KR20110046426A - Method for producing alpha-lipoic acid using lipoic acid synthesis associated enzymes - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 리포산 합성 관련 효소와 리포산 합성과 관련 있는 조효소를 이용한 알파-리포산의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 리포산 합성효소, 리포일 트랜스퍼레이즈와 리포산 단백질 리가제A, 및 이들을 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체를 이용한 알파-리포산의 제조방법에 관한 것이다. 또한 리포산 합셩과 관련 있는 조효소, 보다 상세하게는 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체 (Pyruvate Dehydrotenase Complex)와 철-황 클러스터 (Fe-S Cluster), 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체를 이용하여 알파-리포산의 생합성을 효과적으로 증가시키는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing alpha-lipoic acid using an enzyme related to lipoic acid synthesis and a coenzyme related to lipoic acid synthesis, and more particularly, to a lipoic acid synthase, lipoyl transferase and lipoic acid protein ligase A, and a nucleic acid encoding them. It relates to a molecule, a vector including the nucleic acid molecule, and a method for producing alpha-lipoic acid using a transformant including the vector. In addition, a coenzyme related to lipoic acid fusion, more specifically, a pyruvate dehydrotenase complex and an iron-sulfur cluster (Fe-S Cluster), a nucleic acid molecule encoding the same, a vector containing the nucleic acid molecule, It relates to a method for effectively increasing the biosynthesis of alpha-lipoic acid using a transformant comprising the vector.
알파-리포산은 간과 효모의 추출액에 함유된 미량성분으로 1951년 생화학자 리드 박사 (L.J. Reed)가 처음으로 이 미량의 성분을 간에서 분리하여 알파-리포산으로 명명한 이후 합성에 의해 그 구조가 확립되었으며, 젖산균의 발육인자라는 사실이 알려지면서 새로운 비타민으로 등장하였다. Alpha-lipoic acid is a trace component contained in liver and yeast extracts. In 1951, biochemist Dr. LJ Reed first separated this trace component from the liver and named it alpha-lipoic acid, and its structure was established by synthesis. As it became known that it is a growth factor of lactic acid bacteria, it appeared as a new vitamin.
알파-리포산은 피루베이트 및 기타 알파-케토산의 산화성 탈카르복실화에서 조효소(glucose-metabolizing pyruvate dehydrogenase)로서 작용하며(Packer L, et al. Medicine 19(2):227-250; 1995), 식물 및 동물의 모든 세포에 리포산염, 디하이드로리포산염으로 존재한다. Alpha-lipoic acid acts as a glucose-metabolizing pyruvate dehydrogenase in oxidative decarboxylation of pyruvate and other alpha-keto acids (Packer L, et al. Medicine 19(2):227-250; 1995), It is present in all cells of plants and animals as lipoate and dihydrolipoate.
알파-리포산은 폐내에서도 미량 합성되기는 하는데, 그 양은 충분하지 않고 나이가 들어감에 따라 그 생산량은 감소한다. 또 일반식품 중에는 조금밖에 함유되어 있지 않기 때문에 건강식품 등으로 섭취하는 것이 바람직하다. Alpha-lipoic acid is also synthesized in trace amounts in the lungs, but the amount is not sufficient and its production decreases with age. In addition, since it contains only a little in general foods, it is preferable to consume it as a health food.
알파-리포산의 항산화작용이 밝혀진 이후 주로 다른 항산화제(비타민류, L-카르니틴 등)와 배합제품이 많고, 피부미용 및 항노화, 혈당치 저하, 다이어트 효과를 나타내는 제품들이 많이 개발되었다. 그 이유는 알파-리포산이나 비타민을 단독으로 사용하는 경우보다 알파-리포산과 비타민의 조합이 증가된 활성, 즉 상승효과를 나타내기 때문이다(EP-A 0 572 922, Drug Metab Rev 1998;30(2):245-275, Arch Biochem Biophys 1999;363(1):148-154). Since the antioxidant activity of alpha-lipoic acid was discovered, there are a lot of products that are combined with other antioxidants (vitamins, L-carnitine, etc.), and many products have been developed that show skin beauty and anti-aging, blood sugar lowering, and diet effects. The reason is that the combination of alpha-lipoic acid and vitamin exhibits increased activity, that is, synergistic effect, compared to the case of using alpha-lipoic acid or vitamin alone (EP-A 0 572 922, Drug Metab Rev 1998;30( 2):245-275, Arch Biochem Biophys 1999;363(1):148-154).
연구에 따르면 항산화제가 활성산소를 없애는 과정에서 자신이 산화가 되고, 이는 다시 재활용되는 과정을 거쳐야 되는데 이 과정에서 다른 항산화제가 관여하다. 결국 항산화제 사이엔 상호작용과 시너지 효과를 갖고 있는 셈이고 복합제 복용이 치료 효율을 현저히 높여준다. 이러한 유용한 기능을 가지는 알파-리포산 및 그 염들은 오랜기간 식품에 첨가되거나 의약품에 많이 사용되고 있다. 뿐만 아니라 건강기능식품으로 사용되고 있으며, 음료 형태로도 사용되고 있다. 이러한 이유로 알파-리포산을 제조하기 위한 많은 연구가 진행되어 왔다.Research has shown that antioxidants are oxidized in the process of removing active oxygen, which must be recycled again, and other antioxidants are involved in this process. In the end, it has an interaction and synergy effect between antioxidants, and taking a combination drug significantly increases the treatment efficiency. Alpha-lipoic acid having such a useful function and its salts have been added to foods for a long time or are widely used in medicines. In addition, it is used as a health functional food, and it is also used as a beverage. For this reason, many studies have been conducted to prepare alpha-lipoic acid.
알파-리포산은 열안정성이 낮아 주로 이들의 염이 개발되어 산업적으로 생산되고 있다(EP-B 702953, EP-A947194, EP-B 702953 등). 그러나 알파-리포산의 생물학적인 생산 방법에 대해서는 현재까지 개발된 된 적이 없다는 점에 착안하여 본 발명을 하기에 이르렀다.Alpha-lipoic acid has low thermal stability and its salts are mainly developed and industrially produced (EP-B 702953, EP-A947194, EP-B 702953, etc.). However, the present invention came to the attention of the fact that the biological production method of alpha-lipoic acid has not been developed until now.
본 발명자들은 알파-리포산의 생물학적인 생산을 효율적으로 증가시키는 방법을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors have completed the present invention by identifying a method of efficiently increasing the biological production of alpha-lipoic acid.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 첫 번째 목적은 리포일 트랜스퍼레이즈의 유전자를 제공하는 것이다.The present invention solves the above problems and is conceived by the necessity of the above, and the first object of the present invention is to provide a lipoyl transferase gene.
본 발명의 두 번째 목적은 상기 유전자로부터 발현된 리포일 트랜스퍼레이즈효소를 제공하는 것이다.A second object of the present invention is to provide a lipoyl transferase enzyme expressed from the gene.
본 발명의 세 번째 목적은 상기 유전자로부터 발현된 리포일 트랜스퍼레이즈를 포함한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.A third object of the present invention is to provide a recombinant expression vector comprising lipoyl transferase expressed from the gene.
본 발명의 네 번째 목적은 형질전환된 재조합 대장균을 포함하는 모든 형질전환 균주를 제공하는 것이다.The fourth object of the present invention is to provide all transformed strains including the transformed recombinant E. coli.
본 발명의 다섯 번째 목적은 형질전환된 재조합 대장균을 이용한 재조합 리포일 트랜스퍼레이즈 효소를 제공하는 것이다.A fifth object of the present invention is to provide a recombinant lipoyl transferase enzyme using the transformed recombinant E. coli.
본 발명의 여섯 번째 목적은 대사 재설계를 통한 리포산 합성 효소를 모두 포함하고, 상기 유전자로부터 발현된 리포산 합성 효소를 모두 포함한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.A sixth object of the present invention is to provide a recombinant expression vector that includes all of the lipoic acid synthase through metabolic redesign, and includes all of the lipoic acid synthase expressed from the gene.
