KR100895613B1 - New acyclic triterpenoids compound, and pharmaceutical composition comprising Alpinia katsumadai extract or acyclic triterpenoids compounds isolated from the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 비환식 트리테르페노이드계 화합물, 및 초두구 추출물 또는 이로부터 분리된 비환식 트리테르페노이드계 화합물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 초두구 추출물 또는 이로부터 분리된 비환식 트리테르페노이드계 화합물은 ICAM-1과 LFA-1 매개성 세포접착을 저해하여 단핵구, 호중구 및 임파구와 같은 혈구세포가 혈관내피세포에 접착하고 침투하는 것을 효과적으로 저하시킴으로써, ICAM-1/LFA-1 매개성 세포접착에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the novel acyclic triterpenoid-based compound, and the acyclic triterpenoid-based compound isolated from the cedar extract. The turmeric extract of the present invention or the acyclic triterpenoid-based compound isolated therefrom inhibits ICAM-1 and LFA-1 mediated cell adhesion so that blood cells such as monocytes, neutrophils and lymphocytes adhere to vascular endothelial cells. By effectively lowering the penetration, it can be usefully used for the prevention or treatment of diseases caused by ICAM-1 / LFA-1 mediated cell adhesion.
Description
도 1은 본 발명에 따른 화학식 1의 비환식 트리테르페노이드계 화합물의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.1 is a diagram showing 1 H-NMR spectrum of the acyclic triterpenoid compound of
도 2는 본 발명에 따른 화학식 1의 비환식 트리테르페노이드계 화합물의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.2 is a diagram showing 13 C-NMR spectrum of the acyclic triterpenoid compound of
도 3은 본 발명에 따른 화학식 1의 비환식 트리테르페노이드계 화합물의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 도이다.3 is a diagram showing an HMBC spectrum of the acyclic triterpenoid compound of
도 4는 본 발명에 따른 화학식 1의 비환식 트리테르페노이드계 화합물의 질량분석 스펙트럼(FAB-Mass)을 나타낸 도이다.4 is a diagram showing a mass spectrometry (FAB-Mass) of the acyclic triterpenoid compound of
도 5는 본 발명의 초두구 에탄올 추출물의 가용성 세포간 접착분자-1(sICAM-1)과 LFA-1이 발현된 인간 단핵구 세포주(THP-1)와의 접착 저해 활성을 나타낸 도이다.5 is a diagram showing the adhesion inhibitory activity of the soluble intercellular adhesion molecule-1 (sICAM-1) and LFA-1 expressed human monocyte cell line (THP-1) of the ethanol extract of the cephalosphere ethanol of the present invention.
도 6은 본 발명의 초두구 클로로포름 분획물의 가용성 세포간 접착분자- 1(sICAM-1)과 LFA-1이 발현된 인간 단핵구 세포주(THP-1)와의 접착 저해 활성을 나타낸 도이다.Figure 6 is a diagram showing the adhesion inhibitory activity of the soluble intercellular adhesion molecule-1 (sICAM-1) and LFA-1 expressed human monocyte cell line (THP-1) of the ultracranial chloroform fraction of the present invention.
도 7은 본 발명의 화학식 1 및 2의 비환식 트리테르페노이드계 화합물의 가용성 세포간 접착분자-1(sICAM-1)과 LFA-1이 발현된 인간 단핵구 세포주(THP-1)와의 접착 저해 활성을 나타낸 도이다.Figure 7 shows the inhibition of adhesion between soluble intercellular adhesion molecule-1 (sICAM-1) and LFA-1 expressing human monocyte cell line (THP-1) of the acyclic triterpenoid compounds of
본 발명은 신규한 비환식 트리테르페노이드계 화합물, 및 초두구 추출물 또는 이로부터 분리된 비환식 트리테르페노이드계 화합물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the novel acyclic triterpenoid-based compound, and the acyclic triterpenoid-based compound isolated from the cedar extract.
세포간 접착분자-1(Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1; CD54)은 내피세포(endothelial cell) 표면에서 발현되는 접착 수용체(adhesion receptor)로서, Ig-superfamily에 속하는 단백질이다. ICAM-1은 혈관내피세포와 일부 림프구 (lymphocyte), 단핵구(monocyte)에서 저밀도로 발현되며[Springer, Nature 346: 425-434, 1990, Rothlein et al., J. Immunol . 137: 1270-1274, 1986], IL-1, TNF-α, IFN-γ와 같은 염증성 사이토카인(cytokine)과 LPS(lipopolysaccharide)를 다양한 세포에 처리하였을 때, 다양한 세포학적 유형(multiple cell type)에서 ICAM-1의 발현이 급속히 증가되어 혈류 중 이동하는 단핵구나 림프구 등 염증세포를 부착하고 염증세포가 염증발생 조직으로 이동하는데 역할을 한다[Hubbard and Rothlein, Free Radic . Biol. Med. 28: 1379-1386, 2000]. 따라서, ICAM-1의 발현은 염증세포가 염증발생 부위로 이동 및 접속하는 초기에 작용하여 염증반응의 증폭작용에 중요한 역할을 한다.Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1; CD54) is an adhesion receptor expressed on the surface of endothelial cells and is a protein belonging to the Ig-superfamily. ICAM-1 is expressed at low density in vascular endothelial cells, some lymphocytes, and monocytes [Springer, Nature 346 : 425-434, 1990, Rothlein et al., J. Immunol . 137 : 1270-1274, 1986], various cell types when inflammatory cytokines such as IL-1, TNF-α, IFN-γ and LPS (lipopolysaccharide) were treated to various cells. The expression of ICAM-1 increases rapidly in the bloodstream, which attaches inflammatory cells such as monocytes or lymphocytes that move in the bloodstream, and plays a role in inflammatory cells moving to inflammatory tissues. [Hubbard and Rothlein, Free Radic . Biol. Med . 28 : 1379-1386, 2000]. Therefore, expression of ICAM-1 plays an important role in the amplification of the inflammatory response by acting at the early stage of inflammatory cell migration and access to the site of inflammation.
백혈구 관련 항원-1(Leukocyte function associated antigen-1, LFA-1; CD11a/CD18)은 ICAM-1의 리간드로서, 주로 백혈구에 발현되는 β2-인테그린에 속하는 분자이다. LFA-1는 휴면 백혈구(resting leukocyte)에서는 불활성이지만, T-세포 수용체-매개성 신호(T-cell receptor-mediated signaling)나 포르볼에스터 (phorbol ester)와 같은 다양한 자극인자에 의해 백혈구로부터 활성화되어 ICAM-1과 결합한다[Dustin and Springer, Nature 341: 619-624, 1989, Rothlein and Springer, J. Exp . Med . 163: 1132-1149, 1986].Leukocyte function associated antigen-1 (LFA-1; CD11a / CD18) is a ligand of ICAM-1 and is a molecule belonging to β2-integrin mainly expressed on leukocytes. LFA-1 is inactive in resting leukocytes, but is activated from leukocytes by various stimulators such as T-cell receptor-mediated signaling or phorbol esters. Binds to ICAM-1 [Dustin and Springer, Nature 341 : 619-624, 1989, Rothlein and Springer, J. Exp . Med . 163 : 1132-1149, 1986.
