KR20110058850A - 정지 코돈 번역초과에 의한 폴리펩티드 이소형의 세포 표면 표시 - Google Patents
정지 코돈 번역초과에 의한 폴리펩티드 이소형의 세포 표면 표시 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 특히 a) 해당 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI), 제1 폴리뉴클레오티드 하류의 하나 이상의 정지 코돈, 및 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 정지 코돈 하류의 제2 폴리뉴클레오티드를 적어도 포함하는 하나 이상의 카세트 (Cas-POI)를 포함하는 이종성 핵산을 포함하는 복수 개의 진핵 숙주 세포를 제공하는 단계; b) 해당 폴리펩티드가 발현되도록 진핵 숙주 세포를 배양시켜 해당 폴리펩티드의 적어도 일부가 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현되게 하며, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 상기 숙주 세포의 표면 상에 표시되는 것인 단계; c) 세포 표면 상에 표시되는 융합 폴리펩티드의 존재 또는 양을 기준으로 하나 이상의 진핵 숙주 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 해당 폴리펩티드를 목적하는 수준으로 발현하는 진핵 숙주 세포를 생산하거나 또는 선별하는 방법에 관한 것이다. 또한, 각각 디자인된 이종성 핵산을 포함하는 숙주 세포 및 각각의 숙주 세포를 사용하여 폴리펩티드를 생산하는 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 고생산성 포유동물 숙주 세포의 선별 방법 및 각각의 방법에 사용하기에 적합한 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 폴리펩티드의 효율적인 고수율 생산 방법에 관한 것이다.
고생산성 세포주의 선별은 임의의 생물공정의 개발에서 중요한 최초 단계이며 생명공학에서 가장 어려운 과제 중 하나이다. 이러한 고생산성 클론은 드물고, 폴리펩티드 생산에 많은 에너지를 소비할 수 있어, 감소된 성장률을 갖는 문제점이 있다. 그에 따라 과성장 및 비생산성 또는 저생산성 세포가 유도된다. 그러나, 폴리펩티드의 생산에서 고수율로 해당 폴리펩티드를 생산하는 세포주를 수득하는 것이 바람직하다. 전통적으로, 고생산성 세포주는 여러 번의 한계 희석법에 의한 클로닝 및 이어지는 생성물 분석에 의해 선별되었다. 그러나, 상기 전통적인 방법은 노동 집약적이고 비용이 많이 들기 때문에 몇몇 단점을 갖는다. 그밖에, 전체 공정이 상당 시간을 소요하며 공정의 완료에 수개월이 걸릴 수 있지만, 그럼에도 불구하고 클론 세포주가 안정하여 산업적 생물공정에서 유용할 것이라는 보장이 없다. 또한, 최고 생산인자의 선별은 스크리닝될 수 있는 세포수의 실질적인 제약으로 인해 어려워지고, 따라서 작은 개체수를 갖는 고생산성 세포의 선별의 효율이 잠재적으로 감소할 수 있다.
따라서, 고생산성 클론을 선별하는 대안의 방법을 제공하기 위한 수많은 연구가 수행되어 왔다. 예를 들어, 유동 세포계수법은 생산성의 모니터링 및 특별한 특성을 갖는 세포의 단리를 보다 용이하게 해주었다. 유동 세포계수법의 중요한 이점은, 세포 소집단(sub-population)까지 식별하는 능력으로 대량의 세포를 신속하게 스크리닝하는 능력 및 목적하는 특성을 나타내는 작은 개체수의 세포를 효율적으로 선별하는 능력을 포함한다. 유동 세포계수법을 이용하여 고생산성 세포를 선별하는 전통적인 접근법의 대부분은 하이브리도마(hybridoma) 세포의 선별에 대하여 규명된 것이다.
한 접근법은 형광 표지된 항체의 사용을 통해 동정 및 회수될 수 있는, 증가된 양의 세포 표면 항체를 표시하는 하이브리도마 세포의 세포 표면 항체 함량을 기반으로 한다. 그러나, 정량적 상관관계는 대체로 입증되지 않았다.
세포 표면 항체 선별에 있어서의 제약 중 일부를 피하기 위한 대안의 방법으로서 분비된 항체를 기준으로 세포를 선별하는 또다른 접근법이 개발되었다. 한 접근법은 친화성 매트릭스를 적용하고; 다른 접근법은 겔 미세액적 기법을 사용한다. 전자 방법은 분비된 해당 생성물에 대하여 특이적인, 인공 친화성 매트릭스의 형성을 기반으로 한다. 분비된 분자는 분비하는 세포의 표면 상의 친화성 매트릭스에 결합하고, 그 후에 유동 세포계수 분석법 및 세포 분류법을 위한 특수 형광 시약으로 표지된다.
미세액적 캡슐화는 아가로스 비드 내에 단세포의 완전한 캡슐화를 포함한다. 상기 비드는 특이적 포획 항체를 함유하므로 분비된 생성물을 포획함과 동시에 세포들 사이에 생성물의 교차 공급을 방지한다.
다른 방법은 유동 세포계수법에 의해 검출가능한, 마커 유전자의 공동발현을 기반으로 한다. 단점은 마커 유전자 (예를 들면, 녹색 형광 단백질)의 발현과 해당 유전자의 발현 사이의 낮은 연관성이다. 또한, 마커 유전자의 발현은 세포가 추가 에너지를 소모하게 하여 스트레스를 유발할 수 있다.
대안의 방법은 막 결합된 포획 단백질의 유도성 공동발현을 기반으로 한다. 막 결합된 포획 단백질은 세포 표면에 고정되어 있고, 분비된 폴리펩티드를 이들이 세포로부터 방출되는 즉시 포획한다. 이렇게 포획된 분자는 이어서 세포의 표면 상에서 검출가능하다. 그러나, 유전자 조작된 숙주 세포가 필요하고 또한 비생산성 세포의 교차 공급이 발생할 수 있다.
또한, 세포막에 일시적으로 회합된 분비된 생성물이 생산성 세포를 선별하기 위해 사용되었다. 그러나, 비생산성 세포의 교차 공급이 발생하고 상기 방법은 비교적 높은 배경 활동을 갖는다. 또한, 여러 번의 풍부화 및 선별을 수행하는 것이 불가능한 것으로 밝혀졌다.
따라서, 고생산성 숙주 세포의 선별 기술을 개발할 필요가 있다. 따라서 본 발명의 목적은 비생산성, 저생산성 및/또는 중간 생산성 세포로 이루어진 큰 집단 내에서 고생산성 재조합 숙주 세포를 검출하는 방법을 제공하고, 또한 고수율로 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은
a) 해당 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI), 제1 폴리뉴클레오티드 하류의 하나 이상의 정지 코돈, 및 면역글로불린 막관통 앵커(anchor) 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 정지 코돈 하류의 제2 폴리뉴클레오티드를 적어도 포함하는 하나 이상의 카세트(cassette; Cas-POI)를 포함하는 이종성 핵산을 포함하는 복수 개의 진핵 숙주 세포를 제공하는 단계;
b) 해당 폴리펩티드가 발현되도록 진핵 숙주 세포를 배양시켜 해당 폴리펩티드의 적어도 일부가 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현되게 하며, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 상기 숙주 세포의 표면 상에 표시되는 것인 단계;
c) 세포 표면 상에 표시되는 융합 폴리펩티드의 존재 또는 양을 기준으로 하나 이상의 진핵 숙주 세포를 선별하는 단계
를 포함하는, 해당 폴리펩티드를 목적하는 수준으로 발현하는 하나 이상의 진핵 숙주 세포를 풍부화 또는 선별하는 방법을 제공함으로써 상기 문제점을 해결한다.
"이종성 핵산"이란, 예를 들어 형질감염과 같은 재조합 기법을 사용하여 숙주 세포로 도입된 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 숙주 세포는 이종성 폴리뉴클레오티드에 상응하며, 각각 동일한 내생성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 그러나, 특히 용어 "이종성 핵산"이란 숙주 세포에 도입된 외래 폴리뉴클레오티드를 말한다. 도입은 예를 들면 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있는 적합한 벡터를 형질감염시킴으로써 달성가능하다 (안정한 형질감염). 이종성 핵산이 게놈으로 삽입되지 않는 경우에, 이종성 핵산은 후기에, 예를 들어 세포가 체세포분열할 때 상실될 수 있다 (일시적 형질감염). 상기 두 변형이 모두 적합하지만, 안정한 형질감염이 바람직하다. 적합한 벡터는 또한 게놈으로 통합되지 않고, 예를 들면 에피솜 복제에 의해 숙주 세포에서 유지될 수도 있다. 그러나, 이종성 핵산을 숙주 세포에 도입하기 위한 다른 기법이 또한 당분야에 알려져 있으며, 이들은 하기에서 더욱 상세히 설명될 것이다.
"폴리뉴클레오티드"는 통상적으로 하나의 데옥시리보오스 또는 리보오스로부터 또다른 데옥시리보오스 또는 리보오스에 연결된 뉴클레오티드의 중합체이며 상황에 따라서 DNA 및 RNA를 말한다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 어떠한 크기 제한도 포함하지 않는다.
"카세트"은, 예를 들어 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI), 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 서로 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 요소, 조절 요소 및/또는 본원에 기재된 다른 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군을 말한다. 본원에서 사용된 "카세트"는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 요소를 포함한다. 카세트는, 예를 들어 프로모터, 인핸서 및/또는 폴리A 부위와 같은 폴리뉴클레오티드 조절 요소를 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 한 실시양태에 따라서, 카세트는 폴리펩티드의 발현에 적합한 "발현 카세트"이다. 발현 카세트는, 그에 의해 전사 개시 요소의 전사 조절하에 있게 되는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI)와 같은 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 조절 요소로서, 하나 이상의 전사 개시 요소, 예를 들면 프로모터를 포함한다. 발현 카세트는 또한 전사 종결을 위한 적합한 조절 요소, 예컨대 폴리A 부위를 포함할 수 있다.
"카세트 (Cas-POI)"는 해당 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI), 제1 폴리뉴클레오티드 하류의 하나 이상의 정지 코돈, 및 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 정지 코돈 하류의 제2 폴리뉴클레오티드를 적어도 포함한다. 바람직하게는, 카세트 (Cas-POI)는 발현 카세트 (Exp-POI)이다.
"발현 카세트 (Exp-POI)"는 해당 폴리펩티드 (POI)의 발현에 적합한 발현 카세트를 한정한다. 발현 카세트로서 하나 이상의 전사 개시 요소를 포함한다. 상기 발현 카세트 (Exp-POI)는 하기에서 보다 상세히 설명될 본 발명의 사용 실시양태에 따라, 코딩 영역의 부분으로서 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI)를 포함하거나 또는 해당 폴리펩티드를 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI)를 삽입하기에 적합한 부위를 포함한다.
본 발명의 개괄적인 개념은 정지 코돈을 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI)와 폴리펩티드를 세포 표면에 고정시키는 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 위치시키는 것이다. 용어 "면역글로불린 막관통 앵커" 및 "면역글로불린 막관통 도메인"은 본원에서 동의어로 사용된다. 정지 코돈은 번역 종결 신호를 구성하거나 또는 그의 부분이고, 해당 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 자연발생적 정지 코돈일 수 있고 따라서 번역을 종결시키기 위해 자연발생적으로 사용된다. 카세트 (Cas-POI)의 디자인은 발현시에 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드가 전사체로 전사되고, 임의로 가공되어, 이후에 번역되면 2개의 상이한 폴리펩티드의 생성을 초래한다. 한 번역 변형에 따라서, 전사체의 번역은 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI)와 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 위치하는 (하나 이상의) 정지 코돈에서 중단된다. 상기 정지 코돈에서의 번역의 종결은 막관통 앵커를 포함하지 않는 폴리펩티드 생성물을 초래한다. 제2 번역 변형에 따라서, 상기 하나 이상의 정지 코돈을 초과하여 번역함으로써, 해당 폴리펩티드를 포함하고, 또한 세포막에 융합 폴리펩티드를 고정시킬 수 있는 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체가 융합된 번역 생성물을 제공한다. 이러한 융합 폴리펩티드는 포함된 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 단편을 통해 세포 표면으로 이동하여 그에 고정된다. 카세트 (Cas-POI)의 발현시에 상기 인프레임(in frame) 정지 코돈에서의 번역의 종결은, 번역초과(translational read-through)가 발생하여 상기 기재된 융합 폴리펩티드를 제공하므로 어느 정도는 "불완전(leaky)"하다는 것이 본 발명의 중요한 특징이다. 정지 코돈(들)의 선택 및 개수, 및 정지 코돈에 인접한 영역, 특히 정지 코돈 다음의 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 배양 조건에 의해서도 영향을 받을 수 있는 한정된 비율로, 이러한 번역 초과가 발생하기 때문에, 표면 결합된 융합 폴리펩티드의 수준은 해당 폴리펩티드의 발현 수준과 직접적으로 상관관계가 있다. 따라서 세포 표면 상에 존재하는 융합 폴리펩티드의 양은 어느 정도까지는 각각의 세포에 의한 해당 폴리펩티드의 전체 발현 수준에 비례하는데, 그 이유는 융합 폴리펩티드의 표면 발현과 해당 폴리펩티드의 발현에서의 숙주 세포의 생산성 사이에는 높은 연관성이 있기 때문이다. 따라서 표면 결합된 융합 폴리펩티드의 수준은 개개 세포의 전체 생산성을 대표하고 세포 표면 상에 표시되는 융합 폴리펩티드의 존재 또는 양을 기준으로 하나 이상의 진핵 숙주 세포의 선별을 가능하게 한다. a), b) 및 c) 단계를 포함하는 선별 사이클은 고생산성 진핵 숙주 세포의 효율적이고 재현가능한 동정 및 단리를 가능하게 한다.
적합한 검출/선별 방법, 예컨대 면역염색법, 유동 세포계수법, 형광 현미경법, MACS, 자기 비드와 같은 친화성 기반 방법 및 유사한 기법은 표면 결합된 융합 폴리펩티드의 존재 및 수준을 기준으로 고생산성 세포의 동정, 선별 및/또는 풍부화를 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 비생산성, 저생산성 및/또는 중간 생산성 세포로 이루어진 집단으로부터 고생산성 세포 집단 또는 하나 이상의 고생산성 세포의 선별 및 풍부화를 가능하게 함으로써 스크리닝의 어려움을 현저히 감소시킨다. 또한 여러 번, 바람직하게는 2회 또는 3회의 선별 및/또는 풍부화를 수행하는 것이 가능하다. 예를 들어 충분한 발현성 또는 고발현성 진핵 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은 예를 들어 막 고정된 융합 폴리펩티드를 인식하는 항체 또는 그의 단편과 같은 검출 화합물을 사용함으로써 선별가능하다. 상기 검출 화합물은 표지가 있을 수 있고 따라서 통상의 검출 방법에 의해 검출가능하다.
본 발명의 교시내용에 따라서, 면역글로불린 막관통 앵커/도메인의 적어도 단편이 해당 폴리펩티드를 세포 표면에 고정시키기 위해 사용된다. 전장 면역글로불린 막관통 앵커 대신에 단편이 사용되는 경우에, 각각의 단편은 융합 폴리펩티드를 세포 표면에 고정시킬 것이다. 면역글로불린 막관통 앵커/도메인 또는 그의 기능성 단편은 세포막에 매립되어 있어 그에 단단히 고정된다. 이와 같은 단단한 고정은 본 발명의 앵커를 예를 들어 GPI 앵커와 구분한다. 본 발명에 따라 사용되는 면역글로불린 막관통 앵커는 세포 표면에 대한 융합 폴리펩티드의 매우 강력하고 그에 따라 지속적인 고정을 제공하며, 이는 또한 단백질가수분해에 의한 유리(shedding)가 일어나지 않거나 또는 적어도 일어날 가능성이 낮다. 이는 정제 후에 수행된 생성물 분석에 의해 확인된다. 중쇄 종류를 함유하는 면역글로불린 막관통 앵커 (또는 면역글로불린 막관통 앵커 단편)는 수행된 질량 분광 분석법에서 발견되지 않는다. 유리된 융합 폴리펩티드에 의한 분비된 가용성 해당 폴리펩티드의 오염 위험성 또한 감소하기 때문에 선행기술에 비해 중요한 이점이 된다. 또한, 발현된 해당 폴리펩티드의 특성 분석에 따르면, 전통적인 클론/발현 시스템으로부터의 물질과의 유의한 차이점이 발견되지 않는다.