본 발명의 일곱 번째 목적은 형질전환된 재조합 대장균을 이용한 재조합 리포산 합성효소를 제공하는 것이다.The seventh object of the present invention is to provide a recombinant lipoic acid synthase using the transformed recombinant E. coli.
본 발명의 여덟 번째 목적은 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체와 철-황 클러스터의 유전자를 제공하는 것이다.The eighth object of the present invention is to provide a pyruvate dehydrogenase complex and an iron-sulfur cluster gene.
본 발명의 아홉 번째 목적은 상기 유전자로부터 발현된 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체와 철-황 클러스터 효소를 제공하는 것이다.The ninth object of the present invention is to provide a pyruvate dehydrogenase complex and an iron-sulfur cluster enzyme expressed from the gene.
본 발명의 열 번째 목적은 상기 유전자로부터 발현된 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체와 철-황 클러스터를 포함한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.The tenth object of the present invention is to provide a recombinant expression vector comprising a pyruvate dehydrogenase complex and an iron-sulfur cluster expressed from the gene.
본 발명의 열한 번째 목적은 형질전환된 재조합 대장균을 이용한 재조합 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체와 철-황 클러스터 효소를 제공하는 것이다.The eleventh object of the present invention is to provide a recombinant pyruvate dehydrogenase complex and an iron-sulfur cluster enzyme using transformed recombinant E. coli.
본 발명의 열두 번째 목적은 상기 모든 효소를 이용하여 옥탄산(octanoic acid)로부터 알파-리포산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.The twelfth object of the present invention is to provide a method for preparing alpha-lipoic acid from octanoic acid using all of the above enzymes.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent by the following detailed description, claims and drawings.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a)리포산 합성효소; b) 리포산 단백질 리가제A 효소; 및 c)리포일 트랜스퍼레이즈 효소를 이용한 알파-리포산 제조방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention is a) lipoic acid synthase; b) lipoic acid protein ligase A enzyme; And c) it provides a method for producing alpha-lipoic acid using a lipoyl transferase enzyme.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 리포산 합성효소는 서열번호 17의 아미노산 서열을 가지고, 상기 리포산 단백질 리가제A 효소는 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지며, 상기 리포일 트랜스퍼레이즈 효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the present invention, the lipoic acid synthase has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, the lipoic acid protein ligase A enzyme has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and the lipoyl transferase enzyme is SEQ ID NO: 4 It is preferable to have an amino acid sequence of, but is not limited thereto.
또한 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 제조방법은 a)피루베이트 디하이드로게네이즈, 및 b)철-황 클러스터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조 효소를 더욱 포함하는 것이 바람직하다.In addition, in a preferred embodiment of the present invention, the production method of the present invention preferably further comprises at least one crude enzyme selected from the group consisting of a) pyruvate dehydrogenase, and b) iron-sulfur cluster.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 피루베이트 디하이드로게네이즈는 서열번호 9, 10, 또는 11의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the present invention, pyruvate dehydrogenase preferably has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, 10, or 11, but is not limited thereto.
본 발명의 다른 일 구체예에 있어서, 철-황 클러스터는 서열번호 15, 또는 16의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In another embodiment of the present invention, the iron-sulfur cluster preferably has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or 16, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서 상기 제조방법은 옥탄산과 L-시스테인을 이용하여 알파-리포산을 생산하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In another embodiment of the present invention, the production method is preferably to produce alpha-lipoic acid using octanoic acid and L-cysteine, but is not limited thereto.
또한 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 리포일 트랜스퍼레이즈 효소를 제공한다.In addition, the present invention provides a lipoyl transferase enzyme having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
또 본 발명은 상기의 리포일 트랜스퍼레이즈 효소를 코딩하는 유전자를 제공하다. 상기의 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 유전자가 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.Further, the present invention provides a gene encoding the lipoyl transferase enzyme described above. The gene is preferably a gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
또 본 발명은 서열번호 9, 10, 또는 11의 아미노산 서열을 가지는 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체를 제공한다.In addition, the present invention provides a pyruvate dehydrogenase complex having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, 10, or 11.
또한 본 발명은 서열번호 15, 또는 16의 아미노산 서열을 가지는 철-황 클러스터를 제공한다.In addition, the present invention provides an iron-sulfur cluster having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or 16.
본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 제조방법은 옥탄산과 L-시스테인을 이용하여 알파-리포산을 생산하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the present invention, the production method is preferably to produce alpha-lipoic acid using octanoic acid and L-cysteine, but is not limited thereto.
또한 본 발명은 각각 서열번호 4; 서열번호 9, 10, 또는 11; 및 서열번호 15, 또는 16의 아미노산 서열 또는 그 기능적 단편을 가지는 리포일 트랜스퍼레이즈 효소, 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 및 철-황 클러스터를 제공한다.In addition, the present invention each SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 9, 10, or 11; And a lipoyl transferase enzyme having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or 16 or a functional fragment thereof, a pyruvate dehydrogenase complex, and an iron-sulfur cluster.
본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 리포일 트랜스퍼레이즈 효소는 슈도모나스 플로로센스에서 유래한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the present invention, the lipoyl transferase enzyme is preferably derived from Pseudomonas fluorosense, but is not limited thereto.
또한 본 발명의 바람직한 일 구체예에 있어서 리포일 트랜스퍼레이즈 효소는 알파-리포산 생산에 특이적인 것을 특징으로 한다.In addition, in a preferred embodiment of the present invention, the lipoyl transferase enzyme is characterized in that it is specific for the production of alpha-lipoic acid.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 리포일 트랜스퍼레이즈 효소의 분자량은 28 kDa인 것을 특징한다. In one embodiment of the present invention, the lipoyl transferase enzyme of the present invention has a molecular weight of 28 kDa.
본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체는 대장균 K12에서 유래한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the present invention, the pyruvate dehydrogenase complex is preferably derived from E. coli K12, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체 분자량은 각각, 100 kDa, 66 kDa, 또는 53 kDa인 것을 특징한다. 또한 본 발명은 본 발명의 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체를 코딩하는 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체 유전자를 제공한다.In one embodiment of the present invention, the molecular weight of the pyruvate dehydrogenase complex of the present invention is 100 kDa, 66 kDa, or 53 kDa, respectively. In addition, the present invention provides a pyruvate dehydrogenase complex gene encoding the pyruvate dehydrogenase complex of the present invention.
본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 철-황 클러스터는 대장균 K12에서 유래한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the present invention, the iron-sulfur cluster is preferably derived from E. coli K12, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 철-황 클러스터의 분자량은 각각, 45 kDa, 또는 14 kDa인 것을 특징한다. 또한 본 발명은 본 발명의 철-황 클러스터를 코딩하는 철-황 클러스터 유전자를 제공한다.In one embodiment of the present invention, the molecular weight of the iron-sulfur cluster of the present invention is characterized in that, respectively, 45 kDa, or 14 kDa. In addition, the present invention provides an iron-sulfur cluster gene encoding the iron-sulfur cluster of the present invention.
또한 본 발명은 본 발명의 상기 리포산 합성효소 유전자들을 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 균주를 배양하여 리포산 합성효소를 제조하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing a lipoic acid synthase by culturing a strain transformed with a recombinant expression vector containing the lipoic acid synthase genes of the present invention.
또한 본 발명은 본 발명의 상기 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 균주를 배양하여 리포산 합성효소를 제조하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing a lipoic acid synthase by culturing a strain transformed with a recombinant expression vector containing the pyruvate dehydrogenase complex of the present invention.
또한 본 발명은 본 발명의 상기 철-황 클러스터를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 균주를 배양하여 리포산 합성효소를 제조하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing a lipoic acid synthase by culturing the strain transformed with the recombinant expression vector containing the iron-sulfur cluster of the present invention.
