KR20110085231A

KR20110085231A - 줄기세포성 유지 또는 줄기세포 분화를 위한 줄기세포 배양용 조성물

Info

Publication number: KR20110085231A
Application number: KR1020100004899A
Authority: KR
Inventors: 황동연; 윤태민
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2010-01-19
Filing date: 2010-01-19
Publication date: 2011-07-27
Also published as: KR101133553B1

Abstract

본 발명은 기본배지에 프로틴 키나아제 C(Protein Kinase C)의 저해제(inhibitor)를 포함하는 줄기세포성 유지용 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 기본배지에 프로틴 키나아제 C(Protein Kinase C)의 활성화제(activator)를 포함하는 줄기세포 분화 유도용 배지 조성물에 대한 것이다. 상기 배지 조성물을 이용하여 줄기세포의 특성을 유지하면서 줄기세포를 배양하거나 줄기세포의 분화를 유도할 수 있다.

Description

줄기세포성 유지 또는 줄기세포 분화를 위한 줄기세포 배양용 조성물 {COMPONENTS OF STEM CELL CULTURE MEDIA FOR EITHER MAINTAINING STEMNESS OR INDUCING DIFFERENTIATION OF STEM CELLS}

본 발명은 줄기세포 배양과 줄기세포 분화유도에 이용하는 배지 조성물 및 배양 방법에 대한 것이다.

줄기세포란 특정한 세포로 분화가 진행되지 않은 채 유지되다가, 필요한 경우 신경, 혈액, 연골 등 생물체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 능력을 가진 세포를 말한다.

이러한 줄기세포를 얻을 수 있는 방법은 크게 두 가지가 있다. 첫째는 수정란으로부터 발생한 배아로부터 얻는 것(배아줄기세포)이고, 둘째는 성인이 된 몸의 각 부분에 간직되어 있는 줄기세포(성체줄기세포)를 회수하는 것이다. 기능적인 면에서 차이는 있지만 배아줄기세포나 성체줄기세포는 모두 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 특징을 가지고 있다.

인간 배아줄기세포는 우리 몸의 모든 세포를 생성할 수 있는 능력이 있는 만능분화능(pluripotency)를 가졌으며, 자기와 닮은 세포들을 무한정 만들어 낼 수 있는 자기재생(self-renewal) 능력이 있다. 이 두 가지 성질을 합하여 "줄기세포성(stemness)"이라고 부른다.

현재 인간 배아줄기세포의 줄기세포성 유지에 관여하는 몇 가지의 신호전달체계가 밝혀져 있다. 그 대표적인 것들이 FGF(Fibroblast Growth Factor) 신호전달체계(signaling pathway)와 TGF-Beta(Transforming Growth Factor-Beta)/Activin 신호전달체계라고 할 수 있다. 또한 Oct4(Octamer Binding Transcription Factor-4), Nanog, Sox2(SRY(Sex Determining Region-Y) Box-2)들과 같은 세포질 내에 존재하는 전사인자들도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Biswas A, Hutchins R., Stem Cells Dev. 2007(2), 213-22; Darr H, Benvenisty N., Regen Med. 2006(3), 317-25).

이와 관련하여 이들 신호전달체계의 구성요소들인 SMAD 2/3(Sma and MAD(Mothers Against Decapentaplegic) Related Protein-2/3), ALK4(Activin Receptor-Like Kinase-4), ALK5(Activin Receptor-Like Kinase-5), ALK7(Activin Receptor-Like Kinase-7), Nodal, Cripto, LEFTY1(Left-right determination factor-1)와 LEFTY2(Left-right determination factor-2)도 인간 배아줄기세포의 줄기세포성 유지에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 밝혀졌다(Xiao L, Yuan X, Sharkis SJ., Stem Cells. 2006(6), 1476-1486; Besser D.,J Biol Chem. 2004(43), 45076-45084; 및 James D, Levine AJ, Besser D, Hemmati-Brivanlou A., Development. 2005, 132(6), 1273-1282).

이와 더불어 WNTs(Wingless-Type MMTV Integration Site Family Members) 단백질들과 WNT 신호전달체계도 인간 배아줄기세포의 줄기세포성 유지에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 밝혀졌다. 이 신호전달체계의 구성요소인 GSK-3b(Glycogen Synthase Kinase-3b)의 활성 억제와 이에 따른 베타 카테닌(beta-catenin)의 증가가 중요한 역할을 하고 있음이 보고되었다 (Miyabayashi T, et . al, Proc Natl Acad Sci USA. 2007, 104(13), 5668-5773).