본 발명의 방법에 의해 수득된 세포는 한계 희석법 또는 유사 방법에 의해 클로닝된 세포보다 높은 평균 발현 수준을 갖는다. 이들은 또한 본 발명에 따르는 특정 막관통 도메인/앵커를 포함하지 않는 표준 벡터의 형질감염 후의, 예를 들어 유동 세포계수법에 의한 클로닝 세포보다 높은 평균 발현 수준을 갖는다.
본 발명의 스크리닝/선별 방법의 결과로서 동정된 세포는 일반적으로 원래 세포 집단의 선별되지 않은 세포로부터 단리될 것이고 풍부화될 수 있다. 이들은 개개의 세포로서 단리되고 배양될 수 있다. 이들은 또한, 임의로 추가의 정량 또는 정성 분석을 위한 1번 이상의 추가 선별에 사용가능하거나, 또는 예를 들어 단백질 생산을 위한 세포주의 개발에 사용가능하다. 한 실시양태에 따라서, 상기 기재된 바와 같이 선별된 고생산성 세포의 풍부화된 집단은 고수율로 해당 폴리펩티드를 생산하기 위한 집단으로서 직접 사용된다.
유리하게는, 해당 폴리펩티드의 막관통 변이체, 특히 항체를 공동발현하는 클론과, 해당 폴리펩티드의 막관통 변이체를 공동발현하지 않는 전통적인 벡터 구성으로부터 유도된 클론의 관찰된 성장 거동 및 생산성은 동일한 것으로 생각된다. 또한, 클론 생산 안정성 역시 동등하게 우수해 보인다.
또한,
a) 해당 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI), 제1 폴리뉴클레오티드 하류의 하나 이상의 정지 코돈, 및 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 정지 코돈 하류의 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 카세트 (Cas-POI)를 포함하는 이종성 핵산을 포함하는 복수 개의 진핵 숙주 세포를 제공하는 단계;
b) 해당 폴리펩티드가 발현되도록 진핵 숙주 세포를 배양시켜 해당 폴리펩티드의 적어도 일부가 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현되게 하며, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 상기 숙주 세포의 표면 상에 표시되는 것인 단계;
c) 세포 표면 상에 표시되는 융합 폴리펩티드의 존재 또는 양을 기준으로 하나 이상의 진핵 숙주 세포를 선별하는 단계;
d) 해당 폴리펩티드의 발현이 가능한 조건하의 배양 배지에서 선별된 진핵 숙주 세포를 배양시키는 단계
를 포함하는, 고수율로 해당 폴리펩티드를 생산하는 방법이 제공된다.
발현된 해당 폴리펩티드는 숙주 세포를 파열시킴으로써 수득될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 발현될 수 있는데, 예를 들면 배양 배지로 분비될 수 있고 그로부터 수득될 수 있다. 또한 각 방법의 조합도 가능하다. 이로써, 폴리펩티드는 고수율로 효율적으로 생산되고 수득/단리될 수 있다. 수득된 폴리펩티드는 또한 목적하는 특성의 해당 폴리펩티드를 생산하기 위해, 예를 들어 정제 및/또는 변이 단계와 같은 추가 가공 단계에 적용될 수 있다. 한 실시양태에 따라서, 상기 숙주 세포는 무혈청 조건하에서 배양된다. 상기 약술한 바와 같이, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI)와 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 단편을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 사이에 하나 이상의 정지 코돈을 삽입함으로써, 고발현성 숙주 세포의 선별이 가능하고, 이로써 고수율로 해당 폴리펩티드의 생산을 가능하게 한다. 따라서 본 발명의 선별/풍부화 단계는 전체 생산 공정의 필수적이고 중요한 구성이다.
본 발명의 교시내용에 따른 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 단편의 사용은 면역글로불린 분자를 생산할 때 특히 유리한데, 그 이유는 상기 면역글로불린 막관통 앵커는 자연발생적으로 세포 표면에 면역글로불린 분자를 고정시키는데에 적합하기 때문이다. 놀랍게도, 면역글로불린 막관통 앵커는 CHO 세포와 같은 포유동물 숙주 세포에서 면역글로불린 분자를 발현시킬 때 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 선행기술에 따르면 Ig 막관통 도메인을 앵커로서 사용할 경우에 항체의 표면 발현, 및 그에 따라 세포막에 고정된 발현을 달성하기 위해서는 상기 세포에서 Ig 알파 및 Ig 베타 수용체 사슬의 공동발현이 필요한 것으로 추정되기 때문에, 이와 같은 사실은 놀랍다. 이러한 보조 수용체는 예를 들면, 하이브리도마 또는 골수종 세포 (예를 들면, SP2/0 세포)와 같은 B 세포 및 B 세포 유도체에서는 자연발생적으로 발현되지만, CHO 세포와 같은 비(非)-B 세포에서는 발현되지 않는 것으로 생각된다. 그러나, 보조 수용체의 발현이 일어나지 않음에도 불구하고, 해당 폴리펩티드 및 특히 면역글로불린 분자의 표면 표시는 Ig 막관통 앵커/도메인을 사용할 경우에 CHO 세포와 같은 비-B 세포 유도체에서 잘 작동됨이 밝혀졌다. 따라서, 한 실시양태에 따라서, B 세포 또는 B 세포 유도체가 아닌 진핵 숙주 세포가 사용된다. 따라서, Ig 알파 및 Ig 베타 수용체 사슬을 자연발생적으로 발현하지 않는 진핵, 바람직하게는 포유동물 숙주 세포가 사용된다. 따라서, 바람직하게는 숙주 세포는 CHO 세포이다. 또한, 한 실시양태에 따라서, Ig 알파 및 Ig 베타 수용체 사슬의 인공적인 공동발현은 상기 진핵 숙주 세포에서 일어나지 않는다.
임의의 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 단편이 본 발명의 교시내용에 따라 사용가능하다. 특히, 면역글로불린 막관통 앵커는 IgM, IgA, IgE, IgG 및/또는 IgD 또는 상기의 기능성 변이체로부터 유도된 면역글로불린 막관통 앵커로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 면역글로불린 막관통 앵커는 IgG1, IgG2, IgG3 및/또는 IgG4로부터 유도된다. IgG1 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체가 특히 적합하다. IgG 유도된 막관통 앵커의 바람직한 예는 서열 2 및 서열 7로 표시된다.
한 실시양태에 따라서, 면역글로불린 막관통 앵커는 세포질 도메인을 포함한다. 세포질 도메인을 포함하는 면역글로불린 막관통 앵커의 사용은 그에 의해 융합 폴리펩티드의 세포 표면에의 매우 단단한 고정이 제공되기 때문에 바람직하다. 면역글로불린 세포질 도메인을 사용하는 것이 특히 적합하다. 한 실시양태에 따라서, 면역글로불린 세포질 도메인은 IgG, IgA 및 IgE 또는 상기의 기능성 변이체로부터 유도된다. 상기 면역글로불린 세포질 도메인은 IgD 및 IgM으로부터 유도된 것보다 더 크다. 서열 4 및 서열 6은 세포질 도메인으로서 사용가능한 IgG 유도된 세포질 도메인의 적합한 아미노산 서열을 나타낸다. IgG 유도된 세포질 도메인을 포함하는 IgG 유도된 막관통 앵커의 바람직한 예는 서열 3으로 표시된다.
따라서, 면역글로불린 막관통 앵커는 융합 폴리펩티드의 숙주 세포 표면에의 고정을 가능하게 하는, 서열 2 및/또는 서열 3으로 표시되는 폴리펩티드 서열 또는 그의 기능성 변이체, 특히 그의 기능성 단편을 포함할 수 있다.
적합한 카세트 (Cas-POI)의 소정의 구획의 뉴클레오티드 서열은 서열 1로 표시된다. 표시된 정보는 본 발명의 교시내용에 따라 사용가능한 특히 적합한 면역글로불린 (Ig) 막관통 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 번역초과에 적합한 인프레임 정지 코돈을 포함한다. 정지 코돈은 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 인프레임 하류에 위치하며 따라서 폴리뉴클레오티드 서열은 전사되어 아미노산 서열로 가공된다. 코딩 서열이란 아미노산으로 번역되는 서열을 말한다. 따라서, 정지 코돈은 코딩 서열에 속하지 않고 따라서 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에도 속하지 않는다. 정지 코돈은 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 자연발생적 정지 코돈일 수 있다. 이 경우에, 추가의 정지 코돈(들)이 필요하지 않을 수 있지만 존재할 수도 있다 (상기 참조).
카세트 (Cas-POI)의 제2 폴리뉴클레오티드는 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 코딩할 수 있으며, 이는 서열 2로 표시되는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 서열 3은 적합한 면역글로불린 막관통 도메인의 또다른 변이체를 표시하며, 이는 또한 세포질 도메인 (서열 4가 세포질 도메인만을 표시함), 불완전 정지 코돈 및 추가 코돈 (WL)에 상응하는 추정 아미노산 및 연결 영역 (서열 5가 연결 영역만을 표시함)을 포함한다. 또한 다른 아미노산이 선택된 정지 코돈 및/또는 정지 코돈의 개수 및 사용된 인접 코돈(들)에 따라서, 하나 이상의 정지 코돈 및 인접 코돈에 상응하는 위치에 존재할 수 있다. 이들 아미노산은 단지 융합 폴리펩티드에 존재하기 때문에, 해당 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경하지 않는다. 따라서, 서열 2 또는 서열 3으로 표시되는 폴리펩티드 서열 또는 그의 기능성 변이체, 특히 그의 기능성 단편을 포함하는 면역글로불린 막관통 도메인은 본 발명의 교시내용에 따른 막관통 앵커로서 사용가능하고, 따라서 기재된 방법 및 기재된 벡터 및 숙주 세포에서 사용가능하다.
본 발명에 따른 면역글로불린 막관통 앵커의 "기능성 변이체"는 융합 폴리펩티드의 세포 표면에의 막관통 고정을 가능하게 하는, 각각의 자연발생적 면역글로불린 막관통 도메인 및 상기의 기능성 단편의 아미노산 서열에 대하여 하나 이상의 아미노산 서열 교환 (예를 들면, 결실, 치환 또는 부가)을 갖는 면역글로불린 막관통 앵커를 포함한다.
번역 종결 신호 및 정지 코돈으로서 단백질 합성의 종결을 신호하는 3개의 정지 코돈 (TAA (UAA), TAG (UAG) 및 TGA (UGA) - 또한 다양한 테트라뉴클레오티드 주변, 하기 참조) 중 어느 하나가 목적하는 수준의 억제에 따라서, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI)와 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에서 사용될 수 있다 (번역초과). 상기 약술한 바와 같이, 정지 코돈은 또한 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 자연발생적 정지 코돈일 수 있다. 바람직하게는, 상기 번역 종결 신호는 번역초과를 촉진하기 위해 불완전한 종결 효율을 갖는다. 정지 코돈의 "불완전성"은 또한 하나 이상의 정지 코돈에 인접하여 그의 하류에 있는 코돈(들)에 의해 영향을 받으며, 특히 제1 뉴클레오티드는 전사 번역초과에 영향을 미칠 수 있다 (하기 참조).
카세트 (Cas-POI)는 해당 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하기 위해 전사될 필요가 있다. 그러므로, 한 실시양태에 따라서, 카세트 (Cas-POI)는 발현 카세트이다. 추가의 실시양태에 따라서, 카세트 (Cas-POI)는 숙주 세포의 게놈으로 통합되어 카세트 (Cas-POI)는 숙주 세포의 전사 개시 요소, 예컨대 프로모터의 전사 조절하에 있게 된다.
카세트 (Cas-POI)에 포함된 핵산의 전사는
- 그의 번역이 해당 폴리펩티드를 초래하는 제1 폴리뉴클레오티드;
- 상기 제1 폴리뉴클레오티드 하류의 하나 이상의 정지 코돈;
- 그의 번역이 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 초래하는, 상기 정지 코돈 하류의 제2 폴리뉴클레오티드
를 적어도 포함하는 전사체를 초래한다.
전사체의 적어도 일부는 하나 이상의 정지 코돈의 번역초과에 의해 해당 폴리펩티드 및 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드로 번역된다. 번역초과는 정지 코돈의 선택/번역 종결 신호의 디자인에 따라 자연발생적으로 일어날 수 있거나 또는 예를 들어 종결 억제제를 사용하여 배양 조건을 적합화함으로써 유도될 수 있다 (하기 참조).
본 발명의 방법에 사용된 카세트 (Cas-POI)는 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 단편에 대한 코딩 서열의 상류에 단 하나의 정지 코돈을 포함할 수 있다. 그러나, 동일하거나 상이할 수 있는, 일련의 2개 이상의 정지 코돈, 예를 들면 2개 또는 3개 또는 4개의 정지 코돈을 사용하는 것도 가능하다. 또한 정지 코돈의 주변, 즉 트리뉴클레오티드 정지 코돈 자체 및 정지 코돈의 바로 하류에 있는 각각의 코돈의 뉴클레오티드(들)도 번역초과 수준에 영향을 미친다. 그러나, 배양 조건을 조정함으로써 한 실시양태에 따라 달성가능한 융합 폴리펩티드를 생산하기 위해서는 특정 수준의 번역초과가 일어남을 보장할 필요가 있다.
1차 전사체는 인트론을 포함하는 미성숙 mRNA일 수 있다. 각각의 미성숙 mRNA는 mRNA로 가공 (스플라이싱)될 것이다. 별법으로, 전사는 직접 mRNA를 생성할 수 있다. mRNA 전사체의 번역 동안에 통상적으로 정지 코돈(들)의 자연발생 수준의 배경 번역초과가 있거나 또는 각각의 번역초과 수준이 배양 조건을 적합화함으로써 유도될 수 있다. 이러한 번역초과 수준은 또한 사용된 정지 코돈(들)의 개수 및 특성, 하류 정지 코돈 및 특히 정지 코돈(들)의 테트라뉴클레오티드 주변 및 배양 조건에 따라 좌우되는 특정 비율의 융합 폴리펩티드를 초래한다. 따라서, 특정 비율의 융합 폴리펩티드가 정지 코돈의 존재에도 불구하고 본 발명의 교시내용에 따라 생산된다. 이러한 융합 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드를 세포 표면에 단단히 고정시키는, 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 포함한다. 그 결과, 융합 폴리펩티드는 숙주 세포의 표면에 표시되고, 고수준의 막 고정된 재조합 융합 폴리펩티드 (고수준의 분비된 폴리펩티드를 의미함)를 표시하는 세포는 예를 들어 유동 세포계수법에 의해, 특히 적절하게 표지된 검출 화합물과 접촉시키는 형광 활성화 세포 분류법 (FACS)에 의해 선별될 수 있다.
불완전한 번역 종결 효과를 갖는 적합한 번역 종결 신호 및 종결 코돈 및 종결 코돈 구성은 선행기술에 개시된 바와 같이 디자인될 수 있다 (예를 들면, 본원에 참조로 인용되는, 문헌 [Li et al. 1993, Journal of Virology 67 (8), 5062-5067]; 문헌 [McCughan et al. 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 5431-5435]; 문헌 [Brown et al 1990, Nucleic Acids Research 18 (21) 6339-6345] 참조).
한 실시양태에 따라서, 하기 정지 코돈 구성이 사용되고; 정지 코돈은 밑줄친 볼드체로 표시되었다.
TGA CTA 코딩 가닥, 및 그에 따라 DNA 수준에 대한 정지 코돈 구성의 뉴클레오티드 서열; 정지 코돈은 밑줄친 볼드체로 표시됨.
UGA CUA RNA 수준에 대한 정지 코돈 구성의 뉴클레오티드 서열
W L 번역초과가 일어날 경우에 정지 코돈 및 인접 코돈에 상응하는 추정 아미노산; 따라서 표시된 폴리뉴클레오티드의 가장 가능성이 높은 번역초과 생성물을 나타냄.
정지 코돈의 번역초과로 인해 융합 폴리펩티드로 도입되는 추가의 아미노산은, 융합 단백질이 세포 표면 상에 표시되는 한, 어느 종류의 것도 가능하다. 상기 추가의 아미노산은 융합 폴리펩티드로 도입될 뿐이기 때문에, 해당 폴리펩티드의 아미노산은 변경되지 않는다.
해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI) 다음에 다수의 정지 코돈을 사용하는 것이 가능한 것 이외에도, 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 단편을 코딩하는 서열의 하류에 다수의 정지 코돈을 사용하는 것이 통상적으로 유리할 것이다. 상기 위치에 다수의 정지 코돈, 예를 들어 약 10개 이하의 정지 코돈, 약 6개 또는 8개 이하의 정지 코돈, 약 2개, 3개, 4개 또는 5개의 정지 코돈을 사용하는 것이 효율적인 번역 종결을 보장할 것이다.
