KR20110048700A

KR20110048700A - Anticancer composition comprising docetaxel and thiacremonone by inhibiting nf-κb

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Publication number: KR20110048700A
Application number: KR1020090105385A
Authority: KR
Inventors: 홍진태; 반정옥; 오주훈; 황인국; 정헌상
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2009-11-03
Filing date: 2009-11-03
Publication date: 2011-05-12

Abstract

PURPOSE: A combination anticancer composition of docetacel and thiacremonone is provided to suppress proliferation of colon cancer cell line, SW 620 and HCT 116. CONSTITUTION: An anticancer composition contains docetaxel and thiacremonone which suppresses colon cancer cell line, SW 620 and HCT 116. The effective concentration of docetacxel and thacremonone is 5nM and 50ug/ml. The cancer cell line is liver cancer, gastric cancer, lung cancer, or prostate cancer cell line.

Description

Anticancer composition comprising docetaxel and chiacremonone by inhibiting NF-κB through inhibition of nuclear transcription factor-κＢ activity

본 발명은 핵 전사인자-κB의 활성 저해를 통한 도세탁셀 및 치아크레모논 병용 항암제 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 핵 전사인자-κB(NF-κB)의 활성 저해를 통해 대장암 세포주 SW 620 및 HCT 116의 증식을 억제하는 도세탁셀과 치아크레모논을 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a docetaxel and chicremonone combination anticancer composition through the inhibition of nuclear transcription factor-κB activity. More specifically, the present invention relates to an anticancer composition containing docetaxel and chiacremonone as active ingredients that inhibit proliferation of colorectal cancer cell lines SW 620 and HCT 116 through the inhibition of nuclear transcription factor-κB (NF-κB).

핵 전사인자-κB(NF-κB)는 악성 전환 및 종양 촉진에 관여하는 유전자 발현을 통해 종양 성장의 촉진, 혈관형성, 전이 및 화학요법제 저항성을 야기한다. NF-κB의 구성적 활성화는 많은 종양에서 규명되었다. 또한 NF-κB는 결장암 세포에서 구성적으로 활성화되어 있다. 산발성 선종 폴립 내 기질 대식세포의 세포핵뿐만 아 니라 결장암 세포주 및 인간 종양 표본은 증가된 NF-κB 활성을 나타내었다. 또한 내인성 또는 구성적으로 활성화된 NF-κB는 암세포 내 약물 저항성 유도에 중요함도 보고된 바 있다. 따라서 NF-κB의 활성을 저해할 수 있는 약제는 다양한 암 치료를 위한 화학요법제와 병용될 수 있는 것으로 간주되고 있다.Nuclear transcription factor-κB (NF-κB) causes tumor growth, angiogenesis, metastasis and chemotherapeutic resistance through gene expression involved in malignant conversion and tumor promotion. Constitutive activation of NF-κB has been identified in many tumors. NF-κB is also constitutively activated in colon cancer cells. Colon cancer cell lines and human tumor specimens as well as cell nuclei of stromal macrophages in sporadic adenomatous polyps showed increased NF-κB activity. It has also been reported that endogenous or constitutively activated NF-κB is important for inducing drug resistance in cancer cells. Therefore, drugs that can inhibit the activity of NF-κB is considered to be combined with chemotherapeutic agents for the treatment of various cancers.

유럽 주목(Taxus baccata) 나무의 침엽에서 생산되는 반합성 탁소이드(taxoid)인 도세탁셀은 시중에서 가장 중요한 새롭고 활성적인 화학요법제 중의 하나이다. 도세탁셀은 결장암을 포함한 불감수성 인간 고형 종양의 치료에 잠재적인 활성을 지닌다. 도세탁셀이 다양한 종양 세포 내에서 잠재적인 세포 사멸 활성을 지니나 이러한 약제의 높은 용량의 사용은 또 다른 수준의 독성 반응을 유도하는 것으로 나타났다. 그러나 낮거나 중간 정도의 용량의 도세탁셀은 환자에서 유의적인 항종양 활성을 나타내지 않는다. 따라서 암에 대한 단일-치료법으로서 도세탁셀의 사용은 배제되고 있다.Docetaxel, a semisynthetic taxoid produced from the conifers of the European Taxus baccata tree, is one of the most important new and active chemotherapeutic agents on the market. Docetaxel has potential activity in the treatment of insensitive human solid tumors, including colon cancer. Although docetaxel has potential apoptosis activity in various tumor cells, the use of high doses of these agents has been shown to induce another level of toxic response. However, low or medium doses of docetaxel do not show significant antitumor activity in the patient. Thus the use of docetaxel as a mono-therapy for cancer is ruled out.

이에 대한 대안으로 암에 대해 최적의 결과를 달성하기 위해 하나 이상의 항암제와 도세탁셀을 함께 사용하는 병용 치료 방법이 개발되고 있다. 췌장 암세포주인 NOR-P1에 대한 단백질-결합 폴리사카라이드(PSK)와 도세탁셀의 병용 치료의 효과는 PSK가 종양 세포를 낮은 용량의 도세탁셀에 의해 유도된 세포독성에 더욱 민감하게 하고 유효한 아폽토시스의 수행을 유발함을 나타내었다. As an alternative, a combination treatment method is being developed that combines docetaxel with one or more anticancer agents to achieve optimal results for cancer. The effect of the combination treatment of protein-binding polysaccharide (PSK) and docetaxel on the pancreatic cancer cell line NOR-P1 is that PSK makes tumor cells more sensitive to the cytotoxicity induced by low doses of docetaxel and results in effective apoptosis. Induced.

더욱이 증가된 아폽토시스는 단백질-결합 폴리사카라이드(PSK)에 의한 NF-κB 활성 억제 후 NF-κB에 의해 조절되는 아폽토시스 단백질-1 세포 저해제(c-IAP1)의 불활성화 및 카스파제-3 활성의 증가에 의한 것이다. IκB 인산화의 알려진 약리학적 저해제인 BAY 11-7085는 시험관 내 및 생체 내 난소암 모델 모두에서 IκB 인산화 및 NF-κB 활성의 기초 및 일시적 유도를 저해하고, 파클리탁셀의 세포독성 효능을 증가시킨다. 비독성 식이 보충제와 화학요법제의 또다른 병용 세포독성 효과도 알려져 있다. 전립선암에 대해 효과적인 실리비닌(Silibinin)은 진행성 인간 전립선 암종 DU145 세포에서 독소루비신의 치료 효능을 상승시킬 수 있다. 시스플라틴과 커큐민(curcumin)의 병용은 NF-κB 활성의 저하를 통해 상승적인 항종양 활성을 유발하였다.Furthermore, increased apoptosis may be due to inactivation of caspase-3 activity and inactivation of apoptosis protein-1 cell inhibitor (c-IAP1) regulated by NF-κB following inhibition of NF-κB activity by protein-binding polysaccharide (PSK). It is due to the increase. BAY 11-7085, a known pharmacological inhibitor of IκB phosphorylation, inhibits the basal and transient induction of IκB phosphorylation and NF-κB activity in both in vitro and in vivo ovarian cancer models and increases the cytotoxic efficacy of paclitaxel. Another combined cytotoxic effect of nontoxic dietary supplements and chemotherapeutic agents is also known. Silibinin effective against prostate cancer can increase the therapeutic efficacy of doxorubicin in advanced human prostate carcinoma DU145 cells. The combination of cisplatin and curcumin induced synergistic anti-tumor activity through a decrease in NF-κB activity.

마늘은 여러 발암인자의 활성화를 억제시키는 것으로 나타난 황 및 셀레노화합물(seleno compound)을 포함한 많은 약리학적 활성 물질을 포함한다. 또한 이들 화합물은 암세포 성장을 저해하고 또는 세포 사멸을 유도하는 것으로 나타났다. 디아릴 디설파이드, S-아릴머캅토시스테인 및 아조엔(ajoene)을 포함한 마늘에서 분리된 황 화합물은 발암물질의 대사에 관련된 효소의 활성을 증가시키고 항산화 활성을 지니고 시험관 내 및 생체 내 지질 과산화 및 간 독성에 대한 보호 활성을 지니는 것으로 알려져 있다. 또한 최근 여러 연구는 이들 황 화합물이 배양된 폐 암세포뿐만 아니라 유방암, 간암 및 림프성 백혈병을 포함한 여러 인간 암세포의 성장을 저해할 수 있음을 나타내었다.Garlic contains many pharmacologically active substances, including sulfur and seleno compounds, which have been shown to inhibit the activation of several carcinogenic factors. These compounds have also been shown to inhibit cancer cell growth or induce cell death. Sulfur compounds isolated from garlic, including diaryl disulfide, S-arylmercaptocysteine and ajoene, increase the activity of enzymes involved in the metabolism of carcinogens and have antioxidant activity and in vitro and in vivo lipid peroxidation and liver It is known to have protective activity against toxicity. Recent studies have also shown that these sulfur compounds can inhibit the growth of cultured lung cancer cells as well as several human cancer cells including breast cancer, liver cancer and lymphocytic leukemia.

한편 여러 연구 그룹은 결장암 증식에 대한 예방 효과에 대한 황 화합물의 중요성을 나타내었다. 본 발명자들은 종전 마늘로부터 신규한 황 화합물을 분리하였고 이를 치아크레모논으로 확인하였고 후속 연구는 이들이 100∼150 ㎍/mL (100∼150 ㎍/mL) 농도 범위 내에서 NF-κB의 활성화 억제 및 타겟 유전자 발현을 통해 결장암 세포 성장 상에 저해 효과를 발휘함을 나타냄을 개시한 바 있다. Several research groups, on the other hand, have shown the importance of sulfur compounds for their protective effect on colon cancer proliferation. We isolated new sulfur compounds from previous garlic and identified them as chicremonone and subsequent studies showed that they inhibited and targeted the activation of NF-κB within the 100-150 μg / mL (100-150 μg / mL) concentration range. Gene expression has been shown to exhibit an inhibitory effect on colon cancer cell growth.

본 발명에 본 발명자들은 통상의 화학요법제가 치아크레모논과 동시 투여될 때 NF-κB 활성 상의 치아크레모논의 저해 효과가 이들 약제의 암세포 사멸 활성을 증가시키는지 여부를 조사하였다.In the present invention, the present inventors investigated whether the inhibitory effect of chiacremonone on NF-κB activity increases cancer cell killing activity of these agents when conventional chemotherapeutic agents are coadministered with chiacremonone.

이에 따라 본 발명자들은 치아크레모논과 그 밖의 화학요법제의 병용에 따른 대장암에 대한 항암 효과를 측정하고 또한 핵 전사인자 NF-κB의 활성화 저해를 통한 치아크레모논과 그 밖의 화학요법제의 병용 효과를 확인함으로써 핵 전사인자-κB(NF-κB)의 활성 저해를 통해 대장암 세포주 SW 620 및 HCT 116의 증식을 억제하는 도세탁셀과 치아크레모논을 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물을 개발하게 된 것이다. Accordingly, the present inventors measured the anticancer effect of colorectal cancer due to the combination of chiacremonone and other chemotherapeutic agents, and also the combination of chiacremonone and other chemotherapeutic agents through the inhibition of activation of the nuclear transcription factor NF-κB. By confirming the effects, the anticancer composition containing docetaxel and chiacremonone as an active ingredient inhibits the proliferation of colon cancer cell lines SW 620 and HCT 116 through the inhibition of nuclear transcription factor-κB (NF-κB) activity. .

