KR20110051983A - 보이차의 제조타입과 후발효 기간을 구별하는 방법 및 그 구별용 조성물 - Google Patents

보이차의 제조타입과 후발효 기간을 구별하는 방법 및 그 구별용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 보이차에 함유된 특정 바이오마커용 화합물의 양을 비교하여 보이차의 생차와 숙차를 구별하는 방법 및 그 구별용 조성물 그리고 생차의 후발효기간을 구별하는 방법 및 그 조성물에 관한 발명이다.
보이차, 바이오마커, 생차, 숙차

Description

보이차의 제조타입과 후발효 기간을 구별하는 방법 및 그 구별용 조성물{A Method for determining Manufacturing type and post-fermentation year of Pu-erh tea and a Composition thereof}
본 발명은 보이차에 함유된 특정 바이오마커용 화합물의 양을 비교하여 보이차의 생차와 숙차를 구별하는 방법 및 그 구별용 조성물 그리고 생차의 후발효기간을 구별하는 방법 및 그 조성물에 관한 발명이다.
녹차는 크게 비발효차와 발효차로 나뉘며, 발효차는 발효 정도에 따라서 약발효차, 반발효차(홍차, 황차 등),후발효차(보이차, 흑차 등)로 구분된다.
세계적인 후발효차의 제조기술 보유국가는 중국, 일본이다. 중국의 호기적 발효차는 곰팡이류(Fungi)를 발효 균주로 사용하고, 주요산지는 운남성 서 쌍판납이다. 일본의 호기적 발효차로는 곰팡이류(Fungi)를 발효군주로 사용하고 토야마(富山)가 주요산지인 흑차가 있고, 혐기적 발효차로는 혐기성 락토바실러스(Lactobacillus Anaerobe)를 발효균주로 사용하고 주요산지가 아와(阿波)인 번차가 있다. 또한, 혐,호기적 발효차로는 혐기성 곰팡이류(Fungi Anaerobe)를 발효균주로 사용하고 주요산지가 이시즈치(石鎚)인 흑차가 있다.
중국의 보이현에서 유래된 전통 보이차는 녹차잎을 채취할 때 고의적으로 상처를 주고, 가열하여 볶은 후 적당량의 수분을 가하고 공기 중의 미생물을 이용하여 자연 발효시킨다. 그러나, 보이차 원형 덩어리로부터 잎을 분리해야되는 불편함으로 섭취가 용이하지 않고, 공기 중 낙하균에 의해 발효되기 때문에 곰팡이 냄새 또는 잡균 냄새가 나며, 병원성 미생물이 포함되어 있는 경우가 의심될 수도 있다. 또한, 첫 맛이 떫은 맛이 강하고 쓴 맛도 있어서 기호도가 떨어진다.
한국에서는 지리산, 보령, 사찰에서 간헐적으로 가내수공업 형태로 발효차를 제조하여 음용하고 있으며, 아직 정확한 미생물 균을 확보하여 전문적인 제조를 하는 곳은 없다.
보이차(Pu-erh)는 녹차를 원료로 한 후발효차의 일종으로 Camelia sinensis O. ktze. Var. assamica kitamura 라는 학명으로 불리는 중국 운남성 일대에서 자생하는 대엽종의 교목이다. 공기 중의 미생물에 의한 발효를 이용하여 일정한 제조공정이 끝난 뒤에도 발효가 정지 되지 않고 계속 해서 진행된다는 뜻으로 후발효의 대표적인 가공법인 홍차와 비슷한 부류에 속한다.
이러한 보이차는 제다법에 따라 자연발효차인 생차와 인공 발효차인 숙차로 크게 나뉜다. 생차는 수 백년 전통을 지니는 생차는 널리 음용되기까지 자연 건조되어 완성되는 시간이 오래 걸린다는 특징이 있으며 이러한 단점을 보완하여 보이차의 대중화를 위해 인공적으로 미생물을 최적온도에서 접종하여 발효의 시간을 단축시킨 강제발효차인 숙차가 있다. 그러나 숙차의 품질은 천차만별이고 전문가들 사이에서 제대로된 발효법에 따른 진정한 숙차만이 인정받고 있기에 숙차의 우열판 단 기준은 보이차 감별법에 필수요건이다. 우리나라의 경우, 전적으로 수입에 의존하고 있는 보이차의 국내 소비에 있어서 보이차는 제조공정 및 연도 수에 연연하여 가격이 책정되고 있다고 알 고 있으나, 발효가 오래될수록 비싸고 좋다라는 구매 전략에 대한 뚜렷한 과학적인 증거가 없다. 그러므로 보이차의 품질 판별을 위해 찻잎의 생장정도와 등급에 대한 분류법에 대해 정확한 정보 제공과 보이차의 제조공정에 따른 분류 및 발효 숙성 년도에 따른 식별을 위한 기준을 제시하고자 한다.
보이차는 통상적으로 두 가지 방법을 통하여 제조된다.
