KR20110068131A - 향상된 촉매활성을 갖는 과산화효소 제제 및 이의 제조방법 - Google Patents

향상된 촉매활성을 갖는 과산화효소 제제 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헴(heme) 활성부위를 갖는 과산화효소(peroxidase); 효소활성증진제로서, 이미다졸, 벤즈이미다졸, 티아졸 및 이소옥사졸으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 헤테로고리를 함유하며 분자량이 200 이하인 헤테로고리 화합물; 및 완충제를 유효성분으로 포함하는, 향상된 촉매활성을 갖는 과산화효소 제제 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 제제는 유기용매 중에서 설파이드기를 갖는 화합물로부터 설폭사이드기를 갖는 화합물을 제조하는데 유용하다.
과산화효소, 퍼옥시다제, 효소활성증진제, 헤테로고리, 설파이드, 설폭사이드

Description

향상된 촉매활성을 갖는 과산화효소 제제 및 이의 제조방법{PEROXIDASE FORMULATION HAVING　ENHANCED CATALYTIC ACTIVITY AND METHOD OF PREPARATION THEREOF}
본 발명은 향상된 촉매활성을 갖는 과산화효소 제제 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 설파이드기를 갖는 유기화합물에 대한 산화활성이 증진된 과산화효소 제제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
과산화효소(또는 퍼옥시다제(peroxidase)라 함)는 과산화수소 또는 tert-부틸하이드로퍼옥사이드를 포함하는 알킬 과산화수소를 수소수용체로 하여 여러 가지 물질의 산화를 촉매하는 효소의 총칭이며, 좁은 의미에서는 과산화수소에 의하여 페놀류 또는 방향족 아민류 등을 산화시키는 효소이다. 많은 과산화효소는 생물의 세포 밖에서도 비교적 안정한 효소로, 당해 효소를 생성하는 생물의 이름 혹은 기질의 이름과 연관지어 명명되었다. 가장 많이 알려진 과산화효소로는 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, 이하 "HRP"라 함)를 들 수 있는데, 서양고추냉이에서 추출할 수 있고 결정형으로 얻어진다. 미생물 코프리누스 시네레우 스(Coprinus cinereus)로부터 얻어지는 과산화효소인 코프리누스 퍼옥시다제(Coprinus peroxidase, 이하 "CiP"라 함)는 HRP와 같이 활성부위(active site)에 철 프로토포르피린 IX(iron protoporphyrin IX) 분자를 가지고 있는 헴(heme) 과산화효소이다. 이러한 과산화효소는 생촉매(biocatalyst)로서 많은 잠재력을 가지고 있지만 산업적 이용은 아직 제한적이다. 현재 HRP와 같은 과산화효소는 치약의 항-미생물 첨가제(antimicrobial additives)로 사용되거나, 밀가루 반죽에서 찰기를 강화하기 위해 단백질 사슬의 산화적 가교결합을 촉진할 목적으로 사용되는 정도의 용도를 가지고 있다. 가장 진보된 형태로 산업에 이용되는 예로 바이오센서나 면역학적 분석을 들 수 있지만, 산업적인 측면에서 유기합성에 사용되고 있지는 못하다. 이는 효소에 의한 목적물의 생산성이 낮고, 산업적으로 이용하기에는 효소의 안정성이 낮기 때문이다.
과산화효소의 산업적 이용을 위해서는 효소의 기질 전환속도(conversion rate of substrate to product)를 높이는 동시에 전환율(conversion ratio)을 높여야 하지만, 통상적으로 이는 쉽게 달성할 수 있는 일이 아니므로 지금까지 많은 연구자들이 여러 가지 기술을 사용하여 오랫동안 연구해오고 있다. 이러한 기술 중 가장 빈번하게 사용되고 있는 기술은 분자진화기법(directed evolution)으로 유전자 조작을 통하여 변화된 아미노산 서열을 가지는 단백질을 무수히 만든 후 이 중에서 목적에 맞는 효소를 선발하는 것이며, 이와 유사한 기술로서 효소의 입체구조를 다양하게 분석한 후 특정한 아미노산을 선택적으로 치환할 수 있도록 유전자를 코드화하여 효소를 얻는 방법을 들 수 있다. 하지만, 상기 방법들은 일종의 새로 운 효소를 창조하는 것으로 연구과정에서 많은 비용과 연구인력, 장시간의 연구기간이 필요하다. 또한, 어떤 효소는 특정한 담체에 고정화(enzyme immobilization)하는 과정에서 혹은 특정한 물질을 효소 제제 내에 첨가함으로써 촉매활성이 증진되거나 변화된 활성(예를 들면, 기질특이성 혹은 입체선택성)을 보이기도 하지만, 의도적으로 효소의 활성을 자유롭게 조절하게 되려면 더 많은 연구가 필요하다.
