁶/100 ㎕)로 주입되었다. 종양이 5 mm 크기에 도달하면 래트는 총 5회 동안 격일로 비-마취 상태에서 11b(5 mg/kg)로 정맥내 주사되었다. 종양 크기는 실시예에 나타난 바와 같이 캘리퍼스로 측정되었다. 도 5(b)는 대조군 및 11b 처리된 래트에서 절제된 대표적인 피하 종양을 나타낸다. 도 5(c)는 대조군 및 11b 처리된 래트 유래의 생체 내 생물발광 영상 분석을 나타낸다.
도 6은 종양 조직의 조직학 및 면역조직화학을 나타낸 것이다. RK3E-ras-Luc 세포는 래트의 좌측복부 상에 피하 접종되었다. 11b(5 mg/kg)는 5일째부터 시작하여 격일로 종양 포함 래트에 정맥내로 주사되었다. 래트는 11일째에 살생되었다. 도 6(a)는 종양 절편의 H&E 염색(좌측), 고형 종양 유래의 파라핀 절편 상의 분석(중앙) 및 PCNA에 대한 면역조직화학적 염색(우측)을 나타낸다. 도 6(b)는 TUNEL 분석에 대한 양성 세포를 나타내고, 도 6(c)는 PCNA 면역염색에 대한 양성 세포를 나타낸다. 세포는 3반복으로 계측되었다. 컬럼, 평균; 막대, SD.

인디루빈 유도체를 포함한 항암제의 타겟인 CDK2/사이클린 E에 대한 저해 효능을 개선시키기 위해 5' 및 5 위치에서 합동 치환을 지닌 신규한 시리즈의 인디루빈-3'-옥심 유도체가 디자인되고 합성되었다. OH 또는 할로겐으로 5'-치환된 결합 방식이 CDK2의 ATP 결합 사이트 내 분자 도킹 연구로 예측되었고, 이는 개선된 CDK2 저해 활성을 설명하는 중요한 상호작용을 나타내었다.

구조-활성 관계 분석은 5' 위치의 OH 및 할로겐기가 CH₃ 및 OCH₃과 같은 전자 공여그룹보다 선호됨을 나타내었다. 합성 유도체 중 5'-하이드록시-5-니트로 아날로그 11b 및 5'-플루오로 5-니트로 아날로그 13b가 각각 1.9 및 1.7 nM의 IC₅₀ 수치로 CDK2에 대한 유효한 저해 활성 및 0.2∼3.3 nM 범위의 IC₅₀ 수치로 여러 인간 암세포주에 대한 항-증식 효과를 나타내었다. 10개의 다른 수용체 티로신 키나제 및 세린/트레오닌 키나제 패널에서 11b의 키나제 선택성 프로파일 연구는 CDK에 대한 저해 활성에 대한 500-배 이상의 선택성을 유발하였다. 11b의 항암 활성은 5 mg/kg 용량의 정맥주사 투여된 생체 내 이종이식 동물 모델에서 더욱 확인되었고, 이는 대조군 동물과 비교시 체중 감소 없이 84%의 조양 부피 감소를 나타내었다. 조직학적 분석을 통한 항-종양 활성의 메커니즘은 각각 증가되고 감소된 아폽토시스 및 증식에 대한 마커에 의해 나타났다.

또한 5'-하이드록시-5-클로로-인디루빈-3'-옥심 11a, 5'-하이드록시-5-플루오로-인디루빈-3'-옥심 11c, 5'-클로로-5-니트로-인디루빈-3'-옥심 12b, 5'-메틸-5-니트로-인디루빈-3'-옥심 14b 역시 유효한 항암 활성을 지님을 나타내었다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

디자인 전략을 위한 분자 도킹

화합물 2의 증가된 항-증식 효과를 설명하기 위해 분자 도킹 연구가 CHARMm-기반 분자 역학 도킹 프로그램(Discovery Studio 2.0)인 CDocker를 이용하여 CDK2의 ATP 결합 사이트에서 수행되었다(도 2). 도 2a는 화합물 2의 위치 1'의 질소, 위치 2의 카르보닐 산소 및 위치 1의 질소가 ATP 결합 사이트의 힌지 세그먼트(hinge segment)(Gln81, Leu83)와의 3개 수소 결합 상호작용을 유지함을 나타낸다. 더욱이 옥심 모이어티의 3'-하이드록실기는 Gln31의 카르보닐기와 수소 결합을 형성하고 5-니트로기는 Lys33, Asp145의 측쇄와의 염 가교의 원인이 된다. 도 2b는 리간드 2 주변의 4 Å 이내에 정전기 전위를 지닌 결합 표면을 나타내고 5'-Br기는 실질적인 결합 파트너인 양으로 하전된 아미노산 잔기인 Lys89가 있는 ATP 결합 포켓의 외부 수성 공간을 향해 돌출된다. 양으로 하전된 Lys89 잔기와 5'-Br기의 전자 한 쌍의 추가적인 정전기 상호작용은 CDK2와의 더 높은 결합 친화력을 제공하고 따라서 5'-비치환-인디루빈-3'-옥심 아날로그 1 대비 2의 더 유효한 항-증식 활성의 원인이 됨이 가정될 수 있다. 도킹 연구에서 수득된 데이터에 따라 5-치환분(Cl, NO₂, F 및 OCF₃)과 함께 5'-위치의 유도체화는 CDK2에 대한 결합 친화력을 최적화하기 위한 인디루빈 골격 상의 변형 방법에 이상적이다.

CDK 저해 및 항-증식 활성을 위한 인디루빈 골격의 5' 위치의 구조-활성 관계를 조사하기 위해 하기 기가 유도체화를 위해 선택되었다: 1) 5'-브로모 아날로그 2의 경우 Lys89와의 유사한 정전기 상호작용을 형성할 수 있는 5'-F, 5'-Cl, 2) CDK2와의 추가적인 수소 결합을 제공하고 친수성 특징을 도입시키는 5'-OH, 3) 할로겐 치환된 아날로그와 비교시 대조적인 효과를 기대하는 5'-OCH₃, 5'-CH₃.

실제로 CDK2 내의 ATP 결합 사이트에서 대표적인 디자인 분자의 도킹 모델인 5'-하이드록시-5-니트로-인디루빈-3'-옥심 유도체(11b)는 새로운 수소 결합 상호작용이 11b의 5'-OH기와 용매 접근 용이 영역 내 Asp86 사이에 형성됨을 나타내었고 11b의 옥심 모이어티는 Gln131 대신 Ile10과 상호작용하였다. 도 2d는 11b 주변 4 Å 이내에 정전기 전위를 지니는 결합 표본을 나타내고, 이는 어떻게 5'-OH가 외부 수성 표면, 용매 접근 용이 영역 내로 돌출되는지를 나타낸다.