세포 표면 상에 존재하며 따라서 검출가능한 융합 폴리펩티드의 양은 통상적으로 융합 폴리펩티드가 세포막에 고정되어 있어 발현이 계속됨에 따라 세포 표면 상에 축적되기 때문에 폴리펩티드 합성 동안에 증가한다. 한 실시양태에 따라서, 카세트 (Cas-POI)는 정지 코돈 번역초과가 대략 ≤ 50%, ≤ 25%, ≤ 15%, ≤ 10%, ≤ 5%, ≤ 2.5%, ≤ 1.5%, ≤ 1% 또는 ≤ 0.5% 미만의 융합 폴리펩티드를 초래하도록 작제된다. 나머지 부분은 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 단편을 포함하지 않는 폴리펩티드 형태로서 생산된다. 기재된 바와 같이, 정지 코돈 번역초과의 수준은 정지 코돈(들)의 선택 및 개수, 및 정지 코돈에 인접한 영역, 특히 정지 코돈 다음의 뉴클레오티드 뿐만 아니라, b) 단계 동안에 사용된 배양 조건에 의해 영향을 받을 수 있다.
주어진 작제물에서 주어진 정지 코돈에 대한 자연발생 수준의 배경 번역초과와 같은 인자에 따라, 몇몇 경우에는 배경 번역초과 수준을 추가로 감소시키기 위해 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI)와 면역글로불린 막관통 앵커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 1개 초과의 정지 코돈을 사용하는 것이 바람직할 수 있다 (상기 참조). 비교적 낮은 번역초과 수준의 일반적인 이점은 고생산성 대 초고 생산성 클론의 보다 우수한 분리를 유도하는, 후속 선별/풍부화 및 분류 절차 (바람직하게는 FACS에 의해 수행됨)에서의 고도의 엄격함이다. 번역초과 수준이 너무 높으면, 막 결합 폴리펩티드에 대한 세포 표면 용량의 포화가 일어날 수 있어, 발현 수준, 특히 고발현 수준의 판별을 방해할 수 있다. 따라서, 초고 발현성 클론을 선별하기 위해서는 비교적 낮은 번역초과 수준이 유리하다. 따라서, 바람직하게는 단지 ≤ 5%, ≤ 2% 또는 심지어 ≤ 1.5%의 전사체가 융합 폴리펩티드로 번역된다.
그러나, 필요에 따라, 예를 들어 배양 동안에 종결 억제제를 사용함으로써 번역초과 수준을 증가시킬 수도 있다. b) 단계 동안에 배양 배지에 종결 억제제를 사용하는 것은 배양 조건에 의해 정지 코돈의 번역초과 수준에 영향을 미치는 한 방법이다. 종결 억제제는 정지 코돈의 존재로 인한 번역 종결을 억제할 수 있는 화학 제제이다. 특히, 종결 억제제는 아미노글리코시드 군에 속하는 항생제이다. 아미노글리코시드 항생제는 대체 아미노산을 정지 코돈 부위에 삽입함으로써, 보통은 번역 종결을 초래하였을 정지 코돈 또는 정지 코돈 구성의 "번역초과"를 초래하는 능력으로 알려져 있다. 아미노글리코시드 항생제는 G-418, 젠타마이신, 파로모마이신, 하이그로마이신, 아미카신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸미신, 스트렙토마이신 및 토브라마이신을 포함한다. 그러나, 낮은 번역초과 수준이 유리하기 때문에, 바람직하게는 종결 억제제의 부재하에 선별을 수행한다.
본 발명은 번역 정지 코돈 번역초과가 적어도 낮은 비율로 일어나거나 또는 종결 억제제의 첨가에 의해 유도될 수 있는 임의 유형의 숙주 세포에 적용가능하다. 적합한 진핵 숙주 세포는 예를 들면, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주, 녹색 원숭이 세포주 (COS), 마우스 세포 (예를 들면, NS/0), 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포주, 및 인간 세포 및 세포주를 포함하는 포유동물 숙주 세포이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 CHO 세포주이다.
1 사이클의 선별이 우수한 생산성의 숙주 세포를 동정하는데 충분하지만, 한 실시양태에 따라서, 2번 이상의 선별 사이클이 수행되고, 각각의 선별 사이클에서 하나 이상의 진핵 숙주 세포가 세포 표면 상에 표시되는 융합 폴리펩티드의 존재 또는 양을 기준으로 선별된다. 실험 결과는 제2 선별 사이클이 통상적으로 개선된 결과를 유도함을 입증한다.
한 실시양태에 따라서, 선별 단계 c)는 복수 개의 숙주 세포를 융합 폴리펩티드와 결합하는 검출 화합물과 접촉시키고 세포 표면에 결합된 검출 화합물의 존재 또는 양을 기준으로 하나 이상의 숙주 세포를 선별하는 것을 포함한다.
융합 폴리펩티드와의 결합을 위해 사용되는 검출 화합물은 하기 특성 중 하나 이상을 가질 수 있다:
- 상기 화합물은 표지됨;
- 상기 화합물은 형광 표지됨;
- 상기 화합물은 항원임;
- 상기 화합물은 면역글로불린 분자 또는 그의 결합 단편임;
- 상기 화합물은 단백질-A, -G 및/또는 -L임.
세포 표면에서 융합 폴리펩티드와의 결합에 사용되는 검출 화합물은 예를 들면 융합 폴리펩티드를 인식하는, 면역글로불린 분자 또는 그의 단편, 예컨대 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 기본적으로 융합 폴리펩티드의 모든 접근가능한 부분이 검출가능하고, 그에 따라서 가용성 형태로 융합 폴리펩티드와 동시에 분비되는 해당 폴리펩티드에 상응하는 부분도 검출가능하다.
한 실시양태에 따라서, 검출 화합물은 항원이다. 상기 실시양태는 발현된 해당 폴리펩티드가 예를 들어 면역글로불린 분자 또는 그의 단편, 예컨대 각각의 항원과 결합하는 항체인 경우에 적합하다.
검출 및 선별을 가능하게 하기 위해, 융합 폴리펩티드와의 결합에 사용되는 상기 검출 화합물은 표지될 수 있다. 세포 표면 상에 표시된 융합 폴리펩티드와 결합하는 표지된 검출 화합물은 세포 표면을 표지하고 각각 염색한다. 숙주 세포에 의해 발현된 융합 폴리펩티드의 양이 많을수록, 보다 많은 표지된 검출 화합물이 결합된다. 이는 결합된 검출 화합물의 존재 뿐만 아니라 그 양을 표지에 의해 결정할 수 있기 때문에 숙주 세포의 선별을 용이하게 수행할 수 있다는 이점을 갖는다. 고생산성 숙주 세포를 선별하기 위해, 그러한 숙주 세포는 검출 화합물에 의해 매우 효과적으로 각각 집중적으로 표지된 숙주 세포 집단으로부터 선별된다. 형광 표지는 형광 검출 방법, 예컨대 유동 세포계수법에 의한 용이한 검출을 가능하게 하기 때문에 바람직하다. 적합한 형광 표지는 당업자에게 알려져 있다.
한 실시양태에 따라서, 1 사이클 이상의 선별, 바람직하게는 2 또는 3 사이클의 선별이 세포 표면에 대한 검출 화합물의 결합도를 기준으로 하나 이상의 진핵 숙주 세포를 선별하기 위해 수행될 수 있다. 상기 실시양태에 따라서, 하나 이상의 진핵 숙주 세포는 각각의 선별 사이클에서 결합된 검출 화합물의 양을 기준으로 선별된다. 따라서, 매우 효과적으로/집중적으로 표지된 숙주 세포는 세포 표면 염색의 정도, 즉 양을 기준으로 선별된다. 예를 들면, 숙주 세포의 상위 5% 또는 상위 2%가 선별될 수 있다.
다수의 진핵 숙주 세포가 풀(pool)로서 함께 선별되어야 하는 경우에 (소위 풀 풍부화), 다수의 세포, 예를 들면 10개 이상, 50개 이상, 500개 이상, 1000개 이상 또는 50000개 이상이 선별되고 세포 풀에 포함된다. 상기 실시양태는 본 발명의 교시내용에 따라 선별된 다수의 고생산성 숙주 세포를 포함하는 세포 풀이 예를 들어 세포 클론보다 더 신속히 증식될 수 있기 때문에 대량의 해당 폴리펩티드를 신속히 수득하는데 있어서 특히 유리하다.
따라서, 선택적인 세포 클로닝에 적용하는 것 이외에도, 본 발명은 고생산성 세포의 풀 풍부화에도 사용가능하므로, 클론 세포주와 유사한 역가를 달성할 수 있다.
세포 표면, 특히 융합 폴리펩티드에 대한 검출 화합물의 결합도를 기준으로 고생산성 숙주 세포가 단리될 수 있고/있거나 고생산성 세포의 집단이 풍부화될 수 있다. 숙주 세포 표면 상의 융합 폴리펩티드와의 검출 화합물의 결합은 유동 세포계수법, 바람직하게는 형광 활성화 세포 분류법 (FACS)에 의해 검출가능하다.
바람직한 실시양태에서, 다량의 융합 폴리펩티드를 포함하여 따라서 고강도 신호를 나타내는 숙주 세포는 형광 활성화 세포 분류법 (FACS)을 사용하여 분류된다. 본 발명의 명세서에서, FACS 분류법은 고수율로 해당 폴리펩티드를 발현하는 세포를 동정하고 풍부화하기 위한 대량의 숙주 세포의 신속한 스크리닝을 가능하게 하기 때문에 특히 유리하다. 바람직한 실시양태에 따라서 대략 단지 5% 이하의 폴리펩티드가 융합 폴리펩티드로서 생산되기 때문에, 세포 표면 상에서 검출된 고형광은, 예를 들어 배양 배지로 분비될 수 있는 해당 폴리펩티드의 고발현에 상응한다. 최고 형광 비율을 나타내는 세포가 FACS에 의해 동정 및 단리될 수 있다. FACS에 의해 측정된 형광과 생산된 폴리펩티드의 양 사이에 양의 통계학적으로 유의한 상관관계가 실시예에서 관찰되고 확인되었다. 따라서, FACS 분류법은 일반적으로 해당 폴리펩티드를 발현하는 세포를 동정하기 위한 정성 분석에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 실제로 해당 폴리펩티드를 고수준으로 발현하는 숙주 세포를 동정하기 위해 정량적으로 사용될 수 있다. 따라서, 고생산성 숙주 세포는 세포 표면에 고정된, 융합 폴리펩티드에 대한 표지된 검출 화합물의 결합도를 기준으로 선별/풍부화될 수 있다. 이로써, 최고 생산성 세포가 선별/풍부화될 수 있다. 실험 결과로부터 FACS 분석법과 함께 본 발명에 따른 선별 방법을 사용함으로써 선별된 세포 집단에서 비생산성 클론의 상당한 감소가 유도되었음을 알 수 있다. 또한, 클론의 매우 증가된 평균 생산성은 예를 들어 생물약제 생산을 위한 세포주 개발 과정에서 클론 스크리닝의 어려움을 현저히 감소시킨다. 따라서, 매우 많은 후보물질 또는 프로젝트를 위한 세포주를 전통적인 스크리닝 접근법에 비해 적은 자원으로 개발할 수 있다. 또한, 상기 방법은 상당 시간을 소요하는 생산성 분석법 대신에 표면 염색 및 FACS 분석법에 의해 형질감염되고 선별된 풀의 생산력 및 클론 분포의 평가를 가능하게 한다. 표면 염색은 또한 세포 집단의 동종성과 관련하여 클론 생산 안정성을 분석하는데도 사용가능하다. 형성될 수 있는 비생산성 또는 저생산성 소집단은 용이하게 검출가능할 것이다.
한 실시양태에 따라서, 카세트 (Cas-POI) 및/또는 (CAS-POI')는
- 제1 폴리뉴클레오티드의 하류에 위치하는 하나 이상의 정지 코돈의 하류에 위치하는 친화성 태그(tag)를 코딩하고, 또한 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치하는 폴리뉴클레오티드 (Pn-TAG), 및/또는
- 선별가능한 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (Pn-MARKER)
를 더 포함한다.
정지 코돈과 면역글로불린 막관통 앵커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 상기 정의된 폴리뉴클레오티드 (Pn-TAG)를 제공하는 것은 친화성 태그가 융합 단백질로 도입되는 이점을 갖는다. 친화성 태그는 하나 이상의 정지 코돈의 하류에 위치하기 때문에, 해당 폴리펩티드의 융합 변이체에 포함된다. "친화성 태그"란 항체와 같은 결합 화합물/제제에 의해 검출/결합될 수 있는 단쇄 아미노산 서열을 말한다. 기본적으로, 친화성 태그는 포획 제제 및/또는 검출 화합물을 위한 표적으로서 사용된다. 친화성 태그는 해당 폴리펩티드와 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체 사이에 위치하기 때문에, 이 역시 세포 표면 상에 표시되고 따라서, 예를 들어 검출 화합물에 대하여 접근가능하다. 따라서 친화성 태그는 적합한 진핵 숙주 세포의 선별을 가능하게 하기 위해 검출 화합물을 위한 표적으로서 기능할 수 있다. 예를 들어 잘 특성화된 친화성 태그를 검출/선별을 위한 표적으로서 사용하는 것은 존재하는 잘 특성화된 검출 화합물이 검출에 사용가능하기 때문에 유리하다. 또한, 동일한 검출 화합물이 발현될 상이한 종류의 해당 폴리펩티드에 대하여 사용가능하다. 상이한 해당 폴리펩티드에 대하여 특이적인 검출 화합물의 생성은, 친화성 태그에 대하여 특이적인 동일한 검출 화합물이 사용가능하기 때문에 상기 실시양태에 따라서 더 이상 필요하지 않을 것이다. 친화성 태그는 융합 폴리펩티드의 필수적인 부분을 구성하기 때문에 이것 역시 막관통 앵커의 존재로 인해 진핵 숙주 세포의 표면에 단단히 고정된다. 단단히 고정된 융합 폴리펩티드는 잘 유리되지 않아야 한다 (상기 참조).
막 결합된 융합 단백질의 유리는, 분비된 폴리펩티드의 목적하는 용도에 따라, 면역글로불린 막관통 앵커를 사용할 경우에는 드문 사건이기는 하지만 오염 문제를 일으킬 수 있다. 예를 들어, 치료용 폴리펩티드/단백질 발현의 경우에, 가능한 한 순수한 분비 생성물을 수득하는 것이 바람직하다. 예를 들어 His 태그와 같은 친화성 태그를 사용할 경우에, 상기 친화성 태그는 적어도 부분적으로 유리된 단백질에 포함될 것이다. 친화성 태그의 존재 덕분에 통상의 친화성 정제 방법 (예를 들면, His 태그의 경우에 Ni -NTA)을 사용하여 분비된 폴리펩티드의 샘플로부터 유리된 융합 폴리펩티드 (존재할 경우에)를 제거하는 것이 가능하다. 따라서 친화성 태그는 샘플로부터 잠재적인 오염을 용이하게 제거하는데에 유용하다.
또한, 친화성 태그는 발현/수득된 폴리펩티드의 순도를 조절하기 위해 사용될 수 있다. 고순도의 단백질/폴리펩티드가 필요한 적용의 경우에, 수득된 생성물이 순수하고 따라서 유리된 융합 폴리펩티드로 인한 오염을 포함하지 않음을 확인하기 위한 적합한 분석법을 제공하는 것이 유리하고/필수적일 수 있다. 이러한 분석법은 친화성 태그의 검출을 기반으로 할 수 있다. 친화성 태그가 단지 융합 폴리펩티드에 존재하기 때문에, 이것은 샘플내 융합 폴리펩티드 (또는 그의 분해/유리된 형태)의 존재에 대한 특이적인 마커로서 사용가능하다. 친화성 태그가 친화성 태그에 대해 특이적인 검출 화합물을 사용할 경우에 수득된 생성물에서 검출가능하다면, 샘플내에 극소량의 유리된 융합 폴리펩티드가 여전히 존재하고 샘플은 그 양에 따라 추가 정제를 요할 수 있다. 친화성 태그가 샘플에서 검출가능하지 않다면, 분석 샘플에서 유리된 융합 폴리펩티드는 전혀 존재하지 않거나 또는 매우 소량으로 존재하여 샘플이 목적하는 적용에 있어서 충분히 순수함을 보장해야 한다.
