KR20110063494A - 암 치료 및 진단을 위한 표적 유전자인 ｏｉｐ５ - Google Patents

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KR20110063494A
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유스케 나카무라
야타로 다이고
아키라 토가시
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온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 폐 및/또는 식도암 발암작용에서 OIP5 유전자에 의해서 기능되는 역할과 관련되며, OIP5 유전자 또는 조성물, 벡터 또는 상기 이중가닥 분자 및 항체를 포함하는 세포에 대한 이중가닥 분자 투여에 의한 폐 및/또는 식도암의 치료 및/또는 예방 방법에 관계된다. 또한, 본 발명은 폐 및/또는 식도암의 검출 및/또는 진단 방법, 또는 폐 및/또는 식도암 환자에서 OIP5 검출에 의한 암 치료법의 예후 측정/확인 및/또는 효능 모니터링 방법에 관련된다. 또한, OIP5 관련된 암 치료 및 예방을 위한 화합물 동정 방법이 기재된다.

Description

암 치료 및 진단을 위한 표적 유전자인 ＯＩＰ５{OIP５ AS A TARGET GENE FOR CANCER THERAPY AND DIAGNOSIS}
우선권
본 출원의 청구범위는 2008년 8월 28일에 제출된 미국 특허 가출원 제61/190,530호를 근거로 우선권을 주장하고, 상기 내용은 본 발명에 그 전체가 참조로서 통합된다.
기술 분야
본 발명은 생물과학 분야, 더욱 구체적으로는 암 연구, 암 진단 및 암 치료 분야에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 암 치료 및/또는 예방제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
폐암은 전세계에서 암에 의한 사망의 가장 일반적 원인 중 하나이고, 비-소세포성 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)은 상기 케이스의 거의 80% 이상을 차지한다(Greenlee RT, et al., CA Cancer J Clin 2001; 51: 15-36). 식도편평세포암종(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)은 가장 치명적인 소화관의 악성종양 중 하나이며, 진단 시에 대부분의 환자는 진행 상태이다(Shimada H, et al., Surgery 2003; 133: 486-94). 방사선치료 및 화학치료와 같은 다양한 방법과 병행된 현재 의료 기술의 이용에도 불구하고, ESCC의 전체 5년 생존율은 여전히 40% 내지 60%에 머물며(Tamoto E, et al., Clin Cancer Res 2004; 10: 3629-38), 폐암의 전체 5년 생존률은 겨우 15%이다(Greenlee RT, et al., CA Cancer J Clin 2001; 51: 15-36).
폐암 및 식도암의 진단, 치료, 및/또는 예방을 위한 강력한 분자 표적을 분리하기 위하여, 101 폐암 및 19 ESCC 환자로부터 암 세포의 유전자 발현 프로파일의 게놈-와이드(genome-wide) 분석을 27,648 유전자로 구성된 cDNA 마이크로어레이를 이용하여 수행하였다(WO2004/031413, WO2007/013665, WO2007/013671, Daigo Y and Nakamura Y, Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53, Kikuchi T, et al., Oncogene 2003;22:2192-205, Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res 2003;1:485-99, Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 2004;13:3029-43, Kikuchi T, et al., Int J Oncol 2006; 28:799-805, Taniwaki M, et al., Int J Oncol 2006;29:567-75, 및 Yamabuki T, et al., Int J Oncol 2006;28:1375-84). 상기 각각의 유전자 산물의 생물학적 및 임상 병리학적 중요성을 확인하기 위하여, 기능 상실(loss-of-function) 효과의 고속 대량 스크리닝(high-throughput screening)을 RNAi 기술 및 임상 폐암 재료의 종양 조직 마이크로어레이 분석을 이용하여 수행하였다(Suzuki C, et al., Cancer Res 2003;63:7038-41, Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res 2004;10:8363-70, Kato T, et al., Cancer Res 2005;65:5638-46, Furukawa C, et al., Cancer Res 2005;65:7102-10, Ishikawa N, et al., Cancer Res 2005; 65:9176-84, Suzuki C, et al., Cancer Res 2005;65:11314-25, Ishikawa N, et al., Cancer Sci 2006;97:737-45, Takahashi K, et al. Cancer Res 2006;66:9408-19, Hayama S, et al., Cancer Res 2006;66:10339-48, Kato T, et al., Clin Cancer Res 2007;13:434-42, Suzuki C, et al., Mol Cancer Ther 2007;6:542-51, Yamabuki T, et al., Cancer Res 2007;67:2517-25, Hayama S, et al., Cancer Res 2007;67:4113-22, Kato T, et al., Cancer Res 2007;67:8544-53, Taniwaki M, et al., Clin Cancer Res 2007;13:6624-31, Ishikawa N, et al., Cancer Res 2007;67:11601-11, Mano Y, et al., Cancer Sci 2007;98:1902-13, Suda T, et al., Cancer Sci 2007;98:1803-8, Kato T, et al., Clin Cancer Res 2008;14:2363-70 and Mizukami Y, et al., Cancer Sci 2008;99:1448-54).
OIP5(opa interacting 단백질 5)는 Opa(Neisseria Gonorrhoeae opacity-associated) 단백질과의 상호작용을 하는 효모 단백질잡종법(two-hybrid) 분석에 의해서 발견되었다(Williams, J. M., et al., Mol Microbiol 1998; 27(1): 171-86). OIP5는 임균 부착 및 인간 상피세포의 부착에 관련된다. 이전의 연구에서는 인간 위암에서 OIP5 mRNA의 증가된 발현이 나타났으며(Nakamura Y, et al., Ann Surg Oncol 2007;14:885-92.), 그리고 Raf1과 같은 몇몇의 환자들은 이전에 OIP5와 상호작용한다는 것이 보고된바 있으나(Yuryev, A. and L. P. Wennogle, Genomics 2003; 81(2): 112-25), 발암작용 중 OIP5의 생물학적 기능은 밝혀지지 않았다.
WO2004/031413 WO2007/013665 WO2007/013671
Greenlee RT, et al., CA Cancer J Clin 2001; 51: 15-36 Shimada H, et al., Surgery 2003; 133: 486-94 Tamoto E, et al., Clin Cancer Res 2004; 10: 3629-38 Daigo Y and Nakamura Y, Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53 Kikuchi T, et al., Oncogene 2003;22:2192-205 Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res 2003;1:485-99 Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 2004;13:3029-43 Kikuchi T, et al., Int J Oncol 2006; 28:799-805 Taniwaki M, et al., Int J Oncol 2006;29:567-75 Yamabuki T, et al., Int J Oncol 2006;28:1375-84 Suzuki C, et al., Cancer Res 2003;63:7038-41 Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res 2004;10:8363-70 Kato T, et al., Cancer Res 2005;65:5638-46 Furukawa C, et al., Cancer Res 2005;65:7102-10 Ishikawa N, et al., Cancer Res 2005; 65:9176-84 Suzuki C, et al., Cancer Res 2005;65:11314-25 Ishikawa N, et al., Cancer Sci 2006;97:737-45 Takahashi K, et al. Cancer Res 2006;66:9408-19 Hayama S, et al., Cancer Res 2006;66:10339-48 Kato T, et al., Clin Cancer Res 2007;13:434-42 Suzuki C, et al., Mol Cancer Ther 2007;6:542-51 Yamabuki T, et al., Cancer Res 2007;67:2517-25 Hayama S, et al., Cancer Res 2007;67:4113-22 Kato T, et al., Cancer Res 2007;67:8544-53 Taniwaki M, et al., Clin Cancer Res 2007;13:6624-31 Ishikawa N, et al., Cancer Res 2007;67:11601-11 Mano Y, et al., Cancer Sci 2007;98:1902-13 Suda T, et al., Cancer Sci 2007;98:1803-8 Kato T, et al., Clin Cancer Res 2008;14:2363-70 Mizukami Y, et al., Cancer Sci 2008;99:1448-54 Williams, J. M., et al., Mol Microbiol 1998; 27(1): 171-86 Yuryev, A. and L. P. Wennogle, Genomics 2003; 81(2): Nakamura Y, et al., Ann Surg Oncol 2007;14:885-92.
본 발명의 요약
본 발명에서, OIP5 과발현은 폐암 및 식도암 세포의 악성 성향에 기여할 수 있다는 것이 기재된다. 따라서, 상기 OIP5 분자를 표적화하는 것은 폐암 및 식도암의 임상 관리에 있어서 신규한 진단 및 치료 전략의 개발을 기약할 수 있을 것이다.
특히, 본 발명은 특정 서열(특히, 서열번호 11 및 12)을 포함하는 이중가닥 분자가 폐 및/또는 식도암 세포의 세포 성장을 억제하는 효과를 나타낸다는 발견으로부터 발생한다. 구체적으로 OIP5 유전자를 표적으로 하는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNAs)는 본 발명에 의해서 제공된다. 이러한 이중가닥 분자는 분리된 상태 또는 벡터에 암호화된 상태 및 상기 벡터로부터 발현되어 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 이러한 이중가닥 분자뿐만 아니라, 벡터, 및 이들을 발현하는 숙주세포를 제공하는 것이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 세포 성장을 억제하기 위한 방법 및 상기 이중가닥 분자 또는 본 발명의 벡터를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 폐 및/또는 식도암의 치료 방법을 제공한다. 이러한 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 하나 또는 다수의 본 발명의 이중가닥 분자 또는 벡터로 구성된 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암 치료를 위한, 최소 하나의 본 발명의 이중가닥 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자에게 유래된 생물학적 시료에서 OIP5의 발현수준을 확인하는 것에 의해서 개체의 폐 및/또는 식도암의 성향을 진단 또는 확인하는 방법을 제공한다. OIP5 유전자의 정상 대조군 수준에 비하여, OIP5 유전자의 발현 수준의 증가는 개체가 폐 및/또는 식도암으로부터 고통받거나 또는 이들이 발전될 위험이 있다는 것을 가리킨다.
더욱이, 본 발명은 OIP5의 높은 발현수준이 낮은 생존률과 관련된다는 것을 발견한 것과 관련된다. 따라서, 본 발명은 OIP5 발현 수준을 검출하는 단계, 이를 미리 확인된 참조 발현수준과 비교하기 및 이들 사이의 차이로부터 상기 환자의 예후를 결정하는 단계를 포함하는, 폐 및/또는 식도암을 갖는 환자의 예후를 측정 또는 확인하는 방법을 제공한다.
상세한 측면에서, 본 발명은 폐 및/또는 식도암을 치료 및/또는 예방하기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 화합물은 상기 OIP5 폴리펩티드(polypeptide)와 결합하거나 또는 상기 OIP5 폴리펩티드의 생물학적 활성을 감소시키거나 또는 상기 OIP5 유전자 또는 상기 OIP5 유전자를 대체하는 리포터(reporter) 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 상기 OIP5 폴리펩티드와 Raf1 폴리펩티드 사이의 결합을 억제시키거나 또는 상기 OIP5 폴리펩티드의 인산화 반응을 억제시킬 수 있다.
당업자는 본 발명의 하나 또는 다수의 측면이 특정 목적을 달성시킬 수 있으나, 반면 하나 또는 다수의 다른 측면은 다른 특정 목적을 달성할 수 있다고 이해할 수 있다. 이 모든 각각의 측면에 있어서, 각각의 목적은 본 발명의 각각의 측면에 동등하게 적용되지 않을 수 있다. 그 자체로, 상기의 목적은 본 발명의 어느 하나의 측면을 대체하는 것으로 볼 수 있다. 본 발명의 이러한 목적과 다른 목적 및 특징은 하기 상세한 설명을 동반된 도면과 실시예와 함께 읽었을 때, 더욱 명백하게 될 수 있을 것이다. 그러나, 앞서 기재된 본 발명의 요약 및 하기 상세한 설명 모두는 바람직한 실시예의 하나이나, 본 발명 또는 다른 본 발명의 대체되는 실시예에 의해서 한정되지 않는다.
본 발명의 다양한 측면 및 활용은 도면의 간단한 설명 및 본 발명의 상세한 설명 및 하기 바람직한 실시예에 근거하여 당업자에게 명확할 것이다:
[도 1] 도 1은 폐 및 식도암 및 정상 조직에서 OIP5 발현을 나타낸다. Part A에서는, 반정량적 RT-PCR 분석에 의해서 검출된 정상 폐 조직 및 15개 임상 폐암 시료[폐선암(ADC), 폐 SCC, and SCLC; 상위 패널] 및 15개 폐암 세포주(하위 패널)에서 OIP5의 발현이 나타난다. Part B에서는, 정상 식도 및 10개 임상 ESCC 조직 시료(상위 패널) 및 10개 ESCC 세포주에서 반정량적 RT-PCR 분석에 의해서 검출된 OIP5의 발현을 나타낸다. Part C에서는, SBC-5 세포에서 내인성 OIP5 단백질의 세포 내 위치가 나타난다. OIP5는 핵과 세포질에서 염색되었다. DAPI, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole). Part D에서는, 16개 정상 인간 조직에서 OIP5 전사체(transcript)의 노던 블랏(Northern blot) 분석 결과를 나타낸다. 강한 신호가 정소에서 관찰되었다.
[도 2] 도 2는 OIP5 단백질 발현과 NSCLC 환자의 더욱 좋지 않은 임상 결과와 OIP5 단백질 발현과의 관계를 나타낸다. Part A에서는, 폐암(편평세포암종, x100) 및 정상 폐(x100), 및 확대된 화면(x200)내 OIP5 발현의 대표적인 예를 나타낸다. Part B에서는, NSCLC 환자에서 OIP5 발현수준에 따른 종양 특이적 생존의 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 분석 결과를 나타낸다.
[도 3] 도 3은 세포의 성장에 있어서 OIP5 효과를 나타낸다. Part A에서는, 반정량적 RT-PCR에 의해서 분석된 LC319 세포(왼쪽 패널) 및 SBC5(오른쪽 패널)에서 si-OIP5(si-1 및 -2) 또는 대조군에 대한 OIP5 발현을 나타낸다(상위 패널). 구체적으로, si-1, si-2, si-LUC, 또는 si-CNT(중간 패널)에 대한 LC319 또는 SBC-5 세포의 생존능력이 MTT 분석에 의해서 측정되었다. 특이적 siRNA 또는 대조군 siRNA에 의해서 형질전환된 LC319 및 SBC-5 세포의 콜로니 형성 분석(Colony-formation assay)(하위 패널). 모든 실험은 3회 반복된 분석으로 수행되었다. Part B에서는, COS-7 세포의 성정에 있어서 OIP5의 영향을 나타낸다. 구체적으로, COS-7 세포에서 OIP5의 발현은 웨스턴 블랏(western-blot) 분석에 의해서 측정되되었다(왼쪽 상위 패널). 상기 pCAGGSn3Fc-OIP5 또는 막(mock) 벡터로 형질감염된 세포는 각각 3배수로 배양되었으며, 상기 세포의 생존능력은 MTT 분석에 의해서 측정되었다(오른쪽 패널). OIP5 발현 플라스미드로 형질감염된 세포로부터 유래된 콜로니의 크기 및 수는 막(mock) 벡터를 이용하여 형질감염된 세포에 비하여 훨씬 컸다(왼쪽 하위 패널).
[도 4] 도 4는 내인성 및 외인성 OIP5의 인산화 반응을 나타낸다. 구체적으로 람다(lambda)-PPase 처리에 의하여 내인성 또는 외인성 OIP5의 위쪽(인산화) 밴드가 사라졌다.
[도 5] 도 5는 폐암 및 식도암 및 정상 조직에서 OIP5 발현을 나타낸다. Part A에서는, 폐암 세포주에서 OIP5의 발현이 웨스턴 블랏(western blot) 분석에 의해서 측정되었다. ACTB의 발현은 정량 대조군으로서 사용되었다. Part B에서는, SBC-5 세포에서 내인성 OIP5 단백질의 세포내 위치가 나타난다. OIP5는 핵 및 세포질에서 염색되었다. DAPI, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole).
[도 6] 도 6은 정상 조직 및 폐암 및 식도암에서 OIP5 단백질 발현을 나타낸다. Part A에서는 23개 정상 인간 조직에서 OIP5 전사체(transcript)의 노던 블랏(Northern blot) 분석을 나타낸다. 강력한 신호가 정소에서 관찰되었다. Part B에서는, 6개 정상 인간 조직뿐만 아니라, 폐암 및 ESCC의 다양한 조직 종류에서 OIP5 발현이 면역조직화학 염색법에 의해서 검출되었다(확대 X 100). 양성 염색은 정소 세포 및 폐암 세포의 핵 및 세포질에서 대부분 나타났다.
[도 7] 도 7은 OIP5 단백질 발현과 NSCLC 및 ESCC 환자의 더욱 좋지 않은 임상 결과와 OIP5 단백질 발현과의 관계를 나타낸다. Part A에서는 폐암(편평세포암종) 및 정상폐(상단, X100; 하단 X200)에서 OIP5 발현의 대표적인 예를 나타낸다. Part B에서는, NSCLC 환자에서 OIP5 발현수준에 따른 종양 특이적 생존의 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 분석을 나타낸다. Part C에서는, ESCC 및 정상 식도(상단 X100; 하단 X200)에서 OIP5 발현의 대표적인 예를 나타낸다. Part D에서는, ESCC 환자에서 OIP5 발현수준에 따른 종양 특이적 생존의 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 분석(P = 0.0129; log-rank test)을 나타낸다.
[도 8] 도 8은 Raf1 단백질과 상호작용을 통한 OIP5 단백질의 안정화를 나타낸다. Part A에서는, 폐암 세포에서 외인성 OIP5와 내인성 Raf1 단백질의 상호작용을 나타낸다. 면역침전(Immunoprecipitation)은 M2-Flag 아가로즈(agarose) 및 pCAGGSn3FC-OIP5-Flag로 형질감염되고 내인성으로 Raf1을 발현하는 COS-7 세포로부터 유래한 추출물을 이용하여 수행되었다. 면역침전물(Immunoprecipitate)은 내인성 Raf1을 검출하기 위하여, 항-Raf1 다중클론성 항체를 이용한 웨스턴 블랏(western-blot) 분석의 대상이 되었다. IB는 면역블랏팅(immunoblotting)을 가리킨; IP는 면역침전(Immunoprecipitation)을 가리킨다. Part B에서는, 폐암 세포주에서 OIP5 및 Raf1 단백질의 발현을 나타낸다. OIP5의 발현 패턴은 Raf1 단백질의 발현패턴과 상당히 일치하게 나타났다. Part C에서는, Raf1 발현의 OIP5 단백질 수준에 미치는 영향이 나타난다. 왼쪽 패널에서는, Raf1 넉다운(knockdown)의 OIP5 단백질 수준에 미치는 효과가 나타난다. 내인성 Raf1 및 OIP5 전사체(transcript)뿐만 아니라 이들이 암호화하는 단백질의 발현은 si-Raf1로 형질감염된 SBC-5 세포에서 반정량적 RT-PCR 분석 및 웨스턴 블랏(western blot) 분석에 의해서 검출되었다. 오른쪽 패널에서는, Raf1 과발현이 OIP5 수준에 미치는 영향이 나타난다. Raf1 및 OIP5 전사체(transcript) 및 단백질의 발현 수준은 Raf1 발현 벡터로 형질감염된 SBC-5 세포에서 반정량적 RT-PCR 분석 및 웨스턴 블랏(western blot) 분석에 의해서 검출되었다.
[도 9] 도 9는 추가되는 도면을 나타낸다. Part A에서는, OIP5에 대한 항체 특이성을 검사하기 위한 항원 블로킹 분석(antigen blocking assay)을 나타낸다. 항-OIP5 항체는 면역조직화학 염색(항-OIP5 + rhOIP5)을 하기 전에, 재조합 OIP5 단백질과 배양되었다. 폐암 조직(항-OIP5)에서 획득된 항-OIP5 항체에 의한 양성 신호는 rhOIP5와의 전배양(preincubation)에 의해서 감소하였다. Part B에서는, OIP5에 의한 COS-7의 세포 침윤성(invasiveness)의 증가를 나타낸다. COS-7 세포에서 OIP5의 발현은 웨스턴 블랏 분석에 의해서 검사되었다(왼쪽 상위 패널). 마트리겔 매트릭스(Matrigel matrix)에서의 분석은 pCAGGSn3Fc-OIP5-Flag로 형질감염된 후, COS-7 세포의 침윤 특성을 나타낸다. Giemsa 염색(하위 패널; 확대, x100), 및 마트리겔-코팅 필터를 통해서 이동된 세포의 상대적인 수(오른쪽 상위 패널)을 나타낸다. Part C에서는, OIP5와 Raf1 단백질의 직접적인 상호작용을 나타낸다. OIP5 단백질의 풀-다운(pull-down)은 항-His 항체 및 His-태그된 OIP5 및 GST-융합된 재조합 Raf1 단백질의 혼합물을 이용하여 수행되었다. OIP5와 결합된 Raf1 단백질은 Raf1 단백질에 대한 다중클론성 항체(세포 신호 기술)을 이용하여, 연속된 웨스턴 블랏에 의해서 검출되었다. Part D에서는 폐암 세포주에서 반정량적 RT PCR에 의해서 검출된 Raf1의 발현을 나타냈다.
발명의 상세한 설명
본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동일한 어떠한 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 검사를 위해 사용될 수 있지만, 적절한 방법, 장치 및 재료는 하기에 기술된다. 그러나 본 발명의 재료 및 방법을 기술하기에 앞서, 본 발명에 기재된 특정한 사이즈, 모양, 부피, 재료, 방법, 프로토콜 등에 한정되지 않으며, 이는 통상적 실험 및 최적화와 같이 다양하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 설명에 사용한 용어는 특별한 버전 또는 실시예의 설명을 목적으로 사용되었을 뿐, 부록된 청구에 의해서만 제한될 수 있는 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 발명의 상세한 설명에 언급된 각각의 발표, 특허 또는 가출원의 내용은 본 발명에서에서 그 전체가 참조로서 통함된다. 그러나, 본 발명의 그 어떤 것도 이전 발명에 의해서 선행되는 것으로 인정된다고 보지 않는다.
모순이 있는 경우, 정의를 포함하여 본 발명의 명세서는 조절될 것이다. 또한, 상기 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시될 뿐이고 이에 한정되지 않는다.
정의:
본 명세서에 사용되는 용어 "1개(a, an)" 및 "그(the)"는, 특별히 나타내지 않는 한, "적어도 1개"를 의미한다.
본 발명에서 언급된, 상기 용어 "생물학적 시료"는 전체 생물체 또는 그것의 조직, 세포 또는 구성요소의 일부분(예를 들면, 혈액에 한정되지 않고, 점액, 림프액, 윤활액, 뇌척수액, 타액, 양수, 양막제대혈, 소변, 질액 및 정액을 포함하는, 체액)을 나타낸다. 또한 "생물학적 시료"는 전체 생물체 또는 그것의 세포, 조직 또는 구성요소, 또는 이들의 분획물 또는 부분의 일부분으로부터 제조된 균질현탁액, 용해물, 추출물, 세포 배양물 또는 조직 배양물을 나타낸다. 마지막으로, "생물학적 시료"는 예를 들어, 생물체가 번식하는 영양 배지 또는 겔과 같은 배지를 나타내고, 예를 들어, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드와 같은, 세포구성성분을 포함한다.
상기 용어 "유전자", "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "핵산", 및 "핵산 분자"는 핵산 잔기의 폴리머와 호환적으로 사용되고, 달리 나타내지 않는 한 단일-문자 암호로 사용된다. 하나 이상의 핵산을 포함하는 핵산(뉴클레오티드) 폴리머에 적용되는 용어는 에스테르 결합에 의해 연결된다. 사기 핵산 폴리머는 DNA, RNA 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있고, 자연-발생된 것 및 비-자연 발생된 핵산 폴리머 모두를 포함한다.
상기 용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머를 나타내기 위하여 본 명세서에서 호환적으로 사용된다. 상기 용어는 자연적으로 발생된 아미노산, 합성된 아미노산뿐만 아니라, 하나 또는 다수의 아미노산 잔기가 변형된 잔기이거나, 또는 자연적으로 생성된 아미노산에 상응되는 인공적인 화학 미메틱(mimetic)과 같은 비-자연적으로 생성된 잔기인 아미노산 미메틱스(mimetics), 아미노산 폴리머인, 아미노산 유사체 및 아미노산 미메틱 아미노산 폴리머를 일컫는다. 자연적으로 생성된 아미노산은 유전자 코드에 의해서 암호화될뿐만 아니라, 세포에서 번역(translation)된 후, 변형된 아미노산이다(예를 들어, 하이드록시프롤린(hydroxyproline), 감마-카보옥시글루타메이트(gamma-carboxyglutamate), 및 O-포스포세린(phosphoserine)). 상기 문구 "아미노산 유사체(amino acid analog)"는 자연적으로 생성되었으나, 변형된 R기 또는 변형된 백본(backbone)(예를 들어, 호모세린(homoserine), 노르류신(norleucine), 메티오닌(methionine), 설폭사이드(sulfoxide), 메티오닌 메틸 설포니움(methionine methyl sulfonium))으로서, 상기 동일한 기본 화학 구조(알파 탄소가 수소, 카복시(carboxy)기, 아미노(amino)기 및 R기에 결합된다)를 갖는 화합물을 일컫는다. 상기 문구 "아미노산 미메틱(amino acid mimetic)"은 다른 구조를 가지고 있으나, 일반적인 아미노산과 유사한 기능을 갖는 화학 화합물을 일컫는다. 아미노산은 일반적으로 알려진 세 글자 심볼 또는 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission에서 권장하는 한 글자로 본 발명에서 일컬을 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 상기 용어 "암"은 상기 OIP5 유전자가 과발현되는 암을 일컫는다. OIP5가 과발현되는 암의 예는 폐암 및 식도암을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
유전자 또는 단백질
본 발명의 관심을 갖는 핵산 및 폴리펩티드 서열의 유전자는 하기 숫자에 나타내나, 이에 한정되지 않는다;
OIP5: 서열번호 13 및 14
Raf1: 서열번호 17 및 18
추가적으로, 상기 서열 데이타는 하기 접속 번호를 통하여 이용 가능하다.
OIP5: NM_007280;
Raf1: NM_002880 ;
본 발명의 하나의 측면에서, 기능적 등가물은 또한 상기 "폴리펩티드"로 간주된다. 본 발명에서, 단백질의 "기능적 등가물"은 상기 단백질과 동등한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 즉, 원래의 참조 펩티드의 생물학적 활성을 유지하고 있는 폴리펩티드는 본 발명에서 기능적 등가물로서 이용될 수 있다. 이러한 기능적 등가물은 상기 자연적으로 생성된 단백질의 아미노산 서열에 하나 또는 다수의 아미노산이 치환, 삭제 또는 삽입된 것을 포함한다. 대안적으로 상기 폴리펩티드는 최소 각각의 단백질의 서열에 대하여 약 80%의 상동성(또한 서열 일치성이라고도 일컬음), 더욱 바람직하게는 최소 약 90% 내지 95% 상동성이며, 이보다 더욱 바람직하게는 96% 내지 99%의 상동성을 갖는 것을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시 예에서, 상기 폴리펩티드는 엄격한 조건하에서 상기 자연적으로 생성된 유전자의 뉴클레오티드 서열과 혼성화(hybridize)되는 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 이를 생산하는 세포 또는 숙주 또는 이용되는 정제 방법에 따라, 아미노산 서열, 분자량, 등전점(isoelectric point), 당쇄(sugar chain)의 존재 또는 부재, 또는 형태에 변이를 가질 수 있다. 그럼에도, 이러한 폴리펩티드가 본 발명의 인간 단백질의 기능과 동등한 기능을 갖는 한, 이는 본 발명의 범위 안에 있다.
상기 문구 "엄격한(혼성화) 조건"은 핵산 분자가 이의 표적 서열인 일반적 핵산 분자의 복합체 혼합물과 혼성화되나, 다른 서열과 혼성화되지 않는 조건을 일컫는다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며, 다른 상황에서 다양할 수 있다. 긴 서열은 더 높은 온도에서 특이적으로 혼성화된다. 핵산의 혼성화에 대한 포괄적 안내는 “혼성화 원칙 및 핵산 분석 방법의 전략에 대한 개관”(Tijssen, techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic probes, "Overview of principles of 혼성화 and the strategy of nucleic acid assays" (1993))에서 확인된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 일정한 pH의 이온 세기에서 특이적 서열에 대한 융점(Tm) 보다 낮은 약 5 ~ 100℃에서 선택된다. 상기 융점(일정한 pH의 이온세기, 및 핵산 농도)은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 표적 서열과 혼성화되어 평형(과량의 표적 서열이 존재할 때, Tm에서 50%의 프로브이 평형 상태이다)을 이루는 온도이다. 또한, 엄격한 조건은 포름아마이드(formamide)와 같은 불안정화 시약을 첨가하여 도달할 수 있다. 선택적인 또는 특이적인 혼성화를 위하여, 적어도 양성 신호가 바탕값의 두 배이고, 바람직하게는 바탕값 혼성화의 10배이다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 하기와 같을 수 있다: 42℃에서 5×SSC 및 1% SDS로 세척하면서 50% 포름아마이드(formamide), 5×SSC, 및 1% SDS, 65℃에서 반응; 또는 0.2×SSC, 0.1% SDS, 50℃에서 반응.
본 발명의 문맥에서, 상술한 인간 단백질에 대한 기능적 등가물인 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 선별하기 위한 혼성화 조건은 당업자라면 일상적으로 선별할 수 있다. 예를 들면, 혼성화는 "Rapid-hyb buffer”(Amersham LIFE SCIENCE)를 이용하여 68℃에서 30분 또는 그 이상 전-혼성화를 수행하는 것, 표지된 프로브을 첨가하는 것 및 65℃에서 1시간 또는 그 이상 보온하는 것을 통해 수행될 수 있다. 이후 세척 단계는 예를 들면, 낮은 엄격한 조건에서 수행될 수 있다. 예시적인 낮은 엄격한 조건은 42℃, 2x SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 50℃, 2x SSC, 0.1% SDS를 포함한다. 높은 엄격한 조건을 사용하는 것이 종종 바람직하다. 예시적인 높은 엄격한 조건은 2x SSC, 0.01% SDS로 상온에서 20분간 3번 세척, 1x SSC, 0.1% SDS로 37℃에서 20분간 3번 세척, 1x SSC, 0.1% SDS로 50℃에서 20분간 2번 세척을 포함한다. 그러나 온도, 염 농도와 같은 몇몇의 인자는 혼성화의 엄격함에 영향을 줄 수 있고, 당업자는 요구되는 엄격함을 달성하기 위하여 상기 인자를 용이하게 선별할 수 있다.
일반적으로 단백질에서 하나 이상의 단백질의 변형은 상기 단백질의 기능에 영향을 주지 않을 것이다. 사실, 돌연변이되거나 변형된 단백질(즉, 하나, 둘 또는 다수의 아미노산 잔기로 구성된 펩티드는 치환, 삭제, 삽입 및/또는 첨가를 통해서 변형됨)은 본래의 생물학적 활성을 유지하고 있다는 것이 알려져 있다(Mark et al ., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6(1984); Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500(1982); Dalbadie-McFarland et al ., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13(1982)). 따라서, 당업자는 단일 아미노산 또는 적은 백분율의 아미노산 또는 “보존된 변환(conservative modifications)”으로 고려되는 아미노산 서열의 개별적 첨가, 결실, 삽입 또는 치환을 인식할 것이고, 본 발명에서 상기 단백질의 변화 결과, 유사한 기능의 단백질이라면, 본 발명의 내용에 수용가능하다. 따라서, 하나의 실시예에서 본 발명의 펩티드는 하나, 둘 또는 그보다 다수의 아미노산이 참조 서열에 첨가, 삽입, 삭제, 및/또는 치환되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 단백질의 활성이 남아있는 한, 아미노산의 돌연변이의 숫자는 특별히 제한되지 않는다. 그러나 일반적으로 상기 아미노산 서열의 5% 이하를 변화시키는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 실시예에서 돌연변이에서 돌연변이 될 아미노산의 숫자는 일반적으로 30개 아미노산 이하, 바람직하게는 20개 아미노산 이하, 더욱 바람직하게는 10개 이마노산 이하, 더더욱 바람직하게는 5개 또는 6개 아미노산 이하, 가장 바람직하게는 3개 또는 4개 아미노산 이하이다.
