KR20110037516A

KR20110037516A - 4-ｏ-메틸호노키올을 유효성분으로 함유하는 항암 의약 조성물

Info

Publication number: KR20110037516A
Application number: KR1020090094996A
Authority: KR
Inventors: 홍진태; 오주훈; 반정옥
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2009-10-07
Filing date: 2009-10-07
Publication date: 2011-04-13

Abstract

본 발명은 4-O-메틸호노키올을 유효성분으로 함유하는 항암 의약 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 핵 전사인자 NF-κB의 DNA 결합 및 종양 괴사인자-α 유발 전사활성을 억제시켜 암세포 증식을 저해시킬 뿐 아니라 세포주기 단백질인 p21 발현을 유발시켜 세포주기 G₀∼G₁ 주기를 저지함으로서 p21 매개 세포사멸을 유발시켜 암세포의 증식을 억제시킴을 특징으로 하는 4-O-메틸호노키올을 유효성분으로 함유하는 결장암 및 전립선암에 항암 활성을 지니는 항암 의약 조성물에 관한 것이다.

4-O-메틸호노키올, 핵 전사인자 NF-κB, p21, 결장암, 전립선암, 의약 조성물

Description

4-Ｏ-메틸호노키올을 유효성분으로 함유하는 항암 의약 조성물{Anti-cancer phamaceutical composition containing 4-O-methylhonokiol as active ingredient}

후박(Magnolia officinalis)의 뿌리 및 줄기 껍질 속에는 생약 또는 그의 활 성 성분인 호노키올(honokiol), 오보바톨(obovatol), 마그놀올(magnolol)이 함유되어 있으며 이들 성분의 항균, 항염, 항혈전 및 항불안 효과와 같은 다양한 의약 효과로 인해 동양 의학에서 한약재로 사용되어 왔다. (Park, J., et al., Eur J Pharmacol, 496, 189-95.(2004)) 또한 종래의 여러 연구는 호노키올이 백혈병, 폐, 유방 및 난소 암세포와 같은 여러 암세포에 대한 항암 효과뿐만 아니라 항-혈관형성, 항-증식 활성 및 항-침투성을 지님을 나타내고 있다. 또한 마그놀올 역시 다양한 암세포 내에서 아폽토시스를 유도하고 암세포의 증식을 억제하고 전이를 저해하는 것으로 알려져있다. 또한 본 발명자들은 최근 또다른 성분인 오보바톨이 결장 및 전립선 암세포 성장을 저해함을 확인한 바 있다. (Lee, S.Y., et al., Eur J Pharmacol, 582, 17-25.(2008))

핵 전사인자-κB(NF-κB)는 염증성 사이토카인, 케모카인, 세포 부착 분자 및 성장 인자의 생성에 관련된 다양한 유전자를 조절하는 전사 인자이다. NF-κB는 암 발달에 관여하는 유전자 발현을 통해 종양 촉진 및 진행, 혈관형성, 전이 및 저항성을 매개한다. 또한 핵 전사인자 NF-κB는 아폽토시스-1의 세포 저해제(cIAP1), 아폽토시스-2의 세포 저해제(cIAP2), Bfl-1/A1 및 서비빈(survivin)을 포함한 많은 항-아폽토시스 단백질 및 사이클로옥시게나제-2(Cox-2) 및 사이클린과 같은 증식 유전자뿐만 아니라 카스파제 및 Bax와 같은 아폽토시스 유전자의 발현을 조절한다. (Wang, C.Y., et al., Science, 281, 1680-3.(1998))

또한 핵 전사인자 NF-κB는 동물 및 환자 유래의 전립선 및 결장 암세포를 포함한 다양한 고형 종양 세포 내에서 활성화된다. NF-κB의 활성화는 아폽토시스 저해 유전자 발현을 상향-조절하고 따라서 암세포 성장을 유발하는 암세포 증식과 암세포 사멸의 균형을 파괴시키는 것으로 알려져있다. 따라서 핵 전사인자 NF-κB의 저해는 전임상 및 임상 연구에서 암세포의 증식을 조절하기 위해 주목받고 있다. (Adams, J. Nat Rev Cancer, 4, 349-60.(2004)) 또한 여러 연구는 NF-κB 활성을 억제하는 폴리페놀(레스베라트롤, 커큐민, 에피갈로카테킨 갈레이트, 쿼세틴), 리간드(마나산틴, (+)-소서네틴, (-)-소서네올 메틸 에테르), 세스퀴테르펜(코스투놀리드, 파테놀리드 A), 디테르펜(엑시사닌, 카메나카우리) 및 트리테르페노이드(아비신, 올레안드린)와 같은 다양한 천연 화합물이 암세포 성장을 저해함을 보고하였다. 본 발명자들도 인플렉시놀, 치아크레모논 및 코브로톡신과 같은 식물체에 존재하는 화합물에 의한 NF-κB 억제가 결장 및 전립선 암세포 성장을 저해함을 입증한 바 있다.(Park, M.H., et al., Biochemistry, 44, 8326-36.(2005))

p21 경로의 기능적 불활성화는 대부분의 인간 종양에서 관찰된다. p21은 인간 종양 세포 내 사이클린-CDK의 제어를 통한 세포 성장 저해를 위한 중요한 세포 체크포인트 단백질인 세포주기 저지에 관련된 유전자의 발현을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 핵 전사인자 NF-κB-의존적 p21 발현은 인간 백혈병 세포의 저항성에서 관찰되었다. 또한 핵 전사인자 NF-κB는 단핵세포 아폽토시스뿐만 아니라 유방 암세포의 p21 매개된 세포주기 저지에 중요하다. (Hellin, A.C., et al., J Pharmacol Exp Ther, 295, 870-8.(2000))

본 발명자들은 최근 후박(Magnolia officinalis)에서 신규한 생물활성 화합물인 4-O-메틸호노키올(MH)을 분리하였고 이는 대식세포에서 핵 전사인자 NF-κB 활성을 억제함으로써 항염증 효과가 있음을 확인하였다. (Oh, J.H., et al., Chem Biol Interact, 180, 506-14.(2009)) 그러나 4-O-메틸호노키올(MH)의 항암 활성에 관해서는 아직까지 밝혀진 바 없다.

