KR20110090661A

KR20110090661A - 세포내 유전자 전달용 복합체, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 세포내로의 유전자 전달 방법

Info

Publication number: KR20110090661A
Application number: KR1020100010582A
Authority: KR
Inventors: 김원종; 손세진
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단; 전남대학교산학협력단
Priority date: 2010-02-04
Filing date: 2010-02-04
Publication date: 2011-08-10
Also published as: KR101183989B1

Abstract

본 발명은 세포내 유전자 전달용 복합체에 관한 것으로서, 생분해성 결합을 포함하는 양이온성 고분자 및 암 표적 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 세포내 유전자 전달용 복합체는, 암세포를 표적으로 하여 안전하고 효율적인 유전자의 전달이 가능하므로 다양한 유전자를 이용한 암 치료에 이용될 수 있다.

Description

세포내 유전자 전달용 복합체, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 세포내로의 유전자 전달 방법{Composite for delivering a gene into a cell, preparation method thereof, and method of delivering a gene into a cell using same}

본 발명은 세포내 유전자 전달용 복합체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 암세포를 표적으로 하는 세포내 유전자 전달용 복합체, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 세포내로의 유전자 전달 방법에 관한 것이다.

유전자 치료는 질병을 유발하는 유전자를 대신할 수 있는 정상 유전자를 외부로부터 도입함으로써 유전자가 본래의 기능을 발휘할 수 있도록 하는 것을 말한다. 여기에는 본래 결핍되어 있는 유전자를 외부로부터 도입함으로써 목적하는 단백질의 발현을 유도하거나, 발현 억제 유전자 등을 이용해서 특정 단백질의 발현을 억제시키는 방법이 있다. 근래에는 유전적 질환뿐만 아니라, 암, 에이즈, 심혈관계 질환, 자가면역질환 등 다양한 후천성 질환의 치료와 예방을 위하여 유용하게 사용될 것으로 전망되고 있다.

상기 유전자 치료는 일반적인 약물에 의한 치료에 비해서 우수한 선택성을 가질 수 있고 다른 치료법으로는 조절하기 힘든 질병의 치료율 및 치료 속도를 개선하여 오랜 기간 동안 적용할 수 있다. 이러한 유전자 치료는 질병의 증상을 치료하는 것이 아니고 질병의 원인을 치료하여 제거하는 방식이다. 따라서, 이러한 유전자 치료를 효과적으로 하기 위해서는 치료 유전자를 원하는 표적 세포로 전달하여 높은 발현 효율을 얻을 수 있는 유전자 전달 기술을 개발하는 것이 필요하다. 그러나, 거대분자인 DNA, RNA 등을 수용액 상태로 세포내로 전달하는 경우 특정효소에 의해 급속하게 분해되고 세포전달률이 낮아, 이를 효율적으로 전달하는 기술개발을 위한 노력이 지속되고 있다.

유전자를 시험관내 또는 생체내의 세포로 전달하는 방법에는 레트로바이러스, 아데노바이러스 등을 이용하는 바이러스성 벡터법과 지질, 고분자, 전기충격법 등을 이용하는 비바이러스성 벡터법이 포함된다. 바이러스성 벡터는 비바이러스성 벡터에 비하여 유전자 전달 효율이 높은 반면, 체내 적용 시 벡터 자체가 유발하는 면역반응이나 암 유발 등이 문제가 되며, 벡터에 삽입할 수 있는 유전자의 크기에도 제한이 있다. 비바이러스성 벡터는 바이러스성 벡터에 의한 생물학적 위험성이 낮고, 비면역원성이며, 변형 및 대량생산이 가능하고, 전달할 수 있는 유전자의 크기에도 비교적 제한이 없다는 장점 때문에 최근 많은 연구가 이루어지고 있다. 그러나, 비바이러스성 벡터는 바이러스성 벡터에 비해 유전자 전달 효율이 현저히 낮기 때문에, 비바이러스성 벡터의 광범위한 적용을 위해서는 상기의 단점을 극복한 비바이러스성 벡터의 제공 및 확보가 요구되고 있다.