생차(Raw Pu-erh tea)는 크고 비산화된 차 잎을 압착하여서 상온에서 수년간 발효시켜서 전통적으로 생산한다.
숙차(Ripened Pu-erh teas)는 압착하기 전에 적당한 조건 하에서 미생물에 의하여 수 개월 동안 "숙성(ripened)"된다(Chen, H.-Y.; Lin-Shiau, S.-Y.; Lin, J.-K. Pu-erh tea; Its manufacturing and health benefits. In Tea and tea products: Chemistry and health - promoting properties . Ho, C.-T.; Lin, J.-K.; Shahidi, F., Eds.; CRC Press: Boca Raton, 2009; pp 9-15).
기존의 연구에서 보이차에서는 Aspergillus niger, Aspergillus gloucu, several species of Penicillium, Rhizopus, Saccharomyces, 및 Bacterium가 발견되었다.
일반적으로 그들의 장기간의 발효 과정을 가지는 보이차가 더 품질이나 향이 좋은 것으로 알려졌다. 따라서 감정가 및 투자자는 오래된 보이차에 대하여 케이크 당 수천 달러 이상의 높은 가격을 지불하려 한다.
그러나 믿을만하게 오래된 보이차는 발견하고 동정하기 어렵기때문에 많은 가짜 모조 상품들이 시장에 존재한다. 따라서 보이차의 연령을 예측하고, 제조 과정의 타입을 동정하는 정확하고 시스템적인 방법은 소비자를 보호할 뿐만 아니라 품질보증의 관점에서 생산자들에게도 필요하다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 보이차 생산에 사용되는 제조 타입을 구별하기 위한 바이오마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 보이차 생산에 사용되는 제조 타입을 구별하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 보이차에 함유된 스트리시티(stricitinin),트리갈로일글루코스(trigalloylglucose),카페오일퀴니카시드(caffeoylquinicacid), 에피갈로카테킨(epigallocatechin),에피카테킨-3-갈레이트,에피갈로카테킨-3-갈레이트, 및 갈로일퀴니카시드(galloylquinicacid)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물의 양을 비교하여 보이차의 생차와 숙차를 구별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기의 화합물은 생차가 숙차보다 더 함량이 높은 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 보이차에 함유된 갈레이트 화합물의 양을 비교하여 보이차의 생차와 숙차를 구별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기의 화합물은 숙차가 생차보다 더 함량이 높은 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 스트리시티(stricitinin),트리갈로일글루코스(trigalloylglucose),카페오일퀴니카시드(caffeoylquinicacid), 에피갈로카테킨(epigallocatechin),에피카테킨-3-갈레이트,에피갈로카테킨-3-갈레이트, 갈로일퀴니카시드(galloylquinicacid) 및 갈레이트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 보이차의 생차와 숙차 구별용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 보이차의 생차에 함유된 스트리시티(stricitinin),카페오일라우이닉 산(caffeoylauinic acid), 에피갈로카테킨(epigallocatechin),에피카테킨-3-갈레이트, 및 에피갈로카테킨-3-갈레이트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물의 양의 감소를 측정하여서 보이차 생차의 후발효기간을 분석하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 스트리시티(stricitinin),카페오일라우이닉 산(caffeoylauinic acid), 에피갈로카테킨(epigallocatechin),에피카테킨-3-갈레이트, 및 에피갈로카테킨-3-갈레이트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 보이차 생차의 후발효기간 분석용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 보이차의 생차와 숙차를 구별하는 방법 또는 보이차 생차의 후발효기간을 분석하는 방법은 메스 스펙트로스코피 상에서 나타나는 이온화되는 피크의 강도를 바탕으로 상대적인 변화를 측정하는 방법이다.
따라서 메스 피크의　상대적 레인지 차이 및 이를 바탕으로 PCA　도면 상에 위치하게 되는　분포도를 기준으로 생차와 숙차를 구분한다.　
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명의 목적은 보이차 생산에 사용되는 제조 타입을 구별하기 위한 바이오마커를 동정하는 것이다.
본 발명자들은 액체 크로마토그래피 - 질량분석기(LC-MS) 및 다변량해석(multivariate analysis)을 사용하여 후-발효(post-fermentation) 동안 보이차의 화학적 조성이 어떻게 변화하는지를 분석하였다.
이들 분석은 후-발효 동안에 보이차의 조성 변화를 정확하게 알 수 있게 하여 준다. 보이차의 항산화 활성 및 그것의 항산화 화합물의 조성 및 후발효 연도 사이의 상관관계를 결정하였다.
그 접근 방법으로 액체크로마토그래피 질량분석기를 통해 대사체학의 접근 방법으로 다양한 제조공정에 따른 보이차의 대사산물을 이해하고, 제조공정과 숙성단계를 결정하는 바이오마커를 결정하므로써 복합적이고 애매한 보이차의 제조과정 및 숙성 정도의 차이를 결정할 수 있게 된다.
