KR20110042397A - 셀룰라아제를 생산하는 스테륨 허수텀 및 이를 이용한 셀룰로오스의 당화방법 - Google Patents

셀룰라아제를 생산하는 스테륨 허수텀 및 이를 이용한 셀룰로오스의 당화방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 셀룰라아제를 생산하는 균주 및 이를 이용한 셀룰로오스의 당화방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 종래 당화효소 보다 우수한 당화수율을 나타내는 셀룰라아제 생산이 가능한 신균주 스테륨 허수텀 SKU512(Stereum hirsutum SKU512), 이의 배양방법 및 이 균주를 이용한 셀룰로오스의 당화방법에 관한 것이다.
셀룰라아제, 스테륨 허수텀, 셀룰로오스, 당화방법

Description

셀룰라아제를 생산하는 스테륨 허수텀 및 이를 이용한 셀룰로오스의 당화방법{Cellulase producing Stereum hirsutum and its use for saccharification}
본 발명은 셀룰라아제를 생산하는 스테륨 허수텀 및 이를 이용한 셀룰로오스의 당화방법에 관한 것이다.
셀룰로오스(cellulose)는 지구상에 존재하는 가장 풍부한 유기물질 이며, 재생 가능한 자원이다. 그러나, 대부분의 셀룰로오스 자원은 농산 및 임산 폐기물이 범람하고 있는 현재 주요한 환경오염원으로 간주되고 있다. 그러므로 이에 대한 효율적인 당화공정의 개발은 식량문제, 연료문제 그리고 환경문제의 해결에 큰 도움이 될 수 있을 것이다. 전 세계의 농산 및 임산 폐자원은 매년 30억 톤 이상이며, 아시아에서만 8억 톤 이상이 생산된다. 이는 주로 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스로 이루어져 있어 이들의 당화에 의한 포도당을 포함한 단당류의 생산은 바이오 에너지 자원의 중요한 원료 생산 기술이 된다. 현재 농산 및 임산 폐자원으로부터 단당류를 회수하기 위해서는 대부분의 경우 황산을 첨가하여 고온에서 가압 및 분해 방법을 사용하고 있다. 이 경우 산 및 고온에 견딜 수 있는 고가의 생산 장비가 필요하며, 분해산물도 각종 부반응으로 인해 다양하므로 분리 공정이 어렵고, 폐기물 처리 등의 비용으로 인해 생산단가가 높으며 환경 비친화적이라는 문제점을 안고 있다. 따라서, 오랫동안 셀룰로오스를 고효율로 당화시키기 위한 많은 연구가 있어 왔으며 그 중 특히 당화효소의 개발에 초점을 맞춰 많은 연구가 이루어져 왔다. 그 결과, 현재 이들 당화효소의 용도가 다양하게 개발되어 섬유산업, 제지산업, 세제산업, 사료산업 등 여러 분야에서 상업화되었으며, 또한 새로운 응용 연구도 활발하게 진행되고 있다.
한편, 식물체의 세포벽은 셀룰로오스(불용성 β-1,4-글루칸 섬유), 헤미셀룰로오스 (hemicellulose, 비셀룰로오스계 다당류), 리그닌(lignin, 복잡한 폴리페놀 구조의 다당류)과 같은 중합체로 구성되어 있다. 구성성분 중 셀룰로오스가 가장 많이 존재하고, 그 다음으로 자일란(xylan)이 주성분인 헤미셀룰로오스가 많이 존재하며, 이들 두 성분이 전체 식물 바이오매스의 50% 이상을 차지한다. 셀룰로오스는 포도당 단위가 β-1,4 결합으로 연결된 동종 중합체로서 이를 단당류로 분해하기 위해서는 엔도-β-1,4-글루칸아제 (endo-β-1,4-glucanase)[EC 3. 2. 1. 4], 엑소-β-1,4-글루칸아제(exo-β-1,4-glucanase)[EC 3. 2. 1. 91], 베타-글루코시다아제 (β-glucosidase)[EC 3. 2. 1. 21] 등 세 종류의 효소가 필요하다. 엔도-글루칸아제는 안쪽에서 β-1,4 포도당 결합을 무작위적으로 절단하고 엑소-글루칸아제가 비환원당 말단에서 포도당 이당체인 셀로바이오스 (cellobiose)로 절단해 나간다. 셀로바이오스는 베타-글루코시다아제에 의해서 포도당으로 최종 분해된다.