또한, 치료 유전자를 원하는 곳까지 안전하게 전달하는 유전자 전달체 또한 필요하다. 최근의 항암 요법은 1 세대의 화학 치료 요법의 문제점이 드러남에 따라 새로운 치료 요법이나 화학 요법의 단점 극복에 관한 연구 개발을 필요로 하고 있다. 1 세대 화학 치료 요법의 가장 큰 문제점은 화합물의 세포 전달 효율이 낮다는 점과 일단 생체내 안정성과 세포 전달 효율이 높아지더라도 암세포와 정상세포를 구별하지 않은 무차별적인 세포 사멸 기작 때문에 정상 조직에까지 잠재적 독성을 나타내는 점의 두 가지로 요약될 수 있다. 따라서, 유전자의 세포 전달 효율이 높으면서도 치료 유전자를 표적 세포에 선택적으로 전달할 수 있는, 고효율의 세포특이적 유전자 전달체가 요구되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 암세포를 표적으로 하는 세포내 유전자 전달용 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 세포내 유전자 전달용 복합체의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 세포내 유전자 전달용 복합체를 이용한 세포내로의 유전자 전달 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 양이온성 고분자 및 암 표적 물질을 포함하고, 양이온성 고분자가 에스테르 결합, 아마이드 결합, 이황화 결합, 인산염 결합 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 생분해성 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포내 유전자 전달용 복합체를 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 폴리에틸렌글리콜을 이용하여 양이온성 고분자에 암 표적 물질을 컨쥬게이션하여 제조하는 것을 특징으로 하는, 상기 세포내 유전자 전달용 복합체의 제조 방법을 제공한다.

상기 또다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 세포내 유전자 전달용 복합체와 유전자를 혼합한 용액을 세포에 처리하는 것을 포함하는, 세포내로의 유전자 전달 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 생분해성 양이온성 고분자 및 암 표적 물질을 포함하는 세포내 유전자 전달용 복합체를 이용함으로써, 유전자를 암세포에 선택적으로 전달할 수 있을 뿐 아니라 세포 내부에서의 분해가 가능하게 되었다. 따라서, 본 발명의 세포내 유전자 전달용 복합체를 다양한 유전자를 이용한 질병 치료에 이용함으로써, 정상세포로 유입되는 치료 유전자의 양을 최소화시킴과 동시에 세포 내부에서 분해되는 성질을 이용하여 독성을 최소화할 수 있으며, 체내로 투여된 치료 유전자의 이용률을 극대화시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 환원가능형 폴리에틸렌이민의 제조를 보여주는 도식이다.
도 2는 본 발명의 NGR 펩타이드가 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민(cNGR-5X)의 제조를 보여주는 도식이다.
도 3은 N/P 비에 따른 bPEI1.2K/pCMV-Luc 복합체 및 cNGR-5X/pCMV-Luc 복합체가 형성되는 정도를 전기영동법으로 관찰한 사진이다.
도 4는 bPEI1.2K/pCMV-Luc 복합체, bPEI25K/pCMV-Luc 복합체, 5X/pCMV-Luc 복합체 및 cNGR-5X/pCMV-Luc 복합체의 크기 및 표면 전위를 나타낸 그래프이다.
도 5는 DTT를 처리한 후 cNGR-5X/pCMV-Luc 복합체의 입자 크기를 나타낸 그래프이다.
도 6은 DTT를 처리한 후 5X/pCMV-Luc 복합체의 전기영동 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 HT1080 세포에서 bPEI25K/pCMV-Luc 복합체, bPEI1.2K/pCMV-Luc 복합체5X/pCMV-Luc 복합체 및 cNGR-5X/pCMV-Luc 세포 독성 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 MDA-MB-231 세포(CD13-)와 B16F1 세포(CD13+)로 형광 표지한 cNGR-5X(녹색)/pCMV-Luc(적색)이 유입되는 정도를 나타낸 사진이다.
도 9는 fcNGR로 CD13 리셉터를 경유한 세포 유입경로를 차단한 이후에 MDA-MB-231 세포(CD13-)와 B16F1 세포(CD13+)에서의 유전자 발현 효율을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 양이온성 고분자 및 암 표적 물질을 포함하고, 양이온성 고분자가 에스테르 결합, 아마이드 결합, 이황화 결합, 인산염 결합 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 생분해성 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포내 유전자 전달용 복합체를 제공한다.

유전자는 음이온으로 대전된 거대한 고분자 사슬의 형태로 존재하므로 유전자 단독으로 존재할 때는 비교적 부피가 큰 랜덤코일의 형태를 띠고 있어 유전자의 세포내로의 전달이 어렵고, 크기가 작은 나노입자의 형태로 만들어 주어야 한다. 이를 위해, 고분자를 이용한 여러 가지 유전자 전달체 중에서도 유전자와 정전상호작용을 통해 나노크기의 복합체를 형성할 수 있는 양이온성 고분자를 사용할 수 있다.