화학

5',5-치환-3'-인디루빈-옥심 유도체의 합성을 위해 5-치환 인독실 N,O-디아세테이트 5a-d가 대응 5-치환 안트라닐산 3a-d를 시작으로 제조되었다(스킴 1).

스킴 1

간단하게는 화합물 3a-d가 에틸글리옥살레이트로의 환원성 알킬화 조건에 놓이고 이후 가수분해되어 디카르복실산 4a-d를 생성하고 이는 최종적으로 무수초산 내에서 고리화되어 5a-d를 제공한다. 5-하이드록시 아날로그이 경우 고리화 조건 하에서 페놀 하이드록실기도 아세틸화되기 때문에 고리화 화합물 5a는 트리-아세테이트 형태로 수득되었다.

Moon, M. J. et al., Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 237-246에 기재된 바와 같이 기본 조건 하에서 5-치환 인독실 N, O-디아세테이트 5a-d와 다양한 5-치환 이사틴 아날로그 6a-d의 컨쥬게이트 반응으로 5',5-치환 인디루빈 유도체 7-10을 생성한 후 3'-옥심기 내로 케톤의 전환을 위해 각각의 인디루빈 7-10과 하이드록실아민의 반응으로부터 5',5-치환-3'-인디루빈 옥심 유도체 11-14가 합성되었다(스킴 2).

스킴 2

5'-메톡시-5-치환-3'-옥심 화합물 16a-c는 페놀 하이드록실기의 메틸화 및 수반되는 하이드록실아민과의 반응에 의해 대응 5'-하이드록시-5-치환 인디루빈 유도체로부터 합성되었다(스킴 3).

스킴 3

CDK 저해 활성 및 키나제 선택성 프로파일

5',5-치환-인디루빈-3'-옥심 유도체는 1 μM 내의 CDK1/사이클린 B, CDK2/사이클린 E에 대한 저해 활성이 최초로 조사되었다(도 3). 5-니트로인디루빈-3'-옥심 1이 5'-위치에서 치환 효과의 비교를 위해 함께 시험되었다. CDK1 대비 CDK2에 대한 화합물의 저해 활성 및 선택성은 R₁-위치에서 5'-치환분 상에 의존적인 것으로 판명되었다. 일반적으로 5',5-치환-인디루빈-3'-옥심 유도체는 12d, 16a-c를 제외하고는 1 μM 내에서 90% 이상의 저해 효능으로 CDK2에 대한 유효한 저해 활성을 나타내었다. 특히 5'-OH 아날로그 11a-d는 CDK1 및 CDK2 모두에 대해 최대 저해 효능을 나타내었다. R₁-위치의 5'-OH가 CDK1 대비 감소된 CDK2 선택성을 유발하였으나 이러한 결과는 여러 문헌에 따라 CDK1 및 CDK2에 대한 동시 저해제가 항암 활성의 측면에서 추가적인 이득을 지닌다는 개념 때문에 중요하다. 더욱이 5'-하이드록실기의 치환은 인디루빈 아날로그의 물리화학적 특성 중 주요한 단점인 수용성을 개선시켰다. 5'-OH-치환 인디루빈-3'-옥심 유도체와 대조적으로 5'-클로로 및 5'-플루오로 치환 인디루빈-3'-옥심 유도체 12a-d 및 13a-d는 CDK1 대비 6-10배 선택성으로 유효한 CDK2 저해 활성을 유지하였다. 예를 들어 5'-클로로-5-니트로-인디루빈-3'-옥심 12b는 CDK1보다 CDK2에 대해 약 8배 이상 유효하였다(표 1)

5'-할로겐화에 의한 감소된 CDK1 저해 효능은 5-니트로-인디루빈-3'-옥심 1 대비 감소된 CDK1 저해 활성(IC₅₀ = 190 nM)을 나타내는 5'-브로모-5-니트로-인디루빈-3'-옥심 2의 보고에 의해 더욱 지지되었다. 5' 위치에서 전자 공여기를 지닌 화합물 시리즈 중 5'-CH₃을 지닌 14b가 CDK1 대비 7-배까지의 선택성으로 유효한 CDK2 저해 활성을 유지하였다. 그러나 5'-OCH₃ 치환 유도체(16a-c)는 1 μM 내에서 CDK1 및 CDK2에 대해 미약한 저해 활성을 나타내거나 저해 활성이 존재하지 않았다.

CDK2 저해 활성에 대한 5',5-인디루빈-3'-옥심 유도체의 구조-활성 관계는 IC₅₀ 수치로 분석되었다(표 1). 5'-OCH₃유도체 16a-c를 제외하고는 대부분의 유도체는 1∼70 nM의 IC₅₀ 수치로 유효한 저해 활성을 나타내었다. R₁ 위치의 5'-치환분 효과와 관련하여 CDK2 저해 활성은 -OCH₃ < -Cl < -H, -CH₃ < -OH, -F 순서로 증가되었다. 예를 들어 5'-클로로-치환-인디루빈-3'-옥심 화합물 12a-d는 5'-플루오로-인디루빈-3'-옥심 유도체 13a-c(IC₅₀ = 1∼8 nM)보다 10-배 감소된 CDK2 저해 활성(IC₅₀ = 10∼76 nM)을 나타내었다. 또다른 전자-공여기 5-CH₃-치환 인디루빈-3'-옥심 14b는 16b와 비교시 270배 증가된 저해 효과를 나타내었으나 전자-공여기 5'-OCH₃-치환분(16a-c)은 현격히 감소된 CDK2 저해 활성을 나타내었다. 특히 가장 유효한 CDK2 저해제 11b, 13b 및 13c는 5'-비치환-5-니트로-인디루빈-3'-옥심 1(IC₅₀ = 7 nM)보다 약 4배 이상의 효능으로 CDK2에 대해 약 2 nM의 IC₅₀ 수치를 나타내었다. 인디루빈-3'-옥심 유도체의 R₂ 위치의 5-치환 효과 분석시 니트로기 및 플루오로기가 일반적으로 클로로기 또는 트리플루오로메톡시기와 같은 다른 5-치환분보다 CDK2 저해에 더욱 적합하였다. 따라서 5'-위치에서 OH 및 F 및 5-위치에서 F와 같은 전자 효과를 제공하는 치환분 조합을 지닌 인디루빈-3'-옥심 아날로그는 CKD2에 대해 유효한 저해 활성을 나타내었다.