이에 본 발명자들은 과산화효소에 특정 효소활성증진제를 첨가하고 특정한 산도가 유지되도록 함으로써 획기적으로 과산화효소의 활성을 증진시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 설파이드기를 갖는 방향족 유기 화합물에 대한 효소활성이 증진된 과산화효소 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 과산화효소 제제의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 과산화효소 제제를 이용하여 설폭사이드를 갖는 방향족 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명은 헴(heme) 활성부위를 갖는 과산화효소(peroxidase); 효소활성증진제로서 이미다졸, 벤즈이미다졸, 티아졸 및 이소옥사졸로 이루어지는 군으로부터 선택되는 헤테로고리를 함유하며 분자량이 200 이하인 헤테로고리 화합물; 및 완충제를 유효성분으로 포함하는 과산화효소 제제를 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명은 a) 효소활성증진제로서 이미다졸, 벤즈이미다졸, 티아졸 및 이소옥사졸로 이루어지는 군으로부터 선택되는 헤테로고리를 함유하며 분자량이 200 이하인 헤테로고리 화합물, 및 헴 활성부위를 갖는 과산화효소를 완충액에 용해시키는 단계; b) 상기 용액의 pH를 4 내지 7로 조절하는 단계; 및 c) 얻어진 용액을 동결 건조 및 분쇄하는 단계를 포함하는, 산화활성이 증가된 과산화효소 제제의 제조방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명은 상기 과산화효소 제제를 설파이드기를 갖는 방향족 화합물과 유기용매 중에서 반응시키는 단계를 포함하는, 설폭사이드기를 갖는 방향족 화합물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 과산화효소 제제는 수소수용체가 녹아있는 유기용매 중에서 설파이드기를 갖는 화합물의 산화를 효과적으로 촉매함으로써 설폭사이드기를 갖는 대응 화합물이 효율적으로 제조되도록 할 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에 사용된 용어 "효소 제제"는 효소 이외에 기타 성분, 예를 들어 효소활성증진제, 완충제 또는 담체 등이 혼합된 조성물을 의미하며, 바람직하게는 분말상일 수 있다. 상기 효소 제제의 예로서 "과산화효소 제제", "CiP 제제" 또는 "HRP 제제"가 본 명세서에 사용된다.
또한 본 발명에 사용된 용어 "효소활성증진제"는 효소의 촉매활성을 증가시키는데 기여하는 물질 또는 화합물을 의미하며, 본 명세서에서 과산화효소와 함께 사용되는 "효소활성증진제"는 과산화효소의 산화활성을 증진시키기 위한 물질 또는 화합물을 의미한다.
본 발명은 헴(heme) 활성부위를 갖는 과산화효소(peroxidase); 효소활성증진제로서 이미다졸, 벤즈이미다졸, 티아졸 및 이소옥사졸로 이루어지는 군으로부터 선택되는 헤테로고리를 함유하며 분자량이 200 이하인 헤테로고리 화합물; 및 완충제를 유효성분으로 포함하는, 과산화효소 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 효소활성증진제로서 이미다졸, 벤즈이미다졸, 티아졸 및 이소옥사졸로 이루어지는 군으로부터 선택되는 헤테로고리를 함유하며 분자량이 200 이하인 헤테로고리 화합물, 및 헴 활성부위를 갖는 과산화효소를 완충액에 용해시키는 단계; b) 상기 용액의 pH를 4 내지 7로 조절하는 단계; 및 c) 얻어진 용액을 동결 건조 및 분쇄하는 단계를 포함하는, 산화활성이 증가된 과산화효소 제제의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 헴 활성부위를 갖는 과산화효소는 활성부위(active site)에 철 프로토포르피린(iron protoporphyrin) IX 분자를 가지고 있는 헴 과산화효소로서, 바람직하게는 코프리누스 퍼옥시다제(CiP) 또는 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)일 수 있다. 상기 효소는 그 효소를 생성하는 생물의 종류, 순도 및 제조사에 관계없이 사용될 수 있다. 다만, 완전히 정제되지 않은 효소의 경우, 본 발명의 효소제제 제조 과정에서 산도의 조정과 유지에 영향을 미칠 수 있는 물질을 제거하기 위해 세파덱스(Sephadex) G 시리즈와 같은 크기 배제 컬럼(size exclusion column) 또는 이온교환 컬럼을 이용한 크로마토그래피 등 간단한 정제과 정을 거친 후 본 발명의 효소제제에 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 효소활성증진제로 사용될 수 있는 헤테로고리 화합물은 이미다졸, 벤즈이미다졸, 티아졸 및 이소옥사졸로 이루어지는 군으로부터 선택되는 헤테로고리를 함유하면서 분자량이 200 이하인 것이 좋다. 