KR20110081337A - 안티센스 올리고누클레오티드에 의한 ｔｏｌｌ―유사 수용체 4 발현의 조절 - Google Patents

안티센스 올리고누클레오티드에 의한 ｔｏｌｌ―유사 수용체 4 발현의 조절 Download PDF

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라크슈미 바가트
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Abstract

본 발명은 TLR4의 발현을 하향 조절하기 위한 안티센스 올리고누클레오티드 화합물, 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 조성물은 TLR4를 엔코딩하는 핵산을 표적으로 하는 안티센스 올리고누클레오티드를 포함한다. 상기 조성물은 또한 다른 치료 및/또는 예방 화합물 및/또는 조성물과 조합된 TLR4를 엔코딩하는 핵산을 표적으로 하는 안티센스 올리고누클레오티드를 포함할 수 있다. TLR4 발현을 하향 조절하고, TLR4 발현의 조절이 이로울 수 있는 질병의 예방 또는 치료를 위해 상기 화합물 및 조성물을 이용하는 방법을 제공한다.

Description

안티센스 올리고누클레오티드에 의한 ＴＯＬＬ―유사 수용체 4 발현의 조절 {MODULATION OF TOLL-LIKE RECEPTOR 4 EXPRESSION BY ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES}
본 출원은 2008년 11월 4일에 출원된 미국가특허출원번호 제61/111,148호를 우선권으로 주장하며, 이러한 문헌의 내용은 전체적으로 참고문헌에 포함된다.
발명의 배경
본 발명의 분야
본 발명은 Toll-유사 수용체 4(TLR4)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 TLR4를 엔코딩하는 핵산과 특이적으로 하이브리드화하여 TLR4 발현 및 활성을 조절하는 안티센스 올리고누클레오티드, 및 TLR4와 관련되거나 TLR4 발현의 조절이 유익한 질병을 치료하거나 예방함에 있어 이들의 용도에 관한 것이다.
관련 기술의 개요
Toll-유사 수용체(TLR)은 면역계의 많은 세포 상에 존재하고, 선천 면역 반응과 관련있는 것으로 나타났다 [Hornung, V. et al., (2002) J. Immunol. 168:4531-4537]. TLR은, 포유동물이 외래 분자에 대한 면역 반응을 인지하고 개시하는 주요 수단이고, 또한 선천 및 적응 면역 반응들을 연결하는 수단을 제공한다 [Akira, S. et al. (2001) Nature Immunol. 2:675-680; Medzhitov, R. (2001) Nature Rev. Immunol. 1:135-145]. 척추 동물에서, 이러한 패밀리는 TLR1 내지 TLR11로 언급되는 적어도 11개의 단백질로 구성되며, 이는 박테리아, 진균류, 기생충 및 바이러스로부터 병원체 연관 분자 패턴 (pathogen associated molecular pattern; PAMP)을 인식하고 다수의 전사 인자에 의해 매개되는 면역 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다.
일부 TLR은 세포외 병원체를 탐지하고 이에 대한 반응을 개시하기 위해 세포 표면 상에 위치되어 있으며, 다른 TLR은 세포내 병원체를 탐지하고 이에 대한 반응을 개시하기 위해 세포 내측에 위치되어 있다. 표 1은 TLR, 이에 대한 알려진 효능제, 및 TLR을 함유한 것으로 알려진 세포 타입을 제공한 것이다 [Diebold, S. S. et al. (2004) Science 303:1529-1531; Liew, F. et al. (2005) Nature 5:446-458; Hemmi H et al. (2002) Nat Immunol 3:196-200; Jurk M et al, (2002) Nat Immunol 3:499; Lee J et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:6646-6651); (Alexopoulou, L. (2001) Nature 413:732-738].
표 1
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리간드와 TLR 간의 상호작용에 의해 매개된 신호 전달 경로는 TLR 패밀리의 대부분의 일원 중에서 공유되고, toll/IL-1 수용체(TIR 도메인), 골수 분화 마커 88 (MyD 88), IL-1R-관련 키나제 (IRAK), 인터페론 조절 인자 (IRF), TNF-수용체-관련 인자 (TRAF), TGFβ-활성화 키나제 1, IκB 키나제, IκB, 및 NF-κB를 포함한다 [참조: Akira, S. (2003) J. Biol. Chem. 278:38105 및 Geller at al. (2008) Curr. Drug Dev. Tech. 5:29-38]. 보다 상세하게, TLR 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 11에 대해, 이러한 시그널링 캐스케이드(signaling cascade)는 막-결합 TLR과 상호작용하고 이를 활성화시키는 PAMP 리간드로 개시되며, 이러한 리간드는 엔도소말 막 또는 세포 표면에 호모-다이머(homo-dimer)로서 존재한다. 활성화 후에, 수용체는 TIR 도메인 함유 단백질 MyD88의 보충을 허용하기 위해 구조적인 변화를 일으키며, 이는 TLR3을 제외한 모든 TLR 신호 경로에 대해 공통된 어댑터 단백질(adapter protein)이다. MyD88은 IRAK4를 보충하는데, 이는 IRAK1을 인산화하고 활성화시킨다. 활성화된 IRAK1은 TRAF6과 결합하며, 이는 TRAF6 상에 폴리유비퀴틴(polyubiquitin)의 첨가를 촉진시킨다. 유비퀴틴의 첨가는 TAK/TAB 복합물을 활성화시키고, 차례로 IRF를 인산화하여, NF-kB 방출 및 핵으로의 이동을 야기시킨다. 핵에서의 NF-kB는 전염증성 유전자의 발현을 유도한다 [참조, Trinchieri and Sher (2007) Nat. Rev. Immunol. 7:179-190].
TLR의 선택적 국소화 및 이로부터 발생된 신호전달은 면역 반응에서의 이들의 역할에 있어 몇가지 통찰을 제공한다. 면역 반응은 반응에서 수반되는 세포의 서브세트를 기초로 하여 선천 및 적응 반응 둘 모두를 포함한다. 예를 들어, 전통적인 세포-매개 기능, 예를 들어, 세포독성 T 림프구(CTL)의 지연형 과민반응 및 활성화에서 수반되는 T 헬퍼(helper)(Th) 세포는 Th1 세포이다. 이러한 반응은 항원(예를 들어, 바이러스 감염, 세포내 병원체, 및 종양 세포)에 대한 신체의 선천 반응으로서, IFN-감마의 분비 및 CTL의 동시 활성화를 초래한다. TLR4는 세포막에 국소화되는 것으로 공지되어 있고, 이는 지질다당류(LPS)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 병원체의 세포벽에 존재하는 지질에 의해 활성화된다[참조, Aderem and Ulevitch (2000) Nature 406: 780- 785]. LPS에 반응하는 상기 TLR4의 능력은 병원체에 대한 신체의 선천 면역 반응을 발생시키는데 있어서 TLR4의 중요한 역할을 입증한다.
염증 반응을 조절함에 있어 이들의 관여의 결과로서, TLR은 자가면역, 감염성 질병 및 염증을 포함하는 여러 질병의 병인에서 중요할 역할을 하는 것으로 나타났다 [Papadimitraki et al. (2007) J. Autoimmun. 29: 310-318; Sun et al. (2007) Inflam. Allergy Drug Targets 6:223-235; Diebold (2008) Adv. Drug Deliv. Rev. 60:813-823; Cook, D.N. et al. (2004) Nature Immunol. 5:975- 979; Tse and Horner (2008) Semin. Immunopathol. 30:53-62; Tobias & Curtiss (2008) Semin. Immunopathol. 30:23-27; Ropert et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30:41-51; Lee et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30:3-9; Gao et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30:29-40; Vijay-Kumar et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30:11-21]. TLR의 활성이 면역 반응을 개시하는데 관여되지만, TLR을 통한 면역계의 비조절되거나 요망되지 않은 자극은 면역이 손상된 피검체에서 특정 질병을 악화시킬 수 있거나 원치않는 면역 자극을 야기시킬 수 있다. 이에 따라, TLR 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것은 질병 개입(disease intervention)을 위한 유용한 수단을 제공할 수 있다.
최근에, TLR 활성을 선택적으로 억제하기 위한 연구 접근법은 소분자 (WO/2005/007672), 항체 (참조: Duffy, K. et al. (2007) Cell Immunol. 248:103-114), 촉매 RNAi 기술 (예를 들어, 작은 억제 RNA), 특정의 안티센스 분자 (Caricilli et al. (2008) J. Endocrinology 199:399), 및 개질되거나 메틸화된 올리고누클레오티드와의 경쟁적 억제 [참조, Kandimalla et al. US2008/0089883; Barrat and Coffman (2008) Immunol. Rev. 223:271-283]를 포함하고 있다. 예를 들어, 클로로퀸 및 히드록시클로로퀸은 엔도솜의 성숙(maturation)을 하향조절함으로써 엔도소말-TLR 신호전달을 차단하는 것으로 나타났다 [Krieg, A. M. (2002) Annu. Rev. Immunol. 20:709]. 또한, 황 등(Huang et al.)은 T 세포 증식 및 천연 킬러 세포 활성의 종양-매개된 억제를 역전시키기 위해 TLR4 siRNA의 사용[Huang et al. (2005) Cancer Res. 65:5009-5014], 및 안구의 박테리아-유도 염증을 예방하기 위한 TLR4 siRNA의 사용 [Huang et al. (2005) Invest. Opthal. Vis. Sci. 46:4209-4216]을 제시하였다.
추가적으로, 여러 그룹이 두개의 삼중 서열(triplet sequence), 즉 근위 "CCT" 삼중 서열 및 원위 "GGG" 삼중 서열, 폴리 "G" (예를 들어, "GGGG" 또는 "GGG") 또는 특정의 세포내 단백질과 상호작용하는 "GC" 서열을 갖는 합성 올리고데옥시누클레오티드를 사용하여, TLR 신호전달의 억제 및 전염증성 시토카인의 동시 생산 및 방출을 야기시켰다 [참조, Lenert, P. et al. (2003) DNA Cell Biol. 22(10):621-631; Patole, P. et al. (2005) J. Am. Soc. Nephrol. 16:3273-3280), Gursel, I., et al. (J. Immunol, 171: 1393-1400 (2003), Shirota, H., et al., J. Immunol, 173: 5002-5007 (2004), Chen, Y., et al, Gene Ther. 8: 1024-1032 (2001); Stunz, L.L., Eur. J. Immunol. (2000) 32: 1212-1222 ; Kandimalla et al WO2007/7047396]. 그러나, 구아노신 스트링(string)을 함유한 올리고누클레오티드는 테트라플렉스(tetraplex) 구조를 형성하고, 앱타머로서 작용하고, 트롬빈 활성을 억제하는 것으로 나타났다 [Bock LC et al, Nature, 355:564-6, 1992; Padmanabhan, K et al., J Biol Chem., 268(24): 17651-4, 1993]. 이에 따라, 이러한 억제성 올리고데옥시누클레오티드 분자의 이용은 환자에게서 달성되지 못할 수 있다.