대표적인 유효하고 선택적인 CKD2 저해제 11b 및 12b는 수용체 티로신 키나제 및 세린/트레오닌 키나제를 포함한 더욱 다양한 키나제 패널에 대해 더욱 조사되었다(도 4). 11b는 시험된 키나제 중 Aurora A, IKKβ 및 TrkA에 대해서만 미약한 저해 활성을 나타내었고 IC₅₀ 수치는 1∼10 μM의 범위이었다. 12b는 모든 시험된 키나제 패널에 대해 무시 가능한 저해 활성을 나타내었다. CDK1 및 2에 대한 11b 및 12b의 IC₅₀ 수치가 낮은 나노몰 범위이기 때문에 본 발명에서 시험된 세린/트레오닌 키나제 및 수용체 티로신 키나제 중 키나제 선택성 프로파일은 CDK1 및 CDK2에 대해 유의적으로 적합할 수 있다.

항-증식 활성

여러 암세포주 A549, HT1080, HCT116, K562, SNU638, KB, MCF-7에 대한 5',5-치환 인디루빈-3'-옥심 유도체의 항-증식 활성이 설포로다민 B(SRB) 분석으로 평가되었고 암세포 성장 저해의 IC₅₀ 수치가 표 2에 요약되어 있다.

5'-브로모-5-니트로-인디루빈-3'-옥심(2) 및 로스코비틴(Roscovitin)이 분석의 양성 대조군으로 함께 시험되었다.

5'-하이드록시 유도체 11a-d의 항-증식 활성은 NO₂ > F > Cl, OCF₃ 순서로 5 위치의 치환분에 따라 다르게 CDK2에 대한 저해 활성 효능과 상호관련된다. 특히 5'-하이드록시-5-니트로-인디루빈-3'-옥심 11b는 2와 비교시 HT1080 및 HCT116 세포주에 대한 ∼0.4 μM의 IC₅₀ 수치로 암세포에 따라 다르게 유사하거나 개선된 저해 활성을 나타내었다. F 및 CL과 같은 또다른 할로겐기에 의한 5'-브로모기의 교체를 지닌 화합물 중 5-니트로 아날로그 12b 및 13b가 특히 약 0.3 μM의 IC₅₀ 수치로 조절 해제된 사이클린 D1을 지닌 인간 결장암 세포 HCT116의 증식에 대해 5'-브로모-5-니트로-인디루빈-3'-옥심 화합물 2보다 더욱 효과적임을 나타내었다.

특히 5'-플루오로-5-니트로-인디루빈-3'-옥심 13b는 CDK2의 유효한 저해 활성의 상관관계로 모든 암세포주에 대해 가장 광범위한 저해 효능 스펙트럼을 나타내었다(IC₅₀ = 0.28∼0.94 μM). 화합물 13b는 대부분의 다른 유도체의 미약한 활성과 대조적으로 인간 폐암 세포 A549에 대해 나노몰 IC₅₀ 수치로 독점적인 항-증식 활성을 지닌다. 그러나 5'-CH₃, 5'-OCH₃과 같은 전자 공여기로 치환된 인디루빈-3'-옥심 유도체 14 및 16은 항-증식 활성이 0.8∼1 μM IC₅₀ 수치 범위인 5'-메틸-5-니트로-3'-옥심 14b를 제외하고는 대부분의 암세포에 대해 매우 미약한 저해제였다. 5-위치(R₂)의 치환 효과와 관련하여 5'-OH, Cl, F, CH₃과 함께 5-NO₂기는 5',5-이중치환 유도체 시리즈 중 가장 유효한 항-증식 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 종전 공개된 결과와 일치하고 염 가교와의 추가 결합이 5-니트로기와 CDK2의 ATP 결합 사이트 내 Asp145, Lys33 사이에 형성되는 2 및 11b의 결합 모드 가설에 의해 지지되었다. 5'-OCH₃ 유도체의 경우 5-F-치환 아날로그 16b만이 중간 정도의 항-증식 활성을 나타내었고, 이는 다른 작용 메커니즘이 이러한 아날로그와 관련됨을 나타낸다. 본 발명의 결과는 5'-하이드록실기 또는 할로겐기가 CDK2의 ATP 결합 사이트에서 추가적인 수소 결합 상호작용을 형성함으로서 CDK 및 암세포 성장을 저해하는데 적합할 수 있다는 중요한 견지를 제안한다.

화합물 11b의 생체 내 항암 활성

5'-OH-5-니트로 아날로그 11b의 효과를 조사하기 위해 생체 내에서 k-ras 및 GFP/Luc 유전자를 지닌 RK3E 래트 신장 세포가 피하 이식된 Spargue Dawley(SD) 래트 종양 이종이식 동물 모델이 이용되었다. 이식 5일 후 5 mg/kg의 11b가 매일 모니터되면서 총 5회 동안 격일로 동물에 정맥 투여되었다. 종양 부피는 대조군과 비교시 약 84.3%까지 유의적으로 감소되었다(도 5a 및 5b). 11b의 투여 동안 대조군과 비교시 체중에 있어서 유의적인 차이는 존재하지 않았다. 11b 처리 후 10일째에 수득된 생물발광 이미지는 종양 성장의 지표인 발광 강도가 유의적으로 감소되었음을 나타내었다(도 5c).

조직학적 분석은 비처리 대조군 고형 종양이 많은 유사분열 특징, 다초점 괴사 및 출혈을 나타내는 역형성 비분화 암종에 속함을 나타내었다. 그러나 11b 처리 종양은 광대한 세포 사멸을 유발하였다(도 6a, 좌측). TUNEL-양성 아폽토시스성 세포는 대조군 조직과 비교시 11b 처리 종양 유래의 조직에서 약 6.0배로 증가되었다(도 6a, 중앙 및 도 6b). 한편 세포 증식 마커인 PCNA의 발현 수치는 대조군과 비교시 11b 처리 동물에서 감소되었다(도 6a 우측 및 도 6c). 이들 결과는 11b가 생체 내 세포 증식의 저해 및 아폽토시스 활성화를 통해 종양 성장을 억제함을 나타낸다.