또한 본 발명은 본 발명의 상기 리포산 합성 효소들과 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체와 철-황 클러스터 모두를 이용하여 옥탄산으로부터 알파-리포산을 제조하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for preparing alpha-lipoic acid from octanoic acid using both the lipoic acid synthase of the present invention, the pyruvate dehydrogenase complex, and the iron-sulfur cluster.
이하, 본 발명을 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described.
본 발명의 리포일 트랜스퍼레이즈 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터는 각각 서열번호 4; 서열번호 9, 10, 또는 11; 및 서열번호 15, 또는 16으로 표시되는 아미노산서열을 가진 것을 특징으로 한다. 또, 각각 서열번호 4; 서열번호 9, 10, 또는 11; 및 서열번호 15, 또는 16으로 표시되는 아미노산서열에 대해서, 이들 아미노산서열을 가진 단백질이 표시하는 트랜스퍼레이즈 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 활성이 손상되지 않는 범위 내에서, 1이상의 아미노산의 결실, 치환 및 부가의 적어도 1종의 변이가 도입된 변이 효소도 본 발명에 관한 리포일 트랜스퍼레이즈 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터에 포함된다.The lipoyl transferase gene of the present invention, the pyruvate dehydrogenase complex, and the iron-sulfur cluster are each of SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 9, 10, or 11; And an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 or 16. In addition, each of SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 9, 10, or 11; And with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 or 16, within a range in which the transferase gene and pyruvate dehydrogenase complex, iron-sulfur cluster activity indicated by the protein having these amino acid sequences are not impaired, 1 Mutant enzymes into which at least one mutation of the above amino acids has been deleted, substituted, and added are also included in the lipoyl transferase gene, pyruvate dehydrogenase complex, and iron-sulfur cluster according to the present invention.
또, 본 발명에는 리포일 트랜스퍼레이즈 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체가 포함된다. Further, the present invention includes a lipoyl transferase gene and a pyruvate dehydrogenase complex, a recombinant vector containing an iron-sulfur cluster gene, and a transformant transformed with the recombinant vector.
또한, 본 발명에는 이 형질전환체를 배양하여 얻게 되는 배양물로부터 리포일 트랜스퍼레이즈 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터의 제조방법이 포함된다.In addition, the present invention includes a method for producing a lipoyl transferase gene, a pyruvate dehydrogenase complex, and an iron-sulfur cluster from a culture obtained by culturing this transformant.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 리포일 트랜스퍼레이즈 유전자는 슈도모나스 플로로센스의 균체로부터 분리된 것이며, 본 발명의 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터는 대장균 K12의 균체로부터 분리된 것이다. The lipoyl transferase gene of the present invention is isolated from the cells of Pseudomonas fluorosense, and the pyruvate dehydrogenase complex, iron-sulfur cluster of the present invention is isolated from the cells of E. coli K12.
각각 서열번호 3와 서열번호 4에는 본 발명의 리포일 트랜스퍼레이즈 효소 유전자의 염기서열과 그 아미노산 서열을, 표시하나, 앞서 설명한 바와 같이, 상기 아미노산서열을 가진 폴리펩티드가 리포일 트랜스퍼레이즈 효소 활성을 가지는 한, 몇 가지의, 예를 들면 1 또는 수개의 아미노산에 대해서 결실, 치환, 부가 등의 변이가 있어도 된다.In SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively, the nucleotide sequence of the lipoyl transferase gene of the present invention and its amino acid sequence are indicated, but as described above, the polypeptide having the amino acid sequence has lipoyl transferase activity. As long as there may be mutations such as deletion, substitution, addition, etc. for several, for example, one or several amino acids.
각각 서열번호 9, 10, 또는 11에는 본 발명의 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체의 아미노산서열을 표시하나, 앞서 설명한 바와 같이, 상기 아미노산서열을 가진 폴리펩티드가 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 효소 활성을 가지는 한, 몇 가지의, 예를 들면 1 또는 수개의 아미노산에 대해서 결실, 치환, 부가 등의 변이가 있어도 된다. Each of SEQ ID NOs: 9, 10, or 11 shows the amino acid sequence of the pyruvate dehydrogenase complex of the present invention, but as described above, the polypeptide having the amino acid sequence is the pyruvate dehydrogenase complex, iron-sulfur As long as it has cluster enzyme activity, there may be mutations such as deletion, substitution, addition, etc. for several, for example, one or several amino acids.
또, 재조합벡터에는, 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는, 균체밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 또 가진 것도 가능하다.In addition, in the recombinant vector, a fragment for inhibiting expression having various functions for suppressing or amplifying or inducing expression, a marker for selection of a transformant, a resistance gene for antibiotics, or secretion outside the cell body It is also possible to have a gene that encodes a signal for the purpose of.
본 발명에 관한 리포일 트랜스퍼레이즈 효소 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 효소의 제조는, 예를 들면, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 리포일 트랜스퍼레이즈 효소 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 효소를 생성축적시켜, 배양물로부터 상기 효소를 취득함으로써 행하여진다.The production of the lipoyl transferase gene, the pyruvate dehydrogenase complex, and the iron-sulfur cluster enzyme according to the present invention is, for example, a transformation obtained by transforming a host with a recombinant vector having a gene encoding the same. After culturing the sieve, the lipoyl transferase enzyme gene, which is a gene product, and the pyruvate dehydrogenase complex, and the iron-sulfur cluster enzyme are generated and accumulated in the culture (cultured cells or culture supernatant) to obtain the enzyme from the culture. It is done by doing.
본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.As a method of culturing the transformant of the present invention, a conventional method used for culturing a host may be used.
또 배양방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다.대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지,NB배지 등을 들 수 있다. 또, 배양온도는 상기 언급한 적온의 범위에서 배양함으로써 리포일 트랜스퍼레이즈 효소 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 효소를 균체 내에 축적시키고, 회수한다. In addition, as the cultivation method, any method used for culturing ordinary microorganisms, such as a batch type, a flow batch type, a continuous culture type, a reactor type, etc., can be used. A transformant obtained by using bacteria such as E. coli as a host can be used. Examples of the culture medium for cultivation include complete medium or synthetic medium, such as LB medium and NB medium. Further, the culture temperature is in the range of the above-mentioned appropriate temperature to accumulate and recover the lipoyl transferase gene, the pyruvate dehydrogenase complex, and the iron-sulfur cluster enzyme in the cells.
또, 프로모터가 유도성의 발현벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는, 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌아크릴산(IAA) 등을 유도물질로서 들 수 있다.In addition, in the case of culturing a microorganism transformed using an inducible expression vector with a promoter, an inducer suitable for the type of promoter may be added to the medium. For example, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), tetracycline, indoleacrylic acid (IAA), and the like are mentioned as inducers.
리포일 트랜스퍼레이즈 효소 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 효소의 취득은, 얻게 되는 배양물 중으로부터, 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피, 겔여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다.To obtain the lipoyl transferase gene, pyruvate dehydrogenase complex, and iron-sulfur cluster enzyme, the cells or supernatant are centrifugally recovered from the obtained culture, and the cells are crushed, extracted, affinity chromatography, cation. Alternatively, anion exchange chromatography, gel filtration, or the like can be performed alone or in an appropriate combination.
얻게 된 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드겔전기영동, 웨스턴블로팅등에 의해 행할 수 있다.Confirmation that the obtained purified material is the target enzyme can be performed by a conventional method, for example, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, western blotting, or the like.
또한, 숙주로서 미생물을 사용한 형질전환체의 배양, 형질전환체에 의한 리포일 트랜스퍼레이즈 효소 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 효소의 생산과 균체내에의 축적, 및, 균체로부터의 리포일 트랜스퍼레이즈 효소 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 효소의 회수는, 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.In addition, cultivation of transformants using microorganisms as a host, lipoyl transferase gene and pyruvate dehydrogenase complex by transformants, production of iron-sulfur cluster enzymes and accumulation in cells, and from cells Recovery of the lipoyl transferase gene, pyruvate dehydrogenase complex, and iron-sulfur cluster enzyme of is not limited to the above method.
