KR20110061883A

KR20110061883A - Pharmaceutical composition for treatment and prevention of inflammatory disease comprising triterpenoid saponin compounds

Info

Publication number: KR20110061883A
Application number: KR1020090118418A
Authority: KR
Inventors: 노문철; 이우송; 이승웅; 장종선; 박수진; 류영배; 김민석
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-12-02
Filing date: 2009-12-02
Publication date: 2011-06-10

Abstract

PURPOSE: A pharmaceutical composition containing Bupleurum falcatum extract or triterpenoid saponin compounds is provided to suppress VCAM-1 and VLA-4-mediated cell adhesion and to prevent and treat inflammatory diseases. CONSTITUTION: A pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases contains Bupleurum falcatum extract or fraction thereof as an active ingredient. The extract is isolated using water, low alcohol of 1-4 carbon atoms, or mixture solvent thereof. The fraction is water, n-hexane, or chloroform fraction. The pharmaceutical composition also contains triterpenoid saponin compounds of chemical formula 1 or 2 as an active ingredient.

Description

Pharmaceutical composition for treatment and prevention of inflammatory disease comprising triterpenoid saponin compounds}

본 발명은 시호 추출물 또는 이의 분획물, 또는 이들로부터 유래된 트리터페노이드계 사포닌 화합물을 유효성분으로 하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 시호로부터 상기 화합물을 추출 및 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 시호 추출물 또는 이의 분획물, 또는 이들로부터 유래된 트리터페노이드계 사포닌 화합물은 특이적으로 혈관 세포 접착 분자-1 (vascular cell adhesion molecule-1: VCAM-1) 과 VLA-4 (CD49d/ CD29)간의 결합을 저해하여 다양한 염증성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for the prophylaxis and treatment of inflammatory diseases comprising an extract or a fraction thereof, or a triterpenoid-based saponin compound derived therefrom as an active ingredient. The invention also relates to a process for extracting and preparing said compounds from Shiho. Shiho extract of the present invention, or a fraction thereof, or a triterpenoid-based saponin compound derived from them specifically relates to vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) and VLA-4 (CD49d / CD29). By inhibiting the binding between) can be useful for the prevention and treatment of various inflammatory diseases.

천식과 같은 염증성 질환의 특징은 침범된 조직에서의 활성화된 백혈구의 축적이다. 백혈구가 혈관으로부터 염증 부위로 이행하는 과정은 다음의 4가지 주요한 단계를 거친다. : 1. tethering, 2. rolling, 3. 활성단계, 4.단단한 부착단계 및 이행 단계. 또한, 백혈구가 혈관으로부터 염증 부위로 이행하는 과정은 백혈구와 혈관내피세포와의 상호작용 캐스캐이드(cascade)를 포함한다 [Springer, T., Ann. Rev. Physiol., 57, 827, 1995]. 백혈구의 상피 부착은 상피세포 표면의 유도 가능한 부착 분자 수용체가 면역 세포상의 대응 수용체와 상호작용하면서 시작된다. 혈관상피세포는 혈관세포접착 분자-1 (vascular cell adhesion molecule-1: VCAM-1), 세포내 접착분자-1 (intracellular adhesion molecule-1: ICAM-1) 및 E-셀렉틴 (내피세포(endothelial cells)에 있는 셀렉틴)과 같은 특수한 접착 분자를 선택적으로 발현시킴으로써, 어떤 종류의 백혈구 (단핵세포, 임파구 또는 호중구)를 모집할 것인가를 결정한다. A characteristic of inflammatory diseases such as asthma is the accumulation of activated white blood cells in affected tissues. The process of leukocyte migration from blood vessels to the site of inflammation involves four major steps: 1. tethering, 2. rolling, 3. active, 4. solid attachment and transition. In addition, the process by which leukocytes migrate from blood vessels to sites of inflammation include a cascade of interactions of leukocytes with vascular endothelial cells [Springer, T., Ann. Rev. Physiol., 57, 827, 1995]. Epithelial adhesion of leukocytes begins with the inducible adhesion molecule receptors on the surface of epithelial cells interacting with corresponding receptors on immune cells. Vascular epithelial cells include vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin (endothelial cells By selectively expressing specific adhesion molecules, such as selectin), it is determined which kind of white blood cells (monocytes, lymphocytes or neutrophils) are recruited.

혈관세포접착 분자-1 (vascular cell adhesion molecule-1: VCAM-1)은 110kD의 당단백으로 6개의 면역 글로불린 도메인을 포함하며, 혈관 내피세포에서 처음 클로닝되었다. VCAM-1은 사이토카인들에 의해 발현이 증가하며, 베리 레이트 안티젠-4(VLA-4)의 리간드로 α4β1 인테그린과의 상호작용을 통해 단핵 백혈구가 염증장소로 유입되도록 유도하는 역할을 한다. 예컨대, 아테롬성 동맥경화증의 초기 단계에서는 인테그린 대응수용체인 VLA-4를 발현하는 단핵구의 선택적인 모집과 VCAM-1의 국소화된 상피 발현이 일어난다. 단핵구와 임파구 상의 VLA-4의 선택적인 발현으로 인해, VCAM-1은 단핵구의 선택적인 접착을 매개하는데 있어 중요하다. Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) is a 110kD glycoprotein that contains six immunoglobulin domains and was first cloned in vascular endothelial cells. VCAM-1 is increased in expression by cytokines and is responsible for inducing mononuclear leukocytes to enter the site of inflammation by interacting with α4β1 integrin as a ligand of variate antigen-4 (VLA-4). For example, in the early stages of atherosclerosis, selective recruitment of monocytes expressing the integrin corresponding receptor VLA-4 and localized epithelial expression of VCAM-1 occur. Due to the selective expression of VLA-4 on monocytes and lymphocytes, VCAM-1 is important in mediating the selective adhesion of monocytes.

베리 레이트 안티젠-4(VLA-4) 또는 CD49d/CD29로서 알려진 α4β1 인테그린은 모두 다양한 염증성 질환에 있어서 중요한 세포인 단핵구, 림프구, 호산구 및 호염기구 상에서 발현되며 [Helmer, M., Ann. Rev. Immunol,. 8, 365, 1990], 혈관 세포 접착 분자-1(VCAM-1)과 세포외 단백질 파이브로넥틴(fibronectin, FN)을 위한 수용체로서 작용한다 [Elices et al., Cell, 60, 577, 1990]. Α4β1 integrins, also known as Beryl Rate Antigen-4 (VLA-4) or CD49d / CD29, are expressed on monocytes, lymphocytes, eosinophils and basophils, which are important cells in various inflammatory diseases [Helmer, M., Ann. Rev. Immunol ,. 8, 365, 1990], serve as receptors for vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) and extracellular protein fibronectin (FN) [Elices et al., Cell, 60, 577, 1990]. .

VCAM-1 및 VLA-4 의 상호작용은 천식, 동맥경화, 류마티즈 관절염, 당뇨병, 지연성 알러지(IV형 알러지), 이식거부, 이식편 대 숙주 질환, 자가면역 뇌척수염, 전신 홍반성 낭창, 말라리아, 흑색종, 림프종, 악성 종양, 다발성 경화증, 크론병, 염증성 장질환, 관절염, 피부염, 건선, 낭포성 섬유증, 당뇨성 망막증, 비염, 허혈성-재관류 손상, 혈관 재협착, 만성 폐색성 폐성 질환(COPD), 사구체신염, 그래이브 질환, 위장관 알레르기, 관상동맥 질환, 협심증, 소혈관 질환 및 말라리아 등 여러 염증성 질환과 관련이 있다.Interactions of VCAM-1 and VLA-4 include asthma, arteriosclerosis, rheumatoid arthritis, diabetes, delayed allergy (type IV allergy), transplant rejection, graft-versus-host disease, autoimmune encephalomyelitis, systemic lupus erythematosus, malaria, Melanoma, lymphoma, malignant tumor, multiple sclerosis, Crohn's disease, inflammatory bowel disease, arthritis, dermatitis, psoriasis, cystic fibrosis, diabetic retinopathy, rhinitis, ischemic-reperfusion injury, vascular restenosis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD ), Glomerulonephritis, grave disease, gastrointestinal allergy, coronary artery disease, angina, small vessel disease and malaria.