TLR의 발현을 "저해하거나, 억제시키거나, 하향 조절"하는 잠재적 접근법은 안티센스 기술이다. 안티센스 기술 개발의 역사는 표적 RNA에 하이브리드화되는 안티센스 올리고누클레오티드를 설계하고 시험하는 것은 비교적 간단한 과정이지만, 단지 소수의 안티센스 올릭누클레오티드가 의도한 대로 작동하고, 임상 후보자로서 진정한 잠재성을 갖는 안티센스 올리고누클레오티드의 최적화가 예측될 수 없는 것을 나타낸다. 당업자는 안티센스 올리고누클레오티드를 최적화시키고, 정확한 올리고누클레오티드 서열 및 길이를 고안하고, 적절한 핵산 및 올리고누클레오티드 화학을 이용하는 것이 용이하게 명백하지 않음을 인지할 것이다. 그러나, 상기 성분을 제형화하는 것은 임의의 안티센스 올리고누클레오티드의 유용성에 중요하다(Stein and Cheng, 1993, Science 261: 1004-1012). 당업자는 정확한 서열 및 정확한 길이를 고안하지 않고, 적절한 핵산 및 올리고누클레오티드 화학을 이용하지 않고서는, 안티센스 올리고누클레오티드가 표적외(off-target) 효과를 가질 수 있고, 특히 분자가 불안정 해지고, 비활성화되고, 비특이적이 되고, 독성이 될 수 있다는 것을 추가로 인지할 것이다. 안티센스 올리고누클레오티드의 예측불가능한 특성의 결과로서, 현재 단지 하나의 안티센스 올리고누클레오티드가 인간에서의 사용에 대해 승인을 받았으며, 안티센스 올리고누클레오티드는 현재 인간에서의 사용을 위해 시판되지 않는다.
따라서, 유전자 발현을 가장 효과적으로 하향 조절하거나 억제하는 최적화된 안티센스 올리고누클레오티드가 당 분야에 필요하다. 특히, TLR4 발현을 하향 조절하고, 안정적이고, 활성이고, 표적 특이적이고, 비독성이며, 선천 면역 반응을 활성화시키지 않는 안티센스 올리고누클레오티드가 당 분야에 필요하다. 이러한 특징을 갖는 분자는 개발되는 안티센스 올리고누클레오티드로부터 이전에 방해된 안티센스 올리고누클레오티드가 갖는 문제를 극복할 것이다.
발명의 개요
본 발명은 특히 TLR4를 엔코딩하는 핵산에 표적화되고 mRNA 번역의 억제를 통하고/하거나 RNase H 매개 메카니즘을 통해 TLR4의 발현을 효율적으로 억제하는 최적화된 합성 안티센스 올리고누클레오티드에 관한 것이다.
제 1 양태에서, 본 발명에 따른 최적화된 안티센스 올리고누클레오티드는 SEQ ID NO: 7, 8, 17, 24, 30, 49, 86, 100, 102, 115, 121, 126, 136, 146, 184 또는 256의 서열을 갖는 안티센스 올리고누클레오티드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 본 발명에 따른 최적화된 안티센스 올리고누클레오티드, 및 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 TLR4 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 본 발명의 하나의 올리고누클레오티드 또는 다수의 올리고누클레오티드들은 시험관내에서 또는 세포에서 TLR4 mRNA와 특이적으로 접촉되거나 하이브리드화된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물에 본 발명에 따른 화합물 또는 조성물을 투여함을 포함하여, 포유동물, 특히 인간에서 TLR4의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물에 본 발명에 따른 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드를 약제학적 유효량으로 투여함을 포함하여, 포유동물에서 TLR4-매개 면역 반응을 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물, 특히 인간에 본 발명의 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드, 또는 이들의 조성물을 약제학적 유효량으로 투여함을 포함하여, TLR4에 의해 매개되는 질병을 지닌 포유동물을 치료학적으로 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 TLR4에 의해 매개되는 질병 또는 장애에 걸리거나 발병할 위험이 있는 포유동물, 특히 인간에서 상기 질병 또는 장애를 예방하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 포유동물에 본 발명에 따른 안티센스 올리고누클레오티드, 또는 이들의 조성물을 예방학적 유효량으로 투여함을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물에 TLR4 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고누클레오티드 및 TLR4 단백질의 길항제, 키나제 억제제 또는 신호 전달 및 전사(STAT) 단백질의 억제제를 투여함을 포함하여, 상기 포유동물에서 TLR4 발현 및 활성을 억제하는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 본 발명의 올리고누클레오티드 및 방법은 또한 세포 또는 대조 포유동물 또는 TLR4와 관련된 질병 또는 장애에 걸린 포유동물 또는 TLR4를 통한 면역 자극에서 TLR4 유전자의 기능을 시험하는데 유용하다. 세포 또는 포유동물에 올리고누클레오티드가 투여되고, TLR4 mRNA 또는 단백질의 발현이 시험된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명의 안티센스 올리고누클레오티드의 선형 합성에 대한 합성 개략도이다. DMTr = 4,4'-디메톡시트리틸; CE = 시아노에틸.
도 2는 본 발명에 따른 예시적 인간 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드가 면역자극성이 아님을 입증한다(안티센스 단독). 도 2는 또한 실시예 2에 따라 배양되고 처리된 HEK293 세포에서 TLR4 발현 및 활성화를 억제하는 본 발명에 따른 예시적 올리고누클레오티드의 능력을 입증한다(길항제 + 안티센스).
도 3은 인간 TLR4 mRNA의 누클레오티드 서열을 도시한다[SEQ ID NO:282](Genbank Accession No. NM 138554).
상세한 설명
본 발명은 최적화된 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드, 이러한 올리고누클레오티드를 포함하는 조성물, 및 TLR4 매개 면역 반응을 저해하거나 억제하기 위한 이러한 것들의 사용 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명에 따른 안티센스 올리고누클레오티드는 안정적이고, 활성이고, 표적 특이적이고, 비독성이고, 선천 면역 반응을 활성화시키지 않는다. 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 약제학적 조성물 및 다른 조성물들이 또한 제공된다. 또한, 세포 또는 조직을 본 발명의 안티센스 화합물 또는 조성물 중 하나 이상과 단독으로 또는 다른 예방학적 또는 치료학적 조성물과 함께 접촉시키는 것을 포함하는 세포 또는 조직에서 TLR4의 발현을 하향조절하는 방법이 제공된다.
상세하게, 본 발명은 게놈 영역 또는 이로부터 전사된 RNA 분자에 대해 상보적이도록 디자인된 안티센스 올리고누클레오티드를 제공한다. 이러한 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드는 안정적이고, 표적 특이적이고, 내인성 및/또는 외인성 TLR4 리간드 또는 TLR4 효능제에 반응하여 TLR4-매개 신호 전달을 최대한 효과적으로 저해하거나 억제하는 분자를 발생시키는 독특한 서열을 갖는다.
본 발명에 따른 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드는 다양한 세포 타입 및 다양한 시험관내 및 생체내 실험 모델에서 천연 또는 인공 TLR4 효능제에 의해 유도된 면역 반응을 억제한다. 이와 같이, 본 발명에 따른 안티센스 조성물은 면역계를 연구할 뿐만 아니라 인간 및 마우스와 같은 다양한 포유동물의 면역계를 비교하기 위한 툴(tool)로서 유용하다.
또한, 치료학적 또는 예방학적 유효량의 본 발명의 하나 이상의 안티센스 화합물 또는 조성물을 투여함으로써 TLR4 활성화와 관련된 질병 또는 질환에 걸리거나, 걸린 것으로 의심되거나, 발병하기 쉬운 포유동물, 특히 인간을 치료하는 방법이 제공된다. TLR4는 전염증 반응의 중요한 개시인자로 확인되었고, 이의 활성은 여러 질병과 관련이 있으므로[참조: Gribar et al. (2008) J. Leukoc. Biol. 83:493-498; Fukata and Abreu (2007) Biochem. Soc. Trans. 35: 1473-1478; Gao et al. (2007) Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 7:459-467], 본 발명에 따른 최적화된 안티센스 올리고누클레오티드 및 조성물은 성인 및 소아 및 가축 응용분야에서 암, 자가면역 장애, 천식, 호흡기 알레르기, 식품 알레르기, 피부 알레르기, 전신홍반루푸스 (SLE), 관절염, 늑막염(pleurisy), 만성 감염증, 염증 질환, 염증성 장 증후군, 패혈증, 말라리아, 및 박테리아, 기생충 및 바이러스 감염증을 포함하나 이에 제한되지는 않는 면역요법 응용분야에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드는 단독으로, 또는 다른 약물 또는 예방학적 또는 치료학적 조성물, 예를 들어, DNA 백신, 항원, 항체 및 알레르겐과 조합하여, 또는 이와 동시투여하여; 및 질병의 예방 및 치료를 위한 화학치료제 (전통적인 화학치료 및 현대적인 표적화된 치료 둘 모두) 및/또는 TLR4 길항제와 조합하여 다양한 질병의 예방 및/또는 치료에서 유용하다. 본 발명의 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드는 원치않는 TLR4-매개 면역 자극 성질들을 갖는 화합물 또는 약물과 조합하는 경우 유용하다.
본 발명의 목적, 본 발명의 다양한 특징 뿐만 아니라 본 발명 자체는 하기 용어가 기재된 의미를 갖는 수반되는 도면과 함께 설명되는 경우 하기 기재로부터 더욱 잘 이해될 것이다:
용어 "2'-O-치환된"은 펜토즈 부분의 2' 위치가, 1개 내지 6개의 포화되거나 불포화된 탄소 원자를 함유한 -O- 저급 알킬기 (예를 들어, 2'-O-메틸, 그러나 이에 제한되지 않음), 또는 2개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 -O-아릴 또는 알릴기 (여기서, 이러한 알킬, 아릴 또는 알릴기는 비치환될 수 있거나 치환될 수 있음)(예를 들어, 2'-O-에톡시-메틸, 할로, 히드록시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아실, 아실옥시, 알콕시, 카르복실, 카르브알콕실, 또는 아미노기); 또는 히드록시, 아미노, 또는 할로기로 치환된 것을 의미하지만, 2'-H 기로의 치환을 의미하는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 본 발명의 올리고누클레오티드는 5' 말단에 4개 또는 5개의 2'-O-알킬화된 리보누클레오티드, 및/또는 3' 말단에 4개 또는 5개의 2'-O-알킬 리보누클레오티드를 포함한다. 예시적 구체예에서, 합성 올리고누클레오티드의 누클레오티드는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 누클레오티드간 결합에 의해 연결된다. 포스포로티오에이트 결합은 혼합된 Rp 및 Sp 거울상이성질체일 수 있거나, 이러한 것들은 Rp 또는 Sp 형태의 입체규칙적이거나 실질적으로 입체규칙적일 수 있다[참조, Iyer et al. (1995) Tetrahedron Asymmetry 6:1051-1054].