세포접착은 관절염, 골다공증, 세균감염, 혈관협착, 암 전이, 혈관신생, 건선, 천식, 알레르기, 루푸스, 크론씨병 등 염증성 만성질환들과 매우 밀접하게 관련되어 있다[Poston et al., Am . J. Pathol . 140: p665-673, 1992; Macchioni et al., J. Reumatol . 21(10): p1860-1864, 1994; Mason et al., Arthritis Rheum . 36: p519-527, 1993; Kling et al., Clin . Invest . 71: p299-304, 1993].Cell adhesion is very closely associated with inflammatory chronic diseases such as arthritis, osteoporosis, bacterial infections, vascular stenosis, cancer metastasis, angiogenesis, psoriasis, asthma, allergies, lupus, Crohn's disease [Poston et al., Am . J. Pathol . 140 : p665-673, 1992; Macchioni et al., J. Reumatol . 21 (10) : p 1860-1864, 1994; Mason et al., Arthritis Rheum . 36 : p519-527, 1993; Kling et al., Clin . Invest . 71 : p299-304, 1993].
백혈구가 염증부위에 침윤하기 위해서는, 백혈구가 혈관내피세포 표면을 회전하면서 혈관내피세포에 접착하는 과정을 통해야만 한다. ICAM-1은 특히 염증반응이 일어난 혈관내피세포에 많이 발현되어지며, 단핵구, 호중구 및 임파구와 같은 혈구세포가 혈관벽에 접착하고 침투하는 것을 증진시키는 작용을 한다. 또한 혈소판과 혈관내피세포의 접착에도 ICAM-1이 중요한 역할을 하고 있는 것으로 밝혀졌다 [Thomas and DeGraba, Neurology 49: 15-19, 1997].In order for white blood cells to infiltrate inflamed sites, leukocytes must adhere to vascular endothelial cells by rotating the vascular endothelial cells surface. ICAM-1 is particularly expressed in vascular endothelial cells that have undergone inflammatory reactions, and promotes adhesion and penetration of blood cells such as monocytes, neutrophils, and lymphocytes to blood vessel walls. In addition, ICAM-1 plays an important role in the adhesion of platelets to vascular endothelial cells (Thomas and DeGraba, Neurology 49 : 15-19, 1997).
혈관협착은 혈중의 과다한 콜레스테롤 농도에 기인한 동맥경화 발생기전과 더불어 고혈압 혹은 독소나 병원체에 의해 혈관벽의 내피세포에 미세한 손상이 일어나면 만성염증의 형태로 발전하며, 내피세포에서 발현된 세포접착분자에 의해 혈중 단핵구가 혈관벽으로 침투하고, 혈관벽에서 대식세포(macrophage)로 분화되면서 혈관세포의 섬유화를 점진적으로 진행시켜 혈관이 좁아지는 비가역적 변성을 일으키게 된다[Ross, Annu . Rev . Physiol . 57: p791-804, 1995., Christoper and Joseph, Cell 104: p503-516, 2001]. 이러한 염증반응과 혈관협착과정에서 세포접착분자가 중요한 역할을 하고 있으므로, 단핵구와 내피세포 사이에서 이들의 발현을 차단하는 저해제의 개발이 다양하게 연구되고 있다. 이러한 결과로 미루어 ICAM-1이나 LFA-1의 저해제는 염증반응으로 진전될 수 있는 혈관협착 관련 질환을 위한 잠재적인 치료제로서의 가치가 충분하다[Oppenheimer-marks and Lipsky, Clin . Immunol . Immunopathol . 79: p203-210, 1996].Vascular stenosis develops in the form of chronic inflammation when microscopic damage to endothelial cells of blood vessels occurs due to hypertension or toxins or pathogens, along with the mechanism of atherosclerosis due to excessive cholesterol levels in the blood, and by cell adhesion molecules expressed in endothelial cells. Monocytes in the blood penetrate into the blood vessel wall and differentiate into macrophage in the blood vessel wall, gradually progressing fibrosis of blood vessel cells, resulting in irreversible degeneration that narrows blood vessels [Ross, Annu . Rev. Physiol . 57 : p791-804, 1995., Christoper and Joseph, Cell 104 : p503-516, 2001]. Since cell adhesion molecules play an important role in this inflammatory reaction and vascular stenosis, various studies have been made to develop inhibitors that block their expression between monocytes and endothelial cells. These results suggest that inhibitors of ICAM-1 or LFA-1 are valuable as potential therapeutics for vascular stenosis-related diseases that can progress to inflammatory reactions [Oppenheimer-marks and Lipsky, Clin . Immunol . Immunopathol . 79 : p203-210, 1996.
ICAM-1이 염증반응의 진전에 중요하게 관여하고 있다는 사실은, ICAM-1의 단일클론항체(monoclonal antibody)와 여러 종류의 질환모델 동물실험을 통해서 밝혀지고 있다. ICAM-1이나 LFA-1에 직접적으로 대응하는 단일클론항체를 이용한 ICAM-1/LFA-1 결합 저해가 건선, 아토피, 천식, 사구체 신염, 관절염 등의 자가면역질환에 유효한 것으로 밝혀졌으며, 면역응답반응에 있어서 T-세포의 활성화에는 T-세포 수용체를 통한 항원 특이적인 신호 이외에도 ICAM-1/LFA-1 등의 항원 비특이적인 신호가 반드시 필요한 것으로 밝혀졌다[Cornejo et al., Adv . pharmacol . 39: 99- 141, 1997, Patel et al., Circulation 97: 75-8, 1998, Nishikawa et al., J. Exp. Med. 177: 667-77, 1993, Kobayashi et al., Cell Immunol. 164: 295-305, 1995, Nagase et al. Am . J. Respir . Crit . Care Med . 152: 81-86, 1995].The fact that ICAM-1 plays an important role in the development of inflammatory reactions has been demonstrated in animal experiments with monoclonal antibodies of ICAM-1 and various disease models. Inhibition of ICAM-1 / LFA-1 binding using monoclonal antibodies that directly correspond to ICAM-1 or LFA-1 has been shown to be effective for autoimmune diseases such as psoriasis, atopy, asthma, glomerulonephritis and arthritis. In addition to antigen-specific signals through T-cell receptors, antigen-specific signals such as ICAM-1 / LFA-1 were required for activation of T-cells in the response [Cornejo et al., Adv . pharmacol . 39 : 99- 141, 1997, Patel et al., Circulation 97 : 75-8, 1998, Nishikawa et al., J. Exp. Med . 177 : 667-77, 1993, Kobayashi et al., Cell Immunol. 164 : 295-305, 1995, Nagase et al. Am . J. Respir . Crit . Care Med . 152 : 81-86, 1995].