이 화합물은 바람직하게는 이미다졸, 2-메틸이미다졸, 1,2-디메틸이미다졸, 이미다졸카르복실산, 벤즈이미다졸, 벤즈이미다졸-5-카르복실산, 4(5)-(하이드록시메틸)이미다졸, 4-메틸-5-티아졸카르복실산, D-히스티딘 및 L-히스티딘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이러한 효소활성증진제들은 과산화효소 제제의 제조시 수용액 중의 효소와 상호작용함으로써 제제가 건조된 뒤에도 효소에 남아 효소의 촉매 활성을 획기적으로 증진할 수 있다. 본 발명의 과산화효소 제제는 효소 1g 당 0.2 밀리몰(mmole) 내지 200 밀리몰의 효소활성증진제를 함유하는 것이 유기용매 중에서 설파이드기를 가진 유기화합물에 대한 산화활성 증진에 효과적이며, 효소의 활성을 극대화하기 위해서는 효소 1 g당 5 밀리몰 내지 100 밀리몰의 양으로 사용되는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 있어서, 과산화효소 제제의 제조시 과산화효소와 효소활성증진제를 용해시키고 효소의 활성이 최대가 되도록 하는 산도로 조정하는 데 사용되는 완충액(buffer solution)은 인산완충액 또는 시트르산완충액이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 동결 건조 과정에서 의도된 산도를 유지할 수 있는 것이라면 당업자에게 널리 알려진 임의의 완충액을 사용하여도 무방하다. 효소 수용액의 제조시 사용하는 완충액의 농도는 동결건조된 후 얻어지는 최종 효소제제의 무 게와 부피를 좌우하므로 가능한 한 적게 사용하는 것이 좋으며, 수용액의 산도 유지를 위해서 10 내지 100 mM, 더욱 바람직하게는 10 내지 50 mM로 사용하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 본 발명의 과산화효소 제제는 효소 1g 당 0.2 밀리몰 내지 20 밀리몰, 바람직하게는 2 밀리몰 내지 10 밀리몰의 완충제를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 효소활성증진제를 함유하는 과산화효소는 동결건조된 뒤에 체적이 현저하게 감소하거나 공기 중의 수분을 흡수하여 쉽게 눅눅해지는 경우가 있으므로, 효소제제의 분말화를 용이하게 하여 표면적을 넓힘으로써 효소활성을 증진할 목적으로 효소 수용액의 조제시(단계 a) 효소의 고정화를 위한 담체를 추가할 수 있다. 이러한 고정화 담체는 그 표면에 흡착될 과산화효소의 이화학적 성질에 영향을 미치지 않아야 하며, 물과 유기용매에 대하여 불용성인 재료이면서 평균입경이 1 내지 500 ㎛라면 그 종류에 특별히 한정을 두지 않는다. 그러한 담체의 예로서 미분쇄한 결정성 셀룰로오스 등을 들 수 있다. 본 발명에서 효소의 흡착 고정화를 위한 분말성 담체의 첨가량은 특별히 한정할 수 없으나 효소반응을 수행하기 위해 효소제제 분말을 유기용매 중에 첨가하여 현탁액을 조제하였을 때 최소한의 교반이 가능하기 위해서는 효소량의 1배 내지 10배 정도가 바람직하다.
본 발명의 효소 제제는 과산화효소의 활성이 최대화되도록 최종적으로 4 내지 7의 pH를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 효소 제제는 바람직하게는 효소활성증진제와 완충제를 동시에 함유하는 건조 분말의 형태이나, 유기용매에 녹을 수 있는 효소활성증진제를 사용할 경우에는 효소만을 pH 4 내지 7로 조제하여 사용하고 효소반응을 수행할 유기용매에 효소활성증진제를 용해시킨 형태로 사용될 수도 있다.
한편, 바람직한 한 태양에 있어서, 본 발명의 과산화효소 제제는 다음과 같이 제조될 수 있다: 먼저 완충액에 효소활성증진제를 녹이고 필요한 경우 고정화용 담체를 넣은 다음, 과산화효소 제제의 활성이 최대가 되는 pH, 바람직하게는 pH 4 내지 7로 조정한다. 삼차증류수(deionized distilled water) 또는 pH 4 내지 7로 조제한 완충액에 효소를 녹인 용액을, 상기에서 제조된 효소활성증진제 수용액에 첨가하여 혼합한다. 다시 pH를 4 내지 7로 조정한 다음 동결건조하고, 건조된 효소제제를 부드럽게 분쇄하고 밀봉한 다음 건조한 곳에 냉장보관한다.
나아가, 본 발명은 본 발명에 따른 과산화효소 제제를 설파이드기를 갖는 방향족 화합물과 유기용매 중에서 산화제의 존재하에 반응시키는 단계를 포함하는, 설폭사이드를 갖는 방향족 화합물의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 산화활성이 증진된 과산화효소 제제는 유기용매 중에서 알킬아릴설파이드와 아릴아릴설파이드의 설폭시화 반응(sulfoxidation)을 촉매하는 데에 효과적이다. 상기 유기용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 및 펜탄올 등의 알콜류, 벤젠, 아세톤, 아세토니트릴, 에틸 아세테이트 및 헥산 등을 들 수 있으며, 할로겐 원소를 포함하지 않는 것이면 특별히 한정되지 않고 사용될 수 있다.