방향적으로 사용되는 경우에, 용어 "3'"은 일반적으로 동일한 폴리누클레오티드 또는 올리고누클레오티드에서의 또다른 영역 또는 위치로부터 폴리누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 3'에서의 (누클레오티드의 3' 말단부쪽으로의) 영역 또는 위치를 칭한다.
방향적으로 사용되는 경우에, 용어 "5'"는 일반적으로 동일한 폴리누클레오티드 또는 올리고누클레오티드에서의 또다른 영역 또는 위치로부터 폴리누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 5'에서의 (누클레오티드의 5' 말단부쪽으로의) 영역 또는 위치를 칭한다.
용어 "약"은 일반적으로 정확한 수가 중요하지 않음을 의미하는 것이다. 이에 따라, 1개 또는 2개의 누클레오시드 잔기를 덜 갖거나, 1개 내지 수개의 추가의 누클레오시드 잔기를 갖는 올리고누클레오티드는 상술된 구체예 각각의 동등물로서 고려된다.
용어 "효능제(agonist)"는 일반적으로 세포의 수용체에 결합하고 반응을 유도하는 물질을 칭한다. 효능제는 종종 자연발생 물질, 예를 들어, 리간드의 작용을 모방한다.
용어 "길항제"는 일반적으로 효능제의 효과를 감쇄시키는 물질을 칭한다.
용어 "기도 염증"은 일반적으로 천식을 포함한, 알레르겐에 의해 야기된 기도에서의 염증을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "알레르겐"은 일반적으로 피검체에 노출시에 알레르기 반응을 나타내는, 항원 또는 분자, 대개 단백질의 항원부를 칭한다. 통상적으로, 피검체는, 예를 들어, 힐 및 플레어 테스트(wheal and flare test) 또는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 나타나는 바와 같이 알레르겐에 대해 알레르기성을 띤다. 피검체의 단지 작은 서브셋이 분자에 노출시에 알레르기성 (즉, IgE) 면역 반응을 나타내는 경우에도 상기 분자는 알레르겐으로 불린다.
용어 "알레르기"는 일반적으로 식품 알레르기, 호흡기 알레르기 및 피부 알레르기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "항원"은 일반적으로 항체에 의해 또는 T 세포 항원 수용체에 의해 인식되고 선택적으로 결합되는 물질을 칭한다. 항원은 펩티드, 단백질, 누클레오시드, 누클레오티드 및 이들의 조합물을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 항원은 천연 또는 합성 항원일 수 있고, 일반적으로 그러한 항원에 대해 특이적인 면역 반응을 유도한다.
용어 "자가면역 장애"는 일반적으로 "자가" 항원이 면역계에 의해 공격을 받는 장애를 칭한다. 이러한 용어는 홍반루푸스, 다발 경화증, 제 1형 당뇨병, 과민성 대장증후군, 크론병, 류마티스 관절염, 패혈 쇼크, 범발성 탈모증, 급성 파종성 뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis), 애디슨 병, 강직성 척추염, 항인지질 항체 증후군, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 수포성 유천포창, 샤가스 병, 만성 폐쇄성 폐질환, 복강 질환, 피부근염, 자궁내막증, 굿파스처 증후군, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토병, 화농성 땀샘염, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 간질성 방광염, 국소피부경화증, 중증 근무력증, 기면증, 신경근 긴장증, 천포창, 악성 빈혈, 다발성 근염, 원발성 담즙성 간경변증, 정신분열증, 쇼그렌 증후군, 측두 동맥염 ("거대 세포 동맥염"), 맥관염, 백반증, 외음부 통증 및 베게너 육아종증 자가면역 천식, 패혈 쇼크 및 건선을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "암"은 일반적으로 비정상적인 또는 비조절된 세포 증식 및/또는 분화에 의해 야기된 임의의 악성적 성장 또는 종양을 칭하는 것으로서, 이에 제한되지 않는다. 암은 인간 및/또는 동물에서 발생할 수 있고, 임의의 조직 및 모든 조직에서 일어날 수 있다. 암을 지닌 환자를 치료하는 것은 비정상적 또는 비조절된 세포 증식 및/또는 분화, 또는 전이에 영향을 미치도록, 본 발명에 따른 화합물, 약제학적 제형 또는 백신의 투여를 포함할 수 있다.
용어 "담체"는 일반적으로 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 오일, 지질, 지질을 함유한 소포(vesicle), 미소구체, 리포좀 캡슐화제(liposomal encapsulation), 또는 약제학적 제형에서 사용하기 위해 당해 분야에 널리 공지된 다른 물질을 포함한다. 담체, 부형제, 또는 희석제의 특징은 특정 적용을 위한 투여 경로에 따르는 것으로 이해될 것이다. 이러한 물질을 함유한 약제학적으로 허용가능한 제형의 제조는, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990]에 기술되어 있다.
용어 "공동-투여" 또는 "공동-투여된"은 일반적으로 면역 반응을 조절하기 위해 충분히 근접한 시간에 2개 이상의 상이한 물질을 투여하는 것을 칭한다. 공동-투여는 동시 투여 뿐만 아니라 단일 용량 또는 개별 용량으로 임의의 순서로 2개 이상의 상이한 물질을 수일 이하의 시간 간격을 둔 순차적 투여를 칭한다.
용어 "조합하여"는 일반적으로 본 발명에 따른 화합물, 및 환자의 치료 과정 중에 화합물의 TLR4 안티센스 활성을 파괴하지 않는 질병 또는 질환을 치료하기 위해 유용한 다른 제제를 투여하는 것을 의미한다. 이러한 투여는 동시 투여, 뿐만 아니라 일시적으로 수초 내지 수일의 시간 간격을 둔 순서를 포함한, 임의의 순서로 이루어질 수 있다. 이러한 조합 치료는 또한 본 발명에 따른 화합물 및/또는 독립적으로 다른 제제의 1회 초과의 투여를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 화합물 및 다른 제제의 투여는 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해 이루어질 수 있다.
용어 "개체" 또는 "피검체" 또는 "척추 동물" 또는 "환자"는 일반적으로 인간과 같은 포유동물을 칭한다.
발현과 관련하여 사용되는 경우 용어 "저해하다" 또는 "하향 조절하다" 또는 "억제하다"는 일반적으로, 다른 경우에서는 반응 유발 및/또는 반응의 자극으로부터 발생할 수 있는 반응 또는 반응의 정성적 차이에서의 감소를 의미한다.
용어 "키나제 억제제"는 일반적으로 세포에서 인산화 의존성 세포 신호전달 및/또는 성장 경로를 길항시키거나 억제하는 분자를 의미한다. 키나제 억제제는 자연 발생되거나 합성될 수 있고, 경구 치료제로서 투여될 잠재성을 갖는 작은 분자를 포함한다. 키나제 억제제는 표적 키나제 분자의 활성화를 신속하고 특이적으로 억제하는 능력을 갖는다. 단백질 키나제는 부분적으로 이들이 매우 다양한 신호전달 및 성장 경로를 조절하므로 매력적인 약물 표적이고, 이는 많은 상이한 단백질을 포함한다. 이와 같이, 이들은 암, 심혈관 질병, 염증 질환, 당뇨병, 황반 변성 및 신경 장애를 포함하는, 키나제 신호전달과 관련된 질병의 치료에서 큰 잠재성을 갖는다. 키나제 억제제의 예는 소라페니브(sorafenib)(Nexavar®), 수텐트®(Sutent®), 다사티니브(dasatinib), 다사티니브™(Dasatinib™), 작티마™(Zactima™), 티커브™(Tykerb™) 및 STI571을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "선형 합성"은 일반적으로 올리고누클레오티드의 하나의 말단부에서 개시하고 다른 말단부로 선형적으로 진행하는 합성을 칭하는 것이다. 선형 합성은 올리고누클레오티드에 동일하거나 동일하지 않은 (길이, 염기 조성 및/또는 도입된 화학적 개질의 측면에서) 모노머 단위의 도입을 허용한다.
용어 "포유동물"은 특별히 인간, 인간이 아닌 영장류, 랫트, 마우스, 고양이, 개, 말, 소, 젖소, 돼지, 양 및 토끼를 포함하지만, 이에 제한되지 않은 온혈 척추 동물을 포함한다.
용어 "누클레오시드"는 일반적으로 당, 대개 리보오스 또는 데옥시리보오스, 및 퓨린 또는 피리미딘 염기로 이루어진 화합물을 칭한다.
용어 "누클레오티드"는 일반적으로 당에 부착된 인-함유 기를 포함하는 누클레오시드를 칭한다.
용어 "개질된 누클레오시드"는 일반적으로 개질된 헤테로사이클 염기, 개질된 당 부분, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 누클레오시드이다. 일부 구체예에서, 개질된 누클레오시드는 본원에 기술된 바와 같이, 비천연의 피리미딘 또는 퓨린 누클레오시드이다. 본 발명의 목적을 위하여, 개질된 누클레오시드, 피리미딘 또는 퓨린 유사체 또는 비-천연발생 피리미딘 또는 퓨린은 상호교환적으로 사용될 수 있는 것으로서, 비-천연발생 염기 및/또는 비-천연발생 당 부분을 포함하는 누클레오시드를 칭한다. 본 발명의 목적을 위하여, 염기는, 구아닌, 시토신, 아데닌, 티민 또는 우라실이 아닌 경우에 바-천연 염기인 것으로 고려되며, 당은 β-리보-푸라노시드 또는 2'-데옥시리보-푸라노시드가 아닌 경우에 비-천연 당인 것으로 고려된다.
본원에서 사용되는 용어 "개질된 올리고누클레오티드"는 이의 누클레오티드 중 적어도 두개가 합성 결합, 즉 하나의 누클레오티드의 5' 말단부와, 5' 누클레오티드 포스페이트가 임의 수의 화학적 기로 대체된 다른 누클레오티드의 3' 말단부 사이에 포스포디에스테르 결합과는 다른 결합에 의해 공유적으로 결합된 올리고누클레오티드를 기술한다. 용어 "개질된 올리고누클레오티드"는 또한 개질된 염기 및/또는 당을 지닌 적어도 하나의 누클레오티드, 예를 들어, 2'-O-치환된 리보누클레오티드, 5-메틸시토신 및 3'-O-치환된 리보누클레오티드를 갖는 올리고누클레오티드를 포함한다.