본 발명에서 사용된 (+)-카테킨, (-)-에피카테킨-3-갈레이트, NaOH, AlCl3 , sodium carbonate, gallic acid, Folin Ciocalteu's phenol reagent, potassium persulfate, 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH),2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), FeCl3 H2O, C2H3NaO2H2O, sulfanilamide, N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride, lipopolysaccharide (E. coli, Serotype 0.55:B5), phosphoric acid, pyrrolidine dithiocarbamate, dimethyl sulfoxide (DMSO), 및 포름산은 시그마 케미컬(St. Louis, MO)로부터 구입하였다. LC/MS에 사용된 아세토나이트릴 및 물은 Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)로부터 최적 등급으로 구입하였다.
이하 본 발명을 설명한다.
보이차의 제조공정과 숙성 년도에 따른 식별을 위한 탐색을 위하여, 본 발명자는 국내에 수입되어 유통되고 있는 중국 운남에서 재배된 30가지 보이차(18가지의 생차와 12가지의 숙차)를 구매(표 1)하여 60% 아세톤으로 70도씨에서 2시간 동안 환류 추출하여 감압여과 한 후, 그 여액을 0.2uM PTFE 필터하였다. 상기 아세톤 가용부는 액체 크로마토그래피/질량분석기 (LC-ESI MS (Liquid chromatograph electrospray ionization mass spectrometry, Varian 500MS, Varian, Inc., Palo Alto, CA)) 분석을 통해 보이차의 대사산물들을 총체적으로 분자량과 구조적인 정보 등을 통한 프로파일링하였다. 액체크로마토그래피를 실시하기 위해 0.1% 포믹산을 포함한 물(A)과 0.1% 포믹산을 포함한 아세토니트릴(B)을 이동상 용매로 하여 0.2 mL/min 의 유속으로 C18 레진으로 충진된 100* 2.0 mm 길이와 직경 컬럼으로 물질 분리를 수행하였으며,
Figure 112009069389312-PAT00001
표 1은 중국 운남성에서 구입한 녹차의 샘플 리스트이다.
액체크로마토그래피를 수행 한 보이차 시료 용리액은 질량분석기로 주입되는데, 대기압하의 이온화방법으로 보이차의 다양한 분자량과 극성도 그리고 열적으로 불안정한 성분에 대해 효율적으로 이온화 시킬 수 있는 작은 에너지 충격에 의한 이온화 방법을 수행하였다. 시료 분무의 이온화는 가열영역 온도 350 ℃에서 시료 건조를 위한 질소기체를 30 psi 압력과 분무 50 psi 압력으로 수행 되었고, 70 V의 이온화 에너지를 이용하여 음이온모드로 질량범위 50-1000 m/ z 의 신호를 검출하였다.
이렇게 얻어진 각 보이차 시료 성분 질량분석스펙트럼의 데이터 내에 존재하는 기기적인 오류 신호와 각 시료 신호들의 값을 표준화하기 위해 XCMS 라는 소프트웨어를 통해 데이터 가공과정을 실시하였다. 가공 된 데이터 시트는 통계학적으로 유의성 있는 해석을 위해 주성분분석 (principal component analysis) 및 부분최소제곱회귀 (partial least squares regression) 분석법을 이용하여 보이차의 제조공정과 숙성년도 식별확인을 하였다.
상기 분석과정에서 얻어진 보이차 30가지 시료 추출물 분획들은 이들이 가지고 있는 대사산물들의 이화학적 물질 성상 및 함량에 따라 숙차와 생차로 크게 두 그룹으로 확연하게 나누어짐을 확인하였다.(도 1) 주성분 분석 로딩 플랏의 결과, 생차를 구분 짓는 바이오마커로 작용하는 대표적인 주요 변수들은 stricitinin (m/ z633),trigalloylglucose (m/ z635),caffeoylquinicacid(m/ z353), epigallocatechin (m/ z305),epicatechin-3-gallate (m/ z441),epigallocatechin-3-gallate (m/z 457),andgalloylquinicacid(m/z343) 들로 숙차에 비해 함량이 많은 것으로 확인하였다. 반면, 숙차의 경우 gallic acid 가 생차에 비해 높은 함량을 가짐으로써 주요 변수로 나타났다.(도 2)
보이차의 우열을 크게 따지는 숙성년도별 판별법에 대해 살펴 본 결과, 생차는 년도별로 구분이 지어지며 발효 4년 이하와 5년 이상의 생차로 나뉘어 졌다. 반면, 자연 발효가 아닌 인공적인 공정으로 쪄내어서 만드는 숙차의 경우는 년도별 식별이 뚜렷하지 못하였다.(도 3)
뿐만 아니라, 생차와 숙차의 발효 시간에 따른 대사산물 변화를 통해 현재 시판되고 있는 숙성년도 정보와 본 실험 결과에서 관찰된 년도를 비교해 본 결과, 생차는 2.1년, 숙차는 2.9년 정도 차이를 나타내었다.(도 4 및 5)