아미노산 잔기는 돌연변이될 수 있으며, 바람직하게는 아미노산 잔기는 상기 아미노산 측쇄의 특성을 가지는 다른 보존된 아미노산으로 돌연변이될 수 있다(보존적 아미노산 치환으로 알려진 과정). 아미노산 측쇄의 특성의 예로는 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 및 하기 작용기 또는 공동으로 특징을 가지는 측쇄: 지방족 측쇄(G, A, V, L, I, P); 하이드록시기를 포함하는 측쇄(S, T, Y); 황 원자를 포함하는 측쇄(C, M); 카복실산 및 아미드가 포함된 측쇄(D, N, E, Q); 염기가 포함된 측쇄(R, K, H); 및 방향족이 포함된 측쇄(H, F, Y, W)가 있다. 또한, 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 아미노산을 포함하는 각각의 하기 8개의 군은 서로에 대한 보존적 치환이다:
(1) 알라닌(Alanine, A), 글리신(Glycine, G);
(2) 아스파트산(Aspartic acid, D), 글루타민산(Glutamic acid, E);
(3) 아스파라긴(Aspargine, N), 글루타민(Glutamine, Q);
(4) 아르기닌(Arginine, R), 라이신(Lysine, K);
(5) 이소류신(Isoleucine, I), 류신(Leucine, L), 메티오닌(Methionine, M), 발린(Valine, V);
(6) 페닐알라닌(Phenylalanine, F), 티로신(Tyrosine, Y), 트립토판(Tryptophan, W);
(7) 세린(Serine, S), 트레오닌(Threonine, T); 및
(8) 시스테인(Cystein, C), 메티오닌(Methionine, M) (예를 들어, Creighton, Proteins 1984 참조).
이러한 보존적으로 변형된 폴리펩티드는 본 발명의 단백질에 포함된다. 그러나, 본 발명은 이에 한정되지 않고 상기 단백질은 상기 단백질의 생물학적 활성 중 적어도 하나를 가지는 것이라면 비보존적 변형을 포함한다. 또한, 이러한 변형된 단백질은 다형성 변종, 종간 상동체 및 상기 단백질의 대립 유전자에 의해 암호화되는 것들에 대해서 배타적이지 않다.
또한, 본 발명의 유전자는 상기 단백질의 기능적 등가물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 혼성화에 추가로, 예를 들면, 상기 서열에 기초하여 합성된 프라이머를 사용한 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 방법인 유전자 증폭 방법이 상기 단백질의 기능적 등가물인 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 선별하는데 사용될 수 있다. 상기 인간 유전자 및 단백질과 각각 기능적으로 등가물인 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 본래의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 일반적으로 높은 상동성을 가진다. “높은 상동성”은 통상적으로 40% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 내지 95% 이상, 이보다 더욱 바람직하게는 96% 내지 99%이상의 상동성을 지칭한다. 상기 특정 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성은 “Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30(1983)”의 알고리즘을 통해 결정될 수 있다.
이중 가닥 분자:
본 명세서에서 사용된, 용어 "이중 가닥 분자"는 표적 유전자의 발현을 억제하는 핵산을 일컬으며, 예를 들면, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA)(siRNA; 예를 들면, 이중 가닥 리보핵산(double-stranded ribonucleic acid, dsRNA) 또는 작은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA, shRNA)) 및 작은 간섭 DNA/RNA[siD/R-NA; 예를 들면, DNA 및 RNA의 이중 가닥 키메라(dsD/R-NA) 또는 DNA 및 RNA의 작은 헤어핀 키메라(shD/R-NA)]를 포함한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "siRNA"는 표적 mRNA의 번역(translation)을 억제하는 이중가닥 RNA 분자를 일컫는다. siRNA를 세포에 도입하는 DNA가 RNA 전사(transcribed)의 주형이 되는 방법을 포함하는, 표준 기술이 사용되었다. 상기 siRNA는 OIP5 센스 핵산 서열(또한 "센스가닥(sense strand)"이라고 불리움), OIP5 안티센스 핵산 서열(또한 "안티센스가닥(antsense strand)"이라고 불리움) 또는 이 모두를 포함한다. 상기 siRNA는 단일 전사체(transcript)가 상기 표적 유전자, 예를 들어 헤어핀(hairpin)의 센스 및 상보적인 안티센스 핵산 모두를 갖도록 제조될 수 있다. 상기 siRNA는 dsRNA이거나 또는 shRNA일 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "dsRNA"는 서로에 대하여 상보적인 서열로 구성된 두 개의 RNA 문자로 제조된 것을 일컬으며, 이중가닥 RNA 분자를 형성하기 위하여 상보적인 서열을 통하여 같이 어닐링(annealing)된 것을 말한다. 상기 이중가닥의 뉴클레오티드 서열은 표적 유전자 서열의 단백질 암호화 서열로부터 선택되는 "센스" 또는 "안티센스" RNA뿐만 아니라, 상기 표적 유전자의 비암호화(non-coding) 부위의 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNA 분자를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 용어 "shRNA"는 서로 상보적인 제 1 및 제 2 영역, 즉, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는, 스템(stem)-루프 구조를 갖는 siRNA를 일컫는다. 상기 부위의 상보성과 방향성(orientation)의 정도는 영역들 사이에서 염기쌍(base pairing)을 형성하는데 충분하고, 상기 제 1 및 제 2 영역은 루프 영역에 의해 연결되고, 상기 루프는 루프 영역 내의 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체) 사이의 염기쌍의 결여에 기인한다. 상기 shRNA의 루프 영역은 센스 및 안티센스 가닥 사이에 개재 단일 가닥 영역이며, "개재 단일 가닥(intervening single-strand)"이라고도 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "siD/R-NA"는 RNA 및 DNA 모두로 구성되는 이중 가닥 분자를 일컬으며, RNA 및 DNA의 하이브리드 및 키메라를 포함하며, 표적 mRNA의 번역을 억제한다. 본 발명에 있어서, 하이브리드(hybrid)는 DNA로 구성된 폴리뉴클레오티드 및 RNA로 구성된 폴리뉴클레오티드가 서로 혼성화하여 이중 가닥 분자를 형성하는 분자를 가리키고; 한편 키메라는 이중 가닥 분자를 구성하는 상기 가닥의 한쪽 또는 양쪽이 RNA 및 DNA를 포함할 수 있는 것을 나타낸다. siD/R-NA를 세포 내로 도입하는 표준적인 기술이 이용된다. 상기 siD/R-NA는 OIP5 센스 핵산 서열("센스 가닥"이라고도 나타냄), 및 OIP5 안티센스 핵산 서열("안티센스 가닥"이라고도 나타냄), 또는 이들 모두를 포함한다. 상기 siD/R-NA는, 단일 전사체, 예를 들면, 헤어핀과 같은, 표적 유전자로부터의 센스 및 상보적인 안티센스 핵산 서열 모두를 갖도록 구성될 수 있다. 상기 siD/R-NA는 dsD/R-NA 또는 shD/R-NA일 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "dsD/R-NA"는 서로 상보적인 서열을 포함하고, 상기 상보적 서열을 통해 서로 어닐링(anealing)하여 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자를 형성하고 있는 2개의 분자로 이루어진 구조물을 일컫는다. 상기 두 가닥의 뉴클레오티드 서열은 표적 유전자 서열의 단백질을 암호화하는 서열로부터 선택되는 "센스" 또는 "안티센스" 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 상기 표적 유전자의 비암호화 영역으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 dsD/R-NA를 구성하는 2개의 분자의 하나 또는 두 개 모두는 RNA 및 DNA로 구성되거나(키메릭 분자), 또는 대안적으로, 상기 분자의 하나는 RNA로 구성되고, 다른 하나는 DNA로 구성된다(하이브리드 이중 가닥).
본 명세서에서 사용된, 용어 "shD/R-NA"는, 서로 상보적인 제 1 및 2 영역, 즉, 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는, 스템-루프 구조를 갖는 siD/R-NA를 일컫는다. 상기 부위의 제 1 및 2 영역의 상보성과 방향성의 정도는, 영역들 사이에 염기쌍을 형성하는데 충분하고, 제 1 및 제 2 영역은 루프 영역에 의해 연결되며, 상기 루프는 루프 영역 내의 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체) 사이에 염기쌍의 결여로부터 기인한다. shD/R-NA의 상기 루프 영역은, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 개재 단일 가닥 영역이며, 상기 "개재 단일 가닥"라고도 나타낼 수 있다.
본 발명에서 사용된, "분리된 핵산"은 본래의 환경(예를 들어, 만약 자연적으로 생성될 경우에는 자연 환경)으로부터 제거되어, 이의 자연적인 상태로부터 합성적으로 변형된 핵산이다. 본 발명의 문맥에서 분리된 핵산의 예는 DNA, RNA, 및 이의 유사체를 포함한다.
표적 mRNA와 혼성화화는, OIP5에 대한 이중가닥 분자는 상기 유전자의 정상 단일 가닥과 연합에 의하여 OIP5 유전자에 의해서 암호화되는 OIP5 단백질 산물을 감소 또는 억제하여 번역(translation)을 방해하고 따라서 상기 단백질의 발현을 억제한다. 본 명세서에 나타난 바와 같이, 폐 및/또는 식도암 세포주에서 OIP5의 발현은 dsRNA에 의해서 억제되었다(도 3의 A). 따라서, 본 발명은 상기 유전자를 발현하는 세포에 도입되었을 때, OIP5 유전자의 발현을 억제할 수 있는 이중가닥 분자를 제공한다. 이중가닥 분자의 표적 서열은 하기 언급한 것과 같은 siRNA 디자인 알고리즘에 의해서 고안될 수 있다.
OIP5 표적 서열의 예는 예를 들어 하기와 같은 뉴클레오티드를 포함한다:
서열번호 11(서열번호 13의 79 내지 97번째 위치)
서열번호 12(서열번호 13의 557 내지 575번째 위치)
본 발명에서 특히 관심있는 것은 하기 [1] 내지 [18]의 이중가닥 분자이다:
[1] 센스가닥 및 이에 상보적인 안티센스 가닥으로 구성되어, 이중가닥 분자를 형성하기 위하여, 서로 혼성화되고, 세포에 도입되었을 때, OIP5의 생체 내(in vivo) 발현 및 세포 증식을 억제하는 이중가닥 분자;
[2] 서열번호 11(서열번호 13의 79 내지 97번째 위치), 서열번호 12(서열번호 13의 557 내지 575번째 위치) 가운데 선택되는 표적서열과 일치하는 mRNA에 기능을 하는, [1]의 이중가닥 분자;
[3] 상기 센스 가닥이 서열번호 11 및 12 중 선택되는 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는, [2]의 이중가닥 분자;
[4] 100개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, [3]의 이중가닥 분자;
[5] 75개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, [4]의 이중가닥 분자;
[6] 50개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, [5]의 이중가닥 분자;
[7] 25개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, [6]의 이중가닥 분자;
[8] 약 19개 내지 약 25개 사이의 길이를 갖는, [7]의 이중가닥 분자;
[9] 개재 단일 가닥에 의해서 연결된 센스 및 안티센스 가닥 모두를 갖는 단일 폴리뉴클레오티드를 포함하는, [1]의 이중가닥 분자;
[10] [A]는 서열번호 11 및 12 가운데서 선택되는 표적 서열에 상응되는 서열을 포함하는 센스가닥이며, [B]는 3개 내지 23개 뉴클레오티드를 포함하는 개재 단일 가닥(intervening single strand)이며, [A']는 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥인, 화학 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 갖는, [9]의 이중가닥 분자;
[11] RNA로 포함되는, [1]의 이중가닥 분자;
[12] DNA 및 RNA 모두를 포함하는, [1]의 이중가닥 분자;
[13] DNA 폴리뉴클레오티드와 RNA 폴리뉴클레오티드의 하이브리드(hybrid)인, [12]의 이중가닥 분자;
[14] 센스 및 안티센스가닥이 각각 DNA 및 RNA로 구성된, [13]의 이중가닥 분자;
[15] DNA 및 RNA의 키메라인, [12]의 이중가닥 분자;
[16] 상기 안티센스 가닥의 3' 말단에 인접한 부위, 또는 센스가닥의 5' 말단에 인접한 부위 및 안티센스 가닥의 3' 말단의 인접한 부위가 RNA인, [15]의 이중가닥 분자;
[17] 상기 인접 부위가 9개 내지 13개 뉴클레오티드를 포함하는, [16]의 이중가닥 분자; 및
[18] 3' 오버행(overhang)을 포함하는, [1]의 이중가닥 분자.
상기 본 발명의 이중가닥 분자는 하기에 더욱 상세하게 기재될 것이다.
세포에서 표적 유전자 발현을 억제할 수 있는 능력을 갖는 이중가닥 분자를 고안하는 방법은 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제 6,506,559호 참조, 본 명세서에 전체가 참조로서 통합됨). 예를 들어, siRNA를 고안하기 위한 컴퓨터 프로그램은 Ambion 웹사이트(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)에서 사용할 수 있다.
컴퓨터 프로그램은 하기 프로토콜에 기반하여 이중가닥을 위한 표적 뉴클레오티드 서열을 선택한다.
표적 위치의 선택:
1. 전사체의 AUG 시작 코돈(코돈)으로부터 시작하여, AA 다이-뉴클레오티드(di-nucleotide) 서열을 구하기 위하여 다운스트림(downstream)을 스캔한다. 잠재적인 siRNA 표적 부위로서 각각의 AA 및 3'에 인접하는 19개의 뉴클레오티드의 출현을 기록한다. Tuschl 등은 5' 및 3' 비번역 영역(untranslated 부위, UTR) 및 시작 코돈(코돈) 근방(75 염기 이내)의 영역에 대한 siRNA의 설계를 제안하지 않았는데, 이는 이 영역은 조절 단백질 결합 부위에서 더욱 풍부할 수 있으며, UTR 결합 단백질 및/또는 번역 시작 복합체는 siRNA 엔도뉴클레아제(endonuclease) 복합체의 결합을 방해할 수 있기 때문이다.
2. 잠재적인 표적 부위를 적절한 게놈 데이터베이스(인간, 마우스, 래트(rat) 등)와 비교하여 다른 암호화 서열에 대하여 유의적인 상동성을 가지는 임의의 표적 부위의 검토 대상에서 제외한다. 기본적으로, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에 웹상에서 NCBI 서버에서 확인할 수 있는, BLAST가 사용된다(Altschul SF et al ., Nucleic Acids Res 1997 Sep 1,25(17):3389-402).
3. 합성에 적합한 표적 서열을 선택한다. 평가하는 유전자의 길이에 따라 몇몇의 표적 서열을 선별하는 것이 일반적이다.
상술한 프로토콜을 이용하여, 본 발명의 상기 분리된 이중 가닥 분자의 표적 서열은 하기와 같이 설계되었다.
OIP5 유전자를 위한 서열번호 11 및 12.
상기 언급된 표적 서열을 표적하는 이중 가닥 분자는 각각 상기 표적 유전자를 발현하는 세포의 성장을 억제 또는 감소시키는 그들의 활성을 검사하였다. 따라서, 본 발명은 하기 군으로부터 선택되는 어떠한 서열을 표적화하는 이중가닥을 제공한다:
OIP5 유전자를 위한, 서열번호 11(서열번호 13의 79 내지 97번째 위치) 및 12(서열번호 13의 557 내지 575번째 위치)
본 발명의 이중가닥 분자는 단일 표적 OIP5 유전자 서열에 직접적이거나 또는 표적 OIP5 유전자 서열의 다수에 직접적일 수 있다.
상기 언급한 OIP5 유전자 서열을 표적으로 하는 본 발명의 이중가닥 분자는 표적 서열의 핵산 서열의 어느 하나 및/또는 상기 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. OIP5 유전자를 표적으로 하는 폴리뉴클레오티드의 예는 서열번호 11 또는 12의 서열 및/또는 이러한 뉴클레오티드에 상보적인 서열을 포함한다; 그러나, 본 발명은 이러한 예에 제한되지 않으며, 상기 언급한 핵산 서열 내에서 소수의 변형은 변형된 분자가 OIP5 유전자의 발현을 억제하는 능력을 유지하는 한, 허용가능하다. 본 명세서에서, 상기 핵산 서열과 연결되어 사용된 구문 "소수의 변형"은 상기 서열에 하나, 둘 또는 다수의 치환, 삭제, 추가 또는 삽입을 의미한다.
본 발명의 문맥에서, 상기 핵산 서열의 치환, 삭제, 추가, 및/또는 삽입에 적용된 용어 “몇몇의”는 3개 내지 7개, 바람직하게는 3개 내지 5개, 더욱 바람직하게는 3개 내지 4개, 가장 바람직하게는 3개의 핵산 잔기일 수 있다.
본 발명에 따라, 본 발명의 이중 가닥 분자는 실시예에서 사용된 방법들을 사용하여 그것의 능력에 대해 검사될 수 있다. 하기 실시예에서, OIP5 유전자의 mRNA의 다양한 부위의 센스가닥 또는 이의 상보적인 안티센스 가닥으로 구성되는 이중가닥 분자는 표준 방법에 따라서, 폐 및/또는 식도암 세포주에서 OIP5 유전자의 산물을 감소시키는 능력을 시험관 내(in vitro)에서 검사하였다. 더욱이, 예를 들어, 후보 분자의 부재하에서 배양된 세포에 비하여, 후보 이중가닥 분자와 접촉된 세포에서 OIP5 유전자 산불의 감소는 예를 들어, 실시예 1의 항목"반-정량적 RT_PCR" 아래에 언급된 OIP5 mRNA에 대한 프라이머를 이용한 RT-PCR에 의해서 검출될 수 있다. 그리고, 시험관 내 세포 기반 분석에서 OIP5 유전자의 산물을 감소시키는 서열은 이들의 세포 성장을 억제하는 효과를 검사할 수 있다. 시험관 내 세포 기반 분석에서 세포 성장을 억제하는 서열은 OIP5 유전자 산물의 감소량 및 암 세포 성장의 감소를 확인하기 위해서, 암을 갖고 있는 동물, 예를 들어 누드 마우스 이종이식 모델을 이용하여 이들의 생체 내(in vivo) 능력을 분석할 수 있다.
상기 분리된 폴리뉴클레오티드가 RNA 또는 그들의 유도체일 경우, 상기 뉴클레오티드 서열에서 염기 "t"는 "u"로 치환되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는, 상기 용어 "상보적(보충적)"은 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 단위 사이의 왓슨(Watson)-클릭(Crick) 또는 후구스틴(Hoogsteen) 염기쌍을 나타내고, 상기 용어 "결합"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 사이의 물리적 또는 화학적 상호작용을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드 및/또는 비포스포디에스터(non-phosphodiester) 결합을 포함하는 경우, 이러한 폴리뉴클레오티드는 동일한 방법으로 서로 결합할 수 있다. 일반적으로, 상보적 폴리뉴클레오티드 서열은 적절한 조건하에서 혼성화되어 미스매치(mismatch)가 거의 없거나 전혀 없는 안정한 이중 가닥을 형성한다. 또한, 본 발명의 상기 분리된 폴리뉴클레오티드의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 혼성화에 의해 이중 가닥 분자 또는 헤어핀 루프 구조를 형성할 수 있다. 하나의 실시예에 있어서, 이러한 이중 가닥은 10개의 매치마다 1개를 넘지 않는 미스매치(mismatch)를 포함한다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 이중 가닥의 가닥들이 충분히 상보적일 경우, 이러한 이중 가닥은 미스매치(mismatch)를 전혀 포함하지 않는다.
상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 OIP5에 대하여 1249 뉴클레오티드 길이 이하이다. 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 모든 유전자에 대하여 500, 200, 100, 75, 50, 또는 25개 뉴클레오디트 길이 이하이다. 상기 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 OIP5 유전자에 대한 이중가닥 분자를 형성하거나 또는 상기 이중가닥 분자를 암호화하는 DNA 주형을 제조하는데 유용하다. 상기 폴리뉴클레오티드를 이중가닥 분자를 형성하는데 사용할 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 19개 뉴클레오티드 이상이며, 바람직하게는 21개 뉴클레오티드 이상이며, 더욱 바람직하게는 약 19개 내지 25개 뉴클테오티드 사이의 길이를 갖는다.
따라서, 본 발명은 표적 서열에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 센스가닥, 및 안티센스가닥으로 구성되는 이중가닥 분자를 제공한다. 바람직한 실시예에서, 상기 센스가닥은 19개 내지 25개 사이의 뉴클레오티드 쌍 길이를 갖는 이중가닥 분자를 형성하기 위하여, 표적 서열에서 안티센스 가닥과 혼성화된다.
본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 비인산디에스터(non-phosphodiester) 결합을 포함할 수 있다. 당업계에서 잘 알려진 화학적 변형은 상기 이중 가닥 분자의 안정성, 유효성, 및/또는 세포 흡수(cell uptake)를 향상시킬 수 있다. 당업자는 본 발명의 분자에 결합될 수 있는 다른 형태의 화학적 변형을 알 수 있을 것이다(WO03/070744; WO2005/045037). 하나의 실시예에 있어서, 변형은 분해에 대한 내성을 향상시키거나 또는 흡수를 향상시키는데도 이용될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합, 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드(methyl ribonucleotides) (특히 이중 가닥 분자의 센스 가닥에 상에서), 2'-디옥시(deoxy)-플루오로리보뉴클레오티드(fluoro ribonucleotides), 2'-디옥시리보뉴클레오티드(deoxy ribonucleotides), "유니버설 염기(universal base)" 뉴클레오티드, 5'-C-메틸뉴클레오티드(methylnucleotides), 및 반전 디옥시탈염기 잔기의 흡수(inverted deoxyabasic residue incorporation)를 포함한다(US 특허 출원 번호 20060122137).
본 발명의 다른 실시예에서, 변형은 상기 이중 가닥 분자의 안정성을 향상시키거나 또는 표적하는(targeting) 효율을 향상시키기 위해서 이용될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 이중가닥 분자의 두 개의 상보적인 가닥 사이의 화학적 가교 결합, 이중 가닥 분자의 하나의 가닥의 3' 또는 5' 말단의 화학적 변형, 당 변형, 핵산염기 변형 및/또는 골격 변형, 2-플루오로 변형된 리보뉴클레오티드(fluoro modified ribonucleotides) 및 2'-데옥시리보뉴클레오티드(deoxy ribonucleotides)를 포함한다(WO2004/029212). 본 발명의 다른 실시예에서, 변형은 표적 mRNA 및/또는 상보적인 이중 가닥 분자 가닥에 있어서 상보적인 뉴클레오티드에 대한 친화도를 증가 또는 감소시키는데 이용될 수 있다(WO2005/044976). 예를 들면, 비변형된 피리미딘 뉴클레오티드(unmodified pyrimidine nucleotide)는, 2-티오(thio), 5-알키닐(alkynyl), 5-메틸(methyl) 또는 5-프로피닐 피리미딘(propynyl pyrimidine)으로 치환될 수 있다. 추가적으로, 비변형된 퓨린(purine)은, 7-데자(deaza), 7-알킬(alkyl), 또는 7-알케닐(alkenyl) 퓨린(purine)으로 치환될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 이중 가닥 분자가 3' 오버행(overhang)을 갖는 이중 가닥 분자일 경우, 3' 말단 뉴클레오티드 오버행 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides)에 의해 치환될 수 있다(Elbashir SM et al ., Genes Dev 2001 Jan 15,15(2):188-200). 더욱 상세하게는, 발표된 문서, 예를 들면, US 미국 특허 출원 번호 20060234970이 이용 가능하다. 본 발명은 이러한 실시예에 한정되지 않고, 결과적인 분자가 상기 표적 유전자의 발현을 억제하는 능력을 보유하는 한 본 발명의 상기 이중 가닥 분자에 대하여 임의의 공지된 화학적 변형도 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 DNA 및 RNA 모두, 예를 들면, dsD/R-NA 또는 shD/R-NA를 포함할 수 있다. 구체적으로, DNA 가닥과 RNA 가닥의 혼성체(hybrid) 폴리뉴클레오티드 또는 DNA-RNA 키메라 폴리뉴클레오티드(chimera polynucleotides)는 증가된 안정성을 나타낸다. DNA와 RNA의 혼합, 즉, DNA 가닥(폴리뉴클레오티드)과 RNA가닥(폴리뉴클레오티드)으로 이루어진 혼성체 형태의 이중 가닥 분자와, 어느 한쪽 또는 양쪽의 단일 가닥(폴리뉴클레오티드)에 대한 DNA 및 RNA 모두를 포함하는 키메라 형태의 이중 가닥 분자, 또는 그것의 유사체가 상기 이중 가닥 분자의 안정성을 향상시키기 위해서 형성될 수 있다.
DNA 가닥과 RNA 가닥 혼성체(hybrid)는 상기 유전자를 발현하는 세포 내로 도입되었을 경우에 상기 표적 유전자의 발현을 억제하는 활성을 갖는 한, 상기 센스 가닥이 DNA이고 상기 안티센스 가닥이 RNA인 혼성체일 수 있고 또는 그 반대의 혼성체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 센스 가닥 폴리 뉴클레오티드는 DNA이고, 상기 안티센스 가닥 폴리뉴클레티드는 RNA이다. 또한, 상기 유전자를 발현하는 세포 내로 도입되었을 경우에 상기 표적 유전자의 발현을 억제하는 활성을 갖는 한, 상기 키메라 형태의 이중 가닥 분자는 상기 센스 및 안티센스 가닥의 모두는 DNA 및 RNA로부터 구성될 수 있고, 또는 상기 센스 및 안티센스 가닥 중 어느 하나가 DNA 및 RNA로 구성될 수 있다. 상기 이중 가닥 분자의 안정성을 향상시키기 위하여, 바람직하게는, 상기 분자는 가능한 한 많은 DNA를 포함하고, 한편, 상기 표적 유전자 발현의 억제를 유도하기 위해서, 상기 분자는 충분한 발현 억제를 유도하는 범위 내의 RNA인 것이 요구된다.
키메라 형태의 이중 가닥 분자의 하나의 실시예에 있어서, 상기 이중 가닥 분자의 업스트림(upstream) 부분 영역(예를 들어, 상기 센스 또는 안티센스 가닥 내의 상기표적 서열 또는 이의 상보적 서열에 인접하는 영역)은 RNA이다. 바람직하게는, 업스트림 부분 영역은, 상기 센스 가닥의 5' 측(5' 말단) 및 상기 안티센스 가닥의 3'측(3' 말단)을 가리킨다. 대안적으로, 업스트림 부분 영역은, 상기 센스 가닥의 5' 말단 및 상기 안티센스 가닥의 3' 말단을 가리킨다. 즉, 바람직한 실시예에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 3' 말단 인접 영역, 또는 센스 가닥의 5' 말단 인접 영역 및 안티센스 가닥의 3' 말단 인접 영역 모두가 RNA로 구성된다. 예를 들면, 본 발명의 키메라 또는 혼성체 형태의 이중 가닥 분자는 하기의 조합을 포함한다.
센스가닥:
5'-[---DNA---]-3'
3'-(RNA)-[DNA]-5'
:안티센스가닥,
센스가닥:
5'-(RNA)-[DNA]-3'
3'-(RNA)-[DNA]-5'
:안티센스가닥, 및
센스가닥:
5'-(RNA)-[DNA]-3'
3'-(---RNA---)-5'
:안티센스가닥.
상기 업스트림 부분 영역(upstream partial 부위)은, 상기 이중 가닥 분자의 센스 또는 안티센스 가닥 내의 표적 서열 또는 이의 상보적 서열의 말단에서부터 계수되는 약 9～13개의 뉴클레오티드의 도메인일 수 있다. 또한, 이러한 키메라 형태의 이중 가닥 분자의 예시로는 상기 폴리뉴클레오티드의 적어도 업스트림 절반 영역(상기 센스 가닥의 5'측 영역 및 상기 안티센스 가닥의 3'측 영역)이 RNA이고, 다른 절반이 DNA인 19～21 뉴클레오티드 길이의 가닥을 갖는 것을 포함한다. 이러한 키메라 형태의 이중 가닥 분자에 있어서, 상기 표적 유전자의 발현 억제 효과는 안티센스 가닥 전체가 RNA인 경우보다 훨씬 높다(미국 특허 출원 번호 20050004064).
본 발명의 문맥에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 헤어핀 구조, 예를 들면, 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA) 및 DNA와 RNA로 구성된 짧은 헤어핀(short hairpin made of DNA and RNA, shD/R-NA)을 형성할 수 있다. 상기 shRNA 또는 shD/R-NA는 타이트한 헤어핀 턴(hairpin turn)을 형성하는 RNA 또는 RNA와 DNA의 혼합 서열이며 그것은 RNA 간섭을 통해서 유전자 발현을 중지시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 shRNA 또는 shD/R-NA는 단일 가닥 상에 상기 센스 표적 서열과 상기 안티센스 표적 서열을 포함하고, 상기 서열은 루프 서열에 의해 분리된다. 일반적으로, 상기 헤어핀 구조는 dsRNA 또는 dsD/R-NA 내에서 세포 기구에 의해 절단되고, 그런 다음 RNA 유도 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex, RISC)에 결합된다. 이러한 복합체는 상기 dsRNA 또는 dsD/R-NA의 표적 서열에 매치하는 mRNA와 결합하여 절단한다.
헤어핀 루프 구조를 형성하기 위하여, 임의의 뉴클레오티드 서열로 구성된 루프 서열은 상기 센스 및 안티센스 서열의 사이에 위치될 수 있다. 따라서, 또한 본 발명은 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 갖는 이중 가닥 분자를 제공하고, 상기 [A]는 표적 서열을 포함하는 상기 센스 가닥이고, [B]는 개재 단일 가닥(intervening single strand)이며, [A']은 [A]의 상보적인 서열을 포함하는 상기 안티센스 가닥이다. 상기 표적 서열은 예를 들어, OIP5에 대하여 서열번호 11 및 12의 뉴클레오티드 가운데 선택될 수 있다.
본 발명은 이러한 실시예에 한정되지 않고, [A]에서의 상기 표적 서열은 상기 이중가닥 분자가 상기 표적화된 OIP5 유전자의 발현을 억제하는 능력을 보유하는 한, 이러한 실시예로부터 변형된 서열일 수 있다. 상기 영역 [A]는 [B]로 구성되는 루프를 형성하기 위하여 [A']과 혼성화된다. 상기 개재 단일 가닥된 부분 [B], 즉 상기 루프 서열은 3 내지 23개 길이의 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 루프 서열은, 예를 들면, 하기의 서열 중에서 선택될 수 있다(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html). 더욱이, 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 루프 서열은 활성이 있는 siRNA를 제공한다(Jacque JM et al ., Nature 2002 Jul 25, 418(6896):435-8, Epub 2002 Jun 26):
CCC, CCACC, 또는 CCACACC: Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418(6896): 435-8, Epub 2002 Jun 26;
UUCG: Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20(5): 500-5;
Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100(4): 1639-44, Epub 2003 Feb 10; 및
UUCAAGAGA: Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4(6): 457-67.