구체적으로, VCAM-1 및 VLA-4 은 천식, 동맥경화, 류마티즈 관절염 및 자가면역성 당뇨병과 같은 만성적인 염증성 질환의 매개체로 알려져 있다. 특히, VCAM-1과 VLA-4의 발현은 천식 환자에게서 증가되는 것으로 알려져 있으며 [Pilewski et al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 12, 1, 1995; Ohkawara et al, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol,, 12, 4, 1995],. VLA-4 항원을 처리하였을 시 알레르기성 천식이 유도된 쥐 [Borchers et al, Am. J. Physiol., 280, 813, 2001; Henserson et al, J. Clin. Invest., 100, 3083, 1997], 랫트 [Richards et al, J. Respir, Cell Mol. Biol., 15, 172, 1996] 그리고 돼지모델 [Sagara et al, Int. Arch. Allergy Immunol., 112, 287, 1997] 에서 호산구의 축적을 저해하는 것으로 보고되고 있다. 따라서, 적합한 길항제에 의한 VLA-4 차단은 특히, 천식 및 염증성 장질환을 포함한 다양한 염증성 질한의 치료에 효과적일 수 있으며, VLA-4의 생리학적 리간드인 VCAM-1 및 피브로넥틴과의 결합 차단은 관절 염증 진행을 효과적으로 예방하거나 완화시킬 수 있다. VLA-4를 차단함으로서 보조 관절염이 있는 루이스 랫트에 대해 항체 HP2/1로 실험한 결과 질환을 효과적으로 예방하는 것으로 확인되었다 [Barbadillo et al., Springer Semin. Immunopathol., 16, 427, 1995]. Specifically, VCAM-1 and VLA-4 are known mediators of chronic inflammatory diseases such as asthma, arteriosclerosis, rheumatoid arthritis and autoimmune diabetes. In particular, expression of VCAM-1 and VLA-4 is known to be increased in asthmatic patients [Pilewski et al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 12, 1, 1995; Ohkawara et al, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol ,, 12, 4, 1995]. Allergic asthma induced mice treated with VLA-4 antigen [Borchers et al, Am. J. Physiol., 280, 813, 2001; Henserson et al, J. Clin. Invest., 100, 3083, 1997, rats [Richards et al, J. Respir, Cell Mol. Biol., 15, 172, 1996] and the pig model [Sagara et al, Int. Arch. Allergy Immunol., 112, 287, 1997] have been reported to inhibit the accumulation of eosinophils. Thus, blocking VLA-4 by a suitable antagonist may be particularly effective in the treatment of various inflammatory vaginal disorders, including asthma and inflammatory bowel disease, and blocking binding to VCAM-1 and fibronectin, the physiological ligands of VLA-4 It can effectively prevent or alleviate the progression of inflammation. Experiments with antibodies HP2 / 1 against Lewis rats with adjuvant arthritis by blocking VLA-4 have been shown to effectively prevent disease [Barbadillo et al., Springer Semin. Immunopathol., 16, 427, 1995].

또한 VCAM-1 과 VLA-4의 결합을 차단하면 오브알부민-과민성 쥐 모델에서 급성 및 만성 알레르기성 기도 반응이 모두 억제됨이 보고되었으며 [Rabb et al, Am. J. Respir. Care Med. 149, 1186, 1994], VCAM-1 또는 VLA-4에 대한 무력화 항체는 생쥐 모델에서 당뇨병의 발병을 지연시켰다 [Yang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10494, 1993; Burkly et al, Diabetes, 43, 523, 1994; Baron et al, J. Clin. Invest., 93, 1700, 1994]. VCAM-1에 대한 모노클로날 항체 역시 동물 모델에서 이식 거부를 예방하는 효과를 나타내었다 [Oroez et al, Immunol. Lett., 32, 7, 1992].Blocking the binding of VCAM-1 and VLA-4 has also been reported to inhibit both acute and chronic allergic airway responses in the obalbumin-sensitive rat model [Rabb et al, Am. J. Respir. Care Med. 149, 1186, 1994], neutralizing antibodies to VCAM-1 or VLA-4 delayed the onset of diabetes in mouse models [Yang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10494, 1993; Burkly et al, Diabetes, 43, 523, 1994; Baron et al, J. Clin. Invest., 93, 1700, 1994]. Monoclonal antibodies against VCAM-1 have also been shown to prevent transplant rejection in animal models [Oroez et al, Immunol. Lett., 32, 7, 1992].

한편, 폐렴에 걸린 기니피그 모델(guinea pig model)에서 VLA-4에 대한 무력화 항체는 기관지 폐포 세척 유체에서 항원으로 유도된 기관지의 반응항진 및 백혈구 동원을 동시에 억제하며 [Pretolani et al., J. Exp. Med., 180, 795, 1994], VLA-4 또는 VCAM-1에 대한 항체는 쥐 기관지의 항원으로 유도된 호산구 침윤을 억제한다고 보고되었다 [Nakajima et al., J. Exp. Med., 179, 1145, 1994]. 또한 VLA-4 또는 VCAM-1 단클론성 항체 치료는 쥐 또는 원숭이의 피부에서의 지연된 과민성 반응 [Chisholm et al., Eur. J. Immunol., 23, 682, 1993; Silber et al., J. Clin. Invest., 93, 1554, 1993], 특이한 면역억제를 수반하는 쥐에서의 심장 동종이식 거부반응 [Isobe et al., J. Immunol.153, 5810, 1994], 골수 이식 후 쥐에서의 이식-대-숙주 질환 [Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10494, 1993], 및 랫트 및 쥐에서의 실험적인 자가면역 뇌척수염 [Yednock et al., Nature, 356, 63, 1992; Baron et al., J. Exp. Med., 177, 57, 1993]을 지연시키거나 억제시킨다. Meanwhile, in the guinea pig model of pneumonia, the neutralizing antibody against VLA-4 simultaneously inhibits antigen-induced bronchial hyperactivity and leukocyte recruitment in bronchoalveolar lavage fluid [Pretolani et al., J. Exp. . Med., 180, 795, 1994], antibodies to VLA-4 or VCAM-1 have been reported to inhibit eosinophil induction induced by antigens of rat bronchus [Nakajima et al., J. Exp. Med., 179, 1145, 1994]. VLA-4 or VCAM-1 monoclonal antibody treatment also delayed hypersensitivity reactions in the skin of rats or monkeys [Chisholm et al., Eur. J. Immunol., 23, 682, 1993; Silber et al., J. Clin. Invest., 93, 1554, 1993], Cardiac Allograft Rejection in Mice with Specific Immunosuppression [Isobe et al., J. Immunol. 153, 5810, 1994], Graft-versus in Mice after Bone Marrow Transplantation -Host disease [Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10494, 1993, and experimental autoimmune encephalomyelitis in rats and mice [Yednock et al., Nature, 356, 63, 1992; Baron et al., J. Exp. Med., 177, 57, 1993].

VLA-4 와 VCAM-1 의존성 세포 접착은 류마티즈 관절염 [Cronstein and Weismann, Arthritis Rheum., 36, 147, 1993; Elices et al., J. Clin. Invest., 93, 404, 1994], 당뇨병 [Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10494, 1993], 전신 홍반성 낭창 [Takeuchi et al., J. Clin. Invest., 92, 3008, 1993], 지연성 알러지(IV형 알러지) [Elices et al., Clin. Exp. Rheumatol., 11, 77, 1993], 복합 경화증 [Yednock et al., Nature 356, 63, 1992], 말라리아 [Ockenhouse et al., J. Exp. Med., 176, 1183, 1992], 동맥경화 [Obrien et al., J. Clin. Invest., 92, 945, 1993], 이식거부 [Isobe et al., Transplantation Proceedings, 26, 867, 1994], 흑색종과 같은 다양한 악성 종양 [Renkonen et al., Am. J. Pathol., 1992, 140, 763], 림프종 [Freedman et al., Blood, 1992, 79, 206], 다발성 경화증[Lee S.J. et al., J. Neuroimmunol., 98:77-88, 1998; Elovaara et al., Arch. Neurol. 57:546-511, 2000], 자가면역 뇌척수염 [Benveniste et al., J. Neuroimmunol. 98:77-88, 1999], 크론병[Jones et al., Gut, 36:72460, 1995; Goggins et al., Gastroenterology, 108:A825, 1995; Goekeand Manns, Gastroenterology, 106:A684, 1995] 및 건선 [Groves, R. W., J. Am. Acad. Dermatol., 29:67-72, 1993; Schopf, R. E., Br. J Dermatol., 128:34-37, 1993] 등 염증성 질환과 밀접하게 관련되어 있다. 이상의 결과로 볼 때 VCAM-1과 VLA-4는 염증성 질환에 있어서 중요한 치료적 표적 분자임을 알수 있다.VLA-4 and VCAM-1 dependent cell adhesion has been described in Cronstein and Weismann, Arthritis Rheum., 36, 147, 1993; Elices et al., J. Clin. Invest., 93, 404, 1994], diabetes [Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10494, 1993], systemic lupus erythematosus [Takeuchi et al., J. Clin. Invest., 92, 3008, 1993], delayed allergy (type IV allergy) [Elices et al., Clin. Exp. Rheumatol., 11, 77, 1993], complex sclerosis [Yednock et al., Nature 356, 63, 1992], malaria [Ockenhouse et al., J. Exp. Med., 176, 1183, 1992], atherosclerosis [Obrien et al., J. Clin. Invest., 92, 945, 1993], transplant rejection [Isobe et al., Transplantation Proceedings, 26, 867, 1994], various malignant tumors such as melanoma [Renkonen et al., Am. J. Pathol., 1992, 140, 763], lymphoma [Freedman et al., Blood, 1992, 79, 206], multiple sclerosis [Lee S.J. et al., J. Neuroimmunol., 98: 77-88, 1998; Elovaara et al., Arch. Neurol. 57: 546-511, 2000], autoimmune encephalomyelitis [Benveniste et al., J. Neuroimmunol. 98: 77-88, 1999, Crohn's disease [Jones et al., Gut, 36: 72460, 1995; Goggins et al., Gastroenterology, 108: A825, 1995; Goekeand Manns, Gastroenterology, 106: A684, 1995] and psoriasis [Groves, R. W., J. Am. Acad. Dermatol., 29: 67-72, 1993; Schopf, R. E., Br. J Dermatol., 128: 34-37, 1993]. These results suggest that VCAM-1 and VLA-4 are important therapeutic target molecules in inflammatory diseases.