ICAM-1은 염증성 질환뿐만 아니라 바이러스 감염에도 중요한 역할을 하고 있다. 감기 바이러스인 리노바이러스는 ICAM-1을 수용체로서 사용하여 감염된다는 것이 입증되었다[Greve et al., Cell 56: 839-847, 1989; Staunton et al., Cell 56: 849-853, 1989: Tomassini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 4907-4911, 1989]. 또한 인간 면역결핍 바이러스 질환(human immunodeficiency virus type-1, HIV-1) 역시 ICAM-1과 LFA-1의 결합을 이용하여 감염되며, ICAM-1과 LFA-1의 결합 저해제로 알려진 스타틴계 화합물이 HIV-1 바이러스의 증식을 억제하는 것으로 보고되었다[Giguere and Tremblay, J. Virology 78: 12062-12065, 2004]. 따라서, ICAM-1이나 LFA-1의 활성 저해제는 염증성 질환의 치료제뿐만 아니라 리노바이러스와 HIV-1의 항바이러스제로의 이용이 가능하다.ICAM-1 plays an important role in viral infections as well as inflammatory diseases. The rhinovirus, a cold virus, has been demonstrated to infect using ICAM-1 as a receptor [Greve et al., Cell 56 : 839-847, 1989; Staunton et al., Cell 56 : 849-853, 1989: Tomassini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86 : 4907-4911, 1989]. In addition, human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is also infected by the combination of ICAM-1 and LFA-1, and a statin compound known as a binding inhibitor of ICAM-1 and LFA-1 It has been reported to inhibit the proliferation of HIV-1 virus (Giguere and Tremblay, J. Virology 78: 12062-12065, 2004). Therefore, inhibitors of ICAM-1 or LFA-1 activity can be used as antiviral agents of linovirus and HIV-1 as well as in the treatment of inflammatory diseases.
현재, ICAM-1이나 LFA-1의 활성 저해제 개발은 그들의 중화항체가 대상이었으며, 천연물로부터는 수종의 저해제만이 보고되어 있는 실정이다. Abbott사에서 합성품으로서 ICAM-1 발현 저해물질을 보고하였으며[Stewart et al., J. Med . Chem. 44: 988-1002, 2001], ICAM-1의 항원결정기(epitope)를 모체로한 합성물질인 LFA-1의 길항제(antagonist)가 Novartis사와 Roche사로부터 개발되었으나 [Welzenbach et al., J. Biol . Chem . 277: 10590-10598, 2002, Gadek et al., Science 295: 1086-1089, 2002], 아직 질환동물모델을 이용한 in vivo 활성에 대한 보고는 없다.Currently, the development of inhibitors of ICAM-1 or LFA-1 activity has been targeted by their neutralizing antibodies, and only a few kinds of inhibitors have been reported from natural products. Abbott has reported ICAM-1 expression inhibitors as synthetics [Stewart et al., J. Med . Chem. 44 : 988-1002, 2001]. An antagonist of LFA-1, a synthetic substance based on the epitope of ICAM-1, was developed by Novartis and Roche. [Welzenbach et al., J. Biol. . Chem . 277 : 10590-10598, 2002, Gadek et al., Science 295 : 1086-1089, 2002], yet using diseased animal models in vivo There is no report of activity.
천연물 중에서 ICAM-1/LFA-1 매개성 세포접착을 저해하는 물질로는 세코-리모니드(seco-limonids)계 물질(Trichilia rubra, IC50; 10~25 nM), 쿠쿠르비타신 (cucurbitacins) (Conobea scoparioides, IC50; 0.18~1.36 mM), 아드산트로마이신 (adxanthromycins) (Streptomyces sp. Na-148, IC50; 1.5~6.5 mM) 등이 보고되어 있다[Musza et al., Tetrahedron 50: 11369-11378, 1994, Musza et al., J. Net . Prod. 57: 1498-1502, 1994, Nakano et al., J. Antibiotics 53: 12-18. 2000].Inhibitors of ICAM-1 / LFA-1 mediated cell adhesion among natural products are seco-limonids-based materials ( Trichilia). rubra , IC 50 ; 10-25 nM), cucurbitacins ( Conobea scoparioides , IC 50 ; 0.18-1.36 mM), axanthromycins ( Streptomyces sp. Na-148, IC 50 ; 1.5-6.5 mM), etc. have been reported (Musza et al., Tetrahedron 50 : 11369-11378, 1994, Musza) et al., J. Net . Prod. 57 : 1498-1502, 1994, Nakano et al., J. Antibiotics 53 : 12-18. 2000].
한편, 초두구(草頭久, Alpinia katsumadai)는 생강과 식물인 초두구의 종자로, 중국의 광동성과 광서성 등지에서 생산되며, d-4-테르피닐 아세테이트(d-4-Terpinyl acetate), d-알파-테르피네올(d-α-Terpineol) 등을 주로 한 정유성분이 함유되어 있다. 초두구는 맛이 맵고 성질이 따뜻하며, 비장과 위에 작용한다. 또한 따뜻하고 방향성이 강하여 비위를 데우고 속을 따뜻하게 하며 모든 냉기를 없애고 치솟은 기를 내려주고 습담을 없앤다. 초두구는 비위의 한습으로 복부가 차고 아픈 증상, 구토, 식욕부진, 대변이 묽은 증상, 담음이 축적되어 생기는 가슴앓이, 구역질에 쓰인다. 초두구의 약리작용으로는 억균작용, 장관흥분작용, 장관억제작용, 주름개선효과, 구강위생증진, 호르몬 대체 치료 효과 등이 알려져 있다.On the other hand, Alpinia katsumadai is a seed of the ginger family, Ginger, which is produced in Guangdong and Guangxi provinces in China, d-4-terpinyl acetate, d- Contains essential oils such as alpha-terpineol (d-α-Terpineol). Chodugu is spicy and warm in nature, acting on the spleen and stomach. In addition, it is warm and directional, warming the stomach, warming the inside, eliminating all the chills, lowering the soaring flag, and eliminating the scorn. Chodugu is a dampness of the stomach, and the abdomen is cold, painful, vomiting, anorexia, thin stool, heartburn caused by the accumulation of diarrhea, nausea is used. The pharmacological action of chodogu is known as fungi, intestinal excitement, intestinal suppression, wrinkle improvement, oral hygiene, hormone replacement treatment effect.
이와 같이, 초두구에 대해 다양한 약리활성이 보고되어 있지만, 아직까지 ICAM-1/LFA-1 매개성 세포접착 저해 활성에 대한 보고와 연구는 전무한 상태이다.As such, various pharmacological activities have been reported for cephalospheres, but there are no reports and studies on ICAM-1 / LFA-1 mediated cell adhesion inhibitory activity.
이에, 본 발명자들은 천연자원으로부터 ICAM-1/LFA-1 매개성 세포접착 저해 제에 대하여 탐색하던 중, 초두구 추출물 및 이로부터 분리된 비환식 트리테르페노이드계 화합물이 ICAM-1/LFA-1 매개성 세포접착을 저해하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.Thus, the present inventors searched for ICAM-1 / LFA-1 mediated cell adhesion inhibitors from natural resources, and the turmeric extract and the acyclic triterpenoid compounds isolated therefrom were ICAM-1 / LFA- It was confirmed that 1-mediated cell adhesion was inhibited, and the present invention was completed.
본 발명은 신규한 비환식 트리테르페노이드계 화합물을 제공하고자 한다.The present invention seeks to provide a novel acyclic triterpenoid compound.
