KR20110055524A

KR20110055524A - 항체 복합체, 항원 검출 방법, 및 항체 복합체 제조 방법

Info

Publication number: KR20110055524A
Application number: KR1020117002133A
Authority: KR
Inventors: 후토시 시바사키; 요시히토 모리자네
Original assignee: 도쿄 메트로폴리탄 오거니제이션 포 메디칼 리서치; 신세라 테크놀로지즈 가부시키가이샤
Priority date: 2008-06-30
Filing date: 2009-06-30
Publication date: 2011-05-25
Also published as: AU2009267277A1; CN102159592A; CA2731981A1; EP2308899A4; JP5346507B2; US20110189690A1; EP2308899A1; JP2010006788A; WO2010001891A1

Abstract

본 발명은 MUSTag 의 검출 감도를 향상시키기 위해, 표지로서의 핵산 사슬, 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 및 핵산 사슬과 항체를 결합하는 어댑터 부위를 함유하는 항체 복합체에 있어서, 어댑터 부위에, 프로테인 G, 프로테인 A 또는 프로테인 L 중 어느 이뮤노글로블린 결합 도메인을 함유시켜 항체와 결합시키고, 어댑터 부위와 항체를 화학적으로 가교하여, 가교형 항체 복합체로 한다.

Description

항체 복합체, 항원 검출 방법, 및 항체 복합체 제조 방법 {ANTIBODY COMPLEX, ANTIGEN DETECTION METHOD, AND METHOD FOR PRODUCTION OF ANTIBODY COMPLEX}

본 발명은 항체 복합체, 항체 복합체를 사용한 항원 검출 방법, 및 항체 복합체의 제조 방법에 관한 것이다.

미량 항원을 검출 방법으로 하여, 종래, ELISA 등이 개발되었지만, 최근, 검출 감도를 높인 MUSTag 로 불리는 복합체를 사용하는 방법이 개발되었다 (국제 공보 WO2006/049289). 구체적으로는, 항체에, 프로테인 G 를 개재하여, 표지가 되는 올리고뉴클레오티드를 결합시킨 복합체를 사용하고, 이 복합체의 항체 부분을 항원과 결합시킨 후에, 올리고뉴클레오티드를 절단하여 회수하고, PCR 에 의해 올리고뉴클레오티드를 검출함으로써, 항원을 검출하는 방법을 일례로서 들 수 있다.

본 발명은 MUSTag 의 검출 감도를 향상시키는 것을 목적으로 한다.

발명자는 MUSTag 의 검출 감도를 향상시키기 위해서, 여러 가지 조건을 검토한 결과, 실시예에 나타내는 바와 같이, 어댑터 부위와 항체를 가교함으로써, 항원의 검출 감도가 강해지는 것을 알아내었다. 종래, 프로테인 G, 프로테인 A 또는 프로테인 L 은 높은 친화성으로 IgG 분자의 Fc 영역에 결합하는 것이 알려져 있기 때문에, 이 발견은 당업자에 있어서도 예상 외의 것으로, MUSTag 를 사용한 항원의 검출 방법에 있어서는, 프로테인 G, 프로테인 A 또는 프로테인 L 과 항체의 결합력이 충분하지 않은 것이 시사되었다.

본 발명의 하나의 실시양태는, 항원을 검출하기 위한 항체 복합체로서, 표지로서의 핵산 사슬, 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 및 상기 핵산 사슬과 상기 항체를 결합하는 어댑터 부위를 함유하고, 상기 어댑터 부위는 프로테인 G, 프로테인 A 또는 프로테인 L 중 어느 이뮤노글로블린 결합 도메인을 함유하고, 상기 어댑터 부위와 상기 항체는 화학적으로 가교되어 있다. 상기 항체 복합체는 상기 핵산 사슬을 떼어낼 수 있는 절단 부위를 포함해도 된다. 상기 절단 부위는 제한 효소, 광 조사 또는 활성 산소에 의해 절단되어도 된다. 상기 어댑터 부위는 아비딘류의 비오틴 결합 도메인과, 프로테인 G, 프로테인 A 또는 프로테인 L 의 이뮤노글로블린 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 함유하고, 핵산 사슬이 비오틴 결합 핵산이어도 된다. 상기 항체는 모노클로날 항체이어도 된다.

본 발명의 또 다른 실시양태는, 항원을 검출하는 방법으로서, 상기 항원과, 상기 어느 항체 복합체를 접촉시켜, 상기 항원과 상기 항체 복합체를 함유하는 항원 항체 복합체를 형성시키는 공정과, 상기 올리고뉴클레오티드 사슬을 검출하는 검출 공정을 포함한다. 상기 항원 항체 복합체는 상기 항체 복합체를 포함하고, 상기 검출 공정은 상기 절단 부위에서 상기 올리고뉴클레오티드 사슬을 떼어내어 회수하는 공정을 포함해도 된다. 상기 검출 공정은 상기 올리고뉴클레오티드 사슬을 증폭시키는 공정과, 증폭된 상기 올리고뉴클레오티드 사슬을 검출하는 공정을 포함해도 된다.

본 발명의 또 다른 실시양태는, 항원의 검출용 키트로서, 표지로서의 핵산 사슬, 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 및 상기 핵산 사슬과 상기 항체를 결합하는 어댑터 부위를 함유하는 항체 복합체를 함유하고, 상기 어댑터 부위는 프로테인 G, 프로테인 A 또는 프로테인 L 중 어느 이뮤노글로블린 결합 도메인을 함유하고, 상기 어댑터 부위와 상기 항체는 화학적으로 가교되어 있다. 상기 항체 복합체는 상기 핵산 사슬을 떼어낼 수 있는 절단 부위를 포함해도 된다. 상기 절단 부위는 제한 효소, 광 조사 또는 활성 산소에 의해 절단되어도 된다. 상기 어댑터 부위는 아비딘류의 비오틴 결합 도메인과, 프로테인 G, 프로테인 A 또는 프로테인 L 의 이뮤노글로블린 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 함유하고, 핵산 사슬이 비오틴 결합 핵산이어도 된다. 상기 항체는 모노클로날 항체이어도 된다.

==관련 출원에 대한 크로스 레퍼런스==

본 출원은 2008년 6월 30일자로 일본 특허청에 출원한 일본 특허출원 2008-171512호에 기초하는 우선권을 주장하는 것으로, 당해 기초 출원을 인용함으로써, 본 명세서에 포함시키는 것으로 한다.

도 1 은 본 발명의 하나의 실시예에 있어서의, 정제 후의 프로테인 G/스트렙타아비딘/His-tag 융합 단백질의 SDS-PAGE 의 결과를 나타내는 사진이다.
도 2 는 본 발명의 하나의 실시예에 있어서, 가교형 MUSTag 를 사용하고, 여러 가지 항원 농도에 있어서의 항원의 검출 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3 은 본 발명의 하나의 실시예에 있어서, 가교형 MUSTag 를 사용하고, 여러 가지 항원 농도에 있어서의 항원의 검출 결과를 표준화한 그래프이다.
도 4 는 본 발명의 하나의 실시예에 있어서, 복수의 가교제를 사용하여 제조한 가교형 MUSTag 를 사용하고, 여러 가지 항원 농도에 있어서의 항원의 검출 결과를 나타낸 그래프 및 검출 결과를 표준화한 그래프이다.