상기 산화제는 산소를 공여할 수 있는 물질로서 특별히 한정을 두지 않으며, 통상적으로 많이 사용되는 과산화수소, tert-부틸하이드로퍼옥사이드 등이 그 예가 될 수 있다.
본 발명의 과산화효소 제제는 효소활성증진제를 사용하지 않은 효소제제에 비하여, 천 배 내지 만 배까지의 증가된 효소 활성을 나타내므로, 설파이드기를 갖는 화합물로부터 설폭사이드기를 갖는 화합물의 제조시 매우 유용하다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 4(5)-하이드록시메틸이미다졸을 이용한 CiP 제제의 제조
노보자임스 코리아(Novozymes Korea Co.Ltd)에서 구입한 코프리누스 시네레우스(Coprinus cinereus) 과산화효소를 함유하는 배양액으로부터 음이온교환수지를 이용한 컬럼 크로마토그래피와 투석법을 이용하여 효소를 분리한 후, 이를 동결건조하여 CiP를 얻었다. 용량 20 mL의 유리병 2 개에 하기 표 1에 기재된 본 발명의 효소활성증진제인 4(5)-(하이드록시메틸)이미다졸을 각각 0.1177g(최종농도 100 mM에 해당)씩 달아 넣고, 고정화용 담체로서 셀룰로오스(mycrocrystalline cellulose, Sigma, 미국)를 습식분쇄 후 동결건조하여 만든 셀룰로오스 분말(평균 입경 5 μm) 300 mg(CiP 1 mg 당 5 mg)씩 추가한 후, 20 mM의 인산칼륨완충액을 12 mL 가하여 용해 혼합하였다. 이 용액의 산도를 40% 수산화칼륨 수용액으로 pH 4 와 7로 각각 조정한 다음 CiP를 60 mg씩을 첨가하였다. 산도를 다시 조정하고 7 mL 유리병에 0.4 mL씩 나누어 넣은 다음 동결건조하여 본 발명의 CiP 제제를 제조하였다. 건조된 제제는 분쇄하여 밀봉된 상태로 냉장보관하면서 산화활성 시험에 사용하였다. 상기 제제 중 동결건조 후 CiP:효소활성증진제:인산완충제:셀룰로오스의 조성비는 1 mg:0.1 밀리몰:0.02 밀리몰:5 mg의 비율이었다. 상기 제제를 "효소활성증진제를 100 mM 첨가한 제제"라고 칭하였다.
실시예 2: 4- 메틸 -5-티아졸 카르복실산을 이용한 CiP 제제의 제조
상기 실시예 1에서 효소활성증진제로 4-메틸-5-티아졸 카르복실산을 사용하는 것을 제외하고 실시예 1을 반복하여 CiP 제제를 제조하였다.
실시예 3: 2- 메틸이미다졸을 이용한 CiP 제제의 제조
상기 실시예 1에서 효소활성증진제로 2-메틸이미다졸을 사용하고, 고정화 담체인 셀룰로오스 분말을 첨가하지 않은 것을 제외하고 실시예 1을 반복하여 CiP 제제를 제조하였다.
실시예 4: 이미다졸을 이용한 CiP 제제의 제조
상기 실시예 1에서 효소활성증진제로 이미다졸을 사용하는 것을 제외하고 실시예 1을 반복하여 CiP 제제를 제조하였다.
실시예 5: 벤즈이미다졸 -5- 카르복실산을 이용한 CiP 제제의 제조
상기 실시예 1에서 효소활성증진제로 벤즈이미다졸-5-카르복실산을 사용하고, 고정화 담체인 셀룰로오스 분말을 첨가하지 않은 것을 제외하고 실시예 1을 반복하여 CiP 제제를 제조하였다.
실시예 6: 1,2- 디메틸이미다졸을 이용한 CiP 제제의 제조
상기 실시예 1에서 효소활성증진제로 1,2-디메틸이미다졸을 사용하는 것을 제외하고 실시예 1을 반복하여 CiP 제제를 제조하였다.
실시예 7: 벤즈이미다졸을 이용한 CiP 제제의 제조
상기 실시예 1에서 효소활성증진제로 벤즈이미다졸을 사용하고, 고정화 담체인 셀룰로오스 분말을 첨가하지 않은 것을 제외하고 실시예 1을 반복하여 CiP 제제 를 제조하였다.
실시예 8: 이소옥사졸 -5- 카르복실산을 이용한 CiP 제제의 제조
상기 실시예 1에서 효소활성증진제로 이소옥사졸-5-카르복실산을 사용하고, 고정화 담체인 셀룰로오스 분말을 첨가하지 않은 것을 제외하고 실시예 1을 반복하여 CiP 제제를 제조하였다.
실시예 9: L-히스티딘을 이용한 CiP 제제의 제조
상기 실시예 1에서 효소활성증진제로 L-히스티딘을 사용하는 것을 제외하고 실시예 1을 반복하여 CiP 제제를 제조하였다.