결론적으로 본 발명은 제조 방법 및 후발효 기간의 관점에서 여러 보이차의 화학적 조성 차이를 상세하게 나타낸다. PCA 분석의 결과로, 두 다른 타입의 보이차가 PC1에 의하여 명확하게 분리되었다. 높은 수준의 페놀과 플라보노이드를 가지는 생차는 숙차보다 더 놓은 생물활성을 나타내었다. LC-MS 및 다변수 분석(multivariate analyses)을 사용하여, 본 발명자들은 후발효 동안에 생차에서 나타나는 조성 변화의 넓은 특징을 얻었다. epigallocatechin, epicatechin-3-gallate, strictinin, caffeoylauinic acid, 및 epigallocatechin-3-gallate와 같은 화합물들은 후발효 기간이 증가할 수록 감소하 였다. 따라서 이들 화합물들은 자연적으로 오랜기간 동안에 발효된 보이차가 낮은 항산화 활성을 나타내는 이유를 설명할 수 있다. 후 발효 예측 모델은 보이차의 대사산물에 기초한 PLS 분석을 통하여 설계된다. PLS 회귀분석의 결과로, 한국에서 여러 상업적으로 얻을 수 있는 생차는 후발효기간 의존적인 형태로 특정한 조성물 변화의 패턴을 나타내었다. 또한 본 발명자들은 대사체학(metabolomics)이 조성물 패턴 분석에 유용하고 보이차의 생물활성 및 그들의 조성 변화 사이의 상관관계를 조명하는데 유용할 수 있다는 것을 나타내었다.
찻잎의 우열을 크게 따지는 생차의 경우 상기의 분석 방법과 생차 특이적 바이오 마커는 제조공정 검증과 숙성년도 품질관리를 위해 상당히 중요한 판단 근거가 된다.
이하 본 발명을 비한정적인 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 샘플의 제조
여러 후발효 연도를 가진 보이차는 대한민국의 시장으로부터 구입하였다(표 1).
모든 샘플은 중국 운남성에서 재배된 것이었다. 그 샘플들을 중탕 냄비(water bath)에서 70℃에서 2시간 동안 60% 수성 아세톤으로 3 회 추출하였다. 그 혼합물들을 LC/MS 분석을 위하여 0.2 ㎛ PTFE 필터로 여과하였다.
실시예 2: 액체 크로마토그래피- 포토다이오드 어레이- 엑렉트로스프레이 이온화-질량분석기( LC - PDA - ESI / MS ) 조건:
본 발명자들은 212-LC Binary Solvent Delivery System, a MetaThermTM HPLC 컬럼 히터, a ProstarTM 410 AutoSampler, a ProstarTM 335 포토다이오드 어레이 디텍터, 및 500-이온 트랩 질량 스펙트로미터(Varian Technologies (Palo Alto, CA)를 사용하였다. 그 시스템은 MS 워크스테이션 소프트웨터(버젼 6.9.2, Varian, Inc., Palo Alto, CA)를 사용하여 동작하였다. LC-MS 조건은 기존의 논문(Nishitani, E.; Sagesaka, Y. M. J. Food Compost. Anal. 2004, 17, 675-685;Lin, L. Z.; Chen, P.; Harnly, J. M. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 8130-8140;Wang, D.; Lu, J.; Miao, A.; Xie, Z.; Yang, D. J. Food Compost. Anal. 2008, 21, 361-369)에 기반하여서 세팅하였다. 크로마토그래피 분석은 45℃ 컬럼 오븐 온도에서 ChromSep 가트 컬럼 PurSuit XRs 3-C18 (Varian Inc., Lake Forest, CA)을 가지는 ChromSep HPLC 컬럼 SS 100x 2.0　mm i.d., 3　㎛ 입자 크기 (Varian Inc., Lake Forest, CA)에서 수행되었다. 분리에는 0.2　mL/분의 유속을 사용하였다. 이동상은 A (0.1% formic acid in water) 및 B (0.1% formic acid in acetonitrile)의 조합으로 구성되었다. 구배는 15분에 15에서 30% B (v/v)로, 30분에 100% B로 리니어하게 증가되고, 35분까지 100% B로 유지한 후, 35.01 분에 15%로 리니어하게 감소시키고 다음 분석 샘플의 주입 때까지 40 분 동안 15%를 유지하였다. 그 UV 스펙트럼은 피크 강도의 실시간 모니터링을 위하여 280 nm에 세팅하였다. 포토 다이오드 분석은 차 구성성분 동정을 위하여 200-600　nm으로부터 흡 광도를 연속적으로 기록하는데 사용하였다. 질량 스텍트럼은 m/z　50-1000 범위에 대하여 70V에서 네가티브 이온화(NI)에서 전기스프레이 이온화를 사용하여 동시에 얻었다. 양 NI모두에 대하여 각각 30　psi 및 350℃의 건조 가스 압력과 온도, nebulizer 압력(50　psi), 및 70V의 캐피럴리 전압을 사용하였다.