결론적으로 여러 신규한 5',5-치환-인디루빈-3'-옥심 화합물이 다양한 암세포주에서 항-증식 활성을 지닌 CDK1 및 2에 대한 유효한 저해제로서 개발되었다. 5'-비치환 인디루빈-3'-옥심 1과 비교시 5',5-치환-인디루빈-3'-옥심 유도체의 증가된 저해 활성은 용매 접근 용이 영역을 향한 분자의 추가적인 돌출 및 5'-하이드록시 아날로그 11b로 예증되는 ATP 결합 포켓의 제공된 아미노산 잔기와의 상호작용의 측정을 야기하는 CDK2의 ATP 결합 사이트에서의 분자 도킹 연구로 해석될 수 있다. 특히 5'-하이드록시-5-니트로-인디루빈-3'-옥심(11b) 및 5'-플루오로-5-니트로-인디루빈-3'-옥심(13b)은 0.2∼3.3 μM 범위의 IC₅₀ 수치의 여러 인간 암세포주에 대한 유효한 항-증식제일 뿐만 아니라 각각 1.71 nM 및 1.91 nM의 IC₅₀ 수치의 유효한 CDK2 저해제였다. 구조-활성 관계 분석은 OH기 및 할로겐기가 5' 위치에서 5'-CH₃, 5'-OCH₃과 같은 전자 공여기에 바람직함을 나타내었다. 대표적인 아날로그인 5'-하이드록시-5-니트로-인디루빈-3'-옥심(11b)은 유의적인 생체 내 항암 활성뿐만 아니라 선택된 키나제 패널 대비 CDK에 대한 500-배 이상의 선택성을 나타내었다. 본 발명에서 야기된 정보는 CDK 저해제 기반 약물 디자인의 개발 및 임상적 응용에 기여할 것으로 기대될 수 있다.

또한 5'-하이드록시-5-클로로-인디루빈-3'-옥심(11a), 5'-하이드록시-5-플루오로-인디루빈-3'-옥심(11c), 5'-클로로-5-니트로-인디루빈-3'-옥심(12b), 5'-메틸-5-니트로-인디루빈-3'-옥심(14b) 역시 유효한 항암 활성제로 간주될 수 있다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

화학

¹H NMR 스펙트럼은 300 MHz에서 JEOL JNM-LA 300WB 분광계 또는 400 MHz에서 JEOL JNM-ECX 400P 분광계로 측정되었고, 스펙트럼은 CDCl₃ 또는 DMSO-d ₆ 또는 아세톤-d ₆ 내에서 측정되었다. 언급하지 않는 한 화학 변위는 내부 테트라메틸실란으로부터 ppm 다운필드 또는 DMSO(2.5 ppm), 아세톤(2.04 ppm)으로부터 상대 ppm으로 표기된다. 질량 분석은 일렉트로스프레이 상에서 수행되었고 고-해상 질량 스펙트럼(m/z)이 신속 원자 충격법(FAB), 전자 충격(EI)[JEOL: 질량 범위 2600 amu, 10 kV 아세틸화] 및 일렉트로스프레이 이온화(ESI) 상에 기록되었다. 고-해상 질량 분석은 한국 기초 과학 지원 연구원(대구)에서 수행되었다.

모든 최종 생성물의 순도는 HPLC에 의해 측정되었다(언급되지 않는 한 95% 이상의 순도). 순도 측정은 선형 기울기 용매 시스템 내에서 Shimadzu Shim-pack C18 분석 컬럼(250 mm X 4.6 mm, 5 ㎛, 100 Å)을 이용하여 Shimadzu SCL-10A VP HPLC 시스템 상에 수행되었다. 용매 시스템은 유속 = 1 mL/분으로 30분간 H₂O : CH₃CN = 65 : 35 내지 5 : 95이었다. 피크는 다이오드 어레이 검출기를 이용하여 UV 흡광에 의해 검출되었다.

(실시예 1) 5-치환 인독실 N,O-디아세테이트 5a-d의 제조

50 ml의 메탄올 내의 5-치환 안트라닐산 용액(1.0 g, 6.45 mmol) 내에 0.5 ml의 아세트산 첨가 후 에틸글리옥살레이트(1 ml, 9.7 mmol) 및 NaCNBH₃(609.5 mg, 9.7 mmol)이 첨가되었다. 반응 혼합물은 실온에서 3시간 동안 교반되었다. 이후 메탄올이 증발에 의해 제거되었다. 물 내의 포화 NH4Cl 용액 내에서 잔여물이 채취되었고 에틸아세테이트로 추출되었다. 추출물은 황산나트륨 상에서 건조되고, 여과되고, 증발되었다. 생성물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된 후(CH₃Cl : 메탄올 = 30 : 1) 이들 생성물(1.4 g, 5.8 mmol)은 25 ml의 1 N NaOH(aq) 및 10 ml의 메탄올 내에서 가수분해되었다. 반응 혼합물은 실온에서 1시간 동안 교반되었고 수득된 용액은 1 N HCl에 의해 산성화되었다. 형성된 침전물은 여과에 의해 채취되고 물로 세척되었다. 수득된 이산 화합물 4a-d(1.2 g, 4.97 mmol)는 무수 초산(15 ml) 및 Na₂CO₃(1.3 g, 12.4 mmol) 내에 첨가되었다. 반응 혼합물은 4시간 동안 역류되었다. 생성물은 에틸아세테이트로 추출되고 물로 세척되었다. 추출물은 황산나트륨 상에서 건조되고, 여과되고, 증발되었다. 생성물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산 : 에틸아세테이트 = 2 : 1)에 의해 정제되었다.

1-아세틸- 1H -인돌-3,5-elf 디아세테이트(5a)에 대한 데이터

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 8.46 (1H, d, J = 9.3 Hz), 7.76 (1H, s), 7.30 (1H, d, J = 2.4 Hz), 7.11 (1H, dd, J = 9.3, 2.4 Hz), 2.67 (3H, s), 2.36 (3H, s), 2.31 (3H, s). ESI[M-H]^- : 273.83.

1-아세틸-5-클로로- 1H -인돌-3-일 아세테이트(5b)에 대한 데이터

¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 8.40 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.75 (1H, s), 7.53 (1H, d, J = 2 Hz), 7.34 (1H, dd, J = 8.8, 2 Hz), 2.61 (3H, s), 2.39 (3H, s). ESI[M-H]^- : 249.83.

1-아세틸-5-플루오로- 1H -인돌-3-일 아세테이트(5c)에 대한 데이터

¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 8.42 (1H, m), 7.75 (1H, s), 7.19 (1H, dd, J = 8.2, 2.4 Hz), 7.10 (1H, td, J = 8.8, 2.4 Hz), 2.59 (3H, s), 2.37 (3H, s). ESI[M-H]^- : 233.88.

1-아세틸-5-메틸- 1H -인돌-3-일 아세테이트(5d)에 대한 데이터

¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 8.31 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.65 (1H, s), 7.31 (1H, s), 7.19 (1H, d, J = 7.6 Hz), 2.57 (3H, s), 2.44 (3H, s), 2.36 (3H, s). ESI[M-H]^- : 229.80.