따라서 본 발명은 이러한 4-O-메틸호노키올이 핵 전사인자 NF-κB 활성화 저해를 통한 인간 결장암 세포주 및 전립선 암 세포주의 증식 저해 및 상기 암 세포주의 세포 주기는 4-O-메틸호노키올에 의한 p21 단백질 유도를 통해 정지 될 수 있음을 가정하고 4-O-메틸호노키올의 항암 활성 실험을 행한 바 4-O-메틸호노키올이 p21 단백질의 유도를 통해 인간 결장암 세포주 및 전립선 암 세포주의 세포 주기 정지를 통한 아폽토시스의 유발 및 핵 전사인자 NF-κB 활성화 저해를 통해 암 세포주 증식을 저해시킴을 측정하고 본 발명을 완성하게 된 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 4-O-메틸호노키올이 핵 전사인자 NF-κB 활성화 저해를 통한 인간 결장암 세포주 및 전립선 암 세포주의 증식 저해 및 상기 암 세포주의 세포 주기는 4-O-메틸호노키올에 의한 p21 단백질 유도를 통해 정지 될 수 있는지 여부를 측정코자 한 것이다. 또한 상기 4-O-메틸호노키올이 p21 단백질의 유도를 통해 인간 결장암 세포주 및 전립선 암 세포주의 세포 주기 정지를 통한 아폽토시스의 유발 및 핵 전사인자 NF-κB 활성화 저해를 통해 암 세포주 증식을 저해시킴을 측정코자 한 것이다.

본 발명의 목적은 하기 일반식 Ⅰ의 4-O-메틸호노키올 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 결장암 또는 전립선암 치료용 항암 의약 조성물을 제공하는 것이다.

식 I

이때 상기 4-O-메틸호노키올은 핵 전사인자 NF-κB의 DNA 결합활성 및 종양괴사인자 유도 전사활성을 억제시킴으로써 암세포 증식을 억제시킴을 특징으로 한다.

한편 상기 4-O-메틸호노키올은 세포주기 단백질 p21의 발현을 유도를 통한 세포주기 G₀∼G₁ 주기를 저지함으로서 세포사멸을 유발시켜 암세포 증식을 억제시킴을 특징으로 한다.

또한 상기 4-O-메틸호노키올은 아폽토시스 저해 단백질인 Bcl-2, 서비빈(Survivin), GSK-3β, 카스파제-9, 카스파제-3, cIAP, αIAP, COX-2 및 iNOS의 발현을 감소시켜 암세포의 세포사멸을 유도함을 특징으로 한다.

또한 상기 4-O-메틸호노키올은 아폽토시스 유발 단백질인 Bax, 활성화 카스파제-3 및 활성화 카스파제-9의 발현을 증진시킴으로서 암세포의 세포사멸을 유도함을 특징으로 한다.

본 발명의 효과는 4-O-메틸호노키올이 핵 전사인자 NF-κB 활성화 저해를 통한 인간 결장암 세포주 및 전립선 암 세포주의 증식 저해 및 상기 암 세포주의 세포 주기는 4-O-메틸호노키올에 의한 p21 단백질 유도를 통해 정지됨을 확인한 것이다. 또한 상기 4-O-메틸호노키올이 p21 단백질의 유도를 통해 인간 결장암 세포주 및 전립선 암 세포주의 세포 주기 정지를 통한 아폽토시스의 유발 및 핵 전사인자 NF-κB 활성화 저해를 통해 암 세포주 증식을 저해시킴을 확인하고 4-O-메틸호노키올을 유효 성분으로 함유하는 결장암 및 전립선 암에 효과적인 항암제를 제공하는 것이다.

본 발명은 후박(Magnolia officinalis)의 성분인 4-O-메틸호노키올(methylhonokiol)의 인간 결장 및 전립선 암세포 증식 저해 및 그의 작용 메커니즘 상의 효과를 조사하였다.

4-O-메틸호노키올의 처리(0∼40 μM)는 농도- 및 시간-의존적 방식으로 인간 전립선암 세포주(PC-3 및 LNCaP) 및 결장암 세포주(SW620 및 HCT116)의 핵 전사인자 NF-κB DNA 결합 활성 및 종양 괴사 인자-알파-유도 전사 활성을 감소시켰으며 이에 따라 암세포의 증식을 저해하였다.

또한 4-O-메틸호노키올은 G₀-G₁기 세포주기 저지를 통해 아폽토시스성 세포사멸을 유도하였다. 세포 증식 저해 효과와 마찬가지로 4-O-메틸호노키올은 세포주기 단백질인 사이클린(cyclin) D1, 사이클린 E, 41사이클린-의존적 키나제 2(CDK2), CDK4의 발현을 감소시켰으나 p21 단백질 및 p53 단백질의 유도를 나타내었다.

또한 4-O-메틸호노키올-처리 암세포는 Bcl-2, 서비빈(Survivin), 글리코겐 신타제 키나제-3β(GSK-3β), 카스파제-9, 카스파제-3, cIAP, αIAP, COX-2 및 iNOS와 같은 아폽토시스 저해 단백질의 발현 수치의 현저한 감소를 나타내었으나 Bax, 활성화 카스파제-3 및 활성화 카스파제-9와 같은 아폽토시스 유발 단백질을 증가시켰다.

그러나 사이클린 D1/CDK4 결합 자리지정-돌연변이된 p21로 트랜스펙트된 암세포뿐만 아니라 소간섭 RNA(siRNA)로 넉다운(knockdown)시킨 p21은 핵 전사인자 NF-κB 활성을 저해하지 않았으며, 아폽토시스성 세포사멸을 유발하거나 4-O-메틸호노키올-유도된 세포 성장 저해를 나타내지 않았고 사이클린 D1 및 CDK4의 발현을 하지 못하였다.

반대로 특정 저해제 또는 p50 및 p65의 siRNA로의 핵 전사인자 NF-κB의 저 해는 4-O-메틸호노키올-유도 p21 발현 및 세포 성장 저해를 제거시켰다. 더욱이 결장암 세포주(SW620) 및 전립선암 세포주(PC-3)와 같은 암세포를 지닌 생체 내 이종이식 누드 마우스에서 4-O-메틸호노키올은 종양 성장, p21 발현 및 NF-κB 활성, 세포주기 및 아폽토시스 저해 단백질의 발현을 저해하였으나 아폽토시스성 세포사멸 및 조절 단백질을 증가시켰다.

따라서 본 발명은 4-O-메틸호노키올이 활성화된 NF-κB의 억제와 함께 p21 매개된 세포주기 정지를 통해 인간 결장 및 전립선 암세포 성장을 저해시킴을 나타낸다. 따라서 4-O-메틸호노키올이 결장암 및 전립선암에 유용한 항암제임을 확인할 수 있는 것이다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

시험관 내 인간 결장암 및 전립선암 세포의 NF-κB 활성화를 저해하는 4- O -메틸호노키올

핵 전사인자 NF-κB는 결장암 및 전립선암 치료제에 대한 저항성뿐만 아니라 아폽토시스성 세포사멸에 관련된 인자이다. 결장 및 전립선 암세포는 매우 활성화된 NF-κB를 지닌다. 4-O-메틸호노키올이 활성화된 NF-κB의 저해를 통해 결장 및 전립선 암세포의 성장을 저해하는지 여부를 측정하기 위해 본 발명자들은 먼저 전기영동 겔 이동 변화 분석에 의해 NF-κB의 DNA 결합 활성을 측정하였다.