현재 VCAM-1이나 VLA-4의 활성 저해제 개발은 그들의 중화항체가 대상으로 Antegren^TM에서 개발된 α4 항체인 natalizumab는 다발성 경화증 및 Crohn's disease를 타겟으로 임상 2 상 및 3상에 있으며, Biogen/Elan의 단일클론항체, Merck 및 Aventis의 LDV mimic 화합물과 Roche 의 acylphenylalanine 화합물들이 clinical trial 중에 있다 [Jefferson, Expert Opin. Ther. Patents, 12, 991, 2002]. 합리적인 약제의 개발 연구에 의해 인간의 IgG1 일정 영역에 융합된 인간 VCAM-1의 N-말단 도메인 두 개를 함유하는 용해성 VCAM-Ig 융합 단백질을 제조되었으며, 융합 단백질의 생체 내 투여는 노노베세(nonobese) 당뇨병 쥐에서 자가면역 당뇨병의 발병을 상당히 지연시키는 것으로 보고되고 있다 [Jakubowski et al., J. Immunol., 155, 938, 1995]. 또 다른 접근법에서는 VCAM-1의 도메인 1에서 α4 인테그린 결합 고리를 면밀히 모사한 사이클릭 펩타이드 길항제를 합성하기 위한 VCAM-1 단편의 결정학적 3차원 구조를 사용했다. 합성된 VCAM-1 펩타이드 CQIDSPC는 정제된 VCAM-1에 대한 VLA-1-발현성 세포의 접착을 억제시킬 수 있다 [Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5714, 1995].Currently, the development of inhibitors of VCAM-1 or VLA-4 activity is in progress, and their neutralizing antibodies are targeted at phase 2 and 3 clinical trials of natalizumab, an α4 antibody developed by Antegren ^TM , targeting multiple sclerosis and Crohn's disease. Monoclonal antibodies, LDV mimic compounds from Merck and Aventis and acylphenylalanine compounds from Roche are in clinical trials [Jefferson, Expert Opin. Ther. Patents, 12, 991, 2002. Development of rational drugs has led to the preparation of a soluble VCAM-Ig fusion protein containing two N-terminal domains of human VCAM-1 fused to a region of human IgG1, and the in vivo administration of the fusion protein is nonobese. ) Has been reported to significantly delay the development of autoimmune diabetes in diabetic rats (Jakubowski et al., J. Immunol., 155, 938, 1995). Another approach used the crystallographic three-dimensional structure of the VCAM-1 fragment to synthesize a cyclic peptide antagonist closely mimicking the α4 integrin binding ring in domain 1 of VCAM-1. The synthesized VCAM-1 peptide CQIDSPC can inhibit the adhesion of VLA-1-expressing cells to purified VCAM-1 [Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5714, 1995].

본 발명자들은 천연자원으로부터 VCAM-1/VLA-4 매개성 세포접착 저해제를 탐색한 결과, 시호 추출물 및 그 분획물 그리고 이로부터 유래된 트리터페노이드계 사포닌 화합물들이 VCAM-1과 VLA-4 매개성 세포접착을 저해하는 효과를 규명하여 본 발명을 완성하였다.The present inventors searched for VCAM-1 / VLA-4 mediated cell adhesion inhibitors from natural resources, and as a result, Shiho extract and its fractions and triterpenoid-based saponin compounds derived therefrom were found to be VCAM-1 and VLA-4 mediated cells. The present invention was completed by identifying the effect of inhibiting adhesion.

본 발명의 목적은 시호 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases, comprising Shiho extract or a fraction thereof as an active ingredient.

본 발명의 다른 목적은 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases comprising a compound represented by the formula (1) or (2) as an active ingredient.

본 발명의 다른 목적은 시호로부터 상기 화합물을 추출하여 제조하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for extracting and preparing the compound from Shiho.

상기 목적을 달성하기 위하여, 하나의 양태로서, 본 발명은 시호 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.In order to achieve the above object, as one embodiment, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases comprising Shiho extract or a fraction thereof as an active ingredient.

시호(Bupleurum falcatum)는 미나리과에 속하는 다년초로서, 묏미나리라고도 한다. 본 발명에서 시호 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매, 바람직하게는 메탄올, 에탄올 또는 부탄올로 추출한 것을 포함한다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 추출물에는, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나도 포함하는 것으 로 한다.Seaple ( Bupleurum falcatum ) is a perennial plant belonging to the family Apiaceae. Shiho extract in the present invention includes water extracted with a solvent selected from the group consisting of lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms and mixed solvents thereof, preferably methanol, ethanol or butanol. In the present invention, the extract is intended to include an extract obtained by an extraction treatment, a dilution or concentrate of the extract, a dried product obtained by drying the extract, or any one of these modifiers or purified products.

본 발명에서 시호 추출물을 얻기 위한 방법은 다음과 같다. 시호 분쇄물을 건조 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C₁) 내지 4(C₄)의 저급 알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 추출 온도는 20 내지 100 ℃, 바람직하게는 실온에서, 추출 기간은 약 12시간 내지 4일, 바람직하게는 3일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출한다. 바람직하게는 냉침추출로 1회 내지 5회 연속 추출하여 감압여과하고, 그 여과추출물을 진공회전농축기로 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 감압농축하여 물, 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 시호 조추출물을 수득할 수 있다.In the present invention, a method for obtaining Shiho extract is as follows. Shiho crushed powder is prepared from a lower alcohol having 1 (C ₁ ) to 4 (C ₄ ) carbon, such as water, methanol, ethanol and butanol, in volumes of about 2 to 20 times, preferably about 3 to 5 times, dry weight. Using a polar solvent or a mixed solvent having a mixing ratio of about 1: 0.1 to 1:10 as the elution solvent, the extraction temperature is 20 to 100 ℃, preferably at room temperature, the extraction period is about 12 hours to 4 days, Preferably, extraction is performed using an extraction method such as hot water extraction, cold needle extraction, reflux cooling extraction, or ultrasonic extraction for three days. Preferably, the extract is filtered 1 to 5 times by cold extraction and subjected to filtration under reduced pressure, and the filtrate is concentrated under reduced pressure at 20 to 100 ° C., preferably at room temperature using a vacuum rotary condenser, and soluble in water, lower alcohols, or a mixed solvent thereof. One crude crude extract can be obtained.

본 발명의 시호 에탄올 추출물은 30 및 10 μg/㎖ 농도에서 sVCAM-1과 THP-1세포와의 접착을 각각 95%, 5% 저해하였다 (도 1). 따라서 염증성 질환 또는 감염성 질환의 예방 및 치료에 적합하다.Shiho ethanol extract of the present invention inhibited adhesion of sVCAM-1 and THP-1 cells by 95% and 5% at 30 and 10 μg / ml concentrations (FIG. 1). Therefore, it is suitable for the prevention and treatment of inflammatory diseases or infectious diseases.