이하, 상기 지견에 기초하여 완성한 본 발명의 실시형태를, 실시예를 들면서 상세하게 설명한다. 실시형태 및 실시예에 특별히 설명이 없는 경우에는, J.Sambrook, E.F.Fritsch & T.Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) ; F.M.Ausubel, R.Brent, R.E.Kingston, D.D.Moore, J.G.Seidman, J.A.Smith, K.Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. 등의 표준적인 프로토콜집에 기재된 방법, 혹은 그것을 수식하거나 개변한 방법을 사용한다. 또, 시판되는 시약 키트나 측정 장치를 사용하는 경우에는, 특별히 설명이 없는 경우, 그들에 첨부된 프로토콜을 사용한다.

또한, 본 발명의 목적, 특징, 이점, 및 그 아이디어는 본 명세서의 기재에 의해, 당업자에게는 분명하고, 본 명세서의 기재로부터, 당업자라면 용이하게 본 발명을 재현할 수 있다. 이하에 기재된 발명의 실시형태 및 구체적으로 실시예 등은 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내는 것이고, 예시 또는 설명을 위해서 나타내는 것으로서, 본 발명을 그들에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 개시되어 있는 본 발명의 의도 그리고 범위 내에서, 본 명세서의 기재에 기초하여, 여러 가지 개변 그리고 수식을 할 수 있는 것은 당업자에게 있어서 분명하다.

==가교형 항체 복합체==

본 발명의 항체 복합체는 표지로서의 핵산 사슬, 검출 대상인 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 및 핵산 사슬과 항체를 결합하는 어댑터 부위를 함유하고, 어댑터 부위는 프로테인 G, 프로테인 A 또는 프로테인 L 중 어느 이뮤노글로블린 결합 도메인을 함유하고, 어댑터 부위와 항체는 화학적으로 가교되어 있다.

표지로서의 핵산 사슬은 DNA 이어도 되고 RNA 이어도 되는데, 검출을 용이하게 하기 위해, DNA 인 것이 바람직하다. 또, 그 길이에 제한은 없지만, 절단이나 검출시에 효소 등이 작용하기 쉽도록 짧은 것이 바람직한데, 검출하기 쉽도록, 십수 염기∼수십 염기 길이의 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 또한 한 개 사슬 또는 2 개 사슬이어도 되는데, 안정성의 면에서 2 개 사슬인 것이 바람직하다. 이 핵산 사슬을 PCR 등으로 검출하기 위해서, 핵산 사슬의 염기 배열은 가능한 한 특이적인 것이 바람직하다.

항체 복합체에 포함되는 핵산 사슬과 항체는 어댑터 부위를 개재하여 결합되어 있다. 그것에 의해 올리고뉴클레오티드 복합 항체의 구조 안정성을 더욱 높일 수 있고, 얻어지는 복합체의 수율을 보다 향상시킴과 함께, 나아가서는 검출 감도나 검출 효과를 높이는 등의 효과가 얻어진다.

이 어댑터 부위는 프로테인 G, 프로테인 A 또는 프로테인 L 중 어느 이뮤노글로블린 결합 도메인을 함유하고 있으면, 그 밖의 구성은 특별히 한정되지 않는다.

따라서, 어댑터 부위는 프로테인 G, 프로테인 A 또는 프로테인 L 의 단백질 그 자체를 함유하고 있어도 되고, 그들의 이뮤노글로블린 결합 도메인과 다른 펩티드의 융합 단백질을 함유해도 된다. 또한, 여기서, 프로테인 G, 프로테인 A 또는 프로테인 L 은 야생형 단백질뿐만 아니라, 이뮤노글로블린 결합 활성을 갖는 변이형 단백질이어도 된다.

예를 들어, 이뮤노글로블린 결합 도메인은, 각각, 프로테인 G (GenBank accession number cDNA : X06173, protein : CAA29540) 의 경우, 303-357 번째, 373-427 번째, 443-497 번째의 아미노산의 영역이고, 프로테인 A (GenBank accession number cDNA : M18264, protein : AAA26677) 의 경우, 39-88 번째, 100-149 번째, 158-207 번째, 216-265 번째, 274-323 번째의 아미노산의 영역이며, 프로테인 L (GenBank accession number cDNA : M86697, protein : AAA25612) 의 경우, 115-173 번째, 185-245 번째, 257-317 번째, 329-389 번째, 400-462 번째의 아미노산의 영역이다.

또한, 어댑터 부위는 제조할 때에 필요한 tag 를 포함해도 된다. tag 의 종류는 특별히 한정되지 않고, GST-tag 나 MBP-tag, myc-tag 나 flag-tag 등이어도 되는데, 저분자의 니켈에 결합할 수 있기 때문에, 화학 가교 공정에서 영향이 없다는 점에서, tag 는 His-tag 인 것이 바람직하다.

어댑터 부위에 포함되는 이뮤노글로블린 결합 도메인은 항체에는 직접 결합하고 있는데, 핵산 사슬에 대해서는, 직접적으로 결합하고 있어도 되고, 간접적으로 결합하고 있어도 된다. 간접적으로 결합하는 경우, 예를 들어, 아비딘류의 비오틴 결합 도메인과, 프로테인 G, 프로테인 A 또는 프로테인 L 의 이뮤노글로블린 결합 도메인이 링커 화합물을 개재하여 결합하거나, 혹은 융합 단백질이 되어 있고, 한편, 핵산 사슬이 비오틴과 결합하고 있고, 비오틴 결합 도메인과 비오틴이 결합하는 경우나, 이뮤노글로블린 결합 도메인과 핵산 사슬이 함께 비오틴과 결합하고 있고, 이들 비오틴끼리가 아비딘류를 개재하여 결합하는 경우 등, 여러 가지 양태를 생각할 수 있다. 링커 화합물로는, 예를 들어 「Sulhsuccinimidy1 4-(N·maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo·SMCC)」등을 사용할 수 있다.

여기서, 아비딘류는 통상 호모 4 량체를 형성하고 있고, 1 개의 서브유닛에 대해 1 개의 비오틴 결합 도메인을 가지므로, 단백 전체로 4 개의 비오틴 결합 도메인을 가지고 있게 되는데, 본 발명에서 사용하는 비오틴 결합 도메인은 1 개의 서브 유닛이 있으면 되고, 또 4 량체를 형성하고 있어도 된다. 그러나, 표지인 핵산 사슬을 용액 중에 노출하는 구조로 하기 위해, 프로테인 G1 분자에 핵산 사슬 1 분자를 결합시키는 것이 바람직하고, 그러기 위해서는, 4 량체를 형성하지 않고 비오틴 결합 도메인을 1 개만 갖는 단량체의 아비딘류 변이체를 사용하는 것이 바람직하다. 지금까지 단량체가 되는 아비딘류 변이체는 활발하게 연구되어 왔지만, 성공하지 못한 경우가 많았다 (Qureshi, M.H., and Wong, S.L. (2002). Protein Expr Purif vol.25, p.409-415 ; Laitinen, O.H.et al., (2003). J Biol Chem vol.278, p.4010-4014.). 그러나, 본 발명에 있어서는, 실시예에 나타내는 바와 같이, 스트렙타아비딘의 39-183 번째의 아미노산 배열을 갖는 펩티드를 사용함으로써, 비오틴과의 결합 활성을 잃지 않는 변이체가 제조되었다.