본 발명은 비처리된 LNCaP 및 PC3 인간 전립선암 세포주 뿐만 아니라 SW620 및 HCT116 인간 결장암 세포주 내에서 높은 수치의 NF-κB DNA 결합 활성(구성적 활성화)을 발견하였다. 1시간 동안의 4-O-메틸호노키올 처리는 농도 의존적 방식(10∼30 μM)으로 핵 전사인자 NF-κB의 구성적으로 활성화된 DNA 결합 활성을 저해하였다(도 1A). 이러한 핵 전사인자 NF-κB의 DNA 결합 활성은 p50 및 p65 항체를 이용한 수퍼 쉬프트 에세이뿐만 아니라 핵 전사인자 NF-κB 공통서열의 과도한 비 [γ-³²P] ATP-표지 올리고뉴클레오타이드를 이용한 경쟁 분석에 의해 확인되었다.

핵 전사인자 NF-κB-의존적 수용체 유전자 활성 상의 4-O-메틸호노키올 효과를 측정하기 위해 본 발명자들은 핵 전사인자 NF-κB-조절된 루시페라제 수용체 컨스트럭트로 세포를 일시적으로 트랜스펙트시킨 후 트랜스펙트된 세포를 TNF-α 또는 TNF-α와 4-O-메틸호노키올의 화합물로 자극시켰다. 핵 전사인자 NF-κB-조절된 루시페라제 활성이 자극 없이 검출되지 않았기 때문에 본 발명자들은 TNF-α로 세포를 처리하였다. 핵 전사인자 NF-κB DNA 결합 활성 상의 저해 효과와 마찬가지로 4-O-메틸호노키올(10∼30 μM)은 TNF-α-유도된 핵 전사인자 NF-κB 루시페라제 활성을 농도-의존적으로 저해하였다(도 1B). 공초점 현미경 분석은 p50 및 p65의 세 포핵 내로의 전위도 4-O-메틸호노키올에 의해 감소되었음을 확인시켰다(도 1C).

인간 결장 암세포 및 전립선 암세포 성장을 저해하는 4- O -메틸호노키올

핵 전사인자 NF-κB 활성화의 저해가 암세포 성장 저해와 관련되는지 여부를 조사하기 위해 결장암 세포주 SW620 및 HCT116, 전립선암 세포주 LNCaP 및 PC3 암세포 성장 상의 4-O-메틸호노키올 저해 효과를 트립판 블루 염료 배제 분석을 이용하여 세포수의 직접적인 계측에 의해 분석하였다. 형태 관찰은 세포가 4-O-메틸호노키올의 처리에 의해 점진적으로 크기가 감소되고 작은 원형 단일 세포 형태로 변화됨을 나타내었다(도 2). 또한 4-O-메틸호노키올에 의한 세포 성장 저해는 CCK-8 분석에 의해 확인되었다. 4-O-메틸호노키올(10∼30 μM) 처리는 SW620, HCT116, PC3 및 LNCaP 세포의 세포 성장의 유의적인 농도 및 시간 의존적 저해를 유발하였다(도 2A, B 및 D, E). 그러나 4-O-메틸호노키올은 실험 농도에서 정상 결장 세포주 CCD-112 CON 및 정상 전립선 세포주 PWR-E 세포에서는 세포 독성을 나타내지 않았다(도 2C 및 F). 후박(Magnolia officinalis)에서 분리된 리그난 화합물이 유사한 암세포 성장 저해 능력을 지니는지 여부 및 그의 NF-κB 활성에 대한 상관관계를 조사하기 위해 본 발명은 호노키올, 마그놀올, 오보바톨 및 메틸호노키올에 의한 세포 성장 저해 및 NF-κB DNA 결합 활성을 비교하였다. SW620 및 PC3 세포 내 세포 성장 저해 정도는 PC-3 세포 내 오보바톨 효과를 제외하고 유사하였다. 이러한 세포 성장 저해는 NF-κB DNA 결합 활성 저해와 일치한다.

G ₀ /G ₁ 기 세포주기 저지를 유발하고 세포주기 조절 단백질 발현을 유도하는 4- O -메틸호노키올

다수의 암 화학요법제에 의한 암세포 성장 억제는 세포주기 진행의 교란과 상호관련된다. 4-O-메틸호노키올에 의한 암세포 성장 저해의 메커니즘을 조사하기 위해 본 발명은 세포주기 분포 상의 그의 효과를 측정하였다. 암세포 내 세포주기 분포를 나타내는 흐름 그래프는 도 4에 나타나 있다. 4-O-메틸호노키올(10∼30 μM)에 대한 세포의 노출은 G₀/G₁ 분획의 증가를 유발하였고, 이는 결장 및 전립선 암세포 모두에서 용량(도 4A) 및 시간(도 4B) 의존적 방식으로 S기 세포의 감소가 동반되었다. 진핵세포 세포주기 진행은 대응 조절 사이클린과의 결합이 그의 활성화에 필수적인 CDK의 연속 활성화를 포함한다.

본 발명은 4-O-메틸호노키올-유도된 세포주기 저지의 메커니즘을 조사하기 위해 면역블럿팅에 의해 G₀/G₁-특이적 사이클린 및 CDK의 발현 수치상의 4-O-메틸호노키올 효과를 측정하였다. 도 4C에 나타난 바와 같이 4-O-메틸호노키올 처리는 결장 및 전립선 암세포 내 사이클린 D, CDK2, Cdk4 및 사이클린 E의 단백질 수치의 신속하고 현저한 감소를 유발하였다(도 4C). 이들 결과는 전립선 및 결장 암세포 내 4-O-메틸호노키올-매개된 세포주기 저지가 G₀/G₁ 세포주기 조절과 관련된 사이클 린 및 CDK의 단백질 수치 감소와 관련됨을 나타내었다. CDK 저해제 p21은 Rb 단백질을 과인산화시키고 세포주기 진행을 유발하는 CDK/사이클린 복합체에 결합하고 키나제 활성을 저해함으로서 G₀/G₁ 변환의 조절에 중요한 역할을 한다. 4-O-메틸호노키올-유도된 G₀/G₁기 세포주기 저지의 메커니즘을 더욱 조사하기 위해 본 발명은 면역블럿팅에 의해 p21 및 Rb의 단백질 수치 및/또는 인산화 상의 그의 효과를 측정하였다.

도 4C에 나타난 바와 같이 4-O-메틸호노키올 처리는 암세포 내에서 p21 단백질 발현 증가를 유발하였으나 Rb 인산화를 억제시켰다(도 4C). 또한 p53도 세포주기 진행 조절에 관련된다. 도 4C에 나타난 바와 같이 4-O-메틸호노키올-처리 암세포는 p53의 단백질 수치 및 인산화의 증가를 나타내었다.