다음으로, 본 발명에서 시호 추출물의 용매 분획물은 시호 추출물을 물로 현탁한 후 n-헥산 또는 클로로포름과 같은 비극성 용매를 사용하여 분획함으로써 극성 용매 분획물과 비극성 용매 분획물을 각각 수득할 수 있다. 본 발명에서, 구체적인 일 양태로서 용매분획물로는 물 분획물, n-헥산 분획물 또는 클로로포름 분획물이 제공된다.Next, in the present invention, the solvent fraction of the Siho extract may be obtained by suspending the Siho extract with water and then fractionating it using a nonpolar solvent such as n -hexane or chloroform to obtain a polar solvent fraction and a nonpolar solvent fraction, respectively. In the present invention, as a specific aspect, the solvent fraction is provided with water fraction, n -hexane fraction or chloroform fraction.

본 발명에서 시호 추출물의 분획물을 얻기 위한 방법은 다음과 같다. 상기에서 얻은 시호 조추출물을 증류수에 현탁한 후, 현탁액의 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 헥산, 에틸아세테이트 또는 클로로포름과 같은 비극성 용매를 가하여 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회에 걸쳐 비극성 용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다. 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis , 3rd Ed. p6-7, 1998). 구체적으로, 상기 시호 조추출물을 물에 현탁한 후, 등량의 n-헥산 및 클로로포름을 용매를 이용하여 연속 추출로 시호 각 용매 가용 추출물을 수득할 수 있고, 더욱 구체적으로는 시호 조추출물을 물에 현탁한 후, 동량의 n-헥산을 혼합한 후 분획하여 n-헥산 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있으며, 이 수가용성 분획물에 클로로포름을 가하여 클로로포름 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있다.Method for obtaining a fraction of Shiho extract in the present invention is as follows. The crude crude extract obtained above is suspended in distilled water, and then 1 to 10 times by adding a nonpolar solvent such as hexane, ethyl acetate or chloroform in a volume of about 1 to 100 times, preferably about 1 to 5 times the suspension. Preferably it can be obtained by extracting and separating the nonpolar solvent soluble layer in two to five times. It is also possible to further carry out conventional fractionation processes (Harborne JB Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis , 3rd Ed. p6-7, 1998). Specifically, after suspending the crude crude extract in water, the equivalent amount of n-hexane and chloroform can be obtained by continuous extraction using a solvent, and each of the soluble crude extract can be obtained in water. After suspension, the same amount of n-hexane can be mixed and fractioned to obtain n-hexane soluble fraction and water soluble fraction, and chloroform can be added to the water soluble fraction to obtain chloroform soluble fraction and water soluble fraction. .

본 발명의 시호의 분획물인 클로로포름 분획은 30 및 10 μg/㎖의 농도에서 sVCAM-1과 THP-1세포와의 접착을 각각 98%, 98% 이상 저해하였다 (도 1). 따라서 염증성 질환 또는 감염성 질환의 예방 및 치료에 적합하다.The chloroform fraction, which is a fraction of Shiho of the present invention, inhibited adhesion between sVCAM-1 and THP-1 cells at 98 and 98%, respectively, at concentrations of 30 and 10 μg / ml (FIG. 1). Therefore, it is suitable for the prevention and treatment of inflammatory diseases or infectious diseases.

본 발명의 시호 추출물 및 그의 분획물은 VCAM-1과 VLA-4 매개성 세포접착 저해활성으로 단핵구, 호중구 및 임파구와 같은 혈구세포가 혈관내피세포에 접착하고 침투하는 것을 저해하여 염증관련 질환의 예방 및 치료용 의약품으로 유용하게 사용될 수 있다.Shiho extract and fractions thereof of the present invention inhibit the adhesion of blood cells such as monocytes, neutrophils and lymphocytes to adhesion and invasion of vascular endothelial cells with VCAM-1 and VLA-4 mediated cell adhesion inhibitory activity. It can be usefully used as a therapeutic medicine.

본 발명에서 염증성 질환이란 천식, 동맥경화, 류마티즈 관절염, 당뇨병, 지 연성 알러지(IV형 알러지), 이식거부, 이식편 대 숙주 질환, 자가면역 뇌척수염, 전신 홍반성 낭창, 말라리아, 흑색종, 림프종, 악성 종양, 다발성 경화증, 크론병, 염증성 장질환, 관절염, 피부염, 건선, 낭포성 섬유증, 당뇨성 망막증, 비염, 허혈성-재관류 손상, 혈관 재협착, 만성 폐색성 폐성 질환(COPD), 사구체신염, 그래이브 질환, 위장관 알레르기, 관상동맥 질환, 협심증, 소혈관 질환 및 말라리아로 구성되는 군으로부터 선택되는 질환을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.Inflammatory diseases in the present invention are asthma, arteriosclerosis, rheumatoid arthritis, diabetes mellitus, delayed allergy (type IV allergy), transplant rejection, graft-versus-host disease, autoimmune encephalomyelitis, systemic lupus erythematosus, malaria, melanoma, lymphoma, Malignant tumors, multiple sclerosis, Crohn's disease, inflammatory bowel disease, arthritis, dermatitis, psoriasis, cystic fibrosis, diabetic retinopathy, rhinitis, ischemic-reperfusion injury, vascular restenosis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), glomerulonephritis, And diseases selected from the group consisting of grave disease, gastrointestinal allergy, coronary artery disease, angina pectoris, small vessel disease and malaria.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 트리터페노이드계 사포닌 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.As another aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases or infectious diseases comprising a triterpenoid-based saponin compound represented by the following formula (1) or (2) as an active ingredient.

[화학식 1][Formula 1]

[화학식 2][Formula 2]

상기 화학식 1과 2의 트리터페노이드계 사포닌 화합물들은 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있으며, 통상의 방법에 의해 제조되는 모든 염, 수화물 및 용매화물이 포함된다.The triterpenoid-based saponin compounds of Formulas 1 and 2 may be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and include all salts, hydrates, and solvates prepared by conventional methods.

염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알콜(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르 산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로아이오딕산 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.As salts are acid addition salts formed with pharmaceutically acceptable free acids. Acid addition salts are prepared by conventional methods, for example by dissolving a compound in an excess of aqueous acid solution and precipitating the salt using a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. Equivalent molar amounts of the compound and acid or alcohol (eg, glycol monomethyl ether) in water can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered. In this case, organic acids and inorganic acids may be used as the free acid, and hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, tartaric acid, and the like may be used as the inorganic acid, and methanesulfonic acid, p -toluenesulfonic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, and maleic acid may be used as the organic acid. (maleic acid), succinic acid, oxalic acid, benzoic acid, tartaric acid, fumaric acid, manderic acid, propionic acid, citric acid, lactic acid, glycolic acid, glycol Gluconic acid, galacturonic acid, glutamic acid, glutaric acid, glucuronic acid, glucuronic acid, aspartic acid, ascorbic acid, carbonic acid, vanic acid, hydroiodic acid, and the like can be used. It is not limited to.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.Bases can also be used to make pharmaceutically acceptable metal salts. Alkali metal or alkaline earth metal salts are obtained, for example, by dissolving a compound in an excess of alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and then evaporating and drying the filtrate. In this case, as the metal salt, it is particularly suitable to prepare sodium, potassium or calcium salt, but is not limited thereto. Corresponding silver salts may also be obtained by reacting alkali or alkaline earth metal salts with a suitable silver salt (eg, silver nitrate).

본 발명의 트리터페노이드계 사포닌 화합물들은 시호로부터 추출, 분리 및 정제하여 사용할 수 있으며, 또한, 본 발명의 화합물은 공지의 합성 방법에 의해 제조될 수도 있고, 시판되는 시약을 사용할 수도 있다.The triterpenoid-based saponin compounds of the present invention can be extracted, separated and purified from Shiho, and the compounds of the present invention may be prepared by a known synthesis method or may use commercially available reagents.

본 발명에 따른 시호로부터 트리터페노이드계 사포닌 화합물들의 추출, 분리 및 정제방법은 다음과 같다.Extraction, separation and purification of triterpenoid-based saponin compounds from Siho according to the present invention are as follows.

시호의 클로로포름 분획물을 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 분리한다. 이때, 클로로포름과 메탄올은 100:1 내지 0:100 (v/v)인 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 분리된 활성분획의 VCAM-1 과 VLA-4 매개성 세포접착 저해활성을 측정하여 그 중에서 가장 저해활성이 높은 분획들을 모아 70%, 80%, 90%, 100% 메탄올을 용출용매로 사용하여 역상 컬럼 크로마토그래피로 분리한다. 상기 얻어진 최종 분획 중 VCAM-1과 VLA-4 매개성 세포접착 저해활성이 높은 분획들을 모아 75 % 메탄올을 사용하여 5 ㎖/분으로 흘려주면서 HPLC로 최종 화합물을 분리한다.The chloroform fraction of Shiho was separated by silica gel column chromatography using a mixed solvent of chloroform and methanol. At this time, it is preferable to use a solvent of chloroform and methanol of 100: 1 to 0: 100 (v / v). VCAM-1 and VLA-4 mediated cell adhesion inhibitory activity of the isolated active fractions were measured, and the highest inhibitory fractions were collected and 70%, 80%, 90%, 100% methanol was used as the elution solvent. Separate by reverse phase column chromatography. Of the final fractions obtained, the VCAM-1 and VLA-4 mediated cell adhesion inhibitory fractions were collected, and the final compound was separated by HPLC while flowing at 5 ml / min using 75% methanol.