생분해성 결합은 용해화 가수분해(solubilization hydrolysis), 또는 효소 또는 생물체 등의 작용에 의해 덜 복잡한 중간 물질 또는 최종 산물로의 전환이 가능한 결합을 말한다. 본 발명의 양이온성 고분자는 에스테르 결합, 아마이드 결합, 이황화 결합, 인산염 결합 또는 이들의 조합을 포함하며, 이러한 결합을 포함하는 고분자는 생체내로 유입시 저분자로 분해될 수 있다. 예컨대, 이황화 결합으로 연결된 양이온성 고분자 유전자 전달체는 세포내로 유입되면 저분자로 끊어져서 유전자를 유리시킬 수 있게 된다.

본 발명의 양이온성 고분자로서는 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리-L-라이신(PLL), 키토산, 덴드리머 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

폴리에틸렌이민은 유전자 전달 효율이 높은 전달체 중의 하나로서, 그 모양에 따라 가지형(branched)과 직선형(linear)으로 나눌 수 있으며, 다양한 분자량으로 합성이 가능하고, 가지형의 경우 분지율에 따라 다양한 형태와 기능을 가진 전달체로 응용할 수 있다. 상기 양이온성 고분자로는 가지형 폴리에틸렌이민(bPEI)이 특히 바람직하다.

폴리-L-라이신은 다양한 크기의 분자량으로 합성될 수 있다. 폴리-L-라이신은 생분해성인 펩타이드 결합으로 연결되어 있기 때문에 in vivo에 응용될 수 있으며 유전자와 나노복합체를 형성해서 세포내로 전달될 수 있다. 그러나, 폴리-L-라이신은 어느 정도의 독성도 나타내므로 단독으로 높은 전달 효율을 나타내는 데에는 한계가 있고, 이를 극복하기 위해 엔도좀 파괴 물질이나 엔도좀 융합펩타이드 등을 부착시킴으로써 높은 전달 효율을 나타낼 수 있다.

키토산은 글루코사민(glucosamine)의 피라노스(pyranose) 단위체가 β-1,4 결합된 것으로서, 글루코사민 잔기가 5,000 개 이상 결합되어 있고 분자량이 100만 이상이다. 다가의 양이온을 가진 다당류 계열의 생체고분자물질로 게나 새우와 같은 갑각류의 껍질 및 오징어를 포함하는 수산계로부터 추출할 수 있으며, 그 분자 구조로 볼 때 다당류의 일종인 셀룰로오스와 유사한 구조로서, 생체 친화성이 우수하여 면역 반응시 거부 반응이 일어나지 않는다. 특히, 20,000 ∼ 100,000 이내의 특정 분자량의 범위를 가진 키토산은 강한 생리활성 기능을 띠고 있는 것으로 알려져 있다.

덴드리머는 중심분자로부터 가지모양의 단위구조가 반복적으로 뻗어 나오는 거대분자 화합물을 말하며 입체적으로는 구형에 가까운 구조를 가지고 있다. 덴드리머는 구조상 말단에 작용기가 많이 존재함으로써 세포 특이적 물질이나 핵막 통과를 돕는 펩타이드, 또는 엔도좀 탈출을 돕는 물질의 부착이 용이하다.

본 발명의 암 표적 물질로서는 RGD 펩타이드, NGR 펩타이드, 트랜스페린(transferrin) 및 엽산(folate) 등이 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 암은 구체적으로 대장암, 위암, 폐암, 간암, 자궁암, 유방암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

암세포는 정상세포와 달리 혈관의 생성을 촉진하는 여러 가지 인자들을 세포 주위로 분비한다. 이러한 혈관생성 촉진인자들은 주위의 혈관을 자극하여 암세포를 향해 새로운 혈관들을 형성하게 하고, 암세포들은 형성된 혈관을 통해 여러 가지 영양분, 산소 등을 공급받아 지속적으로 증식하며 전이한다. 혈관생성 촉진인자들의 자극을 받은 암세포 주위의 혈관신생내피세포의 표면에는 인테그린(Integrin), 아미노펩티다아제 N(APN) 수용체(CD13) 등이 다량으로 발현되어 있는데, 각각 RGD 펩타이드 및 NGR 펩타이드와 특이작용을 하는 것으로 알려져 있다. 한편, 암세포에는 트랜스페린과 엽산 수용체도 다량으로 존재한다.