아폽토시스성 세포사멸을 유도하는 4- O -메틸호노키올

4-O-메틸호노키올에 의한 세포주기 저지 저해가 아폽토시스성 세포사멸의 유도를 유발하는지 여부를 조사하기 위해 본 발명은 DAPI 및 TUNEL 이중 염색을 이용함으로서 아폽토시스성 세포사멸 내 변화를 평가한 후 TUNEL-표지 세포는 형광 현미경에 의해 분석되었다. 처리된 세포 내에서 TUNEL 표지된 세포수는 증가되었다(도 3A). 아폽토시스성 세포수(DAPI-양성 TUNEL 염색 세포)는 10∼30 μM의 4-O-메 틸호노키올 처리에 의해 SW620 내에서 2±3, 10±5, 55±13 및 76±8%, HCT116 결장 암세포 내에서 2±4, 15±18, 45±5 및 73±7%, PC3 세포 내에서 3±5, 10±6, 30±20 및 75±2%, LNCaP 세포 내에서 0±6, 6±20, 50±6 및 63±2%으로 증가되었다(도 3B).

암세포 내 NF-κB 활성화는 아폽토시스에 대한 저항성 및 아폽토시스성 조절 단백질 발현과 상호관련된다. 4-O-메틸호노키올에 의한 아폽토시스 유도와 그의 조절 단백질 발현 사이의 상관관계를 규명하기 위해 아폽토시스 관련 단백질 발현이 조사되었다. GSK-3β 및 서비빈 뿐만 아니라 Bcl-2, 아폽토시스 단백질의 Bcl-2 결합 저해제(XIAP) 및 아폽토시스 단백질 2의 저해제(cIAP1/2)와 같은 항-아폽토시스 단백질의 발현은 감소되었으나(도 5), 프로-아폽토시스 단백질; Bax, 카스파제-3, 분열된 카스파제-3 및 분열된 카스파제-9는 4-O-메틸호노키올 처리에 의해 증가되었다(도 5). 더욱이 전립선암 및 결장암의 종양 촉진에 관련되는 COX-2 및 iNOS는 농도-의존적 방식으로 4-O-메틸호노키올 처리 후 유의적으로 감소되었다(도 5).

암세포 성장 및 아폽토시스성 세포사멸 상의 4- O -메틸호노키올의 효과를 감소시키는 NF-κB 넉다운

암세포 성장시 NF-κB 저해의 역할을 측정하기 위해 세포는 4-O-메틸호노키올(20 μM) 처리 전(30분) siRNA p65 또는 p50으로 전처리되었다. 4-O-메틸호노키 올에 의한 세포 성장 저해는 4-O-메틸호노키올 단독으로 처리된 암세포와 비교시 p50 및 p65 siRNA로 트랜스펙트되거나 NF-κB 저해제(PAO, 0.5 μM)로 처리된 SW620 및 PC-3 세포에서 증가되었다(도 6A). 또한 아폽토시스성 세포사멸은 p50 및 p65 siRNA-트랜스펙트된 SW620 암세포 및 PC3 암세포 또는 NF-κB 저해제로 처리된 세포 내에도 증가되었다(도 6B). 또한 p65 및 p50 siRNA에 의해 및 NF-κB 저해제(페닐라신 옥사이드; PAO, 0.5 μM)에 의해 처리된 세포 내에서 p21, 사이클린 D1 및 CDK4(세포주기 저지 마커 단백질)의 발현은 더욱 더 크게 감소되었으나 분열된 카스파제-3(대표적인 세포사멸 마커 단백질로 선택됨)의 발현은 더욱 더 증가되었다(도 6). 이들 결과는 전립선 및 결장 암세포 모두의 4-O-메틸호노키올-매개된 성장 저해가 NF-κB 신호 저해와 상호관련될 수 있음을 더욱 확인시켰다.

암세포 성장 저해 및 아폽토시스성 세포사멸 상의 4- O -메틸호노키올의 효과를 제거시키는 p21 넉다운

4-O-메틸호노키올-유도 세포주기 저지의 p21 역할을 조사하기 위해 본 발명은 siRNA p21로 트랜스펙트된 암세포의 성장 상의 4-O-메틸호노키올의 효과를 측정하였다. P21 siRNA로의 결장 SW620 및 전립선 PC-3 암세포의 일시적으로 트랜스펙션은 4-O-메틸호노키올-유도된 아폽토시스성 세포사멸(도 7C)뿐만 아니라 암세포 성장 상의 저해 효과(도 7A)의 제거를 유발하였다. 더욱이 p21 siRNA로의 암세포의 일시적 트랜스펙션은 p65, p50, GSK-3β, 사이클린 D1 및 Cdk4 발현의 4-O-메틸호 노키올-유도된 감소뿐만 아니라 4-O-메틸호노키올-유도된 NF-κB 저해 및 분열된 카스파제-3 발현의 4-O-메틸호노키올-유도된 증가를 제거시켰다(도 7C). 더욱이 p21의 siRNA의 제거 효과와 유사하게 돌연변이 p21(p21의 사이클린 D1 및 Cdk4 복합체 결합 사이트의 돌연변이화)로의 결장 SW620 및 전립선 PC-3 암세포의 일시적 트랜스펙션도 세포 성장, NF-κB 활성, 사이클린 D1 및 Cdk4의 발현 상의 4-O-메틸호노키올의 저해 효과를 제거하였고 분열된 카스파제-3의 발현뿐만 아니라 아폽토시스성 세포사멸의 4-O-메틸호노키올-유도된 유도를 제거하였다(도 7).

생체 내 이종이식 모델 내 결장 및 전립선 암세포 성장을 저해하는 4- O -메틸호노키올

생체 내 4-O-메틸호노키올의 항암 효과를 규명하기 위해 4-O-메틸호노키올 처리 후 결장 및 전립선 암 이종이식-포함 누드 마우스 내 종양 성장이 조사되었다. SW620 및 PC3 이종이식 조사시 4-O-메틸호노키올은 마우스에 100 내지 300 ㎟ 부피 범위로 4주간 매일 i.p 투여되었다. 마우스는 주 2회 체중이 측정되었다. 대조군과 4-O-메틸호노키올-처리 마우스(n=10) 간의 체중 변화는 실험 동안 현저하게 상이하지 않았다. 도 8과 도 9는 대조군과 비교시 4-O-메틸호노키올 처리 후 측정된 상대 종양 성장 지연을 나타낸다. 28일째에 최종 종양 중량이 기록되었다. 40 및 80 mg/kg 용량의 4-O-메틸호노키올 및 10 mg/kg 용량의 시스플라틴으로 처리된 마우스 내 종양 부피는 각각 대조군의 65%, 40% 및 20%이었다(도 8A). 40 및 80 mg/kg 용량의 4-O-메틸호노키올 및 10 mg/kg 용량의 시스플라틴으로 처리된 마우스 내 종양 중량은 각각 대조군의 75%, 60% 및 45%이었다(도 9A). H&E 및 PCNA, Ki67 및 서비빈 염색에 대한 항원 증식에 의한 종양 절편의 면역조직화학적 분석은 40 및 80 mg/kg 용량-의존적으로 종양 세포 성장을 저해함을 나타내었다. 이들 결과는 4-O-메틸호노키올이 생체 내 결장 및 전립선 암세포 성장을 억제함을 나타내었다.