종래에 이들 효소의 생산은 주로 곰팡이(fungi)를 이용하였으며, 특히 산업 적인 측면에서 효소 생산은 아스퍼질러스(Aspergillus)와 트리코더마(Trichoderma)를 이용하였다. 셀룰라아제 생산 균주로는 트리코더마 리제이 R-30(Trichoderma reesei R-30)[ATCC 56764]이 대표적인 균주로 집중 연구되어 왔으나, 효소의 농도 및 활성이 산업화를 충족시킬 만큼 충분하지 못한 문제점이 있다. 예를 들어, 바이오매스로부터 에탄올을 생산하는 공정은 원료 물질의 재생, 생산 연료의 환경 친화성 등 많은 장점을 갖고 있지만 리그노셀룰로오스계 물질을 원료로 하여 생산된 에탄올은 휘발유에 비해 생산 단가가 현저히 높아 실용화에 장애가 되고 있다. 이러한 에탄올 생산 공정에 있어 비용의 가장 큰 부분은 당화효소의 생산비로서 전체 비용의 약 60%에 해당한다. 그러므로 셀룰라아제를 생산하는 고활성 균주의 개발이 절실히 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 균주를 선별하던 중 고활성 셀룰라아제를 생산하는 신균주 스테륨 허수텀 SKU512(Stereum hirsutum SKU512)[KCCM 10982P]를 분리 동정함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 셀룰라아제를 생산하는 신균주 스테륨 허수텀 SKU512(Stereum hirsutum SKU512)[KCCM 10982P] 및 이의 배양방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 이용한 셀룰로오스의 당화방법을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
본 발명은 셀룰라아제를 생산하는 신균주 스테륨 허수텀 SKU512(Stereum hirsutum SKU512)[KCCM 10982P] 및 이를 이용하여 셀룰라아제를 생산하는 방법을 그 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 균주로부터 생산된 셀룰라아제 또는 상기 방법으로 생산된 셀룰라아제를 이용한 셀룰로오스의 당화방법을 또 다른 특징으로 한다.
본 발명에서 분리한 스테륨 허수텀 SKU512[KCCM 10982P]는 고활성 셀룰라아제를 생산하므로, 셀룰로오스 당화에 이용될 수 있고, 본 발명의 균주로부터 생산된 셀룰라아제는 종래 당화효소 보다 우수한 당화수율을 나타내므로 바이오 에너지의 생산, 섬유산업, 제지산업, 세제산업, 사료산업 및 식품 산업에 있어 저 칼로리 식품의 제조와 음식물 쓰레기의 발효 등 다양한 용도에 적용될 수 있다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 종래 당화효소 보다 우수한 당화수율을 나타내는 셀룰라아제 생산이 가능한 신균주 스테륨 허수텀 SKU512(Stereum hirsutum SKU512)[KCCM 10982P], 이의 배양방법 및 이 균주를 이용한 셀룰로오스의 당화방법에 관한 것이다.
본 발명은 셀룰로오스의 당화방법에 있어서, 상기 균주로부터 생산된 셀룰라아제 또는 상기 방법으로 생산된 셀룰라아제를 이용하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 셀룰로오스의 당화방법에 있어서, 효소(셀룰라아제)의 농도 는 20 ~ 50 FPU/(기질)g, 기질(셀룰로오스) 농도는 4 ~ 16 중량%, pH는 4.5 ~ 6, 온도는 30 ~ 40℃인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 셀룰로오스의 당화방법에 있어서, 셀룰로오스 공급원으로 볏짚, 자트로파 또는 팜커늘을 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 신균주 분리 동정하는 과정을 일 구현예로서 설명하면 다음과 같다.
셀룰라아제를 생산하는 균주를 분리하기 위하여, 각종 버섯 균의 배양액을 생리식염수에 현탁하고, 카르복시메틸셀룰로오스가 첨가된 복합 한천배지(potato dextrose agar)에 도말한 후, 배양한다. 고체 한천배지에서 콜로니가 형성된 후, 콩고레드 시약으로 염색하고, 염화나트륨으로 탈색하여 그 콜로니 주위에 섬유소 분해환이 생성된 균들을 선별하는 방법으로 다양한 버섯 포자로부터 셀룰라아제를 생산하는 버섯균을 다수 탐색한다.