본 발명자는 알파-리포산의 생물학적인 생산을 할 수 있는 효소를 개발하고자 슈도모나스 플로로센스로부터 리포일 트랜스퍼레이즈 효소 유전자를 클로닝하였고, 대장균 K12로부터 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체와 철-황 클러스터 유전자를 클로닝하였다. 전기 유전자를 삽입한 재조합 균주가 옥탄산으로부터 알파-리포산을 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 부산물의 생성을 크게 감소시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.The present inventor cloned the lipoyl transferase enzyme gene from Pseudomonas fluorosense to develop an enzyme capable of biological production of alpha-lipoic acid, and cloned the pyruvate dehydrogenase complex and the iron-sulfur cluster gene from E. coli K12. It was cloned. It was confirmed that the recombinant strain into which the electric gene was inserted can not only produce alpha-lipoic acid from octanoic acid, but also can greatly reduce the generation of by-products, and the present invention was completed.
본 발명은 산업적으로 유용한 생물학적 생산을 하기 위하여 슈도모나스 플로로센스의 유전자로부터 리포일 트랜스퍼레이즈 효소 유전자를 클로닝하고, 대장균 K12로부터 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체와 철-황 클러스터 유전자를 클로닝하였다. 상기 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 분석한다. The present invention cloned the lipoyl transferase gene from the gene of Pseudomonas fluorosense for industrially useful biological production, and cloned the pyruvate dehydrogenase complex and the iron-sulfur cluster gene from E. coli K12. The nucleotide sequence of the gene and the amino acid sequence deduced therefrom are analyzed.
본 발명의 리포일 트랜스퍼레이즈 효소와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체와 철-황 클러스터 유전자는 옥탄산을 기질로 하여 알파-리포산을 형성하는 효소, 또는 조효소로서, 보다 바람직하게는 옥탄산을 알파-리포산으로 전환시킬 수 있는 능력을 갖는 리포일 트랜스퍼레이즈 효소와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터를 의미한다.The lipoyl transferase enzyme of the present invention, the pyruvate dehydrogenase complex, and the iron-sulfur cluster gene are enzymes or coenzymes that form alpha-lipoic acid using octanoic acid as a substrate, and more preferably, octanoic acid is alpha- It refers to a lipoyl transferase enzyme, a pyruvate dehydrogenase complex, and an iron-sulfur cluster having the ability to convert to lipoic acid.
본 발명의 리포일 트랜스퍼레이즈 효소는 분자량이 약 28kDa이며, 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체 분자량은 각각, 100 kDa, 66 kDa, 또는 53 kDa이고, 철-황 클러스터의 분자량은 각각, 45 kDa, 또는 14 kDa이다. The lipoyl transferase enzyme of the present invention has a molecular weight of about 28 kDa, the pyruvate dehydrogenase complex molecular weight is 100 kDa, 66 kDa, or 53 kDa, respectively, and the molecular weight of the iron-sulfur cluster is 45 kDa, or It is 14 kDa.
본 발명의 리포산 생합성 관련 효소와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 유전자를 함께 발현시켰을 때 알파-리포산의 생산이 효율적으로 증가하였다.When the lipoic acid biosynthesis-related enzyme of the present invention, the pyruvate dehydrogenase complex, and the iron-sulfur cluster gene were expressed together, the production of alpha-lipoic acid was efficiently increased.
본 발명의 리포산 생합성 관련 효소와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 유전자는 옥탄산으로부터 알파-리포산 합성을 촉매한다. 따라서 알파-리포산 합성에 사용되는 상기 효소들은 매우 적합하다 할 것이며, 옥탄산으로부터 알파-리포산 생산에 유용하게 적용될 것이다.
The enzyme related to lipoic acid biosynthesis of the present invention, the pyruvate dehydrogenase complex, and the iron-sulfur cluster gene catalyze the synthesis of alpha-lipoic acid from octanoic acid. Therefore, the enzymes used in the synthesis of alpha-lipoic acid will be very suitable and will be usefully applied to the production of alpha-lipoic acid from octanoic acid.
본 발명의 리포산의 생물학적 합성방법에 의해 생산된 알파-리포산은 항산화제, 피부미용 및 항노화, 혈당치 저하 및 다른 많은 치료용 제재의 합성에 있어서 중요하다. 알파-리포산은 유용한 당뇨병, 심장병 치료제로 쓰이고 있다. 따라서 대사 재설계와 리포산 합성에 관련된 조효소를 이용한 알파-리포산의 생산 방법은 생물학적인 생산을 위한 기본 단계로서 중요하게 작용할 것이다.Alpha-lipoic acid produced by the biological synthesis method of lipoic acid of the present invention is important in the synthesis of antioxidants, skin care and anti-aging, lowering blood sugar levels, and many other therapeutic agents. Alpha-lipoic acid is used as a useful diabetes and heart disease treatment. Therefore, the production method of alpha-lipoic acid using coenzymes involved in metabolic redesign and lipoic acid synthesis will play an important role as a basic step for biological production.
도 1은 슈도모나스 플로로센스 균주로부터 유래된 리포산 합성에 관련된 효소들의 기작을 나타내는 도면이다.
도 2는 슈도모나스 플로로센스 균주로부터 유래된 리포일 트랜스퍼레이즈 유전자를 포함하는 발현벡터의 제조방법을 나타내는 도면이다.
도 3은 대장균 K12 균주로부터 유래된 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체(pyruvate dehydrogenase complex)를 포함하는 발현벡터의 제조방법을 나타내는 도면이다.
도 4는 대장균 K12 균주로부터 유래된 철-황 클러스터(Fe-S cluster)를 포함하는 발현벡터의 제조방법을 나타내는 도면이다.
도 5는 슈도모나스 플로로센스 균주로부터 유래된 리포산 합성에 관련된 효소들의 대사 재설계 과정을 통하여 만들어진 각각의 발현벡터의 제조방법을 나타내는 도면이다.1 is a diagram showing the mechanism of enzymes involved in the synthesis of lipoic acid derived from Pseudomonas fluorosense strain.
2 is a diagram showing a method for preparing an expression vector containing a lipoyl transferase gene derived from a Pseudomonas fluorosense strain.
3 is a diagram showing a method of preparing an expression vector containing a pyruvate dehydrogenase complex derived from E. coli K12 strain.
Figure 4 is a diagram showing a method for producing an expression vector containing an iron-sulfur cluster (Fe-S cluster) derived from the E. coli K12 strain.
5 is a diagram showing a method of preparing each expression vector made through a process of metabolic redesign of enzymes related to the synthesis of lipoic acid derived from a Pseudomonas fluorosense strain.
이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하나, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail by the following examples, but the present invention is not limited to the examples.
실시예Example 1: One: 리포일Repoil 트랜스퍼레이즈Transferase 효소의 유전자 Enzyme gene 클로닝Cloning
슈도모나스 플로로센스(ATCC BAA-447,American Type Culture Collection, 미국)를 30℃에서 배양하고, 원심분리(8000g, 10분)하여 균체를 수득하였다. 전기 수득된 균체로부터 게놈 DNA를 분리하고, 슈도모나스 플로로센스 리포일 트랜스퍼레이즈 효소를 암호화하는 유전자의 염기서열을 이용하여 프라이머 lipB-F-BamHI F-5'ATA TGG ATC CAT GCC ACA GAC GCT GGG -3'(서열번호 1)와 lipB-R-HindIII R-5'CGC TAA GCT TGT CGA TTC CGC CCG -3'(서열번호 2)를 제작하여 PCR을 행하였다. PCR 산물 즉, 슈도모나스 플로로센스에서 증폭된 리포일 트랜스퍼레이즈 효소를 포함한 유전자(서열번호 3)를 pGEM T-easy 벡터에 삽입하여 염기서열을 분석하였다.