또한 본 발명은 생체 내 NF-κB 활성 상의 4-O-메틸호노키올 효과를 측정하였다. 시험관 내 저해 효과와 유사하게 4-O-메틸호노키올은 종양 조직에서 NF-κB의 DNA 결합 활성을 용량-의존적으로 저해하였다. 또한 본 발명은 종양 조직에서 NF-κB 서브유니트 p65 및 p50의 면역조직화학적 염색 패턴의 특성을 나타내었다. 4-O-메틸호노키올-처리 종양 조직 내 p65 및 p50의 세포핵 염색의 강도 감소 경향이 존재하였다.

이들 데이터는 생체 내 및 시험관 내 NF-κB의 DNA 결합 활성 상의 4-O-메틸호노키올 저해 효과와 일치하고 NF-κB가 4-O-메틸호노키올의 타겟임을 나타낸다. 또한 4-O-메틸호노키올은 종양 조직 내에서 Bax, 카스파제-3 및 카스파제-9를 증가시켰으나 Bcl-2, AIAP 및 cIAP의 발현을 억제시켰다(도 10). 또한 면역조직화학적 분석은 대조군과 비교시 4-O-메틸호노키올-처리 종양 조직 내에서 분열된 카스파제-3, 9 양성 세포 발현의 상당한 증가를 나타내었다. 그러나 Bcl-2-양성 세포는 유의적으로 감소되었다(도 10). 또한 아폽토시스성 세포사멸은 4-O-메틸호노키올-처 리 종양 조직 내에서 유의적으로 증가되었다(도 10). 더욱이 생체 내 종양 조직에서 p21 발현은 4-O-메틸호노키올에 의해 유의적으로 증가되었으나 p50 수치는 감소되었다.

본 발명은 4-O-메틸호노키올이 G₀/G₁기 세포주기 저지 후 아폽토시스성 세포사멸의 유도와 관련하여 결장 및 전립선 암세포의 성장을 억제함을 나타내었다. NF-κB 넉다운이 아닌 p21 넉다운이 4-O-메틸호노키올 유도된 아폽토시스성 세포사멸뿐만 아니라 G₀/G₁기에서의 세포주기 저지를 증가시키기 때문에 4-O-메틸호노키올-유도된 결장 및 전립선 암세포 성장 저해는 NF-κB 활성 저해뿐만 아니라 p21 발현 증가에 의해 유발되는 것으로 보인다.

많은 연구는 p21 발현 유도가 인간 형질전환된 악성 세포의 세포주기의 G₀-G₁기에서 세포를 저지시킴을 나타내었다. p21 단백질은 CDK를 저해함으로서 G₁-S 변환을 조절한다. 본 발명은 4-O-메틸호노키올 처리가 결장 및 전립선 암세포 모두에서 G₀-G₁ 세포주기 저지와 동시에 p21 단백질의 유도를 유발함을 나타낸다. 따라서 p21 단백질의 유도는 세포주기 저지의 원인이 된다. 4-O-메틸호노키올-유도된 세포주기 저지에 대한 p21의 연루는 더욱 입증되었다.

즉 4-O-메틸호노키올-매개된 아폽토시스성 세포사멸뿐만 아니라 G₀-G₁ 세포주기 저지 및 CDK2/CDK4뿐만 아니라 사이클린 D 및 E의 발현은 siRNA로의 p21 단백질의 넉다운 후 제거되었다. 더욱이 p21의 사이클린/CDK 결합 사이트 돌연변이로 트랜스펙트된 세포는 4-O-메틸호노키올에 반응하지 않았다. 4-O-메틸호노키올-유도된 세포주기 저지 및 사이클린 및 CDK의 저해는 p21 돌연변이 세포에서 관찰되지 않았다. 따라서 본 발명은 p21 발현의 유도가 인간 결장 및 전립선 암세포의 4-O-메틸호노키올-유도된 G₀-G₁기 세포주기 저지에 중요함을 나타낸다.

본 발명의 실험과 유사하게 후박에서 분리된 또다른 성분인 호노키올은 혈관 평활근 세포뿐만 아니라 전립선 암세포에서 p21의 유도를 통해 G₀-G₁기 세포주기 저지를 유도한다. 또한 마그놀올은 인간 방광암에서 G₀-G₁기 세포주기 저지를 유발한다. 이들 결과는 후박에서 분리된 화합물이 항암 세포에 유용할 수 있고 그의 항-종양 효과는 p21의 발현 증가를 통한 G₀-G₁기 세포주기 저지 상의 이들 화합물의 능력과 관련됨을 나타낸다.

G₀-G₁에서 저지된 암세포는 아폽토시스성 세포사멸 유도에 의해 사멸될 수 있다. 핵 전사인자인 NF-κB는 세포 성장 및 아폽토시스성 세포사멸을 조절한다. NF-κB는 p21, Bax, 카스파제-3 및 카스파제-9, Bcl-2, IAP 및 서비빈과 같은 다양 한 타겟 유전자의 발현 및 카스파제-9 및 카스파제-3의 활성화를 조절함으로서 성장 저지 및/또는 아폽토시스에 중요한 전사인자이다. 본 발명에서 4-O-메틸호노키올은 용량 의존적 방식으로 NF-κB DNA 결합 및 NF-κB 전위를 감소시켰다. NF-κB의 불활성화가 아폽토시스성 세포사멸을 통해 암세포 성장을 차단한다는 의견과 상호관련하여 4-O-메틸호노키올은 결장 및 전립선 암세포 모두에서 아폽토시스성 세포사멸을 효과적이고 유의적으로 유도함이 발견되었다.