또, 아비딘류란, 아비딘, 스트렙타아비딘이나 뉴트러아비딘 등의 비오틴 결합 단백질이다. 예를 들어, 아비딘 (RefSeq accession number cDNA : NM_205320, protein : NP_990651) 및 뉴트러아비딘 (아비딘과 배열은 동일하고 탈글리코실 처리한 것) 의 경우, 비오틴 결합 도메인은 아미노산 28-146 번째의 영역이며, 스트렙타아비딘 (GenBank accession number cDNA : X03591, protein : CAA27265) 의 경우에는, 아미노산 39-156 번째의 영역이다.

어댑터 부위와 항체는 화학적으로 가교되어 있지만, 가교의 종류에 대해서는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 아미노기 간 가교, 카르복실기 간 가교, 티올기 간 가교 등을 들 수 있다. 어댑터 부위 중에서, 항체와 가교되는 아미노산 잔기는 특별히 한정되지 않지만, 항체와 직접 결합하고 있는 이뮤노글로블린 결합 도메인 중의 잔기인 것이 바람직하다.

항체는, 검출 대상인 항원에 특이적으로 결합할 수 있으면, 폴리클로날 항체 이어도 되고 모노클로날 항체이어도 된다. 또, 항체의 종류에 제한은 없고, 예를 들어 IgG 이어도 되고 IgM 이어도 되는데, 어댑터 부위에 포함되는 이뮤노글로블린 결합 도메인이 결합하는 종류의 항체여야 한다.

이와 같이, 핵산 사슬, 항체, 및 핵산 사슬과 항체를 결합하는 어댑터 부위를 함유하는 항체 복합체에 있어서, 어댑터 부위와 항체를 가교하여 가교형 항체 복합체로 함으로써, 항원의 검출 감도가 현저하게 강해진다.

상기 서술한 항체 복합체는 핵산 사슬을 떼어낼 수 있는 절단 부위를 포함해도 된다. 이 절단 부위는 핵산, 항체, 어댑터 부위 중 어느 것에 형성되어도 되는데, 예를 들어, 핵산에 형성할 때에는, 제한 효소에 의한 절단 부위, 항체나 단백질의 어댑터에 형성할 때에는, 프로테아제에 의한 절단 부위, 어댑터로서 크로스 링커 (2 가의 가교제 등) 를 형성할 때에는 광 조사나 활성 산소에 의한 절단 부위와 같이, 형성하는 장소에 따라 그 특성이 상이하다. 그러나, 간편함과 특이성 면에서, 핵산 사슬에 제한 효소에 의한 절단 부위를 형성하는 것이 바람직하다.

또, 핵산 사슬을, 표지로서 기능시키기 위해, 방사성 동위 원소, 형광 색소, 효소 등의 마커를 결합시켜도 된다.

==가교형 항체 복합체의 제조 방법==

핵산 사슬, 항체, 및 핵산 사슬과 항체를 결합하는 어댑터 부위를 함유하는 가교형 항체 복합체는, 이들의 구성 요소를 함유하도록 제조할 수 있으면, 특별히 한정되지 않는다.

예를 들어, 먼저, 어댑터 부위에, 표지 부분이 되는 핵산 사슬을 결합시키고, 이어서, 어댑터 부위를 항체에 고정시켜 항체 복합체를 제조하고, 그 후, 화학 가교제를 사용하여 어댑터 부위와 항체를 가교해도 된다.

어댑터 부위에 핵산 사슬을 직접적으로 결합시키는 경우에는, 어댑터 부위의 어디에 결합시켜도 되는데, 예를 들어, 핵산 사슬의 말단을 아미노기 혹은 티올기로 수식하고, 어댑터 부위 중의 아미노기, 카르복실기, 티올기 등의 관능기와 적절한 가교제를 사용하여 화학적으로 가교함으로써 결합시킬 수 있다. 또, 어댑터 부위에 핵산 사슬을 간접적으로 결합시키는 경우에는, 어댑터 부분을 아비딘류의 비오틴 결합 도메인과 결합시켜, 핵산 사슬을 비오틴화하고, 양자를 통상적인 방법에 의해 혼합함으로써, 핵산 사슬을 어댑터 부분에 결합시킬 수 있다. 혹은, 미리 어댑터 부분 및 핵산 사슬 등을 모두 비오틴화해 두고, 통상적인 방법에 의해 당해 어댑터 부분과 핵산 사슬을 혼합함과 함께 아비딘류를 첨가함으로써, 아비딘류를 개재하여 핵산 사슬을 어댑터 부분에 결합시킬 수도 있다. 이어서, 어댑터 부분/핵산 사슬 결합체와 항체를, 통상적인 방법에 의해 혼합함으로써, 항체 복합체를 얻을 수 있다.

마지막으로, 이 항체 복합체를 화학 가교제로 처리함으로써, 항체 복합체 중의 어댑터 부위와 항체를 가교한다. 가교제로는, Dimethyl Pimelimidate (DMP), Dimethyl suberimidate (DMS), Bis[Sulfosuccinimidyl]suberate (BS3) 등을 사용할 수 있는데, 가교의 효율을 높여, 항체 복합체-어댑터 부위를 보다 특이적으로 가교시키기 위해, DMP 를 사용하는 것이 바람직하다.

==가교형 항체 복합체를 사용한 항원 검출 방법==

이렇게 하여 제조된 가교형 항체 복합체와, 검출 대상인 항원을 접촉시켜 항원 항체 복합체를 형성시킨다.

검출 대상이 되는 항원은 그 종류·존재 양식 등 특별히 한정되지 않지만, 항체로 인식할 수 있으면, 단백질이어도 되고 당이어도 되며 핵산이어도 되고, 정제물이어도 되고 추출물이어도 된다. 또, 바이러스나 세포에 존재하고 있어도 되고, 그 경우, 바이러스나 세포를 그대로 검출에 사용해도 된다. 따라서, 피험 시료는, 예를 들어, 생체 성분 (조직이나 혈액) 이나 그 추출물, 식육이나 야채 등의 식품류, 토양이나 하천수 등이어도 된다.