헤어핀 루프 구조를 갖는 본 발명의 바람직한 이중 가닥 분자의 예를 하기에 기재하였다. 하기의 구조에 있어서, 상기 루프 서열은 AUG, CCC ,UUCG ,CCACC ,CTCGAG ,AAGCUU, CCACACC 및 UUCAAGAGA로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 본 발명은 이에 한정되지 않는다:
CGGCAUCGCUCACGUUGUG -[B]- CACAACGUGAGCGAUGCCG(표적 서열 서열번호 11);
GUGACAAAAUGGUGUGCUA -[B]- UAGCACACCAUUUUGUCAC(표적 서열 서열번호 12);
또한, 상기 이중 가닥 분자의 억제 활성을 향상시키기 위하여, 다수의 뉴클레오티드는 오버행으로서, 상기 표적 서열의 3' 말단의 센스가닥 및/또는 안티센스 가닥에 첨가될 수 있다. 첨가되는 뉴클레오티드의 수는 최소 2개이며, 일반적으로 2개 내지 10개이며, 바람직하게는 2개 내지 5개이다. 상기 첨가된 뉴클레오티드는 이중가닥 분자의 3' 말단의 센스가닥 및/또는 안티센스가닥에서 단일가닥을 형성한다. 첨가되는 바람직한 뉴클레오티드의 예는 "t" 및 "u"를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이중가닥 문자가 헤어핀 루프 구조를 형성하기 위하여 단일 폴리뉴클레오티드로 구성되는 경우에 있어서, 3' 행오버 서열은 상기 단일 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 첨가될 수 있다.
상기 이중 가닥 분자의 제조 방법은 당업계에서 잘 알려진 화학적 합성 방법을 사용할 수 있다. 상기 화학적 합성 방법에 따르면, 센스 및 안티센스 단일 가닥 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 분자를 수득하기 위하여, 적절한 방법을 통하여 개별적으로 합성되고, 서로 어닐링(annealing)된다. 상기 어닐링에 대한 특정한 예는 상기 합성된 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 적어도 약 3:7, 보다 바람직하게는 약 4:6, 가장 바람직하게는 상당한 등몰량(equimolar amount)의 몰비(molar ratio)(즉, 약 5:5의 몰비)로 혼합되는 것을 포함한다. 그 다음에, 상기 혼합물을 이중 가닥 분자가 분리되어 지는 온도까지 가열하고, 그런 다음 서서히 냉각한다. 상기 어닐링된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 당업계에 알려진 일반적으로 이용되는 방법에 의해 정제될 수 있다. 정제 방법의 예로는 아가로즈겔(agarose) 전기영동을 이용하는 방법 또는 남은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드가 예를 들면, 적절한 효소를 이용한 분해에 의해 제거되는 방법을 포함한다.
OIP5 서열에 인접하는 조절 서열(regulatory sequence)은 동일하거나 또는 다를 수 있고, 그들의 발현은 독립적으로 또는 시간적 또는 공간적 방법으로 조절될 수 있다. 상기 이중 가닥 분자는 OIP5 유전자 주형을 예를 들면, 짧은 핵 RNA(small nuclear RNA, snRNA) U6 또는 인간 H1 RNA 프로모터 유래의 RNA pol Ⅲ 전사 단위를 포함하는 벡터 내로 클로닝(cloning) 함으로써 세포 내에서 전사시킬 수 있다.
본 발명의 이중 가닥 분자를 포함하는 벡터:
또한, 본 발명은 본 명세서에 기재되는 하나 또는 그 이상의 이중 가닥 분자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 세포를 포함한다.
본 발명에서 특히 관심있는 것은 하기 [1] 내지 [10]의 벡터이다:
[1] 센스가닥 및 이에 상보적인 안티센스 가닥으로 구성되어, 이중가닥 분자를 형성하기 위하여 서로 혼성화되고, 세포에 도입되었을 때, OIP5의 생체 내(in vivo) 발현 및 세포 증식을 억제하는 이중가닥 분자를 암호화하는 벡터;
[2] 서열번호 11(서열번호 13의 79 내지 97번째 위치), 서열번호 12(서열번호 13의 557 내지 575번째 위치) 가운데 선택되는 표적서열과 일치하는 mRNA에 기능을 하는 [1]의 이중가닥 분자를 암호화하는 벡터;
[3] 상기 센스 가닥이 서열번호 11 및 12 중 선택되는 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는, [1]의 벡터;
[4] 100개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, [3]의 벡터;
[5] 75개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, [4]의 벡터;
[6] 50개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, [5]의 벡터;
[7] 25개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, [6]의 벡터;
[8] 약 19개 내지 약 25개 사이의 길이를 갖는, [7]의 벡터;
[9] 개재 단일 가닥에 의해서 연결된 센스 및 안티센스 가닥 모두를 갖는 단일 폴리뉴클레오티드를 포함하는, [1]의 벡터;
[10] [A]는 서열번호 11 및 12 가운데서 선택되는 표적 서열에 상응되는 서열을 포함하는 센스가닥이며, [A']는 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥인, 화학 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 갖는, [9]의 벡터;
본 발명의 벡터는 발현가능한 형태로 본 발명의 이중 가닥 분자를 암호화한다. 본 발명에 있어서, 상기 문구 "발현가능한 형태(in an expressible form)"는 세포에 도입될 경우, 상기 벡터가 상기 분자를 발현하는 것을 나타낸다. 하나의 실시예에 있어서, 상기 벡터는 상기 이중 가닥 분자의 발현에 필요한 조절 요소를 포함한다. 본 발명의 이러한 벡터는 본 발명의 이중 가닥 분자의 생산, 또는 암을 치료하기 위한 직접적인 활성 성분으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 벡터는, 예를 들면, OIP5 서열을 발현 벡터 내로 클로닝함으로써 제조될 수 있어서, 두 가닥의 발현을 허용하는 방법으로(DNA 분자의 전사에 의해) 조절 서열이 상기 서열에 기능적으로 연결된다(Lee NS et al ., Nat Biotechnol 2002 May ,20(5):500-5). 예를 들면, mRNA에 대한 안티센스인 RNA 분자는 제 1 프로모터(예를 들면, 상기 클로닝된 DNA의 3' 말단에 인접한 프로모터 서열)에 의해 전사되고, 상기 mRNA에 대한 센스 가닥인 RNA 분자는 제 2 프로모터(예를 들면, 상기 클로닝된 DNA의 5' 말단에 인접한 프로모터 서열)에 의해 전사된다. 상기 센스 및 안티센스 가닥은 상기 유전자를 제거(silencing)하는 이중 가닥 분자 구조물을 생성하기 위해 생체 내에서 혼성화한다. 대안적으로, 상기 이중 가닥 분자의 센스 및 안티센스 가닥을 각각 암호화하는 두 개의 벡터 구조물은 상기 센스 및 안티센스 가닥을 각각 발현한 다음, 이중 가닥 분자 구조물을 형성하기 위해서 이용된다. 또한, 상기 클로닝된 서열은 ２차 구조(예를 들면, 헤어핀)를 갖는 구조물을 암호화할 수 있으며; 즉, 벡터의 단일 전사체는 상기 표적 유전자의 센스 및 상보적인 안티센스 서열 모두를 포함할 수 있다.
본 발명은 센스가닥 핵산 및 안티센스가닥 핵산을 포함하는 폴리뉴클레외트드 각각 또는 모두의 조합을 포함하는 벡터에 관한 것이며, 상기 안티센스가닥은 상기 센스가닥에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 센스가닥 및 안티센스가닥의 전사체는 상기 이중가닥 분자를 형성하기 위하여 혼성화하며, 상기 벡터는 OIP5 유전자를 발현하는 세포에 도입되었을 때, 상기 유전자의 발현을 억제한다.
또한 본 발명의 상기 벡터는 상기 표적 세포의 게놈 내로 안정적으로 삽입시키기 위해서 이용될 수 있다(상동적 재조합 카세트 벡터의 설명에 관해서 예를 들면, Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987,51:503-12 참조). 예를 들면, Wolff et al., Science 1990,247:1465-8, 미국 특허 번호 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; 및 WO98/04720을 참조한다. DNA 염기 전달 기술의 예로는 "네이키드 DNA(naked DNA)", 촉진성 "부피비카인(bupivicaine), 폴리머, 펩티드 매개" 전달, 양이온의 지방질 복합체(cationic lipid complexes), 및 입자 매개 "유전자총(gene gun)" 또는 압력 매개 전달(예를 들면, 미국 특허 번호 5,922,687를 참조)을 포함한다.
본 발명의 상기 벡터는, 예를 들면, 바이러스성 또는 세균성 벡터일 수 있다. 발현 벡터의 예로는 약독 바이러스 숙주(attenuated viral hosts), 예를 들면, 백시니아(vaccinia) 또는 계두(fowlpox)를 포함한다(미국 특허 번호 4,722,848 참조). 이러한 접근법은, 예를 들면, 상기 이중 가닥 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 벡터로서, 백시니아 바이러스(vaccinia virus)의 사용을 포함한다. 상기 표적 유전자를 발현하는 세포 내로의 도입에서, 상기 재조합 백시니아 바이러스(vaccinia virus)는 상기 분자를 발현하고, 그것에 의해서 상기 세포의 증식을 억제한다. 사용가능한 벡터의 또 다른 예로는 칼메떼(Calmette) 겔랑(Guerin) 간균(Bacille Calmette Guerin, BCG)을 포함한다. BCG 벡터는 Stover et al ., Nature 1991,351:456-60에 기재되어 있다. 다른 벡터의 폭넓은 다양성은 예를 들면, 아데노(adeno) 및 아데노-연관 바이러스 벡터(adeno-associaated virus vectors), 레트로바이러스(retroviral) 벡터, 티푸스균 벡터(Salmonella typhi vector), 해독한 탄저독소 벡터(detoxified anthrax toxin vector) 등을 포함하는, 상기 이중 가닥 분자의 치료적 투여 및 생산을 위해서 사용된다. 예를 들면, Shata et al ., Mol Med Today 2000,6:66-71; Shedlock et al ., J Leukoc Biol 2000,68:793-806; 및 Hipp et al ., In vivo 2000,14:571-85를 참조한다.
본 발명의 이중 가닥 분자를 이용한 암 세포의 성장의 억제 또는 감소 및 암의 치료 방법:
NSCLC를 억제하는 siRNA의 능력은 본 발명에 참조로서 통합되는 국제특허 2005/89735에 기술된 바 있다. 본 발명에서, OIP5에 대한 두 개의 다른 dsRNA는 이들의 세포 성장 억제 능력을 테스트하였다. 상기 폐암 및 식도암 세포주에서 상기 유전자의 발현을 효과적으로 억제시키는 OIP5에 대한 두 개의 다른 dsRNA(도 3A)는 세포 성장 억제와 일치되었다.
따라서, 본 발명은 OIP5 유전자의 발현의 억제를 통하여 OIP5 유전자의 기능장애를 유도함으로써, 세포 성장, 즉 폐 및/또는 식도 세포 성장을 억제하는 방법을 제공한다. OIP5 유전자 발현은 OIP5 유전자 또는 본 발명의 어떠한 이중 가닥 분자를 발현할 수 있는 벡터를 특이적으로 표적으로 하는 상기 상술된 이중가닥 분자 중 어느 하나에 의해서 억제될 수 있다.
이러한 암 세포의 세포 성장을 억제할 수 있는 본 발명의 이중가닥 분자의 능력은 이중가닥 분자를 암을 치료하는데 사용할 수 있다는 것을 가리킨다. 따라서 본 발명은 이러한 유전자들이 정상 조직에서 거의 검출되지 않기 때문에, 부작용 없이 OIP5 유전자에 대한 이중가닥 분자 또는 이러한 분자를 발현하는 벡터의 투여에 의한 암 환자를 치료하는 방법을 제공하며(도 1A, B 및 D, 도 6), 상기 암은 폐 및/또는 식도이다.
본 발명의 구체적인 관심은 하기 방법 [1] 내지 [36]의 방법이다:
[1] OIP5의 발현을 억제하는 적어도 하나의 분리된 이중 가닥 분자를 상기 유전자를 과발현하는 세포에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 분자는 서열번호 13으로부터 유래된 연속된 서열에 해당하는 센스 가닥 및 이에 상보적인 안티센스 가닥으로 구성되고, 서로 혼성화되어 이중 가닥 분자를 형성하는 것을 특징으로 하는, OIP5 유전자를 발현하는 암세포 또는 암에서 암세포의 성장을 억제하고, 암을 치료하는 방법;
[2] 상기 이중가닥 분자가 서열번호 11(서열번호 13의 79 내지 97번째 위치), 서열번호 12(서열번호 13의 557 내지 575번째 위치) 가운데 선택되는 표적서열과 일치하는 mRNA에 기능을 하는 [1]의 방법;
[3] 상기 센스가닥이 서열번호 11 및 12 중 선택되는 표적서열에 상응되는 서열을 포함하는, [2]의 방법;
[4] 상기 치료될 암은 폐 및/또는 식도암인. [1]의 방법;
[5] 상기 폐암은 NSCLC 또는 SCLC이며, 식도암은 ESCC인, [4]의 방법;
[6] 상기 이중가닥 분자의 다양한 종류가 투여되는, [1]의 방법;
[7] 상기 이중가닥 분자는 약 100개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, [3]의 방법;
[8] 상기 이중가닥 분자는 약 75개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, [7]의 방법;
[9] 상기 이중가닥 분자는 약 50개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, [8]의 방법;
[10] 상기 이중가닥 분자는 약 25개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, [9]의 방법;
[11] 상기 이중가닥 분자는 약 19개 내지 25개 사이의 뉴클레오티드 길이를 갖는, [10]의 방법;
[12] 상기 이중가닥 분자는 개재 단일 가닥에 의해서 연결된 센스가닥 및 안티센스가닥을 모두 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드를 포함하는, [1]의 방법;
[13] [A]는 서열번호 11 및 12 가운데서 선택되는 표적 서열에 상응되는 서열을 포함하는 센스가닥이며, [B]는 3개 내지 23개 뉴클레오티드를 포함하는 개재 단일 가닥(intervening single strand)이며, [A']는 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥인, 화학 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 갖는, [12]의 방법;
[14] 상기 이중가닥 분자가 RNA인, [1]의 방법;
[15] 상기 이중가닥 분자가 DNA 및 RNA 모두를 포함하는, [1]의 방법;
[16] 상기 이중가닥 분자가 DNA 폴리뉴클레오티드와 RNA 폴리뉴클레오티드의 하이브리드(hybrid)되는, [15]의 방법;
[17] 상기 센스 및 안티센스가닥이 각각 DNA 및 RNA을 포함하는, [16]의 방법;
[18] 상기 이중가닥 분자가 DNA 및 RNA의 키메라인, [15]의 방법;
[19] 상기 안티센스 가닥의 3' 말단에 인접한 부위, 또는 센스가닥의 5' 말단에 인접한 부위 및 안티센스 가닥의 3' 말단의 인접한 부위를 포함하는 RNA인, [18]의 방법;
[20] 상기 인접 부위가 9개 내지 13개 뉴클레오티드를 포함하는, [19]의 방법;
[21] 상기 이중가닥 분자가 3' 오버행(overhang)을 포함하는, [1]의 방법;
[22] 상기 이중가닥 분자가 상기 분자에 첨가적으로 형질감염 촉진제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물에 함유되어 있는, [1]의 방법;
[23] 상기 이중가닥 분자가 벡터에 의해서 암호화되는, [1]의 방법;
[24] 상기 이중가닥 분자가 서열번호 11(서열번호 13의 79 내지 97번째 위치) 및 서열번호 12(서열번호 13의 557 내지 575번째 위치) 가운데서 선택되는 표적 서열과 일치하는 mRNA에 기능하는 벡터에 의해서 암호화되는, [23]의 방법;
[25] 상기 벡터에 의해서 암호화되는 이중가닥 분자의 센스가닥이 서열번호 11 및 12 가운데서 선택되는 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는, [24]의 방법;
[26] 상기 치료될 암이 폐 및/또는 식도암인, [23]의 방법;
[27] 상기 폐암은 NSCLC 또는 SCLC이며, 식도암은 ESCC인, [26]의 방법;
[28] 상기 이중가닥 분자의 다양한 종류가 투여되는, [23]의 방법;
[29] 상기 벡터에 의해서 암호화되는 이중가닥 분자가 약 100개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, [25]의 방법;
[30] 상기 벡터에 의해서 암호화되는 이중가닥 분자가 약 75개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, [29]의 방법;
[31] 상기 벡터에 의해서 암호화되는 이중가닥 분자가 약 50개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, [30]의 방법;
[32] 상기 벡터에 의해서 암호화되는 이중가닥 분자가 약 25개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는, [31]의 방법;
[33] 상기 벡터에 의해서 암호화되는 이중가닥 분자가 약 19개 내지 25개 사이의 뉴클레오티드 길이를 갖는, [32]의 방법;
[34] 상기 벡터에 의해서 암호화되는 이중가닥 분자가 개재 단일 가닥에 의해서 연결된 센스가닥 및 안티센스가닥을 모두 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드를 포함하는, [23]의 방법;
[35] [A]는 서열번호 11 및 12 가운데서 선택되는 표적 서열에 상응되는 서열을 포함하는 센스가닥이며, [B]는 3개 내지 23개 뉴클레오티드를 포함하는 개재 단일 가닥(intervening single strand)이며, [A']는 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥인, 상기 벡터에 의해서 암호화되는 이중가닥 분자가 화학 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 갖는, [34]의 방법;
[36] 상기 이중가닥 분자가 상기 분자에 첨가적으로 형질감염 촉진제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물에 함유되어 있는, [23]의 방법;
본 발명의 방법은 하기에 더욱 상세하게 기재될 것이다.
OIP5 유전자를 발현하는 세포의 성장은 상기 세포와 EBI3, CDKN3, EF-1델타 또는 OIP5 유전자에 대한 이중 가닥 분자, 상기 분자를 발현하는 벡터 또는 이들을 포함하는 조성물을 접촉시킴으로써 억제된다. 상기 세포는 추가적으로 형질감염제와 접촉된다. 적절한 형질감염제는 당업계에 알려져있다. 상기 문구 "세포 성장의 억제"는 상기 세포가 상기 분자에 노출되지 않은 세포에 비해 낮은 비율로 증식하거나 또는 생존도가 감소되는 것을 나타낸다. 세포 성장은 당업계에 알려진 방법, 예를 들면, MTT 세포 증식 분석법을 사용하여 측정된다.
어떠한 종류의 세포 성장은 상기 세포가 본 발명의 상기 이중 가닥 분자의 표적 유전자를 발현 또는 과발현하는 한, 본 발명의 방법에 따라 저해될 수 있다. 예시적인 세포는 폐 및/또는 식도암, 특히 NSCLC, SCLC 및 ESCC를 포함한다.
그러므로, OIP5 유전자에 관련된 질환 또는 질환이 발생할 위험이 있는 환자는 적어도 하나의 본 발명의 이중 가닥 분자, 적어도 하나의 상기 분자를 발현하는 적어도 하나의 벡터, 또는 적어도 하나의 상기 분자를 포함하는 적어도 하나의 조성물을 투여함으로써 치료될 수 있다. 예를 들면, 폐 및/또는 식도암 환자는 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있다. 세포의 종류는 진단될 종양의 특정 형태에 따라 표준 방법에 의해 확인될 수 있다. 폐 및/또는 식도암은 폐 및/또는 식도암 마커로서, 예를 들어 암배(Carcinoembryonic) 항원(CEA), CYFRA, pro-GRP 또는 흉부-X 선 및/또는 가래 세포학을 이용하여 진단될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 상기 방법에 의해 치료된 환자들은 RT-PCR 또는 면역분석에 의해 상기 환자로부터 유래된 생검에서 OIP5 유전자의 발현을 검출함으로써 선택된다. 바람직하게는, 본 발명의 상기 치료 전, 상기 개체로부터 유래된 생검 시료는 당업계에 알려진 방법, 예를 들면, 면역조직화학적 분석 또는 RT-PCR에 의해 OIP5 유전자 과발현을 확인한다.
본 발명의 방법에 따라, 상기 다양한 종류의 이중가닥 분자(또는 이를 발현하는 벡터 또는 이를 포함하는 조성물)의 투여를 통한, 세포 성장의 억제로 인한 암의 치료를 위해서, 각각의 분자는 상이한 구조를 가질 수 있으나, 동일한 OIP5의 표적 서열과 일치하는 mRNA에 기능을 한다. 대안적으로, 다양한 종류의 이중가닥 분자는 동일한 유전자의 다른 표적 서열과 일치하는 mRNA에 기능을 할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 OIP5이 직접적인 이중가닥 분자를 이용할 수 있다.
세포 성장을 억제하기 위하여, 본 발명의 이중 가닥 분자는 상응하는 mRNA 전사체와 상기 분자의 결합을 획득할 수 있는 형태로 상기 세포 내에 직접적으로 도입될 수 있다. 또한, 상기 기재한 바와 같이, 상기 이중 가닥 분자를 암호화하는 DNA는 벡터로서 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 이중 가닥 분자 및 벡터의 세포 내로 도입시키기 위하여, 형질감염 증진제, 예를 들면, FuGENE(Roche 진단학적s), 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000)(Invitrogen), 올리고펙타민( Oligofectamine)(Invitrogen), 및 뉴클레오펙터(Nucleofector)(Wako pure Chemical)가 사용될 수 있다.
만약 치료가 임상적 효과, 예를 들면, 개체에 있어서 OIP5 유전자의 발현 감소, 또는 암의 크기, 널리 퍼짐, 또는 전이 가능성의 감소를 야기한다면 상기 치료는 “효과적인” 것으로 확인된다. 상기 치료가 예방을 위해 사용될 경우, "효과적인"은 암 형성을 지연 또는 억제시키거나 또는 암의 임상적 증상을 억제 또는 완화시키는 것을 의미한다. 효과성은 상기 특정 종양 형태를 진단 또는 치료하기 위해 잘 알려진 방법과 관련하여 결정된다.
본 발명의 방법 및 조성물이 "방지" 및 "예방(prophylaxis)"의 문맥에서 용도를 찾는 범위에서, 이러한 용어들은 본 명세서에서 사망률의 부담 또는 질환의 질병률을 감소시키는 모든 활동을 일컫는데 상호 교환적으로 사용된다. 예방 및 예방(prophylaxis)은 "제 1차, 2차 및 제 3차 예방 수준"에서 발생될 수 있다. 1차 예방 및 예방(prophylaxis)은 질환의 발전을 피하는 반면, 2차 및 3차 수준의 예방 및 예방(prophylaxis)은 기능을 회복시키고, 질병 연관된 복합증을 감소시킴으로써, 질환의 진행 및 증상의 발생뿐만 아니라 이미 생성된 질환의 부정적인 영향을 감소시키는 예방 및 예방(prophylaxis)을 목표로 한다. 대안적으로 예방 및 예방(prophylaxis)은 예를 들어 종양의 증식 및 전이를 감소시키는 것과 같은 특정 질환의 정도를 감소시키는 것을 목표로 하는 다양한 범위의 예방 치료를 포함한다.
암의 치료 및/또는 예방(prophylaxis), 및/또는 이의 수술후 재발의 예방은 하기와 같은 단계 중 어느 하나를 포함한다: 암 세포의 수술적 제거, 암 세포 성장의 억제, 종양의 퇴축(involution) 또는 축소, 암의 차도 유도 및 암의 생성 억제, 종양 퇴행 및 전이의 감소 또는 억제. 암의 효과적인 치료 및/또는 예방(prophylaxis)은 사망률을 감소시키며, 암을 갖고 있는 개체의 예후를 향상시키며, 혈액 내 종양 마커의 수준을 감소시키며, 암에 동반되는 검출되는 증상을 완화시킨다. 예를 들어, 증상의 감소 또는 회복은 효과적인 치료라고 여겨지며, 및/또는 예방(prophylaxis)은 10%, 20%, 30% 또는 그 이상의 감소 또는 안정적인 질환을 말한다.
본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 아화학량론적(substoichiometric) 양으로 OIP5 mRNA를 분해한다고 이해된다. 어떠한 이론에 구애받지 않고, 본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 촉매반응 방식으로 상기 표적 mRNA의 분해를 야기하는 것으로 여겨진다. 따라서, 표준 암 치료법에 비하여, 본 발명은 치료학적 효과를 발휘하기 위해 암 부위에 또는 그 근방에 전달되기 위해서 상당히 적은 이중 가닥 분자가 필요하다.
당업자는 주어진 개체에 투여되기 위한 본 발명의 상기 이중 가닥 분자의 유효량을, 고려사항, 예를 들면, 체중, 나이, 성별, 질환의 종류, 증상 및 상기 개체의 다른 상태; 투여 경로; 및 상기 투여가 국소적인지 또는 전신적인지를 고려하여 손쉽게 결정할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 상기 이중 가닥 분자의 유효량은 상기 암 부위 또는 그 근방에서 약 1 나노몰(nanomolar, nM) 내지 약 100 nM의 세포간 농도이며, 바람직하게는 약 2 nM 내지 50 nM이며, 더욱 바람직하게는 약 2.5 nM 내지 약 10 nM의 세포간 농도이다. 상기 이중 가닥 분자의 더욱 많거나 더욱 적은 양이 투여될 수 있는 것이 고려된다. 특정한 상황에 요구되는 정확한 양은 당업자에 의해서 손쉽고, 통상적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 방법은 최소 하나의 OIP5를 발현하는 암의 성장 또는 전이를 억제하기 위하여 사용될 수 있다; 예를 들어, 폐 및/또는 식도암, 특히 NSCLC, SCLC 또는 ESCC. 구체적으로, OIP5의 표적 서열(즉, 서열번호 11 또는 12)을 포함하는 이중가닥 분자는 특히 폐 및/또는 식도암의 치료에 바람직하다.
또한, 암을 치료하기 위하여, 본 발명의 이중가닥 분자는 상기 이중가닥 분자와 상이한 약학적 제제와의 조합으로 개체에 투여될 수 있다. 대안적으로 본 발명의 이중가닥 분자는 암을 치료하기 위하여 고안된 다른 치료학적 방법과 조합으로 개체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 본 발명의 이중가닥 분자는 최근에 암 치료 또는 암 전이를 방지하는데 사용된 치료학적 방법과의 조합으로 투여될 수 있다(예를 들어, 방사선 치료, 수술 및 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 다우노루비신(daunorubicin) 또는 타목시펜(tamoxifen)).
본 발명의 방법에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 전달 시약과 조합한, 네이키드(naked) 이중 가닥 분자로서, 또는 상기 이중 가닥 분자를 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터로서 상기 개체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 이중 가닥 분자와 조합하는 투여를 위한 적절한 전달 시약은 Mirus Transit TKO 친유성 시약; 리포펙틴(lipofectin); 리포펙타민(lipofectamine); 셀펙틴(cellfectin); 또는 다양이온(polycations)(예를 들면, 폴리라이신(polylysine)), 또는 리포솜(liposomes)을 포함한다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 전달 시약은 리포솜이다.
리포솜은 특정 조직, 예를 들면, 폐 및/또는 식도 종양 조직과 같은 특정 조직에 상기 이중 가닥 분자의 전달을 보조할 수 있고, 또한 상기 이중 가닥 분자의 혈액 반감기를 증가시킬 수 있다. 본 발명의 문백에서의 사용에 적합한 리포솜은 표준 운반체 형성 지질로부터 형성되고, 이는 일반적으로 중성적 또는 음성 전하의 인지질 및 스테롤, 예를 들면, 콜레스테롤을 포함한다. 지질의 선택은 일반적으로 고려 인자, 예를 들면, 원하는 리포솜 크기 및 혈액 흐름에서 리포솜의 반감기에 의해 좌우된다. 리포솜 제조에 대한 다양한 방법이 알려져 있고, 예를 들면, Szoka et al ., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467; 및 미국 특허 번호 4,235,871; 4,501,728; 4,837,028; 및 5,019,369에 기재된 바와 같이, 그 전체 내용은 본 명세서에 참조로서 통합된다.
바람직하게는, 본 발명의 이중 가닥 분자가 캡슐화된 상기 리포솜은 상기 암 부위로 상기 리포솜을 전달할 수 있는 리간드 분자를 포함한다. 종양 또는 혈관내피세포에 널리 분포하는 수용체, 예를 들어, 종양 항원 또는 내피세포 표면 항원에 결합하는 단일클론 항체들에 결합하는 리간드인 것이 바람직하다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 이중 가닥 분자가 캡슐화된 상기 리보솜은 예를 들면, 구조의 표면에 결합하는 옵소닌화 억제 부분(opsonization-inhibition moieties)을 갖음으로써, 단핵 마크로파지(mononuclear macrophage) 및 세망내피계(reticuloendothelial system)에 의한 소실(clearance)를 피하기 위하여 변형된다. 하나의 실시예에 있어서, 본 발명의 리포솜은 옵소닌화 억제 모이어티 및 리간드 모두를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 리보솜의 제조에 사용하기 위한 옵소닌화 억제 부분은 상기 리보솜 막에 결합하는 전형적인 거대 소수성 폴리머이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 옵소닌화 억제 부분은 예를 들면, 지질 가용성 앵커의 막 사이로의 삽입, 또는 막 지질의 활성기에 직접적으로 결합하는 것과 같이, 막에 화학적 또는 물리적으로 부착될 경우, 리보솜 막에 "결합"된다. 이러한 옵소닌화 억제 소수성 폴리머는 예를 들면, 그 전체 내용이 참조로서 통합된, 미국 특허 번호 4,920,016에 기재되어 있는 바와 같이, 마크로파지 단핵 백혈구계(macrophage-monocyte system, "MMS") 및 세망내피계(retculoendothelial system, "RES")에 의한 상기 리보솜의 흡수를 유의적으로 감소시키는 보호 표층(protective surface layer)을 형성한다. 따라서 옵소닌화 억제 부분으로 변형된 리보솜은 비변형된 리보솜보다 더욱 오랫동안 혈액 순환시 존재한다. 이러한 이유 때문에, 이러한 리보솜은 "스텔스(stealth)" 리보솜이라고 불린다.
스텔스 리보솜은 다공성(porous) 또는 "누출성(leaky)" 미소혈관계(microvasculature)에 의해 공급되는 조직에서 축적되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이러한 미소혈관계의 손상에 의해 특징 되는 표적조직, 예를 들면, 고형 종양은, 이러한 리보솜을 효율적으로 축적할 것이다; Gabizon et al ., Proc Natl Acad Sci USA 1988,18:6949-53을 참조한다. 또한, 상기 RES에 의해 감소된 흡수는 간장 및 비장에서 현저한 축적을 방지함으로써 스텔스 리보솜의 독성을 저하시킨다. 따라서, 옵소닌화 억제 부분으로 변형된 본 발명의 리보솜은 본 발명의 이중 가닥 분자를 종양 세포로 전달할 수 있다.