실시예 3: Trolox Equivalent Antioxidant Capacity ( TEAC )
TEAC 분석은 Re 등(Re, R.; Pellegrini, N.; Proteggente, A.; Pannala, A.; Yang, M.; Rice-Evans, C. Free Radic. Biol. Med. 1999, 26, 1231-1237)의 방법에 기재된 것과 같이 수행하였다. 이 논문에 따라서, 7　mM의 ABTS 암모늄을 Potassium phosphate 버퍼(pH　7.4)에 녹이고 2.45　mM의 potassium persulfate를 처리하였다. 다음 그 혼합물을 진한 청색으로 변할 때까지 상온에서 12-16시간 동안 방치하였다. 다음에 그 용액을 734　nm에서 0.7±0.02에 흡광도가 도달할 때까지 Potassium phosphate 버퍼로 희석하였다. 그것을 BioTek EL　808 마이크로플레이트 리더(Bio-tek Instruments Inc., Power Wave XS, Winooski, VT)를 사용하여 측정하였다. 그 후에 190　㎕의 용액을 10　㎕의 샘플 또는 블랭크(60% aqueous acetone)로 혼합하였다. 그 흡광도를 6분 후에 상온에서 기록하였다. 결과를 mg의 보이차 당 mg의 Trolox 당량 농도로 나타내었다. 표준 용액의 농도는 0.25-4　mM 범위이었다. 실험은 3회 실시하였다.
실시예 4: DPPH 자유기 소거 분석에 의한 항산화 활성 결정
DPPH 분석은 Dietz 등의 논문(Dietz, B. M.; Kang, Y. H.; Liu, G.; Eggler, A. L.; Yao, P.; Chadwick, L. R.; Pauli, G. F.; Farnsworth, N. R.; Mesecar, A. D.; van Breemen, R. B.; Bolton, J. L. Chem. Res. Toxicol. 2005, 18, 1296-1305)을 약간 개량하여서 수행하였다. 200μM의 DPPH 에탄올 용액의 테스트 샘플 또는 블랭크(60% aqueous acetone) (10　㎕) 및 190　㎕를 함유하는 반응 혼합물을 96웰 플레이트에서 30분 동안 상온에서 배양하였다. DPPH 자유 래디컬의 흡광도를 마이크로플레이트 리더를 사용하여서 515　nm에서 측정하였다. 결과를 mg의 보이차 당 mg의 Trolox 당량 농도로 나타내었다. 표준 용액의 농도는 0.156-2.5　mM 범위이었다. 실험은 3회 실시하였다.
실시예 5: Ferric Reducing / Antioxidant Power ( FRAP ) 분석
각 표준 및 샘플의 항산화 능력은 Benzie 및 Strain(Benzie, I. F.; Strain, J. J. Anal. Biochem. 1996, 239, 70-76)를 약간 개량하여서 수행하였다. 간략하게 설명하면 신선하고 37℃에서 가온한 300　㎕의 FRAP 시약을 10　㎕의 테스트 샘플 용액 또는 블랭크(60% aqueous acetone)와 혼합하였다. 그 흡광도를 마이크로플레이트 리더를 사용하여 6분 후에 593　nm에서 측정하였다. FRAP 시약은 2.5　mL의 증류수에 10　mM/L TPTZ 용액(40　mM/L HCl 내), 2.5　mL의 20　mM/L FeCl3 ?H2O(증류수 속), 및 25　mL의 0.3　M/L 초산 버퍼(pH　3.6)를 포함한다. 결과를 mg의 보이차 당 mg의 Trolox 당량 농도로 나타내었다. 표준 용액의 농도는 0.25-2　mM 범위이었다. 실험은 3회 실시하였다.
실시예 6: 총 페놀 및 플라보노이드의 결정
총 페놀 양은 Singleton 등(Singleton, V. L.; Orthofer, R.; Lamuela-Ravent, R. M.; Lester, P. In Methods in Enzymology. Academic Press: 1999; Vol. Volume 299, pp 152-178)의 방법을 사용하여 결정하였다. 그 분석 조건들은 다음과 같다: 10　㎕의 샘플을 96웰 내의 0.2　N Folin-Ciocalteu's 페놀 시약 (160　㎕)에 첨가하였다. 3분 후, 30　㎕의 포화 sodium carbonate 용액을 그 혼합물에 첨가한 후 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 그 혼합물의 결과 흡광도를 마이크로플레이트 리더를 사용하여 750　nm에서 측정하였다. 총 페놀 함량은 gallic acid로 표준 곡선에 기초하여 계산되었다. 그 표준 용액 농도는 12.5-400　㎍/mL 범위이었다. 결과를 mg의 보이차 당 mg의 gallic acid equivalent (GAE)로 나타내었다. 실험은 3회 실시하였다.