상기 탐색과정을 통해 1차 선별된 균주를 대조군(C)으로 종래 셀룰라아제 생산 균주로 이용되는 트리코더마 리제이 R-30를 이용하여, 상기와 같이 카르복시메틸셀룰로오스를 첨가한 고체 한천배지에서 섬유소 분해능을 확인한 후, 섬유소 분해능이 가장 뛰어난 하나의 균주를 선별한다.
상기 균주의 ITS-5.8S rDNA 서열의 유사종과의 유연관계를 분석한 결과, 스테륨 허수텀으로 동정하여 스테륨 허수텀(Stereum hirsutum) SKU512로 명명하였고, 한국미생물보존센터에 기탁하여 2009년 1월 13일자로 기탁번호 KCCM 10982P호를 부여받았다.
상기 균주로부터 셀룰라아제를 생산하기 위하여, 상기 균주를 배양하는 생산배지는 탄소원, 질소원, 황산마그네슘을 포함하고, 추가로 일인산칼륨, 이인산칼륨, 이노시톨을 포함할 수 있다. 바람직하게는 탄소원 10 ~ 40 g/L, 질소원 8 ~ 11 g/L, 황산마그네슘 1 ~ 5 g/L을 포함하고, 여기에 일인산칼륨 3 ~ 6 g/L, 이인산칼륨 3 ~ 6 g/L 및 이노시톨 1 ~ 5 g/L을 포함하는 배지를 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 셀룰로오스 20 ~ 40 g/L, 트립톤 8 ~ 10 g/L, 황산마그네슘 2 ~ 5 g/L, 일인산칼륨 4 ~ 6 g/L, 이인산칼륨 4 ~ 6 g/L 및 이노시톨 1 ~ 4 g/L을 포함하는 배지를 사용할 수 있다.
고효율의 셀룰라아제 생산을 위한 상기 균주의 배양조건은 교반속도 200 ~ 700 rpm, 통기량 0.5 ~ 1.5 vvm 및 온도 23 ~ 32 ℃이고, 보다 바람직한 조건은 교반속도 400 ~ 600 rpm, 통기량 1.0 ~ 1.5 vvm 및 온도 27 ~ 32 ℃이다.
한편, 본 발명은 상기에서 생산된 셀룰라아제를 이용하여 셀룰로오스를 당화하는 방법도 포함된다.
이때, 셀룰로오스의 당화방법에 있어서, 효소(셀룰라아제) 농도는 20 ~ 50 FPU/(기질)g, 기질(셀룰로오스) 농도는 4 ~ 16 중량%, pH는 4.5 ~ 6, 온도는 30 ~ 40 ℃인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 신균주는 고활성 셀룰라아제를 생산하므로, 셀룰로오스 당화에 이용될 수 있고, 이렇게 생산된 셀룰라아제는 종래 당화효소 보다 우수한 당화수율을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 신균주로부터 생산된 셀룰라아제는 바이오 에너지의 생 산, 섬유산업, 제지산업, 세제산업, 사료산업 및 식품 산업에 있어 저 칼로리 식품의 제조와 음식물 쓰레기의 발효 등 다양한 용도에 적용될 수 있다.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 셀룰라아제 생산균의 선별
셀룰라아제를 생산하는 균주를 분리하기 위하여 각종 버섯 균의 배양액 10 ㎕를 생리식염수 10 ㎖에 현탁하고, 현탁액의 10 ㎕(1x104 cfu/㎖) 취하여 2% 카르복시메틸셀룰로오스가 첨가된 복합 한천배지(potato dextrose agar)에 도말한 후, 27 ℃에서 3일간 배양하였다. 고체 한천배지에서 콜로니가 형성된 후 0.1%의 콩고레드 시약으로 염색하고, 1 M 염화나트륨으로 탈색하여 그 콜로니 주위에 섬유소 분해환이 생성된 균들을 선별하는 방법으로 다양한 버섯 포자로부터 셀룰라아제를 생산하는 버섯균을 다수 탐색하였다.