본 발명의 세포내 유전자 전달용 복합체는, 양이온성 고분자가 이황화 결합을 포함하고, 상기 암 표적 물질이 NGR 펩타이드인 것이 바람직하다.

본 발명의 복합체가 전달하는 유전자는 DNA와 RNA 및 이들의 합성동종체를 포괄한다. 이의 예로서는 gDNA, cDNA, pDNA, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, 안티센스뉴클레오티드 등을 들 수 있다. 이들은 자연에 존재하거나 합성될 수 있으며, 크기에 있어서 올리고뉴클레오티드에서 크로모좀까지 다양한 크기로 존재할 수 있다. 이들 유전자는 인간, 동물, 식물, 박테리아, 바이러스 등으로부터 기원된다. 이들은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 획득될 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 세포내 유전자 전달용 복합체를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 세포내 유전자 전달용 복합체는 폴리에틸렌글리콜을 이용하여 양이온성 고분자에 암 표적 물질을 컨쥬게이션하여 제조할 수 있다. 본 발명의 암 표적 물질은 양이온성 고분자에 비펩타이드성 중합체로 연결될 수 있는데, 본 발명에 사용가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜과 프로필렌글리콜의 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 친수성의 폴리에틸렌글리콜이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명은 상기 세포내 유전자 전달용 복합체를 이용한, 세포내로의 유전자 전달 방법을 제공한다. 즉, 상기 세포내 유전자 전달용 복합체와 유전자를 혼합한 용액을 세포에 처리하여 유전자를 세포내로 전달할 수 있다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

{ 실시예 }

<시약 및 시료>

이황화 결합으로 펩타이드의 말단을 환형으로 공유결합시키고 한쪽 말단에 형광체인 FITC를 표지한 환형 NGR인 FITC-aca-CNGRCK(이하, "cNGR"이라 함)를 애니젠(Anygen; 대한민국)에서 구매하였고, 이를 NGR 펩타이드로서 사용하였다. bPEI(MW 1.2K, 25K)는 Polyscience, Inc.(Warrington, PA)에서 구입하였고, 투석막(Dialysis membrane, MWCO 3,500 Da)은 Spectrum Laboratories(Rancho Dominguez, CA)에서 구입하였다.

실시예 1: 폴리에틸렌이민의 제조

저분자량(MW 1,200 Da)의 가지형 폴리에틸렌이민(bPEI1.2K)(1 g)을 증류수에 녹이고 pH를 7.2로 맞춘 후 이틀 동안 동결건조시켰다. 동결건조한 노란색 고체 물질(1 g)을 30 ml의 메탄올에 녹인 후 둥근 플라스크에 넣고 질소 채움 조건과 진공 조건을 5 내지 6 번 반복하였다. 여기에 각각 5, 10 과량의 몰수의 프로필렌 설파이드(propylene sulfide)를 넣고, 온도를 60 ℃로 유지시킨 채 24 시간 동안 반응시키고, 차가운 디에틸에터(diethyl ether)에 세 번 침전시킨 후, 진공 오븐에서 1일 동안 잔여 용매를 제거하여 싸이올화된 bPEI1.2K (thiolated bPEI1.2K)를 합성하였다(도 1 참조). 합성된 싸이올화된 bPEI1.2K를 "5X"라 명명하였다.

실시예 2: NGR 펩타이드가 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민의 제조

cNGR(2.4 mg, 1.4 μmol)과 1.2 배 과량 몰수의 α-(말레이미드-ω-N-하이드록시석신이미드 에스터 폴리(에틸렌 글리콜))(MAL-PEG5K-NHS; MW 5,000 Da; NOF corporation, NY)을 10 ml의 무수(anhydrous) DMSO에 녹여 2 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응물을 실시예 1의 싸이올화된 bPEI1.2K(5X)가 포함된 DMSO(50 ml) 용액에 섞은 후, 48 시간 동안 상온에서 반응시키고, 투석하여(MWCO 5,000 Da) 동결건조시켰다(도 2 참조). 생성된 NGR 펩타이드가 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민을 "cNGR-5X"라 명명하였다.