또한, 본 발명은 초두구 추출물 또는 이로부터 분리된 비환식 트리테르페노이드계 화합물을 포함하는 ICAM-1/LFA-1 매개성 세포접착에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고자 한다.In addition, the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diseases caused by ICAM-1 / LFA-1 mediated cell adhesion, including a chorus extract or acyclic triterpenoid compounds isolated therefrom. do.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 비환식 트리테르페노이드계 화합물을 제공한다.The present invention provides an acyclic triterpenoid compound represented by the following formula (1).
상기 화학식 1의 화합물은 초두구로부터 추출, 분리 및 정제하여 얻은 것을 특징으로 한다.The compound of Formula 1 is characterized in that obtained by extraction, separation and purification from scalp.
또한, 본 발명은 초두구 추출물 또는 이로부터 분리된 화학식 1 및 2의 비환식 트리테르페노이드계 화합물을 포함하는 ICAM-1/LFA-1 매개성 세포접착에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In addition, the present invention is for the prevention or treatment of diseases caused by ICAM-1 / LFA-1 mediated cell adhesion, including acetonitrile extract or acyclic triterpenoid compounds of
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 화학식 1 및 2의 비환식 트리테르페노이드계 화합물은 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있으며, 통상의 방법에 의해 제조되는 모든 염, 수화물 및 용매화물이 포함된다. 상기 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산 (free acid)에 의해 형성되는 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 말레인산, 우마린산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콘산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 트리플루오로아세트산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.Acyclic triterpenoid compounds of
본 발명의 화학식 1 및 2의 비환식 트리테르페노이드계 화합물은 천연 생약재, 예를 들어 초두구로부터 추출·분리하여 사용하였으며, 화학적인 합성 방법으로 제조하거나 또는 시판되는 시약을 구입하여 사용할 수도 있다.The acyclic triterpenoid compounds of
본 발명에 따른 초두구로부터 비환식 트리테르페노이드계 화합물의 추출, 분리 및 정제방법은 다음과 같다.Extraction, separation and purification of the acyclic triterpenoid compound from the scalp according to the present invention are as follows.
구체적으로, 초두구 분쇄물을 건조 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 및 메탄올, 에탄올, 부탄올 등과 같은 C1 내지 C4 의 저급알콜의 극성 용매, 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서, 약 12시간 내지 7일, 바람직하게는 3~7일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 냉침추출로 1회 내지 5회 연속 추출하여 감압여과하고, 그 여과추출물을 진공회전농축기로 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 감압농축하여 초두구 조추출물을 수득할 수 있다.Specifically, the ultra-turmeric pulverized product is a polar solvent of water having a volume of about 2 to 20 times, preferably about 3 to 5 times the dry weight, and a C 1 to C 4 lower alcohol such as methanol, ethanol, butanol and the like. Or a mixed solvent having a mixing ratio of about 1: 0.1 to 1:10, and hydrothermal extraction and cooling at 20 to 100 ° C., preferably at room temperature for about 12 hours to 7 days, preferably 3 to 7 days. Extraction method, such as extraction, reflux cooling extraction or ultrasonic extraction, is preferably carried out by cold extraction for 1 to 5 consecutive extractions under reduced pressure filtration, and the filtered extract is 20 to 100 ° C. with a vacuum rotary concentrator, preferably Concentrated under reduced pressure at room temperature to obtain a crude head extract.
상기 초두구 조추출물을 물에 현탁시키고, 등량의 n-헥산을 혼합한 후 분획하여 n-헥산 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있다. 상기 수가용성 분획물에 클로로포름을 가하여 클로로포름 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있다. 상기 초두구 클로로포름 분획물을 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 분리한다. 이때, 클로로포름과 메탄올은 100~0 : 0~100 (v/v)인 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 분리된 활성분획의 ICAM-1과 LFA-1 매개성 세포접착 저해활성을 측정하여 그 중에서 가장 저해활성이 높은 분획들을 모아 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 메탄올을 용출용매로 사용하여 역상 컬럼 크로마토그래피로 분리한다. 상기 얻어진 최종 분획 중 ICAM-1과 LFA-1 매개성 세포접착 저해활성이 높은 분획들을 모아 90% 메탄올을 사용하여 6㎖/분으로 흘려주면서 HPLC로 최종 화합물 1 및 화합물 2를 분리한다.The crude head extract may be suspended in water, and an equal amount of n-hexane is mixed and fractioned to obtain n-hexane soluble fraction and water soluble fraction. Chloroform may be added to the water soluble fraction to obtain chloroform soluble fraction and water soluble fraction. The ultra-branched chloroform fraction is separated by silica gel column chromatography using a mixed solvent of chloroform and methanol. At this time, it is preferable that chloroform and methanol use the solvent which is 100-0: 0-100 (v / v). ICAM-1 and LFA-1 mediated cell adhesion inhibitory activity of the isolated active fractions were measured, and the fractions with the highest inhibitory activity were collected and 60%, 70%, 80%, 90%, 100% methanol was eluted. Separated by reverse phase column chromatography using.
최종 분리된 화학식 1의 화합물은 신규한 비환식 트리테르페노이드계 화합물로서, 2,3,5,22,23-펜타히드록시-2,6,10,15,19,23-헥사메틸-6,10,14,18-테트라코사테트라엔(2,3,5,22,23-tertrahydroxy-2,6,10,15,19,23-hexamethyl-6,10,14,18- tetracosatetraene)로 명명하였으며, 상기 화학식 2의 화합물은 2,3,22,23-테트라히드록시-2,6,10,15,19,23-헥사메틸-6,10,14,18-테트라코사테트라엔(2,3,22,23-tertrahydroxy-2,6,10,15,19,23-hexamethyl-6,10,14,18-tetracosatetraene)으로 판명되었다.The final isolated compound of
본 발명에 따른 초두구 에탄올 추출물은 50 및 25 ㎍/㎖의 농도에서 sICAM-1과 THP-1 세포와의 접착을 각각 68% 및 54% 저해하며, 초두구 클로로포름 분획물은 50 및 25 ㎍/㎖의 농도에서 sICAM-1과 THP-1세포와의 접착을 각각 85% 및 75% 이상 저해하고, 화학식 1 및 2의 비환식 트리테르페노이드계 화합물들은 IC50 값이 각각 6.98 ㎍/㎖ 및 7.59 ㎍/㎖로 나타난다. 따라서, 본 발명의 초두구 에탄올 추출물, 초두구 클로로포름 분획물 및 이로부터 분리된 화학식 1 및 2의 비환식 트리테르페노이드계 화합물은 ICAM-1과 LFA-1 매개성 세포접착을 저해하여 단핵구, 호중구 및 임파구와 같은 혈구세포가 혈관내피세포에 접착하고 침투하는 것을 효과적으로 저하시킴으로써, ICAM-1/LFA-1 매개성 세포접착에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.Cultivated ethanol extract according to the present invention inhibits adhesion of sICAM-1 and THP-1 cells by 68% and 54% at concentrations of 50 and 25 μg / ml, respectively. Inhibition of adhesion between sICAM-1 and THP-1 cells by 85% and 75% or more, respectively, and the acyclic triterpenoid compounds of