용어 "핵산"은 게놈 영역 또는 이로부터 전사된 RNA 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산은 mRNA이다.
용어 "누클레오티드 결합"은 일반적으로 인접한 누클레오시드들 간에 인 원자 및 하전된 또는 중성 기 (예를 들어, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 메틸포스포네이트)로 이루어진 이들의 당을 통해 2개의 누클레오시드를 연결(예를 들어, 3'-3', 2'-3', 2'-5', 3'-5', 5'-5')시키기 위한 화학적 결합을 칭한다.
용어 "올리고누클레오티드"는 복수의 결합된 누클레오시드 단위로부터 형성된 폴리누클레오시드를 칭한다. 누클레오시드 단위는 바이러스, 박테리아, 세포 잔해 또는 올리고누클레오티드-계열 조성물 (예를 들어, siRNA 및 microRNA)의 일부일 수 있다. 이러한 올리고누클레오티드는 또한 게놈 또는 cDNA를 포함하는 존재하는 핵산 공급원으로부터 획득될 수 있지만, 바람직하게 합성 방법에 의해 생산된다. 특정 구체예에서, 각 누클레오시드 단위는 헤테로사이클 염기 및 펜토푸라노실, 트레할로오스, 아라비노오스, 2'-데옥시-2'-치환된 누클레오시드, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노오스, 2'-O-치환된 아라비노오스 또는 헥소오스 당 기를 포함한다. 누클레오시드 잔기는 임의의 여러 공지된 누클레오시드간 결합에 의해 서로 커플링될 수 있다. 이러한 누클레오시드간 결합은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 실록산, 카보네이트, 카보알콕시, 아세트아미데이트, 카바메이트, 모르폴리노, 보라노, 티오에테르, 브릿징된 포스포라미데이트, 브릿징된 메틸렌 포스포네이트, 브릿징된 포스포로티오에이트, 및 설폰 누클레오시드간 결합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 용어 "올리고누클레오티드-계열 화합물"은 또한 하나 이상의 입체특이적 누클레오시드간 결합 (예를 들어, (Rp)- 또는 (Sp)-포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 또는 포스포트리에스테르 결합)을 갖는 폴리누클레오시드를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "올리고누클레오티드" 및 "디누클레오티드"는 결합이 포스페이트기를 포함하거나 포함하지 않든지 간에 임의의 이러한 누클레오시드간 결합을 갖는 폴리누클레오시드 및 디누클레오시드를 포함하는 것으로 의도된다. 특정의 대표적인 구체예에서, 이러한 누클레오시드간 결합은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 결합, 또는 이들의 조합일 수 있다.
용어 "게놈 영역 또는 이로부터 전사된 RNA 분자에 대해 상보적인"은 생리학적 조건하에서, 예를 들어, 왓슨-크릭 염기 페어링 (올리고누클레오티드와 단일가닥 핵산 간의 상호작용)에 의해 또는 훅스틴 염기 페어링 (올리고누클레오티드와 이중가닥 핵산 간의 상호작용)에 의해, 또는 올리고누클레오티드의 경우에 RNA에 결합하고 유사매듭(pseudoknot) 형성을 야기시키는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 핵산 서열에 결합하는 올리고누클레오티드를 의미하는 것으로 의도된다. 생리학적 조건 하에서 왓슨-크릭 또는 훅스틴 염기 페어링에 의한 결합은 핵산 서열의 기능의 방해를 관찰함으로써 실제적인 측면에서 측정된다.
용어 "펩티드"는 일반적으로 생물학적 반응, 예를 들어, 펩티드가 합텐(hapten)이든지 아니든지 간에 항체 생산 또는 시토카인 활성에 영향을 미치는데 충분한 길이 및 조성을 갖는 폴리펩티드를 칭한다. 용어 "펩티드"는 개질된 아미노산 (천연발생 또는 비-천연발생이든지 간에)을 포함할 수 있으며, 여기서 이러한 개질은 인산화, 당화, 페그화, 지질화 및 메틸화를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "약제학적으로 허용되는"은 본 발명에 따른 화합물의 효능 또는 본 발명에 따른 화합물의 생물학적 활성을 방해하지 않는 비독성 물질을 의미한다.
용어 "생리학적으로 허용되는"은 세포, 세포 배양물, 조직, 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템과 양립가능한 비독성 물질을 칭한다. 바람직하게는, 생물학적 시스템은 살아있는 유기체, 예를 들어, 포유동물, 특히 인간이다.
용어 "예방학적 유효량"은 일반적으로 요망되지 않는 생물학적 효과를 억제하거나 이의 발달을 감소시키는데 충분한 양을 칭한다.
용어 "치료학적 유효량" 또는 "약제학적 유효량"은 일반적으로 질병 또는 질환의 징후 또는 증상의 예방, 감소, 완화 또는 제거를 포함하지만 이에 제한되지 않는 유익한 결과와 같은 요망되는 생물학적 효과에 영향을 미치는데 충분한 양을 칭한다. 이에 따라, 약제학적 조성물 또는 방법의 각 활성 성분의 전체 양은 의미있는 환자의 유익, 예를 들어, 면역 자극을 특징으로 하는 만성 질환의 치유 (그러나, 이에 제한되지 않음)를 나타내는데 충분하다. 이에 따라, "약제학적 유효량"은 투여되는 상황에 의존적일 것이다. 약제학적 유효량은 하나 이상의 예방적 또는 치료적 투여로 투여될 수 있다. 단독으로 투여된 개개의 활성 성분에 적용되는 경우에, 이러한 용어는 그러한 성분 단독의 양을 칭한다. 조합으로 적용되는 경우에, 이러한 용어는 조합으로, 연속적으로 또는 동시에 투여되든지 간에 치료 효과를 나타내는 활성 성분들의 조합된 양을 칭한다.
용어 "치료"는 일반적으로 증상의 완화, 또는 질환 진행의 지연 또는 개선을 포함할 수 있는, 유익하거나 요망되는 결과를 얻기 위해 의도된 방법을 칭한다.
본 발명은 인간 TLR4에 특이적인 핵산에 상보적인 안티센스 올리고누클레오티드를 제공한다(SEQ ID NO: 282). 본 발명에 따른 안티센스 올리고누클레오티드는, (ⅰ) TLR4 mRNA 코딩 서열, 5' 비번역 영역 또는 3' 비번역 영역의 표적화된 영역, (ⅱ) 이의 화학적 개질(들), 또는 (ⅲ) 상기 (ⅰ) 및 (ⅱ) 둘 모두와 관련하여 최적화된다. 일부 구체예에서, 화합물은 TLR4 mRNA의 코딩 영역의 누클레오티드 142 내지 2661, 또는 5' 비번역 영역의 누클레오티드 1-141, 또는 3' 비번역 영역의 2662-5503 내의 영역에 상보적이다(SEQ ID NO: 282).
본 발명에 따른 안티센스 올리고누클레오티드는 TLR4-매개된 면역 반응의 억제가 유익한, 질환을 치료하고/거나 예방함에 있어 유용하다. 유용한 본 발명에 따른 TLR4-표적 안티센스 올리고누클레오티드는 천연발생 누클레오티드, 개질된 누클레오티드, 개질된 올리고누클레오티드 및/또는 골격 개질된 올리고누클레오티드를 포함하는 안티센스 올리고누클레오티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 그러나, mRNA 엔코딩된 단백질의 번역을 억제하는 안티센스 올리고누클레오티드는 불충분한 활성 안티센스 올리고누클레오티드, 부족한 생체이용률, 최적이하의 약물동력학 또는 약력학, 및 면역 자극을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 요망되지 않는 생물학적 효과를 형성시킬 수 있다. 이에 따라, 본 발명에 따른 안티센스 올리고누클레오티드의 최적의 디자인은 상보적인 서열의 단순한 디자인 이상의 여러 고려사항들을 요구한다. 이에 따라, 본 발명에 따른 TLR4-표적 안티센스 올리고누클레오티드의 제조는 안티센스 활성으로 2차 구조 간섭을 제한하고/거나, 올리고누클레오티드의 표적 특이성을 향상시키고/거나, 결합 또는 경쟁 인자 (예를 들어, 단백질)와의 상호작용을 최소화하고/거나, 세포내 흡수, 안정성, 생체이용률, 약물동력학 및 약력학을 최적화하고/거나, 면역 세포 활성화를 저해, 방해 또는 억제하는데 필수적인 변화를 도입하도록 의도된다.
인간 TLR4 유전자가 내피 세포, B 세포 및 골수 세포에서 가장 풍부한, 조직 특이적 방식으로 발현되는 4kb, 5kb 및 7kb 전사체로 발현되는 것으로 결정되었다[Medzhitov et al. (1997) Nature 388:394-397; Rock et al. (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. 95:588-593]. 전사체는 인간에서 841개의 아미노산 단백질을 엔코딩하는 2.5kb의 코딩 영역을 함유한다. 본 발명의 올리고누클레오티드는 TLR4 발현을 억제하기 위한 표적으로서 가장 효과적으로 작용하는 TLR4 핵산 서열의 최적으로 이용가능한 부분과 특이적으로 하이브리드화 되도록 고안된다. TLR4 유전자의 이러한 표적 영역은 공지된 엑손 또는 5' 비번역 영역의 부분을 포함한다. 또한, 인트론-엑손 경계, 3' 비번역 영역 및 인트론은 TLR4 발현의 안티센스 억제를 위한 잠재적으로 유용한 표적이다. 인간 TLR4에 대해 특이적인 일부 대표적인 비제한적 올리고누클레오티드의 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1 - 281을 갖는다. 본 발명에 따른 최적화된 올리고누클레오티드의 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7, 8, 17, 24, 30, 49, 86, 100, 102, 115, 121, 126, 136, 146, 184 또는 256를 갖는 서열을 포함한다.