실시예 10: 이미다졸 -5- 카르복실산을 이용한 CiP 제제의 제조
상기 실시예 1에서 효소활성증진제로 이미다졸-5-카르복실산을 사용하고, 고정화 담체인 셀룰로오스 분말을 첨가하지 않은 것을 제외하고 실시예 1을 반복하여 CiP 제제를 제조하였다.
실시예 11: 1,2- 디메틸이미다졸을 이용한 HRP 제제의 제조
상기 실시예 1에서 CiP 대신에 HRP(horseradish peroxidase, Sigma, Illinois, 미국)를 사용하는 것, 효소활성증진제로 1,2-디메틸이미다졸을 사용하는 것, 효소활성증진제와 효소를 녹인 완충액을 7 mL용 유리병에 2 mL씩 넣어 동결건조하는 것 및 고정화 담체인 셀룰로오스 분말을 첨가하지 않은 것을 제외하고, 실시예 1을 반복하여 HRP 제제를 제조하였다.
실시예 12: 벤즈이미다졸 -5- 카르복실산을 이용한 HRP 제제의 제조
상기 실시예 11에서 효소활성증진제로 벤즈이미다졸-5-카르복실산을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 11을 반복하여 HRP 제제를 제조하였다.
실시예 13: 4(5)- 하이드록시메틸이미다졸을 이용한 HRP 제제의 제조
상기 실시예 11에서 효소활성증진제로 4(5)-하이드록시메틸이미다졸을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 11을 반복하여 HRP 제제를 제조하였다.
실시예 14: L-히스티딘을 이용한 HRP 제제의 제조
상기 실시예 11에서 효소활성증진제로 L-히스티딘을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 11을 반복하여 HRP 제제를 제조하였다.
실시예 15: 이소옥사졸 -5- 카르복실산을 이용한 HRP 제제의 제조
상기 실시예 11에서 효소활성증진제로 이소옥사졸-5-카르복실산을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 11을 반복하여 HRP 제제를 제조하였다.
비교예 1: 효소활성증진제를 포함하지 않는 CiP 제제의 제조
상기 실시예 1에서 효소활성증진제를 사용하지 않는 것을 제외하고 실시예 1을 반복하여 CiP 제제를 제조하였고, 이 제제를 비교예 1로 사용하였다.
비교예 2: 효소활성증진제를 포함하지 않는 HRP 제제의 제조
상기 실시예 11에서 효소활성증진제를 사용하지 않는 것을 제외하고 실시예 11을 반복하여 HRP 제제를 제조하였고, 이 제제를 비교예 2로 사용하였다.
상기 실시예 1 내지 15 및 비교예 1과 2의 제제의 성분을 하기 표 1에 나타내었다.
본 발명의 실시예 및 비교예의 구성성분
제제 효소 효소활성증진제 완충액 pH
실시예 1 CiP 4(5)-하이드록시메틸이미다졸 인산완충액 4, 7
실시예 2 CiP 4-메틸-5-티아졸 카르복실산 인산완충액 4, 7
실시예 3 CiP 2-메틸이미다졸 인산완충액 4, 7
실시예 4 CiP 이미다졸 인산완충액 4, 7
실시예 5 CiP 벤즈이미다졸-5-카르복실산 인산완충액 4, 7
실시예 6 CiP 1,2-디메틸이미다졸 인산완충액 4, 7
실시예 7 CiP 벤즈이미다졸 인산완충액 4, 7
실시예 8 CiP 이소옥사졸-5-카르복실산 인산완충액 4, 7
실시예 9 CiP L-히스티딘 인산완충액 4, 7
실시예 10 CiP 이미다졸-5-카르복실산 인산완충액 4, 7
실시예 11 HRP 1,2-디메틸이미다졸 인산완충액 4, 7
실시예 12 HRP 벤즈이미다졸-5-카르복실산 인산완충액 4, 7
실시예 13 HRP 4(5)-하이드록시메틸이미다졸 인산완충액 4, 7
실시예 14 HRP L-히스티딘 인산완충액 4, 7
실시예 15 HRP 이소옥사졸-5-카르복실산 인산완충액 4, 7
비교예 1 CiP - 인산완충액 4, 7
비교예 2 HRP - 인산완충액 4, 7
실험예 1: 본 발명에 따른 CiP 제제의 아릴아릴 설파이드 ( arylaryl sulfide ) 화합물에 대한 산화반응 촉진 효과 측정