이와 같이 시호 클로로포름 분획으로부터 유래된 본원의 트리터페노이드계 사포닌 화합물들은 IC₅₀ 값이 각 각 8 μg/㎖ (화합물 1) 및 1.7 μg/㎖ (화합물 2)로 측정되었다 (도 2, 3). 따라서 본 발명의 화학식 1 또는 2의 화합물은 염증성 질환의 예방 및 치료에 적합하다.Thus triterpenoid-based saponin compounds of the present application derived from the Shiho chloroform fraction were IC ₅₀ value of 8 μg / ml (Compound 1) and 1.7 μg / ml (Compound 2), respectively (Fig. 2, 3). Accordingly, the compounds of formula 1 or 2 of the present invention are suitable for the prevention and treatment of inflammatory diseases.

본 발명의 화학식 1과 2의 트리터페노이드계 사포닌 화합물들은 VCAM-1과 VLA-4 매개성 세포접착 저해활성으로 단핵구, 호중구 및 임파구와 같은 혈구세포가 혈관내피세포에 접착하고 침투하는 것을 저해하여 염증관련 질환의 예방 및 치료용 의약품으로 유용하게 사용될 수 있다.The triterpenoid-based saponin compounds of Chemical Formulas 1 and 2 of the present invention inhibit VCAM-1 and VLA-4 mediated cell adhesion and inhibit the adhesion and infiltration of blood cells such as monocytes, neutrophils and lymphocytes to vascular endothelial cells. It can be usefully used as a medicine for the prevention and treatment of inflammation-related diseases.

본 발명에서 염증성 질환이란 천식, 동맥경화, 류마티즈 관절염, 당뇨병, 지연성 알러지(IV형 알러지), 이식거부, 이식편 대 숙주 질환, 자가면역 뇌척수염, 전신 홍반성 낭창, 말라리아, 흑색종, 림프종, 악성 종양, 다발성 경화증, 크론병, 염증성 장질환, 관절염, 피부염, 건선, 낭포성 섬유증, 당뇨성 망막증, 비염, 허혈성-재관류 손상, 혈관 재협착, 만성 폐색성 폐성 질환(COPD), 사구체신염, 그래이브 질환, 위장관 알레르기, 관상동맥 질환, 협심증, 소혈관 질환 및 말라리아로 구 성되는 군으로부터 선택되는 질환을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.Inflammatory diseases include asthma, arteriosclerosis, rheumatoid arthritis, diabetes mellitus, delayed allergy (type IV allergy), transplant rejection, graft-versus-host disease, autoimmune encephalomyelitis, systemic lupus erythematosus, malaria, melanoma, lymphoma, Malignant tumors, multiple sclerosis, Crohn's disease, inflammatory bowel disease, arthritis, dermatitis, psoriasis, cystic fibrosis, diabetic retinopathy, rhinitis, ischemic-reperfusion injury, vascular restenosis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), glomerulonephritis, And include diseases selected from the group consisting of grave disease, gastrointestinal allergy, coronary artery disease, angina pectoris, small vessel disease and malaria.

본 발명의 시호 추출물 또는 이의 분획물, 또는 화학식 1 또는 2의 화합물은 오랫동안 생약으로 사용되어 오던 약제인 시호로부터 유래한 것이므로 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.Shiho extract of the present invention or a fraction thereof, or the compound of formula (1) or (2) is derived from Shiho, a drug that has been used for a long time as a herbal, there is no problem such as toxicity and side effects.

본 발명의 염증관련 질환의 예방 및 치료용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 화합물을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다. The pharmaceutical composition for preventing and treating inflammation-related diseases of the present invention comprises 0.0001 to 10% by weight of the extract or compound, preferably 0.001 to 1% by weight, based on the total weight of the composition.

본 발명의 시호 추출물 또는 그의 분획물 그리고 이로부터 분리된 화학식 1과 2 를 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.The composition comprising the extract of Siho or fractions thereof of the present invention and formulas (I) and (2) separated therefrom may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.

본 발명의 시호 추출물 또는 그의 분획물 그리고 이로부터 분리된 화학식 1과 2 의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. Shiho extract of the present invention or a fraction thereof and the formulas (1) and (2) isolated therefrom The pharmaceutical dosage forms may be used in the form of their pharmaceutically acceptable salts, or may be used alone or in combination with other pharmaceutically active compounds, as well as in a suitable collection.

본 발명에 따른 시호 추출물 또는 그의 분획물 그리고 이로부터 분리된 화학식 1과 2 를 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 또는 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.Shiho extract or fractions thereof according to the present invention and formulas 1 and 2 isolated therefrom The composition comprising the, may be used in the form of powder, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral formulations, external preparations, suppositories and sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method. . Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition comprising the extract include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate , Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. When formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, or the like in the extract or fraction. (sucrose), lactose (lactose), gelatin, etc. are mixed and prepared. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate and talc are also used. Liquid preparations for oral use may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc., in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used to include suspensions, solutions, emulsions, and syrups. have. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories. As the non-aqueous solvent and suspending agent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.

본 발명의 시호 추출물 또는 그의 분획물 그리고 이로부터 분리된 화학식 1과 2 의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경 로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물 또는 화합물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. Preferred dosages of Shiho extract or fractions thereof of the present invention and the formulas 1 and 2 separated therefrom are appropriately selected by those skilled in the art, depending on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration. Can be. However, for the desired effect, the extract or compound of the present invention is preferably administered at 0.0001 to 100 mg / kg, preferably at 0.001 to 100 mg / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention can be administered to various mammals such as rats, mice, livestock, humans, and the like. All modes of administration may be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intra-uterine or intracerebroventricular injections.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 시호로부터 상기 화합물을 추출하여 제조하는 방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a method for extracting and preparing the compound from Shiho.

구체적으로, 본 발명은 a) 시호를 분쇄하여 알콜 용매로 추출하여 농축하는 단계; b) 상기 농축물에 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 또는 물을 가하여 층 분리하여 분획물을 얻는 단계; 및 c) 상기에서 유기층만을 감압농축하여 크로마토그래피로 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 화합물의 제조방법에 관한 것이다.Specifically, the present invention comprises the steps of a) crushing Shiho by extracting with an alcohol solvent and concentrating; b) adding hexane, chloroform, ethyl acetate or water to the concentrate to separate the layers to obtain a fraction; And c) concentrating only the organic layer under reduced pressure and separating and purifying the compound by chromatography.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 시호 에탄올 추출물 및 클로로포름 분획 그리고 이로부터 유래된 트리터페노이드계 사포닌 화합물들이 VCAM-1과 VLA-4 매개성 세포접착을 저해하여 단핵구, 호중구 및 임파구와 같은 혈구세포가 혈관내 피세포에 접착하고 침투하는 것을 저하시키는데 유효하므로 염증관련 질환의 예방 및 치료용 의약품으로 유용하게 사용될 수 있다.As described above, the present invention is the ethanol extract and chloroform fraction and triterpenoid-based saponin compounds derived therefrom inhibits VCAM-1 and VLA-4 mediated cell adhesion, blood cells such as monocytes, neutrophils and lymphocytes Since it is effective in reducing adhesion and penetration into vascular blood cells, it can be usefully used as a medicine for the prevention and treatment of inflammatory diseases.

이하, 본 발명을 실시 예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example : 시호로부터 화학식 1과 2로 표시되는 화합물의 분리: Separation of Compounds of Formulas 1 and 2 from Shiho

1. 시호로부터 추출1. Extraction from Seahawks

시호는 물로 깨끗이 세척한 후 그늘에서 건조한 후, 분쇄기로 분말화 시켰다. 분말 화된 시호 2.4 kg에 3배의 에탄올(건조된 시호 중량에 대해)을 가하여 7일간 실온에서 추출한 후 여과하였다. 상기 여과액을 감압 농축하여 조추출물 (430 g)을 얻었다.Shiho was washed with water, dried in the shade, and powdered with a grinder. Three times of ethanol (relative to the weight of dried shell) was added to 2.4 kg of powdered shells, followed by extraction at room temperature for 7 days, followed by filtration. The filtrate was concentrated under reduced pressure to give a crude extract (430 g).