리보솜의 변형에 적절한 옵소닌화 억제 부분은 약 500 내지 약 40,000 달톤이며, 바람직하게는 약 2,000 내지 약 20,000 달톤의 분자량을 갖는 수용성 폴리머이다. 이러한 폴리머는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG) 또는 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol, PPG) 유도체; 예를 들면, 메톡시(methoxy) PEG 또는 PPG, 및 PEG 또는 PPG 스테아레이트(stearate); 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 또는 폴리 N-비닐피롤리돈(vinyl pyrrolidone)과 같은, 합성 폴리머; 선형(linear), 가지형(branched) 또는 덴드리머형(dendrimeric) 폴리아미도아민(polyamidoamines); 폴리아크릴산(polyacrylic acid); 카복실기 또는 아미노기가 화학적으로 연결된 폴리비닐알콜 및 폴리자일리톨(polyxylitol) 뿐만 아니라, 강글리오시드(ganglioside) GM.서브.1과 같은 강글리오시드(ganglioside)와 같은 폴리 알코올(poly alcohol)을 포함한다. 또한, PEG, 메톡시(methoxy) PEG, 또는 메톡시 PPG, 또는 이의 유도체의 공중합체도 적합하다. 더욱이, 상기 옵소닌화 억제 폴리머는 PEG와, 폴리아미노산, 다당류, 폴리아미도아민, 폴리에틸렌아민 또는, 폴리뉴클레오티드 중 하나와 블록 코폴리머(copolymer)이 될 수 있다. 또한, 상기 옵소닌화 억제 폴리머는 아미노산 또는 예를 들면, 갈락투론산(galacturonic acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 마누론산(mannuronic acid), 히알루론산(hyaluronic acid), 펙틴산, 뉴라민산(neuraminic acid), 알긴산(alginic acid), 카라기난(carrageenan); 아미노화 다당류 또는 올리고당(선형 또는 가지형); 또는 카복실화 다당류 또는, 카복실 기의 잔여 연결을 갖는 카보닉 산(carbonic acid)의 유도체와 반응된, 올리고당과 같은 카복실산을 포함하는 천연의 다당류일 수 있다.
바람직하게는, 상기 옵소닌화 억제 부분은 PEG, PPG 또는 그들의 유도체이다. PEG 또는 PEG 유도체로 변형된 리보솜은 때때로 "PEG화 리보솜"이라고도 불린다.
상기 옵소닌화 억제 부분은 다수의 잘 알려진 기술 중 어느 하나를 이용하여 리보솜 막에 결합될 수 있다. 예를 들면, PEG의 N-하이드록시숙신이미드(hydroxysuccinimide)의 에스테르(ester)는, 포스파티딜-에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine) 지질 가용성 앵커에 결합될 수 있고, 그런 다음 막에 결합한다. 이와 유사하게, 덱스트란 폴리머(dextran polymer)는 Na(CN)BH3을 이용한 환원적 아미노화 및 60℃에서 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran)과 같은 용매와 물의 30:12의 비율의 용매 혼합물을 통하여 스테아릴아민(stearylamine) 지질 가용성 앵커와 유도체화될 수 있다
본 발명의 이중 가닥 분자를 발현하는 벡터는 상기에 기재하였다. 적어도 하나의 본 발명의 이중 가닥 분자를 발현하는 이러한 벡터는 직접적으로 또는 Mirus Transit LT1 지질 가용성 시약, LipoTrustTMSR, 리포펙틴(lipofectin), 리포펙타민(lipofectamine), 셀펙틴(cellfectin), 다양이온(polycation)(예를 들면, 폴리라이신(lysine)) 또는 리보솜(liposome) 또는 콜라겐, 아텔로콜라겐(atelocollagen)을 포함하는, 적절한 전달 시약과 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 이중 가닥 분자를 발현하는, 재조합 바이러스 벡터를 환자의 암 부분에 전달하는 방법은 당업계의 기술 범위 내에 있다.
본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 이중 가닥 분자를 암 부분에 전달하는데 적절한 임의의 방법에 의해 개체에 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 이중 가닥 분자는 유전자총(gene gun), 전기천공(electroporation), 또는 다른 적절한 비경구적 또는 장내 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.
적절한 장내 투여 경로는 구강, 직장, 또는 비강내 전달을 포함한다.
적절한 비경구 투여 경로는 방광내 또는 정맥내 투여(예를 들면, 정맥내 볼루스 주사(intravenous bolus injection), 정맥주입(intravenous infusion), 동맥내 볼루스 주사(intra-arterial bolus injection), 동맥주입(intra-arterial infusion) 및 맥관구조(vasculature)로 도뇨관 점적(catheter instillation)); 조직 주위 및 조직내 주입(예를 들면, 종양주위 및 종양내 주사, 망막내 주사 또는 망막하주사); 피하 주사 또는 피하주입을 포함하는 침전(deposition)(예를 들면, 삼투압 펌프에 의해); 암 부위 또는 부위 주위에의 직접적인 처치, 예를 들면 도뇨관(catheter) 또는 다른 설치 수단(예를 들면, 좌약(suppository) 또는 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 물질을 포함하는 임플란트(implant)), 및 흡입을 포함한다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 이중 가닥 분자 또는 벡터의 주사 또는 주입은 암의 부위 또는 그 주변에 투여된다.
본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 단일 용량 또는 복수 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 이중 가닥 분자의 투여가 주입될 경우, 상기 주입은 단일 유지된 용량(single sustained dose)일 수 있거나 또는 다중 주입(multiple infusion)에 의해 투여될 수 있다. 상기 약제의 주입은 암 조직에 직접적이거나 또는 암의 부위의 근방일 수 있다. 암 조직 또는 암 부위의 근방에 상기 약제의 다중 주사가 특히 바람직하다.
또한 당업자는 본 발명의 상기 이중 가닥 분자를 투여 개체에 투여하기 위해 적절한 투여 계획을 손쉽게 결정할 수 있다. 예를 들면, 상기 이중 가닥 분자는 상기 개체에 1회 투여될 수 있고, 예를 들면, 암 부위에 또는 그 근방에 단회 주사 또는 침전(deposition)으로서 투여될 수 있다. 대안적으로, 상기 이중 가닥 분자는 약 3 내지 약 28일의 기간 동안, 더욱 바람직하게는 약 7 내지 약 10일의 기간 동안 매일 1회 또는 2회씩 개체에 투여될 수 있다. 하나의 바람직한 투여 계획에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 7일간 하루 1회 암의 부위에 또는 그 근방에 주사된다. 투여 계획이 복수 투여를 포함할 경우, 상기 개체에 투여되는 이중 가닥 분자의 유효량은 전체 투여 계획 동안 투여된 이중 가닥 분자의 전량을 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명의 이중 가닥 분자를 포함하는 조성물:
상기에 추가적으로, 본 발명은 본 발명의 이중 가닥 분자 또는 상기 분자를 암호화하는 벡터를 적어도 하나 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 가장 관심있는 바는 하기 [1] 내지 [36]의 조성물이다:
구체적으로, 본 발명은 하기의 조성물 [1] 내지 [25]를 제공한다:
[1] OIP5의 발현 및 세포 증식을 억제하는 적어도 하나의 분리된 이중 가닥 분자를 포함하고, 센스 가닥 및 이에 상보적인 안티센스 가닥으로 구성되고, 이중가닥 분자를 형성하기 위하여 서로 혼성화되는, 적어도 하나의 OIP5 유전자를 발현하는 암세포 성장 억제 및 암 치료용 조성물;
[2] 상기 이중가닥 분자가 서열번호 11(서열번호 13의 79 내지 97번째 위치) 및 서열번호 12(서열번호 13의 557 내지 575번째 위치) 가운데 선택되는 표적 서열과 일치하는 mRNA에 기능하는, [1]의 조성물;
[3] 상기 이중가닥 분자의 센스가닥이 서열번호 11 및 12 중 선택되는 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는, [2]의 조성물;
[4] 상기 치료될 암이 폐 및/또는 식도암인, [1]의 조성물;
[5] 상기 폐암이 NSCLC 또는 SCLC이며, 식도암이 ESCC인, [4]의 조성물;
[6] 상기 조성물이 다양한 종류의 이중가닥 분자를 포함하는, [1]의 조성물;
[7] 상기 이중가닥 분자가 100개 이하 길이의 뉴클레오티드를 갖는, [3]의 조성물;
[8] 상기 이중가닥 분자가 75개 이하 길이의 뉴클레오티드를 갖는, [7]의 조성물;
[9] 상기 이중가닥 분자가 50개 이하 길이의 뉴클레오티드를 갖는, [8]의 조성물;
[10] 상기 이중가닥 분자가 25개 이하 길이의 뉴클레오티드를 갖는, [9]의 조성물;
[11] 상기 이중가닥 분자가 약 19개 내지 약 25개 사이 길이의 뉴클레오티드를 갖는, [10]의 조성물;
[12] 상기 이중가닥는 개재 단일 가닥에 의해서 연결된 센스가닥 및 안티센스가닥을 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드를 포함하는, [1]의 조성물;
[13] [A]는 서열번호 11 및 12 가운데서 선택되는 표적 서열에 상응되는 서열을 포함하는 센스가닥이며, [B]는 3개 내지 23개 뉴클레오티드를 포함하는 개재 단일 가닥(intervening single strand)이며, [A']는 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥인, 화학 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 갖는, [12]의 조성물;
[14] 상기 이중가닥 분자가 RNA인, [1]의 조성물;
[15] 상기 이중가닥 분자가 DNA 및/또는 RNA인, [1]의 조성물;
[16] 상기 이중가닥 분자가 DNA 폴리뉴클레오티드와 RNA 폴리뉴클레오티드의 하이브리드;
[17] 상기 센스 및 안티센스가닥 폴리뉴클레오티드는 각각 DNA 및 RNA를 포함하는, [16]의 조성물;
[18] 상기 이중가닥 분자는 DNA 및 RNA의 키메라인, [15]의 조성물;
[19] 상기 안티센스 가닥의 3' 말단에 인접한 부위, 또는 센스가닥의 5' 말단에 인접한 부위 및 안티센스 가닥의 3' 말단의 인접한 부위 모두가 RNA인, [18]의 조성물;
[20] 상기 인접 부위가 9개 내지 13개 뉴클레오티드를 포함하는, [19]의 조성물;
[21] 상기 이중가닥 분자가 3' 오버행(overhang)을 포함하는, [1]의 조성물;
[22] 상기 조성물이 형질감염 촉진제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, [1]의 조성물;
[23] 상기 이중가닥 분자가 벡터에 의해서 암호화되며, 상기 조성물에 포함되어 있는, [1]의 조성물;
[24] 상기 벡터에 의해서 암호화된 이중가닥 분자는 서열번호 11(서열번호 13의 79 내지 97번째 위치), 및 서열번호 12(서열번호 13의 557 내지 575번째 위치) 가운데 선택되는 표적 서열과 일치하는 mRNA에 기능하는, [23]의 조성물;
[25] 상기 벡터에 의해서 암호화되는 이중가닥 분자의 센스가닥은 서열번호 11 및 12 중 선택되는 표적서열에 상응되는 서열을 포함하눈, [24]의 조성물;
[26] 상기 치료될 암은 폐 및/또는 식도암인, [23]의 조성물;
[27] 상기 폐암은 NSCLC 또는 SCLC이며, 식도암은 ESCC인, [26]의 조성물;
[28] 상기 이중가닥 분자의 다양한 종류가 투여되는, [23]의 조성물;
[29] 상기 벡터에 의해서 암호화되는 이중가닥 분자는 약 100개 뉴클레오티드 길이 이하를 갖는, [25] 조성물;
[30] 상기 벡터에 의해서 암호화되는 이중가닥 분자는 약 75개 뉴클레오티드 길이 이하를 갖는, [29] 조성물;
[31] 상기 벡터에 의해서 암호화되는 이중가닥 분자는 약 50개 뉴클레오티드 길이 이하를 갖는, [30] 조성물;
[32] 상기 벡터에 의해서 암호화되는 이중가닥 분자는 약 25개 뉴클레오티드 길이 이하를 갖는, [31] 조성물;
[33] 상기 벡터에 의해서 암호화되는 이중가닥 분자는 약 19개 내지 약 25개 사이의 뉴클레오티드 길이를 갖는, [32] 조성물;
[34] 상기 벡터에 의해서 암호화되는 이중가닥 분자는 개재 단일 가닥에 의해서 연결된 센스가닥 및 안티센스가닥을 모두 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드를 포함하는. [23]의 조성물;
[35] [A]는 서열번호 11 및 12 가운데서 선택되는 표적 서열에 상응되는 서열을 포함하는 센스가닥이며, [B]는 3개 내지 23개 뉴클레오티드를 포함하는 개재 단일 가닥(intervening single strand)이며, [A']는 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥인, 화학 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 갖는, [23]의 조성물; 및
[36] 상기 조성물은 형질감염 촉진제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, [23]의 조성물.
본 발명의 바람직한 조성물은 하기에서 추가로 설명하였다.
본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 당업계에 알려진 기술에 따라, 개체에게 투여되기 전에 약학적 조성물로서 제조될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 적어도 무균 및 발열원이 없는(pyrogen-free) 것으로서의 특성을 지닌다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "약학적 제형"은 인간 및 동물에 사용할 수 있는 시약을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물의 제조 방법은, 예를 들면, 그 전체가 참조로서 본 명세서에 통합되는, Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)에 기재되어 있는 바와 같이, 당업계의 기술의 범위 내이다.
본 약학적 시약은 본 발명의 이중 가닥 분자 또는 그것을 암호화하는 벡터를 적어도 하나 포함하거나(예를 들면, 0.1 내지 90% 중량), 또는 상기 생리학적으로 허용가능한 담체 배양 배지와 혼합된 상기 분자의 생리적으로 허용가능한 염을 포함한다. 바람직한 생리학적으로 허용가능한 담체 배양 배지는, 예를 들면, 물, 완충수, 통상의 생리식염수, 0.4% 생리식염수, 0.3% 글라이신(glycine), 히알루론산(hyaluronic acid) 등을 포함한다.
본 발명에 의하면, 상기 조성물은 다양한 종류의 이중 가닥 분자를 포함할 수 있고, 각각의 상기 분자는 OIP5의 같은 표적 서열, 또는 상이한 표적 서열에 관한 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 OIP5에 대한 이중가닥 분자를 포함할 수 있다. 대안적으로, 예를 들면, 상기 조성물은 하나, 두 개 또는 그 이상의 OIP5 표적 서열에 대한 이중 가닥 분자를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 하나 또는 다수의 이중 가닥 분자를 암호화하는 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 본 이중 가닥 분자의 하나, 둘 또는 다수의 본 발명의 이중가닥 분자를 암호화할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 다양한 종류의, 다른 이중가닥 분자를 각각 암호화하는 벡터를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 이중 가닥 분자는 본 발명의 조성물에 있어서 리보솜(liposome)으로서 포함될 수 있다. "이중가닥 분자를 이용한 암치료의 방법"의 리보솜의 세부사항 항목을 참조한다.
또한 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 약학적 부형제(excipient) 및/또는 첨가제를 포함할 수 있다. 적절한 약학적 부형제는, 안정화제, 항산화제, 침투압조절제, 버퍼, 및 pH 조절제를 포함한다. 적절한 첨가제는 생리학적으로 적합한 완충액(예를 들면, 트로메타민 하이드로클로라이드(tromethamine hydrochloride)), 킬란트(chelants)(예를 들면, DTPA 또는 DTPA-비스아마이드(bisamide) 등) 또는 칼슘킬레이트(calcium chelate) 복합체(예를 들면, 칼슘 DTPA, CaNaDTPA- 비스아마이드(bisamide))의 첨가, 또는, 선택적으로, 칼슘 또는 나트륨염(예를 들면, 염화 칼슘, 칼슘 아스코르베이트(ascorbate), 칼슘 글루코네이트(gluconate) 또는 칼슘유산(lactate))의 첨가를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 액체 형태로서의 사용을 위해 포장될 수 있고, 또는 동결 건조될 수 있다.
고형 조성물에는, 종래의 무독한 고체 담체가 사용될 수 있다; 예를 들면, 만니톨, 유산(lactose), 전분, 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 소디움 사카린(sodium saccharin), 갈석(talcum), 셀룰로스(cellulose), 글루코오스(glucose), 자당(sucrose), 마그네슘 카보네이트(magnesium carbonate) 등의 약학적 등급.
예를 들면, 경구투여를 위한 고형 약학적 조성물은 상기에 기재한 임의의 담체 및 부형제를 포함할 수 있으며, 10-95%, 바람직하게는 25-75%의 본 발명의 하나 또는 그 이상의 이중 가닥 분자를 포함할 수 있다. 에어로졸(흡입) 투여를 위한 약학적 조성물은 상기 기재한 바와 같은 리보솜에 캡슐화된 하나 또는 그 이상의 본 발명의 이중 가닥 분자 0.01-20 중량, 바람직하게는 1-10 중량, 및 분무제(propellant)를 포함할 수 있다. 담체는 원하는 바에 따라 포함될 수 있다; 예를 들면, 비강내 전달(intranasal delivery)을 위한 레시틴.
상기와 더불어, 본 발명의 조성물은 본 발명의 이중 가닥 분자의 생체 내에서의 기능을 억제하지 않는 한, 다른 약학적 활성 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 암치료를 위해서 전통적으로 사용된 화학요법제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 OIP5 유전자를 발현에 의해서 특징 지어지는 폐 및/또는 식도암의 치료용 약학적 조성물의 제조에 있어서, 본 발명의 이중 가닥 핵산 분자의 용도를 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 OIP5 유전자를 발현하는 폐 및/또는 식도암 치료용 약학적 조성물의 제조에 있어서, 센스가닥 및 이에 상보적인 안티센스가닥이 이중가닥 핵산 분자를 형성하기 위하여 혼성화되고, 서열번호 11 및 12 가운데 선택되는 서열을 표적화하고, 세포 내 OIP5 발현을 억제하는 이중가닥 핵산 분자의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가적으로 약학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체와, 센스가닥 및 이에 상보적인 안티센스가닥이 이중가닥 핵산 분자를 형성하기 위하여 혼성화되고, 활성 성분으로서 서열번호 11 및 12 가운데 선택되는 서열을 표적화하고, OIP5를 과발현하는 세포 내 OIP5 발현을 억제하는 이중 가닥 핵산 분자를 제형화하는 단계를 포함하는, OIP5 유전자를 발현에 의해서 특징 지어지는 폐 및/또는 식도암의 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 방법 및 과정을 제공한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 활성 성분으로서 센스가닥 및 이에 상보적인 안티센스가닥이 이중가닥 핵산 분자를 형성하기 위하여 혼성화되고, 서열번호 11 및 12 가운데 선택되는 서열을 표적화하고, OIP5를 과발현하는 세포 내 OIP5 발현을 억제하는 이중 가닥 핵산 분자와 약학적 또는 생리학 적으로 허용 가능한 담체를 혼합하는 단계를 포함하는, OIP5 유전자를 발현에 의해서 특징 지어지는 폐 및/또는 식도암의 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 방법 및 과정을 제공한다.
폐 및/또는 식도암을 진단하는 방법:
OIP5의 발현은 특히 폐 및/또는 식도암 세포에서 증가하는 것을 발견하였다(도 1A 및 B). 그러므로 본 발명에서 확인된 상기 유전자뿐만 아니라 이들의 전사 및 번역(translation) 산물이 폐 및/또는 식도암에 대한 마커로서 진단 유용성이 있으며, 세포 시료에서 OIP5의 발현을 측정함으로써 폐 및/또는 식도암을 진단할 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 개체의 OIP5의 발현 수준을 확인함으로써 폐 및/또는 식도암의 검출, 진단 및/또는 폐 및/또는 식도암의 존재 또는 발달 성형을 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법을 통해 진단될 수 있는 폐 및/또는 식도암은 NSCLC, SCLC 및 NSCLC를 포함한다. 또한, 폐 및/또는 식도 선암 및 식도편평세포암종(SCC)를 포함하는 NSCLC도 본 발명에 의해 진단 또는 검출될 수 있다.
본 발명에 따라, 개체의 상태를 검사하기 위한 중간 결과가 제공될 수 있다. 이러한 중간 결과는 의사, 간호사, 또는 다른 종사자가 개체가 상기 질환에 걸린 것을 진단할 수 있도록 보조하기 위한 추가적인 정보와 조합될 수 있다. 즉, 본 발명은 암을 검출하기 위한 진단 마커 OIP5를 제공한다.
대안적으로, 본 발명은 정상 대조군 수준에 비하여 발현수준이 증가한 것을 상기 조직 내 암세포의 존재 또는 의심을 가리키는, 개체 유래 생물학적 시료의 OIP5 유전자의 발현수준을 결정하는 단계를 포함하는, 개체 유래 폐 또는 식도 조직 시료에서 암 세포를 검출 또는 동정하는 방법을 제공한다.
이러한 중간 결과는 의사, 간호사, 또는 다른 종사자가 개체가 상기 질환에 걸린 것을 진단할 수 있도록 보조하기 위한 추가적인 정보와 조합될 수 있다. 즉, 본 발명은 상기 질환으로 고통받는 개체를 진단하는 데 유용한 정보를 의사에게 제공한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 개체로부터 획득한 상기 조직 내에 암 세포의 존제에 대하여 의심이 들면, 임상학적 결정은 상기 OIP5 유전자의 발현 수준에 조직 병리학, 혈액 내 종양 마커(들)의 수준, 및 상기 개체의 임상 단계 등을 포함하는 상기 질환의 다를 측면을 고려하여 내릴 수 있다. 예를 들어, 혈액 내 몇몇의 알려진 진단학적 폐 종양 마커로는 IAP, ACT, BFP, CA19-9, CA50, CA72-4, CA130, CEA, KMO-1, NSE, SCC, SP1, Span-1, TPA, CSLEX, SLX, STN 및 CYFRA이 있다. 대안적으로 CEA, DUPAN-2, IAP, NSE, SCC, SLX 및 Span-1과 같은 혈액 내 진단학적 식도 종양 마커들 또한 잘 알려져 있다. 즉, 본 발명의 특정한 실시예에서 상기 유전자 발현 분석의 결과는 개체의 질환 상태를 추가적으로 진단하는 중간 결과로서 기능을 한다.
본 발명의 특정한 관심은 하기 [1] 내지 [10]의 방법이다;
[1] 하기의 단계를 포함하는, 폐 및/또는 식도암 진단 방법:
(a) 개체 유래 생물학적 시료에서 OIP5 아미노산 서열을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 확인하는 단계; 및
(b) 상기 유전자의 정상 대조군 수준에 비하여, 질환이 존재할 때의 발현 수준이 증가하는 것을 연관짓기.
[2] 상기 발현수준은 상기 정상 대조군 수준에 비하여 적어도 10% 이상 높은, [1]의 방법.
[3] 상기 발현 수준은 하기 가운데서 선택되는 방법에 의해서 검출되는, [1]의 방법:
(a) OIP5 서열을 포함하는 mRNA를 검출하기,
(b) OIP5 서열을 포함하는 단백질을 검출하기, 및
(c) OIP5 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 생물학적 활성을 검출하기.
[4] 상기 폐암은 NSCLC 또는 SCL이며, 상기 식도암은 ESCC인, [1]의 방법.
[5] 상기 발현 수준은 상기 유전자의 유전자 전사체에 대한 프로브(probe)의 혼성화를 검출하는 것에 의해서 확인되는, [3]의 방법.
[6] 상기 발현 수준은 상기 유전자의 발현 수준으로서, 유전자에 의해서 암호화되는 단백질에 대한 항체의 결합의 검출에 의해서 확인되는, [3]의 방법.
[7] 상기 생물학적 시료는 생검, 가래(sputum) 또는 혈액을 포함하는, [1]의 방법.
[8] 상기 개체 유래 생물학적 시료는 상피 세포를 포함하는, [1]의 방법.
[9] 상기 개체 유래 생물학적 시료는 암 세포를 포함하는, [1]의 방법.
[10] 상기 개체 유래 생물학적 시료는 암 상피 세포를 포함하는, [1]의 방법.
폐 및/또는 식도암을 검출하는 방법은 하기에 더욱 상세하게 기재될 것이다.
본 방법에 의해 진단되는 개체는 포유동물이 바람직하다. 예시되는 포유동물로는 예를 들면, 인간, 인간이 아닌 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말, 및 소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
생물학적 시료는 진단을 실시하기 위해 진단되는 상기 개체로부터 수집되는 것이 바람직하다. 임의의 생물학적 물질은 그것이 OIP5의 목표 전사체 또는 번역 산물을 포함하는 한, 측정을 위한 상기 생물학적 시료로서 사용될 수 있다. 상기 생물학적 시료는, 암의 진단 또는 추측에 바람직한 신체의 조직, 및 생검, 혈액, 가래, 흉수 및 소변과 같은 체액을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, 상기 생물학적 시료는 상피세포를 포함하는 세포 군을 포함하며, 더욱 바람직하게는 암 상피세포 또는 암성으로 추정되는 상피세포이다. 추가로, 만약 필요하면, 상기 세포는 신체 조직 및 체액으로부터 획득되어 정제된 후, 생물학적 시료로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따라, 상기 개체 유래의 생물학적 시료에서 OIP5의 발현 수준이 측정된다. 상기 발현 수준은 당업계에 알려진 방법을 사용하여, 전사(핵산) 산물 수준에서 측정될 수 있다. 예를 들면, OIP5의 mRNA는 혼성화 방법(예를 들면, 노던 블랏 분석(Northern hybridization))에 의한 프로브(probe)를 사용하여 정량될 수 있다. 상기 측정은 칩 또는 어레이 상에서 수행될 수 있다. 어레이의 사용은 OIP5를 포함한 다수의 유전자들(예를 들면, 다양한 암 특이적 유전자)의 발현 수준을 측정하는 것이 바람직하다. 당업자들은 OIP5(서열번호 13; GenBank 등록번호: NM_007280)의 서열 정보를 사용한 이러한 프로브를 제조할 수 있다. 예를 들면, 프로브로서 OIP5의 cDNA가 사용될 수 있다. 만약 필요하다면, 상기 프로브는 적절한 표지, 예를 들면, 염료, 형광물질 및 동위원소로 표지될 수 있고, 상기 유전자의 발현 수준은 상기 혼성화된 표지의 세기로서 검출될 수 있다.
또한, OIP5의 전사 산물은 증폭 기반의 검출 방법(예를 들면, RT-PCR)에 의한 프라이머를 사용하여 정량될 수 있다. 또한, 이러한 프라이머는 상기 유전자의 이용가능한 서열 정보를 바탕으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 실시예에서 사용된 프라이머 쌍(서열번호: 1 및 2, 또는 5 및 6)은 RT-PCR 또는 노던 블랏에 의한 검출에 사용될 수 있으나, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 본 방법에 사용된 프로브 또는 프라이머는 엄격한, 중간 정도의 엄격한, 또는 낮은 엄격한 조건하에서 OIP5의 mRNA와 혼성화된다. 본 발명에서 사용한, 상기 문구 "엄격한(혼성화) 조건"은 프로브 또는 프라이머가 이의 표적 서열에 혼성화될 수 있으나, 다른 서열에는 혼성화되지 않는 조건을 나타낸다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며, 다른 상황 아래에서는 상이할 것이다. 더욱 긴 서열의 특정 혼성화는 더욱 짧은 서열보다 더 높은 온도에서 관찰되었다. 일반적으로, 상기 엄격한 조건의 온도는 정해진 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열 용융점(thermal melting point, Tm)보다 약 5℃ 더 낮은 것이 선택된다. 상기 Tm은 평형 상태에서 상기 표적서열에 대하여 상보적인 프로브의 50%가 상기 표적서열에 혼성화되는 온도(정해진 이온 강도, pH 및 핵산 농도하에서)이다. 상기 표적 서열은 일반적으로 과잉으로 존재하기 때문에, Tm에서 상기 프로브의 50%가 평형상태에서 있게된다. 전형적으로 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 약 1.0 M 이하의 나트륨 이온이고, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M의 나트륨 이온(또는 다른 염)이며, 상기 온도는 더 짧은 프로브 또는 프라이머(예를 들면, 10 내지 50개의 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 30℃이고 더 긴 프로브 또는 프라이머에 대해 적어도 약 60℃이다. 또한 엄격한 조건은 포름아미드(formamide)와 같은 불안정화제의 첨가로 획득될 수 있다.
대안적으로, 번역 산물은 본 발명의 진단을 위해 검출될 수 있다. 예를 들면, OIP5 단백질의 양이 측정될 수 있다. 번역 산물로서 상기 단백질의 양의 측정 방법은 상기 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하는 면역분석 방법을 포함한다. 상기 항체는 단일 클론성 또는 다중 클론성일 수 있다. 또한, 상기 항체의 임의의 단편 또는 변형(예를 들면, 키메릭 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, 등)은, 상기 단편이 OIP5 단백질에 대한 결합 능력을 보유하는 한, 검출에 사용될 수 있다. 단백질들의 검출을 위한 이러한 종류의 항체의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 이러한 항체 및 이의 등가물을 제조하기 위해 임의의 방법이 본 발명에서 사용될 수 있다.
OIP5 번역 산물을 기반으로 하는 상기 유전자의 발현수준을 검출하는 또 다른 방법으로서, 염색의 세기를 OIP5 단백질에 대한 항체를 이용한 면역조직화학 분석을 통해서 관찰할 수 있다. 즉, 강한 염색의 관찰은 상기 단백질의 증가된 존재를 가리키며, 동시에 OIP5 유전자의 높은 발현수준을 나타낸다.
더욱이, OIP5 유전자의 발현 수준과 더불어, 다른 암 관련된 유전자의 발현 수준, 예를 들어 폐 및/또는 식도암에서 상이하게 발현된다고 알려진 유전자는 또한 상기 진단의 정확성을 향상시키는데 확인될 수 있다.
생물학적 시료에서 OIP5 유전자를 포함하는 암 마커 유전자의 발현수준은 상응되는 암 마커 유전자의 대조군 수준으로부터 예를 들어, 10%, 25%, 또는 50% 증가하거나 또는 1.1배 이상, 1.5배 이상, 2.0배 이상, 5.0배 이상, 10.0배 이상 또는 그 이상 증가되었을 때, 증가하였다고 볼 수 있다.
상기 대조군 수준은 질환 상태(암 또는 암이 아닌)가 알려진 개체/개체들로부터 미리 수집 및 비축된 시료의 이용에 의한 테스트 생물학적 시료와 동시에 측정된다. 대안적으로, 상기 대조군 수준은 질환 상태가 알려진 개체로부터 유래한 시료에서 미리 측정된 OIP5 유전자의 발현 수준의 분석에 의해 수득된 결과를 바탕으로 한 통계적 방법에 의해 측정될 수 있다. 또한, 상기 대조군 수준은 미리 검사된 세포들에서의 발현 패턴의 데이터베이스일 수 있다. 또한, 본 발명의 하나의 측면에 따라, 생물학적 시료에서 OIP5 유전자의 상기 발현 수준은 다중 대조군 수준과 비교될 수 있고, 상기 대조군 수준은 다중 참고 시료들로부터 측정될 수 있다. 환자 유래의 생물학적 시료의 것과 유사한 조직 형태로부터 유래된 참고 시료로부터 측정된 대조군 수준을 이용하는 것이 바람직하다. 더욱이, 알려진 질환 상태를 갖는 군에서 OIP5 유전자의 발현 수준의 표준값을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 표준값은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 획득될 수 있다. 예를 들면, 평균 +/- 2 S.D. 또는 평균 +/- 3 S.D의 범위가 표준값으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 암인 것으로 알려지지 않은 생물학적 시료로부터 측정된 대조군 수준은 "정상 대조군 수준"으로 불린다. 반면, 만약 상기 대조군 수준이 암성 생물학적 시료로부터 측정된다면, 그것은 "암성 대조군 수준"으로 불린다.