Pseudomonas fluorosense (ATCC BAA-447, American Type Culture Collection, USA) was cultured at 30° C. and centrifuged (8000 g, 10 minutes) to obtain cells. Genomic DNA was isolated from the previously obtained cells, and primers lipB-F-BamHI F-5'ATA TGG ATC CAT GCC ACA GAC GCT GGG- 3'(SEQ ID NO: 1) and lipB-R-HindIII R-5'CGC TAA GCT TGT CGA TTC CGC CCG-3' (SEQ ID NO: 2) were prepared and PCR was performed. The PCR product, that is, a gene (SEQ ID NO: 3) containing the lipoyl transferase enzyme amplified from Pseudomonas fluorosense, was inserted into the pGEM T-easy vector to analyze the base sequence.
실시예Example 2: 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조와 효소의 발현 2: Preparation of recombinant expression vectors and recombinant strains and expression of enzymes
실시예 1에 따른 리포일 트랜스퍼레이즈 효소를 암호화하는 유전자를 이용하여, 리포일 트랜스퍼레이즈 효소를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pQE80L(Qiagen, 미국) BamHⅠ과 HindⅢ 부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 K12(NEB, 영국)에 형질 전환시켰다 (도 2, 서열번호 4).Using the gene encoding the lipoyl transferase enzyme according to Example 1, in order to express the lipoyl transferase enzyme in large quantities in E. coli, the enzyme gene was inserted into the expression vector pQE80L (Qiagen, USA) BamHI and HindIII sites. Then, it was transformed into E. coli K12 (NEB, UK) (Fig. 2, SEQ ID NO: 4).
상기 실시예에서 재조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 SDS-PAGE 젤, 웨스턴 블랏에서 발현된 단백질을 확인하였다.
The recombinant strain prepared in the above example was inoculated into LB medium and cultured at 37° C. for 24 hours, and then the protein expressed in SDS-PAGE gel and Western blot was confirmed.
실시예 3: 대사 재설계에 의한 리포산 합성 효소들의 유전자 클로닝 , 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조 Example 3: Gene Cloning of Lipoic Acid Synthetic Enzymes by Metabolic Redesign , Preparation of Recombinant Expression Vector and Recombinant Strain
슈도모나스 플로로센스에서의 알파-리포산 생산 관련 효소인 리포산합성 효소 (lipA), 리포일 트랜스퍼레이즈 (lipB), 리포산 단백질 라가제A(lplA)들을 대사 재설계 하기 위하여 각각 PCR을 행하였다. 서열번호 5은 리보솜 결합 위치(ribosomal binding site)를 포합한 프라이머다. 얻어진 DNA 단편은 상기 실시예2 와 같이 실시하고, 또한 상기 유전자를 이용하여, 리포산 생산 효소들을 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pQE80L(Qiagen, 미국)에 상기 효소 유전자인 리포산합성 효소 (lipA) 유전자(서열번호 19)와 리포산 단백질 라가제A(lplA)유전자(서열번호 20)를 삽입한 후 재조합 벡터 pQE80L lipB/lipA, pQE80L lplA/lipB, pQE80L lipA/lplA, pQE80L lplA/lipA, pQE80L lplA/lipB/lipA, pQE80L lplA/lipA/lipB를 제조하고, 대장균 K12(NEB, 영국)에 형질 전환시켰다. In order to redesign the metabolism of lipoic acid synthase (lipA), lipoyl transferase (lipB), and lipoic acid protein lagase A (lplA), which are enzymes related to alpha-lipoic acid production in Pseudomonas fluorosense, PCR was performed respectively. SEQ ID NO: 5 is a primer containing a ribosomal binding site. The obtained DNA fragment was carried out in the same manner as in Example 2, and in order to express the lipoic acid-producing enzymes in E. coli in large quantities using the gene, the enzyme gene lipoic acid synthase (lipA) was added to the expression vector pQE80L (Qiagen, USA). ) After inserting the gene (SEQ ID NO: 19) and the lipoic acid protein Lagase A (lplA) gene (SEQ ID NO: 20), the recombinant vectors pQE80L lipB/lipA, pQE80L lplA/lipB, pQE80L lipA/lplA, pQE80L lplA/lipA, pQE80L lplA /lipB/lipA, pQE80L lplA/lipA/lipB was prepared and transformed into E. coli K12 (NEB, UK).
상기 실시예의 대표적인 내용은 도 3에 나타내었다.
Representative contents of the above embodiment are shown in FIG. 3.
실시예Example 4: 4: 피루베이트Pyruvate 디하드로게네이즈Dihadrogenease 복합체 효소의 유전자 Complex enzyme gene 클로닝Cloning
대장균 K12(NEB, 영국)를 37℃에서 배양하고, 원심분리(8000g, 10분)하여 균체를 수득하였다. 전기 수득된 균체로부터 게놈 DNA를 분리하고, 대장균 피루베이트 디하이드로게네이즈를 암호화하는 유전자의 염기서열을 이용하여 프라이머 PDC-F-NcoI F-5' ATA TCC ATG GAT GTC AGA ACG TTT CCC AAA -3'(서열번호 6)와 PDC-R-XhoI R-5' TAA TCT CGA GTT ACT TCT TCT TCG CTT TCG G -3'(서열번호 7)를 제작하여 PCR을 행하였다. PCR 산물 즉, 대장균 K12에서 증폭된 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체 효소를 포함한 유전자를 pGEM T-easy 벡터에 삽입하여 염기서열을 분석하였다(서열번호 8).서열번호 8은 3가지 종류의 피루베이트 디하이드로게네이즈 단백질을 코딩하는 유전자[E1(서열번호 21), E2(서열번호 22) 및 E3(서열번호 23)]가 동시에 삽입되어 있는 것이다. 즉 유전자를 클로닝할 때 genome 내에 존재하는 3가지 종류의 단백질을 한꺼번에 얻어서 expression vector에 full로 넣은 뒤 발현시킨 것이다.
E. coli K12 (NEB, UK) was incubated at 37°C and centrifuged (8000 g, 10 minutes) to obtain cells. Genomic DNA was isolated from the previously obtained cells, and primers PDC-F-NcoI F-5' ATA TCC ATG GAT GTC AGA ACG TTT CCC AAA -3 using the nucleotide sequence of the gene encoding E. coli pyruvate dehydrogenase. '(SEQ ID NO: 6) and PDC-R-XhoI R-5' TAA TCT CGA GTT ACT TCT TCT TCG CTT TCG G -3' (SEQ ID NO: 7) was prepared and PCR was performed. The PCR product, that is, the gene containing the pyruvate dehydrogenase complex enzyme amplified in E. coli K12, was inserted into the pGEM T-easy vector to analyze the base sequence (SEQ ID NO: 8). SEQ ID NO: 8 represents three types of pyruvate Genes encoding the dehydrogenase protein [E1 (SEQ ID NO: 21), E2 (SEQ ID NO: 22) and E3 (SEQ ID NO: 23)) are simultaneously inserted. In other words, when cloning a gene, three kinds of proteins present in the genome were obtained at once, filled into an expression vector, and then expressed.
실시예Example 5: 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조 5: Recombinant expression vector and recombinant strain preparation
실시예 4에 따른 피루베이트 디하드로게네이즈 복합체 효소를 암호화하는 유전자를 이용하여, 피루베이트 디하드로게네이즈 복합체 효소를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pCOLA duet(Novagen, 독일) NcoI과 XhoI 부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 K12(NEB, 영국)에 형질 전환시켰다 (도 4, 서열번호 9, 10, 11).Using the gene encoding the pyruvate dehydrogenase complex enzyme according to Example 4, in order to express the pyruvate dehydrogenase complex enzyme in large quantities in E. coli, the expression vector pCOLA duet (Novagen, Germany) NcoI The enzyme gene was inserted into the and XhoI sites, and then transformed into E. coli K12 (NEB, UK) (Fig. 4, SEQ ID NOs: 9, 10, 11).