(실시예 2) 5',5-치환 인디루빈-3'-옥심 유도체 11-14의 제조

메탄올(5 ml) 내의 이사틴 아날로그(77 mg, 0.425 mmol)에 5-치환 인독시 N, O 디아세테이트(100 mg, 0.425 mmol)가 첨가되었고 혼합물은 5분간 교반되었다. 무수 Na₂CO₃(112.5 mg, 1.06 mmol)이 첨가되었고 교반은 실온에서 3시간 동안 지속되었다. 탁한 침전물이 여과되고 냉수로 세척되고 감소된 압력 하에서 건조되어 5',5-치환 인디루빈 7-10의 유도체를 제공하였다. 적당한 인디루빈 유도체(10 mg, 0.032 mmol)가 피리딘(0.3 ml) 내에 용해되고 하이드록실아민 염산염(6.6 mg, 0.095 mmol) 내에 첨가되었다. 반응 혼합물은 120℃에서 2시간 동안 역류 하에 가열되었다. 냉각 후 생성물은 1 N HCl로 산성화되었다. 침전물은 여과되고 물로 세척되어 선택적으로 (2'Z, 3'E) 형태로 대응 3'-옥심을 정량적으로 제공하였다. 생성물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름 : 메탄올 = 20 : 1)에 의해 정제되었다.

(2' Z , 3' E )-5'-하이드록시-5-클로로-인디루빈-3'-옥심(11a)에 대한 데이터

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 11.71 (1H, s, N-H), 10.78 (1H, s, N'-H), 9.27 (1H, s, O-H), 8.59 (1H, d, J = 2 Hz, H-4), 7.74 (1H, d, J = 2 Hz, H-4'), 7.24 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 7.11 (1H, dd, J = 8, 2 Hz, H-6'), 6.87 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6), 6.85 (1H, d, J = 8 Hz, H-7'). HRMS(고해상 질량 분광법) (EI) [M]⁺ ^ㆍ (C₁₆H₁₀ClN₃O₃): 계산 327.0411 관찰 327.0408. 순도 92%.

(2' Z , 3' E )-5'-하이드록시-5-니트로-인디루빈-3'-옥심(11b)에 대한 데이터

¹H NMR (DMSO, 300 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 13.87 (1H, s, NOH), 11.78 (1H, s, N-H), 11.35 (1H, s, N'-H), 9.41 (1H, d, J = 2.8 Hz, H-4), 9.32 (1H, s, O-H), 8.05 (1H, dd, J = 11.6, 2.8 Hz, H-6), 7.76 (1H, d, J = 3.2 Hz, H-4'), 7.29 (1H, d, J = 11.6 Hz, H-7), 7.04 (1H, d, J = 11.2 Hz, H-7'), 6.86 (1H, dd, J = 11.2, 3.2 Hz, H-6'). HRMS (EI) [M]⁺ ^ㆍ (C₁₆H₁₀N₄O₅): 계산 338.0651 관찰 338.0648.

(2' Z , 3' E )-5'-하이드록시-5-플루오로-인디루빈-3'-옥심(11c)에 대한 데이터

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 11.69 (1H, s, N-H), 10.66 (1H, s, N'-H), 9.25 (1H, s, O-H), 8.42 (1H, dd, J = 11.4, 2.8 Hz, H-6), 7.73 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4'), 7.24 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6'), 6.81-6.99 (3H, m, H-7', H-4, H-7). HRMS (EI) [M]⁺ ^ㆍ (C₁₆H₁₀FN₃O₃): 계산 311.0706 관찰 311.0707. 순도 93%.

(2' Z , 3' E )-5'-하이드록시-5-트리플루오로메톡시-인디루빈-3'-옥심(11d)에 대한 데이터

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 11.70 (1H, s, N-H), 10.78 (1H, s, N'-H), 9.22 (1H, s, O-H), 8.50 (1H, s, H-4), 7.70 (1H, d, J = 2 Hz, H-4'), 7.21 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-7'), 7.03 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 6.88 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6), 6.80 (1H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz, H-6'). HRMS (ESI)[M-H]^- (C¹⁷H⁹F₃N₃O₄): 계산 376.0545 관찰 376.0546.

(2' Z , 3' E )-5'-클로로-5-클로로-인디루빈-3'-옥심(12a)에 대한 데이터

¹H NMR (아세톤, 300 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 13.05 (1H, s, NOH), 11.82 (1H, s, N-H), 9.81 (1H, s, N'-H), 8.67 (1H, s, H-4), 8.35 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-4'), 7.45 (2H, m, H-6, H-7), 7.16 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6'), 6.97 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'). HRMS (EI) [M]⁺ ^ㆍ (C₁₆H₉C_l2N₃O₂): 계산 345.0072 관찰d 345.0075.

(2' Z , 3' E )-5'-클로로-5-니트로-인디루빈-3'-옥심(12b)에 대한 데이터

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 11.98 (1H, s, N-H), 11.39 (1H, s, N'-H), 9.45 (1H, s, H-4), 8.25 (1H, s, H-4'), 8.08 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-6), 7.50 (2H, m, H-6', H-7), 7.05 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'). HRMS (ESI) [M-H]^- (C₁₆H₈ClN₄O₄): 계산 355.0234 관찰 355.0242.

(2' Z , 3' E )-5'-클로로-5-플루오로-인디루빈-3'-옥심(12c)에 대한 데이터

¹H NMR (아세톤, 300 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 12.96 (1H, s, NOH), 11.78 (1H, s, N-H), 9.71 (1H, s, N'-H), 8.41 (1H, d, J = 11.4 Hz, H-7), 8.32 (1H, s, H-4), 7.40-7.50 (2H, m, H-4', H-6'), 6.88-6.91 (2H, m, H-6, H-7'). HRMS (ESI) [M-H]^- (C₁₆H₈ClFN₃O₂): 계산 328.0289 관찰 328.0291.

(2' Z , 3' E )-5'-클로로-5-트리플루오로메톡시-인디루빈-3'-옥심(12d)에 대한 데이터

¹H NMR (아세톤, 300 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 13.02 (1H, s, NOH), 11.82 (1H, s, N-H), 9.88 (1H, s, N'-H), 8.63 (1H, s, H-4) , 8.34 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-4'), 7.47 (2H, m, H-6, H-7), 7.11 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6'), 7.03 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'). HRMS (ESI) [M-H]^- (C₁₇H₈ClF₃N₃O₃): 계산 394.0206 관찰 394.0215.