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 치아크레모논과 그 밖의 화학요법제의 병용에 따른 대장암에 대한 항암 효과를 측정코자 한 것이다. 또한 핵 전사인자 NF-κB의 활성화 저해를 통한 치아크레모논과 그 밖의 화학요법제의 병용 효과를 확인함으로써 핵 전사인자-κB(NF-κB)의 활성 저해를 통해 대장암 세포주 SW 620 및 HCT 116의 증식을 억제하는 도세탁셀과 치아크레모논을 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물을 개발코자 한 것이다. The problem to be solved by the present invention is to measure the anti-cancer effect on colorectal cancer in combination with the chiacremonone and other chemotherapeutic agents. In addition, by confirming the combination effect of chiacremonone and other chemotherapeutic agents through the inhibition of activation of the nuclear transcription factor NF-κB, colon cancer cell lines SW 620 and HCT 116 through inhibition of the activity of nuclear transcription factor-κB (NF-κB). It is intended to develop an anticancer composition containing docetaxel and chiacremonone as active ingredients that inhibit the proliferation.

본 발명의 목적은 핵 전사인자-κB(NF-κB)의 활성 저해를 통해 대장암 세포주 SW 620 및 HCT 116의 증식을 억제하는 도세탁셀과 치아크레모논을 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide an anticancer composition comprising docetaxel and chiacremonone as active ingredients that inhibit proliferation of colorectal cancer cell lines SW 620 and HCT 116 through the inhibition of nuclear transcription factor-κB (NF-κB). .

이때 상기 항암제 조성물의 시험관 내 암세포주 증식 억제 유효농도는 대장암 세포주 2.5 X 10⁵ 세포수/cm²에 대해 도세탁셀 5 nM, 치아크레모논 50 ㎍/ml임을 특징으로 한다.In this case, the in vitro cancer cell line growth inhibition effective concentration of the anticancer agent composition is characterized in that the docetaxel 5 nM, chiacremonone 50 ㎍ / ml for the colorectal cancer cell line 2.5 X 10 ⁵ cells / cm ² .

또한 상기 항암제 조성물은 아폽토시스 유발 단백질인 Bax, 카스파제-3, 카스파제-9 단백질의 발현을 증진시키고, 아폽토시스 저해 단백질인 Bcl-2, X 염색체IAP (xIAP) 및 cIAP-1 단백질 발현을 억제시킴으로써 암세포주의 아폽토시스를 증진시킴을 특징으로 한다.In addition, the anticancer composition enhances the expression of apoptosis-inducing proteins Bax, caspase-3 and caspase-9, and inhibits the expression of apoptosis inhibitory proteins Bcl-2, X chromosome IAP (xIAP) and cIAP-1 protein. Enhances apoptosis of cancer cell lines.

한편 본 발명의 또 다른 목적은 핵 전사인자-κB(NF-κB)의 활성 저해를 통해 암 세포주 증식을 억제하는 도세탁셀과 치아크레모논을 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물에 있어서, 상기 암 세포주는 간암 세포주, 위암 세포주, 폐암 세포주 또는 전립선암 세포주 임을 특징으로 하는 항암제 조성물을 제공하는 것이다. Meanwhile, another object of the present invention is an anticancer composition comprising docetaxel and chiacremonone as active ingredients that inhibit cancer cell line proliferation through the inhibition of nuclear transcription factor-κB (NF-κB) activity, wherein the cancer cell line is liver cancer It is to provide an anticancer composition characterized in that the cell line, gastric cancer cell line, lung cancer cell line or prostate cancer cell line.

본 발명의 효과는 치아크레모논과 그 밖의 화학요법제의 병용에 따른 대장암에 대한 항암 효과를 확인한 것이다. 또한 핵 전사인자 NF-κB의 활성화 저해를 통한 치아크레모논과 그 밖의 화학요법제의 병용 효과를 확인함으로써 핵 전사인자-κB(NF-κB)의 활성 저해를 통해 대장암 세포주 SW 620 및 HCT 116의 증식을 억제하는 도세탁셀과 치아크레모논을 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물을 제공하는 것이다. The effect of the present invention is to confirm the anticancer effect on colorectal cancer by the combination of chiacremonone and other chemotherapeutic agents. In addition, by confirming the combination effect of chiacremonone and other chemotherapeutic agents through the inhibition of activation of the nuclear transcription factor NF-κB, colon cancer cell lines SW 620 and HCT 116 through inhibition of the activity of nuclear transcription factor-κB (NF-κB). It is to provide an anticancer composition containing docetaxel and chiacremonone as an active ingredient which inhibits the proliferation of the drug.

화학요법은 일반적으로 약물 저항성을 극복하고 약물 독성을 저하시키기 위해 다수의 약제를 사용한다. 핵 전사인자-κB(NF-κB)의 활성화는 암세포 내 약물 저항성과 관련된다. 종전 본 발명자들은 마늘에서 분리된 신규한 황 화합물인 치아크레모논이 결장암 세포에서 약 100 ㎍/mL의 IC₅₀ 수치로 NF-κB 및 암세포 성장을 저해함을 보고한 바 있다. Chemotherapy generally uses a number of drugs to overcome drug resistance and reduce drug toxicity. Activation of nuclear transcription factor-κB (NF-κB) is associated with drug resistance in cancer cells. Previously, the present inventors have reported that chiacremonone, a novel sulfur compound isolated from garlic, inhibits NF-κB and cancer cell growth at an IC ₅₀ value of about 100 μg / mL in colon cancer cells.

본 발명에서 본 발명자들은 치아크레모논이 핵 전사인자 NF-κB의 활성화 억제를 통해 화학요법제에 대한 암세포의 감수성을 증가시킬 수 있는지 여부를 조사하였다. 결장암 세포는 치아크레모논(50 ㎍/mL, IC₅₀ 절반 용량)과 낮은 용량의 각각의 화학요법제(IC₅₀ 절반 용량)로 24시간 동안 동시 처리되었다. In the present invention, the present inventors investigated whether chiacremonone can increase the sensitivity of cancer cells to chemotherapeutic agents through the inhibition of activation of the nuclear transcription factor NF-κB. Colon cancer cells were co-treated for 24 hours with chiacremonone (50 μg / mL, IC ₅₀ half dose) and a low dose of each chemotherapeutic agent (half IC ₅₀ dose).

NF-κB 활성은 치아크레모논과 도세탁셀 병용 투여된 세포 내에서 완전하게 제거된 반면 치아크레모논 단독 투여는 NF-κB 활성을 크게 저하시키지 않았다. 또한 이러한 약물 병용 투여 효과는 결장암 및 다른 암세포 내 또다른 항암제에서도 발견되었다. 세포 성장의 저해와 NF-κB 활성의 밀접한 상관관계에서 병용 치료는 NF-κB 타겟 유전자도 조절하였다. NF-κB activity was completely eliminated in the cells administered in combination with chiacremonone and docetaxel, whereas administration of chicremonone alone did not significantly reduce NF-κB activity. In addition, such drug co-administration effects have been found in colon cancer and other anticancer agents in other cancer cells. In a close correlation between inhibition of cell growth and NF-κB activity, the combination treatment also regulated NF-κB target genes.

음용수 내 4주간 치아크레모논을 투여함으로서 마우스의 치아크레모논 경구 치료는 NF-κB 활성 및 NF-κB 타겟 유전자의 조절과 동반된 도세탁셀(1 mg/kg, i.p. 4회)-유도된 종양 성장을 유의적으로 감소시켰다. 이들 결과는 치아크레모논과 인간 암의 치료를 위한 일반적으로 사용되는 화학요법제의 병용 투여 효과를 예측가능케 한다. Oral treatment with chiacremonone in mice by administering chiacremonone for 4 weeks in drinking water resulted in docetaxel (1 mg / kg, ip 4) -induced tumor growth accompanied by NF-κB activity and regulation of NF-κB target genes. Significantly reduced. These results make the predictable effect of the combined administration of chiacremonone and commonly used chemotherapeutic agents for the treatment of human cancer.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.The present invention is described in more detail below.

SW 620 및 HCT 116 인간 결장암 세포주 내 NF-κB 활성화 상의 치아크레모논과 도세탁셀의 병용 효과Combination Effects of Chiacremonone and Docetaxel on NF-κB Activation in SW 620 and HCT 116 Human Colon Cancer Cell Lines

본 발명은 NF-κB의 활성화가 암세포 생존 및 약물 저항성에 중요한 역할을 하기 때문에 치아크레모논(도 1A)이 NF-κB의 활성 억제에 의해 결장암 세포 성장을 저해하는지 여부를 측정코자 하였다. 본 발명자들의 종전 연구는 치아크레모논(30∼150 ㎍/mL)이 결장암 세포인 SW 620 내에서 105 ㎍/mL 및 HCT 116 내에서 130 ㎍/mL의 IC₅₀ 수치로 암세포 성장 및 NF-κB 활성을 용량 의존적으로 저해함을 나타낸 바 있다. 또한 본 발명자들은 도세탁셀(1∼50 nmol/L)이 결장암 세포 내에서 약 10 nmol/L의 IC₅₀ 수치로 세포 성장 및 NF-κB 활성을 용량 의존적으로 저해 함을 관찰하였다. 따라서 본 발명자들은 이들 약제의 병용 효과 조사시 절반 용량의 IC₅₀ 수치(50 ㎍/mL 치아크레모논 및 5 nmol/mL 도세탁셀)를 사용하였다. Since the activation of NF-κB plays an important role in cancer cell survival and drug resistance, we tried to determine whether or not chiacremonone (FIG. 1A) inhibits colon cancer cell growth by inhibiting NF-κB activity. Previous studies by the present inventors have shown that cancer cell growth and NF-κB activity are at an IC ₅₀ value of 105 μg / mL in SW 620 and 30 μg / mL in HCT 116 where chiacremonone (30-150 μg / mL) is colon cancer cells. Has been shown to dose dependently inhibit. We also observed that docetaxel (1-50 nmol / L) dose-dependently inhibited cell growth and NF-κB activity at IC ₅₀ values of about 10 nmol / L in colon cancer cells. Therefore, we used half dose of IC ₅₀ values (50 μg / mL chiacremonone and 5 nmol / mL docetaxel) when investigating the co-effects of these agents.

본 발명은 먼저 NF-κB 활성 상의 치아크레모논과 도세탁셀의 병용 효과를 시험하였다. 각각의 화합물 단독의 용량은 NF-κB 활성을 변경시키지 않았으나 암세포 성장을 다소 저해하였다. 그러나 치아크레모논과 도세탁셀의 병용은 2개의 결장암 세포주 내에서 NF-κB의 전사 활성화를 상승적으로 유의적인 저해를 유발하였다(도 2A). NF-κB의 DNA 결합 활성의 구성적 활성화는 결장암 세포에서 관찰되었고, 도세탁셀(5 nmol/L) 및 치아크레모논 단독(50 ㎍/mL)의 처리는 SW 620 및 HCT 116 결장암 세포에서 NF-κB의 활성화된 DNA 결합 활성을 변화시키지 않았다. The present invention first tested the combined effect of chiacremonone and docetaxel on NF-κB activity. Doses of each compound alone did not alter NF-κB activity but somewhat inhibited cancer cell growth. However, the combination of chiacremonone and docetaxel induced synergistically significant inhibition of transcriptional activation of NF-κB in two colon cancer cell lines (FIG. 2A). Constitutive activation of the DNA binding activity of NF-κB was observed in colon cancer cells, and treatment of docetaxel (5 nmol / L) and chiacremonone alone (50 μg / mL) was observed in NF-κB in SW 620 and HCT 116 colon cancer cells. Did not change the activated DNA binding activity.