따라서, 해당 폴리펩티드를 생산할 때, 수득된 해당 폴리펩티드는
- 친화성 태그를 표적화하는 친화성 정제에 의해 유리된 융합 폴리펩티드의 오염을 제거하고/하거나
- 친화성 태그를 표적화함으로써 유리된 융합 단백질의 존재 또는 부재를 검출함으로써 추가로 가공될 수 있다.
친화성 태그의 적합한 예는 V5, His 태그, FLAG, 스트렙(Strep), HA, c-Myc 등이다. 적합한 친화성 태그는 또한 인공적으로 형성가능하다.
추가의 실시양태에 따라서, 카세트 (Cas-POI) 및/또는 (Cas-POI')는 선별가능한 마커를 코딩하는 추가의 폴리뉴클레오티드 (Pn-MARKER)를 포함한다. 바람직하게는, 상기 선별가능한 마커는 면역글로불린 막관통 앵커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하류에 위치하고 따라서 작제물의 발현시에 융합 폴리펩티드가 표시될 때 세포막의 세포질 부위에 위치한다. 한 실시양태에 따라서, 융합체로서 발현되어야 하기 때문에, 면역글로불린 막관통 앵커/도메인 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 폴리뉴클레오티드 (Pn-MARKER) 사이에 정지 코돈이 위치하지 않는다. 적합한 정지 코돈 및 전사 종결 신호는 폴리뉴클레오티드 (Pn-MARKER)의 발현 후에 효과적인 전사 및 번역 종결을 보장하기 위해 폴리뉴클레오티드 (Pn-MARKER)의 코딩 서열의 하류에 제공되어야 한다. 상기 폴리뉴클레오티드 (Pn-MARKER)는 예를 들면, 약제 내성 유전자 또는 리포터 유전자일 수 있다. 적합한 예가 본원에 기재되어 있다. 한 실시양태에 따라서, 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 루시퍼라제가 리포터로서 사용된다. 이는 2개의 융합 단백질 특성을 기준으로 진핵 숙주 세포의 선별을 가능하게 한다.
한 실시양태에 따라서, 카세트 (Cas-POI) 및/또는 (Cas-POI')는 발현 카세트이다. 당업자라면 본 발명의 방법을 수행하기 위한 적합한 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주를 선택할 수 있을 것이다. 예를 들어, 벡터의 선택에서, 벡터는 숙주 내에서 복제될 수 있을 필요가 있고/있거나 염색체로 통합될 수 있어야 하기 때문에 숙주가 고려되어야 한다. 본 발명에 따른 선별 및 생산 방법에서 사용가능한 적합한 벡터는 또한 하기 상세한 설명 및 특허청구범위에서 설명될 것이다.
해당 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI)를 위한 삽입 부위 및/또는 해당 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI)를 포함하는 하나 이상의 카세트 (Cas-POI), 제1 폴리뉴클레오티드 하류의 하나 이상의 정지 코돈, 및 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 정지 코돈 하류의 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 진핵, 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서 하나 이상의 해당 폴리펩티드를 발현시키는데 적합한 벡터 핵산 또한 제공된다.
본 발명에 따른 "백터 핵산"은 하나 이상의 외래 핵산 단편을 운반할 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. 벡터 핵산은 핵산의 단편을 숙주 세포에 전달하는 "분자 운반체"와 같이 기능한다. 벡터 핵산은 조절 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 벡터 핵산은 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 외래 폴리뉴클레오티드는 벡터 핵산의 발현 카세트(들)로 삽입되어 그로부터 발현될 수 있다. 본 발명에 따른 벡터 핵산은 원형 또는 선형 형태로 존재할 수 있다. 용어 "벡터 핵산"은 또한 외래 핵산 단편의 이동을 가능하게 하는 인공 염색체 또는 유사한 각각의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
각각의 벡터는 상기 기재된 스크리닝 및 생산 방법을 수행하기 위한 발현 벡터로서 사용가능하다. 각각의 벡터 핵산의 이점은 또한 스크리닝 방법과 관련하여 상기 기재되어 있다.
상기 벡터 핵산은
- 해당 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI);
- 포유동물의 선별가능한 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트 (Exp-MSM); 및/또는
- 포유동물의 증폭가능하고 선별가능한 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트 (Exp-MASM)
을 적어도 더 포함할 수 있다.
발현 카세트 (Exp-MSM)은 포유동물의 선별가능한 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트를 한정한다.
발현 카세트 (Exp-MASM)은 포유동물의 증폭가능하고 선별가능한 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트를 한정한다.
용어 "5'" 및 "3'"는 유전자 요소의 위치 및/또는 예를 들어 5' → 3' 방향으로 진행되는 RNA 폴리머라아제에 의한 전사 또는 리보솜에 의한 번역과 같은 사건의 방향 (5' → 3')과 관련하여 핵산 서열의 특징을 설명하는데에 사용되는 관용어이다. 동의어는 상류 (5') 및 하류 (3')이다. 통상적으로, DNA 서열, 유전자 맵, 벡터 카드 및 RNA 서열은 좌측에서부터 우측 방향으로 5' → 3'으로 나타내거나 또는 5' → 3' 방향은 화살표로 표시되며, 여기서 화살표머리가 3' 방향을 가리킨다. 따라서, 이러한 관례를 따르면, 5' (상류)는 좌측 쪽으로 향하여 위치하는 유전자 요소를 나타내고, 3' (하류)는 우측 쪽으로 향하여 위치하는 유전자 요소를 나타낸다.
발현 카세트의 배열 및 배향 또한 중요한 측면이다. 한 실시양태에 따라서, 발현 카세트 (Exp-MASM)은 발현 카세트 (Exp-POI)의 5'에 위치하고 발현 카세트 (Exp-MSM)은 발현 카세트 (Exp-POI)의 3'에 위치한다. 추가의 발현 카세트, 예컨대 추가의 해당 폴리펩티드의 발현을 위한 추가의 발현 카세트 (Exp-POI')가 발현 카세트 (Exp-POI)와 (Exp-MSM) 사이에 삽입될 수 있다 (하기에 더욱 상세히 설명됨). 발현 카세트 (Exp-MASM), (Exp-POI) 및 (Exp-MSM)은 바람직하게는 모두 동일한 5' → 3' 배향으로 배열된다. 본 발명의 발명자들은 이러한 특정 벡터 핵산 배위가 고수율로 세포주를 신속히 생산할 수 있도록 함을 발견하였다.
한 별법에 따라서, 발현 카세트 (Exp-POI)는 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI)를 포함하지 않는다. 따라서, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI)를 포함하지 않는, 발현 카세트 (Exp-POI)를 갖는 "비발현성(empty)" 발현 벡터가 제공된다. 그러나, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI)는 적절한 클로닝 방법을 사용함으로써, 예를 들면 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI)를 발현 카세트 (Exp-POI)에 삽입하기 위해 제한 효소를 사용함으로써 발현 카세트 (Exp-POI)에 도입될 수 있다. 이러한 목적을 위해 발현 카세트 (Exp-POI)는 예를 들어 모든 리딩 프레임(reading frame)에서 사용가능한, 예를 들어 복수 클로닝 부위 (MCS)를 포함할 수 있다. 각각의 "비발현성" 벡터 핵산은 예를 들면 소비자에게 제공된 후에, 그의 특정 해당 폴리뉴클레오티드가 발현 카세트 (Exp-POI)에 삽입될 수 있다. 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI)는 정지 코돈이 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI)와 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 존재하도록 삽입된다. 발현 카세트 (Exp-POI)는 또한 대체 폴리뉴클레오티드 또는 충전 핵산 서열을 포함할 수 있고, 이들은 절개되어 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI)에 의해 대체가능하다. 본 발명은 또한 해당 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI), 제1 폴리뉴클레오티드 하류의 하나 이상의 정지 코돈, 및 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 정지 코돈 하류의 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 (Exp-POI)를 포함하는, 상기 기재된 바와 같은 벡터 핵산을 제공한다. 상기 실시양태는 기본적으로 최종 발현 벡터 핵산에 관한 것이다. 기본적으로 카세트 (Cas-POI)가 발현 카세트 (Exp-POI) 대신에 사용되는 경우에도 마찬가지로 적용된다.
한 실시양태에 따라서, 벡터 핵산은 원형이고 발현 카세트 (Exp-MSM)은 발현 카세트 (Exp-POI)의 3'에 배열되고 발현 카세트 (Exp-MASM)은 발현 카세트 (Exp-MSM)의 3'에 배열된다.
본 발명에 따른 발현 벡터는 해당 폴리펩티드의 발현을 위한 추가의 발현 카세트 (Exp-POI')를 포함할 수 있다. 최종 벡터 핵산에서, 상기 추가의 발현 카세트 (Exp-POI')는 추가의 해당 폴리펩티드의 발현을 위한 추가의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 발현될 폴리펩티드에 따라서, 상기 추가의 발현 카세트 (Exp-POI')는 정지 코돈에 의해 추가의 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 분리되는, 막 앵커 (또는 각각의 앵커, 예컨대 GPI 앵커를 부착시키기 위한 신호 펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 따라서, 상이한 폴리펩티드의 발현을 위한 다수의 발현 카세트가 본 발명에 따른 발현 벡터에 배열되는 것도 가능하다. 그러나, 발현 카세트 (Exp-POI) 만이 해당 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI) 하류의 불완전 정지 코돈 조합체 및 그에 따른 정지 코돈, 및 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 정지 코돈 하류의 제2 폴리뉴클레오티드를 가질 필요가 있고, 추가의 발현 카세트 (Exp-POI')는 각각의 정지 코돈 조합체를 가질 수 있거나 또는 갖지 않을 수 있다.
해당 폴리펩티드의 발현을 위한 2개 이상의 발현 카세트 (Exp-POI) 및 (Exp-POI')를 사용하는 각각의 실시양태는, 면역글로불린 분자 또는 그의 기능성 단편이 발현되는 경우에 특히 유리하다. 따라서,
- 중쇄 및/또는 경쇄의 면역글로불린 분자 또는 그의 기능성 단편을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, 제1 폴리뉴클레오티드 하류의 하나 이상의 정지 코돈, 및 적어도 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 단편을 코딩하는 정지 코돈 하류의 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 (Exp-POI); 및/또는
- 상응하는 경쇄 및/또는 중쇄의 면역글로불린 분자 또는 그의 기능성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 추가의 발현 카세트 (Exp-POI')
를 포함하는, 하나 이상의 면역글로불린 분자 또는 그의 기능성 단편의 발현을 위한 벡터 핵산이 제공된다. 발현 카세트 (Exp-POI')는 발현 카세트 (Exp-POI)의 면역글로불린 사슬에 상응하는 면역글로불린 사슬을 코딩한다 (즉, 발현 카세트 (Exp-POI)가 중쇄를 코딩한다면, 발현 카세트 (Exp-POI')는 경쇄를 코딩하고, 그 반대도 마찬가지임). 따라서, 기능성 면역글로불린 분자 (또는 그의 단편)가 벡터로부터 발현될 수 있다.
중쇄 또는 그의 기능성 단편이 발현 카세트 (Exp-POI)로부터 발현되고 그에 따라 어느 정도까지는 융합 폴리펩티드로서 발현되는 것이 바람직하다. 상응하는 경쇄 또는 그의 기능성 단편은 한 실시양태에 따라서 발현 카세트 (Exp-POI')로부터 발현된다. 상기 발현 카세트 (Exp-POI')는 동일한 벡터 핵산에 위치할 수 있다. 그러나, 별개의 벡터 핵산에 위치할 수도 있다. 그러나, 발현 카세트 (Exp-POI) 및 (Exp-POI')는 하나의 벡터 핵산에 위치하는 것이 바람직하다. 또한 하나의 발현 카세트로부터 두 사슬 (중쇄 및 상응하는 경쇄)을 모두 발현시키는 것이 가능하다. 예를 들어, 이들은 2개의 별개의 사슬을 수득하기 위해 자가-스플라이싱 신호 또는 프로테아제 감수성 부위를 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현될 수 있다. 또한 2개 이상의 폴리펩티드 (POI 및 POI')가 예를 들어 하나 이상의 내부 리보솜 유입점을 포함할 수 있는 하나의 mRNA로부터 수득되는, 바이시스트론 또는 멀티시스트론 구성 또한 가능하다.
한 실시양태에 따라서,
- 중쇄의 면역글로불린 분자 또는 그의 기능성 단편을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, 제1 폴리뉴클레오티드 하류의 하나 이상의 정지 코돈, 및 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 정지 코돈 하류의 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 (Exp-POI); 및
- 상응하는 경쇄의 면역글로불린 분자 또는 그의 기능성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 추가의 발현 카세트 (Exp-POI')
를 포함하는, 하나 이상의 면역글로불린 분자 또는 그의 기능성 단편의 발현을 위한 벡터 핵산이 제공된다.
바람직하게는, 발현 카세트 (Exp-POI)는 중쇄를 포함하고 발현 카세트 (Exp-POI) 및 (Exp-POI')는 둘다 동일한 배향으로 배열된다. 바람직하게는, 발현 카세트 (Exp-POI')는 발현 카세트 (Exp-POI)의 5'에 배열된다. 중쇄의 발현 카세트의 5'에 경쇄에 대한 발현 카세트를 배열하는 것이 면역글로불린 분자의 발현 속도와 관련하여 유리한 것으로 입증되었다. 한 실시양태에 따라서, 발현 벡터는, 발현 카세트(들)가 이미 면역글로불린 막관통 앵커 및 하나 이상의 불완전 정지 코돈 (예를 들면, 충전 서열에 포함됨)과 임의로는 면역글로불린 분자의 불변부의 적어도 일부를 포함하도록 디자인되어야 한다. 그 후에 면역글로불린 분자의 가변부를 코딩하는 단편이 최종 발현 벡터를 수득하기 위해 적절한 클로닝 방법을 사용함으로써 발현 카세트에 사용자/소비자에 의해 삽입될 수 있다.
발현 카세트 (Exp-MSM)에 포함될 수 있는 포유동물의 선별가능한 마커 유전자의 비제한적 예는 항생제 내성, 예를 들어 G418에 대한 내성을 부여하는 유전자; 하이그로마이신 (hyg 또는 hph, 미국 메릴랜드주 개티스보로 소재의 라이프 테크놀러지즈, 인코포레이티드(Life Technologies, Inc.)로부터 시판됨); 네오마이신 (neo; 미국 메릴랜드주 개티스보로 소재의 라이프 테크놀러지즈, 인코포레이티드로부터 시판됨); 제오신 (Sh Ble; 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 파밍젠(Pharmingen)으로부터 시판됨); 퓨로마이신 (pac, 퓨로마이신-N-아세틸-트랜스퍼라아제, 미국 캘리포니아주 팔로알토 소재의 클론테크(Clontech)로부터 시판됨); 우아바인 (oua, 파밍젠으로부터 시판됨) 및 블라스티시딘 (인비트로젠(Invitrogen)으로부터 시판됨)을 포함한다. 상기 포유동물의 선별가능한 마커 유전자는 상기 유전자를 포함하는 포유동물 숙주 세포 및 그에 따라 벡터를 포함하는 숙주 세포의 선별을 가능하게 한다. 본원에서 사용된 용어 "유전자"는 야생형 유전자의 코딩 서열 뿐만 아니라, 목적하는 내성을 제공하는 선별가능한 마커의 기능성 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 말한다. 그러므로, 야생형 유전자의 말단절단형 또는 돌연변이형도, 이들이 목적하는 내성을 제공하는 한 포함된다. 포유동물의 선별가능한 마커 유전자는 바람직하게는 외래 조절 요소, 예컨대 강력한 구성 프로모터를 포함한다. 바람직한 실시양태에 따라서, 상기 발현 카세트 (Exp-MSM)은, 바람직하게는 외래 조절 요소, 예컨대 SV40 프로모터와 같은 강력한 구성 프로모터를 포함하는 효소 기능성 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (I 또는 II)를 코딩하는 유전자를 포함한다. 상기 실시양태는 포유동물의 증폭가능하고 선별가능한 마커 유전자로서 효소 기능성 DHFR을 코딩하는 유전자의 사용과 함께 잘 적용된다.