또한 S1P(Sphingosine-1-Phosphate)도 EDG(Endothelial Differentiation Gene) 수용체 및 이와 연계된 G-단백질을 통하거나, 또는 PDGF(Platelet Derived-Growth Factor)를 통한 신호 전달 체계에 의해서 줄기세포성 유지에 관여함이 보고되었다(Chase LG, Firpo MT., Curr Opin Chem Biol. 2007(4), 367-372; 및 Inniss K, Moore H., Stem Cells Dev. 2006(6), 789-796. ).

줄기세포, 특히 인간 배아줄기세포를 배양하기 위해 현재 통상적으로 사용하고 있는 방법은, 생쥐 배아섬유아세포(mouse embryonic fibroblast)를 피더(feeder) 세포로 이용한 공배양(co-culture)이다. 이는 인간 배아줄기세포의 줄기세포성을 유지하면서 배양하기 위하여 필요한 인자들을 피더 세포가 공급해 주는 방식이다. 현재까지는 피더 세포에서 제공되는 어떤 인자들이 인간 배아줄기세포의 줄기세포성 유지에 중요한 지에 대해 구체적으로 알려진 바가 없다.

생쥐 배아섬유아세포를 이용한 공배양을 통해 배양된 인간 배아줄기세포는 임상에 이용하는 데 어려움이 많다. 왜냐하면 이종 간의 감염물질(xenogen)에 의한 전염 가능성이 존재하기 때문이다. 따라서 피더 세포가 없는 상태에서 인간 배아줄기세포를 배양하고자 하는 시도가 이루어지고 있다. 그러나 현재까지는 동물 유래 물질들이 완전히 제거된 피더-프리(feeder-free) 배양용 배지와 배양 용기의 코팅 물질(extracellular matrix)을 이용하여, 장기간 안정적으로 인간 배아줄기세포들을 배양하는 방법이 확립되지 못하고 있다.

따라서 현재 해결해야 할 가장 중요한 사항은, 피더 세포를 사용하지 않으면서 인간 배아줄기세포를 장기간 배양할 수 있는, 동물 유래물질이 포함되어 있지 않은 배지를 만드는 것이다. 이를 위해서는 인간 배아줄기세포의 줄기세포성에 관여하는 신호전달체계와 리간드 물질 등을 발굴해 내고 줄기세포성 유지 기작을 폭넓게 이해하는 것이 중요하다고 할 수 있다.

하지만 아직까지 밝혀지지 않은 줄기세포성 유지에 중요한 신호전달체계 및 리간드들이 존재하는 것으로 생각된다. 이에 본 발명의 발명자들은 줄기세포성 유지에 관여하는 신호전달체계에 관여하는 물질을 찾아내기 위해 연구를 계속하였다. 또한 이와 반대로 이들 신호전달체계를 저해시켜 줄기세포의 분화를 유도하는 물질에 대하여도 동시에 연구를 수행하였다. 그 결과 본 발명자들은 줄기세포성을 유지하는 물질과 줄기세포 분화를 유도하는 물질을 발견하여 본 발명에 이르렀다.

본 발명의 목적은 줄기세포성 유지용 배지 조성물과 줄기세포 분화유도용 배지 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 줄기세포성 유지용 배지 조성물을 이용하여 줄기세포의 특성을 유지하면서 줄기세포를 배양하는 방법과; 줄기세포 분화유도용 배지 조성물을 이용하여 줄기세포의 분화를 유도하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 배지 조성물을 포함하는 감염-프리(xenogen-free)용 및 피더-프리(feeder-free culture)용 배양 배지를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 기본배지에 프로틴 키나아제 C(protein kinase C; PKC)의 저해제(inhibitor)를 포함하는 줄기세포성 유지용 배지 조성물을 제공한다.