상기 ICAM-1/LFA-1 매개성 세포접착에 의해 유발되는 질환은 염증성 질환 및 감염성 질환을 포함한다. 염증성 질환이란 상기 추출물에서 언급한 바와 같이, 전신성 홍반성 루푸스 및 경피증과 같은 다기관에 관련하는 자가면역질환; 궤양성 대장염 및 크론병 등을 포함하는 염증성 장 질환; 알츠하이머병, 다발성 경화증, 운동뉴런질환, 파킨슨병, 만성피로증후군과 같은 중추신경계 염증 질환; 아토피성 피부염, 건선, 아나필랙시스 및 피부염 같은 IgE 매개성(타입Ⅰ) 과민증을 포함하는 염증; 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 변성, 포도막염, 결막염과 같은 안 질환; 뇌졸증, 관상동맥질환, 심근경색, 불안정 협심증, 맥관염, 동맥경화증, 혈관협착, 베그너스(Wegener's) 육아종증, 처그-스트라우스(Churg-Strauss) 증후군 맥관염, 헤노크-숀레인(Henoch-Schonlein) 자반병, 가와사키병, 거대세포 동맥염과 같은 혈관질환; 관절염, 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 골관절염, 골다공증, 알레르기, 당뇨, 당뇨성 신장병, 급성 소아당뇨병, 애디슨씨병, 굿파스튜어 증후군, IgA 신장병, 신염, 신장염, 사구체신염, 쇼그렌 증후군, 크론씨 병, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 만성폐쇄성 폐질환, 급성 백혈병 매개 폐손상, 천식, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 종양전이, 이식 거부, 중풍, 뇌염, 수막염, 에이즈 치매, 섬유증, 유착형성, 만성 간염 및 결핵같은 만성적 염증질환, 다중경화 및 만성 전립선염 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다(Marlin, et al., Cell 51:813-819 ,1987; Dustin, et al., J. Immunol. 137:245-254, 1986; Dustin, et al., Immunol. Today 9:213-215, 1988; Poston et al., Am. J. Pathol. 140: p665-673, 1992; Macchioni et al., J. Reumatol. 21(10): p1860-1864, 1994; Mason et al., Arthritis Rheum. 36: p519-527, 1993; Kling et al., Clin. Invest. 71: p299-304, 1993; 미국등록특허 제5,629,162호; 대한민국 특허출원 제10-2007-7006370호). 또한, 본 발명에서 감염성 질환이란 ICAM-1을 이용하여 감염되는 리노바이러스(rhinovirus) 또는 HIV-1 에 의한 감염성 질환을 포함한다.
본 발명의 조성물은 초두구 추출물 또는 이로부터 분리된 비환식 트리테르페노이드계 화합물과 함께 ICAM-1/LFA-1 매개성 세포접착 저해활성을 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.Diseases caused by ICAM-1 / LFA-1 mediated cell adhesion include inflammatory diseases and infectious diseases. Inflammatory diseases include, as mentioned in the above extracts, autoimmune diseases related to multiple organs such as systemic lupus erythematosus and scleroderma; Inflammatory bowel disease, including ulcerative colitis and Crohn's disease; Central nervous system inflammatory diseases such as Alzheimer's disease, multiple sclerosis, motor neuron disease, Parkinson's disease, chronic fatigue syndrome; Inflammation including IgE mediated (type I) hypersensitivity such as atopic dermatitis, psoriasis, anaphylaxis and dermatitis; Eye diseases such as diabetic retinopathy, retinitis, macular degeneration, uveitis, conjunctivitis; Stroke, coronary artery disease, myocardial infarction, unstable angina, vasculitis, arteriosclerosis, vascular stenosis, Wegener's granulomatosis, Churg-Strauss syndrome vasculitis, Henoch-Schonlein Vascular diseases such as purpura, Kawasaki disease, giant cell arteritis; Arthritis, rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis, osteoarthritis, osteoporosis, allergy, diabetes, diabetic nephropathy, acute pediatric diabetes, Addison's disease, Goodpasture syndrome, IgA nephritis, nephritis, nephritis, glomerulonephritis, Sjogren's syndrome, Crohn's disease, autoimmunity Pancreatitis, periodontal disease, chronic obstructive pulmonary disease, acute leukemia-mediated lung injury, asthma, graft-versus-host disease, chronic pelvic inflammatory disease, endometritis, rhinitis, tumor metastasis, transplant rejection, stroke, encephalitis, meningitis, AIDS dementia, fibrosis, Including but not limited to adhesion formation, chronic inflammatory diseases such as chronic hepatitis and tuberculosis, multiple sclerosis and chronic prostatitis (Marlin, et al., Cell 51: 813-819,1987; Dustin, et al., J. Immunol . 137: 245-254, 1986; Dustin, et al., Immunol. Today 9: 213-215, 1988; Poston et al., Am. J. Pathol. 140 : p665-673, 1992; Macchioni et. al., J. Reumatol. 21 (10) : p 1860-1864, 1994; Mason et al., Arthritis Rheum . 36: p519-527, 1993; Kling et al, Clin Invest 71:... P299-304, 1993; U.S. Patent No. 5,629,162 - Ho; Republic of Korea Patent Application No. 10-2007-7006370 call). In addition, in the present invention, an infectious disease includes an infectious disease caused by rhinovirus or HIV-1 infected using ICAM-1.
The composition of the present invention may contain one or more known active ingredients having ICAM-1 / LFA-1 mediated cell adhesion inhibitory activity together with a chondula extract or an acyclic triterpenoid compound isolated therefrom. .
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본 발명의 조성물은 초두구 추출물 또는 이로부터 분리된 비환식 트리테르페노이드계 화합물을 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다.The composition of the present invention comprises 0.0001 to 10% by weight, preferably 0.001 to 1% by weight, based on the total weight of the composition of the cedar extract or acyclic triterpenoid compound isolated therefrom.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.The composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent in addition to the above-mentioned active ingredient for administration. The carrier, excipient and diluent may include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, Polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 초두구 추출물 또는 화학식 1 또는 2의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 포함되며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.The compositions of the present invention can be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral formulations, suppositories, or sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods. Specifically, when formulated, it may be prepared using conventional diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, and the like. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations may contain at least one excipient such as starch, calcium, or the compound of
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 초두구 추출물 또는 이로부터 분리된 화학식 1 또는 2의 화합물의 일일 투여량은 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001~100 ㎎/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.The compositions of the present invention may be administered orally or parenterally (eg, applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to the desired method, and the dosage may be based on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, Depending on the drug form, route of administration, and duration, it may be appropriately selected by those skilled in the art. However, for the desired effect, the daily dosage of the chondula extract of the present invention or the compound of
본 발명의 조성물은 ICAM-1/LFA-1 매개성 세포접착에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.The compositions of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, hormone therapy, drug therapy and biological response modifiers for the prevention or treatment of diseases caused by ICAM-1 / LFA-1 mediated cell adhesion. Can be used.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are provided to aid in understanding the present invention. However, the following examples are merely provided to more easily understand the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the examples.