발현 카세트 (Exp-MASM)에 도입된 포유동물의 증폭가능하고 선별가능한 마커 유전자는 벡터 함유 숙주 세포의 선별 및 유전자 증폭을 가능하게 한다. 포유동물의 증폭가능하고 선별가능한 마커 유전자의 비제한적 예는 DHFR 효소를 코딩하는 디히드로엽산 환원효소 (DHFR) 유전자이다. 포유동물의 증폭가능하고 선별가능한 마커 유전자는 바람직하게는 외래 조절 요소, 예컨대 강력한 구성 프로모터를 포함한다. 현재 사용되고 있는 다른 시스템은 특히 글루타민 합성효소 (gs) 시스템 (Bebbington et al., 1992) 및 히스티디놀 유도성 선별 시스템 (Hartmann and Mulligan, 1988)이다. 이러한 증폭가능한 마커는 또한 선별가능한 마커이고 따라서 벡터로부터 수득된 세포를 선별하는데에 사용가능하다. DHFR 및 글루타민 합성효소는 우수한 결과를 제공한다. 두 경우 모두에서 비형질전환 세포의 성장을 방해하는, 관련 대사물 (DHFR의 경우에는 하이포크산틴 및 티미딘, GS의 경우에는 글루타민)의 부재하에 선별을 수행한다. DHFR 시스템과 같은 증폭가능한 시스템에서, 세포를, 유전자 증폭을 촉진시키는 특정 제제, 예컨대 DHFR 시스템의 경우에는 메토트렉세이트 (MTX)에 노출시킴으로써 재조합 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다. 예를 들어 dhfr+ 세포주의 선별을 가능하게 하는 야생형 DHFR 유전자 또는 DHFR 돌연변이체의 코딩 서열이 사용될 수 있다. 유전자 증폭을 촉진시키는 GS에 대한 적합한 억제제는 메티오닌 술폭시민 (MSX)이다. MSX에의 노출은 또한 유전자 증폭을 초래한다.
한 실시양태에 따라서, 상기 발현 카세트 (Exp-MASM)은, 바람직하게는 SV40 프로모터와 함께 사용되는 효소 기능성 디히드로엽산 환원효소 (DHFR)를 코딩하는 유전자를 포함한다.
따라서, 발현 카세트가 하나 이상의 프로모터 및/또는 프로모터/인핸서 요소를 포함하는, 벡터 핵산이 제공된다. 상기 두 조절 요소 사이의 물리적인 경계는 항상 명확한 것은 아니지만, 용어 "프로모터"는 통상 RNA 폴리머라아제 및/또는 임의의 회합 인자가 결합하고 전사가 개시되는 핵산 분자 상의 부위를 말한다. 인핸서는 일시적으로, 또한 공간적으로 프로모터 활성을 증강시킨다. 다수의 프로모터가 광범위한 세포형에서 전사 활성을 갖는다. 프로모터는, 구성적으로 기능하는 부류 및 유도 또는 탈억제에 의해 조절되는 부류의 두 부류로 분류될 수 있다. 포유동물 세포에서 단백질의 고수준 생산을 위해 사용되는 프로모터는 광범위한 세포형에서 강력하고 바람직하게는 활성이어야 한다. 수많은 세포형에서 발현을 유도하는 강력한 구성 프로모터는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 인간 시토메갈로바이러스 전초기 프로모터, SV40 및 라우스 육종(Rous Sarcoma) 바이러스 프로모터, 및 뮤린 3-포스포글리세레이트 키나아제 프로모터, EF1a를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 프로모터 및/또는 인핸서가 CMV 및/또는 SV40으로부터 수득되는 경우에 본 발명의 발현 벡터를 이용하여 우수한 결과가 달성된다.
한 실시양태에 따라서, 해당 폴리펩티드(들)의 발현을 위한 발현 카세트(들)는 선별가능한 마커의 발현을 위한 발현 카세트보다 강력한 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 이러한 배열은 해당 폴리펩티드에 대한 전사체가 선별 마커에 대한 것보다 더 많이 생성되는 효과를 갖는다. 이종성 단백질의 생산을 위한 개개 세포의 용량은 한정되어 있고 따라서 해당 폴리펩티드에 초점을 맞추어야 하기 때문에, 분비된 해당 폴리펩티드의 생산이 선별 마커의 생산보다 우세한 것이 유리하다.
한 실시양태에 따라서, 해당 폴리펩티드의 발현을 위해 사용되는 발현 카세트 (Exp-POI) 및 (Exp-POI') (존재한다면)는 조절 요소로서 CMV 프로모터/인핸서를 포함한다. 바람직하게는 DHFR 및 네오마이신 마커 유전자를 발현하는, 발현 카세트 (Exp-MSM) 및 (Exp-MASM)은 SV40 프로모터 또는 SV40 프로모터/인핸서를 포함한다. CMV 프로모터는 포유동물 발현을 위해 이용가능한 최고 강력한 프로모터 중 하나로 알려져 있고 매우 우수한 발현 속도를 유도한다. SV40 프로모터보다 상당히 많은 전사체를 제공하는 것으로 생각된다.
대부분의 진핵 발생기 mRNA는 1차 전사체의 분열 및 커플링 폴리아데닐화 반응을 포함하는 복잡한 과정 동안에 첨가되는 폴리A 테일을 그의 3' 말단에 포함한다. 폴리A 테일은 mRNA 안정성 및 이동성에 있어서 유익하다. 그러므로, 본 발명에 따른 벡터의 발현 카세트는 통상적으로 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 소 성장 호르몬 (bgh), 마우스 베타-글로빈, SV40 초기 전사 단위 및 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제 유전자로부터 유도된 것을 포함하는, 포유동물 발현 벡터에 사용될 수 있는 다수의 효과적인 폴리A 신호가 있다. 그러나, 합성 폴리아데닐화 부위 또한 알려져 있다 (예를 들면, 문헌 [Levitt et al, 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025]에 따라 프로메가(Promega)의 pCl-neo 발현 벡터 참조). 폴리아데닐화 부위는 SV40폴리A 부위, 예컨대 SV40 후기 및 초기 폴리A 부위 (예를 들면, 문헌 [Subramani et al, 1981, Mol. Cell. Biol. 854-864]에 기재된 플라스미드 pSV2-DHFR 참조), 합성 폴리A 부위 (예를 들면, 문헌 [Levitt et al, 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025]에 따라 프로메가의 pCl-neo 발현 벡터 참조) 및 bgh 폴리A 부위 (소 성장 호르몬)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 발현 카세트는 적절한 전사 종결 부위를 포함할 수 있다. 이는, 전사가 상류 프로모터에서부터 제2 전사 단위를 통해 계속될 때 하류 프로모터의 기능을 억제할 수 있고, 이러한 현상은 프로모터 가림 또는 전사 간섭으로 알려져 있다. 이와 같은 사건은 원핵 및 진핵 세포 모두에서 보고되었다. 두 전사 단위 사이에 전사 종결 신호가 적절히 위치하는 것이 프로모터 가림을 방지할 수 있다. 전사 종결 부위는 잘 특성화되어 있고 발현 벡터에 그의 도입은 유전자 발현에 있어서 여러가지 유익한 효과를 갖는 것으로 나타났다.
발현 카세트는 인핸서 (상기 참조) 및/또는 인트론을 포함할 수 있다. 한 실시양태에 따라서, 해당 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 카세트(들)는 인트론을 포함한다. 고등 진핵세포로부터의 대부분의 유전자는 RNA 가공 동안에 제거되는 인트론을 함유한다. 게놈 작제물은 인트론이 없는 동일한 작제물보다 트랜스제닉 시스템에서 보다 효율적으로 발현된다. 통상적으로, 인트론은 오픈 리딩 프레임의 5' 말단에 위치한다. 따라서, 인트론은 발현 속도를 증가시키기 위해 해당 폴리펩티드(들)의 발현을 위한 발현 카세트(들)에 포함될 수 있다. 상기 인트론은 프로모터 및/또는 프로모터/인핸서 요소(들)와 발현될 폴리펩티드의 오픈 리딩 프레임의 5' 말단 사이에 위치할 수 있다. 그러므로, 적어도 발현 카세트 (Exp-POI)가 프로모터와 해당 폴리펩티드의 발현을 위한 폴리뉴클레오티드의 개시 코돈 사이에 배열된 인트론을 포함하는, 벡터 핵산이 제공된다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 다수의 적합한 인트론이 당분야에 알려져 있다.
한 실시양태에 따라서, 해당 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 카세트에 사용되는 인트론은 SIS 또는 RK 인트론과 같은 합성 인트론이다. RK 인트론은 바람직하게는 해당 유전자의 ATG 개시 코돈 앞에 위치하는 강력한 합성 인트론이다. RK 인트론은 CMV 프로모터의 인트론 공여체 스플라이스 부위 및 마우스 IgG 중쇄 가변부의 수용체 스플라이스 부위로 이루어진다 (예를 들면, 문헌 [Eaton et al., 1986, Biochemistry 25, 8343-8347, Neuberger et al., 1983, EMBO J. 2(8), 1373-1378] 참조; pRK-5 벡터로부터 수득가능함 (BD 파밍젠)).
놀랍게도, 인트론이 DHFR 유전자의 오픈 리딩 프레임의 3' 말단에 위치하는 것은 작제물의 발현/증폭 속도에 유리한 효과를 제공한다. DHFR 발현 카세트에 사용된 인트론은 DHFR 유전자의 보다 작은 비기능성 변이체를 유도한다 (문헌 [Grillari et al., 2001, J. Biotechnol. 87, 59-65]). 이로써, DHFR 유전자의 발현 수준은 낮아진다. 이는 보다 엄격한 선별 조건 및 MTX에 대하여 증가된 감수성을 유도한다. 따라서, 발현 카세트 (MASM)이 증폭가능하고 선별가능한 마커 유전자의 3'에 위치하는 인트론을 포함하는, 벡터 핵산이 제공된다. 적합한 인트론은 pSV2-DHFR 벡터로부터 수득될 수 있다 (예를 들어 상기 참조).
상기 벡터는 원핵의 선별가능한 마커 유전자를 포함하는 하나 이상의 추가 발현 카세트 (Exp-PSM)을 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트 (Exp-PSM)은 발현 카세트 (Exp-MSM)과 (Exp-MASM) 사이에 위치할 수 있다. 상기 선별가능한 마커는 예를 들어 앰피실린, 카나마이신, 테트라시클린 및/또는 클로람페니콜과 같은 항생제에 대한 내성을 제공할 수 있다. 상기 발현 카세트 (Exp-PSM)은 바람직하게는 다른 발현 카세트 (Exp-POI), (Exp-MSM) 및 (Exp-MASM)과 동일한 5' → 3' 배향으로 배열된다.
한 실시양태에 따라서, 벡터에 포함된 발현 카세트 (Exp-POI) 및/또는 (Exp-POI')는
- 제1 폴리뉴클레오티드의 하류에 위치하는 하나 이상의 정지 코돈의 하류에 위치하는 친화성 태그를 코딩하고, 또한 면역글로불린 막관통 앵커를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치하는 폴리뉴클레오티드 (Pn-TAG), 및/또는
- 선별가능한 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (Pn-MARKER)
를 더 포함한다.
이점은 상기 약술되어 있다.
벡터 핵산은 그의 원형 형태로 숙주 세포로 형질감염될 수 있다. 초나선 벡터 분자는 통상적으로 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제의 활성에 의해 핵 내부에서 선형 분자로 전환될 것이다. 그러나, 형질감염 전의 벡터 핵산의 선형화가 종종 안정한 형질감염의 효율을 개선한다. 이는 또한 벡터가 형질감염 전에 선형화된다면 선형화 지점이 조절가능하기 때문이다.
그러므로, 본 발명의 한 실시양태에 따라서, 발현 벡터는 형질감염 전에 벡터 핵산의 선형화를 위해 사용될 수 있는, 예정된 제한 부위를 포함한다. 상기 제한 부위가 벡터 핵산이 개방/선형화되는 위치를 결정하여 작제물이 진핵, 특히 포유동물 세포의 게놈으로 통합될 때 발현 카세트의 순서/배열을 결정하기 때문에, 상기 선형화 제한 부위의 지능적인 배치가 중요하다.
따라서, 벡터 핵산은 벡터를 선형화하기 위한 선형화 제한 부위를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 선형화 제한 부위는 발현 카세트 (Exp-MSM)과 (Exp-MASM) 사이에 위치한다. 바람직하게는, 상기 선형화 제한 부위는 특이적인 것이고 발현 벡터 핵산에 한 번만 존재한다. 예를 들면, 벡터가 선형화 제한 부위에서만 분열되고 예를 들어 발현 카세트(들) 또는 벡터 백본 내에서는 분열되지 않도록 (또는 매우 드물게 분열되도록) 하기 위해 낮은 절단 빈도를 갖는 제한 효소에 의해 인식되는 선형화 제한 부위가 사용될 수 있다. 이는 예를 들어 6개 초과 염기쌍의 인식 서열을 갖거나 또는 염색체 DNA로 불충분하게 표현된 서열을 인식하는 제한 효소에 대한 제한 부위를 제공함으로써 장려될 수 있다. 적합한 예는 SwaI 효소이고 따라서 벡터는 특이적인 선형화 제한 부위로서 SwaI 인식 부위를 도입할 수 있다. 상기 선형화 제한 부위가 벡터 핵산 서열 (해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 포함)에서 한 번을 초과하여 존재하거나, 또는 벡터 핵산 서열에서 여러 번 절단하는 제한 효소가 사용되는 경우에, 추가의 제한 부위를 제거하고 특이적이거나 또는 적어도 드문 선형화 제한 부위를 수득하기 위해, 발현 카세트 (Exp-MSM)과 (Exp-MASM) 사이에 위치하는 선형화 제한 부위 이외의 제한 부위를 예를 들어 변경/돌연변이시키는 것 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.
벡터가 목적하는 표준 발현 벡터로서, 예를 들어 다수의 상이한 폴리펩티드의 발현을 위한 수단으로서 사용되는 경우에, 낮은 절단 빈도를 갖는 효소에 대한 다수의 인식 부위를 포함하는 선형화 제한 부위를 제공하는 것이 유리하다. 선형화를 위해 선택된 제한 효소는 바람직하게는, 벡터의 적절한 선형화를 위해 효소가 한 번만 절단하도록 하기 위해 선별가능한 마커에 대한 발현 카세트 또는 다른 벡터 백본 서열에서는 절단하지 않아야 한다. 낮은 절단 빈도를 갖는 제한 효소에 대한 다수의 인식 부위를 포함하는 선형화 제한 부위를 제공함으로써, 사용자는 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI) 내의 제한을 안전하게 피하기 위해 제공된 옵션으로부터 선형화를 위한 적합한 제한 효소를 선택할 수 있다. 그러나, 상기 약술한 바와 같이, 추가의 제한 부위는 돌연변이될 수 있거나 또는 부분적인 제한효소 분해가 수행될 수 있다.
선형화 제한 부위를 발현 카세트 (Exp-MSM)과 발현 카세트 (Exp-MASM) 사이에 위치시키는 것은 발현 카세트 (Exp-POI) (또한, 존재한다면, 해당 폴리펩티드의 발현을 위한 추가의 발현 카세트)가 발현 카세트 (Exp-MASM)에 의해 5'의 옆에 배치되는 효과를 갖는다. 발현 카세트 (Exp-MSM)은 선형화에서 발현 카세트 (Exp-POI)의 3'에 위치한다. 이로써, 발현 카세트 (MSM) 및 (MASM)은 원형 벡터 헥산의 선형화에서 분리된다. 박테리아 선별 마커에 대한 발현 카세트 (Exp-PSM)이 존재하는 경우에 (하기 참조), 선형화 제한 부위는 바람직하게는 발현 카세트 (Exp-PSM)과 (Exp-MASM) 사이에 위치한다. 이는 박테리아 선별 마커 유전자가 3'에 위치하여 선형화된 벡터 핵산의 "포유동물" 부분의 "바깥쪽"에 존재하는 효과를 갖는다. 박테리아 서열은 포유동물 세포에서 증가된 메틸화 또는 다른 침묵 효과를 유도할 수 있기 때문에 박테리아 유전자는 아마도 포유동물 발현에 있어서 유리하지 않을 것이므로 이러한 배열이 바람직하다.