OIP5 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 수준에 비해 증가거나 또는 암성 대조군 수준과 유사한 경우, 개체는 암에 걸렸거나 또는 발생 위험에 있는 것으로 진단될 수 있다. 또한, 다중 암 관련 유전자의 발현 수준이 비교되는 경우, 상기 시료와 암인 참고 시료 사이의 유전자 발현 패턴의 유사도는 개체가 암에 걸렸거나 또는 발생 위험에 있는 것을 나타낸다.
테스트 생물학적 시료의 발현 수준과 상기 대조군 수준 사이의 차이는 발현 수준이 세포의 암 또는 암이 아닌 상태에 따라 차이를 보이지 않는 핵산, 예를 들면, 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 발현 수준에 대해 표준화될 수 있다. 바람직한 조절 유전자로는 베타-액틴(beta-actin), 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase), 및 리보솜 단백질 P1(ribosomal protein P1)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
암의 예후를 평가하는 방법:
본 발명은, OIP5 발현이 환자의 나쁜 예후와 밀접하게 연관되어 있다는 발견에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 상기 환자의 생물학적 시료의 OIP5의 발현수준을 측정하기; 대조군 수준에 비하여 검출된 발현수준을 비교하기; 나쁜 예후(낮은 생존)의 지시로서 대조군 수준에 비하여 증가한 발현수준을 측정에 의한 암을 갖는 환자의 예후를 측정하고 평가하는 방법을 제공한다.
추가로, 치료 전과 이후의 OIP5 유전자의 발현 수준은 상기 치료의 효능을 평하기 위한 본 발명의 방법에 따라 비교할 수 있다. 구체적으로 치료 이후, 개체 유래 생물학적 시료에서 검출된 발현 수준(즉, 치료 후 수준)은 동일한 개체로부터 치료 시작 이전(즉, 치료 이전 수준)에 획득된 생물학적 시료에서 검출된 발현 수준과 비교된다. 상기 치료 이전의 수준과 비교된 치료 이후의 수준의 감소는 상기 관심있는 치료가 효과적이라는 것을 의미하나, 반면 상기 치료 이전의 수준에 비하여 상기 치료 이후의 수준이 증가하거나 또는 유사한 것은 임상학적 결과 또는 예후가 좋지 않다는 것을 나타낸다.
본 명세서에 사용된, 상기 용어 "효과적인"은 상기 치료가 개체에 있어서 병리학적으로 과발현된 유전자의 발현 감소, 병리학적으로 저발현된 유전자의 발현 또는 크기, 널리퍼짐, 또는 암의 전이 가능성 감소를 유도하는 것을 나타낸다. 관심있는 치료가 예방을 위해 사용될 경우, "효과적인"은 암 형성을 지연 또는 억제시키거나 또는 암의 임상적 증상을 억제, 예방 또는 완화시키는 것을 의미한다. 개체의 종양의 상태의 평가는 표준 임상 프로토콜을 이용하여 이루어진다.
추가로, 치료의 효과성은 암을 진단하기 위해 알려진 임의의 방법과 연관되어 측정될 수 있다. 암은 예를 들어 증상 이상, 예를 들어 체중 감소, 복통, 복통, 요통, 거식증, 메스꺼움, 구토 and 전신 이상(generalized malaise), 허약(weakness), 및 황달을 확인함으로써 진단될 수 있다.
본 명세서에서, 상기 용어 "예후"는 사례의 특성 및 증상에 의해 나타내지는 것으로서 상기 질환으로부터의 회복 가능성뿐만 아니라 상기 질환의 가능성 있는 결과로서 예측되는 것을 나타낸다. 따라서, 덜 호의적인, 부정적인 또는 나쁜 예후는 낮은 치료 후 생존기간 또는 생존율에 의해서 정의된다. 반대로, 긍정적인, 호의적인, 또는 좋은 예후는 증가된 치료 후 생존기간 또는 생존율로서 정의된다.
상기 용어 "예후 평가"는 예상, 예측 또는 주어진 검출 또는 측정을 환자의 암의 장래 결과(예를 들면, 악성종양, 암 치료의 가능성, 생존의 예상 시간, 등)를 연관시키는 능력을 나타낸다. 예를 들면, 시간에 걸친 OIP5의 발현 수준의 측정은 상기 환자에 대한 결과의 예측을 가능하게 한다(예를 들면, 악성종양의 증가 또는 감소, 암의 등급의 증가 또는 감소, 암 치료의 가능성, 생존, 등).
본 발명의 문맥에서, 상기 문구 "예후 평가(또는 측정)"은 암, 진행, 특히 암 재발, 전이 속도 및 질환 재발의 예측 및 가능성 분석을 포함하는 것을 의미한다. 예후 평가를 위한 본 발명의 방법은 치료적 개입, 진단적 기준, 예를 들면, 종양 질환의 전이 또는 재발에 대한 질환 단계, 및 질환 모니터링 및 감시를 포함하는 치료 양식에 대한 결정을 하는데 임상적으로 사용되는 것을 의미한다.
상기 방법에 사용된 상기 환자 유래의 생물학적 시료는 상기 OIP5 유전자가 상기 시료에서 검출될 수 있는 한, 평가될 개체로부터 유래된 임의의 시료가 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 생물학적 시료는 폐 및/또는 식도 세포(폐 및/또는 식도로부터 수득한 세포)이다. 또한, 상기 생물학적 시료는 가래, 혈액, 혈청 또는 혈장과 같은 신체의 체액을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료는 조직으로부터 정제된 세포일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 치료 전, 중, 및/또는 후를 포함하는, 다양한 시점의 환자로부터 수득될 수 있다.
본 발명에 따라, 상기 환자 유래의 생물학적 시료에서 측정된 상기 OIP5 유전자의 더욱 높은 발현 수준, 치료 후 차도, 회복, 및/또는 생존에 대한 나쁜 예후, 및 나쁜 임상적 결과의 더욱 높은 가능성이 보여졌다. 따라서, 본 방법에 따라, 비교에 사용된 상기 "대조군 수준"은 예를 들면, 암의 좋거나 또는 긍정적인 예후를 나타낸 개체 또는 개체의 집단에서 임의의 종류의 치료 전에 검출된 상기 OIP5 유전자의 발현 수준일 수 있고, 치료 후, 이는 본 명세서에서 "좋은 예후 대조군 수준"으로서 말할 수 있을 것이다. 대안적으로, 상기 "대조군 수준"은 암의 좋지 않거나 또는 부정적인 예후를 나타낸 개체 또는 집단에서 임의의 종류의 치료 전에 검출된 상기 OIP5 유전자의 발현 수준일 수 있고, 치료 후, 이는 본 명세서에서 "나쁜 예후 대조군 수준"으로서 나타낼 수 있을 것이다. 상기 "대조군 수준"은 단일 참고 집단 또는 다수의 발현 패턴으로부터 유래된 단일 발현 패턴일 수 있다. 따라서, 상기 대조군 수준은 암 환자, 또는 알려진 질환 단계(좋거나 또는 나쁜 예후)에 있는 환자들의 집단에서 임의의 종류의 치료 전에 검출된 상기 OIP5의 발현 수준을 바탕으로 측정될 수 있다. 바람직하게, 암은 폐 및/또는 식도암이다. 알려진 질환 상태를 갖는 환자군에서 상기 OIP5 유전자의 발현 수준의 표준값을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 표준값은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 획득될 수 있다. 예를 들면, 평균 +/- 2 S.D. 또는 평균 +/- 3 S.D의 범위가 표준값으로서 사용될 수 있다.
상기 대조군 수준은 질환 상태(좋은 예후 또는 나쁜 예후)가 알려진 암 환자로부터 임의의 종류의 치료 전에 미리 수집 및 비축된 시료(대조군 또는 대조군 그룹)를 이용하여 테스트 생물학적 시료와 동시에 측정될 수 있다.
대안적으로, 상기 대조군 수준은 대조군으로부터 미리 수집 및 비축된 시료에서 OIP5 유전자의 발현 수준을 분석함으로써 획득된 결과를 바탕으로 한 통계적 방법에 의해 측정될 수 있다. 또한, 상기 대조군 수준은 미리 테스트된 세포의 발현 패턴 데이터베이스일 수 있다.
또한, 본 발명의 한 측면에 따라, 생물학적 시료에서 상기 OIP5 유전자의 발현 수준은 다중 참고 시료로부터 측정된 다중 대조군 수준과 비교할 수 있다. 상기 환자 유래의 생물학적 시료의 대조군 수준과 유사한 조직 형태로부터 유래된 참고 시료로부터 측정된 대조군 수준을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라, 상기 좋은 예후 대조군 수준에 대한 상기 OIP5 유전자의 발현 수준의 유사성은 상기 환자의 더욱 호의적인 예후를 나타내고, 상기 좋은 예후 대조군 수준과 비교하여 상기 발현 수준에 증가는 치료 후 차도, 회복, 생존, 및/또는 임상적 결과에 대해 덜 호의적인, 더욱 나쁜 예후를 나타낸다. 반면에, 상기 나쁜 예후 대조군 수준과 비교하여 상기 OIP5 유전자의 발현 수준에 감소는 상기 환자의 더욱 호의적인 예후를 나타내고, 상기 나쁜 예후 대조군 수준에 대한 상기 발현 수준에 유사성은 치료 후 차도, 회복, 생존, 및/또는 임상적 결과에 대해 덜 호의적인, 더욱 나쁜 예후를 나타낸다.
생물학적 시료에서 상기 OIP5 유전자의 발현 수준은 상기 발현 수준이 상기 대조군 수준으로부터 1.0배, 1.5배, 2.0배, 5.0배, 10.0배, 또는 그 이상으로 상이할 경우 변화한 것으로 여겨질 수 있다.
상기 테스트 생물학적 시료 및 상기 대조군 수준 사이의 발현 수준 차이는 대조군, 예를 들면, 하우스키핑 유전자에 대해 표준화될 수 있다. 예를 들면, 발현 수준이 상기 암 또는 암이 아닌 세포 사이에 차이가 없는 것으로 알려져 있는, 베타-액틴(beta-actin), 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), 및 리보솜 단백질 P1(ribosomal protein P1)을 암호화하는 것을 포함하는, 폴리뉴클레오티드가 상기 OIP5 유전자의 상기 발현 수준을 표준화하기 위해 사용될 수 있다.
상기 발현 수준은 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 상기 환자 유래의 생물학적 시료에서 유전자 전사체를 검출함으로써 측정될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 검출된 상기 유전자 전사체는 mRNA 및 단백질과 같은 전사 및 번역 산물 모두를 포함한다.
예를 들면, 상기 OIP5 유전자의 상기 전사체 산물은 혼성화, 예를 들면, 상기 유전자 전사체에 대한 OIP5 유전자 프로브를 사용하는, 노던 블랏 혼성화 분석에 의해 검출될 수 있다. 상기 검출은 칩 또는 어레이 상에서 수행될 수 있다. 어레이의 이용은 상기 OIP5 유전자를 포함하는 다수의 유전자의 발현 수준을 검출g하는데 바람직하다. 또 다른 실시예에서, OIP5 유전자에 특이적인 프라이머들을 사용하는 역전사 기반의 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, RT-PCR)과 같은 증폭 기반의 검출 방법을 검출에 사용될 수 있다. 상기 OIP5 유전자 특이적 프로브 또는 프라이머는 종래의 기술을 사용하여 상기 OIP5 유전자의 전체 서열(서열번호 13)로 나타냄으로써 설계 및 제조될 수 있다. 예를 들면, 실시예에서 사용된 프라이머(서열번호 1 및 2)가 RT-PCR에 의한 검출을 위해 사용될 수 있으나, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 본 방법에 사용되는 프로브 또는 프라이머는 엄격한, 중간 정도의 엄격한, 또는 낮은 엄격한 조건하에서 상기 OIP5 유전자의 mRNA와 혼성화된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 상기 문구 "엄격한(혼성화) 조건"은 프로브 또는 프라이머가 이의 표적 서열에 혼성화될 수 있으나, 다른 서열에는 혼성화되지 않는 조건을 나타낸다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고 다른 상황 하에서는 달라질 것이다. 더욱 긴 서열의 특정 혼성화는 더욱 짧은 서열보다 더 높은 온도에서 관찰되었다. 일반적으로, 엄격한 조건의 상기 온도는 정해진 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열 용융점(thermal melting point, Tm)보다 약 5℃ 더 낮은 것으로 선택된다. 상기 Tm은 표적 서열에 대하여 상보적인 프로브의 50%가 평형상태에서 표적 서열에 혼성화되는 온도(정해진 이온 강도, pH 및 핵산 농도하에서)이다. 상기 표적 서열은 일반적으로 과잉으로 존재하기 때문에, Tm에서, 상기 프로브의 50%가 평형상태에 있다. 전형적으로, 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 약 1.0 M 이하의 나트륨 이온이고, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M의 나트륨 이온(또는 다른 염)이며 온도는 더 짧은 프로브 또는 프라이머(예를 들면, 10 내지 50개의 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 30℃이고 더 긴 프로브 또는 프라이머에 대해 적어도 약 60℃이다. 또한 엄격한 조건은 포름아미드(formamide)와 같은 불안정화제의 첨가로 획득될 수 있다.
대안적으로, 상기 번역 산물은 본 발명의 평가를 위해 검출될 수 있다. 예를 들면, 상기 OIP5 단백질의 양이 측정될 수 있다. 상기 번역 산물로서, 상기 단백질의 양을 측정하기 위한 방법은 상기 OIP5 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하는 면역분석 방법을 포함한다. 상기 항체는 단일클론성 또는 다중클론성일 수 있다. 또한, 상기 항체의 임의의 단편 또는 변형(예를 들면, 키메릭 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, 등)은, 상기 단편이 OIP5 단백질에 대한 결합 능력을 보유하는 한, 검출에 사용될 수 있다. 단백질들의 검출을 위한 이러한 종류의 항체의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 이러한 항체 및 이의 등가물을 제조하기 위해 임의의 방법이 본 발명에서 사용될 수 있다.
번역 산물을 기반으로 한 OIP5 유전자의 발현 수준의 검출을 위한 또 다른 방법으로서, 염색의 세기는 OIP5 단백질에 대한 항체를 이용한 면역조직화학적 분석을 통해 관찰될 수 있다. 즉, 강한 염색의 관찰은 상기 OIP5 단백질의 증가된 존재와 동시에 OIP5 유전자의 높은 발현 수준을 나타낸다.
또한, 상기 OIP5 단백질은 세포 증식 활성을 가지는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 OIP5 유전자의 발현 수준은 지표로서 이러한 세포 증식 활성을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들면, OIP5를 발현하는 세포는 생물학적 시료의 존재에서 제조 및 배양되고, 그런 다음 증식 속도 검출 또는 세포주기 또는 콜로니 형성 능력 측정에 의해 상기 생물학적 시료의 상기 세포 증식 활성을 측정할 수 있다.
또한, 상기 OIP5 유전자의 발현 수준과 더불어, 다른 폐 및/또는 식도암 관련 유전자의 발현 수준, 예를 들면, 폐 및/또는 식도암에서 상이하게 발현되는 것으로 알려진 유전자들의 발현 수준도 상기 평가의 정확성을 증가시키기 위해 측정될 수 있다. 이러한 다른 폐암 관련 유전자들은 그 내용이 본 명세서에 참조로 통합된, WO 2004/031413 및 WO 2005/090603에 개재된 유전자들을 포함한다.
대안적으로, 본 발명에 따라서 중간 결과는 또한 개체의 예후 평가를 위한 다른 검사 결과와 더불어 제공될 수 있다. 이러한 중간 결과는 의사, 간호사, 또는 다른 종사자가 개체의 예후를 평가, 측정, 또는 추정할 수 있도록 보조할 수 있다. 예후를 평가하기 위해, 본 발명에 의해 획득된 상기 중간 결과와 조합하는 것으로 여겨지는 추가적인 정보에는 개체의 임상적 증상 및 신체적 상태를 포함한다.
상기 방법에 따른 암의 예후에 대해 평가되는 환자는 포유 동물인 것이 바람직하며, 인간, 인간이 아닌 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말, 및 소를 포함한다.
암의 진단, 암의 예후 평가 및/또는 암 치료법의 효능 모니터링용 키트 :
본 발명은 암 진단 또는 암의 예후 평가 및/또는 암 치료법의 효능 모니터링용 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 암은 폐 및/또는 식도암이다. 구체적으로, 상기 키트는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는, 적어도 하나의 환자 유래 생물학적 시료에서 OIP5 유전자의 발현 검출용 시약을 포함한다:
(a) 상기 OIP5 유전자의 mRNA 검출용 시약;
(b) 상기 OIP5 단백질의 검출용 시약; 및
(c) 상기 OIP5 단백질의 생물학적 활성 검출용 시약.
상기 OIP5 유전자의 mRNA 검출을 위한 적절한 시약은 상기 OIP5 mRNA에 특이적으로 결합하거나 또는 이를 확인하는, 상기 OIP5 mRNA의 한 부분에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드와 같은 핵산을 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 이러한 종류는 상기 OIP5 mRNA에 특이적인 프라이머 및 프로브에 의한 예가 된다. 올리고뉴클레오티드의 이러한 종류는 당업계에 잘 알려진 방법들을 바탕으로 제조될 수 있다. 만약 필요하다면, 상기 OIP5 mRNA 검출용 시약은 고체 매트릭스 상에 고정화될 수 있다. 또한, 상기 OIP5 mRNA를 검출하기 위한 하나 이상의 시약이 상기 키트에 포함될 수 있다.
반면에, 상기 OIP5 단백질의 검출을 위한 적절한 시약은 상기 OIP5 단백질에 대한 항체를 포함한다. 상기 항체는 단일클론성 또는 다중클론성일 수 있다. 또한, 상기 항체의 임의의 단편 또는 변형(예를 들면, 키메릭 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, 등)은, 상기 단편이 OIP5 단백질에 대한 결합 능력을 보유하는 한, 시약으로서 사용될 수 있다. 단백질들의 검출을 위한 이러한 종류의 항체의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 이러한 항체 및 이의 등가물을 제조하기 위해 임의의 방법이 본 발명에서 사용될 수 있다. 또한, 상기 항체는 직접 결합 또는 간접 표지 기술을 통해 신호 생성 분자로 표지될 수 있다. 표지 및 항체 표지 방법 및 그들의 표적에 대한 항체의 결합 검출은 당업계에 잘 알려져 있고 임의의 표지 및 방법이 본 발명을 위해 사용될 수 있다. 또한, 상기 OIP5 단백질 검출을 위한 하나 이상의 시약이 상기 키트에 포함될 수 있다.
또한, 상기 생물학적 활성은 생물학적 시료에서 상기 발현되는 OIP5 단백질로 인해 예를 들면, 세포 증식 활성의 측정에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 상기 세포는 환자 유래의 생물학적 시료의 존재하에서 배양되고, 그런 다음 증식 속도의 검출 또는 세포주기 또는 콜로니 형성 능력 측정에 의해 상기 생물학적 시료의 세포 증식 활성을 측정할 수 있다. 만약 필요하다면, 상기 OIP5 mRNA 검출용 시약은 고체 매트릭스에 고정화될 수 있다. 또한, 상기 OIP5 단백질의 생물학적 활성을 검출하기 위한 하나 이상의 시약이 상기 키트에 포함될 수 있다.
상기 키트는 상기 기재한 시약 중 하나 이상으로 구성될 수 있다. 또한, 상기 키트는 고체 매트릭스 및 상기 OIP5 유전자 또는 상기 OIP5 단백질에 대한 항체, 세포 배양용 배지 및 용기, 양성 및 음성 대조군 시약, 및 상기 OIP5 단백질에 대한 항체 검출용 2차 항체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 좋은 예후 또는 나쁜 예후를 가지는 환자로부터 수득된 조직 시료는 유용한 대조군 시약으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 키트는 완충용액, 희석제, 여과장치, 바늘, 주사, 및 포장 부속물(예를 들면, 문서, 테이프, CD-ROM, 등)을 사용을 위한 지시사항과 함께 포함되는, 상업적이고 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질들을 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 시약 등은 라벨이 있는 용기 안에 포함될 수 있다. 적절한 용기는 병, 바이얼(vial), 및 테스트 튜브를 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시예로서, 상기 시약이 OIP5 mRNA에 대한 프로브인 경우, 상기 시약은 적어도 하나의 검출 부위를 형성하기 위해, 다공성 스트립과 같은 고체 매트릭스 상에 고정화될 수 있다. 상기 다공성 스트립의 측정 또는 검출 영역은 각각 핵산(프로브)을 포함하는, 다수의 부위를 포함할 수 있다. 또한 테스트 스트립은 음성 및/또는 양성 대조군을 위한 부위를 포함할 수 있다. 대안적으로, 대조군 부위는 상기 검사 스트립으로부터 분리된 스트립 상에 위치할 수 있다. 선택적으로, 상이한 검출 부위는 고정화된 핵산의 상이한 양, 즉, 최초 검출 부위에서 더욱 높은 양 및 다음 부위에서 더 낮은 양을 포함할 수 있다. 테스트 시료의 첨가에 있어서, 검출되는 신호를 나타내는 부위의 수는 상기 시료에 존재하는 OIP5 mRNA의 양의 정량적 표시를 제공한다. 상기 검출 부위는 임의의 적절하게 검출되는 모양에서 설정될 수 있고, 전형적으로 테스트 스트립의 너비에 걸친 막대 또는 점의 모양으로 있다.
본 발명의 상기 키트는 추가적으로 양성 대조군 시료 또는 OIP5 표준 시료를 포함한다. 본 발명의 상기 양성 대조군 시료는 OIP5 양성 혈액 시료의 수집에 의해 제조될 수 있고, 그런 다음 이러한 OIP5 수준이 분석된다. 대안적으로, 정제된 OIP5 단백질 또는 폴리뉴클레오티드는 양성 시료 또는 상기 OIP5 표준을 형성하기 위해 OIP5가 없는 혈청에 첨가될 수 있다.
항암 화합물의 스크리닝:
본 발명의 문맥에서, 본 발명의 스크리닝 방법을 통해 확인된 약제는 몇몇의 화합물을 포함하는 임의의 화합물 또는 조성물일 수 있다. 또한, 본 발명의 스크리닝 방법에 따라 세포 또는 단백질에 노출된 테스트 시약은 단일 화합물 또는 화합물들의 조합일 수 있다. 화합물들의 조합이 상기 방법들에 사용되는 경우, 상기 화합물들은 순차적으로 또는 동시에 접촉될 수 있다.
임의의 테스트 시약, 예를 들면, 세포 추출물, 세포 배양 상등액, 발효시킨 미생물의 산물, 해양생물로부터의 추출물, 식물 추출물, 정제된 또는 천연 그대로의 단백질, 펩티드, 비펩티드 화합물, 합성 미세분자 화합물(안티센스 RNA, siRNA, 리보자임과 같은 핵산 구조 등을 포함) 및 천연 화합물은 본 발명의 상기 스크리닝 방법에 사용될 수 있다. 또한, 상기 본 발명의 테스트 시약은 (1) 생물학적 라이브러리, (2) 공간적으로 주소화할 수 있는 평행의 고체상 또는 용액상 라이브러리, (3) 디컨볼루션(deconvolution)을 필요로 하는 합성 라이브러리 방법, (4) "하나의 비드 하나의 화합물(one-bead one-compound)" 라이브러리 방법 및 (5) 친화성 크로마토그래피 선별을 사용한 합성 라이브러리 방법을 포함하는, 당업계에 알려진 조합의 라이브러리 방법에 있어서 다수의 접근법 중 임의의 것을 사용하여 획득될 수 있다. 친화성 크로마토그래피 선별을 사용한 상기 생물학적 라이브러리 방법은 펩티드 라이브러리로 제한되는 반면에, 다른 네 개의 접근법은 화합물의 펩티드, 비펩티드, 올리고머 또는 소분자 라이브러리로 이용가능하다(Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67). 분자 라이브러리의 합성을 위한 방법들의 예들은 당업계에서 확인될 수 있다(DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13; Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6; Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994; Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5; Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059; Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061; Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51). 화합물들의 라이브러리는 용액(Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21 참조)에 또는 비드(Lam, Nature 1991, 354: 82-4), 칩(Fodor, Nature 1993, 364: 555-6), 박테리아(미국 특허 번호 5,223,409), 포자(미국 특허 번호 5,571,698; 5,403,484 및 5,223,409), 플라스미드(Cull et al ., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9) 또는 파지(phage)(Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90; Devlin, Science 1990, 249: 404-6; Cwirla et al ., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82; Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10; 미국 특허. 출원 2002-103360)에 존재할 수 있다.
임의의 본 스크리닝 방법에 의해 스크리닝된 화합물의 구조의 일부가 첨가, 결실 및/또는 치환에 의해 전환되는 화합물은 본 발명의 상기 스크리닝 방법에 의해 수득된 상기 약제에 포함된다.
또한, 상기 스크리닝된 테스트 시약이 단백질인 경우, 상기 단백질을 암호화하는 DNA를 수득하기 위해, 상기 단백질의 전체 아미노산 서열은 상기 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 추론하기 위해 확인되거나, 또는 상기 수득된 단백질의 일부 아미노산 서열은 상기 서열에 기초한 프로브로서 올리고 DNA를 제조하기 위해 분석될 수 있고, 상기 단백질을 암호화하는 DNA를 수득하기 위해 상기 프로브으로 cDNA 라이브러리를 탐색할 수 있다. 상기 수득된 DNA는 암 치료 또는 예방용 후보인 상기 테스트 시약을 제조에 유용하다는 것을 확인하였다.
또한, 본 명세서에 기재된 상기 스크리닝에 있어서 유용한 테스트 시약은 OIP5 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 생체 내 본래의 단백질의 생물학적 활성이 결여된 이의 부분 펩티드일 수 있다.
상기 테스트 시약 라이브러리의 구조는 당업계에 잘 알려져 있음에도 불구하고, 하기 본 명세서에서 테스트 시약을 선별하는 추가적 안내 및 본 발명의 스크리닝 방법을 위한 시약의 라이브러리의 구축을 제공한다.
(ⅰ) 분자 모델링 :
테스트 시약 라이브러리의 구성은 탐색된 특성들을 가지는 것으로 알려진 화합물의 분자 구조, 및/또는 OIP5의 분자 구조의 지식에 의해 촉진된다. 추가적인 평가를 위한 적합한 테스트 시약의 예비 스크리닝에 대한 하나의 접근법은 상기 테스트 시약과 이의 표적 사이의 상호작용의 컴퓨터 모델링(computer modeling)이다.
컴퓨터 모델링 기술은 선택된 분자의 3차원 원자 구조의 가시화 및 상기 분자와 상호작용할 신규한 화합물의 순이론적 설계를 가능하게 한다. 상기 3차원의 구조는 일반적으로 상기 선택된 분자의 X선 결정학적 분석 또는 NMR 이미징에서의 데이터에 의존한다. 상기 분자 역학은 역장(force field) 데이터를 요구한다. 컴퓨터 그래픽 시스템은 어떻게 신규한 화합물이 상기 표적 분자에 연결될지 예측을 가능하게 하고 표적 분자의 구조 및 완벽한 표적 화합물의 결합 특이성의 실험적 조적을 가능하게 한다. 상기 분자와 화합물의 상호작용의 예측에는 작은 변화들이 하나 또는 모두에 만들어지는 경우, 분자 역학 소프트웨어 및 일반적으로 사용자 친화적으로, 분자 설계 프로그램과 사용자 사이에 메뉴에 따라 조작하는 구조의 인터페이스와 연결되는 집약적인 컴퓨터기 필요하다.
일반적으로 상기에 기재된 상기 분자 모델링 시스템의 예로는 CHARMm 및 QUANTA 프로그램, Polygen Corporation, Waltham, Mass가 포함된다. CHARMm은 에너지 최소화 및 분자 역학 기능을 수행한다. QUANTA는 구성, 그래픽 모델링 및 분자 구조의 분석을 수행한다. QUANTA는 상호적인 구성, 변형, 가시화, 및 분자 사이의 행동 분석을 가능하게 한다.
많은 문헌에서 특정 단백질들과 상호적인 약제의 컴퓨터 모델링에 대하여 발표하였고, 예를 들면, Rotivinen et al . Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66; Ripka, New Scientist 1988, 54-8; McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22; Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93; Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62이 있으며; 및, 핵산 조성물을 위한 모델 수용체에 관해서는 Askew et al ., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90이 있다.
화학물질을 스크리닝하고 그래프로 묘사하는 다른 컴퓨터 프로그램은 업체들, 예를 들면, BioDesign, Inc., Pasadena, Calif., Allelix, Inc, Mississauga, Ontario, Canada, 및 Hypercube, Inc., Cambridge, Ontario로부터 이용가능하다. 예를 들면, DesJarlais et al ., J Med Chem 1988, 31: 722-9; Meng et al ., J Computer Chem 1992, 13: 505-24; Meng et al ., Proteins 1993, 17: 266-78; Shoichet et al ., Science 1993, 259: 1445-50을 참조한다.
일단 추정되는 억제제가 확인되면, 하기에 상술한 바와 같이 조합적인 화학 기술이 상기 확인된 억제제의 화학적 구조에 기초한 많은 변종들을 구성하기 위하여 사용될 수 있다. 후보 억제제의 상기 결과의 라이브러리, 또는 "테스트 시약"은 암, 특히 폐 및/또는 식도암의 치료 및/또는 예방(prophylaxis) 및/또는 폐 및/또는 식도암의 수술 후 재발의 예방에 적합한 테스트 시약을 동정하기 위하여 본 발명의 방법을 이용하여 스크리닝될 수 있다.
(ⅱ) 조합의 화학 합성:
테스트 시약의 조합의 라이브러리는 알려진 억제제에 존재하는 중심 구조의 지식에 연관되는 이론적인 약제 설계 프로그램의 부분으로서 제조될 수 있다. 이러한 접근법은 상기 라이브러리가 적당한 크기로 유지되게 하고, 높은 처리량 스크리닝을 돕는다. 대안적으로, 간단하고, 특히 짧은, 폴리머의 분자 라이브러리는 상기 라이브러리를 구성하는 분자 패밀리의 모든 치환을 간단히 합성함으로써 구성될 수 있다. 이러한 후자의 접근법의 예는 6개의 아미노산 길이인 모든 펩티드들의 라이브러리일 수 있다. 이러한 펩티드 라이브러리는 모든 6개의 아미노산 서열 치환을 포함할 수 있다. 이러한 종류의 라이브러리는 선형 조합의 화학적 라이브러리라고 불린다.