상기 탐색과정을 통해 1차 선별된 균주를 대조군(C)으로 종래 셀룰라아제 생산 균주로 이용되는 트리코더마 리제이 R-30를 이용하여, 상기와 같이 카르복시메틸셀룰로오스를 첨가한 고체 한천배지에서 섬유소 분해능을 확인한 후, 섬유소 분해능이 가장 뛰어난 하나의 균주를 선별하였다.
실시예 2: 균주의 동정
상기 실시예 1에서 분리한 균주의 동정을 위하여, 한국미생물 보존센터에서 ITS-5.8S rDNA 서열을 분석하였다. 분리된 균주의 ITS-5.8S rDNA 서열은 서열번호 1에 나타내었다.
상기 균주의 ITS-5.8S rDNA 서열의 유사종과의 유연관계를 분석한 결과, 스테륨 허수텀 으로 동정되었다[도 1].
상기 균주는 스테륨 허수텀(Stereum hirsutum) SKU512로 명명하였고, 한국미생물보존센터에 기탁하여 2009년 1월 13일자로 기탁번호 KCCM 10982P호를 부여받았다.
실시예 3: 균주의 셀룰라아제 생산을 위한 배지 최적화 실험
(1) 탄소원(셀룰로오스)의 농도에 따른 셀룰라아제 활성 시험
7L 발효조에서 탄소원 농도에 따른 본 발명 균주 스테륨 허수텀 SKU512 균주의 셀룰라아제 생산 실험을 수행하였다.
셀룰라아제 활성 측정을 위하여, 베타-글루코시다아제, 엑소-β-1,4-글루칸아제는 파라-니트로페닐(p-nitro- phenyl, pNP)기가 붙은 기질인 파라-니트로페닐 글루코스(pNPG), 파라-니트로페닐 셀로바이오스(pNPC)를 각각 이용하였고, 엔도-β-1,4-글루칸아제의 활성은 환원당을 이용한 somogyi-nelson법을 이용하여 측정하였다.
종 배양: 보관된 스테륨 허수텀의 단일 군락을 전 배양 배지(Potato starch 4 g/L, Dextrose 20 g/L) 50 mL이 들어있는 500 mL 플라스크에 접종하여 진탕배양기에서 200 rpm, 27 ℃로 3일간 배양하였다.
본 배양: 200 mL의 종배양액을 생산 배지(셀룰로오스(아비셀) 20 g/L, 트립톤 5 g/L, 황산마그네슘 1 g/L) 4 L가 들어있는 7 L 발효조에 접종하여 교반속도 200 rpm, 배양온도 27 ℃, 통기량 1.0 vvm, pH 5에서 5일간 본 배양을 수행하였다. 초기 셀룰로오스의 농도를 10 ~ 40 g/L로 달리하여 실험한 결과, 다음 표 1과 같고, 20 g/L의 농도에서 최대 셀룰라아제의 활성을 나타내었다.
[표 1]
여러 셀룰로오스 농도에서 셀룰라아제의 생산
　구분 g/L 엔도-β-1,4-글루칸아제(U/mg-단백질) 엑소-β-1,4-글루칸아제(U/mg-단백질) β-글루코시다아제 (U/mg-단백질)
셀룰로오스 10 0.010 1.32 7.37
20 0.013 1.79 9.67
30 0.010 1.46 8.33
40 0.009 1.37 7.89
(2) 질소원( 트립톤 )의 농도에 따른 셀룰라아제 활성 시험
7 L 발효조에서 셀룰로오스 농도를 20 g/L로 하여 질소원(트립톤) 농도별 실험을 수행하였다.
질소원 농도를 8 ~ 11 g/L로 달리하여 배양한 결과, 활성은 다음 표 2와 같고, 10 g/L 트립톤에서 최대 활성을 나타내었다.
[표 2]
여러 트립톤의 농도에서 셀룰라아제 효소의 활성
구분 g/L 엔도-β-1,4-글루칸아제(U/mg-단백질) 엑소-β-1,4-글루칸아제(U/mg-단백질) β-글루코시다아제(U/mg-단백질)
트립톤 8 0.031 2.07 8.37
9 0.034 2.19 8.57
10 0.042 3.07 9.61
11 0.028 1.88 7.98
(3) 황산마그네슘의 농도에 따른 셀룰라아제 활성 시험
7 L 발효조에서 셀룰로오스와 트립톤의 농도를 각각 20 g/L, 10 g/L로 하여 황산마그네슘의 농도별 실험을 수행하였다.
황산마그네슘 농도를 1 ~ 5 g/L로 달리하여 배양한 결과, 활성은 다음 표 3과 같고, 3 g/L 황산마그네슘에서 최대 활성을 나타내었다.