(2' Z , 3' E )-5'-플루오로-5-클로로-인디루빈-3'-옥심(13a)에 대한 데이터

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 11.81 (1H, s, N-H), 10.85 (1H, s, N'-H), 8.62 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4), 7.97 (1H, dd, J = 8.2, 2.4 Hz, H-6), 7.47 (1H, m, H-4'), 7.31 (1H, m, H-7), 7.15 (1H, dd, J = 8.4, 2 Hz, H-6'), 6.88 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'). HRMS (ESI) [M-H]^- (C₁₆H₈ClFN₃O₂): 계산 328.0289 관찰 328.0295.

(2' Z , 3' E )-5'-플루오로-5-니트로-인디루빈-3'-옥심(13b)에 대한 데이터

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 11.89 (1H, s, N-H), 11.40 (1H, s, N'-H), 9.43 (1H, d, J = 2 Hz, H-4), 8.08 (1H, dd, J = 8.6, 2 Hz, H-6), 8.00 (1H, dd, J = 8.6, 2 Hz, H-7), 7.51 (1H, m, H-4'), 7.33 (1H, td, J = 9, 2.8 Hz, H-6'), 7.06 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'). HRMS (EI) [M]⁺ ^ㆍ (C₁₆H₉FN₄O₄): 계산 340.0608 관찰 340.0610.

(2' Z , 3' E )-5'-플루오로-5-플루오로-인디루빈-3'-옥심(13c)에 대한 데이터

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 11.76 (1H, s, N-H), 10.68 (1H, s, N'-H), 8.41 (1H, dd, J = 11.2, 2.4 Hz, H-4), 7.93 (1H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz, H-4'), 7.39 (1H, m, H-7), 7.30 (1H, td, J = 8.8, 2 Hz, H-6), 6.93 (1H, td, J = 9, 2.4 Hz, H-6'), 6.84 (1H, m, H-7'). HRMS (EI) [M]⁺ ^ㆍ (C₁₆H₉F₂N₃O₂): 계산 313.0663 관찰 313.0666. 순도 93%.

(2' Z , 3' E )-5'-플루오로-5-트리플루오로메톡시-인디루빈-3'-옥심(13d)에 대한 데이터

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 12.02 (1H, s, N-H), 10.72 (1H, s, N'-H), 8.59 (1H, s, H-4), 8.02 (1H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz, H-6), 7.41 (1H, m, H-4'), 7.18 (1H, td, J = 9.2, 2 Hz, H-6), 7.00 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 6.9 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'). HRMS (FAB) (C₁₇H₉O₃N₃F₄): 계산 379.0579 관찰 379.0580.

(2' Z , 3' E )-5'-메틸-5-클로로-인디루빈-3'-옥심(14a)에 대한 데이터

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 11.85 (1H, s, N-H), 10.76 (1H, s, N'-H), 8.64 (1H, s, H-4), 8.10 (1H, s, H-4'), 7.29 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6), 7.20 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 7.10 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-6'), 6.86 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'), 2.31 (3H, s, CH₃). HRMS (EI) [M]⁺ ^ㆍ (C₁₇H₁₂ClN₃O₂): 계산 325.0618 관찰 325.0623.

(2' Z , 3' E )-5'-메틸-5-니트로-인디루빈-3'-옥심(14b)에 대한 데이터

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 11.87 (1H, s, N-H), 11.38 (1H, s, N'-H), 9.46 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4), 8.11 (1H, s, H-4'), 8.07 (1H, dd, J = 8, 2.4 Hz, H-6), 7.37 (1H, d, J = 8 Hz, H-7), 7.26 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-6'), 7.05 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-7'), 2.32 (3H, s, CH₃). HRMS (ESI) [M-H]^- (C₁₇H₁₁N₄O₄): 계산 335.0780 관찰 335.0787. 순도 93%.

(2' Z , 3' E )-5'-메틸-5-플루오로-인디루빈-3'-옥심(14c)에 대한 데이터

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 11.78 (1H, s, N-H), 10.61 (1H, s, N'-H), 8.43 (1H, dd, J = 11.2, 2.4 Hz, H-4), 8.06 (1H, s, H-4'), 7.26 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 7.17 (1H, d, J = 8 Hz, H-7'), 6.86 (1H, td, J = 8.4, 2.4 Hz, H-6), 6.80 (1H, d, J = 8 Hz, H-6'), 2.28 (3H, s, CH3). HRMS (EI) [M]⁺ ^ㆍ (C₁₇H₁₂FN₃O₂): 계산 309.0914 관찰 309.0912.

(2' Z , 3' E )-5'-메틸-5-트리플루오로메톡시-인디루빈-3'-옥심(14d)에 대한 데이터

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 11.80 (1H, s, N-H), 10.87 (1H, s, N'-H), 8.59 (1H, d, J = 2 Hz, H-4), 8.09 (1H, s, H-4'), 7.34 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6), 7.25 (1H, d, J = 8 Hz, H-7), 7.10 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-6'), 6.94 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'), 2.33 (3H, s, CH3). HRMS (EI) [M]⁺ ^ㆍ (C₁₈H₁₂F₃N₃O₃): 계산 375.0831 관찰 375.0833.

(실시예 3) 5'-메톡시-5-치환 인디루빈-3'-옥심 유도체 16a-c의 제조

아세톤(1 ml) 내 5'-하이드록시-인디루빈 아날로그 7d(10 mg, 0.028 mmol) 용액 내에 요오드화메틸(17 ㎕, 0.276 mmo)이 방울져 떨어지고 K₂CO₃(19 mg, 0.138 mmol)이 첨가되고 교반이 실온에서 4시간 동안 지속되었다. 탁한 침전물이 여과되고 냉수로 세척되고 감소된 압력 하에 건조되어 5'-메톡시-5-치환 인디루빈 유도체 15c를 제공하였다. 적당한 인디루빈 유도체(6 mg, 0.016 mmol)가 피리딘(0.3 ml) 내에 용해되고 하이드록실아민 염산염(3.4 mg, 0.048 mmol)이 첨가되었다. 반응 혼합물은 120℃에서 1시간 동안 역류 하에 가열되었다. 냉각 후 생성물은 1 N HCl로 산성화되었다. 침전물은 여과되고 물로 세척되어 선택적으로 (2'Z, 3'E) 형태로 대응 3'-옥심을 정량적으로 제공하였다. 생성물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산 : 메탄올 = 2 : 1)에 의해 정제되었다.

(2' Z , 3' E )-5'-메톡시-5-니트로-인디루빈-3'-옥심(16a)에 대한 데이터

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 11.82(1H, s, N-H), 9.46 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4), 9.33 (1H, s, N'-H), 8.12 (1H, dd, J = 8.4, 2.4 Hz, H-6), 7.77 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4'), 7.30 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 7.24 (1H, d, J = 9.2 Hz, H-7'), 6.85 (1H, dd, J = 7.8, 2.4 Hz, H-6'), 3.39 (3H, s, OCH₃). HRMS (ESI) [M-H]^- (C₁₇H₁₁N₄O₅): 계산 351.0729 관찰 351.0724. 순도 94%.