실시예Example 1 One : : 초두구Headlights 추출물 및 이로부터 분리된 Extracts and separated therefrom 비환식Acyclic 트리테르페노이드계Triterpenoids 화합물의 제조 Preparation of the compound
1. One. 초두구Headlights 에탄올 추출물의 제조 Preparation of Ethanol Extract
초두구는 물로 깨끗이 세척하고 그늘에서 건조한 후, 분쇄기로 분말화시켰다. 분말화된 초두구 100g에 3배의 에탄올(건조된 초두구 중량에 대해)을 가하여 7일간 실온에서 추출한 후 여과하였다. 상기 여과액을 감압 농축하여 초두구 에탄올추출물 20g을 얻었다.The green nut was washed with water, dried in the shade, and then powdered with a grinder. Three times of ethanol (relative to the dried caudal weight) was added to 100 g of powdered crustacean, extracted at room temperature for 7 days, and filtered. The filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain 20 g of ethanol extract.
2. 2. 초두구Headlights 클로로포름 chloroform 분획물의Fraction 제조 Produce
상기 1에서 제조한 초두구 에탄올 추출물 20g을 500㎖의 물에 현탁시키고, 등량의 n-헥산(500㎖×3)을 혼합한 후 분획하여 n-헥산 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 얻었다. 상기 수가용성 분획물에 클로로포름(500㎖×3)을 가하여 클로로포름 가용성 분획물 7.35g 및 수가용성 분획물을 얻었다.20 g of the ethanol extract prepared in
3. 3. 초두구Headlights 클로로포름 chloroform 분획물로부터From fractions 비환식Acyclic 트리테르페노이드계Triterpenoids 화합물의 분리 및 정제 Isolation and Purification of the Compound
상기 2에서 얻은 초두구 클로로포름 분획물 7.35g을 감압 농축하고, 클로로포름:메탄올 = (100/0 ~ 0/100)로 구성된 단계농도 구배(step gradient) 용매 시스템을 이용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 활성분획을 분리하였다. 상기 분리된 활성분획의 ICAM-1과 LFA-1 매개성 세포접착 저해활성을 측정하여 그 중에서 가장 저해활성이 높은 분획들을 모아, 용출 용매로 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 메탄올을 사용하여 역상 컬럼 크로마토그래피(reversed-phase column chromatography, ODS gel)로 활성분획을 분리하였다. 이 중 ICAM-1과 LFA-1 매개성 세포접착 저해활성이 높은 분획들을 모아 최종적으로 용출 용매로서 90% 메탄올을 6㎖/min로 흘려주면서, 고속액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC, YMC Jsphere ODS H-80 (250 × 20 ㎜))를 실시하여 화합물 1 20.3㎎과 화합물 2 50.8㎎을 얻었다. 활성물질의 검출은 UV 210 ㎚에서 행하였으며, ICAM-1과 LFA-1 매개성 세포접착 저해활성 물질은 각각 40분 및 25분에 용출되었다.7.35 g of the ultracereal chloroform fraction obtained in step 2 was concentrated under reduced pressure, and activated using silica gel column chromatography using a step gradient solvent system consisting of chloroform: methanol = (100/0 to 0/100). Fractions were separated. ICAM-1 and LFA-1 mediated cell adhesion inhibitory activity of the isolated active fractions were measured, and the fractions with the highest inhibitory activity were collected, and 60%, 70%, 80%, 90%, 100% as the elution solvent. The active fraction was separated by reverse-phase column chromatography (ODS gel) using methanol. Among them, ICAM-1 and LFA-1 mediated cell adhesion inhibitory fractions were collected and finally, high performance liquid chromatography (HPLC, YMC) was poured with 6% / min of 90% methanol as elution solvent. Jsphere ODS H-80 (250 × 20 mm) was carried out to obtain 20.3 mg of
4. 활성물질의 구조 분석4. Structure analysis of active substance
완전히 분리 및 정제된 화합물 1과 화합물 2의 측정 결과는 하기와 같으며, 발표된 문헌의 데이터와 비교 분석한 결과(Nishiyama Y, Moriyasu M, Ichimaru M, Tachibana Y, Kato A, Mathenge SG et al. Acyclic triterpenoids from Ekebergia capensis. Phytochemistry 1996; 42(3): 803-807), 화학식 1의 화합물은 신규한 비환식 트리테르페노이드계 화합물로서, 2,3,5,22,23-펜타히드록시-2,6,10,15,19,23-헥사메틸-6,10,14,18-테트라코사테트라엔(2,3,5,22,23-tertrahydroxy-2,6,10,15,19,23-hexamethyl-6,10,14,18-tetracosatetraene)으로 명명하였으며[도 1 내지 도 4], 화학식 2의 화합물은 2,3,22,23-테트라히드록시-2,6,10,15,19,23-헥사메틸-6,10,14,18-테트라코사테트라엔(2,3,22,23-tertrahydroxy-2,6,10,15,19,23-hexamethyl-6,10,14,18-tetracosatetraene)으로 판명되었다.The measurement results of
<화합물 1><
1) 성상 : 노란색 오일,1) Appearance: yellow oil,
2) 분자식 : C30H54O5,2) Molecular formula: C 30 H 54 O 5 ,
3) 분자량 : 494,3) Molecular weight: 494,
4) 전자충격 질량분석 (70eV): m/z(rel. int) = 517 [M+Na]+,4) Electron impact mass spectrometry (70 eV): m / z (rel. Int) = 517 [M + Na] + ,
5) 1H-NMR(500MHz, 클로로포름-d3): δ(ppm) 5.43 (1H, t, J= 5.8 Hz, H-7), 5.19 (1H, t, J= 5.3 Hz, H-18), 5.14 (2H, m, H-11, H-14), 4.26 (1H, m, H-5), 3.62 (1H, m, H-3), 3.35 (1H, dd, J= 8.5, 1.5 Hz, H-22), 2.23, 2.13, 2.1, 2.09, 2.05, 2.02 (each 2H, m, H-20, H-8, H-17, H-21, H-9, H-16), 1.63, 1.62, 1.61, 1.60 (each 3H, s, 26, 27, 28, 29-Me), 1.63 (2H, m, H-4), 1.59 (2H, m, H-13), 1.20, 1.19, 1.17, 1.15 (each 3H, s, 1, 24, 25, 30-Me), 1.41 (2H, m, H-12),5) 1 H-NMR (500 MHz, Chloroform-d 3 ): δ (ppm) 5.43 (1H, t, J = 5.8 Hz, H-7), 5.19 (1H, t, J = 5.3 Hz, H-18) , 5.14 (2H, m, H-11, H-14), 4.26 (1H, m, H-5), 3.62 (1H, m, H-3), 3.35 (1H, dd, J = 8.5, 1.5 Hz , H-22), 2.23, 2.13, 2.1, 2.09, 2.05, 2.02 (each 2H, m, H-20, H-8, H-17, H-21, H-9, H-16), 1.63, 1.62, 1.61, 1.60 (each 3H, s, 26, 27, 28, 29-Me), 1.63 (2H, m, H-4), 1.59 (2H, m, H-13), 1.20, 1.19, 1.17, 1.15 (each 3H, s, 1, 24, 25, 30-Me), 1.41 (2H, m, H-12),
6) 13C-NMR(500MHz, 클로로포름-d3): δ(ppm) 11.86, 16.10, 16.18, 16.20 (C-26, C-27, C-28, C-29), 23,46, 24,00(C-1, C-24), 26.21 (C-21), 26.43, 26.57 (C-25, C-30), 26.57 (C-17), 26.62 (C-8), 28.38 (C-16), 29.84 (C-12), 36.06 (C-4), 37.04 (C-20), 39.44 (C-9), 39.82 (C-13), 72.79, 73.26 (C-2, C-23), 78.46, 78.63, 78.90 (C-3, C-5, C-22), 124.66, 124.87 (C-11, C-14), 125.28, 126.57 (C-7, C-18), 134.87, 135.07, 135.24, 137.32 (C-6, C-10, C-15, C-19).6) 13 C-NMR (500 MHz, Chloroform-d 3 ): δ (ppm) 11.86, 16.10, 16.18, 16.20 (C-26, C-27, C-28, C-29), 23,46, 24, 00 (C-1, C-24), 26.21 (C-21), 26.43, 26.57 (C-25, C-30), 26.57 (C-17), 26.62 (C-8), 28.38 (C-16 ), 29.84 (C-12), 36.06 (C-4), 37.04 (C-20), 39.44 (C-9), 39.82 (C-13), 72.79, 73.26 (C-2, C-23), 78.46, 78.63, 78.90 (C-3, C-5, C-22), 124.66, 124.87 (C-11, C-14), 125.28, 126.57 (C-7, C-18), 134.87, 135.07, 135.24 , 137.32 (C-6, C-10, C-15, C-19).