총 플라보노이드 함량은 Yoo 등(Yoo, K. M.; Lee, C. H.; Lee, H.; Moon, B.; Lee, C. Y. Food Chem. 2008, 106, 929-936)에 기재된 방법을 약간 변형하여서 분석하였다. 20㎕의 샘플 또는 표준 용액의 (+)-카테킨을 96웰 플레이트에 각 웰에 첨가하였다. 그 표준 용액 농도는 100-800　㎍/mL 범위이었다. 증류수(40　㎕) 및 6　㎕의 5% (w/v) 질산 나트륨을 각 웰에 첨가하였다. 5분 후, 12　㎕의 10% (w/v) AlCl3를 첨가하였다. 6분 후, 40　㎕의 1　M NaOH를 그 혼합물에 첨가하고 42　㎕의 증류수를 첨가하였다. 흡광도를 마이크로플레이트 리더를 사용하여서 515　nm에서 측정하였고 그 플라보노이드 함량을 mg의 보이차 당 mg의 (+)-카테킨 당량으로 나타내었다. 실험은 3회 실시하였다.
실시예 7: 데이터 가공
데이터 전가공은 MS 워크스테이션 6.9 소프트웨어(Palo Alto, CA)를 사용하 여서 수행하였다. LC-MS 스펙트럼은 Vx Capture (version 2.1, Laporte, MN)를 사용하여서 NetCDF 포맷으로 전환하였다. 전환 후, LC-MS 스펙트럼을 XCMS에 의하여 가공하였다. R 언어에 대한 XCMS 파라미터를 아래(http://masspec.scripps.edu/xcms/documentation.php)로 XCMS's 디폴트 세팅과 같은 단순한 명령에 의하여 수행되었다. 그 결과 데이터는 엑셀(Microsoft, Redmond, WA)로 보내진 후 통계 분석을 다른 통계 프로그램을 사용하여 수행하였다.
실시예 8: 통계 및 다변수 ( Multivariate ) 분석
통계 분석은 SIMCA-P+ (version 11.5, Umetrics, Umea 스웨덴)을 사용하여 모든 연속 변수에 대하여 수행되었다. 다중 클래스에 대한 단변량(Univariate) 통계는 STATISTICA (version 7.0, StatSoft Inc., Tulsa, OK)를 사용한 브레이크다운 및 원-웨이 ANOVA에 의하여 수행되었다. 다변량 통계는 본 발명에서 대사산물의 다양화에 대한 일반적인 오버뷰를 얻기 위하여 비감독된 PCA(PCA)에 의하여 수행되었다. 또한 감독된 PLS(partial least square) 통계법도 수행되었고 그것은 할당된 변수 클래스(X 변수; LC-MS 피크 및 Y 변수; 후 발효 기간)에 대한 정보가 필요하다. 모든 변수는 PCA 및 PLS 분석 전에 컬럼-와이즈 현태에서 평균-센터링을 가지는 팔레토 스케일링이었다.
상기 실시예의 결과는 다음과 같다.
두 타입의 보이차의 항산화 활성 비교
두 제조방법을 사용하여 생산된 보이차의 항산화 활성을 비교하기 위하여 TEAC, DPPH 및 FARP 분석을 수행하였다. 생차의 항산화 활성이 세 다른 항산화 분석에서 숙차에 비하여 현저하게 우수하였다. 숙차는 1170 (DPPH), 810 (FRAP) 및 1090 (TEAC) mg의 Trolox 당량(보이차 그램 당) 항산화 활성을 보인 반면에, 생차(raw Pu-erh tea)는 1770 (DPPH), 2780 (FRAP) 및 2020 (TEAC) mg의 Trolox 당량(보이차 그램 당) 항산화 활성을 나타내었다(표 2). 요약하면 생차는 숙차에 비하여 더 높은 항산화 활성을 나타내었다.
Figure 112009069389312-PAT00002
총 페놀과 총 플라보노이드 양의 비교
생차는 숙차에 비하여 너 많은 양의 페놀 및 플라보노이드 화합물을 가지는 것이 발견되었다. 도 1b에서 알 수 있는 바와 같이, 생차의 전체 페놀 양(182　mg의 gallic acid 당량/보이차 그램)은 숙차(110　mg의 gallic acid 당량/보이차 그램)보다 1.65배 높았다. 생차의 총 플라보노이드 양(98　mg의 gallic acid 당량/보이차 그램)은 숙차(49　mg의 gallic acid 당량/보이차 그램)의 것보다 두 배 더 높았다(표 2).