실시예 3: pCMV - Luc 의 제조

pCMV-Luc은 pcDNA3(Invitrogen; Carlsbad, CA, USA)의 HindIII/XbaI 부위에 pGL3-control 벡터(Promega; Madison, WI, USA)로부터 얻은 HindIII/XbaI 반딧불이(firefly) 루시퍼라아제(luciferase) cDNA 단편(fragment)을 삽입하여 제조하였으며, 그 제조 방법은 문헌[Nomura, T. et al. Gene Therapy, 6, 121-129 (1999)]에 기재되어 있다.

pCMV-Luc을, 화학적으로 만든 DH5R 스트레인(chemically competent DH5R strain; Gibco BRL)에서 증식시키고, 밤새 배양하여, 알칼리 용해(alkaline lysis) 및 컬럼 정제(Qiagen plasmid Maxi kit; Qiagen, Valencia, CA)를 통하여 얻었다. pCMV-Luc 용액의 농도는 260 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였고, 이의 260 내지 280nm에서의 OD 값이 1.8 내지 1.9의 범위에 있도록 하였다.

실시예 4: cNGR -5X/ pCMV - Luc 복합체의 제조

양이온성 고분자(cNGR-5X)와 유전자(pCMV-Luc)의 배합비율, 양이온성 고분자의 질소원자와 유전자의 인산염원자의 비(이하, "N/P 비")를 1, 2, 3, 4, 5 및 10으로 달리한 용액(20 μl; 200 ng, 10 μl의 pCMV-Luc과 10 μl의 cNGR-5X를 배합) 각각을 15 분 동안 상온에서 반응시켜 "cNGR-5X/pCMV-Luc 복합체"라 명명하였다. 1:6으로 희석된 로딩 다이(loading dye) 2 μl를 10 μl의 상기 반응물 용액에 넣은 후, 0.5 g/ml의 브롬화에티듐(EtBr)을 함유한 TBE 완충액(4.45 mM Tris-base, 1 mM sodium EDTA, 4.45 mM 보론산, pH 8.3)상에서 전기영동을 실시하여 cNGR-5X가 효과적으로 pCMV-Luc와 복합체를 형성하는지 관찰하였다(도 3 참조).

비교예 1 내지 3: 양이온성 고분자/유전자 복합체의 제조

cNGR-5X 대신 bPEI1.2K, bPEI25K 및 5X를 사용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일하게 실시하여 양이온성 고분자/유전자 복합체를 제조하고(표 1 참조), bPEI1.2K/pCMV-Luc 복합체 및 5X/pCMV-Luc 복합체의 전기영동 결과를 도 3에 나타내었다.

구성성분 비교

복합체	양이온성 고분자 (이황화결합 유무)	암 표적 물질
본 발명 (cNGR-5X/pCMV-Luc)	bPEI1.2K (O)	O (cNGR)
비교예 1 (bPEI1.2K/pCMV-Luc)	bPEI1.2K (X)	X
비교예 2 (bPEK25K/pCMV-Luc)	bPEI25K (X)	X
비교예 3 (5X/pCMV-Luc)	bPEI1.2K (O)	X

그 결과, 도 3에서 나타낸 바와 같이, 비교예 1의 저분자량의 bPEI1.2K/pCMV-Luc 복합체의 경우 양이온성 고분자의 양이 높은 비율로 존재하는 경우(N/P 비=10)에서 DNA 밴드가 관찰되지 않는 반면, 본 발명의 cNGR-5X/pCMV-Luc 복합체는 N/P 비가 5 이상일 때부터 DNA 밴드가 관찰되지 않는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해, 본 발명의 복합체는 저분자량의 고분자를 포함한 복합체에 비해 더욱 효과적으로 유전자와 상호작용하여 완전한 복합체를 형성함을 알 수 있다.

실험예 1: 양이온성 고분자/유전자 복합체의 물리화학적 성질

형성된 양이온성 고분자/유전자 복합체의 물리화학적 성질을 평가하기 위하여 실시예 4 및 비교예 1 내지 3에서 제조한 cNGR-5X/pCMV-Luc 복합체, bPEI1.2K/pCMV-Luc 복합체, bPEI25K/pCMV-Luc 복합체, 5X/pCMV-Luc 복합체의 크기 및 표면 전하량을 측정하였다. pCMV-Luc(3 ㎍)을 cNGR-5X, bPEI1.2K, bPEI25K 및 5X 각각과 N/P 비가 1, 2, 3, 4, 5, 10 및 15가 되도록 하여 양이온성 고분자/유전자 복합체를 DPBS(1 ml)에 가하고 Malvern 4700 submicron particle analyser system과 Zetasizer^®S(Malvern Instruments, UK)를 이용하여 크기와 표면 전하량을 각각 측정하였다(도 4 참조).