조합의 화학적 라이브러리의 제조는 당업자들에게 잘 알려져 있고, 화학적 또는 생물학적 합성 중 하나에 의해 생성될 수 있다. 조합의 화학적 라이브러리는 펩티드 라이브러리(예를 들면, 미국 특허 5,010,175; Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93; Houghten et al ., Nature 1991, 354: 84-6 참조)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 화학적 다양성 라이브러리를 생성하기 위한 다른 화학 물질들이 사용될 수 있다. 이러한 화학물질에는 펩티드(예를 들면, PCT 공개번호 WO 91/19735), 암호화된 펩티드(예를 들면, WO 93/20242), 랜덤 바이오-올리고머(예를 들면, WO 92/00091), 벤조디아제핀(benzodiazepines)(예를 들면, 미국 특허 5,288,514), 디버소머(diversomers) 예를 들면, 히단토인(hydantoins), 벤조디아제핀(benzodiazepines) 및 디펩티드(dipeptides)(DeWitt et al ., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90:6909-13), 비닐로구스 폴리펩티드(vinylogous polypeptides)(Hagihara et al ., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568), 글루코스 스캐폴딩(glucose scaffolding)을 갖는 비펩티드의 펩티도미메틱(nonpeptidal peptidomimetics)(Hirschmann et al ., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8), 작은 화합물 라이브러리의 유사체 유기 합성(Chen et al ., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661), 올리고카바메이트(oligocarbamates)(Cho et al ., Science 1993, 261: 1303), 및/또는 펩티딜포스포네이트(peptidylphosphonates)(Campbell et al ., J Org Chem 1994, 59: 658), 핵산 라이브러리(Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, 1990-2008, John Wiley Interscience; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA 참조), 펩티드 핵산 라이브러리(예를 들면, 미국 특허 5,539,083 참조), 항체 라이브러리(예를 들면, Vaughan et al ., Nature Biotechnology 1996, 14(3):309-14 및 PCT/US96/10287 참조), 카보하이드레이트(carbohydrate) 라이브러리(예를 들면, Liang et al ., Science 1996, 274: 1520-22; 미국 특허 5,593,853 참조), 및 작은 화합물 분자 라이브러리(예를 들면, 벤조디아제핀(benzodiazepine), Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1;6(6):624-31.; 이소프레노이드(isoprenoids), 미국 특허 5,569,588; 시아졸이디논(thiazolidinones) 및 메타시아자논(metathiazanones), 미국 특허 5,549,974; 피롤리딘(pyrrolidines), 미국 특허 5,525,735 및 5,519,134; 모르폴리노 화합물(morpholino compounds), 미국 특허 5,506,337; 벤조디아제핀(benzodiazepine), 5,288,514 등 참조)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
조합 라이브러리의 제조를 위한 장치는 상업적으로 이용가능하다(예를 들어, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA를 참조하라). 추가로, 다양한 조합 라이브러리는 그 자체가 상업적으로 이용가능하다(예를 들어, ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, 등을 참조하라).
(ⅲ) 다른 후보들:
라이브러리를 제조하기 위한 또 다른 접근법은 재조합 박테리오파지(bacteriophage)를 사용한다. 상기 "파지(phage) 방법"을 이용하여(Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90; Cwirla et al ., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82; Devlin et al ., Science 1990, 249: 404-6), 매우 큰 라이브러리들이 구조화될 수 있다(예를 들면, 106 -108 화학 entities ). 두 번째 접근법은 주로 화학적 방법들을 사용하고, Geysen 방법(Geysen et al ., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15; Geysen et al ., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74); 및 Fodor 등의 방법(Science 1991, 251: 767-73)이 이의 예이다. Furka 등(14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR:013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93), Houghten(미국 특허 4,631,211) 및 Rutter 등(미국 특허 5,010,175)은 작용제(agonist) 또는 길항제(길항제)로서 검사될 수 있는 펩티드들의 혼합물을 제조하기 위한 방법을 기재한다.
앱타머(aptamer)는 특정한 분자 표적에 단단히 결합하는 핵산을 포함하는 거대분자이다. Tuerk와 Gold(Science. 249:505-510(1990))는 앱타머의 선택을 위한 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법을 밝혔다. 상기 SELEX 방법에서, 핵산 분자의 거대한 라이브러리(예를 들어 1015개의 다른 분자)는 스크리닝을 위해서 사용될 수 있다.
OIP5 결합 화합물의 스크리닝:
본 발명의 문맥에서, 정상 조작에서 발현이 없음에도 불구하고, OIP5의 과발현은 폐 및/또는 식도암에서 관찰되었다(도 1A, B, D 및 2A). 따라서, OIP5 유전자, 상기 유전자에 의해서 암호화되는 단백질을 이용하여, 본 발명은 OIP5에 결합하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 폐 및/또는 식도암에서 OIP5의 발현으로 인하여, OIP5에 결합하는 화합물은 암 세포의 증식을 억제할 것으로 추정되므로, 폐 및/또는 식도암의 치료 또는 예방에 유용할 것이다. 따라서, 본 발명은 또한, 암 세포의 증식 및/또는 세포 침습을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법, 및 상기 OIP5 폴리펩티드를 이용한 암, 특히 폐 및/또는 식도암의 치료 또는 예방을 위한 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 스크리닝 방법의 하나의 특정한 실시예는 하기 단계를 포함한다:
(a) 테스트 화합물과 OIP5 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화된 폴리펩티드를 접촉시킥;
(b) 상기 폴리펩티드와 상기 테스트 화합물 사이의 결합능력을 측정하기; 및
(c) 상기 폴리펩티드에 결합하는 상기 테스트 화합물을 선택하기.
본 발명의 문백에 있어서, 치료학적 효과는 상기 테스트 약제 또는 화합물 및 OIP5 단백질의 결합 수준에 관련될 수 있다. 예를 들어, 상기 테스트 약제 또는 화합물이 OIP5 단백질에 결합할 경우, 상기 테스트 약제 또는 화합물은 필요한 치료학적 효과를 가지 약제 또는 화합물로서 동정 또는 선택될 수 있다. 대안적으로, 상기 테스트 약제 또는 화합물이 OIP5 단백질에 결합하지 않는 경우, 상기 테스트 약제 또는 화합물은 유효한 치료학적 효과가 없는 약제 또는 화합물로서 동정될 수 있다.
본 발명의 방법은 하기에 더욱 구체적으로 기재될 것이다.
스크리닝에 사용되는 상기 OIP5 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 천연적 또는 이의 일부 펩티드로부터 유래된 단백질일 수 있다. 상기 테스트 화합물과 접촉되는 상기 폴리펩티드는, 예를 들면, 정제된 폴리펩티드, 용해성 단백질, 담체에 결합된 형태 또는 다른 폴리펩티드들과 융합된 융합 단백질일 수 있다.
예를 들면, 상기 OIP5 폴리펩티드를 사용하여 상기 OIP5 폴리펩티드에 결합하는 단백질들에 대한 스크리닝 방법으로서, 당업자에게 잘 알려진 많은 방법이 사용될 수 있다. 이러한 스크리닝은 예를 들면, 면역침전 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 OIP5 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 외래 유전자들, 예를 들면, pSV2neo, pcDNA I, pcDNA3.1, pCAGGS 및 pCD8에 대한 발현 벡터로 상기 유전자를 도입함으로써 숙주(예를 들면, 동물) 세포 등에서 발현된다.
상기 발현에 사용되는 프로모터는 통상적으로 사용되는 임의의 프로모터가 사용될 수 있고 예를 들면, SV40 초기 프로모터(SV40 early promoter)(Rigby in Williamson (ed.), Genetic engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141 (1982)), EF-알파 프로모터(EF-alpha promoter)(Kim et al . Gene. 91:217-23(1990)), CAG 프로모터(CAG promoter)(Niwa et al ., Gene. 108:193(1991)), RSV LTR 프로모터(RSV LTR promoter)(Cullen, Methods Enzymol. 152:684-704(1987)), SR 알파 프로모터(SR alpha promoter)(Takebe et al ., Mol Cell Biol. 8:466(1988)), CMV 즉시 초기 프로모터(CMV immediate early promoter)(Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA. 84:3365-9(1987)), SV40 후기 프로모터(SV40 late promoter)(Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet. 1:385-94(1982)), 아데노바이러스 후기 프로모터(Adenovirus late promoter)(Kaufman et al ., Mol Cell Biol. 9:946(1989)), HSV TK 프로모터(HSV TK promoter) 등을 포함한다.
외래 유전자를 발현하기 위해 숙주 세포 내로 상기 유전자의 도입은 임의의 방법들, 예를 들면, 전기천공법(Chu et al ., Nucleic Acids Res 15: 1311-26 (1987)), 인산칼슘 방법(Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52 (1987)), DEAE 덱스트란(dextran) 방법(Lopata et al ., Nucleic Acids Res 12: 5707-17 (1984); Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3 (1984)), 리포펙틴(Lipofectin) 방법(Derijard B., Cell 76: 1025-37 (1994); Lamb et al ., Nature Genetics 5: 22-30 (1993); Rabindran et al ., Science 259: 230-4 (1993)) 등에 따라 수행될 수 있다.
상기 OIP5 유전자에 의해 암호화되는 상기 폴리펩티드는 항체의 특이성이 밝혀진, 상기 단일클론성 항체의 에피토프를 상기 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단으로 도입시킨, 단일클론성 항체의 인식 부위(에피토프, epitope)를 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 에피토프-항체 시스템이 사용될 수 있다(Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)). 예를 들면, 베타-갈락토시다제(β-갈락토시다아제), 말토스(maltose) 결합 단백질, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase), 녹색 형광 단백질(green florescence protein, GFP) 등을 가진 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터들은 그것의 다중 클로닝 부위의 사용에 의해 상업적으로 이용가능하다. 또한, 다수 내지 12개 개의 아미노산으로 구성된 작은 에피토프만을 도입함으로써 제조된 융합 단백질은 상기 융합에 의해 상기 OIP5 폴리펩티드의 특성이 변화되는 않는다는 것도 보고되었다. 에피토프, 예를 들면, 폴리히스티딘(polyhistidine)(His-tag), 인플루엔자 집합체(influenza aggregate) HA, 인간 c-myc, FLAG, 수포성 구내염 바이러스 당단백질(Vesicular stomatitis virus glycoprotein, VSV-GP), T7 유전자 10 단백질(T7 gene 10 protein, T7-tag), 인간 단순 헤르페스 바이러스 당단백질(human simple herpes virus glycoprotein, HSV-tag), E-tag(단일클론 파지 상의 에피토프) 등, 그들을 인식하는 단일클론 항체들은 상기 OIP5 폴리펩티드에 결합하는 스크리닝 단백질에 대한 상기 에피토프-항체 시스템으로서 사용될 수 있다(Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)).
면역침전에 있어서, 면역 복합체는 이러한 항체들을 적절한 세제를 사용하여 제조된 세포 용해물에 첨가함으로써 형성된다. 상기 면역 복합체는 상기 OIP5 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드와의 결합 능력을 포함하는 폴리펩티드, 및 항체로 구성된다. 또한 면역침전은 상기 언급된 바에 따라 제조될 수 있는, 상기 OIP5 폴리펩티드에 대한 항체들, 더불어 상기 에피토프에 대한 항체들을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 항체가 마우스 IgG 항체인 경우, 면역 복합체는 예를 들면, 단백질 A 세파로스(Protein A sepharose) 또는 단백질 G 세파로스(Protein G sepharose)에 의해 침전될 수 있다. 만약 OIP5 유전자에 의해 암호화되는 상기 폴리펩티드가 에피토프, 예를 들면 GST를 갖는 융합 단백질로서 제조된다면, 면역 복합체는 글루타티온-세파로스 4B(glutathione-Sepharose 4B)과 같은 이러한 에피토프에 특이적으로 결합하는 물질을 사용하여, 상기 OIP5 폴리펩티드에 대한 항체의 사용에 있어서와 같이 동일한 방법으로 형성될 수 있다.
면역침전은 예를 들면, 문헌(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988))에서의 방법들에 따라 수행될 수 있다.
SDS-PAGE는 면역침전된 단백질의 분석에 흔히 사용되고, 결합된 단백질은 적절한 농도를 갖는 겔을 사용하여 상기 단백질의 분자량에 의해 분석된다. 상기 OIP5 폴리펩티드에 결합되는 상기 단백질은 일반적인 염색 방법, 예를 들면 쿠마쉬염색(Coomassie staining) 또는 은염색(silver staining)에 의해 검출되기 어렵기 때문에, 상기 단백질을 위한 검출 민감성은 방사성 동위원소, 35S-메티오닌(methionine) 또는 35S-시스테인(cystein)을 함유하는 배양 배지에서 세포를 배양하고, 상기 세포에서 단백질을 표지, 및 상기 단백질을 검출함으로써 향상시킬 수 있다. 상기 단백질의 분자량이 밝혀진 경우, 상기 표적 단백질은 SDS-폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 겔로부터 직접적으로 정제될 수 있고 그것의 서열이 결정될 수 있다.
웨스트 웨스턴 블랏팅 분석(Skolnik et al ., Cell 65: 83-90 (1991))을 상기 OIP5 폴리펩티드에 결합하는 단백질들에 대한 상기 폴리펩티드를 사용한 스크리닝 방법으로서 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 OIP5 폴리펩티드에 결합하는 단백질은 파지 벡터(예를 들면, ZAP)를 사용하여 상기 OIP5 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 발현하는 것으로 예상되는 배양된 세포들로부터 cDNA 라이브러리를 제조, LB 아가로스 상에서 상기 단백질을 발현, 필터 상에 발현된 상기 단백질을 고정, 상기 필터로 상기 정제되고 표지된 OIP5 폴리펩티드를 반응, 및 상기 표지에 따라 상기 OIP5 폴리펩티드에 결합하는 단백질들을 발현하는 프라그(plaque)를 검출함으로써 수득될 수 있다. 본 발명의 상기 폴리펩티드는 비오틴과 아비딘 사이에 결합, 또는 상기 OIP5 폴리펩티드에 융합된, OIP5, 또는 펩티드, 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체(예를 들면, GST)를 사용함으로써 표지될 수 있다. 또한 방사성 동위원소 또는 형광물질 등을 사용한 방법들이 사용될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 상기 스크리닝 방법의 또 본 발명의 다른 실시예에서, 세포들을 사용한 이중 하이브리드 시스템(two-hybrid system)이 사용될 수 있다("MATCHMAKER Two-Hybrid system", "Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER one-Hybrid system" (Clontech); "HybriZAP Two-Hybrid Vector System" (Stratagene); 참고문헌 "Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)", "Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)").
상기 투-하이브리드 시스템(two-hybrid system)에 있어서, 본 발명의 상기 폴리펩티드는 SRF-결합 영역 또는 GAL4 결합 영역에 융합되고 효모 세포에서 발현된다. cDNA 라이브러리는 본 발명의 상기 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 발현하는 것으로 예상되는 세포들로부터 제조되고, 이러한 라이브러리가, 발현되는 경우, VP16 또는 GAL4 전사 활성 영역에 융합된다. 그런 다음 상기 cDNA 라이브러리는 상기 효모 세포 내로 도입되고, 상기 라이브러리로부터 유래된 상기 cDNA는 검출된 양성 클론으로부터 분리된다(본 발명의 상기 폴리펩티드에 결합하는 단백질이 효모 세포에서 발현되는 경우, 상기 두 개의 결합은 양성 클론을 검출이 가능하게 하는, 리포터 유전자를 활성화함). 상기 cDNA에 의해 암호화되는 단백질은 상기 분리된 cDNA를 E. Coli에 도입하여 단백질을 발현함으로써 제조될 수 있다. 리포터 유전자로서, 예를 들면, Ade2 유전자, lacZ 유전자, CAT 유전자, 루시퍼라제(luciferase) 유전자 등이 HIS3 유전자와 더불어 사용될 수 있다.
또한, OIP5 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 결합하는 화합물은 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 사용하여 스크리닝될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 상기 폴리펩티드는 친화성 컬럼의 담체 상에 고정화될 수 있고, 본 발명의 상기 폴리펩티드에 결합할 수 있는 단백질을 포함하는 테스트 화합물이 상기 컬럼에 사용된다. 본 명세서에서 테스트 화합물은, 예를 들면, 세포 추출물, 세포 용해물 등일 수 있다. 상기 테스트 화합물을 담지한 후, 상기 컬럼은 세척되어, 본 발명의 상기 폴리펩티드에 결합된 화합물이 제조될 수 있다. 상기 테스트 화합물이 단백질인 경우, 상기 수득된 단백질의 아미노산 서열이 분석되고, 올리고 DNA는 상기 서열을 바탕으로 합성되며, cDNA 라이브러리들은 상기 단백질을 암호화하는 DNA를 수득하기 위한 프로브로서 상기 올리고 DNA를 사용하여 스크리닝된다.
표면 플라스몬 공명 현상(surface plasmon resonance phenomenon)을 사용한 바이오센서(biosensor)가 본 발명에서 결합된 화합물의 검출 또는 정량용 수단으로서 사용될 수 있다. 이러한 바이오센서가 사용될 경우, 표지 없이 극히 소량의 폴리펩티드를 사용하여, 본 발명의 상기 폴리펩티드와 피검 화합물 사이에 상호작용은 표면 플라스몬 공명 신호에 따라 실시간으로 관찰될 수 있다(예를 들면, BIAcore, Pharmacia). 따라서, 바이오센서, 예를 들면, BIAcore를 사용하여 본 발명의 상기 폴리펩티드와 피검 화합물 사이의 결합을 측정하는 것이 가능하다.
상기 고정화된 OIP5 폴리펩티드가 합성 화학 화합물, 또는 천연물 저장, 또는 랜덤 파지 펩티드 디스플레이 라이브러리에 노출된 경우 결합하는 분자를 스크리닝하는 방법, 및 상기 OIP5 단백질뿐만 아니라, OIP5 단백질에 결합하는 화합물(작용제 및 길항제를 포함하는) 을 분리하기 위한 조합의 화학 기술에 기초한 높은 처리량을 사용한 스크리닝 방법(Wrighton et al., Science 273: 458-64(1996); Verdine, Nature 384: 11-13(1996); Hogan, Nature 384: 17-9(1996))이 당업자들에게 잘 알려져 있다.
OIP5 의 생물학적 활성을 억제하는 화합물의 스크리닝:
본 발명의 문백에서, 상기 OIP5 단백질은 폐 및/또는 식도암 세포의 세포 증식을 촉진시키는 활성(도 3B) 및 세포 침습 활성(도 9B)를 갖는 것을 특징으로 한다. 이러한 생물학적 활성을 지표로서 이용하여, 본 발명은 암 세포의 증식 및/또는 세포 침습을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법, 및 암, 특히 폐 및/또는 식도암의 치료 또는 예방을 위한 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, OIP5 유전자 관련된 암이 치료 또는 예방을 위한 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다:
(a) 테스트 화합물과 OIP5 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화되는 폴리펩티드를 접촉시키기;
(b) 상기 단계 (a)의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 측정하기; 및
(c) 상기 테스트 화합물이 없는 상태에서 측정되는 폴리펩티드의 생물학적 활성에 비하여, 상기 OIP5 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화되는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 테스트화합물을 선택하기.
본 발명에 따르면, 세포 증식을 촉진하는 활성의 억제, 또는 OIP5 관련된 암(예를 들어, 폐 및/또는 식도암)의 치료 또는 예방에 있어서, 상기 테스트 화합물의 치료학적 효과가 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 하기의 단계를 포함하는, 상기 OIP5 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편을 이용한, 상기 세포증식을 억제하는 후보 화합물, 또는 OIP5 관련된 암의 치료 또는 예방을 위한 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 테스트 화합물을 상기 OIP5 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편과 접촉시키기; 및
(b) 상기 단계 (a)의 폴리펩티드 또는 단편의 생물학적 활성을 측정하기, 및
(c) 상기 (b)의 생물학적 활성가 테스트 약물 또는 화합물의 치료학적 효과를 연관짓기.
본 발명의 문맥에 있어서, 상기 치료학적 효과는 OIP5 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편의 생물학적 활성과 연관될 수 있다. 예를 들어 상기 테스트 약물 또는 화합물이 상기 테스트 약물 또는 화합물이 없는 상태에서 검출되는 수준에 비하여, 상기 OIP5 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편의 생물학적 활성을 감소 또는 억제시키는 경우, 상기 테스트 약물 또는 화합물은 치료학적 효과를 갖는 후보 약물 또는 화합물로서 동정 또는 선택될 수 있다. 대안적으로, 상기 테스트 약물 또는 화합물이 상기 테스트 약물 또는 화합물이 없는 상태에서 검출되는 수준에 비하여, 상기 OIP5 또는 이의 기능적 단편의 생물학적 활성을 감소 또는 억제하지 못하는 경우, 상기 테스트 약물 또는 화합물은 현저한 치료학적 효과가 없는 약물 또는 화합물로서 동정될 수 있다.
본 발명의 방법은 하기에 더욱 구체적으로 기재될 것이다.
임의의 폴리펩티드는 이들이 OIP5 단백질의 생물학적 활성을 억제하는 한, 스크리닝을 위해서 사용될 수 있다. 이러한 생물학적 활성은 상기 OIP5 단백질의 세포-증식 활성을 포함한다. 예를 들어, OIP5 단백질이 사용될 수 있으며, 이러한 단백질과 기능적으로 동등한 폴리펩티드 또한 사용될 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 세포에 의해서 내인성 또는 외인성으로 발현될 수 있다.
이러한 스크리닝에 의해서 분리된 상기 화합물은 OIP5 유전자에 의해서 암호화된 상기 폴리펩티드의 길하제(antagonist)에 대한 후보이다. 상기 용어 "길항제"는 폴리펩티드에 결합함으로써 상기 폴리펩티드의 기능을 억제하는 분자를 나타낸다. 또한 상기 용어는 OIP5를 암호화하는 유전자의 발현을 감소 또는 억제시키는 분자를 나타낸다. 더욱이, 이러한 스크리닝에 의해 분리된 화합물은 분자들(DNA 및 단백질 포함)과 상기 OIP5 폴리펩티드의 생체 내 상호작용을 억제시키는 화합물에 대한 후보이다.
본 발명의 방법에서 검출되는 상기 생물학적 활성이 세포 증식인 경우, 이는 예를 들어 상기 OIP5 폴리펩티드를 발현하는 세포의 준비, 테스트 화합물이 있는 상태에서 상기 세포의 배양, 및 상기 세포의 증식 속도 결정, 세포 주기 등의 측정 뿐만 아니라, 세포의 생존 또는 예를 들어, 도 3에 나타난 바와 같은 콜로니 형성 활성 측정에 의하여 검출될 수 있다. 상기 OIP5를 발현하는 세포의 증식 속도를 감소시키는 화합물은 폐 및/또는 식도암의 치료 또는 예방을 위한 후보 화합물로서 선택된다.
보다 구체적으로, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(a) 테스트 화합물은 OIP5를 발현하는 세포와 접촉시키기;
(b) 세포 증식 활성을 측정하기; 및
(c) 상기 테스트 화합물이 없는 상태에서의 세포-증식 활성과 비교하여, 세포-증식 활성을 감소시키는 테스트 화합물을 선택하기.
바람직한 실시예에서, 상기 본 발명의 방법은 추가적으로 하기의 단계를 포함할 수 있다:
(d) OIP5를 전혀 발현하지 않거나, 미약하게 발현하는 세포에 아무런 효과가 없는 테스트 화합물은 선택하기.
본 발명의 명세서에서 정의된, 상기 문구 "생물학적 활성의 억제"는 바람직하게는 상기 화합물이 없는 상태에 비하여, OIP5의 생물학적 활성이 적어도 10% 억제되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 적어도, 25%, 50% 또는 75%의 감소이며, 가장 바람직하게는 90% 감소이다.
OIP5 의 발현을 변화시키는 화합물의 스크리닝:
본 발명에 있어서, siRNA에 의한 OIP5 유전자의 발현의 감소는 암세포 증식 억제(도 3A), 및 세포 침습이 촉진될 때 OIP5의 과발현을 증가시킨다. 따라서, 본 발명은 OIP5의 발현을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 OIP5의 발현을 억제하는 화합물은 암 세포의 증식 및/또는 세포 침습을 억제할 것으로 예상되며, 따라서 OIP5 관련된 암, 특히 폐 및/또는 식도암의 치료 또는 예방에 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 암 세포의 증식을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법, 및 OIP5 관련된 암, 특히 폐 및/또는 식도암의 치료 또는 예방을 위한 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명의 문맥에서, 이러한 스크리닝은 예를 들어, 하기의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 후보 화합물을 OIP5를 발현하는 세포와 접촉시키기; 및
(b) 대조군에 비하여, OIP5의 발현수준을 감소시키는 후보 화합물을 선택하기.
본 발명의 방법은 하기에 더욱 구체적으로 기재될 것이다.
상기 OIP5를 발현하는 세포는 예를 들어, 폐 및/또는 식도암으로부터 확립된 세포주 또는 OIP5 발현 벡터를 형질감염시킨 세포주를 포함하며, 이러한 세포들은 본 발명의 스크리닝을 위해서 사용될 수 있다. 상기 발현 수준은 당업계에서 잘 알려진 방법, 예를 들어 RT-PCR, 노던 블랏 분석, 웨스턴 블랏 분석, 면역염색, 및 유세포분석에 의해서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 정의된 것으로서 상기 용어 "발현 수준의 감소"는 상기 화합물이 없는 상태에서 발현 수준에 비하여, OIP5의 발현 수준이 적어도 10% 감소되는 것이며, 더욱 바람직하게는 적어도 25%, 50% 또는 75% 감소 수준이며, 가장 바람직하게는 적어도 90% 감소 수준이다. 본 발명에 있어서 상기 화합물은 화학적 화합물, 이중가닥 뉴클레오티드, 등을 포함한다. 상기 이중가닥 뉴클레오티드의 제조는 상기 언급된 설명에 있다. 상기 스크리닝의 방법에 있어서, OIP5의 발현 수준을 감소시키는 화합물은 폐 및/또는 식도암의 치료 및 예방에 사용되는 후보 약제로서 선택될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 상기 스크리닝 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 후보 화합물을 OIP5의 전사 조절 영역 및 상기 전사 조절 영역의 조절하에서 발현되는 리포터 유전자를 포함하는, 벡터가 도입된 세포와 접촉시키는 단계;
(b) 상기 리포터(reporter) 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키는 상기 후보 화합물을 선별하는 단계.
본 발명에 따르면, 상기 테스트 약물 또는 화합물의 세포 성장 억제에 있어서 치료 효과 또는 OIP5 관련된 질환의 치료 또는 예방을 위한 후보 약물 또는 화합물의 치료 효과가 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 암 세포의 증식을 억제하는 후보 약물 또는 화합물을 스크리닝하는 방법, 및 OIP5 관련된 질환의 치료 또는 예방을 위한 후보 약물 또는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 문맥에 있어서, 이러한 스크리닝은 예를 들어 하기의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 후보 화합물을 OIP5의 전사 조절 영역 및 상기 전사 조절 영역의 조절하에서 발현되는 리포터 유전자를 포함하는, 벡터가 도입된 세포와 접촉시키는 단계;
(b) 상기 리포터(reporter) 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키는 상기 후보 화합물을 선별하는 단계.
본 발명의 문맥에서, 상기 치료학적 효과는 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성과 관련될 수 있다. 예를 들어, 상기 테스트 약물 또는 화합물이 상기 테스트 약물 또는 화합물이 없는 상태에서 검출되는 수준에 비하여, 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키는 경우, 상기 테스트 약물 또는 화합물은 치료학적 효과를 갖는 후보 약물 또는 화합물로서 동정되거나 선택될 수 있다. 대안적으로, 상기 테스트 약물 또는 화합물이 상기 테스트 약물 또는 화합물이 없는 상태에서 검출된 수준에 비하여, 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키지 않는 경우, 상기 테스트 약물 또는 화합물은 현저한 치료학적 효과가 없는 약물 또는 화합물로서 동정될 수 있다.
적절한 리포터 유전자 및 숙주 세포는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 리포터 유전자로는 루시퍼라제(luciferase), 녹색 형광 단백질(green florescence protein, GFP), 디스코소마 속 적색 형광 단백질(Discosoma sp. Red Fluorescent Protein, DsRed), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(Chrolamphenicol Acetyltransferase, CAT), lacZ 및 베타-글루쿠로니다제(beta-glucuronidase, GUS)가 있고, 숙주 세포에는 COS7, HEK293, HeLa 등이 있다. 상기 스크리닝에 요구되는 상기 리포터 컨스트럭트는 리포터 유전자 서열과 OIP5의 전사 조절 영역을 연결시킴으로써 제조될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 OIP5의 전사 조절 영역은 전사 시작 부위(transcriptional start site)로부터 적어도 500bp 상부(upstream)이며, 바람직하게는 1000bp 상부(upstream)이며, 더욱 바람직하게는 5000 또는 10000bp 상부(upstream)를 포함한다. 상기 전사 조절 영역을 포함하는 뉴클레오티드 단편(segment)은 게놈 라이브러리(genome library)로부터 분리되거나 또는 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 상기 스크리닝을 위하여 필요한 리포터 컨스트럭트(construct)는 리포터 유전자 서열을 이러한 유전자 중 임의의 하나의 전사조절부위에 연결시킴으로써 제조될 수 있다. 전사 조절 영역을 확인하기 위한 방법, 및 또한 분석 프로토콜도 잘 알려져 있다(Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press).
상기 리포터 컨스트럭트(construct)를 포함하는 벡터는 숙주 세포에 감염되고, 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 검출된다(예를 들면, 발광측정장치(luminometer), 흡광광도계(absorption spectrometer), 유세포분석기(flow cytometer) 등). 본 명세서에서 정의된 것으로서 "발현 또는 활성의 감소"는 상기 화합물의 부재와 비교하여 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성의 적어도 10% 감소이며, 바람직하게는 적어도 25%, 50% 또는 75% 감소이며, 가장 바람직하게는 적어도 95% 감소이다.
OIP5 와 Raf1 의 결합을 지표로서 이용한 스크리닝:
본 발명에 있어서, OIP5와 Raf1 단백질의 직접적인 상호작용은 풀-다운 분석(pull-down assay)에 의해서 나타났다(도9C). OIP5와 Raf1 단백질의 풀-다운(pull-down)은 항-His 항체를 이용하여 수행되었으며, His-태그 OIP5와 GST-융합된 재조합 Raf1 단백질의 혼합물과 배양되었다. OIP5-결합된 Raf1 단백질은 그 후, Raf1에 대한 다중클론성 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅에 의해서 검출되었다(도9C). 다라서, 본 발명은 OIP5와 Raf1 사이의 결합을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
OIP5 단백질과 Raf1 단백질 사이의 결합을 억제하는 화합물은 지표로서, OIP5 단백질과 Raf1 단백질 사이의 결합 수준을 검출함에 따라 스크리닝될 수 있다. 따라서, 본 발명은 지표로서 OIP5 단백질과 Raf1 단백질 사이의 결합을 이용하여, OIP5 단백질과 Raf1 단백질 사이의 결합을 억제할 수 있는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. OIP5 단백질과 Raf1 단백질 사이의 결합을 억제하는 호합물들은 OIP5 단백질의 불안정화(destabilization)를 통하여, 암 세포 증식 및/또는 세포 침습을 억제할 수 있을 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명은 OIP5 유전자를 발현하는 암 세포, 예를 들어 폐암 세포 및/또는 식도암 세포의 성장을 억제 또는 감소시키는 후보 화합물을 스크리닝하는 방법 또한 제공하며, 따라서, 암 예를 들어, 폐암 및/또는 식도암의 치료 또는 예방을 위한 후보 화합물을 제공한다. 추가로, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해서 획득된 화합물은 또한 세포 침습을 억제하는데 유용할 수 있다.
본 발명에서 특히 관심있는 바는 하기 [1] 내지 [5]의 방법이다:
[1] 하기 (a) 내지 (d)의 단계를 포함하는, OIP5 폴리펩티드와 Raf1 폴리펩티드 사이의 결합을 방해하는 화합물을 스크리닝하는 방법:
(a) 테스트 화합물이 있는 상태에서, OIP5 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물과 Raf1 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물을 접촉시키기;
(b) 상기 폴리펩티드 사이의 결합 수준을 검출하기;
(c) 상기 단계 (b)에서 검출된 결합 수준을 상기 테스트 화합물이 없는 상태에서 검출된 결합수준과 비교하기; 및
(d) 결합 수준을 감소시킬 수 있는 테스트 화합물을 선별하기.