[표 3]
여러 황산마그네슘의 농도에서 셀룰라아제 효소 활성
구분 g/L 엔도-β-1,4-글루칸아제(U/mg-단백질) 엑소-β-1,4-글루칸아제(U/mg-단백질) β-글루코시다아제(U/mg-단백질)
황산마그네슘 　 1 0.041 3.54 9.67
2 0.044 3.63 10.54
3 0.062 4.55 11.84
4 0.059 4.01 10.44
5 0.053 3.99 9.89
(4) 일인산칼륨 농도에 따른 셀룰라아제 활성 시험
7 L 발효조에서 셀룰로오스, 트립톤, 황산마그네슘 농도를 각각 20 g/L, 10 g/L, 3 g/L로 하여 일인산칼륨의 농도별 실험을 수행하였다.
일인산칼륨 농도를 3 ~ 6 g/L로 달리하여 배양한 결과, 활성은 다음 표 4와 같고, 5 g/L 일인산칼륨에서 최대 활성을 나타내었다.
[표 4]
여러 일인산칼륨 농도에서 셀룰라아제 효소활성
구분 g/L 엔도-β-1,4-글루칸아제(U/mg-단백질) 엑소-β-1,4-글루칸아제(U/mg-단백질) β-글루코시다아제(U/mg-단백질)
일인산칼륨 3 0.068 4.99 12.43
4 0.070 5.11 12.51
5 0.073 5.87 15.99
6 0.068 4.89 13.78
(5) 이인산칼륨 농도에 따른 셀룰라아제 활성 시험
7 L 발효조에서 셀룰로오스, 트립톤, 황산마그네슘, 그리고 일인산칼륨의 농도를 각각 20 g/L, 10 g/L, 3 g/L, 5 g/L로 하여 이인산칼륨의 농도별 실험을 수행하였다.
이인산칼륨 농도를 3 ~ 6 g/L로 달리하여 배양한 결과, 활성은 다음 표 5와 같고, 5 g/L 이인산칼륨에서 최대 활성을 나타내었다.
[표 5]
여러 이인산칼륨 농도에서 셀룰라아제 효소활성
구분 g/L 엔도-β-1,4-글루칸아제(U/mg-단백질) 엑소-β-1,4-글루칸아제(U/mg-단백질) β-글루코시다아제(U/mg-단백질)
이인산칼륨 3 0.073 5.89 16.77
4 0.076 5.93 17.21
5 0.083 6.12 19.34
6 0.069 5.89 17.11
(6) 이노시톨 농도에 따른 셀룰라아제 활성 시험
7 L 발효조에서 셀룰로오스, 트립톤, 황산마그네슘, 일인산칼륨 그리고 이인 산칼륨의 농도를 각각 20 g/L, 10 g/L, 3 g/L, 5 g/L, 5 g/L로 하여 이노시톨 농도별 실험을 수행하였다.
이노시톨 농도를 1 ~ 5 g/L로 달리하여 배양한 결과, 활성은 다음 표 6과 같고, 2 g/L 이노시톨에서 최대 활성을 나타내었다.
[표 6]
여러 이노시톨 농도에서 셀룰라아제 효소활성
구분 g/L 엔도-β-1,4-글루칸아제(U/mg-단백질) 엑소-β-1,4-글루칸아제(U/mg-단백질) β-글루코시다아제(U/mg-단백질)
　
　
이노시톨
　
　		 1 0.084 6.14 19.55
2 0.087 6.22 20.67
3 0.078 6.19 20.11
4 0.075 6.01 19.52
5 0.069 5.33 19.07
실시예4 : 고활성 효소 생산을 위한 최적 배양조건 실험
7 L 발효조에서 셀룰로오스, 트립톤, 황산마그네슘, 일인산칼륨, 이인산칼륨, 이노시톨의 농도를 각각 20 g/L, 10 g/L, 3 g/L, 5 g/L, 5 g/L, 2 g/L로 하여 배양 환경조건의 최적화 실험을 수행하였다.