본 발명에 따른 CiP 제제의 산화촉진 효과를 살펴보기 위하여, 과산화효소의 중요한 기질 중 하나로서 아릴아릴 설파이드 화합물인 오메프라졸 설파이드(omeprazole sulfide; EQ estate사, 프랑스)를 대상으로 산화반응을 수행하였다. 구체적으로, 오메프라졸 설파이드를 무수 메탄올에 녹여 125 mM 용액을 제조하고, 또한 수소수용체로서 t-부틸하이드로퍼옥사이드(Sigma사, 미국)를 무수 메탄올에 녹여 500 mM 용액을 제조하였다. 반응을 위한 유기용매 2-프로판올 10 mL를 20 mL 유리병에 넣고 상기에서 제조한 오메프라졸 설파이드 용액 20 ㎕와 t-부틸하이드로퍼옥사이드 용액 20 ㎕를 혼합하여 반응용액을 제조하였다. 한편, 실시예 1 내지 9의 CiP 제제(CiP 2 mg 함유 분량)에 상기 반응용액 2 mL를 가한 다음 밀봉하고, 자석 교반기를 이용하여 항온(25℃)에서 2500 rpm으로 교반함으로써 산화반응을 개시하였다. 대조구로서는 비교예 1의 효소활성증진제를 함유하지 않는 CiP 제제(CiP 30 mg)에 반응용액 2 mL를 가하고 37℃ 항온에서 실험을 수행하였다. 일정한 시간 간격으로 상기 반응액 300 ㎕를 채취하여 원심분리한 후, 상징액을 취하여 HPLC로 R,S-오메프라졸을 정량하였다. 상기 HPLC는 Chiralcel OD-H 컬럼(Daisel사, 일본)이 장착된 Waters HPLC를 사용하였고, 이동상으로 n-헥산/에탄올(92/8, 부피/부피, 1.35 mL/분)을 흘려주었고, 검출파장은 302 nm를 사용하였다. SigmaPlot 2000(SPSS Inc., Chicago, IL, 미국)의 최소자승법(least-squares method)에 의한 회귀계산 기능을 이용하여 직선회귀식을 산출함으로써 초기반응속도를 구하였다. 측정결과는 하기 표 2에 나타내었으며, 표 2의 효소활성증진 효과는 비교예 1의 37℃에서의 초기반응속도를 1로 하였을 때의 상대적 초기반응속도이다.
본 발명에 따른 CiP 제제에 의한 오메프라졸 설파이드의 산화반응 속도
제제 pH 초기반응속도
(μM/CiP 1 mg/분)		 효소활성증진효과(배)
실시예 1 4 1.20±0.02 1,463
7 1.06±0.21 11,778
실시예 2 4 0.35±0.03 427
7 0.37±0.03 4,111
실시예 3 4 0.92±0.01 1,122
7 0.55±0.03 6,111
실시예 4 4 0.62±0.08 756
7 0.23±0.07 2,556
실시예 5 4 0.55±0.03 671
7 0.57±0.19 6,333
실시예 6 4 0.091±0.000 111
7 0.37±0.01 4,111
실시예 7 4 0.21±0.04 256
실시예 8 4 0.071±0.001 87
실시예 9 7 0.046±0.000 444
비교예 1 4 0.00082±0.00017 1
7 0.00009±0.00001 1
상기 표 2의 결과에서 보는 바와 같이, 효소활성증진제를 사용하지 않은 비교예 1에 비하여 본 발명에 따른 CiP 제제들은 효소활성이 현저하게 증가하였음을 알 수 있었다. 특히, 실시예 1 제제의 경우, 비교예 1에 비해 활성이 1만 배 이상 상승하였다.
실험예 2: 본 발명에 따른 CiP 제제에 의한 알킬아릴 설파이드(alkylaryl sulfide) 화합물에 대한 산화반응 촉진효과 측정
본 발명에 따른 CiP 제제의 다른 화합물에 대한 산화촉진 효과를 살펴보기 위하여, 과산화효소의 다른 기질로서 알킬아릴 설파이드 화합물인 티오아니솔(메틸페닐 설파이드, 시그마사, 미국)을 대상으로 산화반응을 수행하였다. 상기 티오아니솔은 과산화효소의 산화반응을 연구하는 데 많이 사용되는 물질이다. 구체적으로, 실험예 1에서와 동일한 방법으로 티오아니솔 및 t-부틸하이드로퍼옥사이드를 혼합한 반응용액을 제조하였다. 상기 반응용액 중의 티오아니솔 및 t-부틸하이드로퍼옥사이드의 농도는 각각 0.5 mM 및 1 mM이었다. 과산화효소의 전환반응 산물로써 R,S-메틸페닐 설폭사이드를 HPLC로 정량한 다음 초기 반응속도를 구하였다. 상기 HPLC는 Chiralcel OD-H 컬럼이 장착된 Waters HPLC를 사용하였고, 이동상으로 n-헥산/2-프로판올(93/7, 부피/부피, 1.5 mL/분)을 흘려주었고, 검출파장은 242 nm를 사용하였다. 또한 Symmetry C18 컬럼을 장착하고 이동상으로 아세토니트릴/물(1/9, 부피/부피, 0.1%(부피/부피) 인산 함유, 1.5 mL/분)을 흘려주었고, 검출파장은 242 nm를 사용하였다. 측정결과는 하기 표 3에 나타내었으며, 표 3의 효소활성증진 효과는 비교예 1의 초기반응속도를 1로 하였을 때의 상대적 초기반응속도이다.