항원 항체 복합체의 제조 방법은 특별히 한정되지 않고, 항원을 지지체에 고정화해도 되고 하지 않아도 되지만, 예를 들어, 항원을 지지체에 고정화시키고, 가교형 항체 복합체를 항원에 결합시킴으로써, 가교형 항체 복합체를 지지체에 결합시킨다. 그 후, 완충액으로 세정함으로써, 미반응의 가교형 항체 복합체를 제거할 수 있고, 고순도의 항원 항체 복합체를 얻을 수 있다. 이 지지체에는, 플라스틱의 저면이나 비즈 등을 사용할 수 있다. 또, 항원을 지지체에 고정화하는 데에, 항원을 지지체에 직접 결합시켜도 되고, 간접적으로 결합시켜도 된다. 직접 결합시키는 경우에는, 항원을 포함하는 완충액을 지지체와 접촉시키면 되고, 간접적으로 결합시키는 경우에는, 지지체에, 항원이 결합하는 물질 (예를 들어, 항체 등) 을 미리 결합시키고, 그곳에 항원을 포함하는 완충액을 지지체와 접촉시키면 된다. 특이성을 높이기 위해서는, 후자의 간접 결합이 바람직하다.

항원에 결합한 가교형 항체 복합체를 검출하기 위해서, 용기째 PCR 등으로, 가교형 항체 복합체 중의 핵산을 검출해도 되는데, 검출 조작을 간편하게 하기 위해서, 핵산을 회수하는 것이 바람직하다.

핵산은 가교형 항체 복합체 통째로 회수해도 되고, 예를 들어, 통상적인 방법에 따라, 항원과 항체를 해리시킴으로써 가교형 항체 복합체를 회수할 수 있다. 혹은, 핵산만을 회수해도 되고, 산 처리, 알칼리 처리, 열 처리, 프로테아제 처리 등을 실시하여, 가교형 항체 복합체를 변성시키거나 분해시키거나 하면 된다.

그러나, 이와 같은 과격한 처리에서는, 검출을 HRP 등의 효소 반응으로 실시할 수 없어, PCR 을 실시하기 위해서는, Taq 폴리머라아제 등의 효소를 기능시킬 수 있도록 핵산을 정제할 필요가 있다. 따라서, 가교형 항체 복합체에 핵산 사슬을, 제한 효소 처리나 광 처리 등의 온화한 처리로 떼어낼 수 있는 절단 부위를 형성하는 것이 바람직하다. 그리고, 핵산 사슬의 검출을 하기 위해서, 이 절단 부위에서 항원 항체 복합체로부터 핵산 사슬을 떼어내어 회수한다. 이 회수 공정에 의해, 핵산 사슬의 검출 전에 농축시킬 수 있고, 보다 소량의 핵산 사슬도 검출 가능하게 된다.

이와 같이 하여 회수된 핵산 사슬을 검출한다. 검출 방법은 특별히 한정되지 않지만, 방사성 동위 원소, 형광 색소, 효소 등의 마커가 핵산 사슬에 결합하고 있는 경우, 그 마커를 검출해도 된다. 그러나, 검출 감도의 면에서, 핵산 사슬을 증폭시켜 검출하는 것이 바람직하다. 증폭 방법은 통상적인 방법에 따르면 되고, PCR 법, LAMP 법, ICAN 법 등을 사용할 수 있다. 또, 검출도, 전기 영동법 등 통상적인 방법을 이용하면 된다.

또한, 복수의 항원을 동시에 검출하기 위해서는, 각 항원에 특이적으로 결합하는 항체와, 항원의 종류에 일대일로 대응하는 핵산 사슬을 함유하는 항체 복합체를 사용함으로써, 각 항원을 각 핵산 사슬과 대응할 수 있도록 한다. 그것에 따라, 각 핵산 사슬을 검출함으로써 각 항원을 개별적으로 검출할 수 있다.

이 경우, 각 항원에 대한 특이적 항체 복합체를 얻기 위해서는, 각각의 항체 복합체를 각각 형성한 후, 정제해 둘 필요가 있고, 사용할 때에는, 항체 복합체를 각각 혼합하면 된다.

상이한 항원에 대응하는 핵산 사슬은 배열을 바꿈으로써 특이성을 갖게 해도 되고, 길이를 바꿈으로써 특이성을 갖게 해도 된다. 후자의 경우, DNA 증폭을 위한 프라이머를 공통으로 하는 것도 가능해진다. 또, 핵산 사슬에, 상이한 종류의 표지 (예를 들어, 효소의 경우, 알칼리포스파타아제와 HRP 와 같이) 로 라벨함으로써, 특이성을 갖게 할 수도 있다.

==항원 검출용 키트==

본 발명에 관련된 가교형 항체 복합체를 사용한 항원의 검출을 용이하게 하기 위해서, 필요한 시약을 항원 검출용 키트로서 키트화해도 된다.

이 키트는 표지로서의 핵산 사슬, 검출 대상인 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 및 핵산 사슬과 항체를 결합하는 어댑터 부위를 함유하는 항체 복합체를 함유한다. 여기서, 어댑터 부위는 프로테인 G, 프로테인 A 또는 프로테인 L 중 어느 이뮤노글로블린 결합 도메인을 함유하고, 어댑터 부위와 항체는 화학적으로 가교되어 있다.

그 밖의 항체 복합체의 양태는 「가교형 항체 복합체」의 항에서 서술한 대로이다.

이 키트에는, 가교형 항체 복합체 외에, 다른 구성 성분을 구비해도 되고, 여러 가지 버퍼, 프라이머나 효소 등의 검출용 시약을 포함하고 있어도 된다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

==프로테인 G/스트렙타아비딘/His-tag 의 융합 단백질의 제조==

먼저, 프로테인 G/스트렙타아비딘/His-tag 의 융합 단백질 (이하, 융합 단백질이라고 부른다) 을 제조하였다. 먼저, 프로테인 G 에 있어서의 IgG 항체 Fc 영역과의 결합 영역을 포함하는 부분으로서, 배열 번호 1 (프로테인 G 전체 길이, GenBank accession number : M13825) 에 나타나는 아미노산 배열 중 제 228 번째∼제 268 번째의 아미노산 배열 영역 (배열 번호 2) 을 코드하는 DNA (배열 번호 3 에 나타나는 염기 배열 중 제 1259 번째∼제 1381 번째의 염기 배열 (배열 번호 4)), 및 스트렙타아비딘에 있어서의 비오틴과의 결합 영역을 포함하는 부분으로서, 배열 번호 5 (스트렙타아비딘 전체 길이, GenBank accession number : X03591) 에 나타나는 아미노산 배열 중 제 39 번째∼제 183 번째의 아미노산 배열 영역 (배열 번호 6) 을 코드하는 DNA (배열 번호 7 에 나타나는 염기 배열 중 제 164 번째∼제 598 번째의 염기 배열 영역 (배열 번호 8) 을, 인산기 부위 무보호법에 의한 화학 합성법에 의해 합성하였다. 이 때, 필요에 따라, 단편적으로 합성된 개개의 2 개 사슬 DNA 를 결합시켜, 전체 길이 DNA 를 완성하였다. 그 후, 합성한 각 DNA 를 각각 주형 (鑄型) 으로 하고, 하기의 프라이머를 사용하여〈95 ℃ 30 초 - 55 ℃ 30 초 - 72 ℃ 30 초를 35 사이클〉의 반응 조건에서 PCR 을 실시하고, 각 2 개 사슬 DNA 를 증폭시켰다. 또한, PCR 에 의해 얻어지는 DNA 단편이 양단 (소문자 부분의 염기 배열) 에 제한 효소 인식 부위를 갖도록, 각 프라이머를 설계하였다.