상기 실시예에서 재조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 SDS-PAGE 젤에서 발현된 단백질을 확인하였다.
The recombinant strain prepared in the above example was inoculated into LB medium and cultured at 37° C. for 24 hours, and then the protein expressed on the SDS-PAGE gel was confirmed.
실시예Example 6: 철-황 클러스터 효소의 유전자 6: Gene of the iron-sulfur cluster enzyme 클로닝Cloning
대장균 K12(NEB, 영국)를 37℃에서 배양하고, 원심분리(8000g, 10분)하여 균체를 수득하였다. 전기 수득된 균체로부터 게놈 DNA를 분리하고, 대장균 철-황 클러스터를 암호화하는 유전자의 염기서열을 이용하여 프라이머 IscS-F-HindIII F-5' CGA CAA GCT TAT GAA ATT ACC GAT TTA TCT CGA C -3'(서열번호 12)와 IscU-R- ClaI R-5'AGA GAT CGA TTT TTG CTT CAC GTT TGC TTT TAT A -3'(서열번호 13)를 제작하여 PCR을 행하였다. PCR 산물 즉, 대장균 K12에서 증폭된 철-황 클러스터 효소를 포함한 유전자(서열번호 14)를 pGEM T-easy 벡터에 삽입하여 염기서열을 분석하였다. 서열번호 8번과 마찬가지로 서열번호 14는 2개의 유전자[iscS(서열번호 24)와 iscU(서열번호 25)]를 한번에 full로 genome으로부터 증폭하여 염기서열을 분석하였고, 이것을 발현벡터에 넣어 발현을 시키면 2종류의 철-황 클러스터 효소가 발현되게 된다.
E. coli K12 (NEB, UK) was incubated at 37°C and centrifuged (8000 g, 10 minutes) to obtain cells. Genomic DNA was isolated from the previously obtained cells, and primer IscS-F-HindIII F-5' CGA CAA GCT TAT GAA ATT ACC GAT TTA TCT CGA C -3 using the nucleotide sequence of the gene encoding the E. coli iron-sulfur cluster '(SEQ ID NO: 12) and IscU-R-Clai R-5'AGA GAT CGA TTT TTG CTT CAC GTT TGC TTT TAT A-3' (SEQ ID NO: 13) was prepared and PCR was performed. The PCR product, that is, the gene (SEQ ID NO: 14) containing the iron-sulfur cluster enzyme amplified in E. coli K12 was inserted into the pGEM T-easy vector to analyze the base sequence. Like SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14 amplifies two genes [iscS (SEQ ID NO: 24) and iscU (SEQ ID NO: 25)] in full from the genome to analyze the base sequence. Two types of iron-sulfur cluster enzymes are expressed.
실시예Example 7: 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조 7: Recombinant expression vector and recombinant strain preparation
실시예 6에 따른 철-황 클러스터 효소를 암호화하는 유전자를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pPRO Lar. A122 (Takara, 일본) HindⅢ과 ClaⅠ 부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 K12(NEB, 영국)에 형질 전환시켰다 (도 5, 서열목록 15, 16).In order to express the gene encoding the iron-sulfur cluster enzyme according to Example 6 in large quantities in E. coli, the expression vector pPRO Lar. A122 (Takara, Japan) The enzyme gene was inserted into the HindIII and ClaI sites, and then transformed into E. coli K12 (NEB, UK) (FIG. 5, SEQ ID NO: 15, 16).
상기 실시예에서 재조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 SDS-PAGE 젤에서 발현된 단백질을 확인하였다.
The recombinant strain prepared in the above example was inoculated into LB medium and cultured at 37° C. for 24 hours, and then the protein expressed on the SDS-PAGE gel was confirmed.
실시예Example 8: 대사 재설계를 한 리포산 합성 효소들을 이용한 알파-리포산 생산 방법 8: Alpha-lipoic acid production method using metabolic redesigned lipoic acid synthase
상기 실시예 3에서 발현시킨 리포산 생합성 관련 효소들을 이용하여 알파-리포산의 생산실험을 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 리포산 생합성 관련 효소들을 이용하는 본 발명의 알파-리포산 생산방법에서, 초기 기질인 옥탄산의 농도 1mM, L-시스테인을 0.2mM로 사용하여 알파-리포산의 생산농도를 확인하였다.Using the lipoic acid biosynthesis-related enzymes expressed in Example 3, the production experiment of alpha-lipoic acid was performed under the following conditions. In the method for producing alpha-lipoic acid of the present invention using enzymes related to lipoic acid biosynthesis, the production concentration of alpha-lipoic acid was confirmed by using the initial substrate, octanoic acid at a concentration of 1 mM and L-cysteine at 0.2 mM.
600nm에서의 흡광도가 0.6이 될 때, 0.1mM ITPG를 첨가하여 효소 생산을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 16℃로 유지하였다.When the absorbance at 600 nm reached 0.6, 0.1 mM ITPG was added to induce enzyme production. During the above process, the stirring speed was maintained at 200 rpm and the culture temperature was maintained at 16°C.
균 배양 방법은 실시예 3과 같이 수행하였으며, 그 결과는 표 1에 나타내었다. 표 1에 나타난 바와 같이, 대사 재설계를 통해 리포산 생산효소를 같이 발현 시켰을 때, 알파-리포산 생산농도는 202.6㎍ g-cell- 1 이었다. The bacteria culture method was performed as in Example 3, and the results are shown in Table 1. As shown in Table 1, when the lipoic acid-producing enzyme was simultaneously expressed through metabolic redesign, the alpha-lipoic acid production concentration was 202.6㎍ g-cell - 1 .
실시예 9: 대사 재설계를 통한 리포산 합성 효소들과 피루베이트 디하이드로게네이즈를 이용한 알파-리포산 생산 방법 Example 9: Lipoic acid synthase and pyruvate through metabolic redesign Alpha-lipoic acid production method using dehydrogenase
리포산 생합성 효소들과 리포산 생합성에 관련된 조효소를 이용하는 본 발명의 알파-리포산 생산방법에서, 피루베이트 디하이드로게네이즈 효소가 알파-리포산 생산에 미치는 영향에 대해서 확인하였다. 균 배양과 알파-리포산 생산 방법은 실시예 8과 같이 수행하였으며, 그 결과는 표 2에 나타내었다.In the alpha-lipoic acid production method of the present invention using lipoic acid biosynthesis enzymes and coenzymes related to lipoic acid biosynthesis, the effect of pyruvate dehydrogenase enzyme on alpha-lipoic acid production was confirmed. The bacteria culture and the alpha-lipoic acid production method were performed as in Example 8, and the results are shown in Table 2.
피루베이트 디하이드로게네이즈 효소는 리포일 트랜스퍼레이즈 효소의 조효소로서 작용하는데, 피루베이트 디하이드로게네이즈의 E2 도메인을 octanoyl-ACP에 부착시킴으로 다음 단계의 효소인 리포산 생산효소의 기질로 작용하게끔 도와준다.따라서 피루베이트 디하이드로게네이즈는 재조합 리포일 트랜스퍼레이즈가 존재할 때에 알파-리포산의 생산에 영향을 미친다.Pyruvate dehydrogenase enzyme acts as a coenzyme of lipoyl transferase enzyme. By attaching the E2 domain of pyruvate dehydrogenase to octanoyl-ACP, it helps to act as a substrate for the next enzyme, lipoic acid-producing enzyme. Therefore, pyruvate dehydrogenase affects the production of alpha-lipoic acid in the presence of recombinant lipoyl transferase.