본 발명에 따른 CiP 제제에 의한 티오아니솔의 산화반응 속도
제제 pH 초기반응속도
(μM/CiP 1 mg/분)		 효소활성증진
효과(배)
실시예 1 4 0.82±0.01 141
7 0.92±0.09 484
실시예 2 4 0.58±0.04 100
7 0.47±0.03 247
실시예 3 4 0.94±0.02 162
7 2.46±0.18 1,295
실시예 4 4 0.49±0.03 84
7 0.29±0.08 153
실시예 5 4 0.50±0.02 86
7 2.56±0.01 1,347
실시예 6 4 0.22±0.10 38
7 0.87±0.05 458
실시예 7 4 0.62±0.03 107
7 0.25±0.03 132
실시예 8 4 0.28±0.03 48
실시예 9 7 0.046±0.000 24
실시예 10 7 0.086±0.005 45
비교예 1 4 0.0058±0.0004 1
7 0.0019±0.0004 1
상기 표 3의 결과에서 보는 바와 같이, 효소활성증진제를 사용하지 않은 비교예 1에 비하여 본 발명에 따른 CiP 제제들은 효소활성이 현저하게 증가하였음을 알 수 있었다. 특히, 실시예 3(pH 7) 및 실시예 5(pH 7)의 제제의 경우, 비교예 1에 비해 활성이 천배 이상 상승하였다.
실험예 3: 본 발명에 따른 HRP 제제에 의한 아릴아릴 설파이드(arylaryl sulfide) 화합물에 대한 산화반응 촉진 효과 측정
실험예 1에서 CiP 제제 대신에 실시예 11 내지 15 및 비교예 2의 HRP 제제를 10 mg/2mL로 사용하여 실험하는 것을 제외하고 실험예 1을 반복하여 초기반응속도를 측정하였다. 측정결과는 하기 표 4에 나타내었다.
본 발명에 따른 HRP 제제에 의한 오메프라졸 설파이드의 산화반응 속도
제제 pH 초기반응속도
(μM/HRP 5 mg/분)
실시예 11 7 0.23±0.01
실시예 12 4 0.16±0.04
7 0.060±0.02
실시예 13 4 0.020±0.01
7 0.065±0.00
실시예 14 7 0.019±0.01
실시예 15 4 0.016±0.01
비교예 2 4, 7 ≒ 0
상기 표 4에서 보는 바와 같이, 효소활성증진제를 사용하지 않은 비교예 2의 초기반응속도가 거의 0에 가까워 측정이 불가능한 점을 고려할 때, 본 발명에 따른 실시예 11 내지 15의 제제들에서 효소활성이 현저하게 증가하였음을 알 수 있었다.
실험예 4: 유기 용매 종류에 따른 CiP 제제의 산화반응 촉진 효과 측정
반응 매질로서 유기 용매의 종류가 다를 때 본 발명의 산화활성이 증진된 과산화효소가 기질의 산화반응을 잘 촉매하는지 여부를 살펴보기 위하여, 실험예 1에서 2-프로판올 대신에 하기 표 5에 기재된 아세토니트릴, 벤젠, THF, 1-부탄올, 1,4-디옥산, 에틸 아세테이트 및 피리딘 각각을 사용하고, 실시예 2의 효소활성증진제로서 4-메틸-5-티아졸 카르복실산을 사용한 CiP 제제를 사용하여 실험예 1과 동일하게 초기반응속도를 측정하였다. 측정결과를 하기 표 5에 나타내었다.
유기용매 종류에 따른 본 발명에 따른 CiP 제제에 의한 오메프라졸 설파이드의 산화반응 속도
유기 용매 초기반응속도
(μM/CiP 1 mg/분)
2-프로판올 0.37±0.00
아세토니트릴 0.57±0.00
벤젠 0.37±0.08
THF 0.26±0.01
1-부탄올 0.14±0.01
1,4-디옥산 0.11±0.00
에틸 아세테이트 0.11±0.00
피리딘 0.084±0.01
상기 표 5에서 보는 바와 같이, 유기 용매 종류에 따라 CiP 제제에 의한 오메프라졸 설파이드의 산화반응 속도가 약간씩 다르지만 용매가 달라지더라도 산화반응이 잘 진행됨을 알 수 있었다.
실험예 5: 효소활성증진제의 첨가량에 따른 CiP 제제에 의한 오메프라졸 설파이드의 산화반응 촉진 효과 측정-(1)
효소활성증진제의 첨가량에 따른 산화반응 촉진 효과를 살펴보기 위하여, 실험예 1에서 CiP 제제로 실시예 4의 효소활성증진제인 이미다졸이 각각 1, 25, 100 및 300 mM로 첨가된 제제(pH 7)를 사용하여 실험예 1과 동일하게 실험을 수행하여 초기반응속도를 측정하였다. 측정된 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
효소활성증진제 첨가량에 따른 오메프라졸 설파이드의 산화반응 속도
이미다졸 첨가량(mM) 초기반응속도
(μM/CiP 1 mg/분)
0 0.00009±0.00001
1 0.050±0.00
25 0.20±0.04
100 0.21±0.03
300 0.22±0.00
상기 표 6에서 보는 바와 같이, 효소활성증진제로써 이미다졸을 1 mM 이상 함유시 오메프라졸 설파이드에 대한 산화반응이 촉진되는 것으로 나타났으며, 특히 이미다졸이 25 mM 이상 함유시 반응속도가 최대가 됨을 알 수 있었다. 상기 결과로부터 효소 1g 당 함량으로 계산시 0.2 밀리몰(mmole) 내지 60 밀리몰의 효소활성증진제를 함유하는 것이 바람직한 것으로 판단되었다.