프로테인 G 프라이머 F :

프로테인 G 프라이머 R :

스트렙타아비딘 프라이머 F :

스트렙타아비딘 프라이머 R :

얻어진 DNA 단편을 EcoRI 로 절단 후, 라이게이션에 의해 결합시키고, 재차, 프로테인 G 프라이머 F 와 스트렙타아비딘 프라이머 R 을 사용하여 PCR 을 실시하고, 융합 DNA 단편을 증폭시켰다.

다음으로, His-tag 와의 융합 단백질을 합성하기 위한 박테리아용 발현 벡터 pCR2.1 (Invitrogen 사) 을 사용하고, 증폭시킨 융합 DNA 단편을 NdeI 로 절단하고, 이 벡터의 NdeI 부위에 삽입하였다. 이와 같이 하여, 프로테인 G/스트렙타아비딘/His-tag 의 융합 단백질 (배열 번호 13) 을 코드하는 염기 배열 (배열 번호 14) 을 갖는 재조합 벡터를 구축하였다.

이 재조합 벡터를 대장균 DH5α 에 도입하고, IPTG 로 발현 유도시킨 후, 대장균을 가용화하여, 니켈킬레이트를 고상화한 세파로오스 비즈 (품명 : Ni-NTA agarose, 회사명 : QIAGEN, 제품 번호 : 30210) 를 사용하여, 프로테인 G/스트렙타아비딘/His-tag 의 융합 단백질을 정제하였다. 정제 후의 단백질의 분석 결과의 일례 (SDS-PAGE 에 의한 해석) 를 도 1 에 나타낸다.

==올리고뉴클레오티드의 비오틴화==

배열 번호 15 의 배열 (131 염기) 을 갖는 DNA 를 인서트한 pcDNA3 (Invitrogen 사 제조) 을 주형 DNA 로 하고, 비오틴화 프라이머 (5-MUSTagBio) 를 포함하는 하기 프라이머 (배열 번호 16 및 17) 를 사용하여〈95 ℃ 60 초 - 55 ℃ 60 초 - 72 ℃ 30 초를 35 사이클〉의 반응 조건에서 PCR 을 실시함으로써, 5' 말단이 비오틴화된 올리고뉴클레오티드 사슬 #1 (배열 번호 15) 을 합성하였다.

#1 :

마찬가지로, 배열 번호 18 의 배열을 갖는 DNA 를 인서트한 pcDNA3 (Invitrogen 사 제조) 를 주형으로 하고, 동일한 프라이머 (배열 번호 16, 17) 를 사용하여, 5' 말단이 비오틴화된 올리고뉴클레오티드 사슬 #7 (배열 번호 18) 을 합성하였다.

#7 :

〈PCR 용 프라이머의 배열〉

5-MUSTag primer Bio-F :

3-MUSTag primer R :

==가교형 항체 복합체의 제조==

(1) 올리고뉴클레오티드와 항체의 융합 단백질에 대한 결합

미량 원심 튜브에, 결합 버퍼 (0.2 M Borate pH 9.0, 0.5 M NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.05 ％ Monocaprate) 243.4 ㎕, 융합 단백질 6.6 ㎕ (100 pmol), 비오틴화 올리고뉴클레오티드 (IFN-γ 및 IL-12 에 대해서는 #1, EGF 및 IL-15 에 대해서는 #7) 를 40 ㎕ (100 pmol) 첨가하고, 실온에서 0.5 시간 회전시키면서, 융합 단백질의 스트렙타아비딘 부위와 비오틴화 올리고뉴클레오티드를 결합시켰다. 그 후, 하기의 항체 (0.5 ㎎/㎖) 를 60 ㎕ (200 pmol) 첨가하고, 실온에서 1 시간 회전시키면서, 융합 단백질의 프로테인 G 부위와 항체를 결합시켰다.

〈항체의 종류〉

항 hEGF 항체 : 종류 : goat polyclonal, 회사명 : R&D, 제품 번호 : AF236, 농도 : 0.5 ㎎/㎖

항 hIFN-γ 항체 : 종류 : goat polyclonal, 회사명 : R&D, 제품 번호 : AF-285-NA, 농도 : 0.5 ㎎/㎖

항 hIL-12 p70 항체 : 종류 : mouse IgG1, 회사명 : R&D, 제품 번호 : MAB611 (clone 24945), 농도 : 0.5 ㎎/㎖

항 hIL-15 항체 : 종류 : mouse IgG1, 회사명 : R&D, 제품 번호 : MAB247 (clone 34593), 농도 : 0.5 ㎎/㎖

(2) 가교 반응

사용 직전에 커플링 버퍼로 6 mM 로 조정한 DMP (Pierce, #21667, MW 259.177) 를 반응 용액과 등량 (약 350 ㎕) 첨가하여 혼합하고, 1 시간, 실온에서 정치하였다. 1 M Tris (pH 7.4) 를 최종 농도 50 mM 가 되도록 첨가하고, 15 분간, 실온에서 정치하고, 가교 반응을 정지시킨 후, 0.45 ㎛ PTFE 필터 (제품명 : Millex FH, 회사명 : Millipore, 제품 번호 : SLFHR04NL) 로 여과하였다. 마지막으로, 하기의 조건에서 반응액을 겔 여과 크로마토그래피에 의해 분획하고, 가장 분자량이 큰 피크의 획분을 회수하여 MUSTag 용액으로 하였다. 용액 중의 MUSTag 의 농도는, 제작에 사용한 항체를 표준으로 하고, ELISA 로 비교함으로써 측정하였다.

〈겔 여과 크로마토그래피의 조건〉

기기 : 제품명 : SMART system, 회사명 : 구 Pharmacia (현 GE Healthcare, 제조 중지품)

칼럼 : 제품명 : Superdex 200 PC 3.2/30, 회사명 : GE Healthcare, 제품 번호 : 17-1089-01)

버퍼 : 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.5 M NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.05 ％ Monocaprate