더욱이 특정 NF-κB 저해제 또는 NF-κB의 siRNA에 의한 넉다운으로의 4-O-메틸호노키올 처리는 아폽토시스 조절 단백질(분열된 카스파제-3) 및 p21 발현뿐만 아니라 4-O-메틸호노키올-유도된 아폽토시스성 세포사멸을 증가시켰다. 커큐민 및 인돌-3-카비놀(I3C)과 같은 많은 자연 발생적 항암제는 NF-κB 타겟 유전자의 조절을 통해 암세포 성장을 저해함이 주목된다. 커큐민은 인간 골수성 백혈병 세포(U937)에서 세포 증식(사이클린 D1, COX-2 및 c-myc) 및 항-아폽토시스(IAP1, IAP2, XIAP, Bcl-2, Bcl-xL, Bfl-1/A1, TNF 수용체-결합 인자 1 및 세포성 FLIP) 단백질과 관련된 NF-κB-조절된 유전자 생성물의 발현을 조절하였다. 또한 인돌-3-카비놀(I3C)은 인간 T-세포 백혈병 세포(Jurkat) 내에서 세포 증식(사이클린 D1 및 COX-2), 항-아폽토시스(서비빈, cIAP1/2, XIAP, Bcl-2, Bfl-1/A1, TRAF1 및 FLIP) 및 침입(MMP-9)과 관련된 유전자를 저해하였다.

이들 발견과 마찬가지로 본 발명의 데이터는 4-O-메틸호노키올이 생체 내 뿐 만 아니라 시험관 내에서 세포 증식(사이클린 D1 및 COX-2) 및 항-아폽토시스(XIAP, IAP1/2 및 Bcl-2)와 관련된 NF-κB-조절된 유전자 생성물을 명백하게 저해하였고 프로-아폽토시스 유전자(카스파제-3, 9 및 Bax)를 증가시켰다. 본 발명의 데이터는 NF-κB의 불활성화를 통한 전립선 및 결장 암세포를 포함한 여러 암세포의 시험관 내 생체 내 항-종양 활성을 나타내는 후박에서 분리된 호노키올 및 마그놀올의 효과와 유사하다. 또한 본 발명자들은 후박에서 분리된 또다른 화합물인 오보바톨이 NF-κB의 불활성화를 통해 결장 및 전립선 암세포를 저해함을 발견한 바 있다. 이들 데이터는 NF-κB의 구성화된 활성화시 4-O-메틸호노키올의 저해 능력이 아폽토시스성 세포사멸의 유도를 통해 결장 및 전립선 암세포 성장의 4-O-메틸호노키올-유도 저해에 관련됨을 나타낸다.

또한 4-O-메틸호노키올은 종양 조직 내 PCNA, Ki67 및 생존 반응 세포 수의 유의적인 감소에 의해 입증된 바와 같이 생체 내 결장 및 전립선 종양의 성장을 유의적으로 저해함이 관찰되었다. 또한 4-O-메틸호노키올은 결장 및 전립선 암 이종이식 누드 마우스 종양 조직 모두에서 세포핵 내로의 p50 및 p65의 전위, 항-아폽토시스 단백질(XIAP, IAP1/2 및 Bcl-2)의 발현을 감소시켰으나 p21뿐만 아니라 프로-아폽토시스 단백질(카스파제-3, 9 및 Bax)의 발현을 증가시켰다.

본 발명의 발견과 유사하게 최근의 여러 연구는 항암제가 NF-κB 활성화 저해에 의해 동반되는 p21의 상향조절을 통해 여러 인간 암세포의 성장을 저재할 수 있음을 나타내었다. 대두 펩타이드는 p21 단백질 발현 유도를 통해 NF-κB 활성화를 유발하는 신호전달 경로를 억제함으로서 인간 유방 MCF-7 종양 세포의 성장을 현저하게 저해하고 아폽토시스를 유도하였다. 더욱이 커큐민은 NF-κB p65의 단백질 발현을 하향-조절함으로서 p21 발현을 상향-조절시켜 인간 유방암 MDA-MB-231 세포의 이동 활성을 저해하고 아폽토시스를 유도하였다. 더욱이 커큐민(Bufo melanostictus Schneider)과 피부-유래 인자(BM-ANF1)의 혼합 처리는 NF-κB 신호전달의 감소를 통한 p21의 상향조절에 의해 결장 암세포 성장을 저해하는 것으로 나타났다. 인간 유방 암세포 SK-Br-3 세포 내 아폽토시스는 NF-κB의 하향조절 및 p21의 상향조절의 발현을 통해 레인 리시네이트(rhein lysinate)에 의해 유도되었다. 이들 생체 내 결과는 4-O-메틸호노키올이 NF-κB의 불활성화 및 세포주기 저해제 p21의 발현 증가를 통한 아폽토시스성 세포사멸을 통해 결장 및 전립선 종양 세포의 성장을 억제시킴을 나타낸다.

본 발명에서 결장 및 전립선 암세포 성장의 저해, 아폽토시스성 세포사멸 및 세포주기 진행 저지는 10∼30 μmol/L 4-O-메틸호노키올 농도에서 관찰되었다. 이러한 농도의 4-O-메틸호노키올이 인간의 약동학적 데이터 부재시 생체 내에서 달성 가능한지 여부는 예측하기 어렵다. 그럼에도 불구하고 본 발명에서 사용된 4-O-메틸호노키올 농도는 후박에서 분리된 화합물의 항-종양 효과를 증명하기 위해 종전 연구에서 사용된 범위 내에 존재한다. 예를 들어 2 mg 호노키올/마우스의 i.p. 주입에 의한 암컷 누드 마우스 내 RKO 결장직장암종 세포 성장의 저해가 관찰된 바 있다. 더욱이 80 mg/kg 용량의 호노키올 투여는 대조군 마우스와 비교시 ∼71%까지 평균 생존시간을 유의적으로 증가시켰다. 그러나 본 발명은 (a) PC-3 세포에 대한 경구 투여된 호노키올의 생체 내 항암 활성 및 (b) 호노키올-처리 마우스에서 유래된 종양 내 증가된 아폽토시스 및 감소된 세포 증식 및 혈관생성을 증명하기 위한 최초로 발표된 보고이다. 본 발명에서 누드 마우스에 이식된 SW620 및 PC-3 암세포의 성장은 80 mg 4-O-메틸호노키올/kg 체중/일의 i.p. 주입에 의해 약 50% 저해되었다. 체중 감소 및 다른 독성은 4-O-메틸호노키올-처리 마우스에서 관찰되지 않았다. 총괄적으로 이들 결과는 4-O-메틸호노키올이 인간 결장 및 전립선암에 대한 가능한 화학예방제 및/또는 치료 효능을 측정하기 위해 추가적인 임상 조사가 고려되어야 함을 나타낸다.

본 발명의 의약 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제형시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 적합한 투여량은 제형화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라 다양한 방법으로 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.01∼1000 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 의약 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분인 4-O-메틸호노키올의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요 기간, 질환의 정도 등을 고려하여 결정하며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제형화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

시약

4-O-메틸호노키올은 후박(Magnolia officinalis Rehd. et Wils)의 껍질에서 분리된 후 n-헥산, 에틸 아세테이트 및 n-BuOH로 추출된 후 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR에 의해 확인되다. 4-O-메틸호노키올은 99.6% 순도의 백색 분말로 Bioland Ltd.(한국 충남)에서 구입하였다. 4-O-메틸호노키올의 원액은 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 희석되었다(최종 농도 50 mmol/L).