교반속도 200 ~ 700 rpm, 통기량 0.5 ~ 1.5 vvm 및 배양온도를 23 ~ 32 ℃로 달리하여 셀룰라아제 활성을 비교한 결과, 다음 표 7과 같이 교반속도 600 rpm, 통기량 1.3 vvm, 배양온도 30 ℃에서 최대 셀룰라아제 활성을 나타내었다.
상기 최적조건에서의 배양 시간별 엔도-β-1,4-글루칸아제, 엑소-β-1,4-글루칸아제 및 베타-글루코시다아제의 시간에 따른 활성 변화를 도 2a, 도 2b 및 도 2c에 각각 나타내었다.
[표 7]
효소 활성 최적화를 위한 조건 실험표
구분 엔도-β-1,4-글루칸아제(U/mg-단백질) 엑소-β-1,4-글루칸아제(U/mg-단백질) β-글루코시다아제(U/mg-단백질)
배양 온도 (℃) 23 0.033 3.21 14.21
25 0.067 5.01 18.88
27 0.081 6.22 20.67
30 0.092 6.44 21.45
32 0.076 6.12 20.33
교반조건
(rpm)		 200 0.083 6.25 20.70
300 0.083 6.36 20.87
400 0.085 6.48 20.91
500 0.088 6.50 21.01
600 0.096 6.56 22.77
700 0.081 6.25 21.06
통기조건
(vvm)		 0.5 0.083 6.59 22.20
1 0.085 6.65 23.65
1.3 0.145 6.72 24.67
1.5 0.087 6.21 22.98
세 효소의 활성 대조균으로 트리코더마 리제이 R-30를 이용하여 스테륨 허수텀 SKU512 균주의 활성을 비교하였다. 배양조건은 모두 일관되게 적용되었으며, 활성 비교 결과 스테륨 허수텀 SKU512 균주가 생산하는 셀룰라아제 효소들의 활성이 각각 엔도-β-1,4-글루칸아제 0.145 U/mg-단백질, 엑소-β-1,4-글루칸아제 6.72 U/mg-단백질, 베타-글루코시다아제 24.67 U/mg-단백질로서 대조군에 비해 현저히 높은 셀룰라아제 활성을 지니는 것을 확인하였다[표 8].
[표 8]
구분 엔도-β-1,4-글루칸아제
(U/mg-단백질)		 엑소-β-1,4-글루칸아제
(U/mg-단백질)		 β-글루코시다아제
(U/mg-단백질)
트리코더마 리제이 R-30 0.12 0.20 1.50
스테륨 허수텀 SKU512 0.14 6.72 24.67
실시예 5: 균주의 당화수율 분석
일반적으로 식물체가 함유하고 있는 리그노셀룰로오스는 효소의 가수 분해만으로 높은 당화수율을 얻을 수 없다. 따라서, 효소가수분해 과정 전에 전처리 과정을 거치게 되는데, 본 발명에서는 2 중량% 수산화나트륨의 알칼리 처리방법을 이용하였다. 이러한 전처리 과정은 리그닌과 헤미셀룰로오스의 조각화를 제공함으로써 셀룰라아제 효소의 섬유소 가수분해 효율의 증가를 가져오게 된다. 전처리를 위해 10 g의 볏짚을 40 ㎖의 2 중량% 수산화나트륨 용액이 든 플라스크에 넣고 85 ℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 0.45 μM 필터에 여과하였다. 이와 같이, 전 처리 및 여과된 볏짚을 65 ℃에서 건조시켜 사용하였다. 균주의 최적 당화 조건을 탐색하기 위하여, 효소의 농도, 기질의 농도, 온도, pH 에 대한 실험을 진행하였다.
먼저, 전 처리된 볏짚을 농도별로 20 ㎖의 0.1 M 소디움 아세테이트 완충액 (pH 5.0)에 다양한 농도의 셀룰라아제와 함께 첨가하였다. 셀룰라아제가 첨가된 완충액은 15 ~ 55 ℃에서 150 rpm으로 72시간 동안 반응시킨 후, 변성된 효소를 제거하기 위하여 반응액을 100 ℃에서 3분간 끓이고 실온에서 식힌 뒤 4000 rpm에서 15분간 원심분리하여 침전시켰다. 효소활성 측정은 환원당 측정법으로 그 상등액을 이용하였다.