그러나 NF-κB의 전사 활성의 상승적 저해와 일치하게 50 ㎍/mL 치아크레모논 및 5 nmol/L 도세탁셀의 병용은 NF-κB의 DNA 결합 활성 상의 상승적 저해 효과를 유발하였다(도 2B). 치아크레모논과 또다른 화학요법제와의 병용 효과를 시험하기 위해 본 발명은 치아크레모논과 5-플루오로우라실(100 nmol/L) 또는 옥살리플라틴(oxaliplatin)(10 nmol/L)으로 SW 620 및 HCT 116 결장암 세포를 처리하고 이들 병용도 NF-κB를 상승적으로 저해함을 확인하였다. NF-κB 활성 상의 또다른 잘-처방된 화학요법제뿐만 아니라 도세탁셀과 치아크레모논의 병용 효과는 간 HepG2, 전립선 PC-3, 위 NKM-45 및 폐 NCI-H460 암세포를 포함한 또다른 암세포에서도 관찰 되었다 . Consistent with the synergistic inhibition of NF-κB transcriptional activity, however, the combination of 50 μg / mL chiacremonone and 5 nmol / L docetaxel induced a synergistic inhibitory effect on the DNA binding activity of NF-κB (FIG. 2B). To test the combined effect of chiacremonone with another chemotherapeutic agent, the present invention provides a method for treating SW 620 with chiacremonone and 5-fluorouracil (100 nmol / L) or oxaliplatin (10 nmol / L). HCT 116 colon cancer cells were treated and found to synergistically inhibit NF-κB. Combination effects of docetaxel with chiacremonone, as well as another well-prescribed chemotherapeutic agent on NF-κB activity, have also been observed in other cancer cells, including liver HepG2, prostate PC-3, gastric NKM-45, and lung NCI-H460 cancer cells It became.

SW 620 및 HCT 116 결장암 세포주 내 세포 성장 상의 치아크레모논과 도세탁셀의 병용 효과Combination Effects of Chiacremonone and Docetaxel on Cell Growth in SW 620 and HCT 116 Colon Cancer Cell Lines

결장암 세포가 치아크레모논과 도세탁셀의 병용 요법에 의해 발휘되는 세포독성 효과에 더욱 민감한지 여부를 측정하기 위한 후속 실험이 착수되었다. 24시간 동안 50 ㎍/mL 치아크레모논 및 5 nmol/L 도세탁셀 단독으로 SW 620 및 HCT 116 결장암 세포의 처리는 세포 성장의 5% 내지 30% 저해를 나타내었다(도 2C). NF-κB의 상승적 저해와 동시에 두 약제의 동반 첨가는 SW 620 및 HCT 116 결장암 세포에서 세포 성장 상의 강한 상승적 저해 효과(70∼80% 저해)를 유발하였다(도 2C). Subsequent experiments were undertaken to determine whether colon cancer cells are more sensitive to the cytotoxic effects exerted by the combination therapy of chiacremonone and docetaxel. Treatment of SW 620 and HCT 116 colon cancer cells with 50 μg / mL chiacremonone and 5 nmol / L docetaxel alone for 24 hours showed 5% to 30% inhibition of cell growth (FIG. 2C). Concomitant addition of the two agents simultaneously with synergistic inhibition of NF-κB induced a strong synergistic inhibitory effect (70-80% inhibition) on cell growth in SW 620 and HCT 116 colon cancer cells (FIG. 2C).

암세포 증식 저해 상의 또다른 화학요법제인 5-플루오로우라실(100 nmol/L) 및 옥살리플라틴(10 nmol/L)과 치아크레모논의 병용 효과도 결장암 세포에서 관찰되었다. 더욱이 암세포 증식 저해 상의 다른 화학요법제와 치아크레모논의 이들 병용 효과는 간(HepG2), 위(MKN-45), 폐(NCI-H460) 및 전립선(PC-3) 암세포를 포함한 다른 암세포에서도 측정되었다. 이들 결과는 치아크레모논과 낮은 용량의 화학요법제의 병용이 약제 단독 처리와 비교시 암세포 성장의 유의적으로 큰 저해를 유도하고 이들 병용 효과는 암세포 형태 및 화학요법제 특이적이지 않음을 나타낸다.The combined effect of 5-fluorouracil (100 nmol / L) and oxaliplatin (10 nmol / L) with chiacremonone, another chemotherapeutic agent on cancer cell proliferation inhibition, was also observed in colon cancer cells. Moreover, these combinations of other chemotherapeutic agents and chicremonone on inhibition of cancer cell proliferation are also measured in other cancer cells, including liver (HepG2), stomach (MKN-45), lung (NCI-H460) and prostate (PC-3) cancer cells. It became. These results indicate that the combination of chiacremonone with low doses of chemotherapeutic agents induces significantly greater inhibition of cancer cell growth compared to treatment with drugs alone and these combination effects are not cancer cell morphology and chemotherapy specific.

SW 620 및 HCT 116 인간 결장암 세포주 내 아폽토시스성 세포 사멸 상의 치아크레모논과 도세탁셀의 병용 효과Combined Effects of Chiacremonone and Docetaxel on Apoptotic Cell Death in SW 620 and HCT 116 Human Colon Cancer Cell Lines

세포 사멸은 세포 성장 저해의 또다른 요인이다. 따라서 본 발명은 형광 현미경에 의한 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 및 TdT-매개 dUTP 틈 및 표지(TUNEL) 염색 분석을 이용하여 결장암 세포 내 아폽토시스성 세포 사멸을 조사하였다. 세포 성장 저해 조사와 일치하게 치아크레모논과 도세탁셀 병용 처리는 단일-약제 처리와 비교시 결장암 세포의 아폽토시스성 세포수(DAPI-염색된 TUNEL 양성 세포)를 유의적으로 증가시켰다(도 3). 이들 결과는 치아크레모논과 도세탁셀의 병용 처리에 의한 암세포 성장의 저해 효능은 암세포의 아폽토시스의 유도 결과임을 나타낸다.Cell death is another factor of cell growth inhibition. Therefore, the present invention investigated apoptotic cell death in colon cancer cells using 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and TdT-mediated dUTP gap and label (TUNEL) staining assay by fluorescence microscopy. . Consistent with cell growth inhibition studies, the combination of chicremonone and docetaxel significantly increased the apoptotic cell number (DAPI-stained TUNEL positive cells) of colon cancer cells as compared to single-drug treatment (FIG. 3). These results show that the inhibitory effect of cancer cell growth by the combination treatment of chiacremonone and docetaxel is a result of induction of apoptosis of cancer cells.

SW 620 및 HCT 116 인간 결장암 세포주 내 아폽토시스 조절 단백질 발현 상의 치아크레모논과 도세탁셀의 병용 효과Combination Effects of Chiacremonone and Docetaxel on Apoptosis Regulatory Protein Expression in SW 620 and HCT 116 Human Colon Cancer Cell Lines

암세포 내 NF-κB 활성화는 아폽토시스 조절 단백질뿐만 아니라 아폽토시스 저항성 및 항-아폽토시스 단백질의 조절과 상호 관련된다. 병용 처리에 의한 아폽토시스 유도와 그의 조절 단백질 발현 사이의 상관관계를 규명하기 위해 아폽토시스-관련 단백질의 발현이 조사되었다. 세포는 치아크레모논(50 ㎍/mL)과 도세탁셀(5 nmol/L)의 병용으로 처리되었고, 전체-세포 추출물은 웨스턴 블럿팅 수행되었 다. 본 발명의 자료는 병용 처리는 세포 생존을 지원하는 모든 시험된 마커 단백질의 발현 수치를 실질적으로 저해함을 나타내었다. 단일 처리와 비교시 Bcl-2, XIAP 및 cIAP-1의 발현 수치의 유의적인 감소는 병용 처리시 관찰된 반면 아폽토시스 유발 단백질인 Bax 및 카스파제-3(분열된 카스파제-3 포함)과 카스파제-9(분열된 카스파제-9 포함)의 활성 형태의 발현 수치 증가는 병용 처리 후 측정되었다(도 4).NF-κB activation in cancer cells correlates with the regulation of apoptosis resistance proteins as well as apoptosis resistance proteins and anti-apoptotic proteins. The expression of apoptosis-related proteins was investigated to characterize the correlation between apoptosis induction by the combination treatment and its regulatory protein expression. Cells were treated with a combination of chiacremonone (50 μg / mL) and docetaxel (5 nmol / L), and whole-cell extracts were subjected to western blotting. The data of the present invention showed that the combination treatment substantially inhibited the expression levels of all tested marker proteins that support cell survival. Significant decreases in the expression levels of Bcl-2, XIAP and cIAP-1 compared to a single treatment were observed during the combination treatment, whereas the apoptosis-inducing proteins Bax and caspase-3 (including cleaved caspase-3) and caspase The increase in the expression level of the active form of -9 (including cleaved caspase-9) was measured after the combination treatment (FIG. 4).

이종 이식 모델 내 종양 성장 상의 치아크레모논과 도세탁셀의 생체 내 병용 효과In vivo combination effect of chiacremonone and docetaxel on tumor growth in xenograft models

치아크레모논과 도세탁셀의 병용 처리 또는 이들 약제 단독 처리 후 결장암 이종이식-포함 누드 마우스 내 종양 성장이 조사되었다. 치아크레모논에 대한 최적 용량을 측정하기 위해 SW 620 결장암-포함 누드 마우스(100-300 ㎣)는 4주간 음용수 내에 5, 10 및 30 mg/kg의 다른 용량 범위로 치아크레모논을 경구 투여함으로서 처리되었다. 5, 10 및 30 mg/kg의 치아크레모논으로 처리된 마우스는 대조군과 비교시 종양에 대한 다른 저해 반응(32∼50% 종양 부피 저해)을 나타내었다. 따라서 본 발명자들은 도세탁셀과의 병용 처리를 위한 최적 조건으로 1 mg/kg의 용량(1 mg/kg, i.p., 28일간 주 1회)을 선택하였고, 이는 5, 10 및 30 mg/kg에 의해 32% 내지 50% 종양 성장 저해를 나타내었다. SW 620 이종이식 조사시 100 내지 300 ㎣의 범위의 종양을 지닌 마우스 내에 치아크레모논(1 mg/kg)은 4주간 주 1회 도세탁셀(1 mg/kg) i.p. 주입 10일 전 경구 투여되었다(도 5A). Tumor growth in colon cancer xenograft-containing nude mice after combination treatment of chiacremonone with docetaxel or treatment with these agents alone was investigated. To determine the optimal dose for chiacremonone, SW 620 colon cancer-containing nude mice (100-300 mm 3) were treated by oral administration of chiacremonone at different dose ranges of 5, 10 and 30 mg / kg in drinking water for 4 weeks. It became. Mice treated with 5, 10 and 30 mg / kg of chiacremonone showed another inhibitory response to the tumor (32-50% tumor volume inhibition) compared to the control. We therefore selected a dose of 1 mg / kg (1 mg / kg, ip, once weekly for 28 days) as the optimal condition for concomitant treatment with docetaxel, which was 32 by 5, 10 and 30 mg / kg. % To 50% tumor growth inhibition. In mice with tumors ranging from 100 to 300 mm 3 on SW 620 xenograft irradiation, chicremonone (1 mg / kg) was dosed once weekly for 4 weeks of docetaxel (1 mg / kg) i.p. It was administered orally 10 days prior to infusion (FIG. 5A).