해당 폴리펩티드는 임의의 특정한 단백질 또는 단백질 군으로 제한되지 않으며, 그와 반대로 본원에 기재된 방법에 의해 선별 및/또는 발현하기를 원하는, 임의의 크기, 기능 또는 기원을 갖는 임의의 단백질일 수 있다. 따라서, 다수의 상이한 해당 폴리펩티드가 발현/생산될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"란 펩티드 결합(들)에 의해 함께 연결된 아미노산의 중합체를 포함하는 분자를 말한다. 폴리펩티드는 단백질 (예를 들면, 50개 초과의 아미노산을 가짐) 및 펩티드 (예를 들면, 2 내지 49개의 아미노산)를 포함하는, 임의 길이의 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드는 예를 들어 생활성 폴리펩티드, 예컨대 효소 단백질 또는 펩티드 (예를 들면, 프로테아제, 키나아제, 포스파타아제), 수용체 단백질 또는 펩티드, 수송체 단백질 또는 펩티드, 살세균 및/또는 내독소-결합 단백질, 구조 단백질 또는 펩티드, 면역 폴리펩티드, 독소, 항생제, 호르몬, 성장 인자, 백신 등을 포함하는, 임의의 활성 또는 생활성을 갖는 단백질 및/또는 펩티드를 포함한다. 상기 폴리펩티드는 펩티드 호르몬, 인터류킨, 조직 플라스미노겐 활성화 인자, 시토카인, 면역글로불린, 특히 항체 또는 항체 단편 또는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
해당 폴리펩티드의 예로서, 본원에서 사용된 "면역글로불린 분자"는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편, 예를 들면 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유하는 단편에 의해 실질적으로 또는 부분적으로 코딩된 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 말한다. 인식되는 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변부 유전자, 및 다수의 면역글로불린 가변부 유전자를 포함한다. 경쇄는 통상적으로 예를 들어 카파 또는 람다로서 분류된다.
중쇄는 통상적으로 예를 들어 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 분류되고, 이들은 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE의 면역글로불린 군을 한정한다. 상기 면역글로불린은 임의의 이소형일 수 있다. 매우 흔히 IgG (예를 들면, IgG1) 분자는 치료용 단백질로서 생산/요구된다. 통상적인 면역글로불린 (항체) 구조 단위는 4량체를 포함한다. 실제로, 각각의 4량체는 폴리펩티드 사슬로 이루어진 동일한 2쌍으로 구성되고, 각각의 쌍은 "경쇄" (약 25 kD) 및 "중쇄" (약 50-70 kD)를 갖는다. 각각의 사슬의 N 말단은 주로 항원 인식을 위한 약 100 내지 110개 이상의 아미노산으로 이루어진 가변부를 한정한다. 용어 "가변성 경쇄 (VL)" 및 "가변성 중쇄 (VH)"는 각각 이러한 경쇄 및 중쇄를 말한다.
항체는 온전한 면역글로불린으로서 또는 예를 들어 다양한 펩티다아제로의 분해에 의해 생산될 수 있는, 수많은 잘 특성화된 단편으로서 존재한다. 항체 단편은 전체 항체로부터의 20개 이상의 아미노산, 바람직하게는 적어도 여전히 항원 결합능을 갖는 100개 이상의 아미노산을 포함하는 상기 항체의 임의의 단편이다. Fab 단편, F(ab)2 단편, 다수의 결합 도메인을 포함하는 다물체(multibody), 예컨대 2물체, 3물체 또는 4물체, 단일 도메인 항체 또는 애피바디(affibody)와 같은 항체 단편은 항체의 결합 영역을 포함할 수 있다. 항체 변이체는 동일한 결합 기능을 갖지만, 예를 들어 변경된 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편의 유도체이다. 상기 항체 및/또는 항체 단편은 뮤린 경쇄, 인간 경쇄, 인간화 경쇄, 인간 중쇄 및/또는 뮤린 중쇄 뿐만 아니라, 이들의 활성 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다. 그러므로, 이들은 예를 들면 뮤린, 인간, 키메라 또는 인간화 유래의 것일 수 있다. 다양한 항체 단편이 온전한 항체의 분해 측면에서 정의되었지만, 당업자라면 이러한 Fab' 또는 F(ab)2 단편이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법, 펩티드 표시 등을 이용하여 데노보(de novo) 합성될 수 있음을 알 것이다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 "항체"는 또한 전체 항체의 변이에 의해 생성되거나 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 데노보 합성된 항체 단편을 포함한다. 항체는 또한 단일 팔을 갖는(single-armed) 복합 단일클론 항체, 가변성 중쇄 및 가변성 경쇄가 함께 연결되어 (직접 또는 펩티드 링커를 통해) 연속적 폴리펩티드를 형성하는 단쇄 Fv(scFv) 항체를 포함하는 단쇄 항체 뿐만 아니라, 2물체, 3물체 및 4물체를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Pack et al. J Mol Biol. 1995 Feb 10;246(1): 28-34]; 문헌 [Pack et al. Biotechnology (N Y). 1993 Nov;11(11): 1271-7]; 문헌 [Pack & Plueckthun Biochemistry. 1992 Feb 18;31(6): 1579-84] 참조). 항체는 예를 들면, 다중클론성, 단일클론성, 키메라, 인간화, 단쇄, Fab 단편, 단쇄 Fab (문헌 [Hust et al., BMC Biotechnol (2007) 7:14]), Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편 등이다.
본 발명에 따라 생산된 폴리펩티드는 당분야에 알려져 있는 방법에 의해 회수될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드는 원심분리, 여과, 초미세여과, 추출 또는 침전을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는 통상적인 방법에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다. 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱(chromatofocusing) 및 크기 배제), 전기영동 방법 (예를 들면, 정제용 등전 초점화), 용해도 분별 (예를 들면, 암모늄 술페이트 침전) 또는 추출을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는 당분야에 알려진 다양한 방법에 의해 정제를 수행할 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 세포 파열에 의해 숙주 세포로부터 수득될 수 있다.
또한, 하나 이상의 카세트 (Cas-POI), 바람직하게는 발현 카세트 (Exp-POI)를, 상기 카세트가 해당 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI), 제1 폴리뉴클레오티드 하류의 하나 이상의 정지 코돈, 및 면역글로불린 막관통 앵커 또는 기능성 변이체를 코딩하는 정지 코돈 하류의 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 벡터에 조합시키는 단계를 포함하는, 상기 기재된 벡터 핵산의 생산 방법이 제공된다. 상기 방법은
- 포유동물의 선별가능한 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트 (Exp-MSM),
- 포유동물의 증폭가능하고 선별가능한 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트 (Exp-MASM)
을, 바람직하게는 발현 카세트 (Exp-MASM)이 발현 카세트 (Exp-POI)의 5'에 위치하고 발현 카세트 (Exp-MSM)이 발현 카세트 (Exp-POI)의 3'에 위치하고, 또한 발현 카세트 (Exp-MASM), (Exp-POI) 및 (Exp-MSM)이 동일한 5' → 3' 배향으로 배열되도록 조합시키는 것을 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 기재된 스크리닝 방법에 의해 수득된 진핵, 바람직하게는 포유동물 숙주 세포가 제공된다. 또한, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 이종성인 외래 폴리뉴클레오티드, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드 하류의 하나 이상의 정지 코돈, 및 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 정지 코돈 하류의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 카세트 (Cas-POI)를 포함하는 진핵, 바람직하게는 포유동물 숙주 세포가 제공된다. 카세트 (Cas-POI)는 예를 들면, 본 발명에 따른 벡터 핵산에 의해 도입될 수 있다. 바람직하게는, 카세트 (Cas-POI) 및/또는 카세트 (Cas-POI')는 발현 카세트이다.
카세트 (Cas-POI)의 추가 특징 및 적합한 벡터의 정보는 상기 기재되었고 또한 본 발명의 숙주 세포에 적용된다. 적합한 진핵 숙주 세포는 상기 기재되어 있다. 바람직하게는, 진핵 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포이다. 한 실시양태에 따라서 진핵 숙주 세포는 B 세포 또는 B 세포 유도체가 아니다. 따라서, 진핵, 바람직하게는 포유동물 숙주 세포는 Ig 알파 및 Ig 베타 수용체 사슬을 자연발생적으로 발현시키지 않는 숙주 세포이다. 또한, 한 실시양태에 따라서, Ig 알파 및 Ig 베타 수용체 사슬의 인공적인 공동발현은 상기 숙주 세포에서 일어나지 않는다. CHO 세포가 바람직한 숙주 세포이다.
또한, 진핵 숙주 세포가 본 발명에 따른 벡터 핵산 및/또는 본 발명에 따른 카세트 (Cas-POI)를 포함하는 이종성 핵산으로 형질감염되는, 상기 기재된 진핵 숙주 세포의 생산 방법이 제공된다. 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입하기 위한 당분야에 알려진 적절한 방법이 다수 있다. 각각의 방법은 칼슘 포스페이트 형질감염, 전기천공, 리포펙션(lipofection), 유전자총(biolistic)- 및 중합체-매개 유전자 이동법을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 전통적인 랜덤 통합 기반 방법 이외에도 재조합 매개된 접근법이 카세트 (Cas-POI)를 숙주 세포 게놈으로 이동시키는 데 사용가능하다. 이러한 재조합 방법은 전이유전자의 방향성 삽입을 매개할 수 있는, 부위 특이적 재조합효소, 예컨대 Cre, Flp 또는 ΦC31 (예를 들면, 문헌 [Oumard et al, Cytotechnology (2006) 50: 93-108] 참조)의 사용을 포함할 수 있다. 별법으로, 상동성 재조합의 메카니즘이 카세트 (Cas-POI)를 삽입하는데에 사용가능하다 (문헌 [Sorrell et al, Biotechnology Advances 23 (2005) 431-469] 참조). 재조합 기반 유전자 삽입은 숙주 세포에 이동/도입되는 이종성 핵산에 포함되어야 할 요소의 개수를 최소화한다. 예를 들면, 프로모터 및 폴리A 부위 (외생성 또는 내생성)가 이미 제공된 삽입 좌위를 사용할 수 있어, 나머지 요소 (예를 들면, 해당 폴리뉴클레오티드, 정지 코돈 및 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드) 만이 숙주 세포에 이동/형질감염시킬 필요가 있다. 카세트 (Cas-POI)의 부분의 이동도, 그 나머지 부분이 삽입 부위에 존재한다면 충분할 것이다. 본 발명에 따른 적합한 발현 벡터 뿐만 아니라, 적합한 숙주 세포 및 해당 폴리펩티드의 실시양태가 상기 상세히 설명되었고; 본 발명의 발명자들은 상기 개시내용을 말한다.
또한, 상기 상세한 설명 및 특허청구범위에서 한정된 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 폴리펩티드가 제공된다. 상기 폴리펩티드는 바람직하게는 면역글로불린 분자 또는 그의 단편이다. 본 발명의 방법에 따라 생산된 폴리펩티드는 우수한 안정성을 나타낸다. 그 결과는 또한 폴리펩티드가 기능성 형태로, 따라서 정위 입체형태로 발현됨을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 상세히 설명된 발현 벡터를 사용하여 본 발명에 따른 생산 방법에 의해 수득된 폴리펩티드를 제공한다. 상기 약술한 바와 같이, 폴리펩티드는 도입된 선별/스크리닝 단계에 의해 우수한 수율로 수득된다. 폴리펩티드는 바람직하게는 항체 또는 그의 단편과 같은 면역글로불린 분자이다.
본 발명은 하기 비제한적 실시예를 통해 보다 상세히 설명되지만, 이는 본 발명의 바람직한 실시양태를 기재한다.
실시예
실시예
1:
Ig
막관통
형태의 벡터
작제
IgG1 중쇄 불변부의 부분과 불완전 정지 코돈 충전부 및 Ig 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 합성 1113 bp DNA 단편을 Age1 및 Asc1 생성 pNT11 (표 1 참조)을 통해 pBW201 (IgG1 중쇄 및 카파 경쇄를 함유하는 표준 벡터)에 삽입하였다. 사용된 Ig 막관통 도메인의 뉴클레오티드 서열은 서열 1로 표시되고, 불완전 정지 코돈 충전부가 표시된다. 물론, 동일한 막 고정 기능을 제공하는 코딩된 Ig 막관통 도메인의 변이체도 본 발명의 원리에 따라 사용가능하다. 상기 변이체는 코딩된 Ig 막관통 도메인에 대하여 상동물이며 예를 들어 보존적 아미노산 치환에 의해 수득될 수 있다. 이들은 바람직하게는 적어도 80%, 85%, 90%의 상동성을 갖는다. 각각의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 엄격한 조건하에서 표시된 서열에, 예를 들면 혼성화된다.
pNT11 및 pBW201의 wt DHFR 선별 마커 유전자는 SwaI 및 BglII을 통해 DHFR의 L23P 점 돌연변이체를 코딩하는 합성 1252 bp 단편에 의해 대체되어, pNT29 및 pBW478을 생성할 수 있다. DHFR 돌연변이체는 dhfr+ 세포주의 선별을 가능하게 한다.
FACS 벡터 (pNT11, pNT29)는 항체 발현을 위한 표준 벡터 (pBW201, pBW478)를 기반으로 한다. pNT11 및 pBW201은 이들이 포함하고 있는 DHFR 선별 마커 카세트가 pNT29 및 pBW478과 상이하다. 그러나 백본은 동일하다. 벡터는 모노시스트론성 "탠덤(tandem)" 구성을 가지며, CMV 프로모터/인핸서에 의해 유도되는 항체 경쇄 및 중쇄 발현 카세트를 함유한다. FACS 벡터를 생산하는 유일한 변이는 항체 중쇄 (HC) cDNA의 3'에 IgG1 막관통 및 세포질 도메인을 삽입하는 것이었다. 불완전한 번역 종결 신호를 갖는 짧은 충전부는 HC와 막관통 도메인 사이에 위치한다. 정지 코돈을 위해 선택된 서열 환경은 5% 이하의 번역초과를 유도할 것으로 예상된다. 4개의 벡터는 모두 동일한 인간 IgG 항체를 코딩한다.
상기 약술한 바와 같이, 발현을 위해 사용된 벡터 핵산 및 특히 선택된 벡터 요소의 배향 및 배열은 면역글로불린 분자의 매우 효율적인 발현을 가능하게 한다. 본 발명과 함께 사용가능하고 상기 기재된 적합한 벡터는 하기 표에 예시하였다 (화살표는 유전자 요소의 5' → 3' 배향을 나타냄).
[표 1]
표 1의 약어들은 당업자에게 자명한 일반적인 의미를 가지며 상기 기재한 바와 같고, 특히 하기 의미를 갖는다.
CMVprom/enh = 인간 시토메갈로바이러스 전초기 프로모터/인핸서
RK-인트론 = CMV 프로모터의 인트론 공여체 스플라이스 부위 및 마우스 IgG 중쇄 가변부의 수용체 스플라이스 부위를 포함함 (예를 들면, 문헌 [Eaton et al., 1986, Biochemistry 25, 8343-8347, Neuberger et al., 1983, EMBO J. 2(8), 1373-1378] 참조; pRK-5 벡터로부터 수득가능함 (BD 파밍젠))
mAB-LC = 단일클론 항체 경쇄
mAB-HC = 단일클론 항체 중쇄
SV40폴리A = SV40 폴리A 부위
SV40prom/enhan = SV40 프로모터/인핸서
Neo = 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제
Synth 폴리A = 합성 폴리아데닐화 부위
Amp = 베타 락타마제 항생제 내성 유전자
DHFR = 디히드로엽산 환원효소 유전자
실시예
2:
CHO
세포의 형질감염 및 선별
세포 배양, 형질감염 및 스크리닝은 사유의, 화학적으로 규명된 배양 배지에서 CHO 세포가 성장하는 현탁액을 사용하여 진탕 플라스크에서 수행하였다. 세포를 제조사의 지침에 따라 리포펙션 또는 전기천공 (뉴클레오펙션(nucleofection))에 의해 형질감염시켰다. 형질감염 효율은 GFP (녹색 형광 단백질)-리포터 플라스미드를 형질감염시키고 형질감염된 세포를 유동 세포계수법에 의해 분석하여 확인하였다. 세포 생존율에 따라, G418 함유 선택 배지를 세포에 첨가함으로써 형질감염시킨지 24-28시간 후에 선별을 시작하였다. 세포가 80% 초과의 생존율까지 회수되면, 세포를 G418 무함유 MTX (메토트렉세이트) 함유 배지에 통과시킴으로써 제2 선별 단계를 적용하였다. MTX 선별로부터 세포를 회수한 후에, FACS 풍부화 사이클, FACS 클로닝 또는 한계 희석법 클로닝 및 스크리닝 동안 MTX 함유 배지에서 계속해서 배양하였다.
세포 생존율 및 성장률을 자동화 시스템 (ViCell, 벡크만 쿨터(Beckmann Coulter))을 사용하여 모니터링하였다.