상기 기본배지는 줄기세포 배양을 위한 배지로서, 이 기술분야의 통상의 기술자들에게 널리 알려진 배지라면 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 기본배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지의 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), KnockOut DMEM, MEF 및 mTeSR-1 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한 기본배지에 인위적으로 합성하여 제조된 첨가물이나 상업적으로 제조된 첨가물을 동시에 포함할 수도 있다. 상업적으로 제조된 첨가물의 예를 들면, 넉아웃 시럼 리플이스먼트(KnockOut Serum Replacement;Invitrogen, USA), 넉아웃 SR 제노프리(KnockOut SR XenoFree; Invitrogen, USA)와 넉아웃 SR 제노프리 성장인자 칵테일(KnockOut SR XenoFree Growth Factor Cocktail; Invitrogen, USA) 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서는 줄기세포성을 유지하는 화합물 및 줄기세포성 유지를 저해하고 줄기세포의 분화를 유도하는 화합물을 찾기 위해 다음과 같은 두 가지의 소분자화합물 탐색 방법이 수행되었다.

첫 번째로, 줄기세포성 유지에 관여하는 소분자 화합물을 탐색하는 방법이다. 인간 배아줄기세포를 "Matrigel(BD Biosciences, USA)"이라는 세포외 기질(extracellular matrix)로 코팅한 배양 용기에 도포한 후, 이 인간 배아줄기세포에 분화유도 배지를 넣어 주어 자연 분화를 유도하면서 소분자 화합물을 처리하였다. 그리고 배양 마지막 날에 인간 배아줄기세포의 콜로니 형성 여부, 콜로니 모양 관찰, 알칼린 포스파테이즈(alkaline phosphatase) 염색, 그리고 여러 가지 종류의 미분화 표지(Oct4, SSEA4, Tra1-60, Tra1-81 등)들에 대한 면역염색을 실시하여 줄기세포성을 계속 유지하게 하는(즉, 분화를 억제시키는) 소분자 화합물들을 찾아낸다.

두 번째는, 줄기세포성을 저해한, 즉 줄기세포의 분화를 유도하는 소분자 화합물을 찾아내는 방법이다. 인간 배아줄기세포를 Matrigel로 코팅한 배양용기에 도포하여 준 후, 미분화유지 배양 배지(예를 들면, mTeSR-1(Stemcell Technologies, USA))를 이용하여 배양하면서 소분자 화합물을 처리하였다. 그 다음 배양 마지막 날에 인간 배아줄기세포의 콜로니 형성 여부 및 콜로니 모양 관찰, 알칼린 포스페이트(alkaline phosphatase) 염색, 그리고 여러 가지 종류의 미분화표지(Oct4, SSEA4, Tra1-60, Tra1-81)들에 대한 면역염색을 통하여 인간 배아줄기세포들의 줄기세포성을 저해한 소분자 화합물을 찾아낸다.

그 결과, PKC에 대한 저해제가 인간 배아줄기세포의 줄기세포성을 유지해 주는 데 관여하며, 반대로 PKC의 활성화제가 줄기세포성 유지를 저해하고 분화를 유도하는 성질을 보이는 것을 알아냈다.

상기 PKC에 대한 저해제는 이 기술분야에 이미 알려진 것은 모든 저해제를 모두 포함한다. 구체적인 예로 3-[1-[3-(디메틸아미노)프로필]-5-메톡시-1H-인돌-3-일]-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온(3-[1-[3-( Dimethylamino ) propyl ]-5-methoxy-1H-indol-3-yl]-4-(1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione); 3-(1H-인돌-3-일)-4-[2-(4-메틸피페라진-1-일)퀴나졸린-4-일]피롤-2,5-디온(3-(1H- indol -3- yl )-4-[2-(4-methylpiperazin-1-yl)quinazolin-4-yl]pyrrole-2,5-dione); 3-{1-[3-(아미디노티오)프로필]-1H-인도일-3-일}-3-(1-메틸-1H-인도일-3-일)말레이미드 메탄 술포네이트(3-{1-[3-( amidinothio ) propyl ]-1H- indoyl -3- yl }-3-(1- methyl -1H-indoyl-3-yl)maleimide methane sulfonate); 13-하이드록시옥타데카디에노익 액시드(13- hydroxyoctadecadienoic acid); 바이신돌일말레이미드(bisindolylmaleimide) GF 109203X; 2,6-디아미노-N-([1-옥소트리데실)-2-피페리디닐]메틸)헥산아미드(2,6- Diamino -N-([1- oxotridecyl )-2- piperidinyl ] methyl ) hexanamide); 및 4'-디메틸아미노-4'-하이드록시스타우로스포린(4'- demethylamino -4'-hydroxystaurosporine)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서는 상기 PKC 저해제를 상기 배지 조성물 내에 0.001 내지 1000 uM 포함시켜 사용할 수 있다. 상기 PKC 저해제의 함량이 0.001 uM 미만인 경우에는 줄기세포성 유지 효과가 나타나지 않는 문제점이 발생할 수 있다. 반면에 상기 PKC 저해제의 함량이 1000 uM 를 초과하는 경우에는, 세포독성이 나타나는 문제점이 발생할 수 있다.