표 2에 나타난 바와 같이, 알파-리포산의 생산은 피루베이트 디하이드로게네이즈를 같이 발현 시켰을 때에는 같이 발현시키지 않았을 때보다 최저 30% 정도 알파-리포산의 생산이 증가하였다. 피루베이트 디하이드로게네이즈를 같이 발현 시켰을 때 알파-리포산의 최고 생산농도는 231.4㎍ g-cell- 1 이었다. 이러한 최종 농도는 재조합 균주를 첨가하지 않은 대조군에 비해 알파-리포산의 생물학적 생산에서 우수한 수치이다. As shown in Table 2, the production of alpha-lipoic acid increased the production of alpha-lipoic acid by at least 30% when pyruvate dehydrogenase was expressed together compared to when not expressed together. When pyruvate dehydrogenase was simultaneously expressed, the highest production concentration of alpha-lipoic acid was 231.4㎍ g-cell - 1 . This final concentration is superior to the control group to which the recombinant strain was not added in the biological production of alpha-lipoic acid.
실시예 10: 리포산 합성 효소 및 철-황 클러스터를 이용한 대사 재설계에 의한 알파-리포산 생산 방법 Example 10: Method for producing alpha-lipoic acid by metabolic redesign using lipoic acid synthase and iron-sulfur cluster
리포산 생합성 효소들과 리포산 생합성에 관련된 조효소를 이용하는 본 발명의 알파-리포산 생산방법에서, 철-황 클러스터가 알파-리포산 생산에 미치는 영향에 대해서 확인하였다. 균 배양과 알파-리포산 생산 방법은 실시예 8과 같이 수행하였으며, 그 결과는 표 3에 나타내었다.In the alpha-lipoic acid production method of the present invention using lipoic acid biosynthesis enzymes and coenzymes related to lipoic acid biosynthesis, the effect of iron-sulfur clusters on alpha-lipoic acid production was confirmed. The bacteria culture and the alpha-lipoic acid production method were performed as in Example 8, and the results are shown in Table 3.
철-황 클러스터는 리포산 생산 효소의 조효소로서 작용하는데, 철-황 클러스터는 리포산 생산 효소의 작용 전자를 전달하는 과정에 관여하여, 최종적으로 알파-리포산 합성을 하게 한다. 따라서 철-황 클러스터는 재조합 리포산 생산 효소가 존재할 때에 알파-리포산의 생산에 영향을 미친다.The iron-sulfur cluster acts as a coenzyme of the lipoic acid-producing enzyme, and the iron-sulfur cluster is involved in the process of transferring the action electrons of the lipoic acid-producing enzyme, and finally causes the synthesis of alpha-lipoic acid. Thus, the iron-sulfur cluster affects the production of alpha-lipoic acid in the presence of a recombinant lipoic acid producing enzyme.
표 3에 나타난 바와 같이, 알파-리포산의 생산은 철-황 클러스터를 같이 발현 시켰을 때, 알파-리포산 생산농도는 560.2㎍ g-cell- 1 이었다. 이러한 최종 농도는 재조합 균주를 첨가하지 않은 대조군에 비해 알파-리포산의 생물학적 생산에서 우수한 수치이다. As shown in Table 3, when the production of alpha-lipoic acid expressed iron-sulfur cluster together, the production concentration of alpha-lipoic acid was 560.2 µg g-cell - 1 . This final concentration is superior to the control group to which the recombinant strain was not added in the biological production of alpha-lipoic acid.
실시예 11: 리포산 합성 효소, 피루베이트 디하이드로게네이즈 , 철-황 클러스터를 이용한 대사 재설계에 의한 알파-리포산 생산 방법 Example 11: Lipoic acid synthase, pyruvate Alpha-lipoic acid production method by metabolic redesign using dehydrogenase and iron-sulfur clusters
리포산 생합성 효소들과 리포산 생합성에 관련된 조효소를 이용하는 본 발명의 알파-리포산 생산방법에서, 피루베이트 디하이드로게네이즈, 철-황 클러스터가 함께 알파-리포산 생산에 미치는 영향에 대해서 확인하였다. 균 배양과 알파-리포산 생산 방법은 실시예 4와 같이 수행하였으며, 그 결과는 표 4에 나타내었다.In the alpha-lipoic acid production method of the present invention using lipoic acid biosynthetic enzymes and coenzymes related to lipoic acid biosynthesis, the effects of pyruvate dehydrogenase and iron-sulfur clusters on alpha-lipoic acid production were confirmed. The bacteria culture and the alpha-lipoic acid production method were performed as in Example 4, and the results are shown in Table 4.
표 4에 나타난 바와 같이, 알파-리포산의 생산은 피루베이트 디하이드로게네이즈, 철-황 클러스터를 같이 발현 시켰을 때, 알파-리포산 생산농도는 677.5㎍ g-cell-1 이었다. 이러한 최종 농도는 알파-리포산의 생물학적 생산에서 우수한 수치이다. 따라서 본 발명의 알파-리포산 생산 방법은 기존의 화학 합성방법에 비해 우수한 농도로 알파-리포산의 생산이 가능하도록 한다.As shown in Table 4, when the production of alpha-lipoic acid was expressed with pyruvate dehydrogenase and iron-sulfur cluster, the production concentration of alpha-lipoic acid was 677.5 µg g-cell -1 . This final concentration is a good value for the biological production of alpha-lipoic acid. Therefore, the alpha-lipoic acid production method of the present invention enables the production of alpha-lipoic acid at an excellent concentration compared to the conventional chemical synthesis method.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Method for producing alpha-lipoic acid using a novel lipoic acid synthetase and a novel lipoic acid protein ligase <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 atatggatcc atgactactg cgcaagacgc 30 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aattaagctt ggaaaccagg cctgcctt 28 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tataggatcc atgccggctt tttcatgc 28 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 taataagctt atcccccagg aagcccttg 29 <210> 5 <211> 1020 <212> DNA <213> Pseudomonas fluorescence <400> 5 atgactactg cgcaagacgc tgttcaaacc ctgatcccga cgctggatat ctccgagcga 60 gcggcccgtc cgaaagttga aaccggcgtc aaattgcgcg gtgcggaaaa ggtcgcgcgc 120 attccggtga agatcattcc gactaccgaa ctgccgaaga aaccggactg gattcgcgta 180 cgcatccccg tctccccgga agtcgatcgg atcaagcagc tgctgcgcaa 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Met Thr Thr Ala Gln Asp Ala Val Gln Thr Leu Ile Pro Thr Leu Asp 1 5 10 15 Ile Ser Glu Arg Ala Ala Arg Pro Lys Val Glu Thr Gly Val Lys Leu 20 25 30 Arg Gly Ala Glu Lys Val Ala Arg Ile Pro Val Lys Ile Ile Pro Thr 35 40 45 Thr Glu Leu Pro Lys Lys Pro Asp Trp Ile Arg Val Arg Ile Pro Val 50 55 60 Ser Pro Glu Val Asp Arg Ile Lys Gln Leu Leu Arg Lys His Lys Leu 65 70 75 80 His Ser Val Cys Glu Glu Ala Ser Cys Pro Asn Leu Gly Glu Cys Phe 85 90 95 Ser Gly Gly Thr Ala Thr Phe Met Ile Met Gly Asp Ile Cys Thr Arg 100 105 110 Arg Cys Pro Phe Cys Asp Val Gly His Gly Arg Pro Lys Pro Leu Asp 115 120 125 Val Asp Glu Pro Met Asn Leu Ala Val Ala Ile Ala Asp Leu Arg Leu 130 135 140 Lys Tyr Val Val Ile Thr Ser Val