실시예
3: 세포의
FACS
분석,
풍부화
및
클로닝
세포의 표지: 형질감염 풀마다 2 X 10E7개의 세포를 원심분리하여, 냉각된 PBS (포스페이트 완충 염수) 5 mL로 세척하고, 냉각된 PBS 1 mL 중에 재현탁시켰다. 적당량의 FITC (플루오레세인 이소티오시아네이트) 표지된 항-IgG 항체를 세포에 첨가하고 암실에서 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 그 후에, 세포를 실온에서 PBS 5 mL로 2번 세척하고, PBS 1 mL 중에 재현탁시키고, 여과한 다음, 분석용 FACS 튜브에 분배하여, 분류하고 클로닝하였다.
세포의 분석, 분류 및 클로닝: 세포 분류는 FACSDiva 소프트웨어를 사용하여 오토매틱 셀 디포지션 유닛 (Automatic Cell Deposition Unit; ACDU)이 설치된 FACSAria (벡튼 디킨슨(Becton Dickinson))에 의해 수행하였다. 488 nm로 조정된 저출력의 공랭식 고체 레이저 (코헤런트® 사파이어™(Coherent® Sapphire™) 고체)를 사용하여 2차 항체에 결합된 플루오레세인 염료를 여기시켰다. 상대적 FITC 형광 강도를 530/30 BP 필터를 통해 E 검출기에서 측정하였다. 최대 강도의 FITC 형광 세포의 5%를 블록에서 또는 96 웰 플레이트에서 단세포로서 게이팅하고 분류하였다.
실시예
4: 클론 생산성 및 안정성의 측정
클론의 생산성을 상이한 포맷을 사용하여 회분식 및 유가식 실험에서 분석하였다. 초기 클론 스크리닝은 세포를 진탕 24웰 플레이트에 시딩함으로써 24웰 플레이트 회분식 분석법으로 수행하였다. 세포 배양 상청액 중의 항체 농도를 배양을 시작한지 10일 후에 단백질-A HPLC에 의해 측정하였다. 최고 생산성 클론을 또한 회분식 및 유가식으로 진탕 플라스크 모델에서 분석하였다. 회분식 배양액을 100 mL 작업량으로 진탕 플라스크 500에 시딩하고 진탕기 캐비넷 (습윤화되지 않음)에서 150 rpm 및 10% CO2하에 배양하였다. 세포의 생존율은 분석을 시작할 때 90%보다 커야 한다. 시딩 세포 밀도는 2 x 105 c/mL였다. 생성물 농도/세포수/생존율 측정을 3-7일, 10일 및 13일째에 실시하였다. 유가식 실험은 출발 세포 밀도가 4 x 105 c/mL이고 공급물을 주기적으로 첨가하는 것을 제외하고는, 동일한 조건을 사용하여 수행하였다. 클론 안정성은 세포를 14주간 배양함으로써 평가하고 생산성은 2주마다 진탕 플라스크 회분식 모델을 사용하여 측정하였다.
실시예
5: 일시적 형질감염 세포의 분석
새로운 FACS 벡터 (pNT11 또는 pNT29)로 형질감염시킨 후에 막 결합된 번역 생성물이 세포 표면 상에 존재하는지를 검사하기 위해, 일시적으로 형질감염된 세포를 면역염색법 및 유동 세포계수법에 의해 분석하였다. 형질감염 후 48시간에, 세포를 인간 IgG에 대한 FITC 표지된 항체로 염색하였다. GFP 발현 벡터로 형질감염된 세포를 형질감염 대조군으로서 사용하였고, 형질감염 효율은 약 60%인 것으로 계산되었다. 비형질감염 세포 및 표준 벡터 (막관통 도메인을 포함하지 않음)로 형질감염된 세포는 유의한 수준의 표면 회합된 항체를 나타내지 않았지만, FACS 벡터로 형질감염된 세포의 16%가 배경 수준보다 높게 염색되었다. 이로부터 세포막에 고정된, 융합 펩티드, 이 경우에는 항체 분자가 세포 표면 상에서 검출가능함을 알 수 있었다.
실시예
6: 안정한 형질감염 세포의 분석 및
풍부화
일시적으로 형질감염된 세포 상의 막 결합된 항체의 존재를 통해 형질감염 세포의 선별된 풀 내의 분포 및 표면 발현 수준을 분석하였다. 이로써, 생산성 세포가 FACS 분류법에 의해 선택적으로 풍부화가능함을 알 수 있었다. 따라서, 형질감염 후의 세포를 G418, 그 후에 MTX를 이용하여 선별하였다. 내성 세포의 풀을 FITC 표지된 항-IgG 항체로 염색하고 유동 세포계수법에 의해 분석하였다. 대조군으로서, 비형질감염 세포를 염색하고 분석하였다. 양성(positive) 세포의 소집단을 FACS 벡터로 형질감염된 선별된 풀 내에서 검출하였다. 양성 세포의 분포는 두 분석 풀 사이에 상이하였다. 고생산성 세포가 그의 형광 신호에 따라 풍부화가능한지 (따라서 정량 선별이 가능한지)를 평가하기 위해, 최대 형광 강도를 갖는 세포를 두 풀 각각으로부터 분류하고 (상위 5%) 계대배양시켜 풍부화 전의 풀과 생산성을 비교하였다.
실시예
7:
풍부화
세포 및
비풍부화
세포의 생산성 분석
유동 세포계수법에 의한 풍부화 전과 후의 선별된 풀의 생산성 분석을 진탕 플라스크 회분식 배양액에서 수행하여 13일째에 최종 생성물 농도를 비교하였다. 13일째에 상청액을 수거하여 단백질-A HPLC에 의해 IgG 함량을 분석하였다. 두 풀은 모두 본 발명의 교시내용에 따라 1 사이클의 FACS 풍부화를 수행한 후에 이미 생산성 수준의 유의한 증가를 보여주었다. 풀 1의 경우에 생성물 농도는 대략 2 지수만큼 증가하였지만, 풀 2는 거의 10 지수만큼 증가하였으며, 이는 고생산성 세포가 염색 및 분류 동안에 선택적으로 검출됨을 나타낸다. 제1 풍부화 사이클에서 이미 거의 250 mg/l의 항체 농도가 수득될 수 있었다.
실시예
8: 고생산성 세포의 선택적
클로닝을
기반으로 하는 유동 세포계수법
유동 세포계수법을 사용하여 개개의 염색된 세포를 그의 염색 프로파일에 따라 분류하고 시딩할 수 있었다. 이러한 선택적 클로닝이 한계 희석법에 의한 클로닝보다 대량의 고생산성 클론을 초래하는지를 분석하기 위해, 두 방법을 사용하여 클론을 생산하고 생산성을 24웰 플레이트 회분식 배양액에서 분석하였다. 24웰 플레이트에서 회분식 배양을 수행하고 10일째에 상청액을 수거하여 단백질-A HPLC에 의해 IgG 함량을 측정하였다. 결과는 하기와 같다.
[표 2]
유동 세포계수법에 의해 유도된 클론은 한계 희석법에 의해 유도된 클론과 비교하여 높은 평균 생산성을 나타냈고, 이는 또한 생산성 범위의 클론 분포에서도 반영되었다.
실시예
9:
FACS
벡터와 표준 벡터의 비교
형질감염된 세포의 유동 세포계수법에 의한 풍부화의 유리한 효과를 확인하고 FACS 벡터 (pNT29)의 사용을 표준 벡터와 비교하기 위해, 세포를 형질감염시키고 G418 및 MTX를 이용하여 선별하였다. FACS 벡터로 형질감염시킨 3개의 세포 풀 (샘플 1, 2 및 3), 및 표준 벡터로 형질감염시킨 3개의 세포 풀 (샘플 7, 8 및 9)을 유동 세포계수법에 의해 분석하고 최대 염색 신호를 갖는 5%를 분류하였다. 진탕 플라스크 회분식 배양을 수행하여 풍부화 후의 생성물 농도 증가를 비교하였다. 형질감염되고 선별된 풀을 염색하고 유동 세포계수법에 의해 분류하여 형광 강도를 기준으로 상위 5%를 풍부화하였다. 풍부화 전과 후에, 진탕 플라스크 회분식 배양을 수행하고 13일 후에 상청액을 단백질-A HPLC에 의해 분석하였다. 결과는 하기와 같다 (근사치).
[표 3]
[표 4]
상기 결과로부터 입증되는 바와 같이, FACS 벡터로 형질감염된 세포의 생산 수준은 시험한 3개의 풀에서 유의하게 증가하였고, 표준 벡터의 경우에는 1개의 풀만이 생성물 농도의 유의한 증가를 나타냈다. FACS 벡터를 이용한 경우에 풍부화 후의 평균 생성물 농도는 표준 벡터와 비교하여 유의하게 높았다. 순차적으로 추가 2 사이클의 FACS 풍부화를 수행하여 고생산성 세포를 풍부화시켰고, 이는 FACS 벡터의 경우에만 세포 집단의 생산성이 증가함을 나타냈다. 최종적으로, 생성물 농도는 4 내지 30배 증가할 수 있다.
선택적 클로닝에 대한 두 벡터의 적합성을 비교하기 위해, 비슷한 생산성을 갖는 비풍부화 풀로부터의 클론을 유동 세포계수법에 의해 선택적으로 분류하였다. 그 후에, 클론의 생산성을 24웰 회분식 배양액에서 분석하였다. FACS 벡터로 형질감염된 풀로부터 유도된 클론은 표준 벡터로 형질감염된 풀로부터의 클론보다 높은 평균 발현 수준을 갖는 것으로 밝혀졌다. 생산성의 클론 분포는 FACS 벡터의 경우에 우수한 생산성을 갖는 클론이 보다 대량으로 수득됨을 보여준다 (표 5 참조).
[표 5]
실시예
10:
FACS
벡터와 표준 발현 벡터의 추가 비교
a) 벡터
작제
벡터 pBW201, pNT11, pBW478 및 pNT29는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득하였다.
b)
CHO
세포의 형질감염, 선별 및
클로닝
이들은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다.
c) 세포의
FACS
분석,
풍부화
및
클로닝
이들은 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다.
d) 항체 생산성 및 클론 안정성의 측정
클론 및 풀의 생산성을 상이한 포맷을 사용하여 회분식 및 유가식 실험에서 분석하였다. FACS 풍부화 전과 후의 풀을 250 mL 용량의 진탕 플라스크를 사용하여 50 mL 작업량으로 1 mL 당 1 x 105개 세포 (c/mL)를 시딩함으로써 진탕 플라스크 회분식 분석법으로 분석하였다. IgG 함량을 회분식 배양 13일째에 채취한 샘플로부터 단백질-A HPLC에 의해 분석하였다. 클론의 초기 스크리닝은 세포를 진탕 24웰 플레이트에 시딩함으로써 24웰 플레이트 회분식 분석법으로 수행하였다. 세포 배양 상청액 중의 항체 농도를 배양을 시작한지 10일 후에 정량식 단백질-A HPLC에 의해 측정하였다. 최고 생산성 클론을 회분식 및 유가식으로 진탕 플라스크 모델에서 분석하였다. 회분식 배양액을 100 mL 작업량으로 진탕 플라스크 (500 mL 용량)에 시딩하고 진탕기 캐비넷 (습윤화되지 않음)에서 150 rpm, 36.5℃ 및 10% CO2하에 배양하였다. 세포의 생존율은 분석을 시작할 때 90%보다 컸다. 시딩 세포 밀도는 2 x 105 c/mL였다. 항체 농도, 세포수 및 생존율을 3-7일, 10일 및 13일째에 측정하였다. 유가식 실험은 실행 시간이 17일이고, 출발 세포 밀도가 4 x 105 c/mL이고, 7 x 106 c/mL 초과의 생존 세포 밀도에서 시작하여 공급물을 주기적으로 첨가하는 것을 제외하고는, 동일한 조건을 사용하여 수행하였다. 클론 안정성은 세포를 12주간 배양함으로써 평가하고 생산성은 2주마다 진탕 플라스크 회분식 모델을 사용하여 측정하였다.
e) 안정한 형질감염 세포의 분석 및
풍부화
안정하게 형질감염된 세포 집단에서의 표면 발현을 분석하여 생산성 세포가 FACS 분류법에 의해 선택적으로 풍부화가능한지를 검사하였다. 따라서, 형질감염 후의 세포를 G418, 그 후에 MTX를 이용하여 선별하였다. 내성 세포의 풀 (벡터마다 10개)을 상기 기재된 바와 같이 염색하고 유동 세포계수법으로 분석하였다. 사용된 염색 프로토콜에 의해 양성 세포의 소집단을 pBW478 및 pNT29 형질감염 세포 풀에서 검출할 수 있었다. 예상된 바와 같이, FACS 벡터에서 높은 비율의 FACS 양성 세포가 관찰되었다.
고생산성 세포가 그의 형광 신호에 따라 풍부화가능한지를 평가하기 위해, 최대 형광 강도를 갖는 세포를 개개의 세포 풀로부터 분류하고 (상위 5%) 계대배양시켜 풍부화 전의 풀과 생산성을 비교하였다. 1번 분류된 세포 집단의 증식 및 풀링 후에 제2 사이클의 풍부화를 수행하였다. 염색 양성 세포의 비율은 놀랍게도 제1 풍부화 사이클에서 표준 벡터에서 최고로 증가하였다. FACS 벡터로 형질감염된 풀은 사용된 염색 프로토콜에 의해 유사한 풍부화 지수를 나타냈고, 일반적으로 유의한 풀 대 풀 차이가 관찰되었다. 제2 풍부화 사이클 후에, 거의 동종의 FACS 양성 세포 집단이 수득되었다 (표 6a 및 6b 참조).
표 6a 및 6b: 분류 전과 후의 평균 염색 결과 및 생산성
[표 6a]
표 6a: 형질감염되고 선별된 세포 풀을 표면 IgG에 대하여 염색하였다. 비형질감염 세포의 수준을 초과하여 염색된 세포의 평균 비율을 나타냈다. 풍부화 전에 FACS 벡터에서 보다 높은 비율의 양성 세포가 관찰되었다. 상위 5%의 제1 풍부화 사이클 후에, 염색 양성 세포의 비율은 표준 벡터에서 보다 높았다. 제2 풍부화 사이클 후에, 두 접근법 모두에서 모든 세포의 90% 초과의 비율이 양성이었다. 약어: AVG: 평균 및 STDD: 표준 편차.
[표 6b]
표 6b: 세포 풀의 생산성을 진탕 플라스크 회분식 배양액으로부터 배양 13일째에 단백질-A HPLC에 의해 분석하였다. 제1 풍부화 사이클은 두 경우 모두에서 생산성의 유의한 증가를 유도하였다. 제2 풍부화 후에, FACS 벡터로 형질감염된 세포 풀만이 생산성의 추가 증가를 나타냈다.
f)
풍부화
세포 및
비풍부화
세포의 생산성 분석
유동 세포계수법에 의한 풍부화 전과 후의 선별된 풀의 생산성 분석을 진탕 플라스크 회분식 배양액에서 수행하여 13일째에 최종 역가를 비교하였다. 풍부화 전의 풀의 생산성은 사용된 두 벡터 모두에서 매우 유사한 범위에 있었다. 개개의 풀에 대한 제1 풍부화 사이클에 의해 평균 생산성의 유의한 개선이 모든 접근법에서 달성되었고, 여기서도 개개의 풀 사이에 실질적인 차이가 있었다 (표 6b 참조). 놀랍게도, 표준 벡터로 형질감염된 풀의 생산성은 FACS 벡터로 형질감염된 풀과 비교하여 높지 않았지만, 훨씬 높은 수준의 FACS 염색 양성 세포가 관찰되었다. 풀링되고 분류된 세포 집단으로부터의 2차 분류에 의해, 표준 벡터에서 생산성의 추가 개선은 달성되지 않았다. 이와 달리, FACS 염색 결과는 세포의 거의 100%가 항체를 생산함을 시사하지만, 낮은 생산성이 달성되었다 (표 6a 참조). FACS 벡터로 형질감염된 풀의 생산성은 2차 분류에 의해 유의하게 개선될 수 있었다. 사용된 FACS 방법은 고생산성 세포의 보다 선택적인 풍부화를 유도하였고, 생산성은 비분류 집단과 비교하여 약 8배 이상, 1차 분류 후의 풀과 비교하여 2배 이상 증가하였다.
g) 고생산성 세포의 선택적
클로닝을
기반으로 하는 유동 세포계수법
유동 세포계수법을 사용하여 개개의 염색된 세포를 그의 염색 프로파일에 따라 분류하고 시딩할 수 있었다. 이러한 선택적 클로닝이 표준 벡터와 비교하여 FACS 벡터를 사용하였을 때 보다 대량의 고생산성 클론을 초래하는지를 분석하기 위해, 두 방법을 사용하여 클론을 생산하고 생산성을 24웰 플레이트 회분식 배양액에서 분석하였다.