상기 줄기세포성 유지용 배양 조성물을 통해 배양되는 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포일 수 있다.

또한 상기 성체 줄기세포는 모든 조직의 성체 줄기세포에서 유래된 것일 수 있다. 예를 들면, 성체 줄기세포는 신경 줄기세포, 간 줄기세포, 조혈 줄기세포, 제대혈 줄기세포, 표피 줄기세포, 위장관 줄기세포, 내피 줄기세포, 근육 줄기세포, 중간엽 줄기세포 및 췌장 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

현재 사용되는 피더-프리 배양 방법은, 동물 유래물질들이 포함이 되어 있다. 임상용 인간 배아줄기세포를 얻기 위해서는 이 동물 유래물질들이 완전히 배제된 새로운 배양 배지가 필요하다.

상기 본 발명에 따른 줄기세포성 유지용 배지 조성물은, 피더 세포를 사용하지 않고도, 배아줄기세포를 배양할 수 있는 감염물질-프리(xenogen-free)용 및 피더-프리(feeder-free culture)용 배양 배지를 만드는 데 이용될 수 있다.

구체적으로, 앞서 언급한 PKC 저해제와 같은 인간 배아줄기세포의 줄기세포성 유지에 관여하는 물질들을 이용하면, 피더-프리 그리고 감염-프리 상태의 배지 조성물을 제조할 수 있고, 이 배지 조성물을 통해 배아줄기세포를 배양할 수 있다.

또한, 생쥐 배아섬유아세포 대신에 인간유래 세포들을 피더 세포로 사용하는 경우에도 역시 기존의 동물 유래물질이 함유된 배지 대신에 새로운 감염-프리 배지를 사용해야 임상용 인간 배아줄기세포를 배양할 수 있다. 이러한 배지를 개발하는 데에도 상기 언급한 PKC 저해제가 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 기본배지에 PKC 활성화제(activator)를 포함하는 줄기세포 분화유도용 배지 조성물을 제공한다.

상기 PKC 활성화제는 이 기술분야에 공지된 모든 PKC 활성화제를 포함한다. 구체적인 예로, TPA(12-O- tetradecanoylphorbol -13- acetate); 1-헥실인돌악탐-V10(1-hexylindolactam-V10); 6,11,12,14-테트라하이드록시-아비에타-5,8,11,13-테트라엔-7-온(6,11,12,14- tetrahydroxy - abieta -5,8,11,13- tetraene -7- one); 8-옥틸-벤졸악탐-V9(8- octyl - benzolactam - V9); 아세틸-1-카르니틴(acetyl -l- carnitine); 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12- myristate 13- acetate); BMS-214662; 브료스태틴 1(Bryostatin 1); 1-올레오일-2-아세틸-sn-글라이세롤(1-Oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol); L-a-포스파티딜이노시톨-3,4-비스포스파테이트(L-a-Phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate); 1-스테아로일-2-아라키도노일-sn-글라이세롤(1- Stearoyl -2- arachidonoyl - sn - glycerol); 및 ROPA(Resiniferonol 9,13,14-ortho-phenylacetate)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서는 상기 PKC 활성화제를 상기 배지 조성물 내에 0.001 내지 1.000 uM 포함시켜 사용할 수 있다. 상기 PKC 활성화제의 함량이 0.001 uM 미만인 경우에는 줄기세포 분화 유도 효과가 나타나지 않는 문제점이 발생할 수 있다. 반면에 상기 PKC 활성화제의 함량이 1000 uM 를 초과하는 경우에는, 세포독성이 나타나는 문제점이 발생할 수 있다.

상기 줄기세포 분화유도용 배지 조성물에 이용되는 기본배지 및 줄기세포의 종류는 앞서 언급한 것과 동일하다.

줄기세포를 이용한 세포치료제 개발을 위해서는 특정 세포로의 분화가 필수적이다. 만약 일정 수의 배아줄기세포가 분화되지 않고 계속 남아서 존재한다면 이들은 생체에 이식 후에 "테라토마"라는 암을 형성하게 될 확률이 높다. 이 PKC 활성화제를 이용하여 분화를 더 촉진시킨다면, 더 많은 분화세포를 얻을 수 있을 것이며 암 발생 빈도가 훨씬 줄어들 것이다.