<화합물 2><Compound 2>
화합물 2는 짙은 무색의 오일로, 분자량을 측정한 결과 [M+Na]+가 m/z 501이었으며, 고분해 ESI-MS에서 분자식이 C30H54O4로 추정되었다. 화합물 2의 자외선 흡광도를 측정한 결과 최대 흡수치가 210 ㎚에서 나타났다. 화합물 2의 구조를 결정하기 위한 NMR 시험 중에, 13C-NMR에서 질량분석 스펙트럼에서 추정된 탄소 30개의 반에 해당되는 15개의 탄소가 관찰되었는데, 이는 화합물 2가 대칭구조 (symmetrical structure)를 갖고 있음을 보여주었다. 1H-NMR 스펙트럼에서는 4개의 올레핀 프로톤(olefinic proton, δ 5.13, 5.18)이 관찰되었으며, 4개의 메틸 프로톤(methyl protone, δ 1.59, 1.61), 올레핀 그룹에 연결된 6개의 메틸렌 프로톤 (methylene proton, δ 1.99, 2.08, 2.01)이 관찰되었다. 또한 4개의 메틸렌 프로톤(δ 1.40, 1.58, 2.06 과 2.23), 수산기(hydroxyl group)에 결합된 2개의 메틴 프로톤(methin protone, δ 3.36) 및 4개의 말단 메틸 프로톤(δ1.15, 1.19)이 관 찰되었다.Compound 2 was a dark colorless oil. [M + Na] + was m / z 501 as a result of molecular weight measurement, and the molecular formula was estimated to be C 30 H 54 O 4 in high resolution ESI-MS. Ultraviolet absorbance of Compound 2 was measured, and the maximum absorption was found at 210 nm. During the NMR test to determine the structure of Compound 2, 15 carbons, equivalent to 30 half carbons estimated in the mass spectrometry, were observed in 13 C-NMR, which Compound 2 has a symmetrical structure. Showed. Four olefinic protons (δ 5.13, 5.18) were observed in the 1 H-NMR spectrum, four methyl protones (δ 1.59, 1.61), and six methylene protons (δ) linked to the olefin group. 1.99, 2.08, 2.01) were observed. In addition, four methylene protons (δ 1.40, 1.58, 2.06 and 2.23), two methine protones (δ 3.36) and four terminal methyl protons (δ 1.15, 1.19) bound to the hydroxyl group It was cold.
실험예Experimental Example 1 One : 가용성 Availability 세포간Intercellular 접착분자-1( Adhesion Molecule-1 ( sICAMsICAM -1)과 인간 단핵구 세포주(-1) and human monocyte cell lines ( THPTHP -1)와의 접착 저해 활성Adhesion Inhibitory Activity with -1)
본 발명의 초두구 추출물 및 이로부터 분리된 비환식 트리테르페노이드계 화합물의 sICAM-1과 THP-1 세포와의 접착 저해 활성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.In order to determine the adhesion inhibitory activity of sICAM-1 and THP-1 cells of the chonduo extract of the present invention and the acyclic triterpenoid compound isolated therefrom, the following experiment was performed.
재조합 가용성 세포간 접착분자-1(Recombinant sICAM-1; R&D Systems, Abingdon, UK)을 10 ㎍/㎖ (in PBS)로 희석한 후, 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 넣고, 4℃에서 12시간 반응시켰다. PBS로 1회 세척하고, 10 ㎎/㎖ 소혈청알부민 (bovine serum albumin, BSA)을 100 ㎕씩 넣고, 상온에서 1~2시간 봉쇄(blocking)하였다. THP-1 세포(1x107 cells/㎖)를 BCECF-AM(2',7'-bis(2-carboxyethyl)-5,6-carboxy-fluorescein acetoxymethyl ester, 5 μM)에 첨가한 후, 30~60분간 37℃에서 반응시켰다. THP-1 세포를 PBS로 세척하고 LFA-1/2 항체 (500 ng/㎖)로 처리하여 37℃에서 10~20분간 반응시킨 후, THP-1 세포와 상기 실시예 1에서 제조한 초두구 에탄올 추출물, 초두구 클로로포름 분획물, 및 화학식 1 및 2의 화합물(50 및 25 ㎍/㎖)을 재조합 가용성 세포간 접착분자-1(recombinant sICAM-1)이 코팅되어 있는 플레이트의 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 37℃에서 30~60분간 반응시켰다. 반응 후 결합하지 않은 THP-1 세포를을 제거하고, PBS로 3회 세척하였다. PBS(1% Triton X- 100)로 세포를 가용화시킨 다음 형광(여기 485㎚, 방출 592㎚)을 측정하였다.After diluting the recombinant soluble intercellular adhesion molecule-1 (Recombinant sICAM-1; R & D Systems, Abingdon, UK) to 10 μg / ml (in PBS), put 100 μl into a 96-well plate, 12 hours at 4 ℃ Reacted. After washing once with PBS, 100 μl of 10 mg / ml bovine serum albumin (BSA) was added thereto and blocked at room temperature for 1 to 2 hours. THP-1 cells (1 × 10 7 cells / ml) were added to BCECF-AM (2 ′, 7′-bis (2-carboxyethyl) -5,6-carboxy-fluorescein acetoxymethyl ester, 5 μM), then 30-60 The reaction was carried out for 37 minutes at 37 ° C. THP-1 cells were washed with PBS, treated with LFA-1 / 2 antibody (500 ng / ml), and reacted at 37 ° C. for 10 to 20 minutes, followed by THP-1 cells and ultracereal ethanol prepared in Example 1. 100 μl of the extract, the head chloroform fraction, and the compounds of
결과는 도 5 내지 도 7에 나타내었다.The results are shown in Figures 5-7.