본 발명의 올리고누클레오티드는 길이가 적어도 14개의 누클레오티드이지만, 바람직하게 길이가 15개 내지 60개의 누클레오티드, 바람직하게 길이가 20개 내지 50개의 누클레오티드이다. 일부 구체예에서, 이러한 올리고누클레오티드는 약 14개 내지 28개의 누클레오티드, 또는 약 16개 내지 25개의 누클레오티드, 또는 약 18개 내지 22개의 누클레오티드, 또는 20개의 누클레오티드를 함유한다. 이러한 올리고누클레오티드는 수작업으로 또는 자동화된 합성기에 의해 수행될 수 있는 포스포라미데이트 또는 H-포스포네이트 화학과 같은 당해 분야에 인식된 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 합성 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드는 TLR4 mRNA에 하이브리드화하기 위한 이들의 능력을 손상시키지 않는 여러 방법으로 개질될 수 있다. 이러한 개질은 알킬포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스페이트 에스테르, 알킬포스포노티오에이트, 포스포라미데이트, 카바메이트, 카보네이트, 포스페이트 트리에스테르, 아세트아미데이트 또는 카르복시메틸 에스테르 또는 이들의 조합인 올리고누클레오티드의 적어도 하나의 누클레오티드간 결합, 및 하나의 누클레오티드의 5' 말단부와, 5' 누클레오티드 포스포디에스테르 결합이 임의의 수의 화학적 기로 대체된 다른 누클레오티드의 3' 말단부 간의 다른 누클레오티드 결합을 포함할 수 있다.
예를 들어, 미국특허번호 제5,149,797호에는 메틸포스포네이트 또는 포스포라미데이트 측부 영역들 사이에 개입된 포스포로티오에이트 코어 영역을 갖는 전통적인 키메라 올리고누클레오티드가 기재되어 있다. 미국특허번호 제5,652,356호에는 올리고누클레오티드 포스포로티오에이트의 하나 이상의 영역에 의해 측부에 위치된 하나 이상의 비이온성 올리고누클레오티드 영역(예를 들어, 알킬포스포네이트 및/또는 포스포라미데이트 및/또는 포스포트리에스테르 누클레오시드간 결합)을 포함하는 "역위된"(inverted) 키메라 올리고누클레오티드가 기재되어 있다. 개질된 누클레오티드간 결합을 갖는 다양한 올리고누클레오티드는 표준 방법에 따라 제조될 수 있다. 포스포로티오에이트 결합은 혼합된 Rp 및 Sp 거울상이성질체일 수 있거나, 이러한 것들은 표준 절차에 따라 Rp 또는 Sp 형태로 입체규칙적 또는 실질적으로 입체규칙적으로 제조될 수 있다.
자가-안정화된 올리고누클레오티드가 또한 본 발명의 방법에서 유용한 개질된 올리고누클레오티드인 것으로 여겨진다 [Tang et al. (1993) Nucleic Acids Res. 20:2729-2735]. 이러한 올리고누클레오티드는 두개의 영역을 포함한다: 표적 하이브리드화 영역; 및 자가-안정화된 올리고누클레오티드내에 존재하는 핵산 서열에 대해 상보적인 올리고누클레오티드 서열을 갖는 자기-상보적 영역.
다른 개질은 올리고누클레오티드 분자의 내부 또는 말단부(들)에 존재하는 개질을 포함하고, 누클레오시드간 포스페이트 결합, 예를 들어, 콜레스테롤, 콜레스테릴, 또는 아미노 기들 사이에 다양한 수의 탄소 잔기를 갖는 디아민 화합물의 분자에 첨가, 및 절단되거나 반대 사슬에 또는 게놈에 결합하는 관련 효소 또는 다른 단백질에 가교하는 말단 리보오스, 데옥시리보오스 및 포스페이트 개질을 포함한다. 이러한 개질된 올리고누클레오티드의 예는 개질된 염기 및/또는 리보오스 대신에 아라비노오스와 같은 당을 갖는 올리고누클레오티드, 또는 이의 3' 및 5' 위치 모두에 히드록실기(이의 3' 위치에)가 아닌 그리고 포스페이트 기(이의 5' 위치에)가 아닌 화학적 기에 부착된 당을 갖는 3',5'-치환된 올리고누클레오티드를 포함한다.
당에 대한 개질의 다른 예는 1-6개의 포화되거나 불포화된 탄소 원자를 함유한 -O-알킬기, 또는 2-6개의 탄소 원자를 갖는 -O-아릴 또는 -O-알릴기로의 2'-O-치환을 포함하지만 이에 제한되지 않은 리보오스 부분의 2' 위치에 대한 개질을 포함하며, 여기서 이러한 -O-알킬, -O-아릴 또는 -O-알릴기는 비치환될 수 있거나, 예를 들어, 할로, 히드록시, 트리플루오로메틸 시아노, 니트로 아실, 아실옥시, 알콕시, 카르복시, 카르브알콕실 또는 아미노기로 치환될 수 있다. 이러한 치환 중 어떠한 것도 리보오스의 경우에 본래 2'-히드록실기 또는 데옥시리보오스의 경우에 2'1-H-를 배제하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명에 따른 올리고누클레오티드는 하나 이상의 리보누클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국특허번호 제5,652,355호에는 DNA 코어 영역의 측부에 위치한 2'-O-치환된 리보누클레오티드의 영역을 갖는 전통적인 하이드리드 올리고누클레오티드가 기재되어 있다. 미국특허번호 제5,652,356호에는 두개의 올리고데옥시리보누클레오티드 영역들 사이에 "전통적인" 하이브리드 올리고누클레오티드에 대해 "역위된 구조를 갖는 2'-O-치환된 (또는 2' OH, 비치환된) RNA 영역을 포함하는 올리고누클레오티드를 포함하는 "역위된" 하이브리드 올리고누클레오티드가 기재되어 있다. 본 발명의 특히 유용한 올리고누클레오티드의 비제한적인 예는 이들의 3', 5', 또는 3' 및 5' 말단에서 2'-O-알킬화된 리보누클레오티드를 가지며, 여기서 적어도 4개 또는 5개의 인접 누클레오티드가 개질되어 있다. 2'-O-알킬화된 기의 비제한적인 예는 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-O-프로필, 2'-O-부틸 및 2'-O-에톡시-메틸을 포함한다.
다른 개질된 올리고누클레오티드는 이들의 3' 및/또는 5' 말단부(들)에 누클레아제 저항-부여 벌크 치환체(nuclease resistance-conferring bulky substituent)로 캡핑되거나, 누클레오티드 당 하나의 비-브릿징 산소에 치환을 갖는다. 이러한 개질은 누클레오시드간 결합의 일부 또는 전부, 뿐만 아니라 올리고누클레오티드의 각 말단부 또는 양 말단부에서 및/또는 분자의 내부에서 일어날 수 있다.
본 발명의 올리고누클레오티드는 본 발명의 안티센스 분자와 동일한 영역을 표적으로 하지 않는 하나 이상의 안티센스 올리고누클레오티드 또는 다른 핵산 함유 화합물과 조합하여 투여될 수 있다. 이러한 다른 핵산 함유 화합물은 리보자임, RNAi 분자, siRNA, miRNA 및 앱타머를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 올리고누클레오티드는 본 발명에 따른 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드의 존재하에서 TLR4 매개 면역 반응을 활성화시키는 하나 이상의 화합물 또는 조성물과 조합하여 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 올리고누클레오티드는 하나 이상의 백신, 항원, 항체, 세포독성제, 알레르겐, 항생제, TLR 길항제, siRNA, miRNA, 안티센스 올리고누클레오티드, 앱타머, 펩티드, 단백질, 유전자 치료 벡터, DNA 백신, 애주번트, 키나제 억제제, STAT 단백질의 억제제 또는 공동 자극 분자, 또는 이들의 조합물과 조합하여 투여될 수 있다.
TLR4 안티센스 올리고누클레오티드의 비제한적인 리스트는 하기 표 2의 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO: 281에 기술되어 있다. 본 발명에 따른 최적화된 안티센스 올리고누클레오티드는 SEQ ID NO: 7, 8, 17, 24, 30, 49, 86, 100, 102, 115, 121, 126, 136, 146, 184 또는 256을 갖는 안티센스 올리고누클레오티드이다. 표 2에서, 올리고누클레오티드-계열 TLR4 안티센스 화합물은 모든 포스포로티오에이트 (PS) 결합을 갖는다. 그러나, 당업자는, 포스포디에스테르 (PO) 결합, 또는 PS 및 PO 결합의 혼합물이 사용될 수 있는 것을 인식할 것이다.