1차에서, 세포를 임의의 예비풍부화 단계 없이 MTX 선별된 세포 풀로부터 직접 FACS 클로닝하였다. 벡터마다 3개의 풀을 그의 염색 프로파일에 따라 선택하였다. 염색된 세포 풀의 상위 5%로부터 클론을 생산하였고 총 약 500개의 클론을 분석하였다. 참조 벡터에서 클론의 평균 생산성은 39 mg/L였고, FACS 벡터 클론은 평균 87 mg/L를 생산하였다. 표 7a에서 알 수 있는 바와 같이, 이는 또한 훨씬 높은 비율의 고생산성 클론이 FACS 벡터에 의해 수득됨을 확인해주는 클론 분포에 의해서도 반영되었다. 표준 벡터 형질감염으로부터 분석한 270개 초과의 클론 중 하나는 그 나머지와 비교하여 거의 2배 높은 생산성을 갖는다는 점이 흥미롭다. 이러한 예외적인 클론은 LP라고 명명하였다. 따라서 FACS 스크리닝 방법과 함께 표준 벡터 구성을 이용하여 이러한 고생산성 세포 클론을 동정하는 것이 일반적으로 가능하다. 그러나, 이는 매우 드물고 따라서 행운의 사건이다. 이는 또한 본 발명의 교시내용에 따른 선별 방법과 결정적인 차이가 있다. 표준 구성은 예외적이고 매우 드문 경우에만 (초) 고 생산인자의 선별을 가능하게 하지만, 본 발명에 따른 방법은 재현가능하고, 따라서 신뢰할 수 있게 (초) 고 생산인자의 선별을 가능하게 한다.
2차 FACS 클로닝 실험을 제1 풍부화 사이클 후에 벡터마다 10개의 풀링 집단으로부터 출발하여 수행하였다. 이번에는 대략 240개의 클론이 24웰 회분식 배양액에서 스크리닝되었다. 또한, FACS 벡터로 수득된 클론은 참조 표준 벡터보다 훨씬 높은 평균 생산성을 나타냈다. 40 mg/L의 평균 클론 생산성에서 참조 벡터는 예비풍부화 없이 클로닝한 것과 비교하여 개선점이 없었다. LP 클론은 다시 동정되지 않았다. FACS 벡터로 형질감염된 클론의 경우에, 275 mg/L의 평균 생산성이 사용된 FACS 방법으로 수득되었다. 클론 분포는 고생산인자의 선택적 클로닝과 관련하여 FACS 벡터 구성의 우수성을 명확하게 입증한다 (표 7b 참조).
표 7a 및 7b: 클론 생산성의 비교
[표 7a]
표 7a: 클론을 선별 후에 최고 비율의 염색 양성 세포를 갖는 3개의 염색 세포 풀의 상위 5%로부터 유동 세포계수법에 의해 생산하였다. 생산성 평가를 위해, 24웰 플레이트에서 회분식 배양을 수행하였고 10일째에 상청액을 수거하여 단백질-A HPLC에 의해 IgG 함량을 측정하였다. 생산성 범위의 클론 분포를 나타냈다. 유의하게 높은 비율의 고생산성 클론이 FACS 벡터 (pNT29)를 사용하였을 경우에 수득되었다.
[표 7b]
표 7b: 제1 풍부화 사이클 후에 염색된 집합 풀의 상위 5%로부터 FACS 클로닝에 의해 수득된 클론을 분석하였다. 예비풍부화의 이점은 참조 벡터 (pBW478)로 형질감염된 세포에서 관찰되지 않았지만, FACS 벡터 (pNT29)로 형질감염된 세포의 경우에는 예비풍부화가 비생산인자의 유의한 감소 및 클론의 평균 생산성의 증가를 유도하였다.
h) 클론의 특성화
표준 벡터로부터 유도된 LP 클론 및 10개의 고생산성 FACS 벡터 클론을 진탕 플라스크로 증식시키고 범용 진탕 플라스크 회분식 및 유가식 모델에서 검사하여 그의 생산능을 평가하였다.
회분식 배양에서의 생산성은 모든 검사한 클론에 대해서 1 g/L 정도로 대략 동일한 것으로 관찰되었다. 유가식 생산성 또한 모든 클론에 대하여 매우 유사하였고 3.5 내지 4 g/L의 범위였다 (표 8 참조). FACS 벡터로 형질감염된 클론을 참조 벡터로 형질감염된 클론 (이전 실험으로부터의 클론 및 LP)과 비교하면 성장 파라미터의 유의한 차이점은 관찰되지 않았다. 또한, 생산 안정성은 FACS 벡터 유도된 클론에서 높은 것으로 관찰되었으며, 10개의 분석 클론 중 1개만이 배양 12주 후에 25% 초과의 생산성 감소를 나타냈지만, 이는 이전 실험에서 참조 표준 벡터에 의해 관찰된 것보다 낮은 비율의 비안정성 클론을 나타낸다 (데이터 도시하지 않음).
[표 8]
표 8: 표준 벡터 (pBW478)로 수득된 최고 생산성 클론 및 FACS 벡터 (pNT29)로부터 유도된 10개의 클론을 회분식 및 유가식 진탕 플라스크 배양액에서 분석하였다. IgG 함량을 13일째에 (회분식 배양액) 또는 17일째에 (유가식 배양액) 단백질-A HPLC에 의해 분석하였다. 모든 분석 클론은 유사한 범위의 생산성을 나타냈다.
실시예
11: 형질감염된
CHO
세포에 의한 폴리펩티드의 대량 생산
폴리펩티드의 대량 생산은 예를 들어 웨이브(wave), 유리 또는 스테인리스강 생물반응기에서 수행할 수 있었다. 상기 목적을 위해 세포를 통상적으로 단일 냉동 바이알, 예를 들면 마스터 셀 뱅크(Master Cell Bank) 제조의 바이알로부터 출발하여 증식시켰다. 세포를 해동시키고 여러 단계를 거쳐 증식시켰다. 상이한 규모의 생물반응기에 적절량의 세포를 접종시켰다. 세포 밀도는 생물반응기에 공급액 및 첨가제를 첨가함으로써 증가시킬 수 있었다. 세포를 장시간 동안 고생존율에서 유지하였다. 1 리터당 수백 밀리그램 내지 1 리터당 수 그램 이하 범위의 반응기내 생성물 농도가 대용량으로 달성되었다. 친화성, 이온 교환, 소수성 상호작용 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있는, 표준 크로마토그래피 방법에 의해 정제를 수행할 수 있었다. 생물반응기의 용량은 최종 규모에서 수천 리터의 부피까지 가능하다 (예를 들면, 문헌 [F. Wurm, Nature Biotechnology Vol. 22, 11, 2004, 1393-1398] 참조).
SEQUENCE LISTING
<110> Novartis AG
<120> Expression system
<130> 50 858 K
<150> EP08163161.6
<151> 2008-08-28
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 219
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence of a human IgG1 transmembrane domain
including stuffer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> Stuffer including stop codon
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Stop codon
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> Additional codon to mediate leakyness of the upstream stop codon
<400> 1
tgactagagc tgcaactgga ggagagctgt gcggaggcgc aggacgggga gctggacggg 60
ctgtggacga ccatcaccat cttcatcaca ctcttcctgt taagcgtgtg ctacagtgcc 120
accgtcacct tcttcaaggt gaagtggatc ttctcctcgg tggtggacct gaagcagacc 180
atcatccccg actacaggaa catgatcgga cagggggcc 219
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polypeptide sequence of a putative transmembrane region derived
from a human IgG1 transmembrane domain
<400> 2
Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Phe Ile Thr Leu Phe Leu Leu Ser Val
1 5 10 15
Cys Tyr Ser Ala Thr Val Thr Phe Phe
20 25
<210> 3
<211> 73
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polypeptide sequence of an Ig transmembrane region derived from
the human IgG1 transmembrane domain comprising the amino acids
derived from the stop codon and the adjacent codon, a connecting
region and a putative transmembrane region
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> amino acids that are most likely used at the TGA stop codon and
the downstream codon in case of read through
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(20)
<223> Putative connecting region derived from the human IgG1
transmembrane domain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(45)
<223> Putative transmembrane region derived from the human IgG1
transmembrane domain - said region may also be deemed as
comprising the next two amino acids
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (46)..(73)
<223> Putative cytoplasmatic region derived from human IgG1 - the first
two amino acids may also be deemed as belonging to the
transmembrane domain
<400> 3
Trp Leu Glu Leu Gln Leu Glu Glu Ser Cys Ala Glu Ala Gln Asp Gly
1 5 10 15
Glu Leu Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Phe Ile Thr Leu Phe
20 25 30
Leu Leu Ser Val Cys Tyr Ser Ala Thr Val Thr Phe Phe Lys Val Lys
35 40 45
Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Asp Leu Lys Gln Thr Ile Ile Pro Asp
50 55 60
Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ala
65 70
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cytoplasmatic region derived from an human IgG1 transmembrane
domain
<400> 4
Lys Val Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Asp Leu Lys Gln Thr Ile
1 5 10 15
Ile Pro Asp Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ala
20 25
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Connecting region derived from the human IgG1 transmembrane
domain
<400> 5
Glu Leu Gln Leu Glu Glu Ser Cys Ala Glu Ala Gln Asp Gly Glu Leu
1 5 10 15
Asp Gly
<210> 6
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Cytoplasmatic region derived from an human IgG1 transmembrane
domain
<400> 6
Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Asp Leu Lys Gln Thr Ile Ile Pro
1 5 10 15
Asp Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ala
20 25
<210> 7
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polypeptide sequence of a putative transmembrane region derived
from a human IgG1 transmembrane domain
<400> 7
Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Phe Ile Thr Leu Phe Leu Leu Ser Val
1 5 10 15
Cys Tyr Ser Ala Thr Val Thr Phe Phe Lys Val
20 25
Claims (15)
- a) 해당 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI), 제1 폴리뉴클레오티드 하류의 하나 이상의 정지 코돈, 및 면역글로불린 막관통 앵커(anchor) 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 정지 코돈 하류의 제2 폴리뉴클레오티드를 적어도 포함하는 하나 이상의 카세트(cassette; Cas-POI)를 포함하는 이종성 핵산을 포함하는 복수 개의 진핵 숙주 세포를 제공하는 단계;
b) 해당 폴리펩티드가 발현되도록 진핵 숙주 세포를 배양시켜 해당 폴리펩티드의 적어도 일부가 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현되게 하며, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 상기 숙주 세포의 표면 상에 표시되는 것인 단계;
c) 세포 표면 상에 표시되는 융합 폴리펩티드의 존재 또는 양을 기준으로 하나 이상의 진핵 숙주 세포를 선별하는 단계
를 포함하는, 해당 폴리펩티드를 목적하는 수준으로 발현하는 하나 이상의 진핵 숙주 세포의 선별 방법. - a) 해당 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI), 제1 폴리뉴클레오티드 하류의 하나 이상의 정지 코돈, 및 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 정지 코돈 하류의 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 카세트 (Cas-POI)를 포함하는 이종성 핵산을 포함하는 복수 개의 진핵 숙주 세포를 제공하는 단계;
b) 해당 폴리펩티드가 발현되도록 진핵 숙주 세포를 배양시켜 해당 폴리펩티드의 적어도 일부가 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현되게 하며, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 상기 숙주 세포의 표면 상에 표시되는 것인 단계;
c) 세포 표면 상에 표시되는 융합 폴리펩티드의 존재 또는 양을 기준으로 하나 이상의 진핵 숙주 세포를 선별하는 단계;
d) 해당 폴리펩티드의 발현이 가능한 조건하의 배양 배지에서 선별된 진핵 숙주 세포를 배양시키는 단계
를 포함하는, 해당 폴리펩티드의 고수율 생산 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 카세트 (Cas-POI)의 발현이
- 그의 번역이 해당 폴리펩티드를 생성하는 제1 폴리뉴클레오티드;
- 상기 제1 폴리뉴클레오티드 하류의 하나 이상의 정지 코돈;
- 그의 번역이 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 생성하는, 상기 정지 코돈 하류의 제2 폴리뉴클레오티드
를 적어도 포함하는 전사체를 생성하며, 여기서 상기 전사체의 적어도 일부는 하나 이상의 정지 코돈의 번역초과(translational read-through)에 의해 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드로 번역되는 것인 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 막관통 앵커가
a) IgA, IgE, IgM, IgG 및/또는 IgD로부터 유도된 막관통 앵커,
b) 세포질 도메인을 포함하는 면역글로불린 막관통 앵커,
c) 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6 및/또는 서열 7로 표시된 서열을 포함하는 면역글로불린 막관통 앵커, 및
d) 융합 폴리펩티드의 진핵 숙주 세포의 표면에의 고정을 가능하게 하는, 상기의 기능성 변이체
로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, c) 단계가 복수 개의 진핵 숙주 세포를 융합 폴리펩티드와 결합하는 검출 화합물과 접촉시키고 결합된 검출 화합물의 존재 또는 양을 기준으로 하나 이상의 진핵 숙주 세포를 선별하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 정지 코돈 번역초과가 대략 ≤ 50%, ≤ 25%, ≤ 15%, ≤ 10%, ≤ 5%, ≤ 2.5%, ≤ 1.5%, ≤ 1% 또는 ≤ 0.5% 미만의 융합 폴리펩티드를 초래하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 2번 이상의 선별 사이클을 수행하며, 여기서 각각의 선별 사이클에서 하나 이상의 진핵 숙주 세포가 세포 표면 상에 표시되는 융합 폴리펩티드의 존재 또는 양을 기준으로 선별되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 화합물의 진핵 숙주 세포의 표면에의 결합이 유동 세포계수법에 의해 검출되는 것인 방법.
- a) 해당 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI)를 위한 삽입 부위 및/또는 해당 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 카세트 (Cas-POI),
b) 상기 삽입 부위의 하류 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 하류의 하나 이상의 정지 코돈, 및
c) 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 정지 코돈 하류의 제2 폴리뉴클레오티드
를 포함하는, 진핵 숙주 세포에서 하나 이상의 해당 폴리펩티드의 발현에 적합한 벡터 핵산. - 제9항에 있어서,
- 카세트 (Cas-POI)내 해당 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI);
- 포유동물의 선별가능한 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트 (MSM); 및/또는
- 포유동물의 증폭가능하고 선별가능한 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트 (MASM)
중 하나 이상을 포함하는 벡터 핵산. - 제9항 또는 제10항에 있어서,
- 중쇄의 면역글로불린 분자 또는 그의 기능성 단편을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, 제1 폴리뉴클레오티드 하류의 하나 이상의 정지 코돈, 및 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 정지 코돈 하류의 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 (Exp-POI); 및
- 상응하는 경쇄의 면역글로불린 분자 또는 그의 기능성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 추가의 발현 카세트 (Exp-POI')
를 포함하는, 하나 이상의 면역글로불린 분자 또는 그의 기능성 변이체의 발현을 위한 벡터 핵산. - 하나 이상의 카세트 (Cas-POI)를, 상기 카세트 (Cas-POI)가 해당 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 (Pn-POI), 제1 폴리뉴클레오티드 하류의 하나 이상의 정지 코돈, 및 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 정지 코돈 하류의 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 벡터에 조합시키는 것을 포함하는, 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 벡터 핵산의 생산 방법.
- 하기 특성 중 하나 이상을 갖는 진핵 숙주 세포:
a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득됨;
b) 해당 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드 하류의 하나 이상의 정지 코돈 및 면역글로불린 막관통 앵커 또는 그의 기능성 변이체를 코딩하는 정지 코돈 하류의 폴리뉴클레오티드를 적어도 포함하는 카세트 (Cas-POI)를 포함함; 및/또는
c) 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 벡터 핵산을 포함함. - 제13항에 따른 진핵 숙주 세포를 해당 폴리펩티드의 발현을 위해 배양하는, 해당 폴리펩티드의 생산 방법.
- 제2항 내지 제8항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
- 폴리펩티드를 세포 배양액으로부터 수득하는 단계;
- 폴리펩티드가 배양 배지로 분비되고 그로부터 수득하는 단계;
- 진핵 숙주 세포를 파열시켜 발현된 폴리펩티드를 수득하는 단계;
- 발현된 폴리펩티드를 단리시키는 단계;
- 발현된 폴리펩티드를 정제하는 단계; 및/또는
- 발현된 폴리펩티드를 추가 가공하고/하거나 변형시키는 단계
중 하나 이상을 수행하는, 해당 폴리펩티드의 생산 방법.
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