(2' Z , 3' E )-5'-메톡시-5-플루오로-인디루빈-3'-옥심(16b)에 대한 데이터

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 11.68 (1H, s, N-H), 9.22 (1H, s, N'-H), 8.44 (1H, m, H-4), 7.70 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4'), 7.21 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-6), 6.96 (2H, m, H-7, H-7'), 6.79 (1H, dd, J = 8.6, 2.4 Hz, H-6'), 3.26 (3H, s, OCH₃). HRMS (EI) [M]⁺ ^ㆍ (C₁₇H₁₂FN₃O₃): 계산 325.0863 관찰 325.0859.

(2' Z , 3' E )-5'-메톡시-5-트리플루오로메톡시-인디루빈-3'-옥심(16c)에 대한 데이터

¹H NMR (아세톤, 400 MHz, δ ppm, Hz 내 J) 11.70 (1H, s, N-H), 8.62 (1H, s, H-4), 8.28 (1H, s, N'-H), 7.90 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4'), 7.24 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6), 7.12 (1H, m, H-7'), 7.04 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 6.99 (1H, dd, J = 8.4, 2.4 Hz, H-6'), 3.33 (3H, s, OCH₃). HRMS (EI) [M]⁺ ^ㆍ (C₁₈H₁₂F₃N₃O₄): 계산 391.0780 관찰 391.0782.

(실시예 4) 분자 도킹

분자 도킹은 Discovery Studio 2.0(Accelrys) 상의 CHARMm-기반 분자 역학 도킹 알고리즘인 CDocker을 이용하여 수행하였다. 5-브로모-인디루빈과 동시-결정화된 CDK2 구조는 PDB 데이터 뱅크(PDB 코드: 2BHE)에서 수득되었다. 단백질 정화 과정 및 CHARMm-힘의 장이 연속적으로 적용되었다. 8 Å로 지정된 반경을 지닌 5-브로모-인디루빈 주변 영역이 활성 사이트로서 선택되었다. 복합체 구조에서 리간드를 제거한 후 3개 축 방향의 결합 구면이 활성 사이트 주변에 형성되었다. 모든 디폴트 파라미터가 도킹 과정에 사용되었다. CHARMm-기반 분자 역학(1,000 단계)가 무작위 리간드 11b 배좌를 생성시키는데 이용되었고 어떠한 리간드 11b의 위치는 견고한 몸체 회전 후 700K에서 모의 어닐링(annealing)을 이용하여 결합 사이트 내에 최적화되었다. 최종 에너지 최소화는 전체 전위 모드로서 조정되었다. 11b의 최종 결합 배좌는 기본 에너지 상에서 측정되었다. 리간드 2, 13b의 도킹 연구는 상기 기재된 바와 같이 수행되었다.

(실시예 5) 효소 분석

CDK1/사이클린 B, CDK2/사이클린 E는 Milipore(Billerica, MA)에서 구입하였다. 키나제 활성은 25 μM의 최종 반응 부피 내에 CDK1의 경우 45 μM [γ-³³P]ATP(500 cpm/pmol) 또는 CDK2의 경우 120 μM [γ-³³P]ATP(500 cpm/pmol)의 존재 하에 0.1 mg/mL 히스톤 H1과 함께 완충액(8 mM 3-(N-모폴리노)프로판술폰산(MOPS) pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 10 mM Mg아세테이트) 내에서 시험되었다. 반응은 MgATP 믹스의 첨가에 의해 개시되었다. 30℃에서 40분간 인큐베이션 후 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 정지되었다. 10 ㎕의 상청액이 2.5 cm x 3 cm 조각의 Whatman P30 포스포셀룰로스 종이 위에 떨어지고 20초 후 여과물은 75 mM 인산 내에서 5분간 3회 세척되고 건조 전 메탄올 내에서 1회 세척되었다. 여과물은 1 mL의 ACS(Amersham) 섬광 유체의 존재 하에 계측되었다. 활성은 일반적으로 저해제 부재시 최대 활성의 비율로 표기되었다. 대조군은 적당하게 희석되 DMSO로 적용되었다.

다양한 재조합 키니제(c-Met, Met M1250T, Ron, VEGF2, EGFR, TrkA, PI3Kγ, IKKβ, 인슐린 수용체, Aurora A)에 대한 키나제 활성 저해가 동질성 시간차 형광(homogeneous time-resolved fluorescence, HTRF) 분석을 이용하여 측정되었다. 간단하게 분석은 ATP의 존재 하에 펩타이드 기질의 인산화를 기반으로 한다.수득된 인산화 기질은 TR-FRET(시간차-형광 공명 에너지 전이(Time Resolved-Fluorescence Resonance Energy Transfer)) 신호에 의해 검출된다. 키나제 도메인을 포함하는 재조합 단백질은 Millipore(Billerica, MA)에서 구입하였다. 제조사 지침에 따라 HTRE KinEASE 키트(Cisbio)를 이용하여 각각의 효소에 대해 최적 효소, ATP 및 기질 농도가 수립되었다. 분석은 시리즈로 희석된 화합물과 혼합된 효소 및 키나제 반응 완충액(250 mM HEPES (pH 7.0), 0.5 mM 오소바나데이트(orthovanadate), 0.05% BSA, 0.1% NaN₃) 내의 펩타이드 기질로 구성된다. 검출을 위한 시약 첨가 후 TR-FRET 신호가 EnVision 멀티-표지 판독기(Perkin Elmer, Waltham, MA)를 이용하여 측정되었다.