표 2
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
AS는 안티센스의 약어이다. 밑줄쳐진 누클레오티드는 2'-O-메틸리보누클레오티드이며; 나머지 모두는 2'-데옥시리보누클레오티드이다. 본 발명에 따른 예시적인 안티센스 올리고누클레오티드에서, "CG" 디누클레오티드가 서열에 함유되는 경우에, 이러한 올리고누클레오티드는 올리고누클레오티드의 면역 자극성 성질을 제거하거나 억제하도록 개질된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 최적화된 안티센스 올리고누클레오티드, 및 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 담체의 특징은 투여 경로에 따를 것이다. 이러한 조성물은 합성 올리고누클레오티드 및 담체 이외에, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 및 당해 분야에 널리 공지된 다른 물질을 함유할 수 있다. 본 발명의 약제 조성물은 또한 TLR4 발현의 억제를 향상시키는 다른 활성 인자 및/또는 제제를 함유할 수 있다. 예를 들어, 각각이 TLR4 mRNA의 상이한 영역들과 관련된 합성 올리고누클레오티드의 조합이 본 발명의 약제 조성물에서 사용될 수 있다. 본 발명의 약제 조성물은 누클레오티드 유사체, 예를 들어, 아지도티미딘, 디데옥시시티딘, 디데옥시이노신 등을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 추가 인자 및/또는 제제는 본 발명의 합성 올리고누클레오티드와의 상승적, 부가적 또는 향상된 효과를 형성시키거나 본 발명의 합성 올리고누클레오티드에 의해 야기된 부작용을 최소화하기 위해 약제 조성물 중에 포함될 수 있다. 본 발명의 약제 조성물은 리포좀의 형태로 존재할 수 있는데, 여기서 본 발명의 합성 올리고누클레오티드가 다른 약제학적으로 허용되는 담체 이외에, 양친매성 제제(amphipathic agent), 예를 들어, 마이셀, 불용성 단일층, 액정, 또는 수용액에 존재하는 라멜라 층으로서의 응집된 형태로 존재하는 지질과 조합된다. 리포좀 제형을 위한 적합한 지질은 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 설파타이드, 리소레시틴, 인지질, 사포닌, 담즙산, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 하나의 특히 유용한 지질 담체는 리포펙틴이다. 이러한 리포좀 제형의 제조는, 예를 들어, 미국특허번호 제4,235,871; 4,501,728; 4,837,028; 및 4,737,323호에 기술된 바와 같이, 당해 기술의 수준내에 존재한다. 본 발명의 약제 조성물은 세포 또는 서방형 폴리머로 올리고누클레오티드의 전달을 향상시키는 시클로덱스트린 등과 같은 화합물을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 TLR4 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 본 발명의 하나의 올리고누클레오티드 또는 다수의 올리고누클레오티드는 시험관내 또는 세포에서 TLR4 mRNA과 특이적으로 접촉되거나 이와 하이브리드화된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물, 특히 인간에서 TLR4의 발현을 저해하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 본 발명에 따른 화합물 또는 조성물을 상기 포유동물에 투여하는 것을 포함한다. 당업자는 본 발명에 따른 안티센스 화합물 및 조성물이 다양한 수단을 통해 투여될 수 있음을 인지할 것이다. 하나의 이러한 투여 수단은 실시예 3에 따른다. 본 발명에 따른 화합물 또는 조성물의 안티센스 활성은 TLR4 mRNA 및 TLR4 단백질 농도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 데이터는 본 발명에 따른 예시적 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드의 투여가 생체내에서 TLR4 발현의 하향조절을 야기시킬 수 있음을 입증하는 것을 예기한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 TLR 매개 면역 반응을 저해하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 약학적 유효량의 본 발명에 따른 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드를 상기 포유동물에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 투여 경로는 비경구, 근내, 피하, 복막내, 정맥내, 점막 전달, 경구, 설하, 경피, 국소, 흡입, 비내, 에어로졸, 안내, 기관내, 직장내, 질내, 유전자총(gene gun), 피부 패치 또는 점안약 또는 구강세척제 형태를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 당업자는 하나의 상기 투여가 실시예 3에 따라 달성되거나 공지된 방법에 의해 달성될 수 있음을 인지할 것이다. 본 발명에 따른 화합물 또는 조성물의 안티센스 활성은 TLR4 신호전달과 관련된 생체마커를 측정, 예를 들어, 비제한적인 예로 IL-12를 측정함으로써 결정될 수 있다. 데이터는 본 발명에 따른 예시적 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드의 투여가 생체내에서 TLR4 발현의 하향조절을 야기시키거나, TLR4 효능제에 의해 IL-12의 유도를 방지할 수 있음을 입증하는 것을 예기한다. 더욱 일반적으로, 데이터는 TLR4 효능제에 의한 전염증성 사이토카인의 유도를 억제하는 본 발명에 따른 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드의 능력을 입증하는 것을 예기한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물, 특히 인간에 본 발명의 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드를 약제학적 유효량으로 투여함을 포함하여, TLR4에 의해 매개되는 질병을 갖는 척추 동물을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 구체예에서, 이러한 질병은 암, 자가면역 장애, 기도 염증, 염증 장애, 감염성 질병, 말라리아, 라임병, 안구 감염증, 결막염, 피부 장애, 건선, 피부경화증, 심혈관 질병, 죽상경화증, 만성 피로 증후군, 사르코이드증, 이식 거부, 알레르기, 천식 또는 병원체에 의해 야기된 질병이다. 바람직한 자가면역 장애는 홍반루푸스, 다발 경화증, 제 1형 당뇨병, 과민성 대장증후군, 크론병, 류마티스 관절염, 패혈 쇼크, 범발성 탈모증, 급성 파종 뇌척수염, 애디슨 병, 강직성 척추염, 항인지질 항체 증후군, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 수포성 유천포창, 샤가스 병, 만성 폐쇄성 폐질환, 복강 질병, 피부근염, 자궁내막증, 굿파스처 증후군, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토병, 화농성 땀샘염, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 간질성 방광염, 국소피부경화증, 중증 근무력증, 기면증, 신경근 긴장증, 천포창, 악성 빈혈, 다발성 근염, 원발성 담즙성 간경변증, 정신분열증, 쇼그렌 증후군, 측두 동맥염 ("거대 세포 동맥염"), 맥관염, 백반증, 외음부 통증 및 베게너 육아종증을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구체예에서, 염증 장애는 기도 염증, 천식, 자가면역 질병, 만성 염증, 만성 전립선염, 사구체신염, 베체트병, 과민증, 염증성 장 질병, 재관류 손상, 류마티스 관절염, 이식 거부, 궤양성 대장염, 포도막염, 결막염 및 맥관염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 TLR4에 의해 매개되는 질병 또는 장애에 걸리거나 발병할 위험이 있는 동물, 특히 인간에서의 질병 또는 장애를 예방하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 동물에 예방학적 유효량의 본 발명에 따른 안티센스 올리고누클레오티드 또는 조성물을 투여함을 포함한다. 이러한 질병 및 장애는 암, 자가면역 장애, 기도 염증, 염증 장애, 감염성 질병, 말라리아, 라임병, 안구 감염증, 결막염, 피부 장애, 건선, 피부경화증, 심혈관 질병, 죽상경화증, 만성 피로 증후군, 사르코이드증, 이식 거부, 알레르기, 천식 또는 척추 동물에서 병원체에 의해 야기된 질병을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 자가면역 장애는 홍반루푸스, 다발 경화증, 제 1형 당뇨병, 과민성 대장증후군, 크론병, 류마티스 관절염, 패혈 쇼크, 범발성 탈모증, 급성 파종 뇌척수염, 애디슨 병, 강직성 척추염, 항인지질 항체 증후군, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 수포성 유천포창, 샤가스 병, 만성 폐쇄성 폐병, 복강 질환, 피부근염, 자궁내막증, 굿파스처 증후군, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토병, 화농성 땀샘염, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 간질성 방광염, 국소피부경화증, 중증 근무력증, 기면증, 신경근 긴장증, 천포창, 악성 빈혈, 다발성 근염, 원발성 담즙성 간경변증, 정신분열증, 쇼그렌 증후군, 측두 동맥염 ("거대 세포 동맥염"), 맥관염, 백반증, 외음부 통증 및 베게너 육아종증을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 염증 장애는 기도 염증, 천식, 자가면역 질병, 만성 염증, 만성 전립선염, 사구체신염, 베체트병, 과민증, 염증성 장 질병, 재관류 손상, 류마티스 관절염, 이식 거부, 궤양성 대장염, 포도막염, 결막염 및 맥관염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 TLR4 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고누클레오티드 및 TLR4 단백질의 길항제, 키나제 억제제 또는 STAT 단백질의 억제제를 포유동물에 투여하는 것을 포함하여, 포유동물에서 TLR4 발현 및 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 따라서, TLR4 발현은 안티센스 올리고누클레오티드에 의해 억제되고, 나머지 발현된 임의의 TLR4 단백질은 길항제에 의해 억제된다. 바람직한 길항제는 항-TLR4 항체 또는 이의 결합 단편 또는 펩티도미메틱(peptidomimetic), RNA 계열 화합물, 올리고누클레오티드 계열 화합물, 및 TLR4 활성 또는 신호전달 단백질 활성의 소분자 억제제를 포함한다.
본 발명에 따른 다양한 방법에서, 치료학적 또는 예방학적 유효량의, TLR4의 발현을 억제하는데 효과적인 본 발명의 합성 올리고누클레오티드가 세포에 투여된다. 이러한 세포는 세포 배양물, 신생혈관형성된 조직 배양물의 일부일 수 있거나, 동물, 예를 들어, 인간 또는 다른 포유동물의 일부 또는 전신일 수 있다. TLR4 안티센스 올리고누클레오티드의 치료학적 조성물의 투여는 당업자에 의해 결정되는 바와 같이, 질환 및 반응에 따라, 질환의 증상 또는 대리 표시자(surrogate marker)를 감소시키는데 효과적인 투여량 및 시간으로 공지된 절차를 이용하여 수행될 수 있다. 치료학적 유효량의 하나 이상의 본 발명의 치료학적 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드를 단일 치료 에피소드(single treatment episode)로서 개체에 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 상술된 본 발명의 방법의 일부 대표적인 구체예에서, 올리고누클레오티드는 국소적으로 및/또는 전신으로 투여된다. 용어 "국소적으로 투여된"은 신체의 규정된 구역 또는 영역으로의 전달을 칭하는 반면, 용어 "전신 투여"는 전체 유기체로의 전달을 포함한다는 의미를 갖는다.
본 발명에 따른 임의의 방법에서, TLR4 안티센스 올리고누클레오티드 중 하나 이상은 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드의 면역조절 효과를 감소시키지 않는 질병 또는 질환을 치료하기 위해 단독으로 또는 유용한 임의의 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 임의의 방법에서, 질병 또는 질환을 치료하기 위해 유용한 제제는 면역 반응의 특이성 또는 크기를 향상시키기 위한 하나 이상의 백신, 항원, 항체, 세포독성제, 알레르겐, 항생제, 안티센스 올리고누클레오티드, TLR 효능제, TLR 길항제, siRNA, miRNA, 앱타머, 펩티드, 단백질, 유전자 치료 벡터, DNA 백신, 애주번트 또는 키나제 억제제, 또는 공동-자극 분자, 예를 들어, 시토카인, 케모카인, 단백질 리간드, 트랜스-활성 인자(trans-activating factor), 펩티드 및 개질된 아미노산을 포함한 펩티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 자가면역 질병의 치료에서, TLR4 안티센스 올리고누클레오티드가 하나 이상의 표적화된 치료제 및/또는 모노클론 항체와 조합하여 투여될 수 있는 것이 고려된다. 대안적으로, 이러한 제제는 항원 또는 알레르겐(allergen)을 엔코딩하는 DNA 벡터를 포함할 수 있다. 이러한 구체예에서, 본 발명의 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드는 직접 면역 조절 또는 억제 효과를 형성시킬 수 있다. 하나 이상의 다른 치료제가 동시-투여될 때, 본 발명의 합성 올리고누클레오티드는 다른 치료법(들)과 동시에, 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 다양한 방법에서, 투여 경로는 비경구, 점막 전달, 경구, 설하, 경피, 국소, 흡입, 비강내, 에어로졸, 안구내, 기관내, 직장내, 질내, 유전자 총, 피부 패치 또는 점안약 또는 구강세척제 형태일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
치료학적 유효량의 본 발명의 합성 올리고누클레오티드가 경구적으로 투여될 때, 합성 올리고누클레오티드는 정제, 캡슐, 분말, 용액 또는 엘릭서(elixir)의 형태로 존재할 것이다. 정제 형태로 투여될 때, 본 발명의 약제 조성물은 젤라틴 또는 애주번트와 같은 고체 담체를 추가적으로 함유할 수 있다. 정제, 캡슐, 및 분말은 약 5 내지 95% 합성 올리고누클레오티드 및 바람직하게는 약 25 내지 90% 합성 올리고누클레오티드를 함유한다. 액체 형태로 투여될 때, 물, 원유, 동물 기원 오일, 또는 땅콩 오일, 미네랄 오일, 대두유, 참깨 오일과 같은 식물 기원의 오일, 또는 합성 오일과 같은 액체 담체가 첨가될 수 있다. 액체 형태의 약제 조성물은 생리학적 염수 용액, 덱스트로오스 또는 다른 당류 용액 또는 글리콜, 예를 들어, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 추가로 함유할 수 있다. 액체 형태로 투여될 때, 약제 조성물은 약 0.5 내지 90 중량%의 합성 올리고누클레오티드 또는 약 1 내지 50 중량%의 합성 올리고누클레오티드를 함유한다.