상기 조추출물에서 활성물질을 분리, 정제하기 위하여, 클로로포름 및 물을 이용하여 각각의 분획물로 분리하여 다음 실험예 1의 방법으로 VCAM-1과 VLA-4 매개성 세포접착 저해활성을 측정하였다. 측정 결과, 클로르포름층에서 가장 우수한 VCAM-1과 VLA-4 매개성 세포접착 저해활성을 나타내었다.In order to isolate and purify the active material from the crude extract, chloroform and water were separated into their respective fractions, and VCAM-1 and VLA-4 mediated cell adhesion inhibitory activity was measured by the following Experimental Example 1. As a result, it showed the best VCAM-1 and VLA-4 mediated cell adhesion inhibitory activity in the chloroform layer.

2. 클로로포름층의 분리 및 정제2. Separation and Purification of Chloroform Layer

시호 조추출물의 클로로포름층을 감압 농축하고(180 g), 클로르포름:메탄올 = (100/0 ~ 0/100)로 구성된 단계농도 구배(step gradient) 용매 시스템을 이용하여 실리카겔의 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 활성분획을 분리하였다.The chloroform layer of Crude crude extract was concentrated under reduced pressure (180 g), and column chromatography of silica gel was performed using a step gradient solvent system consisting of chloroform: methanol = (100/0 to 0/100). The active fractions were separated.

상기 분리된 활성분획의 VCAM-1과 VLA-4 매개성 세포접착 저해활성을 측정하여 그 중에서 가장 저해활성이 높은 분획들을 모아, 용출 용매로 70%, 80%, 90%, 100% 메탄올을 사용하여 역상 컬럼 크로마토그래피(reversed-phase column chromatography, ODS gel)로 활성분획을 분리하였다. 이 중 VCAM-1과 VLA-4 매개성 세포접착 저해활성이 높은 분획들을 모아 최종적으로 용출 용매로서 65 % 메탄올을 5 ㎖/min로 흘려주면서, 고속액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography; HPLC, YMC Jsphere ODS H-80 (250 × 20 mm))를 실시하여 화학식 1의 순수화합물을 얻었다. 활성물질의 검출은 UV 210 nm에서 행하였으며, VCAM-1과 VLA-4 매개성 세포접착 저해활성 물질은 55분에 용출되었다. 80% MeOH을 사용 7 ㎖/min 으로 흘려주면서, HPLC (high performance liquid chromatography; HPLC, YMC J'sphere ODS H-80, 150 × 20 mm, 4 μm)를 실시하여 36분에서 용출되는 화학식 2의 순수화합물을 얻었다.The VCAM-1 and VLA-4 mediated cell adhesion inhibitory activity of the isolated active fractions were measured, and the fractions with the highest inhibitory activity were collected, and 70%, 80%, 90%, and 100% methanol was used as the elution solvent. The active fractions were separated by reversed-phase column chromatography (ODS gel). Among them, VCAM-1 and VLA-4 mediated cell adhesion inhibitory fractions were collected, and finally, high performance liquid chromatography (HPLC, YMC) was poured with 5% / min of 65% methanol as elution solvent. Jsphere ODS H-80 (250 × 20 mm) was carried out to obtain a pure compound of formula 1. The active material was detected at UV 210 nm, and VCAM-1 and VLA-4 mediated cell adhesion inhibitory substances were eluted at 55 minutes. While flowing 80% MeOH at 7 ml / min, performing HPLC (high performance liquid chromatography; HPLC, YMC J'sphere ODS H-80, 150 × 20 mm, 4 μm) of the formula 2 eluted at 36 minutes Pure compound was obtained.

3. VCAM-1과 VLA-4 매개성 세포접착 저해활성 물질의 구조 분석3. Structure analysis of VCAM-1 and VLA-4 mediated cell adhesion inhibitory substances

완전히 분리 정제된 화합물 1은 흰색분말상의 물질로, 분자량을 측정한 결과 [M+Na]⁺가 m/z 804 이었으며, EI-MS 에서 분자식이 C₄₂H₆₈O₁₃로 추정되었다. ¹³C-NMR 에서 모두 42개의 signal이 관찰되었으며, 70에서 90 ppm에서 당부분에 해당하는 피크가 관찰되었다. ¹H-NMR 에서는 4.42 및 4.56 ppm에서 2개의 anomeric proton에 해당하는 피크가 관찰되었으며, 106.4 및 107.2 ppm에서 2개의 anomeric proton에 해당하는 탄소 피크가 관찰되었다. 5.94 ppm (1H, d, J = 10.4 Hz, H-11)과 5.69 ppm (1H, d, J = 10.4 Hz, H-12)의 proton 피크가 관찰되어, 이중결합이 하나 존재함을 알 수 있었다. ¹³C-NMR에서는 63.2, 64.5, 73.5 및 85.7 ppm에서 산소와 연결된 탄소 피크가 관찰되었으며, 기존에 보고된 NMR 결과 [Ebata et al., Chem. Pharm. Bull. 38, 1432, 1990; Kubota et al., Tetrahedron, 24, 675, 1968; Shimizu et al., Chem. Pharm. Bull., 33, 3349, 1985]와 비교하여 saikosaponin A으로 결정하였다. Compound 1, which was completely separated and purified, was a white powdery substance. As a result of molecular weight measurement, [M + Na] ⁺ was m / z 804, and the molecular formula was estimated to be C ₄₂ H ₆₈ O ₁₃ in EI-MS. Forty-two signals were observed in ¹³ C-NMR and corresponding peaks were observed at 70 to 90 ppm. ¹ H-NMR showed peaks corresponding to two anomeric protons at 4.42 and 4.56 ppm and carbon peaks corresponding to two anomeric protons at 106.4 and 107.2 ppm. Proton peaks of 5.94 ppm (1H, d, J = 10.4 Hz, H-11) and 5.69 ppm (1H, d, J = 10.4 Hz, H-12) were observed, indicating that there was one double bond. . ^{In 13} C-NMR, oxygen-linked carbon peaks were observed at 63.2, 64.5, 73.5 and 85.7 ppm, and previously reported NMR results [Ebata et al., Chem. Pharm. Bull. 38, 1432, 1990; Kubota et al., Tetrahedron, 24, 675, 1968; Shimizu et al., Chem. Pharm. Bull., 33, 3349, 1985] was determined as saikosaponin A.

완전히 분리 정제된 화합물 2은 흰색분말상의 물질로, 분자량을 측정한 결과 [M+Na]⁺가 m/z 804 이었으며, EI-MS 에서 분자식이 C₄₂H₆₈O₁₃로 추정되었다. 화합물 1과 마찬가지로 ¹³C-NMR에서 모두 42개의 signal이 관찰되었으며, 70에서 90 ppm에서 당부분에 해당하는 피크가 관찰되었다. ¹H-NMR 에서는 4.41 및 4.55 ppm에서 2개의 anomeric proton에 해당하는 피크가 관찰되었으며, 106.6 및 107.2 ppm에서 2개의 anomeric proton에 해당하는 탄소 피크가 관찰되었다. 화합물 2는 77.6 ppm에서 관찰되는 16번 탄소의 차이만 있을 뿐 화합물 1과 유사한 구조의 화합물임을 알 수 있다. (화합물 1의 16번 탄소는 63.2 ppm에서 관찰됨.) 이상의 기기분석 결과와 기 존에 보고된 NMR 결과 [Ishii et al., Chem. Pharm. Bull., 28, 2367, 1987; Shimizu et al., Chem. Pharm. Bull., 33, 3349, 1985; Hartlet et al., Phytochemistry, 35, 1009, 1994] 를 비교하여 saikosaponin D로 결정하였다. Compound 2, which was completely separated and purified, was a white powdery substance. As a result of molecular weight measurement, [M + Na] ⁺ was m / z 804, and the molecular formula was estimated to be C ₄₂ H ₆₈ O ₁₃ in EI-MS. As in compound 1, 42 signals were observed in ¹³ C-NMR, and peaks corresponding to sugars were observed at 70 to 90 ppm. ¹ H-NMR showed peaks corresponding to two anomeric protons at 4.41 and 4.55 ppm and carbon peaks corresponding to two anomeric protons at 106.6 and 107.2 ppm. Compound 2 can be seen that there is only a difference of 16 times the carbon as compound 1 with a compound of similar structure is observed in the 77.6 ppm. (Carbon 16 of compound 1 is found at 63.2 ppm.) Above instrumental analysis and previously reported NMR results [Ishii et al., Chem. Pharm. Bull., 28, 2367, 1987; Shimizu et al., Chem. Pharm. Bull., 33, 3349, 1985; Hartlet et al., Phytochemistry, 35, 1009, 1994] was compared to determine the saikosaponin D.