마우스는 주 2회 체중 측정되었다. 대조군, 치아크레모논-도세탁셀 병용 치료 또는 치아크레모논 및 도세탁셀 단일-처리 마우스(n=10) 사이의 체중 변화는 실험 동안 현저하게 상이하지 않았다. 종양 부피 및 마우스 체중 분석은 치아크레모논과 도세탁셀 모두 개별적으로 약간의 항종양 활성을 유발함을 나타내었다(도 5B-D). 병용 처리는 종양 성장의 우수한 억제를 발휘하였다. 대조군(1.0±0.36 g), 치아크레모논(0.88±0.40 g), 도세탁셀(0.62±0.37 g) 단독 그룹과 비교시 병용 그룹은 종양 중량(0.39±0.14 g)의 현저한 퇴보를 나타내었다(도 5B). 또한 대조군(1.81±0.08 ㎤), 치아크레모논(1.71±0.19 ㎤) 및 도세탁셀(1.50±0.13 ㎤) 단독 그룹과 비교시 병용 그룹은 종양 부피(1.22±0.55 ㎤)의 현저한 퇴보를 나타내었다(도 5C). Mice were weighed twice a week. Body weight changes between the control, chiacremonone-docetaxel combination treatment or chiacremonone and docetaxel single-treated mice (n = 10) were not significantly different during the experiment. Tumor volume and mouse weight analysis showed that both chicremonone and docetaxel individually caused some antitumor activity (FIGS. 5B-D). The combination treatment exerted good inhibition of tumor growth. Compared with the control group (1.0 ± 0.36 g), chiacremonone (0.88 ± 0.40 g) and docetaxel (0.62 ± 0.37 g) alone, the combined group showed a significant degeneration of tumor weight (0.39 ± 0.14 g) (FIG. 5B). ). In addition, the combination group showed a significant degeneration of the tumor volume (1.22 ± 0.55 cm 3) compared to the control group (1.81 ± 0.08 cm 3), chiacremonone (1.71 ± 0.19 cm 3) and docetaxel (1.50 ± 0.13 cm 3) alone (FIG. 5C).

동일한 처리의 또다른 실험군에서 본 발명은 치아크레모논과 도세탁셀의 병용 처리가 단일 처리와 비교시 마우스의 생존율을 유의적으로 증가시킴을 나타내었다(도 5D). H&E 염색에 의한 종양 절편의 면역조직화학적 분석 및 Ki-67(세포 증식 마커)에 대한 증식 항원 염색은 단일 처리와 비교시 종양 세포 성장 상의 치아크레모논과 도세탁셀의 병용에 의한 더 큰 저해 효과를 나타내었다(도 6A). 또한 병용 치료는 아폽토시스성 세포 사멸뿐만 아니라 종양 조직 내 분열 카스파제-3 반응성 세포수 내 큰 변화가 동반되었다(도 6C). In another experimental group of the same treatment, the present invention showed that the combination treatment of chiacremonone and docetaxel significantly increased the survival rate of mice compared to a single treatment (FIG. 5D). Immunohistochemical analysis of tumor sections by H & E staining and proliferative antigen staining for Ki-67 (cell proliferation marker) show greater inhibitory effects by the combination of chiacremonone and docetaxel on tumor cell growth compared to single treatment. (FIG. 6A). Combination treatment was also accompanied by apoptosis cell death as well as large changes in the number of dividing caspase-3 reactive cells in tumor tissue (FIG. 6C).

생체 내 NF-κB의 DNA-결합 활성 및 아폽토시스 유도 유전자 또는 억제 유전자의 발현 상의 치아크레모논과 도세탁셀의 병용 효과Combination Effect of Chiacremonone and Docetaxel on DNA-binding Activity and Expression of Apoptosis Inducing or Inhibitory Genes of NF-κB in Vivo

또한 본 발명은 생체 내 모델을 이용하여 NF-κB 활성 상의 치아크레모논과 도세탁셀의 병용 효과를 시험하였다. 시험관 내에서 보고된 저해 효과와 유사하게 치아크레모논과 도세탁셀의 병용은 종양 조직 내 NF-κB의 DNA 결합 활성을 유의적으로 저해하였다(도 7A). 또한 웨스턴 블럿팅은 단일 처리와 비교시 치아크레모논과 도세탁셀의 병용 처리 후 세포핵 내 p65 및 p50의 감소된 발현을 나타내었다(도 7A). 또한 본 발명은 종양 조직 내의 NF-κB 서브유니트 p65 및 p50의 면역조직화학적 염색 패턴의 특성을 나타내었다. 치아크레모논과 도세탁셀 병용 처리된 종양 조직 내에서 p65 및 p50의 세포핵 염색 강도 감소 경향이 존재하였다(도 7B). In addition, the present invention tested the combined effect of chiacremonone and docetaxel on NF-κB activity using an in vivo model. Similar to the inhibitory effects reported in vitro, the combination of chicremonone and docetaxel significantly inhibited the DNA binding activity of NF-κB in tumor tissues (FIG. 7A). Western blotting also showed reduced expression of p65 and p50 in the cell nucleus after the combination of chiacremonone and docetaxel compared to single treatment (FIG. 7A). The present invention also showed the characterization of immunohistochemical staining patterns of NF-κB subunits p65 and p50 in tumor tissues. There was a tendency to decrease the nuclear staining intensity of p65 and p50 in the tumor tissues treated with chiacremonone and docetaxel in combination (FIG. 7B).

이들 데이터는 시험관 내 및 생체 내 NF-κB의 DNA 결합 활성의 치아크레모논과 도세탁셀의 병용의 저해 효과와 일치하고, NF-κB의 저해가 종양 세포를 도세탁셀에 대해 감수성을 지님을 나타낸다. 웨스턴 블럿팅 분석에 의해 측정시 Bax 및 분열된 카스파제-3 수치의 증가가 존재하였으나 결장암 조직 내 Bcl-2, xIAP 및 cIAP의 감소된 발현이 병용 처리 후 감소되었다. These data are consistent with the inhibitory effect of the combination of chiacremonone and docetaxel on the DNA binding activity of NF-κB in vitro and in vivo, indicating that inhibition of NF-κB is sensitive to docetaxel for tumor cells. There was an increase in Bax and cleaved caspase-3 levels as measured by Western blotting analysis but reduced expression of Bcl-2, xIAP and cIAP in colon cancer tissues decreased after combination treatment.

본 발명의 중요한 특징은 치아크레모논이 결장암 세포 내 NF-κB의 활성화 억제를 통한 성장 저해 및 아폽토시스 유도에 의해 도세탁셀의 치료 효율을 강하게 증진시킨다는 점이다. 암세포 성장 저해 및 NF-κB 활성 상의 치아크레모논과 다른 화학요법제의 이들 병용 효과는 결장 및 간, 위, 폐 및 전립선 암세포를 포함한 다른 암세포에서도 측정되었다. 더욱이 치아크레모논과 도세탁셀은 종양 증식 저해 상에 생체 내 강한 병용 효율을 나타내었다. 이들 결과는 치아크레모논과 화학요 법제의 병용 효과가 세포 형태 및 화학요법제에 특이적이지 않음을 나타낸다. 이들 데이터는 치아크레모논에 의한 NF-κB의 불활성화가 통상의 화학요법제에 대한 암세포 감수성을 증가시키는 원인임을 나타낸다. An important feature of the present invention is that chiacremonone strongly enhances the therapeutic efficiency of docetaxel by inhibiting growth and inducing apoptosis through inhibiting the activation of NF-κB in colon cancer cells. These combined effects of chiacremonone and other chemotherapeutic agents on cancer cell growth inhibition and NF-κB activity have also been measured in other cancer cells, including colon and liver, stomach, lung and prostate cancer cells. Furthermore, chiacremonone and docetaxel showed strong combination efficiency in vivo on tumor growth inhibition. These results indicate that the combination effect of chiacremonone and chemotherapeutic agents is not specific for cell morphology and chemotherapeutic agents. These data indicate that inactivation of NF-κB by chiacremonone is the cause of increased cancer cell sensitivity to conventional chemotherapeutic agents.

여러 연구는 암세포의 성장 저해시 통상의 화학요법제 및 자연 발생적 화합물을 이용한 유사한 유익한 병용 치료 효과를 보고하였다. 예를 들어 제니스테인(genistein)은 화학요법 저항성 HT-29 결장암 세포주 내 아폽토시스 유도시 5-플루오로우라실과의 상승적 병용 효과를 나타내었다. 또한 커큐민과 셀레콕십(celecoxib)은 대장 암세포의 성장을 상승적으로 저해하였다. 많은 화학요법제는 NF-κB 활성을 유도하여 암세포 내 약물 저항성을 유발하는 것으로 알려져 있다. Several studies have reported similar beneficial combination treatment effects with conventional chemotherapeutic agents and naturally occurring compounds in inhibiting cancer cell growth. Genistein, for example, has shown a synergistic combination with 5-fluorouracil in inducing apoptosis in chemotherapy resistant HT-29 colon cancer cell lines. Curcumin and celecoxib also synergistically inhibited the growth of colon cancer cells. Many chemotherapeutic agents are known to induce NF-κB activity resulting in drug resistance in cancer cells.

따라서 본 발명자들은 치아크레모논에 의한 NF-κB의 저해가 화학요법제에 대한 암세포의 감수성 증가에 대한 유효함을 확인하였다. 그러나 본 발명에서 NF-κB 활성을 약간만 감소시키거나 전혀 효과를 지니지 않는 낮은 용량의 치아크레모논과 도세탁셀(세포 성장 저해 및 NF-κB 활성 상의 그의 IC₅₀ 수치의 절반)이 사용 되었기 때문에 어떻게 치아크레모논과 도세탁셀 또는 다른 화학요법제의 병용이 NF-κB의 구성적 활성화를 차단하는지는 명백하지 않다. Therefore, the present inventors confirmed that inhibition of NF-κB by chiacremonone is effective for increasing the sensitivity of cancer cells to chemotherapeutic agents. However, in the present invention, how the toothcrere was used because low doses of chicremonone and docetaxel (half of its IC ₅₀ levels on cell growth inhibition and NF-κB activity) were used which only slightly reduced or had no effect on NF-κB activity. It is not clear whether the combination of monone with docetaxel or other chemotherapeutic agents blocks the constitutive activation of NF-κB.

NF-κB 활성 유도시 일반적인 신호 경로가 두 화합물의 병용에 의해 차단되고, 치아크레모논 또는 도세탁셀 단독으로는 저하될 수 없음은 확실하다. 또는 NF-κB의 활성화시 다수의 신호 경로가 NF-κB의 각각의 신호 시행 활성화의 공동 작용에 의해 방지되었다. 여러 치료제 병용 처리는 NF-κB의 저해 공동 작용을 통해 암세포 감수성을 증가시키는 것으로 나타났고, 이는 본 발명자들의 가설을 지지한다. 커큐민과 화학요법제에 의한 NF-κB의 더욱 적당한 불활성화는 암세포 사멸 효과를 강화시킨다. When inducing NF-κB activity, it is clear that the general signaling pathway is blocked by the combination of the two compounds, and that it can not be lowered by chiacremonone or docetaxel alone. Or upon activation of NF-κB a number of signal pathways were prevented by the synergistic action of each signal enforcement activation of NF-κB. Several therapeutic combination treatments have been shown to increase cancer cell susceptibility through inhibitory synergistic action of NF-κB, which supports our hypothesis. More moderate inactivation of NF-κB by curcumin and chemotherapeutic agents enhances cancer cell killing effects.