또한 이들 PKC 활성화제는 줄기세포의 분화를 유도하는 특징이 있다. 따라서 PKC 활성화제를 이용하면 줄기세포를 특정 계통(lineage)이나 특정 형태(type)의 세포로 분화를 유도시킬 수 있고, 결과적으로 그들 특정 세포들을 효율적으로 얻을 수 있는 장점이 있다.

앞서 언급한 바와 동일하게, PKC 활성화제를 이용하면, 피더-프리 그리고 감염-프리 상태의 배지 조성물을 제조할 수 있고, 이 배지 조성물을 통해 배아줄기세포의 분화를 유도할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 PKC 저해제를 포함하는 줄기세포성 유지용 배지 조성물을 이용하여 줄기세포의 특성을 유지하면서 줄기세포를 배양하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 PKC 활성화제를 포함하는 배지 조성물을 이용하여 줄기세포의 분화를 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 PKC저해제를 포함하는 배지 조성물 또는 PKC 활성화제를 포함하는 배지 조성물을 이용하여 감염-프리용 및/또는 피더-프리용 배양 배지를 만들 수 있다. 또한 본 발명에 따른 배지 조성물을 포함하는 배양 배지를 이용하여 줄기세포성을 유지시키거나 줄기세포의 분화를 촉진하여 원하는 특정 세포를 원하는 시기에 얻을 수 있다.

도 1은 PKC 저해제가 인간 배아줄기세포의 줄기세포성을 유지하고 분화를 억제하는 것을 나타내 주는 세포 염색 사진이다.
도 2는 PKC 활성화제가 인간 배아줄기세포의 분화를 유도함을 보여주는 세포 염색 사진이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 줄기세포성 유지용 배지 조성물의 제조 및 줄기세포 미분화 확인

Matrigel(BD Biosciences, USA)로 코팅한 96 웰플레이트의 각 웰에 인간 배아줄기세포(CHA6 cell line, 차의과학대학교, 한국)의 콜로니의 조각들을 도포해 주었다. 그 뒤 분화유도 배지인 MEF 배지(DMEM high-glucose(Welgene)+ 10% FBS(Welgene)+ 1% pennicillin/streptomycin (Caisson)+ 1% NEAA(GIBCO)+ 0.1% b-mercaptoethanol(GIBCO))를 넣어 주어 인간 배아줄기세포 배양을 시작하였다(37.0℃, 5.0% CO₂). 이 때 배아줄기세포는 96웰 플레이트의 각 웰 당 5조각의 덩어리를 넣어 주었다. 그 다음 PKC저해제인 3-[1-[3-(디메틸아미노)프로필]-5-메톡시-1H-인돌-3-일] -4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온 (3-[1-[3-( Dimethylamino ) propyl ]-5- methoxy -1H- indol -3- yl ]-4-(1H- indol -3- yl )-1H- pyrrole -2,5-dione)(

, Calbiochem) 5 uM 을 약 5-7일에 걸쳐 매일 새로운 배지에 첨가하여 배아줄기세포를 배양하는 실험을 진행하였다.

대조군으로 PKC 저해제를 포함하지 않은 MEF 배지와 인간줄기세포를 분화억제용 배지인 mTeSR 배지에 배아줄기세포를 배양하였다.

상기 줄기세포의 분화 유도를 확인하기 위하여, 광학현미경으로 세포의 형태를 관찰하거나(도 1의 a-c), DAPI로 핵을 염색하여 세포들의 존재 및 분포 여부를 확인하였다(도 1의 d-f).

도 1에서 보듯이, MEF 배지를 사용하여 배양할 때는 배아줄기세포가 분화되어 널리 퍼지는 현상을 보이고 있다(도 1의 a 및 d). 반면에 PKC 저해제를 첨가해준 경우에는 배아줄기세포들이 뭉쳐 있는 콜로니 형태를 유지하고 있음을 알 수 있었다 (도1의 b 및 e). 대조군으로 사용한 미분화 유지 배양 배지(mTeSR, Stemcell Technologies, USA: bFGF, TGFb, LiCl, GABA, pipecolic acid 가 포함되어 있는 배지))의 경우에도 인간 배아줄기세포가 거의 분화되지 않고 콜로니 형태로 뭉쳐있음을 볼 수 잇었다 (도 1의 c 및 f).