보이차의 후-발효 기간( post - fermentation year ) 및 총 화합물 조성 및 생물활성 사이의 상관관계
보이차의 후-발효 기간(post-fermentation year) 및 총 화합물 조성 및 생물활성 사이의 상관관계를 조사하기 위하여, 상관 계수를 STATISTICA를 사용하여 계산하였다. 생차의 생물활성은 그들의 후발효기간과 현저하게 상관관계가 있는 반면에 숙차 및 그들의 후발효기간 사이에는 큰 상관관계는 없었다. 더욱 상세하게 설명하면 생차의 후발효기간은 FRAP (r　= -0.60, p　<　0.05) 및 총 폴리페놀 양(r　=　-0.65, p　<　0.05)과 음의 상관관계(negatively correlated)이었다. 생차의 총 플라보노이드 양은 FRAP (r　=　0.75, p　<　0.05) 및 TEAC (r　=　0.71, p　<　0.05)와 양의 상관관계인 반면 숙차의 총 페놀양은 DPPH (r　=　0.87, p　<　0.05) 및 TEAC (r　=　0.91, p　<　0.05)와 양의 상관관계이었다. 생차의 총 페놀 양 및 후 발효기간에 대한 및 FRAP 분석의 민감도를 고려하면 생차의 분석에 FRAP 분석이 유용할 것으로 생각된다.
보이차의 다른 제조방법에 따른 분석
생차 및 숙차 사이에 현저하게 다른 바이오마커를 찾기 위하여, 다변수(multivariate) 통계 분석을 수행하였다. 비감독 PCA(principal components analysis)를 사용한 다변수 통계는 대사 프로화일을 분리하는 주된 요소는 제조 타입이지 후발효 기간이 아닌 것을 나타낸다. PCA 스코어 플롯은 PC1에 의한 377 주된 피크에 기반한(R2X=75.6%) 숙차와 생차의 명확한 분리를 나타내었다. 생차에서 관찰되는 비교적 큰 변이는 다른 후발효기간의 결과이다. 반면에 그것의 원 물질은 다양한 숙차의 조성은 신속한 발효 동안에 서로 유사해지는 것 같다. 이것은 비록 이 효과는 수 년이 걸리지만 생차의 후발효는 그들의 조성에 현저한 효과를 가지지만 숙차의 조성 패턴은 그들의 후발효기간에 크게 영향을 받지 않는다는 것을 나타낸다.
그 PCA 로딩 플롯은 각 피크의 LC- MS 피크 강도로부터 평균-센터링(mean-centering)를 가지는 파레토(pareto) 스케일링을 사용하여 얻었다. 일부 현저한 피크가 PCA 로딩 플롯에서 관찰되었다. 피크 동정은 신뢰할 수 있는 화합물의 UV 스펙트럼 데이터, 인-하우스 데이터베이스(Lee, J. S.; Kim, D. H.; Liu, K.-H.; Oh, T. K.; Lee, C. H. Rapid Commun . Mass Spectrom . 2005, 19, 3539-3548) 및 코-크로마토그래피, MS/MS 스펙트럼 데이터로 수행되었다. 현저하게 다른 피크들이 상기 방법을 사용하여 동정되었다. 일부 피크는 다이머 및 그들의 당량체를 가지는 동위원소 형태로 검출되었다[m/z 883 (441), 884 (441), 916 (457), 915 (457), 634 (633)]. 도 2에서 나타내는 바와 같이, 생차는 stricitinin (m/z 633), trigalloylglucose (m/z 635), caffeoylquinic acid (m/z 353), epigallocatechin (m/z 305), epicatechin-3-gallate (m/z 441), epigallocatechin-3-gallate (m/z 457), 및 galloylquinic acid (m/z 343)가 숙차에 비하여 현저하게 더 높은 수준 함유하였다(t-test, p < 0.001). 그러나 gallic acid는 생차에서 현저하게 낮았다(t-test, p < 0.001). 전체적으로 숙차는 낮은 수준의 카테킨과 높은 수준의 gallic acid을 가진다. 따라서 숙차의 DPPH 및 TEAC와 같은 항산화 활성은 총 플라보노이드 함량이라기 보다는 총 페놀 함량과 높은 상관관계를 가진다.
여러 보이차의 90 샘플로부터 377 피크들이 XCMS에 의하여 추출되었다. 그들 중에서 343 피크들이 생차 및 숙차 사이에 현저하게 다른 질량 강도를 나타내었다 (p < 0.001).
본 발명에서는 항산화, NO 저해 및 세포 보호 활성에서 생차가 숙차보다 더 높은 생물활성을 가진다는 것을 보였다
생차의 여러 후발효기간의 PLS 분석
생차의 화합물 조성과 후발효기간 사이의 상관관계를 결정하기 위하여, SIMCA-P를 사용한 PLS분석을 수행하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 오래된(Aged) 생차(5년 이상) 및 얼마 안된(young) 생차(4　년 이하)는 그것의 PCA 스코어 플롯 뿐 아니라 PLS 컴포넌트　1에 의하여 구분된다. PLS 분석은 차에 대한 품질예상 모델을 만드는 알고리즘으로 사용될 수 있다. 도 4에 나타낸 바와 같이, PLS 회귀(regression)로부터 창조된 후 발효 기간 예측 모델은 2.08 년의 워크세트(RMSEE)에서 관찰을 위한 피트(fit)의 루트 평균 스퀘어 에러를 나타낸다. 이 분석을 사용하여, 본 발명자들은 생차의 조성이 그들의 후발효기간에 따라 점차적으로 변한다는 것을 발견하였다(R2=78.5, Q2=73.8). 이 후발효기간 예측 모델은 생차의 후발효기간을 예측하는데 사용될 수 있다.