유속 : 100 ㎕/min

(3) 항원과 MUSTag 의 결합

EGF, IFN-γ, IL-12, IL-15 의 각각에 대한 하기 포착용 항체를, 고상화용 버퍼 (0.05 M NaHCO3-Na2CO3 Buffer (pH 9.6), 0.02 ％ sodium azide) 로 2 ㎍/㎖ 의 농도로 조제하고, 96 웰 플레이트의 각 웰에 50 ㎕ 첨가하여 4 ℃ 에서 하룻밤 정치함으로써, 포착용 항체를 플레이트에 고상화하였다. 고상화 후, 웰 내의 액을 버리고, 1 ％ BSA/PBS 를 50 ㎕ 첨가하고, 60 분간 실온에서 정치하여, 플레이트의 블로킹을 실시하였다. 그 후, 이하와 같이 조정한 8 단계 농도의 각 항원을 50 ㎕ 첨가하여 혼합하고, 실온에서 60 분간 정치하고 플레이트 상에 고상화한 포착용 항체와 결합시켰다. 항체 결합 후, 웰 내의 용액을 버리고, MUSTag 희석액 (1 ％ BSA/0.05 ％ Tween 20/0.45 M NaCl/50 mM Na2HPO4-NaH2PO4 Buffer (pH 7.4)) 으로 8 ng/㎖ 의 농도로 조제한 가교 MUSTag, 및, 컨트롤로서, 가교하지 않은 MUSTag 를 25 ㎕ 첨가하고, 실온에서 60 분간 방치하여 항원에 결합시켰다. 그 후, 1st wash Buffer (0.5 M NaCl/0.05 ％ Tween 20/20 mM Tris-HCl (pH 7.4)) 300 ㎕ 로 1 회, 2nd wash Buffer (0.05 ％ Tween 20/PBS 300 ㎕) 로 3 회 각 웰을 세정하였다.

〈포착용 항체의 종류〉

항 hEGF 항체 : 종류 : mouse IgG1, 회사명 : R&D, 제품 번호 : MAB636 (clone 10827), 보존 농도 : 0.5 ㎎/㎖

항 hIFN-γ 항체 : 종류 : mouse IgG2A, 회사명 : R&D, 제품 번호 : MAB2852 (clone K3.53), 보존 농도 : 0.5 ㎎/㎖

항 hIL-12 항체 : 종류 : goat polyclonal, 회사명 : R&D, 제품 번호 : AF-219-NA, 보존 농도 : 0.5 ㎎/㎖

항 hIL-15 항체 : 종류 : mouse IgG1, 회사명 : R&D, 제품 번호 : MAB647 (clone 34505), 보존 농도 : 0.5 ㎎/㎖

〈항원의 조정〉

이하, 각 항원의 희석에는, 항원 희석액 (1 ％ BSA/PBS) 을 사용하였다.

rhEGF 의 원액 (회사명 : R&D, 제품 번호 : 236-EG, 보존 농도 : 200 ㎍/㎖)를 100,000 배로 희석하고, 2000 pg/㎖ 로 조제하였다. 또한 희석 항원액을 10 배씩 희석하여 10 배 희석 계열을 7 단계 제조하고, 네거티브 컨트롤 (0 pg/㎖, 항원 희석액만) 을 포함하여 8 종류의 농도 (2000, 200, 20, 2, 0.2, 0.02, 0.002, 0 [pg/㎖]) 의 항원을 준비하였다.

rhIFN-γ 의 원액 (회사명 : R&D, 제품 번호 : 285-IF, 보존 농도 : 100 ㎍/㎖) 을 5,000 배로 희석하고, 20000 pg/㎖ 로 조제하였다. 또한 희석 항원액을 5 배씩 희석을 실시하여 5 배 희석 계열을 7 단계 제조하고, 네거티브 컨트롤 (0 pg/㎖, 항원 희석액만) 을 포함하여 8 종류의 농도 (20000, 4000, 800, 160, 32, 6.4, 1.28, 0 [pg/㎖]) 의 항원을 준비하였다.

rhIL-12 의 원액 (회사명 : R&D, 제품 번호 : 219-IL, 보존 농도 : 10 ㎍/㎖) 을 1 ％ BSA/PBS 로 250 배로 희석하고, 40000 pg/㎖ 로 조제하였다. 또한 희석 항원액을 5 배씩 희석하여 5 배 희석 계열을 7 단계 제조하고, 네거티브 컨트롤 (0 pg/㎖, 항원 희석액만) 을 포함하여 8 종류의 농도 (40000, 8000, 1600, 320, 64, 12.8, 2.56, 0 [pg/㎖]) 의 항원을 준비하였다.

rhIL-15 의 원액 (회사명 : R&D, 제품 번호 : 247-IL, 보존 농도 : 10 ㎍/㎖) 을 2,500 배로 희석하고, 4000 pg/㎖ 로 조제하였다. 또한 희석 항원액을 5 배씩 희석하여 5 배 희석 계열을 7 단계 제조하고, 네거티브 컨트롤 (0 pg/㎖, 항원 희석액만) 을 포함하여 8 종류의 농도 (4000, 800, 160, 32, 6.4, 1.28, 0.256, 0 [pg/㎖]) 의 항원을 준비하였다.

(4) 올리고뉴클레오티드 사슬의 검출

세정 후의 각 웰의 용액을 완전히 제거하고, EcoRI 효소 용액 (7.5 unit/㎖ EcoRI/50 mM NaCl/10 mM MgCl2/10 mM Tris-HCl (pH 7.4)) 을 30 ㎕ (EcoRI 0.225 unit/well 함유) 를 첨가하여 실온에서 15 분 반응시키고, 항체 복합체의 올리고뉴클레오티드 사슬을 절단하였다. 반응 후의 상청을 회수하고, 이 상청 3 ㎕ 에 대해, 하기의 프라이머 및 프로브 (프라이머의 배열은 #1 과 #7 로 공통) 를 사용하여 리얼타임 PCR 을 실시하였다. 또한, PCR 은〈95 ℃, 15 min 의 프리히팅 후, 95 ℃, 15 sec - 60 ℃, 1 min 를 35 사이클〉이라는 조건에서 실시하였다. 리얼타임 PCR 에 의한 DNA 사슬의 합성 반응에 수반하여 변동하는 형광량을, 반응 개시 후 1 사이클마다 측정함으로써, 항원의 각 희석 계열의 웰마다, 증폭 단편의 검출의 가능 여부, 및 증폭량의 변화를 관찰하였다.

〈리얼타임 PCR 용 프라이머·프로브 배열〉

(5) 얻어진 결과의 표준화와 해석

상기 검출 방법에 있어서, 항원 항체 반응의 검출 결과는 Ct 값 (PCR 에 의해 증폭된 DNA 가 기준량에 이르는 데에 필요로 한 사이클 수) 으로 나타낸다. 그 결과를 도 2 에 나타낸다.

또, 각 검출 결과에 대해, 블랭크인 Ct 값의 평균으로부터 각 항원 농도에서의 Ct 값을 빼고 차분 (ΔCt) 을 구함으로써, 각 검량선의 표준화를 실시하였다. 그 결과를 도 3 에 나타낸다.

여기서, ΔCt 가 각 측정계에 있어서의 블랭크 측정값의 표준 편차의 3.3 배가 되는 항원 농도를 저농도측의 검출 한계로 하고, (가교 있음의 MUSTag 를 사용했을 때의 저농도측의 검출 한계의 항원 농도)/(가교 없음의 MUSTag 를 사용했을 때의 저농도측의 검출 한계의 항원 농도) 를 검출 감도로 하였다 (가교 없음의 MUSTag 를 사용했을 때의 감도를 1 로 하였다). 마찬가지로, 고농도측의 정량 한계는 얻어진 검량선을 사용하고, 각 항원 농도에서의 ΔCt 를 농도로 변환했을 때에, 변환 후의 값의 변동 계수 (C.V.) 가 20 ％ 가 되는 농도로서 산출하였다.