[2] 하기 단계 (a) 내지 (d)를 포함하는, 암의 치료 또는 예방, 또는 암 세포의 성장 및/또는 세포 침습을 억제에 유용한 약물 또는 화합물을 스크리닝하는 방법:
(a) 테스트 화합물이 있는 상태에서, OIP5 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물과 Raf1 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물을 접촉시키기;
(b) 상기 폴리펩티드 사이의 결합 수준을 검출하기;
(c) 상기 단계 (b)에서 검출된 결합 수준을 상기 테스트 화합물이 없는 상태에서 검출된 결합수준과 비교하기; 및
(d) 결합 수준을 감소시킬 수 있는 테스트 화합물을 선별하기.
[3] 상기 OIP5의 기능적 등가물이 Raf1-결합 도메인을 포함하는, 상기 [1] 또는 [2]의 방법.
[4] 상기 Raf1의 기능적 등가물이 OIP5-결합 도메인을 포함하는, 상기 [1] 또는 [2]의 방법.
[5] 상기 암은 폐암 및 식도암으로 구성된 군으로부터 선택되는, [1]의 방법.
본 발명의 문맥에 있어서, OIP5 및 Raf1 폴리펩티드의 기능적 등가물은 OIP5 폴리펩티드(서열번호 14), Raf1(서열번호 18) 폴리펩티드 각각에 동등한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 특히, OIP5의 기능적 등가물은 서열번호 14의 아미노산 서열과 같은 Raf1에 대한 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 단편이다. 유사하게, 상기 Raf1의 기능적 등가물은 OIP5-결합 도메인을 포함하는 서열번호 17의 폴리펩티드 단편이다.
OIP5와 Raf1의 결합을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법으로서, 당업자에게 잘 알려진 다양한 방법이 이용도리 수 있다.
사용될 폴리펩티드는 천연 원천으로부터 유래된 재조합 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 이의 부분 펩티드일 수 있다. 상기 언급한 임의의 테스트 화합물을 스크리닝에 이용할 수 있다.
OIP5 단백질과 Raf1 단백질 사이의 결합을 검출하기 위한 방법으로서, 당업자에게 잘 알려진 임의의 방법이 이용될 수 있다. 이러한 검출은 예를 들어, 면역침전, 웨스트-웨스턴 블랏팅 분석(Skolnik et al., Cell 65: 83-90(1991)), 세포를 이용한 이중 하이브리드 시스템("MATCHMAKER Two-Hybrid system", "Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER one-Hybrid system"(Clontech); "HybriZAP Two-Hybrid Vector System"(Stratagene); 참조 "Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612(1992)", "Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92(1994)"), 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 및 표면 플라스몬 공명 현상(surface plasmon resonance phenomenon)을 사용한 바이오센서(biosensor)을 이용하여 수행될 수 있다.
몇몇의 실시예에서, 본 발명의 스크리닝 방법은 OIP5 단백질과 Raf1 단백질을 모두 발현하는 세포를 이용하여 세포 기반한 분석에서 수행될 수 있다. OIP5 단백질과 Raf1을 발현하는 세포는 예를 들어, 암, 예를 들어 폐암 및/또는 식도암으로부터 확립된 세포주를 포함한다. 대안적으로 상기 세포는 OIP5와 Raf1 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드로 세포를 형질전환시켜, 제조될 수 있다. 이러한 형질전환(transformation)은 OIP5와 Raf1을 모두 암화화하는 발현벡터, 또는 OIP5 또는 Raf1 중 어느 하나를 암호화하는 발현벡터를 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 스크리닝은 테스트 화합물이 있는 상태에서, 이러한 세포를 배양함으로써 수행될 수 있다. OIP5 단백질과 Raf1 단백질의 결합은 항-OIP5 항체 또는 항-Raf1 항체를 이용한 면역침전 분석에 의해서 검출될 수 있다.
본 발명에 따라, 세포 성장 억제에 있어서 후보 약물 또는 화합물의 치료학적 효과 또는 OIP5 관련된 암(예를 들어, 폐암 및 식도암) 치료 또는 예방을 위한 후보 약물 또는 화합물의 치료학적 효과가 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 상기 세포 증식을 억제하기 위한 후보 약물 또는 화합물, 또는 OIP5 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물을 이용한 암(예를 들어, 폐암 및 또는 식도암)의 치료 또는 예방을 위한 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다:
(a) 테스트 약물 또는 화합물이 있는 상태에서, OIP5 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물과 Raf1 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물을 접촉시키기;
(b) 상기 폴리펩티드 사이의 결합력을 측정하기;
(c) 상기 단계 (b)에서 측정된 결합 수준과 상기 테스트 약물 또는 화합물이 없는 상태에서 측정된 결합수준을 비교하기; 및
(d) 상기 단계 (c)의 결합 수준과 상기 테스트 약물 또는 화합물의 치료학적 효과를 연관짓기.
본 발명에 있어서, 상기 치료학적 효과는 OIP5 폴리펩티드와 Raf1 폴리펩티드 사이의 결합 수준과 연관될 수 있다. 예를 들어, 상기 테스트 약물 또는 화합물이, 상기 폴리펩티드 사이의 결합 수준을 상기 테스트 약물 또는 화합물이 없는 상태에서 측정된 결합 수준에 비하여 억제하는 경우, 상기 테스트 약물 또는 화합물은 치료학적 효과를 갖는 후보 약물 또는 화합물로서 동정 또는 선별될 수 있다. 대안적으로, 상기 테스트 약물 또는 화합물이 상기 폴리펩티드 사이의 결합 수준을 상기 테스트 약물 또는 화합물이 없는 상태에서 측정된 수준에 비하여 감소 또는 억제시키지 않는 경우, 상기 테스트 약물 또는 화합물은 현저한 치료학적 효과가 없는 약물 또는 화합물로서 동정될 수 있다.
OIP5 의 인산화 반응을 억제할 수 있는 화합물의 스크리닝:
본 발명에 있어서, Raf1 단백질에 의한 OIP5 단백질의 인산화 반응은 OIP5 폴리펩티드의 안정화에 기여하는 것으로 나타났으며(도8C), 따라서 이는 암 세포의 성장에 있어서 매우 중요한 역할을 가질 수 있다. 따라서, Raf1 단백질에 의한 OIP5 단백질의 인산화 반응을 억제하는 화합물은 암 세포 상정 및/또는 세포 침습을 억제하는데 유용하며, 따라서 OIP5 관련된 암 과발현(예를 들어, 폐암 또는 식도암)의 치료 또는 예방을 위한 후보 화합물이 될 수 있다.
따라서, 본 발명은 세포 증식 및/또는 세포 침습을 억제하는 후보 화합물, 또는 지표로서 OIP5 인산화 반응을 이용하여 OIP5 관련된 암의 과발현을 치료 또는 예방하는 후보 화합물을 스크리닝하는 방법 또한 제공한다. 본 발명의 문맥에 있어서, 이러한 스크리닝은 예를 들어 하기의 단계를 포함한다:
(a) OIP5 폴리펩티드의 인산화 반응을 위한 안정적인 조건하에서, OIP5 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물과 Raf1 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물을 테스트 화합물이 있는 상태에서 접촉시키기;
(b) 상기 OIP5 폴리펩티드의 인산화 반응 수준을 검출하기;
(c) 상기 단계 (b)의 인산화 반응과 상기 테스트 화합물이 없는 상태에서 검출된 인산화 반응 수준을 비교하기; 및
(d) 상기 OIP5 폴리펩티드의 인산화 반응 수준을 감소시키는 테스트 화합물을 선별하기.
본 발명에 따라, 세포 성장 억제에 있어서 테스트 약물 또는 화합물의 치료학적 효과 또는 OIP5 관련된 질환, 예를 들어 폐암 및 식도암의 치료 또는 예방을 위한 후보 약물 또는 화합물의 치료학적 효과가 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 유방암 세포의 증식을 억제하는 후보 약물 또는 화합물을 스크리닝하는 방법, 및 유방암 치료 또는 예방을 위한 후보 약물 또는 화합물을 스크리닝하는 방법 또한 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(a) 테스트 약물 또는 화합물이 있는 상태에서, OIP5 단백질과 Raf1 단백질을 접촉시키기;
(b) OIP5 단백질의 인산화 수준을 검출하기;
(c) 상기 OIP5 단백질의 인산화 수준을 상기 테스트 약물 또는 화합물이 없는 상태에서 측정된 인산화 반응 수준과 비교하기; 및
(d) 상기 단계 c)의 인산화 수준과 상기 테스트 약물 또는 화합물의 치료학적 효과를 연관시키기.
본 발명에 있어서, 상기 치료학적 효과는 상기 OIP5 단백질의 인산화 반응과 관련될 수 있다. 예를 들어, 상기 테스트 약물 또는 화합물이 상기 OIP5 단백질의 인산화 반응 수준이 상기 테스트 약물 또는 화합물이 없는 상태에서 검출된 인산화 반응 수준에 비하여 감소되는 경우, 상기 테스트 약물 또는 화합물은 치료학적 효과를 갖는 후보 약물 또는 화합물로서 동정 또는 선별될 수 있다. 대안적으로, 상기 테스트 약물 또는 화합물이 OIP5 단백질의 인산화 반응 수준을 상기 테스트 약물 또는 화합물이 없는 상태에서 측정된 인산화 반응 수준에 비하여 감소시키지 못하는 경우, 상기 테스트 약물 또는 화합물은 현저한 치료학적 효과가 없는 약물 또는 화합물로서 동정될 수 있다.
본 발명의 문맥에 있어서, OIP5 또는 Raf1 폴리펩티드의 기능적 등가물은 OIP5 폴리펩티드(서열번호 14) 또는 Raf1 폴리펩티드(서열번호 18) 각각에 대하여 동등한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 본 명세서에 사용된, 문구 "기능적 등가물"은 "유전자 또는 단백질" 항목에 기재된 바와 동일한 의미를 갖는다.
Raf1 폴리펩티드에 의한 OIP5 폴리펩티드의 인산화 반응을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법으로서, 당업계에 알려진 임의의 방법이 이용될 수 있다. 본 발명의 문맥에 있어서, OIP5 폴리펩티드의 인산화 반응을 위한 적합한 조건은 인산염 공여체(phosphate donor) 예를 들어, ATP의 존재 하에서 분리된 OIP5 폴리펩티드 와 분리된 Raf1 폴리펩티드의 배양과 제공된다. Raf1에 의한 OIP5 인산화 반응을 위한 적합한 조건은 또한 OIP5 폴리펩티드 및 Raf1 폴리펩티드를 모두 발현하는 세포를 배양하는 것을 포함한다. 예를 들어, 이러한 세포는 암 세포(예를 들어, 폐암 세포, 식도암 세포)와 같은 OIP5와 Raf1을 내인성으로 발현하는 세포, 또는 OIP5 폴리펩티드 및/또는 Raf1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 갖고 있는 형질전환 세포일 수 있다.
상기 분리된 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포를 테스트 화합물이 있는 상태에서 배양된 후, 상기 OIP5 폴리펩티드의 인산화 반응은 인산화된 OIP5를 인식하는 항체와 같은 시약을 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 면역분석 또는 웨스턴 블랏팅 분석이 OIP5 폴리펩티드의 인산화 반응 상태를 검출하는데 적용될 수 있다.
인산화된 OIP5의 검출에 앞서, 상기 OIP5 폴리펩티드는 다른 요소로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 겔 전기영동(gel electrophoresis)는 잔여 성분으로부터 OIP5 폴리펩티드의 분리를 위해서 사용될 수 있다. 대안적으로, OIP5 폴리펩티드는 항-LGN/GPSM2 항체를 갖고 있는 담체에 의해서 획득될 수 있다.
대안적으로, 상기 OIP5 폴리펩티드의 인산화 반응은 분리된 OIP5 폴리펩티드 및 Raf1 폴리펩티드, 또는 인산염 공여체(phosphate donor)에 의해서 표지된 이러한 폴리펩티드를 발현하는 세포와의 배양, 및 상기 표지를 추적함으로써 검출될 수 있다. 예를 들어, 방사선 표지된 ATP(예를 들어, 32P-ATP)는 인산염 공여체로서 이용될 경우, 상기 분리된 OIP5 폴리펩티드의 방사선 활성은 OIP5 폴리펩티드의 인산화 반응 수준과 관련될 수 있다.
본 발명의 문맥에 있어서, 강력한 암의 예방 또는 치료활성을 갖는 후보 화합물이 동정될 수 있다. 이러한 후보 화합물의 치료학적 활성은 암의 치료 약물을 동정하기 위한 두 번째 및/또는 추가적인 스크리닝 방법에 의해서 측정될 수 있다. 예를 들어, OIP5 단백질에 결합하는 화합물은 암의 상기 기재된 암의 활성을 억제하는 경우, 이는 이러한 화합물이 OIP5 특이적인 치료학적 효과가 있다고 결론내릴 수 있다.
본 발명의 측면은 청구항에 기재된 본 발명의 범위를 한정하지 않는, 하기 실시예에 기재되었다.
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학적 용어들은 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본 발명에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료는 본 발명의 실행 또는 실험에 이용될 수 있으며, 적합한 방법 및 재료는 하기 기재된다.
실시예
본 발명은 청구항에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는, 하기의 실시예에서 자세하게 기재될 것이다.
재료 및 방법
세포주 및 조직 시료.
본 발명에서 사용된 15개의 인간 폐암 세포주는 5개의 선암(Adenocarcinomas, ADCs)(A549, LC319, PC-14, NCI-H1373, 및 NCI-H1781), 5개의 편평세포암종(squamous cell carcinoma, SCC)(SK-MES-1, LU61, NCI-H520, NCI-H1703, 및 NCI-H2170), 1개의 대세포암(large-cell carcinoma, LCC)(LX1), 및 4개의 소세포폐암(small-cell lung cancer, SCLCs)(DMS114, DMS273, SBC-3, 및 SBC-5)을 포함하였다. 상기 본 발명에서 사용된 인간 식도암 세포주는 하기이다; 9개의 SCC 세포주(TE1, TE2, TE3, TE4, TE5, TE6, TE8, TE9, 및 TE10) 및 1개의 ADC 세포주(TE7)(Nishihira T, et al., J Cancer Res Clin Oncol 1993;119:441-9). 모든 세포는 10% 소 태아 혈청(fetal calf serum, FCS)이 첨가된 적합한 배지의 단층에서 배양되며, 5% CO2를 갖고 있는 습한 공기의 37℃에서 유지되었다. 인간 소기관지 상피세포(small airway epithelial cell, SAEC)를 대조군으로서 사용하였고, Cambrex Bioscience, Inc.(East Rutherford, NJ)에서 나온 최적 배지(소기관지 성장 배지)에서 배양하였다. 1차 폐암 및 시료는 이전에 획득되었다. 본 발명 및 언급된 모든 임상 재료의 이용은 개체 보호시설 윤리 위원회(individual institutional Ethical Committees)의 승인을 받았다. 임상 단계는 UICC TNM 분류의 국제 조합에 따라 평가하였다(Sobin L and Wittekind Ch. 6th ed. New York: Wiley-Liss; 2002). 조직의 마이크로어레이에서, 면역 염색에 사용된 포르말린에 고정된 폐 종양 및 인접된 정상 폐 조직 시료는 훗카이도(Hokkaido) 대학(사포로, 일본)에서 치료 수술을 받고 있는 279명의 환자로부터 획득되었다(161명의 ADC, 96명의 SCC, 18명의 LCC, 4명의 ASC; 96명의 여성 및 183명의 남성 환자; 26 ~ 84세 범위, 평균 나이 63.3세). 또한, 280개의 포르말린에 고정된 1차 ESCC(27명의 여성 및 253명의 남성 환자; 38 ~ 82세 범위, 평균 나이 61.5세) 전체는 케이유카이(Keiyukai) 사포로 병원(사포로, 일본)에서 치료 수술을 받고 있는 환자로부터 획득되었다. 또한, 조직의 마이크로어레이에서, 면역 염색에 사용된 366개의 NSCLC(단계I-IIIA; 201 ADCs, 101 SCCs, 23 LCCs, 11 ASCs; 103 여성 및 233 남성 환자; 29 ~ 85세 범위, 평균 나이 66.0세) 및 정상 폐 조직 시료는 사이타마(Saitama) 암 센터(사이타마, 일본)로부터 획득되었다. 이러한 환자들은 이들의 주요 암의 절제를 받았으며, 그 중 양성 림프절 전이가 있는 환자만이 수술을 받은 후, 백금 기반의 보조 화학치료법으로 치료되었다. 포르말린 고정된 1차 221개의 ESCC(단계 I-IVA; 21 여성 및 200 남성 환자; 44세 ~ 79세 범위, 평균 나이 62세) 및 인접 정상 식도 조직 시료는 케이유카이(Keiyukai) 사포로 병원(사포로, 일본)에서 치료 수술을 받은 환자로부터 획득되었다. 76개의 ESCC(단계 I-IVB; 13 여성 및 63 남성 환자; 38세 ~ 84세, 평균나이 63세) 및 인접 정상 식도 조직시료 또한 훗카이도(Hokkaido) 대학 및 이의 부설 병원(사포로, 일본)에서 치료 수술을 받고 있는 환자로부터 획득되었다. 본 연구 및 모든 임상 재료의 이용은 개체 보호시설 윤리 위원회(individual institutional Ethical Committees)로부터 허가받았다.
반정량적 RT-PCR.
전체 RNA는 제조업자의 프로토콜에 따라, Trizol 시약(Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)을 이용하여, 배양된 세포 및 임상조직으로부터 추출되었다. 추출된 RNA 및 정상 인간 조직 폴리(A) RNA는 DNase I(Nippon Gene, Tokyo, Japan)로 처리되었으며, 올리고(dT) 프라이머 및 SuperScript II 역전사 효소(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 역으로 전사되었다. 반정량적 RT-PCR 실험은 하기의 OIP5 특이적 프라이머 또는 ACTB 특이적 프라이머를 내부 대조군으로 이용하여 수행되었다:
OIP5: 5'-CTTCAAGAATGGAGGGGAAA-3'(서열번호 1), 및
5'-GTATTCATAACAACTGCTCCATGC-3'(서열번호 2);
ACTB: 5'-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3'(서열번호 3) 및
5'-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3'(서열번호 4).
PCR 반응은 산물의 강도가 증폭의 선형단계에 있도록 사이클 수를 최적화하였다.
노던-블랏(Northern-blot) 분석.
인간 다중 조직 블랏(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)은 32P-표지된 OIP5의 PCT 산물과 혼성화되었다. 상기 OIP5의 cDNA 프로브는 하기의 프라이머들을 이용하여 RT-PCR에 의해서 제조되었다:
5'-CCAGTGACAAAATGGTGTGC-3'(서열번호 5), 및
5'-GTATTCATAACAACTGCTCCATGC-3'(서열번호 6).
전-혼성화(Pre-hybridization), 혼성화 및 세척은 제조사의 설명서에 따라 수행하였다. 상기 블랏은 -80℃에서 강화 스크린으로 7일 동안 방사능 현상하였다.
웨스턴 블랏팅(Western-blotting).
종양 조직 또는 세포는 용해 버퍼에서 용해되었다; 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5% NP40, 0.5% 소듐데옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 및 프로테아제 억제제 칵테일 세트(Protease Inhibitor Cocktail Set) III(Calbiochem). 증가된 화학발광(chemiluminescence) 웨스턴 블랏팅 분석 시스템(GE Healthcare Biosciences)은 이전에 기재된 바에 따라 이용되었다(Kato T, et al., Cancer Res 2005;65:5638-46). 상업적으로 이용가능한 인간 OIP5에 대한 토끼 다중클론성 항체(Catalog No. 12142-1-AP, Proteintech group. Inc.)는 폐암 및 식도암 세포주뿐만 아니라, 정상 기도 상피세포의 용해물을 이용한 웨스턴 블랏팅 분석에 의해서 내인성 OIP5 단백질에 특이적이라는 것을 확인하였다.
면역세포화학(Immunocytochemistry).
배양된 세포는 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 이용하여 고정되었으며, 상온에서 3분 동안 PBS에 희석된 0.1% Triton X-100을 이용하여 투과성있게(permeablilized) 하였다. 세포는 비특이적 결합을 방지하기 위하여, 상온에서 10분 동안 CASBLOCK(ZYMED)으로 덮었다. 그리소, 세포는 상온에서 60분 동안 1% BSA를 포함하고 있는 PBS에 희석된 1차 항체를 이용하여 배양되었다. PBS로 세철된 후, 상기 면역 복합체(immunocomplex)는 Alexa 488(Invitrogen)이 컨쥬게이트된 염소 항-토끼 2차 항체를 이용하여 염색되었다. 각각의 시료는 DAPI(4',6'-diamidine-2'-phenylindolendihydrochrolide)를 포함하고 있는 벡타실드(Vectashield)(Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA)를 이용하여 고정시켰으며, 스팩트럼 콘포칼 스캐닝 시스템(TSC SP2 AOBS; Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)으로 가시화하였다.
면역조직화학 및 조직 마이크로어레이(microarray) 분석.
종양 조직 마이크로어레이는 포르말린에 고정된 NSCLC를 이용하여, 이전에 발표된 바에 따라 구성되었다(Chin SF, et al., Mol Pathol 2003;56:275-9, Callagy G, et al., Diagn Mol Pathol 2003;12:27-34, Callagy G, et al. J Pathol 2005;205:388-96). 샘플링을 위한 조직영역은 슬라이드에서 상응하는 H&E-염색된 절편의 시각적 배열에 기초하여 선별되었다. 기증자의 종양 블록에서 유래한 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 조직 응어리(diameter, 0.6 mm; depth, 3-4 mm)을 조직 집적기(microarrayer)(Beecher Instruments, Sun Prairie, WI)와 함께 파라핀 블록에 위치시켰다. 정상 조직의 응어리는 각 케이스로부터 펀치되었다. 상기 결과의 마이크로어레이 블록의 5 ㎛ 절편을 면역조직화학 분석에 사용하였다. OIP5에 대한 양성은 임상 병리학적 데이타를 모르는, 염색 양성 또는 음성으로 기록하는 세 명의 독립적인 조사자에 의해서 반정량적으로 측정되었다. 폐암은 모든 검수자들이 그들을 정의한 경우에만, 양성으로 판정되었다.
임상 NSCLC에서 OIP5 과발현의 중요성을 조사하기 위하여, 조직 섹션은 ENVISION+ 키트/HRP(horseradish peroxidase; DakoCytomation, Glostrup, Denmark)을 이용하여 염색되었다. OIP5 항체(Proteintech group. Inc.)는 내인성 퍼옥시데이즈(peroxidase) 및 단백질을 블로킹(blocking)한 뒤, 첨가되었으며, 이러한 섹션은 HRP가 표지된 항-토끼 IgG를 2차 항체로서 이용하여 배양되었다. 기즐-크로모겐(Substrate-chromogen)이 첨가되었으며, 상기 시료는 헤마톡실린(hematoxylin)을 이용하여 대비염색(counterstain)되었다.
통계학적 분석
분할표(Contingency table)는 OIP5 발현과 NSCLC 환자에서 임상 병리학적 변수 사이의 관계를 분석하기 위하여 사용되었다. 종양 특이적 생존 곡선은 NSCLC와 관련된 수술날짜부터 사망 시기, 또는 이어진 관찰까지의 시기로부터 계산하였다. 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 곡선은 각각의 관련된 변수 및 OIP5 발현을 위해서 계산되었다; 환자 사이의 생존 시기 차이는 로그-순위 검정(log-rank test)을 이용하여 준석되었다. 단일 변수(Univariate) 및 다중 변수(multivariate) 분석은 임상병리학적 변수 및 암-관련된 사망 사이의 회합을 결정하기 위하여 콕스 비례 위험 회귀 모형(Cox proportional hazard regression model)으로 수행되었다. 첫 째, 사망과 연령, 성별, 병리학적 종양 분류(pT-classification) 및 병리학적 절 분류(pN-classification)를 포함하는 가능한 예후 인자 사이의 조합을 한번에 하나의 인자씩 고려하여 분석하였다. 둘째, 다중 변수 콕스 분석은 상기 모형에 항상 OIP5 발현을 강요하는 역행(단계적) 절차에서 0.05 이하의 P 값 항목 수준을 만족하는 어떤 및 모든 변수를 함께 적용하였다. 상기 모형이 인자들의 추가를 계속함으로써, 독립 인자는 P<0.05의 출구 수준을 초과하지 않았다.
RNA 간섭 분석(interference assay).
작은 간섭 RNA(siRNA) 듀플렉스(Dharmacon, Inc., Lafayette, CO)(100 pM)는 NSCLC 세포주인 A549에 30 ㎕의 Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 형질전환되었다. 상기 형질전환된 세포는 7일 동안 배양하였고, 상기 콜로니의 수를 Giemsa 염색에 의해서 계수하였으며; 세포의 생존 능력을 3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸리움 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)(MTT) 분석(cell counting kit-8 solution; Dojindo Laboratories, Kumanoto, Japan)을 통해 평가하였다. OIP5 mRNA 발현의 억제를 확인하기 위하여, 반정량적 RT-PCR 실험을 상기 기재한 바와 같이, OIP5에 특이적인 합성된 프라이머를 이용하여 수행하였다. 상기 RNA 간섭을 위한 합성된 올리고뉴클레오티드의 표적 서열은 하기와 같다:
대조군 1(Luciferase/LUC: Photinus pyralis luciferase gene): 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3'(서열번호 7);
대조군 2(On-Target plus/CNT; Dharmacon Inc.): 5'-UGGUUUACAUGUCGACUAA-3'(서열번호 8);
siRNA-OIP5-1: 5'-CGGCAUCGCUCACGUUGUGUU-3'(서열번호 9);
siRNA-OIP5-2: 5'-GUGACAAAAUGGUGUGCUAUU-3'(서열번호 10);
siRNA-Raf1-1: 5'-GCAAAGAACAUCAUCCAUA-3'(서열번호 15); 및
siRNA-Raf1-2: 5'-GACAUGAAAUCCAACAAUA-3'(서열번호 16).
세포 성장 분석.
COS-7 세포는 1×106 세포/100 mm 디쉬의 농도로 심어졌으며, OIP5(pcAGGSn3FC-OIP5-Flag) 또는 mock 플라스미드를 발현하도록 제작된 플라스미드를 이용하여 형질감염되었다. 세포는 0.4 ㎎/㎖의 제네티신(geneticin)(Invitrogen)을 포함하는 배지에서 7일 동안 선별되었으며, 세포 수는 MTT 분석(cell counting kit-8 solution; Dojindo Laboratories)에 의해서 측정되었다.
마트리겔 침습 분석(Matrigel invasion assay).
OIP5(pcAGGSn3FC-OIP5-Flag)를 발현하는 p3XFLAG-태그된 플라스미드 또는 mock 플라스미드 중 어느 하나로 형질감염된 COS-7 세포는 10% FCS를 포함하는 DMEM에서 포화에 거의 가깝도록 배양되었다. 상기 세포는 트립신처리(trypsinization)에 의해서 수득되고, 혈청 또는 프로테아제 억제제가 포함되지 않은 DMEM으로 세척하였으며, 1×105 세포/㎖의 농도가 되도록 DMEM에 현탁되었다. 상기 세포의 현탁을 만든기 전에, 마트리겔 매트릭스(matrigel matrix)(Becton Dickinson Labware)의 건조된 면을 상온에서 DMEM을 이용하여 다시 수화시켰다. 10% FCS를 포함한 DMEM(0.75 ㎖)은 각각의 24-웰 마트리겔 침습 챔버의 아래 챔버에 첨가하였으며, 세포 현탁액의 0.5 ㎖(5×104 세포)을 위쪽 챔버 각각의 인서트(insert)에 첨가하였다. 상기 인서트의 플레이트는 37℃에서 24시간 동안 배양되었다. 배양 후, 상기 챔버는 처리되었다; 상기 마트리겔을 통해서 침습한 세포는 고정되고, 제조업자(Becton Dickinson Labware)의 지시에 따라 Giemsa에 의해서 염색되었다
결과
OIP5는 폐암 및 식도암 및 정상 조직에서 발현한다. 폐암 및 식도암을 위한 신규한 치료학적 약제 및/또는 바이오마커(biomarker) 개발을 위한 신규한 분자를 동정하기 위하여, 폐암 및 ESCC의 게놈-와이드 발현 프로파일 분석을 cDNA 마이크로어레이를 이용하여 수행하였다(Daigo Y and Nakamura Y, Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53, Kikuchi T, et al., Oncogene 2003;22:2192-205, Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res 2003;1:485-99, Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 2004;13:3029-43, Kikuchi T, et al., Int J Oncol 2006; 28:799-805, Taniwaki M, et al., Int J Oncol 2006;29:567-75, 및 Yamabuki T, et al., Int J Oncol 2006;28:1375-84). 스크리닝된 27,648개의 유전자 가운데, 증가된 OIP5 전사체의 발현(3배 또는 그 이상)은 상기 검사된 폐암 및 식도암 시료의 대부분에서 확인되었다. 이의 과발현은 반정량적 RT-PCR 실험 방법에 의해서 15개 폐암 조직 중 9개, 15개 폐암 세포주 중 15개, 10개의 ESCC 조직 중 6개, 및 10개의 ESCC 세포주 중 9개에서 확인되었다(도 1A 및 1B).
폐암 및 식도암 세포주에서 OIP5의 높은 수준의 발현은 항-OIP5 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석에 의해서 또한 확인되었다(도 5A). OIP5 단백질은 상기 OIP5 단백질의 변이 가능성을 나타내는, 웨스턴 블랏팅에 의해서 이중 밴드(double band)로서 검출되었다. 따라서, 내인성 OIP5가 과발현되는 SBC-5 세포 추출물과 OIP5를 발현하는 플라스미드(pcAGGSn3FC-OIP5-Flag)를 형질감염시킨 COS-7 세포은 단백질 포스파타아제(phosphatase)(New England Biolabs)가 있는 상태 또는 없는 상태에서 배양하였으며, 웨스턴 블랏 분석에 의해서 OIP5 단백질의 분자량을 분석하였다. 상기 포스파타아제가 처리된 추출물 내 주요한 내인성 및 외인성 OIP5 단백질 모두의 측정된 무게는 처리되지 않은 세포에 비하여 작았다. 상기 데이타는 OIP5가 세포 내에서 인산화될 가능성이 있다는 것을 나타냈다(도 4). 면역형광 분석은 폐암 세포주 SBC-5에서 내인성 OIP5의 세포 내 위치를 파악하기 위하여 수행되었으며, OIP5가 핵 및 세포질 내에 위치한다는 것을 확인하였다(도 1C, 도 5B). 프로브로서 OIP5 cDNA를 이용한 노던 블랏 분석은 분석된 16개 조직(도 1D) 또는 23개 조직(도 6A) 가운데 오직 정소에서만 1.5kb 전사체에 상응되는 강한 신호를 확인하였다. 더욱이, 6개의 정상 조직(간, 심장, 신장, 폐, 식도 및 정소)에서 OIP5 단백질 발현은 면역조직화학법에 의하여 항-OIP5 다중클론성 항체를 이용하여 폐암 및 식도암에서의 OIP5 단백질 발현과 비교되었다. OIP5는 정소 세포의 핵및 세포질 및 폐암 및 식도암 세포에서 다량으로 검출되었다; 그러나, 이의 발현은 나머지 5개의 정상 조직에서는 거의 검출되지 않았다(도 6B). 폐암 조직에서 획득된 항-OIP5 항체에 의한 양성 신호는 재조합 인간 OIP5와 상기 항체를 전배양시킴으로써 감소하였으며, 이는 OIP5 단백질에 대한 높은 특이성을 나타낸다(도 9A)
OIP5 발현과 NSCLC 환자 및 ESCC의 좋지 않은 예후와의 관련성.