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 cNGR-5X/pCMV-Luc 복합체의 경우 저분자량의 고분자(bPEI1.2K)를 포함한 복합체와 비교하여 크기가 작고, 표면 전위가 0에 가까운 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 본 발명의 복합체가 효과적으로 유전자와 결합하여 응축되고, 표면 전위가 중성에 가까워 체내에서의 안정성이 매우 높을 것임을 알 수 있다.

실험예 2: cNGR -5X/ pCMV - Luc , 5X/ pCMV - Luc 복합체의 환원가능한 성질의 평가

합성된 이황화결합을 포함하는 고분자가 복합체를 형성한 후에도 환원제인 DTT에 의하여 효과적으로 분해되고, 유전자를 방출할 수 있는지 알아보기 위하여 실시예 4의 전기영동법을 통하여 분석하였다. 먼저, cNGR-5X/pCMV-Luc 복합체에 DTT를 처리한 후(37 ℃, 5 mM, 5 μM), 시간에 따른 입자 크기의 변화를 측정하였다(도 5 참조). 또한, 비교예 3에서 제조한 N/P 비가 5인 5X/pCMV-Luc 복합체를 DTT(25 mM, 1 시간, 37 ℃)로 처리한 후, SDS(0.5M)하에서 전기영동을 실시하였다(도 6 참조).

그 결과, 도 5 및 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 cNGR-5X/pCMV-Luc 복합체 및 비교예 3의 5X/pCMV-Luc 복합체에 고농도의 DTT를 처리한 경우, 입자의 크기가 증가하고 유전자와 분리됨을 확인하였다. 이러한 결과를 통해, 상기 복합체들이 DTT에 의해 환원되어 유전자와의 결합력이 약해졌음을 알 수 있다.

실험예 3: cNGR -5X/ pCMV - Luc 복합체의 세포 독성 평가 - 세포 생존율 분석( MTT 분석 방법)

생성된 cNGR-5X/pCMV-Luc 복합체가 세포에 미치는 독성을 MTT 분석 방법을 이용하여 평가하였다. MTT 분석 방법은 살아있는 세포의 미토콘드리아 탈수소 효소작용(dehydrogenases)에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 자주색을 띄는 비수용성의 MTT-포마잔(formazan) 결정으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법으로서, 신속하고 정확하게 많은 양의 세포 증식 거동을 측정할 수 있다.

HT1080 세포(KCLB10121)를 96-웰 플레이트에서 농도 1 x 10⁴ cells/웰로 24 시간 동안 배양하였다. pCMV-Luc(0.2 ㎍/㎕)을 cNGR-5X, bPEI1.2K, bPEI25K 및 5X 각각과 N/P 비가 5, 10, 20 및 40이 되도록 하여 사용 전 30분 동안 착물을 형성시켰다. 형성된 착물을 100 ㎕의 혈청 없는 배양액(serum-free medium)과 함께 HT1080 세포에 처리하고 4 시간 후 배양액을 200 ㎕ 의 10% 혈청이 포함된 배양액으로 교체하여 20 시간 동안 세포를 배양하였다. 그 후 MTT 용액(20 ㎕, 5 mg/mL)을 투입하고, 세포를 4 시간 동안 더 배양하고 매질을 제거한 후, 150 ㎕ DMSO를 각 웰에 투입하여, 세포와의 반응을 통해 형성된 자주색 포마잔 결정을 용해시켰다. 각 웰에서 100 ㎕를 분취하여 준비해 둔 96-웰 플레이트로 옮겼다. 570 nm 에서 마이크로플레이트 스펙트로플로로미터(microplate spectrofluorometer; VICTOR 3 V Multilabel Counter, Perkin Elmer Wellesley, MA, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 시료를 처리하지 않은 HT1080 세포에 대한 활성을 100%로 하여 상대적인 생존율을 평가하였다(도 7 참조).

그 결과, 도 7에서 나타낸 바와 같이, 고분자량의 bPEI를 포함한 복합체가 세포에 심각한 독성을 유발하는 데 비해, 본 발명의 cNGR-5X/pCMV-Luc 복합체는 세포에 독성을 거의 유발하지 않음을 알 수 있다.