발효와 특히 상관관계가 있는 일부 화합물을 동정하기 위하여, 상관계수를 STATISTICA를 사용하여 계산하였다. 현저한 화합물들은 상기 기재된 것과 동일한 방법으로 동정되었다. quinic acid (r = -0.688) (도시 안함), epigallocatechin-3-gallate (r = -0.567), caffeoylquinic acid (r = -0.565), epigallocatechin (r = -0.505), strictinin (r = -0.495), epicatechin-3-gallate (r = -0.435), 및 gallic acid (r = 0.546)와 같은 화합물들이 후 발효기간과 큰 상관관계가 있고(p　<　0.05), 생차의 연령을 결정하는 바이오마커를 사용될 수 있다(도 4). 상기 언급한 바와 같이, 생차의 TPC 및 FRAP는 또한 그들의 후발효기간과 큰 상관관계가 있다. 이들 바이오마커들은 왜 오래된 생차는 총 페놀양이 더 낮고 항산화 활성이 더 낮은지를 설명할 수 있다.
숙차의 여러 후발효 기간의 PLS 분석
도 5에서 나타낸 바와 같이, 오래된 숙차와 얼마 안된 숙차는 PCA 스코어 플롯 뿐 아니라 PLS 요소 1 또는 2에 의하여 명확하게 분리되지 아니한다. 앞에서 언급한 바와 같이, 숙차의 조성들은 빠른 발효에 의하여 현저하게 변한다. 이것은 숙차의 2차 대사산물은 그들의 후발효기간에 심하게 영향을 받지 않는다는 것을 나타낸다. 생차와 다르게 숙차는 높은 결정의 계수(R2=60.9, Q2=40.1)를 나타내지 아니한다(도 5).
도 1(A)는 보이차의 PCA 스코어 플롯을 나타낸 그림(■, 생차이고; 붉은색은 숙차), (B)는 평균 센터링을 가지는 파레토 스케일링을 사용하여 얻어진 PCA 로딩 플롯.
도 2 (A)는 생차 및 숙차 사이에 현저하게 다른 화합물의 휘스커 플롯과 박스. (B)는 후발효와 관련하여 중요한 화합물들을 나타낸 그림.
도 3은 다른 후-발효 기간을 가지는 보이차로부터 유래한 PCA 스코어 플롯. a는 생차, b는 숙차.
도 4 (a)는 생차의 PLS 스코어 플롯(붉은색 원은 5년 이상; ■, 4년 이하), (b) 생차의 후발효 기간의 예측을 위한 PLS 회귀 모델.
도 5 (a)는 숙차의 PLS 스코어 플롯(붉은색 원은 5년 이상; ■, 4년 이하), (b) 숙차의 후발효 기간의 예측을 위한 PLS 회귀 모델.

Claims (7)

  1. 보이차에 함유된 스트리시티(stricitinin),트리갈로일글루코스(trigalloylglucose),카페오일퀴니카시드(caffeoylquinicacid), 에피갈로카테킨(epigallocatechin),에피카테킨-3-갈레이트,에피갈로카테킨-3-갈레이트, 및 갈로일퀴니카시드(galloylquinicacid)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물의 양을 비교하여 보이차의 생차와 숙차를 구별하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기의 화합물은 생차가 숙차보다 더 함량이 높은 것을 특징으로 하는 보이차의 생차와 숙차를 구별하는 방법.
  3. 보이차에 함유된 갈레이트 화합물의 양을 비교하여 보이차의 생차와 숙차를 구별하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기의 화합물은 숙차가 생차보다 더 함량이 높은 것을 특징으로 하는 보이차의 생차와 숙차를 구별하는 방법.
  5. 스트리시티(stricitinin),트리갈로일글루코스(trigalloylglucose),카페오일퀴니카시드(caffeoylquinicacid), 에피갈로카테킨(epigallocatechin),에피카테킨-3-갈레이트,에피갈로카테킨-3-갈레이트, 갈로일퀴니카시드(galloylquinicacid) 및 갈레이트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 보이차의 생차와 숙차 구별용 바이오마커 조성물.
  6. 보이차의 생차에 함유된 스트리시티(stricitinin),카페오일라우이닉 산(caffeoylauinic acid), 에피갈로카테킨(epigallocatechin),에피카테킨-3-갈레이트, 및 에피갈로카테킨-3-갈레이트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물의 양의 감소를 측정하여서 보이차 생차의 후발효기간을 분석하는 방법.
  7. 스트리시티(stricitinin),카페오일라우이닉 산(caffeoylauinic acid), 에피갈로카테킨(epigallocatechin),에피카테킨-3-갈레이트, 및 에피갈로카테킨-3-갈레이트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 보이차 생차의 후발효기간 분석용 마커 조성물.
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