그 뒤, 외과적으로 절제된 NSCLC에서의 OIP5 발현의 관련성은 다양한 임상병리학적 변수와 검사되었다. OIP5의 임상병리학적 중요성을 확인하기 위하여, OIP5 단백질의 발현은 추가로 치료 수술 반응을 겪은 419명의 환자로부터 얻은 폐암 조직을 포함하는 조직 마이크로어레이 방법에 의해서 수행되었다. 양성 염색은 262개의 ADC 종양 중 163개(62.2%), 및 157개의 비-ADC 종양 중 139개에서 관찰되었다(도 2A). 그리고, OIP5 발현(양성 대 음성)과 다양한 임상 병리학적 변수와의 관련성을 검사하였으며, 조직학의 관련성(비선암에서 높음; 카이 스퀘어 테스트(Chi-square test)에 의하여, P <0.0001 ; 표 1)이 발견되었다. 상기 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 방법은 NSCLC에서 OIP5 상태와 종양 특이적 생존률 사이의 중요한 관계(OIP5 양성 사례에서 짧은 생존기간; 로그-순위 테스트(log-rank test)에 의하여, P = 0.0099; 도 2B)를 나타낸다. 단일변수(univariate) 분석에 의해서, 조직학(선암 대 비선암), 종양 크기(pT1 대 pT2-4), 림프절 전이(pNO 대 pN1-3), 나이(65세 이하 대 65 이상), 성별(여성 대 남성), 및 OOP5 양성(음성 대 양성)은 모두 NSCLC 환자의 좋지 않은 종양 특이적 생존율과 유의적으로 관련되었다(표 2). 더욱이, 콕스 비례 위험 회귀 모형(Cox proportional hazard regression model)을 이용한 다중변이 분석은 pT 단계, pN 단계, 나이 및 양성 OIP5 염색이 NSCLC의 예후 인자에 의존적이지 않다는 것을 나타낸다(표 2).
Figure pct00001

Figure pct00002
상기 OIP5의 임상 병리학적 중요성을 확인하기 위하여, 추가로 OIP5 단백질의 발현을 수술 절제를 받은 336 NSCLC 및 297 ESCC 환자로부터 얻은 폐암 조직을 포함하는 조직 마이크로어레이의 방법에 의해서 검사하였다. 양성 염색은 201개의 ADC 종양 중 131개에서 관찰되었으며(65.2%), 135개의 비ADC 종양 중 118개에서 관찰되었다(87.4%)(도 7A). 그리고, OIP5 발현(양성 대 음성)과 다양한 임상 병리학적 변수 사이의 관련성이 측정되었으며, 이는 조직학(비선암에서 높음, Fisher's exact test에 의하여, P < 0.0001) 및 종양 크기(pT2-T3에서 높음; Fisher's exact test에 의하여, P = 0.0318) 및 흡연(흡연자에서 높음, Fisher's exact test에 의하여, P = 0.0187)의 유의한 관련성이 관찰되었다(표 3A). 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 방법은 OIP5 양성과 NSCLC 환자의 짧은 종양 특이적 생존률 사이의 유의적인 관련성을 나타낸다(로그 수위 테스트에 의하여, P = 0.0053; 도 7B). 단일변수 분석에 의하여 비선암 조직학, 커다란 종양 크기(pT2-3), 림프절 전이의 존재(pN1-2), 노인(65세 이상), 남성(여성 대 남성), 및 OIP5 양성은 NSCLC 환자의 좋지 않은 종양 특이적 생존과 유의적으로 관련이 있었다(표 4). 더욱이, 콕스 비례 위험 회귀 모형(Cox proportional hazard regression model)을 이용한 다중변이 분석은 pT 단계, pN 단계, 나이 및 OIP5 양성 염색이 NSCLC 환자의 예후 인자와 의존적이지 않다는 것을 나타낸다(표 3B).
Figure pct00003

Figure pct00004

반면, OIP5 양성 염색은 297개의 수술적으로 절개된 식도암 중 172개에서 관찰된 반면(57.9%), 인접한 정상 식도 조직에서는 전혀 염색이 관찰되지 않았다(도 7C). OIP5 발현(양성 대 음성)과 다양한 임상 병리학적 변수와의 관련성이 관찰되었으며, 종양 크기(pT2-T3에서 높음, Fisher's exact test에 의하면 P = 0.004) 및
림프절 변이(pN1-N2에서 높음, Fisher's exact test에 의하면 P = 0.0052)와 유의한 관련성이 관찰되었다(표 4A). 상기 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 분석은 OIP5 양성과 ESCC 환자의 짧은 종양 특이적 생존 기간 사이의 유의한 관련성(로그 순위 테스트에 의하면, P = 0.0129; 도 7D)을 나타낸다. 단일변수 분석에 의하면, 커다란 종양 크기(pT2-3), 림프절 전이 양성(pN1-2), 남성, 및 OIP5 양성은 ESCC 환자의 낮은 종양 특이적 생존과 유의적으로 관련이 있었다(표 4B). 다중변이 분석에서, OIP5 상태는 본 연구에 등록된 수술을 받은 ESCC 환자의 독립적인 예후 인자로서, 통계학적으로 유의한 수준에 도달하지 못하였으나, pT와 pN 단계뿐만 아니라 나이는 통계학적으로 유의한 수준에 도달하였으며, 이는 식도암에서 OIP5 발현과 이러한 임상 병리학적 인자의 관련성을 제시한다(표 4B).
Figure pct00005

Figure pct00006

OIP5의 세포 성장 및 침습에 미치는 영향.
폐암 세포의 성장 또는 생존에 있어서, OIP5 과발현의 역할의 여부를 측정하기 위하여, OIP5(si-1 및 -2)에 대한 siRNA를 2개의 다른 대조군(LUC 및 CNT에 대한 siRNA)와 함께 LC319 및 SBC-5 세포에 내인성 OIP5의 발현을 억제하기 위하여 형질감염시켰다(도 3A). 상기 si-1, si-2가 형질감염된 세포에서 OIP5의 발현 수준은 2개의 대조군 siRNA에 비하여 현저하게 감소되었다(도 3A, 상위 패널). MTT 및 콜로니 형성 분석에 의해서 측정된 세포 생존율 및 콜로니 수는 si-1 또는 si-2가 형질감염된 세포에서 대조군 siRNA가 형질감염된 세포에 비하여 현저하게 rkat되었다(도 3A, 중간 패널).
종양 전이에 있어서, OIP5의 잠재적인 역할을 검사하기 위하여, OIP5(pcAGGSn3FC-OIP5-Flag)를 발현하도록 제작된 플라스미드를 제조하였으며, COS-7 세포에 형질감염시켰다. 웨스턴 블랏 분석에 의하여 OIP5 발현을 확인한 후, MTT 및 콜로니 형성 분석을 수행하였으며, 그리고 OIP5-COS-7 세포의 성장이 mock 벡터를 형질감염시킨 COS-7 세포에 비하여 현저한 수준으로 촉진된 것을 확인할 수 있었다(도 3B, 왼쪽 하단 및 오른쪽 패널). 또한, COS-7-OIP5 세포는 대조군 세포에 비하여 커다란 콜로니를 형성하려는 경향성이 매우 컸으며, 이는 OIP5가 포유류 세포에서 종양 발생 활성을 갖고 있다는 것을 의미한다.
마트리겔 침습 분석(Matrigel invasion assays)은 OIP5가 세포 침습 활성에 있어서 특정 역할을 수행하는지의 여부를 확인하기 위하여 수행되었다. 마트리겔을 통한 COS-7-OIP5 세포의 침습이 mock 플라스미드를 형질감염시킨 대조군 세포에 비하여 현저하게 증가하였다(도 9B). 이러한 결과는 OIP5가 높은 악성 암 세포의 표현형에 독립적으로 기여할 수 있다는 것을 의미한다.
Raf1과의 상호작용을 통한 OIP5 단백질의 안정화.
발암작용에서 OIP5 활성의 생물학적 중요성을 파악하기 위하여, 암 세포에서 OIP5와 상호작용하는 단백질을 동정하고자 하였다. 포유류 세포에서 이들의 생리학적 상호작용 및 기능이 아직 밝혀지지 않았음에도, "베이트(bait)"로서 인간 Raf1의 N-말단 조절 도메인으로 이용한 완전한 효모 투-하이브리드(yeast two-hybrid) 스크리닝 방법에 관한 이전의 보고서는 OIP5가 Raf1과 상호작용하는 20개 후보 파트너 중 하나로 가리키고 있다(Yuryev A and Wennogle LP. Genomics 2003;81:112-25.). Raf1은 다양한 범위의 종양 종류에서 활성화된다고 알려져 있으며, 이는 세포 성장 및 증식에서부터 생존 및 이동의 반응의 케스케이드(cascade)를 유발한다(Yuryev A and Wennogle LP. Genomics 2003;81:112-25.). 따라서, 우선 OIP5가 생리학적으로 Raf1과 관련성이 있는지의 여부를 조사하였다. Flag 태그된 OIP5를 발현하는 플라스미드를 형질감염시킨 COS-7 세포에서 항-Flag 항체를 이용한 면역침전 후, 항 Raf1 항체를 이용한 면역블랏팅은 외인성 OIP5와 내인성 Raf1의 상호작용을 나타낸다(도 8A). 그리고, OIP5와 Raf1 단백질 사이의 직접적인 상호작용은 풀-다운(pull-down) 분석에 의해서 확인되었다. OIP5 단백질의 풀-다운은 항-His 항체를 이용하여 수행되었으며, His-태그된 OIP5 및 GST-융합된 재조합 Raf1 단백질 혼합물과 배양되었다. 그리고, OIP5-결합 Raf1 단백질은 Raf1에 대한 다중클론성 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅에 의해서 검출되었다(도 9C). 그리고, 인간 폐암 세포주에서 OIP5 발현은 반정량적 RT-PCR 실험(도 9D) 및 웨스턴 블랏팅(도 8B)에 의해서 확인되었으며, 대부분의 폐암 세포에서 OIP5와 Raf1의 공동 발현이 확인되었으며, 이는 폐암 세포에서 이러한 2개의 단백질이 복합체 형성의 가능성을 나타낸다.
Raf1의 발현이 암 세포에서 OIP5 기능 조절에 있어서 기능을 수행하는지의 여부를 더욱 자세히 측정하기 위하여, Raf1의 생물학적 중요성을 Raf1에 대한 siRNA를 이용하여 측정하였다. 암 세포에서 Raf1의 OIP5 단백질 기능에 미치는 영향을 더욱 자세히 파악하기 위하여, SBC-5 세포에서 Raf1에 대한 siRNA를 형질감염시킨 후, 내인성 OIP5 단백질의 수준을 측정하였다. 흥미롭게도, OIP5 단백질의 수준은 siRaf1이 처리된 세포에서 감소한반면, OIP5 mRNA의 발현수준은 변화하지 않았다(도 8C, 왼쪽 패널). 반대로, Raf1의 과발현은 OIP5 단백질 발현수준을 증가시켰으나, 반면 OIP5 mRNA 발현수준은 변하지 않았으며(도 8C, 오른쪽 패널), 이는 OIP5 단백질의 안정성이 Raf1에 의해서 조절된다는 것을 나타낸다.
논의
근대의 수술 기술 및 보조 화학 방사선 치료의 발달에도, 폐암 및 ESCC의 예후는 악성 종양 가운데 좋지 않다고 알려져 있다. 몇몇의 분자 표적 약물들이 개발되어 왔으며, 암 치료법에서 이들의 효능이 증명되었다; 그러나 좋은 반응을 보이는 환자의 비율은 여전히 제한적이다(Ranson M, et al., J Clin Oncol 2002;20: 2240-50). 따라서, 최소한의 또는 전무한 부작용을 갖는, 악성 세포에만 특이적인 신규한 항암제의 개발이 시급하게 요구된다. 암 세포가 증가된 후, 101개의 폐암 및 19개의 ESCC 세포의 게놈-와이드 발현 프로파일 분석은 27,648개의 유전자를 포함하고 있는 cDNA 마이크로어레이를 이용한, 레이저 현미해부(laser microdissection)에 의해서 수행되었다(Daigo Y and Nakamura Y, Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53, Kikuchi T, et al., Oncogene 2003;22:2192-205, Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res 2003;1:485-99, Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 2004;13:3029-43, Kikuchi T, et al., Int J Oncol 2006; 28:799-805, Taniwaki M, et al., Int J Oncol 2006;29:567-75, 및 Yamabuki T, et al., Int J Oncol 2006;28:1375-84). 본 발명자들은 게놈-와이드 발현 분석에 의한 후보 분자의 스크리닝과 RNAi 기술을 이용한, 기능 손실 효과의 고속 대량 스크리닝을 결합한 전략을 택했으며, 조직 마이크로어레이에서 다량의 임상 시료 가운데 단백질의 체계적인 분석을 수행하였다(Suzuki C, et al., Cancer Res 2003;63:7038-41, Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res 2004;10:8363-70, Kato T, et al., Cancer Res 2005;65:5638-46, Furukawa C, et al., Cancer Res 2005;65:7102-10, Ishikawa N, et al., Cancer Res 2005; 65:9176-84, Suzuki C, et al., Cancer Res 2005;65:11314-25, Ishikawa N, et al., Cancer Sci 2006;97:737-45, Takahashi K, et al. Cancer Res 2006;66:9408-19, Hayama S, et al., Cancer Res 2006;66:10339-48, Kato T, et al., Clin Cancer Res 2007;13:434-42, Suzuki C, et al., Mol Cancer Ther 2007;6:542-51, Yamabuki T, et al., Cancer Res 2007;67:2517-25, Hayama S, et al., Cancer Res 2007;67:4113-22, Kato T, et al., Cancer Res 2007;67:8544-53, Taniwaki M, et al., Clin Cancer Res 2007;13:6624-31, Ishikawa N, et al., Cancer Res 2007;67:11601-11, Mano Y, et al., Cancer Sci 2007;98:1902-13, Suda T, et al., Cancer Sci 2007;98:1803-8, Kato T, et al., Clin Cancer Res 2008;14:2363-70, 및 Mizukami Y, et al., Cancer Sci 2008;99:1448-54). 그 결과, OIP5는 종종 임상 폐암 및 식도암 시료에서 과 발현되는 것이 나타났으며, 상기 유전자 산물은 생존/성장 및 암 세포의 암 성향을 증가시키는데 필수불가결하다는 것을 밝혔다.
OIP5 단백질은 코일드-코일(coiled-coil) 도메인을 갖는 229-아미노산 단백질을 암호화한다. OIP5는 효모 투-하이브리드(yeast two-hybrid) 분석에 의해서 Opa(Neisseria Gonorrhoeae opacity-associated) 단백질과 상호작용을 한다는 것이 확인되었으며(Williams, J. M., et al., Mol Microbiol 1998; 27(1): 171-86), 이는 임균 부착에서 이의 관련성 및 인간 상피 세포로의 침습을 의미한다. 또한, OIP5는 완전한 효모 투-하이브리드 분석에 의해서, Raf1과 상호작용한다는 것이 나타났다(Yuryev, A. and L. P. Wennogle, Genomics 2003; 81(2): 112-25). OIP5는 라미나 관련 폴리펩티드(Lamina-associated polypeptide, LAP2a)와 결합함으로써, 핵 단백질로서 세포 주기 제어(cell cycle exit)에 관련된다는 것을 제시한다(Naetar, N., et al., J Cell Sci 2007; 120(Pt 5): 737-47).
본 발명에서, OIP5 단백질은 종종 폐암 및 식도암에서 과발현되며, 이러한 암의 발달에 있어서 중요한 역할을 수행할 수도 있다.
폐암 세포에서 siRNA에 의한 OIP5 발현의 넉다운(knockdown)은 세포 성장의 억제를 만든다. 더욱이, 본 발명자들의 조직-마이크로어레이 실험을 통해서 획득한 임상 병리학적 증거는 OIP5 양성 종양을 갖는 NSCLC 환자가 OIP5-음성 종양을 갖는 환자에 비하여 암 특이적 생존 기간이 짧다는 것을 나타냈다. 중요하게, Raf1은 암세포에서 OIP5와 상호작용 및 안정화시킬 수 있다. 상기 시험관 내 및 생체 내 분석에서 얻은 결과는 OIP5가 중요한 성장 요소일 수 있으며, 폐암 세포의 악성 표현형에 더욱 관련될 수 있다는 것을 강력하게 제시한다. 더욱이, OIP5 기작의 연구는 발암 작용에 있어서 발암 유전자 활성의 기작을 더욱 잘 이해할 수 있도록 이끌었다. 추가로, 이러한 결과는 OIP5가 Raf1 기작의 구성성분 중 하나로서, 암 세포의 성장/생존에 있어서 중요한 역할을 수행한다는 것을 제시하기 때문에, 비록 OIP5 발암 유전자의 기작에 대한 폭넓은 이해가 필요한 OIP5 기작의 자세한 연구가 필요할지라도, Raf1과 OIP5 사이의 기능적 상호작용의 선택적 표적화는 치료학적 전략으로 유용할 수 있다.
OIP5는 전형적인 정속항원의 하나로서 분류되기 때문에, 분자 표적화제에 의한 OIP5 활성의 선택적인 억제는 암에 대하여 최소한의 부작용을 갖는 강력한 생물학적 활성이 있을 것으로 예상되는 치료학적 전략이 될 수 있다.
요약하면, OIP5는 Raf1과 상호작용에 의한 폐암 및 식도암의 성장에 있어서 중요한 역할을 수행할 수 있다. 절제된 시료에서 OIP5의 과발현은 예후가 나쁠 수 있는 환자의 보조 치료의 활용을 위한 지표로서 유용할 수 있다. 추가로, 상기 데이타는 인간 암 치료를 위한 OIP5를 특이적으로 표적화하는 신규한 항암 약물 및 암 백신을 제조하는 가능성을 강하게 제시한다.
본 명세서이 기재된 레이저-캡쳐 절제(laser-capture dissection) 및 게놈-와이드 cDNA 마이크로어레이를 이용한 암의 유전자 분석은 암의 예방 및 치료법을 위한 표적으로서 특정한 유전자를 규명하였다. 차별적으로 발현하는 OIP5 유전자의 발현에 기반하여, 본 발명은 암, 구체적으로 폐 및/또는 식도암의 동정 및 검출을 위한 진단학적 분자 마커를 제공한다.
본 명세서에서 제공되는 데이타는 암의 폭넓은 이해에 첨가되며, 신규한 진단학적 전략의 발달을 촉진하며, 치료 약물 및 예방 약물을 위한 분작 표적의 확인을 위한 단서를 제공한다. 이러한 정보는 종양형성(tumorigenesis)의 보다 폭넓은 이해에 기여하며, 암의 진단, 치료, 및 최종적으로 예방을 위한 신규한 전략을 개발하는 지표를 제공한다.
본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 출판물은 그 전체가 참조로서 통합된다.
더욱이, 본 발명은 이의 특이적인 실시예를 참조로 하여 상세히 기재되었으나, 이는 상기 기재가 사실상 예시적이며 설명적이고, 본 발명 및 이의 바람직한 실시예를 나타내려는 것으로 이해될 수 있다. 일반화된 실험을 통해서, 당업자는 다양한 변화 및 변형이 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않은 채로 만들어질 수 있다고 쉽게 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 상기 기재에 의해서 정의되지 않고, 하기의 청구항 및 이의 균등물에 의해서 정의되는 것으로 의도된다.
<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> OIP5 as a Target Gene for Cancer Therapy and Diagnosis <130> 11fpi-02-09 <150> US 61/190,530 <151> 2008-08-28 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400> 1 cttcaagaat ggaggggaaa 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400> 2 gtattcataa caactgctcc atgc 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400> 3 gaggtgatag cattgctttc g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400> 4 caagtcagtg tacaggtaag c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer for Northern blot <400> 5 ccagtgacaa aatggtgtgc 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized 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Ser Gly Thr Gln Glu Lys Asn Lys Ile Arg Pro Arg Gly Gln Arg 325 330 335 Asp Ser Ser Tyr Tyr Trp Glu Ile Glu Ala Ser Glu Val Met Leu Ser 340 345 350 Thr Arg Ile Gly Ser Gly Ser Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Lys Trp 355 360 365 His Gly Asp Val Ala Val Lys Ile Leu Lys Val Val Asp Pro Thr Pro 370 375 380 Glu Gln Phe Gln Ala Phe Arg Asn Glu Val Ala Val Leu Arg Lys Thr 385 390 395 400 Arg His Val Asn Ile Leu Leu Phe Met Gly Tyr Met Thr Lys Asp Asn 405 410 415 Leu Ala Ile Val Thr Gln Trp Cys Glu Gly Ser Ser Leu Tyr Lys His 420 425 430 Leu His Val Gln Glu Thr Lys Phe Gln Met Phe Gln Leu Ile Asp Ile 435 440 445 Ala Arg Gln Thr Ala Gln Gly Met Asp Tyr Leu His Ala Lys Asn Ile 450 455 460 Ile His Arg Asp Met Lys Ser Asn Asn Ile Phe Leu His Glu Gly Leu 465 470 475 480 Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val Lys Ser Arg Trp 485 490 495 Ser Gly Ser Gln Gln Val Glu Gln Pro Thr Gly Ser Val Leu Trp Met 500 505 510 Ala Pro Glu Val Ile Arg Met Gln Asp Asn Asn Pro Phe Ser Phe Gln 515 520 525 Ser Asp Val Tyr Ser Tyr Gly Ile Val Leu Tyr Glu Leu Met Thr Gly 530 535 540 Glu Leu Pro Tyr Ser His Ile Asn Asn Arg Asp Gln Ile Ile Phe Met 545 550 555 560 Val Gly Arg Gly Tyr Ala Ser Pro Asp Leu Ser Lys Leu Tyr Lys Asn 565 570 575 Cys Pro Lys Ala Met Lys Arg Leu Val Ala Asp Cys Val Lys Lys Val 580 585 590 Lys Glu Glu Arg Pro Leu Phe Pro Gln Ile Leu Ser Ser Ile Glu Leu 595 600 605 Leu Gln His Ser Leu Pro Lys Ile Asn Arg Ser Ala Ser Glu Pro Ser 610 615 620 Leu His Arg Ala Ala His Thr Glu Asp Ile Asn Ala Cys Thr Leu Thr 625 630 635 640 Thr Ser Pro Arg Leu Pro Val Phe 645

Claims (31)

  1. 하기 (a) 및 (b)의 단계를 포함하는, 폐 및/또는 식도암 진단 방법:
    (a) 하기(i) 내지 (iii)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법에 의해서 개체 유래 생물학적 시료에서 OIP5 유전자의 발현수준을 확인하는 단계:
    (i) 상기 OIP5 유전자의 mRNA를 검출하기,
    (ii) 상기 OIP5 유전자에 의해서 암호화된 단백질을 검출하기, 및
    (iii) 상기 OIP5 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 생물학적 활성을 검출하기; 및
    (b) 폐 및/또는 식도암에 존재하는 유전자의 정상 대조군 수준에 비하여, 단계(a)에서 결정된 발현수준이 증가한 것을 연관시키는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 결정된 발현수준이 정상 대조군 수준보다 적어도 10% 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 결정된 발현수준이 OIP5 단백질에 대한 항체의 결합을 검출하는 것에 의해서 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 개체 유래 생물학적 시료는 생검(biopsy)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 하기의 단계를 포함하는, 폐 및/또는 식도암 환자의 예후를 측정 또는 확인하는 방법:
    (a) 환자 유래 생물학적 시료에서 OIP5 유전자의 발현수준 검출하는 단계;
    (b) 대조군 수준에 비하여 검출된 발현수준 비교하는 단계; 및
    (c) (b)와의 비교를 근거로 상기 환자의 예후를 결정하는 단계.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 대조군 수준은 양호한 예후의 대조군 수준이며, 대조군 수준에 비하여 발현수준의 증가는 좋지 않은 예후로 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 증가는 상기 대조군 수준에 비하여 최소 10% 증가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 발현수준은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법에 의해서 결정되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) OIP5 유전자의 mRNA를 검출하기;
    (b) 상기 OIP5 유전자에 의해서 암호화된 단백질 검출하기, 및
    (c) 상기 OIP5 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 생물학적 활성 검출하기.
  9. 제 5항에 있어서, 상기 환자 유래 생물학적 시료는 생검(biopsy)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 시약을 포함하는, 폐 및/또는 식도암 진단 또는 폐 및/또는 식도암 환자의 예후 측정 또는 결정용 키트:
    (a) OIP5 유전자의 mRNA 검출용 시약;
    (b) OIP5 유전자에 의해서 암호화된 단백질 검출용 시약; 및
    (c) OIP5 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 생물학적 활성 검출용 시약.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 시약은 상기 유전자의 유전자 전사체(transcript)에 대한 프로브(probe)인 것을 특징으로 하는 키트.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 시약은 상기 유전자에 의해서 암호화된 단백질에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 키트.
  13. 세포에 도입되었을 때, OIP5 유전자의 생체내(in vivo) 발현을 억제할 뿐만 아니라 세포의 증식을 억제하는, 분리된 이중가닥 분자로서, 상기 분자는 센스가닥 및 이에 상보적인 안테신스 가닥을 포함하고, 상기 가닥들은 이중갇가 분자를 형성하기 위해 혼성화되며, 여기서 상기 센스가닥은 서열번호 13의 연속적인 서열에 상응되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 이중가닥 분자.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 센스가닥(sense strand)은 서열번호 11 및 12로 구성되는 군으로부터 선택되는 표적 서열에 상응되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분자.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 이중가닥 분자는 약 19 내지 약 25개의 길이 사이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)인 것을 특징으로 하는 분자.
  16. 개재 단일 가닥(intervening single-strand)에 의해서 연결된 센스(sense) 및 안티센스가닥(antsense strand)을 모두 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)로 구성된 제13항의 이중가닥 분자.
  17. [A]는 서열번호 11 및 12로 구성된 군으로부터 선택되는 표적서열에 상응되는 서열을 포함하는 센스가닥(sense strand)이며, [B]는 3 내지 23 뉴클레오티드를 포함하는 개재 단일 가닥이며, 그리고 [A'] 는 [A]에 대한 상보적 서열을 포함하는 안티센스가닥(antsense strand)인, 화학 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'를 갖는 제 16항의 이중가닥 분자
  18. 제 13항 내지 제17항의 이중가닥 분자를 암호화하는 벡터.
  19. 제 13항 내지 제 17항의 분리된 이중가닥 분자 또는 제 18항의 벡터 중 적어도 하나를 투여하는 단계를 포함하는, OIP5 유전자 유전자를 발현하는 암의 치료 또는 예방 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 치료될 암은 폐 및/또는 식도암인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 13항 내지 제 17항의 분리된 이중가닥 분자 분자 또는 제 18항의 벡터 중 적어도 하나를 포함하는, OIP5 유전자를 발현하는 암의 치료 또는 예방용 조성물.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 치료될 암은 폐 및/또는 식도암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 하기의 단계를 포함하는, OIP5 유전자 과발현과 관련된 암의 치료 또는 예방, 또는 암 세포 성장을 억제하는 후보 화합물 스크리닝 방법:
    (a) 테스트 화합물과 OIP5 유전자의 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)에 의해서 암호화되는 폴리펩티드(polypeptide)를 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 폴리펩티드와 상기 테스트 화합물의 결합 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 폴리펩티드에 결합하는 테스트 화합물을 선별하는 단계.
  24. 하기의 단계를 포함하는, OIP5 유전자 과발현과 관련된 암의 치료 또는 예방, 또는 암 세포 성장을 억제하는 후보 화합물 스크리닝 방법:
    (a) 테스트 화합물과 OIP5 유전자의 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)에 의해서 암호화되는 폴리펩티드(polypeptide) 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 단계(a)의 폴리펩티드의 생물학적 활성 검출하는 단계; 및
    (c) 상기 테스트 화합물이 존재하지 않은 상태에서 검출된 폴리펩티드의 생물학적 활성에 비하여, 상기 OIP5 유전자의 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화되는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 테스트 화합물 선별하기.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 생물학적 활성은 상기 세포 증식의 촉진인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 하기의 단계를 포함하는, OIP5 유전자 과발현과 관련된 암의 치료 또는 예방, 또는 암 세포 성장을 억제하는 후보 화합물 스크리닝 방법:
    (a) 테스트 화합물과 OIP5 유전자를 발현하는 세포 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 테스트 화합물이 존재하지 않은 상태에서 검출된 발현수준에 비하여, 상기 OIP5 유전자의 발현수준을 감소시키는 테스트 화합물을 선별하는 단계.
  27. 하기의 단계를 포함하는, OIP5 유전자 과발현과 관련된 암의 치료 또는 예방, 또는 암 세포 성장을 억제하는 후보 화합물 스크리닝 방법:
    (a) 테스트 화합물과 OIP5 유전자의 전사조절부위(transcriptional regulatory region) 및 상기 전사조절부위의 조절 하에 발현되는 리포터(reporter) 유전자를 포함하는 벡터가 도입된 세포를 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 리포터(reporter) 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) 대조군에 비하여 상기 리포터(reporter) 유전자의 발현 또는 활성 수준을 감소시키는 테스트 화합물을 선별하는 단계.
  28. 하기의 단계를 포함하는, OIP5 유전자 과발현과 관련된 암의 치료 또는 예방, 또는 암 세포 성장을 억제하는 후보 화합물 스크리닝 방법:
    (a) 상기 테스트 화합물 존재 하에서, OIP5 폴리펩티드(polypeptide) 또는 이의 기능적 등가물과 Raf1 폴리펩티드(polypeptide) 또는 이의 기능적 등가물 접촉시키기;
    (b) 상기 폴리펩티드 사이의 결합 수준 검출하는 단계;
    (c) 상기 단계(b)에서 검출된 결합 수준을 상기 테스트 화합물의 부재하에서 검출된 결합 수준과 비교하는 단계; 및
    (d) 상기 단계(c)에서 테스트 화합물의 부재하에서 검출된 결합 수준과 비교하여 결합 수준을 감소시키는 테스트 화합물을 선별하는 단계.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 OIP5의 기능적 등가물은 Raf1-결합 도메인(domain)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 하기의 단계를 포함하는, OIP5 유전자 과발현과 관련된 암의 치료 또는 예방, 또는 암 세포 성장을 억제하는 후보 화합물 스크리닝 방법:
    (a) 인산화 반응을 위한 적합한 조건 하에서 테스트 화합물의 존재할 때, OIP5 폴리펩티드(polypeptide) 또는 이의 기능적 등가물과 Raf1 폴리펩티드(polypeptide) 또는 이의 기능적 등가물을 접촉시키기는 단계;
    (b) OIP5 폴리펩티드의 인산화 반응 수준을 검출하는 단계; 및
    (c) 테스트 화합물의 부재하에 검출된 인산화 반응 수준에 비하여, OIP5 폴리펩티드의 인산화 반응 수준을 감소시키는 테스트 화합물을 선별하는 단계.
  31. 제 23항, 제 24항, 제 26항, 제 27항, 제 28항 또는 제 20항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 암은 폐암 및 식도암에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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