Asp Arg Asp Asp Leu Arg Asp Gly 145 150 155 160 Gly Ala Gln His Phe Ala Asp Cys Ile Arg Glu Ile Arg Lys Leu Ser 165 170 175 Pro Asn Val Gln Leu Glu Thr Leu Val Pro Asp Tyr Arg Gly Arg Met 180 185 190 Asp Val Ala Leu Glu Ile Thr Ala Ala Thr Pro Pro Asp Val Phe Asn 195 200 205 His Asn Leu Glu Thr 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35 40 45 Thr Glu Leu Pro Lys Lys Pro Asp Trp Ile Arg Val Arg Ile Pro Val 50 55 60 Ser Pro Glu Val Asp Arg Ile Lys Gln Leu Leu Arg Lys His Lys Leu 65 70 75 80 His Ser Val Cys Glu Glu Ala Ser Cys Pro Asn Leu Gly Glu Cys Phe 85 90 95 Ser Gly Gly Thr Ala Thr Phe Met Ile Met Gly Asp Ile Cys Thr Arg 100 105 110 Arg Cys Pro Phe Cys Asp Val Gly His Gly Arg Pro Lys Pro Leu Asp 115 120 125 Val Asp Glu Pro Met Asn Leu Ala Val Ala Ile Ala Asp Leu Arg Leu 130 135 140 Lys Tyr Val Val Ile Thr Ser Val Asp Arg Asp Asp Leu Arg Asp Gly 145 150 155 160 Gly Ala Gln His Phe Ala Asp Cys Ile Arg Glu Ile Arg Lys Leu Ser 165 170 175 Pro Asn Val Gln Leu Glu Thr Leu Val Pro Asp Tyr Arg Gly Arg Met 180 185 190 Asp Val Ala Leu Glu Ile Thr Ala Ala Thr Pro Pro Asp Val Phe Asn 195 200 205 His Asn Leu Glu Thr Val Pro Arg Leu Tyr Lys Ala Ala Arg Pro Gly 210 215 220 Ser Asp Tyr Gln Trp Ser Leu Thr Leu Leu Gln Lys Phe Lys Gln Leu 225 230 235 240 Val Pro His Val Pro Thr Lys Ser Gly Leu Met Leu Gly Leu Gly Glu 245 250 255 Thr Asp Asp Glu Val Ile Glu Val Met Lys Arg Met Arg Glu His Asp 260 265 270 Ile Asp Met Leu Thr Leu Gly Gln Tyr Leu Gln Pro Ser Arg Asn His 275 280 285 Leu Pro Val Gln Arg Phe Val His Pro Asp Thr Phe Ala Trp Phe Ala 290 295 300 Glu Glu Gly Tyr Arg Met Gly Phe Lys Asn Val Ala Ser Gly Pro Leu 305 310 315 320 Val Arg Ser Ser Tyr His Ala Asp Glu Gln Ala Lys Leu Ala Lys Ala 325 330 335 Gly Leu Val Ser 340 <210> 7 <211> 741 <212> DNA <213> Pseudomonas fluorescence <400> 7 atgccggctt tttcatgcct atcgccaagg atttctactg ccatgactca accccttgcc 60 ttgactgtcg aagccggcct gcaggccgag caagatctgc tggccctggt gtgtaccggt 120 gaacaagagt tcggcctgct gttctggcag cccagtgacc gggcgctggt gatgcctcgg 180 cgcttgagcc gtctgcctgg atttgaacgg gcctgcgagg agtcggccgc caacggctgg 240 ccggtgctgc tgcgcgaaac cggcggtgag ccggtgccgc agtcggcggc cacggtgaac 300 atcgccctgg tctacgcccc gccacgcagc gaaggggatc agggccggat cgaaaccgcg 360 taccggcgcc tgtgtcagcc gatctgcgac ctgctcagcg aactgggggg caacccgtca 420 ttgggcgaag tggaaggggc gttctgcgat ggtcgcttca acgtcaacct ggacgggcgc 480 aagatggttg gcaccgccca gcgctggcgt cagagcaagg gtggccagcg gccagtgggc 540 ctggtgcatg gtgccttgct gctggataac gaacgcgatt cgatggtgaa cgcggtcaat 600 actttcaatc aggcctgtgg cctggaacag cgctgccggg ccgaaagtca tatcgccctg 660 cacgaggcct ttgcggcgcc cgatgcgcta gtgcggctgg agagcctgta ccgacagatg 720 ctcaagggct tcctggggga t 741 <210> 8 <211> 247 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescence <400> 8 Met Pro Ala Phe Ser Cys Leu Ser Pro Arg Ile Ser Thr Ala Met Thr 1 5 10 15 Gln Pro Leu Ala Leu Thr Val Glu Ala Gly Leu Gln Ala Glu Gln Asp 20 25 30 Leu Leu Ala Leu Val Cys Thr Gly Glu Gln Glu Phe Gly Leu Leu Phe 35 40 45 Trp Gln Pro Ser Asp Arg Ala Leu Val Met Pro Arg Arg Leu Ser Arg 50 55 60 Leu Pro Gly Phe Glu Arg Ala Cys Glu Glu Ser Ala Ala Asn Gly Trp 65 70 75 80 Pro Val Leu Leu Arg Glu Thr Gly Gly Glu Pro Val Pro Gln Ser Ala 85 90 95 Ala Thr Val Asn Ile Ala Leu Val Tyr Ala Pro Pro Arg Ser Glu Gly 100 105 110 Asp Gln Gly Arg Ile Glu Thr Ala Tyr Arg Arg Leu Cys Gln Pro Ile 115 120 125 Cys Asp Leu Leu Ser Glu Leu Gly Gly Asn Pro Ser Leu Gly Glu Val 130 135 140 Glu Gly Ala Phe Cys Asp Gly Arg Phe Asn Val Asn Leu Asp Gly Arg 145 150 155 160 Lys Met Val Gly Thr Ala Gln Arg Trp Arg Gln Ser Lys Gly Gly Gln 165 170 175 Arg Pro Val Gly Leu Val His Gly Ala Leu Leu Leu Asp Asn Glu Arg 180 185 190 Asp Ser Met Val Asn Ala Val Asn Thr Phe Asn Gln Ala Cys Gly Leu 195 200 205 Glu Gln Arg Cys Arg Ala Glu Ser His Ile Ala Leu His Glu Ala Phe 210 215 220 Ala Ala Pro Asp Ala Leu Val Arg Leu Glu Ser Leu Tyr Arg Gln Met 225 230 235 240 Leu Lys Gly Phe Leu Gly Asp 245
Claims (14)
b) 리포산 단백질 리가제A 효소;
c)리포일 트랜스퍼레이즈 효소; 및
d-1)피루베이트 디하이드로게네이즈, 및 d-2)철-황 클러스터 단백질 중 하나 이상의 단백질을 이용한 알파-리포산 제조방법.
a) lipoic acid synthase;
b) lipoic acid protein ligase A enzyme;
c) lipoyl transferase enzyme; And
A method for preparing alpha-lipoic acid using at least one of d-1) pyruvate dehydrogenase, and d-2) iron-sulfur cluster protein.
The method according to claim 1, wherein the lipoic acid synthase has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, the lipoic acid protein ligase A enzyme has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, the lipoyl transferase enzyme is an amino acid sequence of SEQ ID NO: Alpha-lipoic acid production method characterized in that it has a.
The method of claim 1, wherein the iron-sulfur cluster has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, or 16, characterized in that alpha-lipoic acid production method.
b) 리포산 단백질 리가제A 효소;
c)리포일 트랜스퍼레이즈 효소; 및
d-1)피루베이트 디하이드로게네이즈, 및 d-2)철-황 클러스터 단백질 중 하나 이상의 단백질을 포함하는 알파-리포산 제조용 조성물.a) lipoic acid synthase;
b) lipoic acid protein ligase A enzyme;
c) lipoyl transferase enzyme; And
A composition for preparing alpha-lipoic acid, comprising one or more proteins of d-1) pyruvate dehydrogenase, and d-2) iron-sulfur cluster protein.
The method according to claim 8, wherein the lipoic acid synthase has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, the lipoic acid protein ligase A enzyme has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, the lipoyl transferase enzyme is an amino acid sequence of SEQ ID NO: Alpha-lipoic acid production composition characterized in that it has a.
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