(실시예 1) 세포 배양

HCT116 및 SW620 인간 결장암 세포주, LNCaP 및 PC-3 인간 전립선암 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 획득되었고 5% CO₂ 가습 공기 내에서 37℃에서 10% 우태아혈청, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 지닌 RPMI1640 내에서 성장되었다. 인간 결장 CCD 112-CoN 세포 및 전립선 정상 세포 PWR-1E 세포도 ATCC에서 획득되었고 5% CO₂ 가습 공기 내 에서 37℃에서 10% 우태아혈청, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 지닌Eagle's 최소 필수 배지(EMEM) 내에서 성장되었다.

(실시예 2) 세포 성장 분석

HCT116 및 SW620 인간 결장암 세포주 LNCaP 및 PC-3 인간 전립선암 세포주는 100 ㎕ 배지 당 96 웰 플레이트 내에서 10⁴ 세포/웰의 밀도로 평판 배양되었다. 세포 성장 저해 효과는 제조사의 지침에 따라 세포 계측 에세이 키트(CCK-8 kit, Dojindo, Maryland, USA)를 이용하여 24, 48 및 72시간 동안 배양된 세포 내에서 평가되었다. 총 세포수는 트립판 블루 분석에 의해 평가되었다. 각각의 분석은 3반복으로 수행되었다.

(실시예 3) 트랜스펙션 및 루시페라제 활성

HCT116 및 SW620 인간 결장암 세포주 LNCaP 및 PC-3 인간 전립선암 세포주(1 X 10⁵ 세포/웰)는 24-웰 플레이트 내에 평판 배양되었고 제조사(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)의 설명서에 따라 OPTI-MEN 내의 플라스미드와 리포펙트(lipofect) AMINE PLUS의 혼합물을 이용하여 pNF-κB-Luc 플라스미드(5x NF-κB; Stratagene, CA, USA)로 일시적으로 트랜스펙트되었다. 트랜스펙트된 세포는 TNF- α(10 ng/ml)의 부재 또는 존재시 8시간 동안 다른 농도(10∼40 μM)의 4-O-메틸호노키올로 처리되었다. 루시페라제 활성은 제조사의 지침(PerkinElmer Life And Analytical Sciences, Inc., Waltham, MA, USA)에 따라 루시페라제 분석 키트(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 측정되었다.

(실시예 4) 겔 전기이동 변화 및 수퍼 쉬프트 에세이

겔 전기이동 쉬프트 분석은 Son, D.J. et al., Mol Cancer Ther, 6, 675-83, 2007에 기술된 바와 같이 수행되었다. 단백질 밴드의 상대 밀도는 My Image를 이용하여 농도 계측기에 의해 스캔되었고 Labworks 4.0 소프트웨어(UVP Inc.)에 의해 정량화되었다.

(실시예 5) 웨스턴 블럿 분석

웨스턴 블럿 분석은 Son, D.J. et al., Mol Cancer Ther, 6, 675-83, 2007에 기술된 바와 같이 수행되었다. 멤브레인은 특정 항체와 함께 상온에서 5시간 동안 인큐베이트되었다: p65 및 p50에 대한 마우스 폴리클론 항체(1:500 희석, Santa Cruz Biotechnology Inc.), CDK6 및 p53에 대한 마우스 단일클론 항체(1:500 희석, Santa Cruz Biotechnology Inc.), CDK4, p21, 사이클린 D 및 사이클린 E(1:500 희석, Medical and Biology Laboratories Co. LTD., Japanese), iNOS(1:500 희석, BD transduction, CA, USA), Bax, Bcl-2 및 GSK-3β에 대한 토끼 폴리클론(1:500 희석, Santa Cruz Biotechnology Inc.), 카스파제-3, 분열된 카스파제-3, 카스파제-9, 분열된 카스파제-9, pp53, 서비빈 및 c-IAP1(1:1000 희석, Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA, USA), cIAP2(1:500 희석, Adcam Ltd, Cambridge, UK) 및 COX-2(1:500 희석, Cayman chemical company, MI, USA). 이후 블럿은 대응하는 컨쥬게이트된 항-토끼 및 항-마우스 면역글로불린 G-당근 과산화효소(1:2,000 희석, Santa Cruz Biotechnology Inc.)와 인큐베이트되었다. 면역반응 단백질은 ECL 웨스턴 블럿팅 검출 시스템으로 검출되었다. 단백질의 상대 밀도는 MyImage를 이용하여 농도 계측기에 의해 스캔되었고 Labworks 4.0 소프트웨어에 의해 정량화되었다.

(실시예 6) 유세포 측정에 의한 세포주기 분석

세포는 채취되고 70% 에탄올 내에서 고정되고 -20℃에서 보관되었다. 이후 세포는 얼음-냉각된 인산염-완충 식염수로 2회 세척되었고 RNase 및 DNA 삽입 색소인 요오드화프로피듐과 인큐베이트되었다. 세포-주기 분석은 FACS 캘리버 기기(BD Biosceinces, San Jose, CA)를 이용하여 수행되었다.

(실시예 7) siRNA의 트랜스펙션

인간 결장암 세포주 SW620 및 전립선암 세포주PC-3 는 무혈청 배양 배지 내에서 제조된 WelFect-EX 플러스 트랜스펙션 시약(WelGENE, Seoul, Korea)을 이용하여 37℃에서 5시간 동안 100 nM의 CDKN1A(p21), NF-κB-(p50) 및 NF-κB-(p65) siRNA 또는 비-특이적 siRNA(Bioneer, Co., Korea) 및 돌연변이된 사이클린 CDK 복합체 결합 사이트(Cy1 사이트, △17-24)인 p21 돌연변이 플라스미드(CDKN1A p21, 버지니아주 샬러츠빌 버지니아 의과대학 생화학 분자 유전학과 Anindya Dutta 박사로부터 획득)로 트랜스펙트되었다. 5시간 후 배지 전부가 첨가되었고 세포는 48시간 동안 추가 배양되었다.

(실시예 8) 아폽토시스의 검출

아폽토시스의 검출은 Son, D.J. et al., Mol Cancer Ther, 6, 675-83, 2007에 기술된 바와 같이 수행되었다. 간단하게, 세포는 8-챔버 슬라이드 상에서 배양되었다. 4-O-메틸호노키올(10∼40 μM)로 24시간 동안 처리 후 세포는 PBS로 2회 세척되었고 상온에서 PBS 내 4% 파라포름알데하이드 내 인큐베이션에 의해 고정되었다. TdT-매개 dUTP 틈 및 표지(TUNEL) 분석은 제조사의 지침에 따라 원위치 세포사멸 검출 키트(Roche Diagonostics GmbH, Mannheim, Germany)를 이용하여 수행되었다. 제공된 면적 내 세포의 총수는 DAPI 염색을 이용하여 측정되었다. 아폽토시스 지수는 TUNEL-양성 염색 세포수를 계측된 총 세포수 x 100으로 나눔으로서 측정되었다.