화합물 1Compound 1

(1) 물질의 성상: 흰색의 분말(1) Appearance of substance: white powder

(2) 물질의 분자식과 분자량: C₄₂H₆₈O₁₃, 781(2) Molecular formula and molecular weight of substance: C ₄₂ H ₆₈ O ₁₃ , 781

(3) 전자충격 질량분석 (70eV): m/z (rel. int) = 804 [M+Na]⁺ (3) Electron Shock Mass Spectrometry (70eV): m / z (rel. Int) = 804 [M + Na] ⁺

(4) 수소 핵자기 공명스펙트럼 [300MHz, 피리딘-d₆, δ(ppm)]: δ 5.94 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-11), 5.69 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-12), 1.45 (3H, d, J = 6.2 Hz, H-6'), 1.36 (3H, s, H-26), 1.13 (3H, s, H-27), 1.02 (3H, s, H-25), 0.95 (3H, s, H-29), 0.92 (3H, s, H-30), 0.87 (3H, s, H-24). (4) hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum [300 MHz, pyridine-d ₆ , δ (ppm)]: δ 5.94 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-11), 5.69 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-12), 1.45 (3H, d, J = 6.2 Hz, H-6 '), 1.36 (3H, s, H-26), 1.13 (3H, s, H-27), 1.02 (3H, s, H-25), 0.95 (3H, s, H-29), 0.92 (3H, s, H-30), 0.87 (3H, s, H-24).

(5) 탄소 핵자기 공명스펙트럼 [500MHz, 피리딘-d₆, δ(ppm)]: δ 13.5 (C-24), 17.7 (C-6'), 18.2 (C-6), 19.2 (C-25), 20.5 (C-26), 21.3 (C-27), 24.3 (C-30), 26.2 (C-22), 26.6 (C-2), 31.4 (C-20), 32.1 (C-7), 34.1 (C-29), 35.1 (C-21), 36.6 (C-15), 36.7 (C-10), 38.1 (C-19), 39.1 (C-1), 42.6 (C-8), 44.2 (C-4), 46.1 (C-14), 47.5 (C-17), 47.8 (C-5), 52.6 (C-18), 53.6 (C-9), 62.5 (C-6), 63.2 (C-16), 64.5 (C-23), 71.5 (C-5'), 72.0 (C-2), 72.3 (C-4), 72.6 (C-4), 73.5 (C-28), 76.3 (C-2), 78.9 (C-5), 79.3 (C-3), 82.0 (C-3), 84.4 (C-13), 85.7 (C-3), 106.4 (C-1), 107.2 (C-1), 131.6 (C-12), 132.6 (C-11).(5) Carbon nuclear magnetic resonance spectra [500 MHz, pyridine-d ₆ , δ (ppm)]: δ 13.5 (C-24), 17.7 (C-6 '), 18.2 (C-6), 19.2 (C-25 ), 20.5 (C-26), 21.3 (C-27), 24.3 (C-30), 26.2 (C-22), 26.6 (C-2), 31.4 (C-20), 32.1 (C-7) , 34.1 (C-29), 35.1 (C-21), 36.6 (C-15), 36.7 (C-10), 38.1 (C-19), 39.1 (C-1), 42.6 (C-8), 44.2 (C-4), 46.1 (C-14), 47.5 (C-17), 47.8 (C-5), 52.6 (C-18), 53.6 (C-9), 62.5 (C-6), 63.2 (C-16), 64.5 (C-23), 71.5 (C-5 '), 72.0 (C-2), 72.3 (C-4), 72.6 (C-4), 73.5 (C-28), 76.3 (C-2), 78.9 (C-5), 79.3 (C-3), 82.0 (C-3), 84.4 (C-13), 85.7 (C-3), 106.4 (C-1), 107.2 ( C-1), 131.6 (C-12), 132.6 (C-11).

화합물 2Compound 2

(1) 물질의 성상: 하얀색의 분말(1) Appearance of substance: White powder

(3) 전자충격 질량분석(70eV): m/z(rel. int) = 804 [M+Na]⁺ (3) Electron impact mass spectrometry (70 eV): m / z (rel. Int) = 804 [M + Na] ⁺

(4) 수소 핵자기 공명스펙트럼 [300MHz, 피리딘-d₆, δ(ppm)]: δ 5.98 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-11), 5.71 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-12), 1.45 (3H, d, J = 6.2 Hz, H-6'), 1.38 (3H, s, H-26), 1.64 (3H, s, H-27), 1.03 (3H, s, H-25), 1.04 (3H, s, H-29), 0.96 (3H, s, H-30), 0.89 (3H, s, H-24).(4) hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum [300 MHz, pyridine-d ₆ , δ (ppm)]: δ 5.98 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-11), 5.71 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-12), 1.45 (3H, d, J = 6.2 Hz, H-6 '), 1.38 (3H, s, H-26), 1.64 (3H, s, H-27), 1.03 (3H, s, H-25), 1.04 (3H, s, H-29), 0.96 (3H, s, H-30), 0.89 (3H, s, H-24).

(5) 탄소 핵자기 공명스펙트럼 [500MHz, 피리딘-d₆, δ(ppm)]: δ 13.5 (C-24), 17.7 (C-6'), 18.0 (C-6), 18.6 (C-25), 19.3 (C-26), 20.0 (C-27), 24.9 (C-30), 31.8 (C-22), 26.6 (C-2), 32.0 (C-20), 32.4 (C-7), 34.2 (C-29), 35.2 (C-21), 35.9 (C-15), 36.7 (C-10), 38.9 (C-19), 39.1 (C-1), 42.4 (C-8), 44.1 (C-4), 44.2 (C-14), 45.8 (C-17), 47.9 (C-5), 51.8 (C-18), 53.5 (C-9), 63.2 (C-6), 77.6 (C-16), 64.6 (C-23), 71.5 (C-5), 72.0 (C-2), 72.3 (C-4), 72.7 (C-4), 78.3 (C-28), 76.3 (C-2), 78.9 (C-5), 79.3 (C-3), 82.1 (C-3), 85.4 (C-13), 85.7 (C-3), 106.6 (C-1), 107.2 (C-1), 132.5 (C-12), 132.5 (C-11).(5) Carbon nuclear magnetic resonance spectrum [500 MHz, pyridine-d ₆ , δ (ppm)]: δ 13.5 (C-24), 17.7 (C-6 '), 18.0 (C-6), 18.6 (C-25 ), 19.3 (C-26), 20.0 (C-27), 24.9 (C-30), 31.8 (C-22), 26.6 (C-2), 32.0 (C-20), 32.4 (C-7) , 34.2 (C-29), 35.2 (C-21), 35.9 (C-15), 36.7 (C-10), 38.9 (C-19), 39.1 (C-1), 42.4 (C-8), 44.1 (C-4), 44.2 (C-14), 45.8 (C-17), 47.9 (C-5), 51.8 (C-18), 53.5 (C-9), 63.2 (C-6), 77.6 (C-16), 64.6 (C-23), 71.5 (C-5), 72.0 (C-2), 72.3 (C-4), 72.7 (C-4), 78.3 (C-28), 76.3 ( C-2), 78.9 (C-5), 79.3 (C-3), 82.1 (C-3), 85.4 (C-13), 85.7 (C-3), 106.6 (C-1), 107.2 (C -1), 132.5 (C-12), 132.5 (C-11).