술린닥(sulindac)은 병용 처리 후 상승적인 NF-κB 수치 감소를 통해 HCT 116 결장암 세포 내 삼산화비소-매개 아폽토시스를 증가시킨다. 이는 IκB-α의 인산화 및 분해의 저해에 의해 발생하는 반면 NF-κB 수치는 As₂O₃ 또는 술린닥 단독 처리에 의해 유의적으로 변화되지 않았다. 세포 생존능, 아폽토시스의 유도, NF-κB 활성 및 항아폽토시스 유전자 발현의 유의적인 감소는 약제 단독 처리와 비교시 엘로티닙(erlotinib)과 B-DIM 병용 처리된 췌장암 BxPC-3 세포에서 보고되었다. 더욱이 본 발명의 결과와 매우 유사하게 모든-트랜스 레티노산과 파클리탁셀의 병용은 상승적으로 누드 마우스 내 인간 교모세포종 U87MG 이종이식 내 아폽토시스를 유도하고 NF-κB 활성을 저해하였다. NF-κB 활성 상의 치아크레모논과 도세탁셀의 상승적 병용 효과는 본 발명에서 규명되지 않았다. 그러나 치아크레모논의 항산화 특성은 세포 내 산화환원 전위를 부가적으로 저하시킬 수 있고, 이는 NF-κB 불활성화시 추가적인 장애를 제공한다. 또한 다양한 메커니즘에 의한 NF-κB의 동시 불활성화도 NF-κB 활성을 완전하게 제거할 수 있는 치아크레모논에 의해 가능하다.Sulindac increases arsenic trioxide-mediated apoptosis in HCT 116 colon cancer cells through synergistic decreases in NF-κB levels after combination treatment. This is caused by inhibition of phosphorylation and degradation of IκB-α whereas NF-κB levels were not significantly changed by As ₂ O ₃ or sulindac treatment alone. Significant decreases in cell viability, induction of apoptosis, NF-κB activity and anti-apoptotic gene expression were reported in pancreatic cancer BxPC-3 cells treated with erlotinib and B-DIM compared to drug treatment alone. Moreover, very similar to the results of the present invention, the combination of all-trans retinoic acid and paclitaxel synergistically induced apoptosis in human glioblastoma U87MG xenografts in nude mice and inhibited NF-κB activity. The synergistic combination effect of chiacremonone and docetaxel on NF-κB activity has not been identified in the present invention. However, the antioxidant properties of chiacremonone can additionally lower intracellular redox potential, which presents an additional obstacle in NF-κB inactivation. Simultaneous inactivation of NF-κB by various mechanisms is also possible with chiacremonone, which can completely eliminate NF-κB activity.

NF-κB에 의한 다운스트림 타겟 유전자 발현은 화학요법제에 대한 암세포의 민감화에 관련된다. Bcl-2, IAP1/2 및 서비빈(survivin)의 NF-κB-매개 발현이 아폽토시스로부터 암세포를 보호하는 반면 Bax 및 카스파제-3 및 카스파제-9가 암세포 성장을 저해하고 아폽토시스를 유도함이 잘 알려져 있다.Downstream target gene expression by NF-κB is involved in the sensitivity of cancer cells to chemotherapeutic agents. NF-κB-mediated expression of Bcl-2, IAP1 / 2 and survivin protects cancer cells from apoptosis, while Bax and caspase-3 and caspase-9 inhibit cancer cell growth and induce apoptosis. Known.

본 발명의 데이터는 병용 치료가 생체 내뿐만 아니라 시험관 내에서도 NF-κB 타겟 유전자 발현을 조절함을 나타내었다. 또한 아폽토시스 증가와 일치하게 아폽토시스 단백질인 활성 카스파제-3 및 Bax의 발현이 생체 내 및 시험관 내에서 용량 의존적으로 증가됨이 발견되었다. 아폽토시스는 불필요한 세포를 제거하는 중요한 메커니즘이고 이러한 과정의 철폐는 암세포 발달시 발병기전과 관련된다. 이러한 과정에서 Bcl-2는 아폽토시스를 저해하는 반면 Bax는 아폽토시스를 증진시킨다. 따라서 항-아폽토시스 및 프로-아폽토시스 단백질 수치의 변화는 아폽토시스에 영향을 미치게 된다. 암세포 내의 NF-κB 활성화는 아폽토시스에 대한 저항성 및 항-아폽토시스 Bcl-2 패밀리 단백질 수치 증가와 상호관련된다. 본 발명에서 세포 내 병용 처리는 NF-κB 활성화를 더욱 유의적으로 저해시키고 Bcl-2 단백질 수치를 감소시켰다. 카스파제는 아폽토시스의 실행에 중요한 역할을 하는 프로테아제이다. 본 발명의 데이터는 병용 처리에 의해 NF-κB의 하향-조절이 항-아폽토시스 유전자를 매개하는 반면 아폽토시스 유전자의 상향-조절은 화학요법제에 대한 암세포의 민감화에 원인이 됨을 나타낸다.The data of the present invention showed that the combination therapy regulates NF-κB target gene expression not only in vivo but also in vitro. It was also found that the expression of the apoptosis proteins, active caspase-3 and Bax, increased dose-dependently in vivo and in vitro, consistent with increased apoptosis. Apoptosis is an important mechanism for eliminating unnecessary cells and the abolition of this process is associated with the pathogenesis of cancer cell development. In this process, Bcl-2 inhibits apoptosis while Bax enhances apoptosis. Thus, changes in anti-apoptotic and pro-apoptotic protein levels affect apoptosis. NF-κB activation in cancer cells correlates with resistance to apoptosis and increased anti-apoptotic Bcl-2 family protein levels. Intracellular co-treatment in the present invention significantly inhibited NF-κB activation and reduced Bcl-2 protein levels. Caspase is a protease that plays an important role in the practice of apoptosis. The data of the present invention indicate that down-regulation of NF-κB mediates anti-apoptotic genes by combination treatment, whereas up-regulation of apoptosis genes contributes to the sensitivity of cancer cells to chemotherapeutic agents.

본 발명은 치아크레모논과 도세탁셀의 병용 처리가 생체 내 강한 항종양 활성을 나타냄을 나타내었다. 본 발명의 항종양 활성은 종양 성장의 유의적인(77% 저해) 저해를 나타내는 고-용량 도세탁셀의 단일 처리(10 mg/kg, i.p., 28일간 주 1회)의 항종양 활성의 절반이었다. 그러나 본 발명의 병용 처리는 종양-포함 마우스의 생존율을 크게 증가시켰다. 고-용량 도세탁셀의 단일 처리(10 mg/kg, i.p., 28일간 주 1회)는 약 45일의 수명을 나타낸 반면 병용-처리된 마우스는 110일 이상 생존하였다. 이러한 독성 저하 및 암세포 사멸 효율의 증가는 치아크레모논과 다른 통상적인 화학요법제와의 유익한 병용 효과를 나타낸다. 더 우수한 치료 효율을 달성하기 위해 치료를 위한 2 이상의 화학요법제와의 병용이 일반적으로 고려된다. 두 후보 약제의 분자 메커니즘을 기반으로 한 병용 화학치료의 최적화는 치료 지수를 개선시키고(낮은 독성을 지닌 증가된 치료 효과) 이러한 치료법은 암 환자의 성공적인 치료를 위해 필요하다. 본 발명의 결과는 마늘에서 분리된 식이 황 화합물인 치아크레모논과 화학요법제의 병용은 전립선암, 위암 및 폐암을 포함한 다른 형태의 암을 암에 대한 매우 낮은 독성 및 우수한 항종양 활성으로 인해 큰 유익한 효과를 발휘할 수 있다. 따라서 치아크레모논은 다른 형태의 암의 치료를 위해 다른 화학요법제와의 병용에 유용할 수 있다.The present invention showed that the combination treatment of chiacremonone and docetaxel exhibited strong antitumor activity in vivo. The antitumor activity of the present invention was half of the antitumor activity of a single treatment of high-dose docetaxel (10 mg / kg, i.p., once weekly for 28 days) showing significant (77% inhibition) inhibition of tumor growth. However, the combination treatment of the present invention greatly increased the survival rate of tumor-bearing mice. Single treatment of high-dose docetaxel (10 mg / kg, i.p., once weekly for 28 days) had a lifespan of about 45 days, while co-treated mice survived 110 days or more. This decrease in toxicity and the increase in cancer cell killing efficiency indicate a beneficial combination effect of chiacremonone with other conventional chemotherapeutic agents. Combinations with two or more chemotherapeutic agents for treatment are generally considered to achieve better therapeutic efficiencies. Optimization of combination chemotherapy based on the molecular mechanisms of the two candidate agents improves the therapeutic index (increased therapeutic effect with low toxicity) and such therapies are necessary for successful treatment of cancer patients. The results of the present invention show that the combination of chiacremonone, a dietary sulfur compound isolated from garlic, with chemotherapeutic agents is highly effective due to the very low toxicity and excellent antitumor activity against cancer of other forms of cancer, including prostate cancer, stomach cancer and lung cancer. It can have a beneficial effect. Chiacremonone may thus be useful in combination with other chemotherapeutic agents for the treatment of other forms of cancer.

본 발명의 의약 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제형시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used in the formulation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, silicic acid Calcium, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like. no. In addition to the above components, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.

본 발명의 의약 조성물의 적합한 투여량은 제형화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라 다양한 방법으로 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.01-1000 mg/kg(체중)이다.Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the invention can be determined in a variety of ways depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to reaction. It may be prescribed. On the other hand, the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.01-1000 mg / kg body weight per day.

본 발명의 의약 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and when administered parenterally, may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, or the like. It is preferable that the route of administration is determined according to the type of the disease to which the pharmaceutical composition of the present invention is applied.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분인 치아크레모논 및 도세탁셀의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요 기간, 질환의 정도 등을 고려하여 결정하며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.The concentrations of chiacremonone and docetaxel, which are active ingredients included in the composition of the present invention, are determined in consideration of the purpose of treatment, the condition of the patient, the period of time, the degree of disease, and the like, and are not limited to a specific range of concentrations.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제형화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical compositions of the present invention may be formulated in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. It can be made or prepared by incorporating into a multi-dose container. In this case, the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.

이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these examples do not limit the scope of the present invention.

재료 material

치아크레모논은 마늘에서 분리되었고 Gehrt A. et al., Nat Prod Lett 2000;14:281-4에 의해 기술된 바와 같이 발효에 의해 아크레모늄속(Acremonium sp.) 스트레인 HA33-95로부터 분리된 화합물과 동일한 것으로 나타났다. 치아크레모논의 구조는 도 1A에 나타나 있다. 치아크레모논은 0.01 DMSO 내에서 용해되고 50 ㎍/mL의 용량으로 투여되었다. 도세탁셀은 (주)삼양제넥스에서 구입하였다. 도세탁셀은 반합성 및 정제 방법에 의해 생산되었다. 간단하게는 천연 도세탁셀은 13-디하이드록시박카틴 Ⅲ과 도세탁셀 측쇄로서 (3R,4S)-1-t-Boc-3-트리에틸실릴옥시-4-페닐아제티딘-2-온과의 반합성으로부터 수득된 후 메탄올/증류수 용액으로의 재결정화에 의해 정제되었다. 도세탁셀의 구조는 도 1B에 나타나 있다. 도세탁셀은 생체 내 처리를 위해 0.01% DMSO 내에 용해되었다.Chiacremonone was isolated from garlic and isolated from Acremonium sp. Strain HA33-95 by fermentation as described by Gehrt A. et al., Nat Prod Lett 2000; 14: 281-4. Appeared to be the same. The structure of the tooth cremonone is shown in Figure 1A. Chiacremonone was dissolved in 0.01 DMSO and administered at a dose of 50 μg / mL. Docetaxel was purchased from Samyang Genex. Docetaxel was produced by semisynthetic and purification methods. Briefly, natural docetaxel is derived from the semisynthesis of 13-dihydroxybaccatin III with (3R, 4S) -1-t-Boc-3-triethylsilyloxy-4-phenylazetidin-2-one as the docetaxel side chain. After obtained it was purified by recrystallization into methanol / distilled water solution. The structure of docetaxel is shown in Figure 1B. Docetaxel was dissolved in 0.01% DMSO for in vivo treatment.