도 5에 나타난 바와 같이, 초두구 에탄올 추출물은 50 및 25 ㎍/㎖의 농도에서 sICAM-1과 THP-1 세포와의 접착을 각각 68% 및 54% 저해하였다.As shown in FIG. 5, the Cultivated Ethanol Extract inhibited the adhesion of sICAM-1 and THP-1 cells by 68% and 54% at concentrations of 50 and 25 μg / ml, respectively.
또한 도 6에 나타난 바와 같이, 초두구 클로로포름 분획물은 50 및 25 ㎍/㎖의 농도에서 sICAM-1과 THP-1세포와의 접착을 각각 85% 및 75% 이상 저해하였다.In addition, as shown in Figure 6, ultracranial chloroform fraction inhibited the adhesion of sICAM-1 and THP-1 cells by more than 85% and 75% at concentrations of 50 and 25 μg / ml, respectively.
또한 도 7에 나타난 바와 같이, 화학식 1 및 2의 비환식 트리테르페노이드계 화합물은 IC50 값이 각각 6.98 ㎍/㎖ 및 7.59 ㎍/㎖로 나타났다.In addition, as shown in Figure 7, the acyclic triterpenoid compounds of
따라서, 본 발명의 초두구 추출물 및 이로부터 분리된 비환식 트리테르페노이드계 화합물은 sICAM-1과 THP-1 세포와의 접착 저해 활성이 우수함을 확인하였다.Therefore, it was confirmed that the chondrocyte extract of the present invention and the acyclic triterpenoid compound isolated therefrom have excellent adhesion inhibitory activity between sICAM-1 and THP-1 cells.
실험예Experimental Example 2 2 : : 랫트에On the rat 대한 경구투여 For oral administration 급성독성Acute Toxicity 실험 Experiment
본 발명의 초두구 추출물 및 이로부터 분리된 비환식 트리테르페노이드계 화합물의 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.In order to determine the acute toxicity of the turmeric extract of the present invention and the acyclic triterpenoid compound isolated therefrom, the following experiment was performed.
6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트(rat)를 군당 5 마리씩으로 나누어, 상기 실시예 1에서 제조한 초두구 에탄올 추출물, 초두구 클로로포름 분획물, 및 화학식 1 및 2의 화합물을 0.5% 메틸셀룰로오스 용액에 현탁하여 1g/㎏의 용량으로 단회 경구투여하였다. 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.Six-week-old SPF rats were divided into 5 rats per group, and the ethanol extract, ethanol extract, and chloroform fractions prepared in Example 1 were 0.5% methyl. It was suspended in a cellulose solution and administered once orally at a dose of 1 g / kg. After administration, mortality, clinical symptoms, and changes in body weight were observed, and hematological and blood biochemical tests were performed. Necropsy was performed to observe abdominal and thoracic organ abnormalities.
실험 결과, 본 발명의 시료를 투여한 동물에서는 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학적 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 따라서, 본 발명의 초두구 추출물 및 이로부터 분리된 비환식 트리테르페노이드계 화합물은 랫트에서 1g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD50)은 1g/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.As a result of the experiment, the animals to which the sample of the present invention was administered did not have any clinical symptoms or dead animals, and no toxic change was observed in weight change, blood test, blood biochemical test, autopsy findings, and the like. Therefore, the chondula extract of the present invention and the acyclic triterpenoid-based compound isolated therefrom did not show a toxicity change up to 1 g / kg in rats, and the minimum lethal dose (LD 50 ) was 1 g / kg or more. Judging by
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.Examples of preparations for the compositions of the present invention are illustrated below.
제제예Formulation example 1 One : : 산제의Powder 제조 Produce
초두구 추출물(또는 화학식 1 또는 2의 화합물) 0.1 g0.1 g of green bean extract (or a compound of
유당 1.5 gLactose 1.5 g
탈크 0.5 gTalc 0.5 g
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.The above ingredients were mixed and filled in an airtight cloth to prepare a powder.
제제예Formulation example 2 2 : 정제의 제조 : Preparation of Tablet
초두구 추출물(또는 화학식 1 또는 2의 화합물) 0.1 g0.1 g of green bean extract (or a compound of
락토오스 7.9 gLactose 7.9 g
결정성 셀룰로오스 1.5 g1.5 g of crystalline cellulose
마그네슘 스테아레이트 0.5 g0.5 g of magnesium stearate
상기의 성분들을 혼합한 후 직타법(direct tableting method)으로 정제를 제조하였다.After mixing the above components, a tablet was prepared by a direct tableting method.
제제예Formulation example 3 3 : 캡슐제의 제조: Preparation of Capsule
초두구 추출물(또는 화학식 1 또는 2의 화합물) 0.1 g0.1 g of green bean extract (or a compound of
옥수수전분 5 g5 g of corn starch
카르복시 셀룰로오스 4.9 g4.9 g of carboxy cellulose
상기의 성분들을 혼합하여 분말을 제조한 후, 상기 분말을 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라 경질 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.After the powder was prepared by mixing the above components, the powder was filled in a hard capsule according to the conventional method for preparing a capsule to prepare a capsule.
제제예Formulation example 4 4 : 주사제의 제조 : Preparation of Injection
초두구 추출물(또는 화학식 1 또는 2의 화합물) 0.1 g0.1 g of green bean extract (or a compound of
주사용 멸균 증류수 적량Appropriate sterile distilled water for injection
pH 조절제 적량pH adjuster
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.According to the conventional method for preparing an injection, the amount of the above-mentioned ingredient was prepared per ampoule (2 ml).
제제예Formulation example 5 5 : : 액제의Liquid 제조 Produce
초두구 추출물(또는 화학식 1 또는 2의 화합물) 0.1 g0.1 g of green bean extract (or a compound of
이성화당 10 g10 g of isomerized sugar
만니톨 5 g5 g of mannitol
정제수 적량Purified water
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합하였다. 그 다음 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.Each component was added and dissolved in purified water according to the conventional method for preparing a liquid, and lemon flavor was added appropriately, followed by mixing the above components. Then, purified water was added thereto to adjust the total volume to 100 ml, and then filled in a brown bottle to sterilize to prepare a liquid.
본 발명의 초두구 추출물 또는 이로부터 분리된 비환식 트리테르페노이드계 화합물은 ICAM-1과 LFA-1 매개성 세포접착을 저해하여 단핵구, 호중구 및 임파구와 같은 혈구세포가 혈관내피세포에 접착하고 침투하는 것을 효과적으로 저하시킴으로써, ICAM-1/LFA-1 매개성 세포접착에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.The turmeric extract of the present invention or the acyclic triterpenoid-based compound isolated therefrom inhibits ICAM-1 and LFA-1 mediated cell adhesion so that blood cells such as monocytes, neutrophils and lymphocytes adhere to vascular endothelial cells. By effectively lowering the penetration, it can be usefully used for the prevention or treatment of diseases caused by ICAM-1 / LFA-1 mediated cell adhesion.
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