실험예 6: 효소활성증진제의 첨가량에 따른 CiP 제제에 의한 오메프라졸 설파이드의 산화반응 촉진 효과 측정-(2)
효소활성증진제의 첨가량에 따른 산화반응 촉진 효과를 살펴보기 위하여, 실험예 1에서 CiP 제제로 실시예 2의 효소활성증진제인 4-메틸-5-티아졸 카르복실산이 각각 1, 5, 25, 100 및 300 mM로 첨가된 제제(pH 7)를 사용하여 실험예 1과 동일하게 실험을 수행하여 초기반응속도를 측정하였다. 측정된 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
효소활성증진제 첨가량에 따른 오메프라졸 설파이드의 산화반응 속도
4-메틸-5-티아졸 카르복실산 첨가량(mM) 초기반응속도
(μM/CiP 1 mg/분)
0 0.00009±0.00001
25 0.025±0.001
100 0.37±0.03
300 1.09±0.02
상기 표 7에서 보는 바와 같이, 효소활성증진제로써 4-메틸-5-티아졸 카르복실산을 25 mM 이상 첨가시 오메프라졸 설파이드에 대한 산화반응이 촉진된다는 것을 알 수 있으며, 또한 4-메틸-5-티아졸 카르복실산의 첨가량을 증가시키는 경우 반응속도를 더욱 높일 수 있는 것으로 판단되었다.

Claims (13)

  1. 헴(heme) 활성부위를 갖는 과산화효소(peroxidase); 효소활성증진제로서 이미다졸, 벤즈이미다졸, 티아졸 및 이소옥사졸로 이루어지는 군으로부터 선택되는 헤테로고리를 함유하며 분자량이 200 이하인 헤테로고리 화합물; 및 완충제를 유효성분으로 포함하는, 과산화효소 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 과산화효소가 코프리누스(Coprinus) 퍼옥시다제(CiP) 또는 호스래디쉬(Horseradish) 퍼옥시다제(HRP)인 것을 특징으로 하는 과산화효소 제제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 헤테로고리 화합물이 이미다졸, 2-메틸이미다졸, 1,2-디메틸이미다졸, 이미다졸카르복실산, 벤즈이미다졸, 벤즈이미다졸-5-카르복실산, 4(5)-(하이드록시메틸)이미다졸, 4-메틸-5-티아졸카르복실산, D-히스티딘 및 L-히스티딘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 과산화효소 제제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 헤테로고리 화합물이 과산화효소 1g 당 0.2 밀리몰(mmole) 내지 200 밀리몰의 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는 과산화효소 제제.
  5. 제1항에 있어서, 상기 완충제가 과산화효소 1g 당 0.2 밀리몰 내지 20 밀리몰의 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는 과산화효소 제제.
  6. 제1항에 있어서, 효소의 고정화를 위한 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 과산화효소 제제.
  7. 제6항에 있어서, 상기 담체가 결정성 셀룰로오스인 것을 특징으로 하는 과산화효소 제제.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제제가 pH 4 내지 pH 7의 산도를 갖는 것을 특징으로 하는 과산화효소 제제.
  9. 제1항에 있어서, 상기 제제가 건조 분말 형태인 것을 특징으로 하는 과산화효소 제제.
  10. a) 효소활성증진제로서 이미다졸, 벤즈이미다졸, 티아졸 및 이소옥사졸로 이루어지는 군으로부터 선택되는 헤테로고리를 함유하며 분자량이 200 이하인 헤테로고리 화합물, 및 헴 활성부위를 갖는 과산화효소를 완충액에 용해시키는 단계;
    b) 상기 용액의 pH를 4 내지 7로 조절하는 단계; 및
    c) 얻어진 용액을 동결 건조 및 분쇄하는 단계
    를 포함하는, 제1항의 과산화효소 제제의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단계 a)에서 효소의 고정화를 위한 담체를 추가로 첨가하는 것을 포함하는, 과산화효소 제제의 제조방법.
  12. 제1항의 과산화효소 제제를 설파이드기를 갖는 방향족 화합물과 유기용매 중에서 반응시키는 단계를 포함하는, 설폭사이드기를 갖는 방향족 화합물의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 설파이드기를 갖는 방향족 화합물이 알킬아릴 설파이드 또는 아릴아릴 설파이드인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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