(실시예 1) 세포 배양Example 1 Cell Culture

SW 620 및 HCT 116 인간 결장암 세포, HepG2 간 암세포, PC 전립선 암세포, NCI-H460 폐 암세포 및 MKN-45 위 암세포는 American Type Culture Collection에서 수득되었다. RPMI 1640, DMEM, 페니실린, 스트렙토마이신 및 우태아혈청은 Invitrogen에서 구입하였다. SW 620 및 HCT 116 인간 결장암 세포, PC 전립선 암세포 및 NCI-H460 폐 암세포는 10% 우태아혈청, 100 유니트/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신을 지닌 RPMI 1640 내에서 5% CO₂ 가습 공기 내에 37℃로 성장되었다. HepG2 간 암세포는 10% 우태아혈청, 100 유니트/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신을 지닌 DMEM 내에서 5% CO₂ 가습 공기 내에 37℃로 성장되었다. SW 620 and HCT 116 human colon cancer cells, HepG2 liver cancer cells, PC prostate cancer cells, NCI-H460 lung cancer cells and MKN-45 gastric cancer cells were obtained from the American Type Culture Collection. RPMI 1640, DMEM, penicillin, streptomycin and fetal bovine serum were purchased from Invitrogen. SW 620 and HCT 116 human colon cancer cells, PC prostate cancer cells and NCI-H460 lung cancer cells were placed in 5% CO ₂ humidified air in RPMI 1640 with 10% fetal bovine serum, 100 units / mL penicillin and 100 μg / mL streptomycin. Grown to 37 ° C. HepG2 liver cancer cells were grown to 37 ° C. in 5% CO ₂ humidified air in DMEM with 10% fetal bovine serum, 100 units / mL penicillin and 100 μg / mL streptomycin.

(실시예 2) 세포 생존능 분석Example 2 Cell Viability Assay

세포수를 측정하기 위해 배양된 세포는 TrypLE Express(Invitrogen)로 트립신 처리된 후 세포는 1,500 rpm으로 5분간 원심분리에 의해 펠렛화되었다. 세포는 10 mL의 PBS 내에 재현탁되었고 0.1 mL의 0.2% 트리판 블루이 암세포 현탁액 내에 첨가되었다. 이후 한 방울의 현탁액이 Neubauer 챔버 내에 놓이고 생존 암세포가 계측되었다. 염색 신호를 나타내는 세포는 사멸한 것으로 간주된 반면 트리판 블루를 차단시키는 세포는 생존 가능한 것으로 간주되었다. 각각의 분석은 3반복으로 수행되었다.Cells cultured to determine cell number were trypsinized with TrypLE Express (Invitrogen) and then cells were pelleted by centrifugation at 1,500 rpm for 5 minutes. The cells were resuspended in 10 mL of PBS and 0.1 mL of 0.2% trypan blue was added into the cancer cell suspension. A drop of suspension was then placed in the Neubauer chamber and viable cancer cells were counted. Cells showing staining signals were considered dead while cells blocking trypan blue were considered viable. Each analysis was performed in three replicates.

(실시예 3) 웨스턴 블럿 분석Example 3 Western Blot Analysis

웨스턴 블럿 분석은 Ban JO et al., J Pharmacol Sci 2007;104:374-83에 기술된 바와 같이 수행되었다. 멤브레인은 1차 특정 항체로 면역블럿되었다: p65 및 p50에 대한 마우스 폴리클론 항체(1:500 희석, Santa Cruz Biotechnology, Inc.); Bax(1:500 희석, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 및 카스파제-3, 분열된 카스파제-3, 카스파제-9, 분열된 카스파제-9, PARP, Bcl-2, XIAP 및 c-IAP-1(1:1,000 희석, Cell Signaling Technology, Inc.)에 대한 토끼 폴리클론 항체. 이후 블럿은 대응 컨쥬게이트 항-토끼 및 항-마우스 IgG-당근 과산화효소(1:2,000 희석, Santa Cruz Biotechnology, Inc.)와 인큐베이트되었다. 면역반응성 단백질은 ECL 웨스턴 블럿팅 검출 시스템으로 검출되었다. 단백질 밴드의 상대 밀도는 MyImage(SLB)를 이용한 농도계측기에 의해 스캔되고 Labworks 4.0 소프트웨어(UVP, Inc.)에 의해 정량화되었다.Western blot analysis was performed as described in Ban JO et al., J Pharmacol Sci 2007; 104: 374-83. The membranes were immunoblotted with primary specific antibodies: mouse polyclonal antibodies against p65 and p50 (1: 500 dilution, Santa Cruz Biotechnology, Inc.); Bax (1: 500 dilution, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) and caspase-3, cleaved caspase-3, caspase-9, cleaved caspase-9, PARP, Bcl-2, XIAP and c-IAP Rabbit polyclonal antibody against -1 (1: 1,000 dilution, Cell Signaling Technology, Inc.). The blot was then incubated with the corresponding conjugate anti-rabbit and anti-mouse IgG-carrot peroxidase (1: 2,000 dilution, Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Immunoreactive proteins were detected with the ECL Western Blotting Detection System. The relative density of protein bands was scanned by densitometry with MyImage (SLB) and quantified by Labworks 4.0 software (UVP, Inc.).

(실시예 4) 전기이동 변화 분석Example 4 Analysis of Electrophoretic Change

전기이동 변화 분석(electromobility shift assay)은 Ban JO et al., J Pharmacol Sci 2007;104:374-83에 기술된 바와 같이 수행되었다. 단백질 밴드의 상대 밀도는 MyImage(SLB)를 이용한 농도계측기에 의해 스캔되고 Labworks 4.0 소프트웨어(UVP, Inc.)에 의해 정량화되었다.Electromobility shift assays were performed as described in Ban JO et al., J Pharmacol Sci 2007; 104: 374-83. The relative density of protein bands was scanned by densitometry with MyImage (SLB) and quantified by Labworks 4.0 software (UVP, Inc.).

(실시예 5) 트랜스펙션 및 루시페라제 활성 분석Example 5 Transfection and Luciferase Activity Assay

결장암 세포(2.5 X 10⁵/㎠)는 24-웰 플레이트 내에 평판 배양되었고 제조사의 설명서(Invitrogen)에 따라 플라스미드와 Lipofectamine PLUS in OPTI-MEN 혼합물을 사용하여 pNF-κB-Luc 플라스미드(5 X NF-κB; Stratagene)로 일시적으로 트랜스펙트되었다. 트랜스펙트된 세포는 400 ㎕의 신선한 배지로 24시간 동안 인큐베이트된 후 치아크레모논 50 ㎍/mL 및 도세탁셀 5 nmol/L로 6시간 동안 처리되었다. 루시페라제 활성은 제조사의 지침에 따라 루시페라제 분석 키트(Promega)를 이용하여 측정되었다.Colon cancer cells (2.5 X 10 ⁵ / cm 2) were plated in 24-well plates and pNF-κB-Luc plasmid (5 X NF-) using a mixture of plasmid and Lipofectamine PLUS in OPTI-MEN according to the manufacturer's instructions (Invitrogen). κB; Stratagene). Transfected cells were incubated with 400 μl fresh medium for 24 hours and then treated with 50 μg / mL of chiacremonone and 5 nmol / L of docetaxel for 6 hours. Luciferase activity was measured using the Luciferase Assay Kit (Promega) according to the manufacturer's instructions.

(실시예 6) 아폽토시스 검출Example 6 Apoptosis Detection

결장암 세포(2.5 X 10⁵/㎠)는 챔버 슬라이드(Lab-Tak Ⅱ 챔버 슬라이드 시스템, Nalge Nunc Int.) 상에서 배양되고 4% 파라포름알데하이드 내에 고정되고 실온에서 PBS 내 0.1% Triton X-100으로 30분간 노출에 의해 멤브레인-투과되었다. TUNEL 분석은 제조사의 지침에 따라 원위치 세포 사멸 검출 키트(Roche Diagnostics GmbH)를 이용하여 수행되었다. DAPI 염색을 위해 슬라이드는 DAPI(Vector Laboratories, Inc.) 포함 형광을 위한 봉입제와 함께 암조건으로 실온에서 30분간 인큐베이트되었다. 이후 세포는 형광 현미경(Leica Microsystems AG)을 통해 관찰되었다. 해당 면적 내 세포의 총수는 DAPI 세포핵 염색을 이용함으로서 측정되었다. 아폽토시스 지수는 DAPI-염색된 TUNEL-양성 염색 세포수를 계수된 총 세포수 X 100으로 나눔으로서 측정되었다.Colon cancer cells (2.5 × 10 ⁵ / cm 2) were cultured on chamber slides (Lab-Tak II chamber slide system, Nalge Nunc Int.) And fixed in 4% paraformaldehyde and 30% with 0.1% Triton X-100 in PBS at room temperature. The membrane was permeated by exposure for a minute. TUNEL analysis was performed using an in situ cell death detection kit (Roche Diagnostics GmbH) according to the manufacturer's instructions. For DAPI staining the slides were incubated for 30 minutes at room temperature in dark conditions with inclusions for DAPI (Vector Laboratories, Inc.) containing fluorescence. Cells were then observed under fluorescence microscopy (Leica Microsystems AG). The total number of cells in that area was measured by using DAPI nuclei staining. Apoptosis index was determined by dividing the number of DAPI-stained TUNEL-positive stained cells by the total number of cells counted by 100.

(실시예 7) 이종이식 동물 모델을 이용한 생체 내 항종양 활성 조사Example 7 In Vivo Antitumor Activity Investigation Using Xenotransplantation Animal Model

6주령 수컷 BALB/c 누드 마우스는 일본 SLC에서 구입하였다. 마우스는 미국 실험동물인증협회에 의해 공인되고 한국식품의약품안정청 및 충북대학교에 의해 규정된 현재 규제 및 표준에 따른 시설 내에 멸균 조건으로 수용되고 유지되었다. 마우스는 4개 그룹으로 분할되었다. 2개 그룹의 마우스(n=30)는 10일간 치아크레모논(음용수 내 1 mg/kg)으로 경구 투여로 전처리되었다. 인간 결장암 세포(SW 620)는 27-게이지 바늘로 마우스 우측 하부 옆구리 내로 피하 주사되었다(1 X 10⁷ 종양 세포/0.1 mL PBS/동물). 10일 후 종양이 300 내지 400 ㎣의 평균 부피에 도달하면 첫 번째 종양-포함 누드 마우스(n=10) 그룹은 치아크레모논으로 지속적 처리와 함께 4주간 주 1회 도세탁셀[무수 에탄올 내에 용해된 1 mg/kg/Tween 80/식염수(5%:5%:90%, i.p.)]로 복막내 주사되었다. 두 번째 마우스 그룹은 치아크레모논으로 지속적으로 처리되었다. 세 번째 종양-포함 누드 마우스 그룹(n=10)은 4주간 주 1회 도세탁셀로 복막내 주사되었다. 마지막 마우스 그룹은 대조군으로서 주 1회 운반체[에탄올/Tween 80/식염수(5%:5%:90%, i.p.)]로 처리되었다. 동물의 체중 및 종양 부피는 주 2회 모니터되었다. 종양 부피는 버니어 캘리퍼스(vernier calipers)로 측정되었고 하기 식으로 계산되었다: (A X B²)/2, 2개 수치 중 A는 더 큰 것이고 B는 더 작은 것이다. 실험 종료시 동물은 경추 탈골로 사망시켰다. 종양은 주변 근육 및 진피로부터 분리되고 절제되고 측량되었다. 조직은 생화학적 조사를 위해 조사되었다. 생존율 시험을 위해 동일한 처리의 또다른 세트의 실험이 수행되었다. 생존율 및 또다른 독성 신호는 110일간 10일에 1회 관찰되었다. Six-week old male BALB / c nude mice were purchased from Japanese SLC. Mice were housed and maintained in sterile conditions in a facility in accordance with current regulations and standards accredited by the American Laboratory Animal Certification Association and defined by the Korea Food and Drug Administration and Chungbuk National University. Mice were divided into four groups. Two groups of mice (n = 30) were pretreated by oral administration with chiacremonone (1 mg / kg in drinking water) for 10 days. Human colon cancer cells (SW 620) were injected subcutaneously into the lower right flank of mice with a 27-gauge needle (1 × 10 ⁷ tumor cells / 0.1 mL PBS / animal). After 10 days, when tumors reached an average volume of 300-400 mm 3, the first tumor-containing nude mouse (n = 10) group was docetaxel [1 dissolved in anhydrous ethanol once a week for 4 weeks with continuous treatment with chiacremonone. mg / kg / Tween 80 / saline (5%: 5%: 90%, ip)]. The second group of mice was treated continuously with chiacremonone. The third tumor-bearing nude mouse group (n = 10) was injected intraperitoneally with docetaxel once a week for 4 weeks. The last group of mice was treated with vehicle [ethanol / Tween 80 / saline (5%: 5%: 90%, ip)] once weekly as a control. Animal weight and tumor volume were monitored twice a week. Tumor volume was measured with vernier calipers and calculated with the following formula: (AXB ² ) / 2, of which 2 is larger and B is smaller. At the end of the experiment animals died of cervical dislocation. Tumors were isolated, excised and weighed from the surrounding muscles and dermis. Tissues were examined for biochemical investigations. Another set of experiments of the same treatment was performed for the survival test. Survival and another toxicity signal were observed once every 10 days for 110 days.