미분화 세포의 초기 마커인 알칼린 포스파테이즈 염색(A.P.; alkaline phosphatase staining)은 다음과 같이 수행하였다. 먼저 세포를 4% 파라포름알데하이드(para-formaldehyde)로 1-2분간 고정시킨 후 1x TBST(20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.05%, Tween-20)로 한 번 씻어 주었다. 패스트 레드 바이올렛(Fast red violet), 나프톨(naphtol)과 H₂O를 2:1:1로 섞어 15분간 처리해준 뒤 1x TBST로 한 번 씻어 주고 1x PBS로 갈아 주었다.

그 결과 도 1의 (g)에 나타난 것과 같이, MEF 배지를 사용할 경우에는 세포들이 분화되어 널리 퍼지게 된다. 이에 반해 5 uM의 PKC 저해제(

)을 처리했을 때 세포들이 덜 퍼지게 되어 어느 정도 콜로니의 형태를 유지하고 있으며, 미분화 표지인 알칼린 포스파테이즈(alkaline phosphatase)의 발현이 상당히 증가함을 알 수 있었다(도 1의 h). 즉 PKC 저해제가 줄기세포의 분화를 억제하고 미분화 상태를 유지해주는 역할을 하고 있음을 알 수 있다. 대조군으로 사용한 미분화 유지 배양 배지(mTeSR)의 경우는 배아줄기세포가 거의 분화되지 않고 있고, 알칼린 포스파테이즈(alkaline phosphatase)의 발현이 상당히 증가함을 알 수 있었다(도 1의 c f 및 i).

실시예 2: 줄기세포 분화용 배지 조성물의 제조 및 줄기세포 분화 확인

Matrigel(BD Biosciences, USA)로 코팅한 96 웰플레이트의 각 웰에 인간 배아줄기세포(CHA6 cell line, 차의과학대학교, 한국)의 콜로니의 조각들을 도포해 주었다. 그 뒤 미분화 유지 배양 배지인 mTeSR-1(Stemcell Technologies, USA: bFGF, TGFb, LiCl, GABA, pipecolic acid 가 포함되어 있는 배지)을 넣어 주거나, 피더세포인 STO 세포의 영양배양액(STO-conditioned media 혹은 STO-CM)을 넣어 주어 배아줄기세포 배양을 시작하였다(37.0℃, 5.0% CO₂). 이 때 배아줄기세포는 96웰 플레이트의 각 웰 당 5조각의 덩어리를 넣어 주었다. 그 다음 PKC의 활성화제인 TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) 0.01 uM 을 약 5-7일에 걸쳐 매일 새로운 배지에 첨가해 주었다. 대조군으로서는 PKC 활성화제를 넣지 않은 상태의 미분화 유지 배지인 mTeSR배지와 STO-CM (STO-conditioned media) 를 사용하였다. 또한, PKC 활성화제인 TPA 10 uM와 PKC 저해제(

) 5 uM를 함께 처리하여 배양하였다.

상기 줄기세포의 분화 유도를 확인하기 위하여, 광학현미경으로 관찰하여 세포들의 존재 및 분포 여부를 확인한 결과, 미분화 유지 배양 배지인 mTeSR 에서 배아줄기세포를 배양한 경우는 배아줄기세포가 분화되지 않고 뭉쳐있는 콜로니 형태를 잘 형성하고 있다(도 2의 a). 반면에 반해 PKC 활성화제 TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) 10 uM을 처리해준 경우에는 배아줄기세포가 분화되어 널리 퍼져 존재함을 알 수 있었다(도 2의 b).

미분화 세포의 초기 마커인 알칼린 포스파테이즈 염색(A.P.; alkaline phosphatase staining)을 수행 한 결과 미분화 유지 배지인 mTeSR이나 STO-CM에서는 세포의 염색 정도와 콜로니 형태가 미분화 배아줄기세포의 양상과 유사한 반면에 (도 2의 d 및g), TPA 10 uM을 처리해준 경우에는 알칼린 포스파테이즈 염색(A.P.; alkaline phosphatase staining) 정도가 약할 뿐만 아니라 세포들이 분화되어 널리 퍼져 존재 함을 확인할 수 있었다 (도 2의 e 및 h).

또한 TPA 10 uM와 PKC 저해제 5 uM를 동시에 처리를 해 준 경우에는, PKC의 활성화제에 의한 분화가 차단되어 원래의 미분화 줄기세포의 형태를 보이고 있음을 확인할 수 있다 (도2, c, f 및 i).