치료학적 유효량의 본 발명의 합성 올리고누클레오티드가 비경구, 점막 전달, 경구, 설하, 경피, 국소, 흡입, 비강내, 에어로졸, 안구내, 기관내, 직장내, 질내, 유전자총, 피부 패치 또는 점안약 또는 구강세척제 형태에 의해 투여될 때, 합성 안티센스 올리고누클레오티드는 발열원 부재의 비경구적으로 허용가능한 수용액의 형태일 것이다. pH, 등장성, 안정성 등을 고려한, 이러한 비경구적으로 허용가능한 용액의 제조가 당해 분야내에서 이루어진다. 비경구, 점막 전달, 경구, 설하, 경피, 국소, 흡입, 비강내, 에어로졸, 안구내, 기관내, 직장내, 질내, 유전자 총, 피부 패치 또는 점안약 또는 구강세척제 형태를 위한 약제 조성물은 합성 올리고누클레티드 이외에, 등장성 비히클(isotonic vehicle), 예를 들어, 소듐 클로라이드 주사액, 링거 주사액, 덱스트로오스 주사액, 덱스트로오스 및 소듐 클로라이드 주사액, 락테이트화된 링거 주사액(Lactated Ringer Injection) 또는 당해 분야에 공지된 다른 비히클을 함유할 것이다. 본 발명의 약제 조성물은 또한 안정화제, 보존제, 완충제, 항산화제, 또는 당업자에게 공지된 다른 첨가제를 함유할 수 있다.
비경구, 점막 전달, 경구, 설하, 경피, 국소, 흡입, 비강내, 에어로졸, 안구내, 기관내, 직장내, 질내, 유전자총, 피부 패치 또는 점안약 또는 구강세척제 형태로 투여될 때, 0.01% 내지 10%(중량/부피)의 범위가 사용될 수 있다. 액체 형태로 투여될 때, 물, 원유, 동물 기원 오일, 또는 땅콩 오일, 미네랄 오일, 대두유, 참깨 오일와 같은 식물 기원의 오일, 또는 합성 오일과 같은 액체 담체가 첨가될 수 있다. 국소 투여는 리포좀 또는 경피 시간-방출 패치(time-release patch)에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 약제 조성물 중 합성 올리고누클레오티드의 양은 치료될 질환의 특성 및 중증도, 및 환자에게 수행된 종래 치료의 특징에 따를 것이다. 본 발명의 방법을 실행하기 위해 사용되는 다양한 약제 조성물은 신체 또는 기관(organ) 중량 1 kg 당 약 10 마이크로그램 내지 약 20 mg의 합성 올리고누클레오티드를 함유할 것으로 고려된다.
본 발명의 약제 조성물을 이용한 정맥내 치료의 지속시간은 치료될 질병의 중증도, 및 각 개별적인 환자의 상태 및 가능한 특이 반응(idiosyncratic response)에 따라 변경될 것이다.
일부 질병은 급성 치료에 알맞지만, 다른 질환들은 보다 장기간의 치료를 요구한다. 질병에서 급성 및 장기간 개입(intervention) 둘 모두는 가치있는 목표이다. TLR4에 대한 안티센스 올리고누클레오티드의 주입은 급성 상황에서 특정 질환을 억제하는 효과적인 수단일 수 있다. 그러나, 수주, 수개월 또는 수년의 기간에 걸친 장기간 치료에 대하여, 염수, 서방형 폴리머 또는 리포좀과 같은 담체를 이용한 전신 전달(복막내, 근육내, 피하, 정맥내)이 고려되는 것이 가능하다.
일부 만성 질환에서, 올리고누클레오티드의 전신 투여가 바람직할 수 있다. 주입 횟수는 연속 주입 내지 1개월에 한번, 1개월에 여러 차례일 수 있거나 보다 적은 횟수가 질병 과정(disease process) 및 올리고누클레오티드의 생물학적 반감기를 기초로 하여 결정될 것이다.
본 발명의 올리고누클레오티드 및 방법은 또한 세포 또는 대조 포유동물, 또는 TLR4과 관련된 질병 또는 TLR4을 통한 면역 자극과 관련된 질병에 걸린 포유동물에서 TLR4 유전자의 기능을 시험하기 위해 유용하다. 이러한 사용에서, 세포 또는 포유동물에는 올리고누클레오티드가 투여되며, TLR4 mRNA 또는 단백질의 발현이 시험된다.
임의의 이론 또는 메카니즘으로 제한하는 것은 아니지만, 일반적으로 본 발명에 따른 올리고누클레오티드의 활성이 표적 핵산(예를 들어, 게놈 영역, 유전자 또는 이의 mRNA 전사의 적어도 일부)에 대한 올리고누클레오티드의 하이브리드화에 따르며, 이에 따라 표적의 기능을 붕괴시키는 것으로 여겨진다. 생리학적 조건 하에서의 이러한 하이브리드화는 핵산 서열의 기능의 간섭을 관찰함으로써 실제적인 측면으로서 측정된다. 이에 따라, 본 발명에 따라 사용되는 예시적인 올리고누클레오티드는 표적 핵산을 갖는 안정한 듀플렉스(duplex) (또는 훅스틴 또는 다른 수소 결합 페어링 메카니즘에서의 트리플렉스(triplex))를 형성하고; RNase H 또는 다른 시험관내 효소를 활성화시켜 표적 RNA 분자의 효과적인 파괴를 야기시키고; 생체내에서 핵자간 분해(nucleolytic degradation)(예를 들어, 엔도누클레아제 및 엑소누클레아제 활성)를 방해할 수 있다. 상기 기재된 올리고누클레오티드에 대한 여러 개질 및 당해 분야에 공지된 다른 것들은 이러한 예시적인 특징들 각각을 특이적이고 성공적으로 다룬다.
본원에 인용된 특허 및 간행물은 당 분야의 지식 수준을 반영하며, 이의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다. 상기 특허 및 간행물의 교시와 본 발명의 명세서 사이의 임의의 불일치는 본 발명의 명세서를 우선으로 하여 해소된다. 당업자는 본원에 기재된 특정 물질 및 절차에 대한 다수의 등가물을 인지하거나, 통상적인 실험을 이용하여 이를 확인할 수 있을 것이다. 예를 들어, 올리고누클레오티드와 중첩되는 안티센스 올리고누클레오티드가 사용될 수 있다. 이러한 동등물은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 간주된다.
하기 실시예들은 본 발명을 제조하고 실행하는 예시적인 모드를 예시한 것으로서, 이는 유사한 결과를 얻기 위해 또다른 방법들이 사용될 수 있는 바, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1:
TLR4 -특이적 안티센스 올리고누클레오티드의 제조
본 발명에 따른 화학물질을 자동화된 DNA 합성기 (OligoPilot II, AKTA, (Amersham) 및/또는 Expedite 8909 (Applied Biosystem))을 이용하여 1 μmol 내지 0.1 mM 스케일로 합성하였는데, 도 1에 개략된 선형 합성 절차를 따랐다.
5'-DMT dA, dG, dC 및 T 포스포라미다이트를 Proligo (Boulder, CO)로부터 구입하였다. 5'-DMT 7-데아자-dG 및 araG 포스포라미다이트를 Chemgenes (Wilmington, MA)로부터 입수하였다. DiDMT-글리세롤 링커(linker) 고체 지지체를 Chemgenes로부터 입수하였다. 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-퓨린 아미다이트를 Glen Research (Sterling, VA)로부터 입수하였으며, 2'-O-메틸리보누클레오시드 아미다이트를 Promega (Obispo, CA)로부터 입수하였다. 본 발명에 따른 모든 화합물들은 포스포로티오에이트 골격 개질되었다.
모든 누클레오시드 포스포라미다이트를 31P 및 1H NMR 스펙트럼으로 특징분석하였다. 개질된 누클레오시드를 공급업체에 의해 제안된 일반 커플링 사이클을 이용하여 특정 부위에 도입하였다. 합성 후에, 화합물을 진한 암모늄 히드록사이드를 이용하여 탈보호화하고 역상 HPLC, 탈트리틸화(detritylation), 이후 투석으로 정제하였다. 소듐 염 형태로서의 정제된 화합물을 사용 전에 동결건조하였다. 순도를 CGE 및 MALDI-TOF MS로 시험하였다. 엔도톡신 수준을 LAL 시험으로 결정하였고, 이는 1.0 EU/mg 미만이었다.
실시예 2:
세포 배양 조건 및 시약
TLR4 안티센스 활성을 위한 HEK293 세포 배양 검정
인간 TLR4/CD14/MD-2(Invivogen, San Diego, CA)을 안정하게 발현시키는 HEK293 세포를 5% CO2 인큐베이터에서 10% 열-비활성화된 FBS가 보충된 250 ㎕/웰 DMEM 중의 48-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 80% 컨플루언스(confluence)에서, 배양물을 배양 배지 중 4 ㎕/mL의 리포펙타민 (Invitrogen, Carlsbad, CA)의 존재하에 400 ng/mL의 분비된 형태의 인간 배아 알칼리 포스파타제 (SEAP) 수용체 플라스미드 (pNifty2-Seap) (Invivogen)로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. SEAP 리포터 플라스미드를 NF-κB로 유도하였다. 플라스미드 DNA 및 리포펙타민을 혈청-부재 배지에 별도로 희석시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 희석된 DNA 및 리포펙타민을 혼합하고, 혼합물을 실온에서 20분 동안 추가로 인큐베이션하였다. 100 ng의 플라스미드 DNA 및 1 ㎕의 리포펙타민을 함유한 25 ㎕의 DNA/리포펙타민 혼합물의 분취액을 세포 배양 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 세포를 6 시간 동안 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후에, 배지를 새로운 배양 배지 (항생제 존재하지 않음)로 교체하고, 안티센스 화합물을 웰에 첨가하고, 18-20 시간 동안 인큐베이션하였다. 이후에, 세포를 6 시간 동안 12.5 ng/ml의 인간 TLR4 효능제, LPS로 자극하였다.
처리 마지막에, 20 ㎕의 배양 상청액을 각 웰로부터 취하고, 제조업체 프로토콜(Invivogen)에 따라 퀀티 블루(Quanti Blue) 방법에 의한 SEAP 검정으로 검정하였다. 데이터는 도 2에 도시되어 있다. 도 2의 데이터는 대조군에 비한 NF-κB 활성을 도시하고, 이는 (ⅰ) 본 발명에 따른 예시적 인간 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드가 면역자극성이 아니고(안티센스 단독); 본 발명에 따른 예시적 인간 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드가 TLR4 발현 및 활성화를 억제(효능제 + 안티센스)하는 것을 입증한다.