(실시예 8) 면역조직화학Example 8 Immunohistochemistry

모든 표본은 포르말린 내에 고정되고 시험을 위해 파라핀-포매되었다. 5-마이크로미터-두께 조직 절편은 H&E로 염색되었고 면역조직화학이 수행되었다. 파라핀-포매된 절편은 탈파라핀화되고 재수화되고 증류수로 세척된 후 열-매개 항원 탐색 처리되었다. 내인성 과산화효소 활성은 메탄올 내 2% 과산화수소로 15분간 인큐베이션에 의해 억제된 후 PBS 내에서 5분간 세척되었다. 절편은 PBS 내에서 희석된 3% 정상 말 혈청으로 30분간 차단되었다. 이후 절편은 블럿되었고 실온에서 4시간 동안 차단 혈청 내에서 적당하게 희석된 1차 마우스 증식 세포 세포핵 항원인 Ki-67 및 Bax 단일클론 항체(1:200 희석) 또는 4℃에서 밤새 차단 혈청 내에서 적당하게 희석된 1차 토끼 항-인간 p50 및 분열된 카스파제-3 폴리클론 항체(1:100 희석)로 인큐베이트되었다. 다음 날 슬라이드는 각각 PBS 내에 5분간 3회 세척되었고 2시간 동안 비오틴 처리된 항-마우스 및 토끼 항체 내에서 인큐베이트되었다. 슬라이드는 PBS 내에서 세척된 후 아비딘-비오틴-과산화효소 복합체(ABC, Vector Laboratories, Inc.) 형성되었다. 슬라이드는 세척되고 과산화효소 반응은 디아미노벤지딘 및 과산화물로 발색된 후 헤마토옥실린으로 대조염색되고, 아쿠아-마운트 내에 봉입되고, 광학 현미경(X200, Olympus).을 이용하여 평가되었다. 음성 대조군은 1차 항체를 생략함으로서 모든 경우에 수행되었다. 모든 슬라이드는 헤마톡실린에 의해 대조염색되었다. 정량을 위해 3회 무작위로 선택된 200개 세포가 평가되었고 양성 증식 세포 세포핵 항원인 Ki-67, p65, p50, Bax 및 분열된 카스파제-3-염 색된 세포가 계측되고 염색된 세포의 비율로 표기되었다. 이후 종양 조직 내 아폽토시스성 세포사멸의 검출을 위해 제조사의 지침에 따라 파라핀-포매된 절편은 표지 용액(450 ㎕)과 효소 용액(50 ㎕) 혼합물 내에서 37℃로 1시간 동안 인큐베이트되었고 0.1 mol/L PBS 내에서 5분간 3회 세척되었다. 이후 절편은 세척되고 슬라이드 상에 봉입되고 형광 현미경(DAS 현미경) 관찰을 위해 커버슬라이드로 덮였다. TUNEL 염색은 한정된 면적 내 양성으로 염색된 DAPI 세포수를 계측함으로서 기록되었다.All samples were fixed in formalin and paraffin-embedded for testing. 5-micrometer-thick tissue sections were stained with H & E and immunohistochemistry was performed. Paraffin-embedded sections were deparaffinized, rehydrated and washed with distilled water followed by heat-mediated antigen screening. Endogenous peroxidase activity was inhibited by incubation for 15 minutes with 2% hydrogen peroxide in methanol and then washed for 5 minutes in PBS. Sections were blocked for 30 minutes with 3% normal horse serum diluted in PBS. Sections were then blotted and appropriately diluted in blocking serum primary Ki-67 and Bax monoclonal antibodies (1: 200 dilution) at 4 ° C. overnight or at moderately diluted in blocking serum for 4 hours at room temperature. Incubated with a well diluted primary rabbit anti-human p50 and cleaved caspase-3 polyclonal antibody (1: 100 dilution). The next day slides were washed three times for 5 minutes each in PBS and incubated in biotinized anti-mouse and rabbit antibodies for 2 hours. Slides were washed in PBS and then avidin-biotin-peroxidase complex (ABC, Vector Laboratories, Inc.) formed. The slides were washed and the peroxidase reaction was developed with diaminobenzidine and peroxide, then counterstained with hematoxillin, enclosed in aqua-mounts and evaluated using an optical microscope (X200, Olympus). Negative controls were performed in all cases by omitting the primary antibody. All slides were counterstained with hematoxylin. 200 randomly selected cells were evaluated three times for quantification and positive proliferative cell nucleus antigens Ki-67, p65, p50, Bax and divided caspase-3-salt colored cells were measured and expressed as percentage of stained cells. It became. Paraffin-embedded sections were then incubated at 37 ° C. for 1 hour in a mixture of labeling solution (450 μl) and enzyme solution (50 μl) for detection of apoptotic apoptosis in tumor tissue and 0.1 mol Washed three times for 5 minutes in / L PBS. Sections were then washed, sealed on slides and covered with coverslides for fluorescence microscopy (DAS microscopy) observation. TUNEL staining was recorded by counting the number of DAPI cells stained positive within a defined area.

자료 분석Data analysis

데이터는 GraphPad Prism 4 소프트웨어(버전 4.03, GraphPad software, Inc.)를 이용하여 분석되었다. 데이터는 평균±SE로 제공된다. 편차 동일성은 Bartlett 테스트를 이용하여 평가되었다. 편차가 동일한 경우 그룹과 처리간의 차이는 일원분산분석에 의해 평가되었다. ANOVA 내 P 수치가 유의적인 경우 평균쌍간의 차이는 Dunnett 테스트에 의해 평가되었다. P < 0.05의 수치는 통계학적으로 유의적인 것으로 간주되었다.Data was analyzed using GraphPad Prism 4 software (version 4.03, GraphPad software, Inc.). Data are presented as mean ± SE. Deviation identity was assessed using the Bartlett test. If the deviations were the same, the differences between the groups and treatments were evaluated by one-way ANOVA. If the P values in ANOVA were significant, the differences between the mean pairs were assessed by Dunnett's test. Values of P <0.05 were considered statistically significant.

도 1은 치아크레모논(A) 및 도세탁셀(B)의 구조를 나타낸 것이다.Figure 1 shows the structure of chiacremonone (A) and docetaxel (B).

도 2는 SW 620 및 HCT 116 결장암 세포 내 세포 생존능 및 NF-κB 활성 상의 치아크레모논과 도세탁셀의 병용 처리 효과를 나타낸 것이다. 도 2(A)에서 SW 620 및 HCT 116 결장암 세포는 pNF-κB-Luc 플라스미드(5x NF-κB)로 4시간 동안 트랜스펙트되었다. 트랜스펙트된 세포는 400 ㎕의 신선 배지로 24시간 동안 인큐베이트된 후 50 ㎍/mL 치아크레모논과 5 nmol/L 도세탁셀로 6시간 동안 동시처리되었다. 컬럼, 3반복으로 수행된 독립 실험의 평균; 막대, SD. RLU, 비자극된 세포 내 상대 루시페라제 활성. 도 2(B)에서 SW 620 및 HCT 116 결장암 세포는 50 ㎍/mL 치아크레모논과 5 nmol/L 도세탁셀로 1시간 동안 동시처리되었다. 세포색 추출물은 κB 서열을 포함한 ³²P-말단-표지 올리고뉴클레오타이드의 결합 반응시 인큐베이트되었다. NF-κB의 활성화는 실시예에 나타난 바와 같이 EMSA를 이용하여 조사되었다. 3회 독립 실험 결과에 의한 밴드 강도의 정량화는 농도계측기(Imaging System)에 의해 수행되었고 각 밴드 아래의 수치는 비처리 대조군과의 배수 차이를 나타낸다. 도 2(C)에서 SW 620 및 HCT 116 결장암 세포는 50 ㎍/mL 치아크레모논과 5 nmol/L 도세탁셀로 동시 처리되었다. 세포 생존능은 실시예에 기술된 바와 같이 0.2% 트리판 블루를 이용하여 세포 계측함으로서 24-시간 배양 후 측정되었고, 결과는 사멸 세포의 비율로 표기되었다. 컬럼, 각각 3반복으로 수행된 3회 실험의 평균; 막대, SD. 100 ㎛. ^* P<0.05, 대조군과의 통계적으로 유의적인 차이.Figure 2 shows the effect of the combination treatment of chiacremonone and docetaxel on cell viability and NF-κB activity in SW 620 and HCT 116 colon cancer cells. In FIG. 2 (A) SW 620 and HCT 116 colon cancer cells were transfected with pNF-κB-Luc plasmid (5 × NF-κB) for 4 hours. Transfected cells were incubated with 400 μl fresh medium for 24 hours and then co-treated with 50 μg / mL chiacremonone and 5 nmol / L docetaxel for 6 hours. Column, average of independent experiments performed in three replicates; Rod, SD. RLU, relative luciferase activity in unstimulated cells. In FIG. 2 (B), SW 620 and HCT 116 colon cancer cells were co-treated with 50 μg / mL chiacremonone and 5 nmol / L docetaxel for 1 hour. The cell color extracts were incubated upon the binding reaction of ³² P-terminal-labeled oligonucleotides containing the κB sequence. Activation of NF-κB was investigated using EMSA as shown in the examples. Quantification of band intensities by the results of three independent experiments was performed by an Imaging System and the values below each band represent a fold difference from the untreated control. In Figure 2 (C) SW 620 and HCT 116 colon cancer cells were co-treated with 50 μg / mL chiacremonone and 5 nmol / L docetaxel. Cell viability was measured after 24-hour incubation by cytometry using 0.2% trypan blue as described in the Examples, and the results were expressed as percentage of dead cells. Column, average of three experiments performed in three replicates each; Rod, SD. 100 μm. ^* P <0.05, statistically significant difference from control.