당화율 기준은 반응이 끝난 볏짚을 105 ℃에서 24시간 건조한 후, 줄어든 1 g의 볏짚 무게를 기준으로 다음 수학식 1과 같이 측정되었다.
[수학식 1]
Figure 112009063667506-PAT00001
(1) 기질 농도에 따른 당화수율 실험
500 ml 삼각 플라스크에서 여러 기질 농도에 따른 본 발명 균주 스테륨 허수텀 SKU512 균주의 당화실험을 수행하였다.
효소 농도 20 FPU/g 기질에 대한 기질(볏짚) 농도를 2 ~ 20 중량%로 각각 달리하여 배양한 결과를 다음 표 9에 나타내었다. 4 ~ 16 중량%, 바람직하기로는 8 ~ 12 중량%에서 당화수율이 우수했고, 10 중량% 볏짚 농도에서 최적의 당화수율이 나타났다.
[표 9]
기질 농도 (%) 환원당-g/기질-g 당화수율 (%)
2 0.335 44.4
4 0.389 51.5
6 0.414 54.8
8 0.423 56.0
10 0.459 60.8
12 0.442 58.5
16 0.415 54.9
18 0.376 49.7
20 0.391 51.8
(2) 온도에 따른 당화수율 실험
500 ㎖ 삼각 플라스크에서 반응조건을 효소 농도 및 기질 농도를 각각 30 FPU/g 기질, 10 중량%로 하여 여러 온도에 따른 본 발명 균주 스테륨 허수텀 SKU512 균주의 당화 실험을 수행하였다.
온도를 25, 30, 37, 45 ℃로 각각 달리하여 배양한 결과를 다음 표 10에 나타내었다. 30 ~ 40 ℃에서 당화수율이 우수하였고, 37 ℃에서 최적의 당화수율이 나타났다.
[표 10]
온도
(℃)		 환원당-g/기질-g 당화수율 (%)
25 0.401 53
30 0.467 61
37 0.471 62
45 0.394 52
(3) pH 에 따른 당화실험
500 ㎖ 삼각 플라스크에서 반응조건을 효소 농도, 기질 농도 그리고 온도를 각각 30 FPU/g 기질, 10 중량% 그리고 37 ℃로 하여 여러 pH 따른 본 발명 균주 스테륨 허수텀 SKU512 균주의 당화실험을 수행하였다.
pH를 4, 4.5, 5, 5.5, 6으로 각각 달리하여 배양한 결과를 다음 표 11에 나타내었다. pH 4.5 ~ 6 에서 당화수율이 우수하였고, pH 4.5에서 최적의 당화수율이 나타났다.
[표 11]
pH 환원당-g/기질-g 당화수율 (%)
4 0.239 31
4.5 0.501 66
5 0.484 64
5.5 0.454 60
6 0.441 58
(4) 효소 농도에 따른 당화수율 실험
500 ㎖ 삼각 플라스크에서 반응조건을 효소 농도, 기질 농도, 온도 및 pH를 각각 30 FPU/g 기질, 10 중량%, 37 ℃ 그리고 pH 4.5로 하여 여러 효소 농도에 따른 본 발명 균주 스테륨 허수텀 SKU512 균주의 당화실험을 수행하였다.
효소의 농도를 10 ~ 50 FPU/g-기질로 달리하여 실험한 결과, 다음 표 12와 같으며, 20 ~ 50 FPU/g-기질, 바람직하게는 30 ~ 50 FPU/g-기질의 효소를 사용하였을 때 최적의 당화수율을 나타내었다.
[표 12]
효소 농도 (FPU/g-기질) 환원당-g/기질-g 당화수율 (%)
10 0.508 67.3
20 0.533 70.5
30 0.627 83.1
40 0.615 81.5
50 0.598 79.2
실시예 6: 최적 조건에서의 당화실험
반응기에서 최적화한 조건에서 본 발명의 스테륨 허수텀 SKU512 균주의 당화효소를 이용한 당화실험을 수행하였다.
반응액 내의 효소 농도는 30 FPU/g-기질, 기질 농도는 10 중량%, pH 4.5로 조절하였으며 온도는 37 ℃로 조절하였다. 최적화된 조건에서 실험한 결과, 반응 시간 별 당화수율을 도 3에 나타내었다.