각 사이토카인을 사용했을 때의 저농도측의 검출 한계, 검출 감도 및 고농도측의 정량 한계를 표 1 에 나타낸다.

(6) 가교의 유무에 의한 감도의 비교

가교 반응에 의해, goat polyclonal 제조의 MUSTag (EGF, IFN-γ) 에서 3∼5 배, mouse monoclonal 제조의 MUSTag (IL-12, IL-15) 에서 20∼100 배의 감도 향상을 얻을 수 있었다. 이와 같은 저농도에서의 최고 감도뿐만 아니라 고농도측의 정량 한계도 개선되어 있고, 측정 가능 범위 전체가 넓어져 있었다.

또, 동일한 항원 농도에 대한 ΔCt 값을 비교한 경우의 시그널 강도에 관해서도, goat polyclonal 항체로 최대 2 배, mouse monoclonal 항체로 최대 5 배의 ΔCt 의 증대를 확인할 수 있었다. 이와 같이, 가교형 MUSTag 를 사용함으로써, 측정의 S/N 비가 개선되고, 보다 정밀도 높은 정량이 가능해졌다.

(7) 가교제의 차이에 의한 감도의 비교

DMP 대신에, 가교제로서 DMS (PIERCE, #20700, MW : 273.2, 최종 농도 : 2 mM) 나 BS³ (PIERCE, #21580, MW : 572.43, 최종 농도 : 5 mM 또는 10 mM) 을 사용하고, 항원 IL-15 에 대해 검출 실험을 실시한 결과를 도 4 에 나타낸다. 이 때의 DMS 로 크로스 링크를 실시한 MUSTag 에 관해서는, DMP 로 가교한 것과 동등한 반응성을 나타내었다. BS3 에 의한 가교에 있어서도, 컨트롤과 비교하여 명확한 감도·레인지 향상이 확인되었다.

이와 같이, 아민 반응성 가교제의 종류에 상관없이, 크로스 링크 반응에 의해 MUSTag 의 반응성을 개선할 수 있다.

산업상 이용가능성

본 발명에 의해, MUSTag 의 검출 감도를 향상시킬 수 있었다.

SEQUENCE LISTING <110> Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research Synthera Technologies <120> Antibody complex, method for detecting antibody , and method for making antibody complex <130> PCT1568 <150> JP 2008/171512 <151> 2008-06-30 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 448 <212> PRT <213> Streptococcus sp. <400> 1 Met Glu Lys Glu Lys Lys Val Lys Tyr Phe Leu Arg Lys Ser Ala Phe 1 5 10 15 Gly Leu Ala Ser Val Ser Ala Ala Phe Leu Val Gly Ser Thr Val Phe 20 25 30 Ala Val Asp Ser Pro Ile Glu Asp Thr Pro Ile Ile Arg Asn Gly Gly 35 40 45 Glu Leu Thr Asn Leu Leu Gly Asn Ser Glu Thr Thr Leu Ala Leu Arg 50 55 60 Asn Glu Glu Ser Ala Thr Ala Asp Leu Thr Ala Ala Ala Val Ala Asp 65 70 75 80 Thr Val Ala Ala Ala Ala Ala Glu Asn Ala Gly Ala Ala Ala Trp Glu 85 90 95 Ala Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ala Lys Ala Lys Ala Asp Ala Leu 100 105 110 Lys Glu Phe Asn Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile 115 120 125 Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Ile Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val 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gtgcgggtgc tttggcggtc gcttcaaaac gtaaagaaga 1920 ctaattgtca ttatttttga caaaaagctt 1950 <210> 4 <211> 123 <212> DNA <213> Streptococcus sp. <400> 4 acttacaaat taatccttaa tggtaaaaca ttgaaaggcg aaacaactac tgaagctgtt 60 gatgctgcta ctgcagaaaa agtcttcaaa caatacgcta acgacaacgg tgttgacggt 120 gaa 123 <210> 5 <211> 183 <212> PRT <213> Streptomyces avidinii <400> 5 Met Arg Lys Ile Val Val Ala Ala Ile Ala Val Ser Leu Thr Thr Val 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ala Ser Ala Ser Ala Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala 20 25 30 Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln 35 40 45 Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr 50 55 60 Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu 65 70 75 80 Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala 85 90 95 Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser 100 105 110 Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile 115 120 125 Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp 130 135 140 Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser 145 150 155 160 Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn 165 170 175 Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln 180 <210> 6 <211> 145 <212> PRT <213> Streptomyces avidinii <400> 6 Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile 1 5 10 15 Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala 20 25 30 Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser 35 40 45 Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala 50 55 60 Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly 65 70 75 80 Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu 85 90 95 Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly 100 105 110 His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala 115 120 125 Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln 130 135 140 Gln 145 <210> 7 <211> 638 <212> DNA <213> Streptomyces avidinii <400> 7 ccctccgtcc ccgccgggca acaactaggg agtatttttc gtgtctcaca tgcgcaagat 60 cgtcgttgca gccatcgccg tttccctgac cacggtctcg attacggcca gcgcttcggc 120 agacccctcc aaggactcga aggcccaggt ctcggccgcc gaggccggca tcaccggcac 180 ctggtacaac cagctcggct cgaccttcat cgtgaccgcg ggcgccgacg gcgccctgac 240 cggaacctac gagtcggccg tcggcaacgc cgagagccgc tacgtcctga ccggtcgtta 300 cgacagcgcc ccggccaccg acggcagcgg caccgccctc ggttggacgg tggcctggaa 360 gaataactac cgcaacgccc actccgcgac cacgtggagc ggccagtacg tcggcggcgc 420 cgaggcgagg atcaacaccc agtggctgct gacctccggc accaccgagg ccaacgcctg 480 gaagtccacg ctggtcggcc acgacacctt caccaaggtg aagccgtccg ccgcctccat 540 cgacgcggcg aagaaggccg gcgtcaacaa cggcaacccg ctcgacgccg ttcagcagta 600 gtcgcgtccc ggcaccggcg ggtgccggga cctcggcc 638 <210> 8 <211> 435 <212> DNA <213> Streptomyces avidinii <400> 8 gccggcatca ccggcacctg gtacaaccag ctcggctcga ccttcatcgt gaccgcgggc 60 gccgacggcg ccctgaccgg aacctacgag tcggccgtcg gcaacgccga gagccgctac 120 gtcctgaccg gtcgttacga cagcgccccg gccaccgacg gcagcggcac cgccctcggt 180 tggacggtgg cctggaagaa taactaccgc aacgcccact ccgcgaccac gtggagcggc 240 cagtacgtcg gcggcgccga ggcgaggatc aacacccagt ggctgctgac ctccggcacc 300 accgaggcca acgcctggaa gtccacgctg gtcggccacg acaccttcac caaggtgaag 360 ccgtccgccg cctccatcga cgcggcgaag aaggccggcg tcaacaacgg caacccgctc 420 gacgccgttc agcag 435 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 catatgcact tacaaattaa tccttaa 27 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 gaattcggat ccttcaccgt caacaccgtt g 31 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 gaattcaagc ttgccggcat caccggcacc tg 32 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 ctgcagctgc tgaacggcgt cgagcg 26 <210> 13 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 13 Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Leu Val Pro Ser Ser Asp Pro Leu Val 1 5 10 15 Thr Ala Ala Ser Val Leu Glu Phe Gly Phe Ile Cys Thr Tyr Lys Leu 20 25 30 Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val 35 40 45 Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn 50 55 60 Gly Val Asp Gly Glu Gly Ser Glu Phe Lys Leu Ala Gly Ile Thr Gly 65 70 75 80 Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala 85 90 95 Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu 100 105 110 Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp 115 120 125 Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr 130 135 140 Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly 145 150 155 160 Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr 165 170 175 Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr 180 185 190 Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly 195 200 205 Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln Leu Gln Lys Pro 210 215 220 Asn Ser Ala Asp Ile His His Thr Gly Gly Arg Ser Ser Met His Leu 225 230 235 240 Glu Gly Pro Ile Arg Pro Ile Val Ser Arg Ile Thr Ile His Trp Pro 245 250 255 Ser Phe Tyr Asn Val Val Thr Gly Lys Thr Leu Ala Leu Pro Asn Leu 260 265 270 Ile Ala Leu Gln His Ile Pro Leu Ser Pro Ala Gly Val Ile Ala Lys 275 280 285 Arg Pro Ala Pro Ile Ala Leu Pro Asn Ser Cys Ala Ala 290 295 300 <210> 14 <211> 906 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding the fusin protein <400> 14 atgaccatga ttacgccaag cttggtaccg agctcggatc cactagtaac ggccgccagt 60 gtgctggaat tcggcttcat atgcacttac aaattaatcc ttaatggtaa aacattgaaa 120 ggcgaaacaa ctactgaagc tgttgatgct gctactgcag aaaaagtctt caaacaatac 180 gctaacgaca acggtgttga cggtgaagga tccgaattca agcttgccgg catcaccggc 240 acctggtaca accagctcgg ctcgaccttc atcgtgaccg cgggcgccga cggcgccctg 300 accggaacct acgagtcggc cgtcggcaac gccgagagcc gctacgtcct gaccggtcgt 360 tacgacagcg ccccggccac cgacggcagc ggcaccgccc tcggttggac ggtggcctgg 420 aagaataact accgcaacgc ccactccgcg accacgtgga gcggccagta cgtcggcggc 480 gccgaggcga ggatcaacac ccagtggctg ctgacctccg gcaccaccga ggccaacgcc 540 tggaagtcca cgctggtcgg ccacgacacc ttcaccaagg tgaagccgtc cgccgcctcc 600 atcgacgcgg cgaagaaggc cggcgtcaac aacggcaacc cgctcgacgc cgttcagcag 660 ctgcagaagc cgaattctgc agatatccat cacactggcg gccgctcgag catgcatcta 720 gagggcccaa ttcgccctat agtgagtcgt attacaattc actggccgtc gttttacaac 780 gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt 840 tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca 900 gcctga 906 <210> 15 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo #1 <400> 15 cactgcttac tggcttatcg aaatggaatt ctgcatgcat ctagagggcc ctattctata 60 gcatagtgtc acctaaatgc taggcacctt ctagttgcca gccatctgtt gcacaccaaa 120 cgtggcttgc c 131 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 16 cactgcttac tggcttatcg aaa 23 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 17 ggcaagccac gtttggtg 18 <210> 18 <211> 161 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo #7 <400> 18 cactgcttac tggcttatcg aaatggaatt ctgcatgcat ctagagggcc ctattctata 60 gcatagtgtc acctaaatgc taggcaaccg acaattgcat gaagaactcg cacattgacg 120 tcaataatga cgtatgttcc caccaccaaa cgtggcttgc c 161 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 19 gggcggctgc atctagaggg ccctattcta ta 32 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 20 ggcaagccac gtttggtg 18 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR probe <400> 21 ccttctagtt gccagccatc tgtt 24 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR probe <400> 22 accgacaatt gcatgaagaa ctc 23