실험예Experimental Example 1. One. sVCAMsVCAM -1과 -1 and THPTHP -- 1세포와의With 1 cell 결합저해 활성 Inhibitory activity

Recombinant sICAM-1 (R&D Systems, Abingdon, UK)을 5 μg/㎖ (in PBS)로 희석한 후, 96-well plate에 100 μl씩 넣고 4°C에서 3~4시간 반응 시켰다. PBS로 1회 washing하고, 10 mg/㎖ BSA를 100 μl 씩 넣고 상온에서 1~2시간 blocking 한다. THP-1 cells (1x10⁶ cells/㎖)는 BCECF-AM (5 μM) 첨가 후 30~60분간 37℃에서 반응 시킨다. THP-1 cells을 PBS로 washing하고 LFA-1/2 antibody (500 ng/㎖)처리하여 37°C에서 10~20분간 반응시킨 후 THP-1 cells와 시료를 Recombinant sVCAM-1이 코팅되어있는 plate의 각 well에 100 μl 씩 넣고 37°C에서 60분간 반응시킨다. 반응 후 binding 하지 않은 THP-1 cells을 제거하고, PBS로 3회 washing 한다. PBS (1% Triton X-100)로 Cell을 가용화 시킨 뒤 형광 (ex. 485, em. 592)을 측정하였다.After diluting Recombinant sICAM-1 (R & D Systems, Abingdon, UK) to 5 μg / mL (in PBS), 100 μl each was added to a 96-well plate and reacted at 4 ° C. for 3 to 4 hours. Wash once with PBS, 10 mg / ㎖ BSA 100 μl each block for 1 to 2 hours at room temperature. THP-1 cells (1x10 ⁶ cells / mL) are reacted at 37 ℃ for 30 ~ 60 minutes after BCECF-AM (5μM) addition. THP-1 cells were washed with PBS and treated with LFA-1 / 2 antibody (500 ng / mL) for 10 to 20 minutes at 37 ° C, and then THP-1 cells and samples were coated with Recombinant sVCAM-1. Add 100 μl to each well of the reaction and react at 37 ° C for 60 minutes. After reaction, remove unbound THP-1 cells and wash with PBS three times. Cells were solubilized with PBS (1% Triton X-100) and fluorescence (ex. 485, em. 592) was measured.

시호 에탄올 추출물은 30 및 10 μg/㎖ 농도에서 sVCAM-1과 THP-1세포와의 접착을 각각 95%, 5% 저해하였다 (도 1).Shiho ethanol extract inhibited 95% and 5% adhesion of sVCAM-1 and THP-1 cells at 30 and 10 μg / ml concentrations (FIG. 1).

또한, 그 분획물인 클로로포름 분획은 30 및 10 μg/㎖의 농도에서 sVCAM-1과 THP-1세포와의 접착을 각각 98%, 98% 이상 저해하였다 (도 1).In addition, the fraction chloroform fraction inhibited the adhesion of sVCAM-1 and THP-1 cells at 98 and 98%, respectively, at concentrations of 30 and 10 μg / ml (FIG. 1).

시호 클로로포름 분획으로부터 유래된 트리터페노이드계 사포닌 화합물들은 IC₅₀ 값이 각 각 8 μg/㎖ (화합물 1) 및 1.7 μg/㎖ (화합물 2)로 측정되었다 (도 2, 3).Triterpenoid-based saponin compounds derived from the Shiho Chloroform fraction were measured at IC ₅₀ values of 8 μg / ml (Compound 1) and 1.7 μg / ml (Compound 2), respectively (FIGS. 2 and 3).

제제예Formulation example 1. One. 산제의Powder 제조 Produce

시호 추출물 및 그 분획물 또는 화학식 1-2의 화합물 0.1 gShiho extract and its fractions or 0.1 g of the compound of formula 1-2

유당 1.5 gLactose 1.5 g

탈크 0.5 gTalc 0.5 g

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.The above ingredients are mixed and filled in an airtight cloth to prepare a powder.

제제예Formulation example 2. 정제의 제조 2. Preparation of Tablets

락토스 7.9 g7.9 g of lactose

결정성 셀룰로오스 1.5 g1.5 g of crystalline cellulose

마그네슘 스테아레이트 0.5 g0.5 g of magnesium stearate

총량 10 gTotal amount 10 g

상기의 성분들을 혼합한 후 직타법(direct tableting method)에 의해 정제를 제조한다. 각 정제의 총량은 500 ㎎이고, 그 중 유효성분의 함량은 50 ㎎이다.After mixing the above components, a tablet is prepared by a direct tableting method. The total amount of each tablet is 500 mg, of which the active ingredient content is 50 mg.

제제예Formulation example 3. 분말제의 제조 3. Preparation of powder

옥수수전분 5 g5 g of corn starch

카르복시 셀룰로오스 4.9 g4.9 g of carboxy cellulose

총량 10 gTotal amount 10 g

상기에 나열된 성분들을 잘 혼합하여 분말을 제조한다. 경질 캡슐에 분말 500 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조한다.Mix well the ingredients listed above to make a powder. 500 mg of powder is added to the hard capsule to prepare a capsule.

제제예Formulation example 4. 주사제의 제조 4. Preparation of injections

주사용 멸균 증류수 적량Appropriate sterile distilled water for injection

pH 조절제 적량pH adjuster

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.According to the conventional method for preparing an injection, the amount of the above ingredient is prepared per ampoule (2 ml).

제제예Formulation example 5. 5. 액제의Liquid 제조 Produce

이성화당 10 g10 g of isomerized sugar

만니톨 5 g5 g of mannitol

정제수 적량Purified water

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬행을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다. According to the conventional method of preparing a liquid solution, each component is added and dissolved in purified water, lemon row is added, the above ingredients are mixed, purified water is added, the whole is adjusted to 100 ml by adding purified water, and then filled in a brown bottle. The solution is prepared by sterilization.

도 1은 시호 에탄올 추출물 및 클로로포름 분획물의 soluble VCAM-1 (sVCAM-1)과 VLA-4가 발현된 THP-1세포간의 접착저해활성을 나타낸 도이며,1 is a diagram showing adhesion inhibitory activity between soluble VCAM-1 (sVCAM-1) and VLA-4 expressing THP-1 cells of ethanol extract and chloroform fractions.

도 2는 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 트리터페노이드계 사포닌 화합물의 soluble VCAM-1 (sVCAM-1)과 VLA-4가 발현된 THP-1세포간의 접착저해활성을 나타낸 도이며,2 is a view showing the adhesion inhibitory activity between soluble VCAM-1 (sVCAM-1) and VLA-4-expressing THP-1 cells of the triterpenoid-based saponin compound represented by Formula 1 according to the present invention,

도 3은 본 발명에 따른 화학식 2로 표시되는 트리터페노이드계 사포닌 화합물의 soluble VCAM-1 (sVCAM-1)과 VLA-4가 발현된 THP-1세포간의 접착저해활성을 나타낸 도이다.Figure 3 is a view showing the adhesion inhibitory activity between soluble VCAM-1 (sVCAM-1) and VLA-4-expressing THP-1 cells of the triterpenoid-based saponin compound represented by the formula (2) according to the present invention.

Claims

A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases comprising the extract of Siho or a fraction thereof as an active ingredient.

The composition of claim 1, wherein the extract is an extract extracted with a solvent selected from the group consisting of water, a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms, and a mixed solvent thereof.

The composition of claim 2, wherein the lower alcohol solvent is selected from the group consisting of methanol, ethanol and butanol.

The composition of claim 1 wherein the fraction is a water fraction, an n -hexane fraction or a chloroform fraction.

The method of claim 1, wherein the inflammatory disease is asthma, arteriosclerosis, rheumatoid arthritis, diabetes mellitus, delayed allergy (type IV allergy), transplant rejection, graft-versus-host disease, autoimmune encephalomyelitis, systemic lupus erythematosus, malaria, Melanoma, lymphoma, malignant tumor, multiple sclerosis, Crohn's disease, inflammatory bowel disease, arthritis, dermatitis, psoriasis, cystic fibrosis, diabetic retinopathy, rhinitis, ischemic-reperfusion injury, vascular restenosis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD ), Glomerulonephritis, grave disease, gastrointestinal allergy, coronary artery disease, angina, small vessel disease and malaria.

A pharmaceutical composition for preventing or treating an inflammatory disease comprising a triterpenoid-based saponin compound represented by Formula 1 or Formula 2 as an active ingredient.

[Formula 1]

[Formula 2]

7. The composition of claim 6, wherein said compound is isolated from shiho.

The method of claim 6, wherein the inflammatory disease is asthma, arteriosclerosis, rheumatoid arthritis, diabetes mellitus, delayed allergy (type IV allergy), transplant rejection, graft-versus-host disease, autoimmune encephalomyelitis, systemic lupus erythematosus, malaria, black Species, lymphoma, malignant tumor, multiple sclerosis, Crohn's disease, inflammatory bowel disease, arthritis, dermatitis, psoriasis, cystic fibrosis, diabetic retinopathy, rhinitis, ischemic-reperfusion injury, vascular restenosis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) Composition comprising a glomerulonephritis, grave disease, gastrointestinal allergy, coronary artery disease, angina pectoris, small vessel disease and malaria.

Grinding the siho to extract with an alcohol solvent, a) grinding the siho to extract with an alcohol solvent and concentrating; b) adding hexane, chloroform, ethyl acetate or water to the concentrate to separate the layers to obtain a fraction; And c) concentrating only the organic layer under reduced pressure to separate and purify the compound by chromatography.