실험예 4: cNGR -5X/ pCMV - Luc 복합체의 표적 지향성 평가

cNGR-5X/pCMV-Luc 복합체에 의한 CD13에 대한 표적 지향성을 형광현미경법과 유전자 발현 효율의 측정을 통하여 평가하였다. CD13을 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포(KCLB30026)와 CD13을 과발현하는 B16F1 세포(KCLB80007)에서 복합체가 세포 내부로 유입되는 양을 형광현미경법으로 가시화하였다(도 8 참조).

또한, 자유 cNGR(fcNGR)로 CD13 리셉터를 경유한 세포 유입경로를 차단시킨 후에 cNGR-5X/pCMV-Luc 복합체를 처리하여 하기의 방법으로 pCMV-Luc이 암호화하는 루시퍼라아제가 발현된 정도를 비교하여 유전자 발현 효율의 감소량을 측정하였다(도 9 참조).

MDA-MB-231 세포를 24-웰 플레이트에서 농도 4 x 10⁴ cells/웰로 24 시간 동안 배양하였다. pCMV-Luc(0.1 ㎍/㎕, 1 ㎍)을 cNGR-5X와 N/P 비가 15가 되도록 하여 사용 전 30분 동안 착물을 형성시켰다. 형성된 착물을 250 ㎕의 혈청 없는 배양액과 함께 세포에 처리하고 15 분 동안 배양하였다. 이후 배양액을 500 ㎕ 의 10% 혈청이 포함된 배양액으로 교체하여 24 시간 동안 세포를 배양하였다. 배양액을 제거하고 200 ㎕/웰의 용해 완충액(lysis buffer)을 처리하여 세포를 분해시켰다. 루시퍼라아제 유전자 발현을 마이크로플레이트 스펙트로플로로미터를 이용하여 측정하였다. 상기와 같은 방법으로 B16F1 세포에서 cNGR-5X/pCMV-Luc 복합체의 유전자 전달 효율을 평가하였다.

그 결과, 도 8에서 나타낸 바와 같이, CD13이 발현된 B16F1 세포에만 녹색 및 적색의 형광이 나타남을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 cNGR-5X/pCMV-Luc 복합체는 표면의 cNGR 리간드와 표적 세포에서 발현되는 CD13과의 효과적인 상호작용으로 암세포 내부로 표적 지향화하여 세포 내부로 전달됨을 알 수 있다.

또한, 도 9에서 나타낸 바와 같이, CD13이 발현된 B16F1 세포에서는 fcNGR를 처리한 경우, 처리 농도에 관계없이 유전자 발현효율이 약 8 배 감소한 반면, CD13이 발현되지 않은 MDA-MB-231 세포의 경우에는 fcNGR을 고농도로 처리한 경우에서도 유전자 발현효율이 감소하지 않았다. 이러한 결과를 통해, cNGR-5X/pCMV-Luc 복합체가 표적 세포에 선택적으로 유전자를 전달하여 유전자 발현 효율에 영향을 주었음을 알 수 있다.

Claims

양이온성 고분자 및 암 표적 물질을 포함하고,
상기 양이온성 고분자가 에스테르 결합, 아마이드 결합, 이황화 결합, 인산염 결합 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 생분해성 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포내 유전자 전달용 복합체.
제 1 항에 있어서,
상기 양이온성 고분자가 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리-L-라이신(PLL), 키토산 및 덴드리머로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포내 유전자 전달용 복합체.
제 1 항에 있어서,
상기 암 표적 물질이 RGD 펩타이드, NGR 펩타이드, 트랜스페린(transferrin) 및 엽산(folate)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포내 유전자 전달용 복합체.
제 1 항에 있어서,
상기 양이온성 고분자가 이황화 결합을 포함하고, 상기 암 표적 물질이 NGR 펩타이드인 것을 특징으로 하는 복합체.
제 1 항에 있어서,
상기 유전자가 gDNA, cDNA, pDNA, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, 안티센스뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포내 유전자 전달용 복합체.
폴리에틸렌글리콜을 이용하여 양이온성 고분자에 암 표적 물질을 컨쥬게이션하여 제조하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항에 따른 세포내 유전자 전달용 복합체의 제조 방법.
제 1 항에 따른 세포내 유전자 전달용 복합체와 유전자를 혼합한 용액을 세포에 처리하는 것을 포함하는, 세포내로의 유전자 전달 방법.