Claims

항원을 검출하기 위한 항체 복합체로서,
표지로서의 핵산 사슬, 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 및 상기 핵산 사슬과 상기 항체를 결합하는 어댑터 부위를 함유하고,
상기 어댑터 부위는 프로테인 G, 프로테인 A 또는 프로테인 L 중 어느 이뮤노글로블린 결합 도메인을 함유하고,
상기 어댑터 부위와 상기 항체는 화학적으로 가교되어 있는 것을 특징으로 하는 항체 복합체.
제 1 항에 있어서,
상기 핵산 사슬을 떼어낼 수 있는 절단 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 복합체.
제 2 항에 있어서,
상기 절단 부위는 제한 효소, 광 조사 또는 활성 산소에 의해 절단되는 것을 특징으로 하는 항체 복합체.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 어댑터 부위는 아비딘류의 비오틴 결합 도메인과, 프로테인 G, 프로테인 A 또는 프로테인 L 의 이뮤노글로블린 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 함유하고, 핵산 사슬이 비오틴 결합 핵산인 것을 특징으로 하는 항체 복합체.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체 복합체.
항원을 검출하는 방법으로서,
상기 항원과, 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 복합체를 접촉시키고, 상기 항원과 상기 항체 복합체를 함유하는 항원 항체 복합체를 형성시키는 공정과,
상기 올리고뉴클레오티드 사슬을 검출하는 검출 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 항원 항체 복합체는 제 2 항 또는 제 3 항에 기재된 항체 복합체를 포함하고,
상기 검출 공정은 상기 절단 부위에서 상기 올리고뉴클레오티드 사슬을 떼어내고, 회수하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
상기 검출 공정은
상기 올리고뉴클레오티드 사슬을 증폭시키는 공정과,
증폭된 상기 올리고뉴클레오티드 사슬을 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
항원의 검출용 키트로서,
표지로서의 핵산 사슬, 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 및 상기 핵산 사슬과 상기 항체를 결합하는 어댑터 부위를 함유하는 항체 복합체를 함유하고,
상기 어댑터 부위는 프로테인 G, 프로테인 A 또는 프로테인 L 중 어느 이뮤노글로블린 결합 도메인을 함유하고,
상기 어댑터 부위와 상기 항체는 화학적으로 가교되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
제 9 항에 있어서,
상기 항체 복합체는 상기 핵산 사슬을 떼어낼 수 있는 절단 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 10 항에 있어서,
상기 절단 부위는 제한 효소, 광 조사 또는 활성 산소에 의해 절단되는 것을 특징으로 하는 키트.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 어댑터 부위는 아비딘류의 비오틴 결합 도메인과, 프로테인 G, 프로테인 A 또는 프로테인 L 의 이뮤노글로블린 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 함유하고, 핵산 사슬이 비오틴 결합 핵산인 것을 특징으로 하는 키트.
제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 키트.