실시예 3:
TLR4 안티센스 올리고누클레오티드의 생체내 활성
5-6주령의 암컷 C57BL/6 마우스 (N = 3/그룹)에 5 mg/kg의 본 발명에 따른 예시적 뮤린 TLR4 안티센스 올리고누클레오티드 또는 PBS를 3일 동안 하루에 한번씩 피하로 주입하였다. TLR4 안티센스 올리고누클레오티드를 투여한 후에, 마우스에 0.25 mg/kg의 TLR4 효능제를 피하로 주입하였다. TLR4 효능제를 투여하고 2 시간 후에, 혈액을 수집하고, TLR4 mRNA, TLR4 단백질 및 IL-12 농도를 ELISA로 결정하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Bhagat, Lakshmi Putta, Mallikarjuna Kandimalla, Ekambar R Wang, Daqing Yu, Dong Agrawal, Sudhir <120> Modulation of Toll-Like Receptor 4 Expression By Antisense Oligonucleotides <130> 09-909-WO <140> PCT/US2009/063254 <141> 2009-11-04 <150> US 61/111,148 <151> 2008-11-04 <160> 282 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 1 cagcaattgg tgtattcaaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 2 ctcttcctcg agccgcccca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 3 ttctgaggca ctggtgtctt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 4 tcaccgtctg accgagcagt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 5 tgtgaatgcg tggctcgcta 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial 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oligonucleotide <400> 70 ttgagaacag caacctttga 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 71 ctggttgtcc caaaatcact 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 72 tcagatctaa atactttagg 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 73 ggtaataaca ccattgaagc 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 74 cccaagaagt ttgaactcat 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 75 gatgttctag ttgttctaag 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 76 attggaatgc tggaaatcca 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 77 aactcactca tttgtttcaa 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 78 tgagtgatag gaatactgaa 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 79 gtcaaggtaa atgaggtttc 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 80 ctggtgtgag tatgagaaat 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 81 agatgccatt gaaagcaact 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 82 gagactggac aagccattga 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 83 ccagccattt tcaagacttc 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 84 agttttcctg gaaagaattg 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 85 tgtgaagata tctggaagga 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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gcatgcctgt gctgagtttg aatatcacct gtcagatgaa taagaccatc 2040 attggtgtgt cggtcctcag tgtgcttgta gtatctgttg tagcagttct ggtctataag 2100 ttctattttc acctgatgct tcttgctggc tgcataaagt atggtagagg tgaaaacatc 2160 tatgatgcct ttgttatcta ctcaagccag gatgaggact gggtaaggaa tgagctagta 2220 aagaatttag aagaaggggt gcctccattt cagctctgcc ttcactacag agactttatt 2280 cccggtgtgg ccattgctgc caacatcatc catgaaggtt tccataaaag ccgaaaggtg 2340 attgttgtgg tgtcccagca cttcatccag agccgctggt gtatctttga atatgagatt 2400 gctcagacct ggcagtttct gagcagtcgt gctggtatca tcttcattgt cctgcagaag 2460 gtggagaaga ccctgctcag gcagcaggtg gagctgtacc gccttctcag caggaacact 2520 tacctggagt gggaggacag tgtcctgggg cggcacatct tctggagacg actcagaaaa 2580 gccctgctgg atggtaaatc atggaatcca gaaggaacag tgggtacagg atgcaattgg 2640 caggaagcaa catctatctg aagaggaaaa ataaaaacct cctgaggcat ttcttgccca 2700 gctgggtcca acacttgttc agttaataag tattaaatgc tgccacatgt caggccttat 2760 gctaagggtg agtaattcca tggtgcacta gatatgcagg gctgctaatc tcaaggagct 2820 tccagtgcag agggaataaa tgctagacta aaatacagag tcttccaggt gggcatttca 2880 accaactcag tcaaggaacc catgacaaag aaagtcattt caactcttac ctcatcaagt 2940 tgaataaaga cagagaaaac agaaagagac attgttcttt tcctgagtct tttgaatgga 3000 aattgtatta tgttatagcc atcataaaac cattttggta gttttgactg aactgggtgt 3060 tcactttttc ctttttgatt gaatacaatt taaattctac ttgatgactg cagtcgtcaa 3120 ggggctcctg atgcaagatg ccccttccat tttaagtctg tctccttaca gaggttaaag 3180 tctagtggct aattcctaag gaaacctgat taacacatgc tcacaaccat cctggtcatt 3240 ctcgagcatg ttctattttt taactaatca cccctgatat atttttattt ttatatatcc 3300 agttttcatt tttttacgtc ttgcctataa gctaatatca taaataaggt tgtttaagac 3360 gtgcttcaaa tatccatatt aaccactatt tttcaaggaa gtatggaaaa gtacactctg 3420 tcactttgtc actcgatgtc attccaaagt tattgcctac taagtaatga ctgtcatgaa 3480 agcagcattg aaataatttg tttaaagggg gcactctttt aaacgggaag aaaatttccg 3540 cttcctggtc ttatcatgga caatttgggc tagaggcagg aaggaagtgg gatgacctca 3600 ggaggtcacc ttttcttgat tccagaaaca tatgggctga taaacccggg gtgacctcat 3660 gaaatgagtt 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Claims (20)

  1. SEQ ID NO: 7, 8, 17, 24, 30, 49, 86, 100, 102, 115, 121, 126, 136, 146, 184 또는 256을 포함하는 서열을 갖고, 인간 TLR4에 특이적으로 하이브리드화하여 이의 발현을 억제하는, TLR4 mRNA(SEQ ID NO: 282)에 상보적인 20 내지 50개 누클레오티드 길이의 합성 안티센스 올리고누클레오티드.
  2. 제 1항에 따른 합성 안티센스 올리고누클레오티드 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  3. 제 1항에 따른 합성 안티센스 올리고누클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는, TLR4의 발현을 억제하는 방법.
  4. 제 2항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, TLR4의 발현을 억제하는 방법.
  5. 제 1항에 따른 합성 안티센스 올리고누클레오티드를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물에서 TLR4의 발현을 억제하는 방법.
  6. 제 2항에 따른 조성물을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물에서 TLR4의 발현을 억제하는 방법.
  7. 약학적 유효량의 제 1항에 따른 합성 안티센스 올리고누클레오티드를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물에서 TLR4 매개 면역 반응을 억제하는 방법.
  8. 약학적 유효량의 제 2항에 따른 조성물을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물에서 TLR4 매개 면역 반응을 억제하는 방법.
  9. 약학적 유효량의 제 1항에 따른 합성 안티센스 올리고누클레오티드를 TLR4에 의해 매개되는 하나 이상의 질병 또는 장애를 갖는 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물을 치료학적으로 치료하는 방법.
  10. 약학적 유효량의 제 2항에 따른 조성물을 TLR4에 의해 매개되는 하나 이상의 질병 또는 장애를 갖는 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물을 치료학적으로 치료하는 방법.
  11. 약학적 유효량의 제 1항에 따른 합성 안티센스 올리고누클레오티드를 TLR4에 의해 매개되는 하나 이상의 질병 또는 장애를 예방할 필요가 있는 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물을 상기 질병 및 장애로부터 예방하는 방법.
  12. 약학적 유효량의 제 2항에 따른 조성물을 TLR4에 의해 매개되는 하나 이상의 질병 또는 장애를 예방할 필요가 있는 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물을 상기 질병 및 장애로부터 예방하는 방법.
  13. 제 5항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
  14. 제 9항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 질병 또는 장애가 암, 자가면역 질병 또는 장애, 기도 염증, 염증 질병 또는 장애, 감염성 질병, 말라리아, 라임병, 안구 감염증, 결막염, 피부 질환, 건선, 피부경화증, 심혈관 질병, 죽상경화증, 만성 피로 증후군, 사르코이드증, 이식 거부, 알레르기, 천식 및 병원체에 의해 야기되는 질병으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 자가면역 질병 또는 장애가 홍반루푸스, 다발 경화증, 제 1형 당뇨병, 과민성 대장증후군, 크론병, 류마티스 관절염, 패혈 쇼크, 범발성 탈모증, 급성 파종성 뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis), 애디슨 병, 강직성 척추염, 항인지질 항체 증후군, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 수포성 유천포창, 샤가스 병, 만성 폐쇄성 폐병, 복강 질병, 피부근염, 자궁내막증, 굿파스처 증후군, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토병, 화농성 땀샘염, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 간질성 방광염, 국소피부경화증, 중증 근무력증, 기면증, 신경근 긴장증, 천포창, 악성 빈혈, 다발성 근염, 원발성 담즙성 간경변증, 정신분열증, 쇼그렌 증후군, 측두 동맥염 ("거대 세포 동맥염"), 맥관염, 백반증, 외음부 통증 및 베게너 육아종증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 염증 질병 또는 장애가 기도 염증, 천식, 자가면역 질병 또는 질환, 만성 염증, 만성 전립선염, 사구체신염, 베체트병, 과민증, 염증성 장 질병, 재관류 손상, 류마티스 관절염, 이식 거부, 궤양성 대장염, 포도막염, 결막염 및 맥관염으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  17. 제 3항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 경로가 비경구, 근내, 피하, 복막내, 정맥내, 점막 전달, 경구, 설하, 경피, 국소, 흡입, 비내, 에어로졸, 안구내, 기관내, 직장내, 질내, 유전자총, 피부 패치, 점안약 및 구강세척제로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  18. 제 3항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 백신, 항원, 항체, 세포독성제, 알레르겐, 항생제, 안티센스 올리고누클레오티드, TLR 효능제, TLR 길항제, siRNA, miRNA, 앱타머, 단백질, 유전자 요법 벡터, DNA 백신, 애쥬번트, 공동자극 분자, 키나제 억제제 또는 이의 조합물을 추가로 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  19. TLR4 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고누클레오티드 및 TLR4 단백질의 길항제를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물에서 TLR4 발현 및 활성을 억제하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 TLR4 길항제가 항-TLR 항체 또는 이의 결합 단편 또는 펩티도미메틱(peptidomimetic), RNA 계열 화합물, 올리고누클레오티드 계열 화합물, 및 TLR4 활성의 소분자 억제제로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
KR1020117012592A 2008-11-04 2009-11-04 안티센스 올리고누클레오티드에 의한 ｔｏｌｌ―유사 수용체 4 발현의 조절 KR20110081337A (ko)

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