Claims

기본배지에 프로틴 키나아제 C(protein kinase C) 저해제를 포함하는 줄기세포성 유지용 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 프로틴 키나아제 C 저해제는 3-[1-[3-(디메틸아미노)프로필]-5-메톡시-1H-인돌-3-일]-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온(3-[1-[3-(Dimethylamino)propyl]-5-methoxy-1H-indol-3-yl]-4-(1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione); 3-(1H-인돌-3-일)-4-[2-(4-메틸피페라진-1-일)퀴나졸린-4-일]피롤-2,5-디온(3-(1H-indol-3-yl)-4-[2-(4-methylpiperazin-1-yl)quinazolin-4-yl]pyrrole-2,5-dione); 3-{1-[3-(아미디노티오)프로필]-1H-인도일-3-일}-3-(1-메틸-1H-인도일-3-일)말레이미드 메탄 술포네이트(3-{1-[3-(amidinothio)propyl]-1H-indoyl-3-yl}-3-(1-methyl-1H-indoyl-3-yl)maleimide methane sulfonate); 13-하이드록시옥타데카디에노익 액시드(13-hydroxyoctadecadienoic acid); 바이신돌일말레이미드(bisindolylmaleimide) GF 109203X; 2,6-디아미노-N-([1-옥소트리데실)-2-피페리디닐]메틸)헥산아미드(2,6-Diamino-N-([1-oxotridecyl)-2-piperidinyl]methyl)hexanamide); 및 4'-디메틸아미노-4'-하이드록시스타우로스포린(4'-demethylamino-4'-hydroxystaurosporine)로 이루어진 군으부터 선택되는 것을 특징으로 하는 줄기세포성 유지용 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 프로틴 키나아제 C 저해제는 상기 배지 조성물 내에 0.001 내지 1000 uM 로 포함되는 것을 특징으로 하는 줄기세포성 유지용 배지 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 기본배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), MEF 및 mTeSR-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 줄기세포성 유지용 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포성 유지용 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포가 신경 줄기세포, 간 줄기세포, 조혈 줄기세포, 제대혈 줄기세포, 표피 줄기세포, 위장관 줄기세포, 내피 줄기세포, 근육 줄기세포, 중간엽 줄기세포 및 췌장 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 줄기세포성 유지용 조성물.
기본배지에 프로틴 키나아제 C 활성화제(protein kinase C activator)를 포함하는 줄기세포 분화유도용 배지 조성물.
제7항에 있어서, 상기 프로틴 키나아제 C 활성화제는 TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate); 1-헥실인돌악탐-V10(1-hexylindolactam-V10); 6,11,12,14-테트라하이드록시-아비에타-5,8,11,13-테트라엔-7-온(6,11,12,14-tetrahydroxy-abieta-5,8,11,13-tetraene-7-one); 8-옥틸-벤졸악탐-V9(8-octyl-benzolactam-V9); 아세틸-1-카르니틴(acetyl-l-carnitine); 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate); BMS-214662; 브료스태틴 1(Bryostatin 1); 1-올레오일-2-아세틸-sn-글라이세롤(1-Oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol); L-a-포스파티딜이노시톨-3,4-비스포스파테이트(L-a-Phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate); 1-스테아로일-2-아라키도노일-sn-글라이세롤(1-Stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol); 및 ROPA(Resiniferonol 9,13,14-ortho-phenylacetate) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화유도용 배지 조성물.
제7항에 있어서, 상기 프로틴 키나아제 C 활성화제는 상기 배지 조성물 내에 0.001 내지 1000 uM 로 포함되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화유도용 배지 조성물.
제7항에 있어서, 상기 기본배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM( Isocove's Modified Dulbecco's Medium), MEF 및 mTeSR-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화유도용 배지 조성물.
제7항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화유도용 배지 조성물.
제7항에 있어서, 상기 줄기세포가 신경 줄기세포, 간 줄기세포, 조혈 줄기세포, 제대혈 줄기세포, 표피 줄기세포, 위장관 줄기세포, 내피 줄기세포, 근육 줄기세포, 중간엽 줄기세포 및 췌장 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화유도용 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 배지 조성물을 이용하여 줄기세포의 특성을 유지하면서 줄기세포를 배양하는 방법.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 배지 조성물을 이용하여 줄기세포의 분화를 유도하는 방법.