본 발명에서 시행된 반응 시간에 따른 스테륨 허수텀 SKU512의 셀룰라아제에 의한 볏짚의 당화효율을 조사한 결과, 30 FPU/g-기질의 효소농도, 10 중량%의 기질 을 사용하여, pH 4.5, 37 ℃에서 38시간 반응시켰을 때 84.8%의 최대 당화율을 나타내었다.
한편, 본 발명의 스테륨 허수텀 SKU512 균주에서 생산된 셀룰라아제와 노보자임사의 셀룰라아제(상품명 celluclast)를 각각의 최적 조건에서 당화수율을 비교하여 다음 표 13에 나타내었다.
[표 13]
구분 당생산량(g/g-볏짚) 당화수율(%)
스테륨 허수텀 SKU512 0.641 84.8
Novozyme (celluclast) 0.582 76.1
도 1은 본 발명 균주에 대한 ITS-5.8S rDNA 서열의 유사종과의 유연관계를 분석한 결과이다.
도 2(a)는 스테륨 허수텀 SKU512 균주 및 트리코더마 리제이 R-30의 엔도-β-1,4-글루칸아제 활성을 배양시간에 따라 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 2(b)는 스테륨 허수텀 SKU512 균주 및 트리코더마 리제이 R-30의 엑소-β-1,4-글루칸아제 활성을 배양시간에 따라 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 2(c)는 스테륨 허수텀 SKU512 균주 및 트리코더마 리제이 R-30의 베타-글루코시다아제 활성을 배양시간에 따라 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 스테륨 허수텀 SKU512 균주에 의해 생산된 당화효소를 이용한 최적 조건에서 반응시간별 볏짚의 당화율을 나타낸 그래프이다.
<110> SK CHEMICALS CO., LTD. <120> Cellulase producing Stereum hirsutum and its use for saccharification <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 576 <212> DNA <213> Stereum hirsutum SKU512 <400> 1 cctgcggaag gatcattaac gagttttgaa acgggttgtt gctggccttc cgaggcatgt 60 gcacgccctg ctcatccact ctacacctgt gcacttactg taggttggcg tgggtttcta 120 gcctccgggc tgggagcatt ctgccggcct atgtacacta caaactctaa agtatcagaa 180 tgtaaacgcg tctaacgcat cttaatacaa ctttcagcaa cggatctctt ggctctcgca 240 tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat 300 cgaatctttg aacgcacctt gcgctccttg gtattccgag gagcatgcct gtttgagtgt 360 catgaaattc tcaacccata agtccttgtg atctatgggc ttggatttgg aggcttgctg 420 gccctagcgg tcggctcctc ttgaatgcat tagcttgatt ccgtgcggat cggctctcag 480 tgtgataatt gtctacgctg tgaccgtgaa gcgttttggc aagcttctaa ccgtccatta 540 ggacaatctt tcaacatctg acctcaaatc aggtag 576

Claims (8)

  1. 셀룰라아제를 생산하는 스테륨 허수텀 SKU512(Stereum hirsutum SKU512)[KCCM 10982P].
  2. 청구항 1의 스테륨 허수텀 SKU512(Stereum hirsutum SKU512)[KCCM 10982P]를 배양하여 셀룰라아제를 생산하는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 생산방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 배양은 탄소원, 질소원 및 황산마그네슘을 포함하는 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 생산방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 배양은 셀룰로오스 10 ~ 40 g/L, 트립톤 8 ~ 11 g/L 및 황산마그네슘 1 ~ 5 g/L을 포함하는 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 생산방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 배지는 일인산칼륨, 이인산칼륨, 이노시톨을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 생산방법.
  6. 청구항 2 내지 5 중에서 선택된 어느 한 항의 방법으로 생산된 셀룰라아제를 이용하여 셀룰로오스의 당화과정을 수행하는 것을 특징으로 하는 셀룰로오스의 당화방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 당화과정은 20 ~ 50 FPU/(기질)g의 셀룰라아제 농도, 4 ~ 16 중량%의 셀룰로오스 농도, pH 4.5 ~ 6 및 30 ~ 40℃의 온도 하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 셀룰로오스의 당화방법.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 당화과정은 셀룰로오스 공급원으로 볏짚, 자트로파 또는 팜커늘을 사용하는 것을 특징으로 하는 셀룰로오스의 당화방법.
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