(실시예 6) 세포 증식 분석

세포(A549, HT1080, HCT116, K562, SNU638, KB, MCF-7)가 계측되고 신선한 배지(MEME, DMEM 또는 10% FBS 함유 RPMI)로 5 x 10⁴ 세포수/mL로 희석되고 190 ㎕의 세포 현탁액을 다양한 농도의 시험 화합물(10% 수성 DMSO 내의 10 ㎕)을 포함한 96-웰 플레이트에 첨가시켰다. 시험 플레이트는 CO₂ 인큐베이터 내에 37℃로 3일간 인큐베이트되었다. 0일 대조군의 경우 세포는 CO₂ 인큐베이터 내에 37℃로 30분간 인큐베이트되었다. 모든 처리는 3반복으로 수행되었다. 인큐베이션 기간 후 세포는 50 ㎕의 냉각 50% TCA로 4℃에서 30분간 고정되었고 수돗물로 5회 세척되고 공기 건조되었다. 고정 세포는 실온에서 1시간 동안 아세트산 수용액 내 0.4% SRB 용액으로 염색되었다. 이후 유리 SRB 용액은 1% 아세트산으로 5회 세척함으로서 제거되었고 공기-건조되었다. 결합된 염료는 200 ㎕의 10 mM Tris-염기(pH 10.0)로 용해되었고, 흡광도는 ELISA 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 515 nm에서 측정되었다. 최종적으로 처리 과정 각각에서 수득된 흡광도 수치는 평균되었고, 0일 대조군에서 수득된 평균 수치가 공제되었다. 이들 결과는 용매 처리 대조군 인큐베이션에 대한 비율로 표기되었고, IC₅₀ 수치는 비-선형 회귀 분석을 이용하여 계산되었다(생존 퍼센트 대 농도).

(실시예 7) 종양 이종이식 동물 모델

k-ras-형질전환된 래트 신장 상피 세포주(RK3E-ras)는 10% FCS, 100 유니트/mL 페니실린 및 100 Ag/mL 스트렙토마이신으로 보충된 DMEM 내에 유지되었다. RK3E-ras 세포는 Dr. Eric Fearon(University of Michigan Medical School, Ann Arbor, MI)로부터 제공받았고 Kim, S.-A. et al., Clin. Cancer Res. 2007, 13, 253-259에 기재되어 있다. 숫컷 SD 래트(6주령)가 생체 내 종양 성장 저해를 조사하는데 이용되었다. RK3E-ras-Luc 세포(5 x 10⁶)는 0일째에 래트의 측복부의 피하 내로 이식되었고 래트는 5일째에 무작위로 집단화되었다(5마리 래트/그룹). PEG400, EtOH 및 DW(30:33:37, 3 mg/mL, 5 mg/kg) 혼합물 내 11b 용액은 격일로 총 5회 마취되지 않은 상태에서 정맥 내로 전달되었다. 동물은 최종 투여 48시간 후 살생되어 래트 체중 및 종양 부피가 측정되었다. 종양 성장 부피는 하기와 같이 계산되었다: V = (ab ²) / 2, a는 종양의 최장 직경이고, b는 최단 직경임. 모든 실험은 조선대학교 치과대학 동물실험윤리위원회에 의해 승인된 프로토콜 하에서 수행되었다.

(실시예 8) 생물발광 영상 분석

생물발광 영상을 위해 래트는 Rumpun/케타민(1:1) 마취되어 루시페린(Molecular Probes, Palo Alto, CA)이 i.p. 주입되었다. 래트는 LAS-1000 plus imaging System(Fuji film. Tokyo. Japan)을 이용하여 영상화되어 종양에서 발광되는 생물발광 신호를 기록하였다. CCD 카메라가 장착된 LAS-1000 시스템이 발광의 획득을 위해 사용되었고 Living Image 소프트웨어(Multi Gauge v3.0)가 데이터 분석에 이용되었다.

(실시예 10) 조직학, 면역조직화학 및 TUNEL 분석

절제된 고형 종양은 10% 완충 포르말린 내에 고정되고 파라핀 내에 포매되었다. 광학 현미경 조사를 위해 4-㎛ 절편화 조직은 H&E로 염색되었다. 면역조직화학 연색은 항-PCNA 항체를 이용한 아비딘-비오틴 복합체 방법으로 수행되었다. 면역 반응은 3,3'-디아미노벤지딘으로 시각화되고 Mayer의 헤마톡실린으로 대조염색되었다. TUNEL 분석은 제조사의 지침에 따라 ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection kit(Intergen, Purchase, NY)를 이용하여 수행되었다. 간단하게 슬라이드는 탈파라핀화되고 염색을 강화시키기 위해 37℃에서 15분간 20 ㎍/ml 프로티나제 K로 처리되었다. 내인성 과산화효소를 차단하기 위한 3% 과산화수소 내 침지 후 슬라이드는 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소를 함유한 반응 완충액 내에 37℃에서 1시간 동안 인큐베이트되었다. 이후 슬라이드는 과산화효소-컨쥬게이트된 항-디곡시제닌(digoxigenin) 항체와 함께 30분간 인큐베이트되었고, 반응 생성물은 2 mM 과산화수소를 함유한 0.03% 3,3'-디아미노벤지딘 용액으로 시각화되었다. 슬라이드는 0.5% 메틸 그린으로 대조염색되었다. PCNA 및 TUNEL-양성 세포가 계측되었고 단일 x200 시야 내에 5개 최대 면적의 평균으로서 표기되었다.

Claims

하기 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 사이클린-의존적 키나제 저해제로서 항암 활성을 지닌 인디루빈-3'-옥심 유도체 화합물

일반식 (Ⅰ)

상기 식에서 R₁은 F, Cl, OH 또는 CH₃이고,
R₂는 F, Cl 또는 NO₂이다.
제 1항에 있어서, 상기 일반식 (Ⅰ)의 유도체 화합물 중 R₁은 OH, R₂는 NO₂임을 특징으로 하는 항암 활성을 지닌 인디루빈-3'-옥심 유도체 화합물
제 1항에 있어서, 상기 일반식 (Ⅰ)의 유도체 화합물 중 R₁은 F, R₂는 NO₂임을 특징으로 하는 항암 활성을 지닌 인디루빈-3'-옥심 유도체 화합물
제 1항에 있어서, 상기 일반식 (Ⅰ)의 유도체 화합물 중
ⅰ) R₁은 OH, R₂는 Cl인 인디루빈-3'-옥심 유도체 화합물;
ⅱ) R₁은 OH, R₂는 F인 인디루빈-3'-옥심 유도체 화합물;
ⅲ) R₁은 Cl, R₂는 NO₂인 인디루빈-3'-옥심 유도체 화합물; 또는
ⅳ) R₁은 CH₃, R₂는 NO₂인 인디루빈-3'-옥심 유도체 화합물
임을 특징으로 하는 항암 활성을 지닌 인디루빈-3'-옥심 유도체 화합물
제 1항에 있어서, 상기 일반식 (Ⅰ)의 인디루빈-3'-옥심 유도체는 폐암 세포주, 섬유육종 세포주, 인간 결장암 세포주, 인간 백혈병 세포주, 인간 위암 세포주, 인간 비인두암 세포주 또는 인간 유방암 세포주에 항암 활성을 지님을 특징으로 하는 인디루빈-3'-옥심 유도체 화합물
유효 성분으로 제 1항의 인디루빈-3'-옥심 유도체 화합물을 함유하고 약제학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 항암제 조성물