도 3은 치아크레모논과 도세탁셀의 병용 처리에 의한 SW 620 및 HCT 116 결장암 세포의 아폽토시스성 세포사멸을 나타낸 것이다. SW 620 및 HCT 116 결장암 세포는 50 ㎍/mL 치아크레모논과 5 nmol/L 도세탁셀로 24시간 동안 동시처리되었다. 아폽토시스성 세포는 TUNEL 염색 후 형광 현미경에 의해 조사되었다(형광 현미경; 하단 패널). 해당 면적 내 총 세포수는 DAPI 세포색 염색을 이용하여 측정되었다(상단 패널). 아폽토시스 지수는 DAPI-염색된 TUNEL-양성 세포수 계측시 측정되었다. 컬럼, 각각 3반복으로 수행된 3회 실험의 평균; 막대, SD. ^* P<0.05, 대조군과의 통계적으로 유의적인 차이. 막대, 50 ㎛.Figure 3 shows apoptotic apoptosis of SW 620 and HCT 116 colon cancer cells by the combination treatment of chiacremonone and docetaxel. SW 620 and HCT 116 colon cancer cells were co-treated with 50 μg / mL chiacremonone and 5 nmol / L docetaxel for 24 hours. Apoptotic cells were examined by fluorescence microscopy after TUNEL staining (fluorescence microscopy; bottom panel). Total cell number in the area was measured using DAPI cell color staining (top panel). Apoptosis index was measured upon DAPI-stained TUNEL-positive cell count. Column, average of three experiments performed in three replicates each; Rod, SD. ^* P < 0.05, statistically significant difference from control. Rod, 50 μm.

도 4는 SW 620 및 HCT 116 결장암 세포 내 아폽토시스 조절 단백질의 발현 상의 치아크레모논과 도세탁셀의 병용 처리 효과를 나타낸 것이다. 세포는 50 ㎍/mL 치아크레모논과 5 nmol/L 도세탁셀로 24시간 동안 동시처리되었다. 동량의 총 단백질(50 ㎍/레인)은 12% SDS-PAGE 수행되었다. Bax, 분열된 카스파제-3, 분열된 카스파제-9, Bcl-2, cIAP1/2, XIAP 및 β-액틴의 발현은 특정 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅에 의해 검출되었다. β-액틴 단백질은 내부 대조군으로 사용되었다. 각각의 밴드는 3회 독립 실험을 대표한다.Figure 4 shows the effect of the combination treatment of chiacremonone and docetaxel on the expression of apoptosis regulatory proteins in SW 620 and HCT 116 colon cancer cells. Cells were co-treated with 50 μg / mL chiacremonone and 5 nmol / L docetaxel for 24 hours. Equal amounts of total protein (50 μg / lane) were performed with 12% SDS-PAGE. Expression of Bax, cleaved caspase-3, cleaved caspase-9, Bcl-2, cIAP1 / 2, XIAP and β-actin was detected by western blotting using specific antibodies. β-actin protein was used as internal control. Each band represents three independent experiments.

도 5는 생체 내 모델 내 SW 620 이종이식 내 종양 성장 상의 치아크레모논과 도세탁셀의 병용 치료 효과를 나타낸 것이다. 도 5(A)는 실시예에 기술된 실험 프로토콜의 개략도이다. 도 5(B-D)는 종양 사진 및 종양 중량, 종양 부피 및 생존율을 나타낸다. 그룹 1은 운반체[에탄올/Tween 80/식염수(5/5/90%), i.p., 4주간 주 1회]로 처리되었고; 그룹 2는 1 mg/kg 치아크레모논(10일간 1 mg/kg/d 전처리 및 4주간 지속적 처리) 단독 경구 투여되었고; 그룹 3은 1 mg/kg 도세탁셀(1 mg/kg, 4주간 주 1회)로 단독 처리되었고; 그룹 4는 1 mg/kg 치아크레모논과 1 mg/kg 도세탁셀로 동시처리되었다. 생존율 시험을 위해 동일한 마우스(n=10 마우스/그룹)로 동일한 처리의 또다른 세트의 실험이 수행되었다. 생존율 및 다른 독성 신호는 110일간 10일 마다 1회 관찰되었다.Figure 5 shows the combined treatment effect of chiacremonone and docetaxel on tumor growth in SW 620 xenografts in vivo model. 5A is a schematic diagram of the experimental protocol described in the Examples. 5 (B-D) shows the tumor picture and tumor weight, tumor volume and survival rate. Group 1 was treated with vehicle [ethanol / Tween 80 / saline (5/5/90%), i.p., once weekly for 4 weeks]; Group 2 was orally administered 1 mg / kg chiacremonone (1 mg / kg / d pretreatment for 10 days and continuous treatment for 4 weeks) alone; Group 3 was treated alone with 1 mg / kg docetaxel (1 mg / kg, once weekly for 4 weeks); Group 4 was co-treated with 1 mg / kg chiacremonone and 1 mg / kg docetaxel. Another set of experiments of the same treatment was performed with the same mice (n = 10 mice / group) for the survival test. Survival and other toxicity signals were observed once every 10 days for 110 days.

도 6은 이종이식 동물 모델 생체 내 종양 세포 증식, 아폽토시스 및 NF-κB 단백질 상의 치아크레모논과 도세탁셀의 병용 치료 효과를 나타낸다. 면역조직화학은 실시예에 기술된 바와 같이 다른 처리에 의해 누드 마우스 이종이식 조직 내 H&E, Ki-67 및 분열된 카스파제-3의 발현 수치를 측정하는데 이용되었다. 도 6(A)에서 증식 마커 H&E(상단) 및 Ki-67(두 번째 패널)의 면역조직화학 분석은 치아크레모논-단독 또는 도세탁셀과 병용 처리된 동물 내 결장 종양 세포 증식 상의 저해를 나타낸다. 도 6(B)에서 아폽토시스 마커 분열된 카스파제-3의 면역조직화학 분석은 치아크레모논-단독 또는 도세탁셀과 병용 처리된 마우스 내 결장 종양 세포 아폽토시스의 유도를 나타낸다. 분열된 카스파제-3 반응성 세포의 정량은 실시예에 기술된 바와 같이 계산되었다. 아폽토시스 세포는 TUNEL 염색 후 형광 현미경으로 조사되었다. 도 6(C)에서 해당 면적 내 총 세포수는 DAPI 세포핵 염색을 이용하여 측정되었다(네 번째 패널). 아폽토시스 지수는 DAPI-염색된 TUNEL-양성 세포수 계측시 측정되었다. 컬럼, 6마리 마우스의 평균, 막대, SD. ^* P<0.05, 대조군과의 통계적으로 유의적인 차이. 막대, 50 ㎛.FIG. 6 shows the combined therapeutic effect of chiacremonone and docetaxel on xenograft model in vivo tumor cell proliferation, apoptosis and NF-κB protein. Immunohistochemistry was used to measure the expression levels of H & E, Ki-67 and cleaved caspase-3 in nude mouse xenografts by other treatments as described in the Examples. Immunohistochemical analysis of proliferation markers H & E (top) and Ki-67 (second panel) in FIG. 6 (A) shows inhibition on colon tumor cell proliferation in animals treated with chiacremonone-only or docetaxel. Immunohistochemical analysis of the apoptosis marker cleaved caspase-3 in FIG. 6 (B) shows induction of colon tumor cell apoptosis in mice treated with chiacremonone-only or docetaxel. Quantification of cleaved caspase-3 reactive cells was calculated as described in the Examples. Apoptotic cells were examined under fluorescence microscopy after TUNEL staining. In Figure 6 (C) the total cell number in the area was measured using DAPI nuclei staining (fourth panel). Apoptosis index was measured upon DAPI-stained TUNEL-positive cell count. Column, mean of 6 mice, bar, SD. ^* P <0.05, statistically significant difference from control. Rod, 50 μm.

도 7은 이종이식 동물 모델 생체 내 NF-κB 단백질 및 NF-κB 조절 단백질 상의 치아크레모논과 도세탁셀의 병용 처리 효과를 나타낸 것이다. 도 7(A)에서 NF-κB의 DNA 결합 활성은 실시예에 기술된 바와 같이 이종이식 종양 표본 유래의 세포핵 추출물 내 EMSA에 의해 측정되었다. NF-κB 단백질(p65 및 p50) 발현은 실시예에 기술된 바와 같이 이종이식 종양 표본(각 그룹 당 3개 표본) 유래의 세포색 추출물 내 특정 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅에 의해 검출되었다. p50 및 p65의 면역조직화학 분석은 치아크레모논-단독 또는 도세탁셀 병용 처리된 동물 그룹 내 NF-κB 단백질 발현의 저해를 나타낸다. p50 및 p65 반응성 세포의 정량은 실시예에 기술된 바와 같이 측정되었다. 도 7(B) 및 (C)은 비처리 종양(레인 1), 치아크레모논 1 mg/kg-처리 종양(레인 2), 도세탁셀 1 mg/kg 종양(레인 3) 및 치아크레모논과 도세탁셀-동시처리 종양(레인 4)의 처리 28일째에 절제된 마우스 종양 조직(그룹 당 3개 표본) 내 IAP1/2, XIAP, 서비빈, Bcl-2, Bax, 분열된 카스파제-9/카 스파제-9 및 분열된 카스파제-3/카스파제-3 발현의 웨스턴 블럿 분석을 나타낸다. 사진에서 각 그룹의 대표 표본이 염색되었다. 컬럼, 3마리 동물 절편의 평균, 막대, SD. ^* P<0.05, 대조군과의 통계적으로 유의적인 차이. 막대, 50 ㎛.Figure 7 shows the combined treatment effect of chiacremonone and docetaxel on xenograft animal models in vivo NF-κB protein and NF-κB regulatory protein. In FIG. 7 (A), the DNA binding activity of NF-κB was measured by EMSA in nucleus extracts from xenograft tumor specimens as described in the Examples. NF-κB protein (p65 and p50) expression was detected by western blotting with specific antibodies in cytochrome extracts from xenograft tumor specimens (three samples from each group) as described in the Examples. Immunohistochemical analyzes of p50 and p65 show inhibition of NF-κB protein expression in groups of animals treated with chiacremonone-alone or docetaxel in combination. Quantification of p50 and p65 reactive cells was measured as described in the Examples. 7 (B) and (C) show untreated tumors (lane 1), chiacremonone 1 mg / kg-treated tumors (lane 2), docetaxel 1 mg / kg tumors (lane 3) and chiacremonone and docetaxel- IAP1 / 2, XIAP, Survivin, Bcl-2, Bax, Split Caspase-9 / Caspase- in Mouse Tumor Tissue Resected at Day 28 of Co-Treated Tumor (Lane 4) 9 and Western blot analysis of cleaved caspase-3 / caspase-3 expression. Representative specimens of each group were stained in the photograph. Column, mean of three animal sections, rod, SD. ^* P <0.05, statistically significant difference from control. Rod, 50 μm.

Claims

Anticancer composition containing docetaxel and chiacremonone as active ingredients that inhibit proliferation of colon cancer cell lines SW 620 and HCT 116 through the inhibition of nuclear transcription factor-κB (NF-κB) activity

The method of claim 1, wherein the in vitro cancer cell proliferation inhibitory effective concentration of the anticancer drug composition is docetaxel as claimed docetaxel 5 nM, tooth Crescent monon 50 ㎍ / ml for the colon cancer cell line 2.5 X 10 ⁵ cell number / cm ² and Anticancer composition comprising chiacremonone as an active ingredient

According to claim 1 or 2, wherein the anticancer composition enhances the expression of apoptosis-inducing Bax, caspase-3, caspase-9 protein, Bcl-2, X chromosome IAP (xIAP) apoptosis inhibitory protein And anti-cancer composition comprising docetaxel and chiacremonone as active ingredients, which promote apoptosis of cancer cell lines by inhibiting cIAP-1 protein expression.

In the anticancer composition containing docetaxel and chiacremonone as active ingredients that inhibit cancer cell line proliferation through the inhibition of nuclear transcription factor-κB (NF-κB), the cancer cell line is a liver cancer cell line, gastric cancer cell line, lung cancer cell line or Anticancer composition characterized in that the prostate cancer cell line