(실시예 9) 이종이식 동물 모델 생체 내 항종양 활성 조사

6-주령 수컷 BALB/c 흉선 없는 마우스는 일본 SLC(Hamamatsu, Japan)에서 구입하였다. 모든 실험은 "동물 관리 및 이용"을 위한 충북대학교 지침서에 따라 승인되고 수행되었다. 인간 결장암 세포주 SW620 및 PC3 세포는 27-게이지 바늘로 마우스 우측 하부 옆구리 내로 피하 주사되었다(1 X 10⁷ 종양 세포/0.1 ml PBS/동물). 20일 후 종양이 300∼400 ㎣의 평균 부피에 도달하는 경우 종양-보유 누드 마우스는 3주간 주 2회 4-O-메틸호노키올로 복막내(i.p.) 주사되었다. 또한 양성 대조군으로서 시스플라틴(0.6% TWEEN 80 및 0.3% 에탄올 내에 용해된 10 mg/kg)이 주 1회 복막내 주사되었다. 0.01 M DMSO로 처리된 군은 대조군으로 지정되었다. 동물의 체중 및 종양 부피는 주 2회 모니터되었다. 종양 부피는 버니어 캘리퍼스(vernier calipers)로 측정되었고 하기 식으로 계산되었다: (A X B²)/2, 2개 수치 중 A는 더 큰 것이고 B는 더 작은 것이다. 실험 종료시 동물은 경추 탈골로 사망시켰다. 종양은 주변 근육 및 진피로부터 분리되고 절제되고 측량되었다.

(실시예 10) 면역조직화학

모든 표본은 조사를 위해 포르말린 내에 고정되고 파라핀-봉입되었다. 5 ㎛ 두께 절편은 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색되었고 면역조직화학을 위해 사용되었다. 상온에서 4시간 동안 차단 혈청 내에서 적당하게 희석된 1차 마우스 PCNA 및 Ki-67 단일클론 항체로(1:200 희석) 또는 4℃에서 밤새 차단 혈청 내 적당하게 희석된 1차 마우스 항-인간 p65 항체(1:100 희석) 또는 1차 토끼 항-인간 p50 및 분열된 카스파제-3 폴리클론 항체(1:100 희석)로 인큐베이트된 절편은 이후 비오틴화된 항-마우스 및 토끼 항체 내에서 2시간 동안 인큐베이트된 후 아비딘비오틴-과산화효소 복합체(ABC, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) 처리되었다. 조직 절편은 디아미노벤지딘 및 과산화물로 현상된 후 헤마톡실린으로 대조염색되고 아쿠아-마운트(qua-mount) 내에 봉입되고 광학 현미경(x200, Olympus, Tokyo, Japan) 상에서 평가되었다. 음성 대조군은 1차 항체를 생략함으로서 모든 경우에 수행되었다. 모든 절편은 헤마톡실린에 의해 대조염색되었다. 정량을 위해 3개의 무작위 선택 면적에서의 200개 세포가 평가되었고 양성으로 PCNA, Ki-67, p65, p50 및 분열된 카스파제-3-염색된 세포가 계측되었고 염색된 세포의 비율로 표기되었다. 종양 조직 내 아폽토시스성 세포사멸의 검출을 위해 파라핀 포매된 절편은 제조사의 지침에 따라 각각 표지 용액(450 ㎕)과 효소 용액(50 ㎕)의 혼합물 내에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이트되었고 0.1 M PBS 내에서 5분간 3회 세척되었다. 이후 절편은 DAPI로 37℃에서 15분간 인큐베이트되었다. 최종적으로 절편은 세척되고 슬라이드 상에 봉입되고 형광 현미경(DAS 현미경) 관찰을 위해 커버 슬립으로 덮였다. 양성 TUNEL 염색은 양성 염색된 DAPI의 수를 계측함으로서 기록되었다.

자료 분석

데이터는 GraphPad Prism 4 소프트웨어(버전 4.03, GraphPad software, Inc.)를 이용하여 분석되었다. 데이터는 평균±S.D.로 제공된다. 그룹과 처리간의 차이는 일원분산분석에 의해 평가되었다. ANOVA 내 P 수치가 유의적인 경우 평균쌍간의 차이는 Dunnett 테스트에 의해 평가되었다. P < 0.05의 수치는 통계학적으로 유의적인 것으로 간주되었다.

도 1은 NF-κB 전사 및 DNA 결합 활성 상의 4-O-메틸호노키올 효과를 나타낸 것이다. 도 1(A)는 인간 전립선 및 결장 암세포 내 NF-κB 결합 활성 상의 4-O-메틸호노키올 효과를 나타낸다. 세포는 표시된 농도의 4-O-메틸호노키올로 1시간 동안 처리되었다. NF-κB 활성은 실시예에 나타난 바와 같이 EMSA를 이용하여 조사되었다. 표시된 농도의 4-O-메틸호노키올(10, 20 및 30 μM)로 처리된 인간 전립선 및 결장 암세포 유래의 세포핵 추출물은 NF-κB 서열을 포함한 ³²P-표지된 올리고뉴클레오타이드의 결합 반응 내에서 인큐베이트되었다. NF-κB DNA 결합 활성은 EMSA에 의해 측정되었다. 도 1(B)는 인간 전립선 및 결장 암세포 내 NF-κB 루시페라제 활성 상의 4-O-메틸호노키올 효과를 나타낸다. 세포는 pNF-κB 루시페라제(5x NF-κB)로 트랜스펙트된 후 표시된 농도의 4-O-메틸호노키올로 24시간 동안 활성화된 후 루세페라제 활성이 측정되었다. 데이터는 p50 및 p65/Histon H1에 대해 수행된 3반복 실험으로부터 평균±S.D.로 나타나 있다. *(p<0.05)는 대조군으로부터 통계적으로 유의적인 차이를 나타낸다.

도 2는 4-O-메틸호노키올에 의한 인간 전립선 및 결장 암세포의 형태 변화 및 세포 생존력을 나타낸 것이다. 형태 변화는 현미경(배율, x200) 하에서 관찰되었다. SW620(A) 및 HCT116(B) 인간 결장 암세포 및 PC3(D) 및 LNCap(E) 인간 전립 선 암세포는 다양한 용량(10∼30 μM)의 4-O-메틸호노키올로 다양한 시간(0∼72시간) 동안 처리되었다. 정상 결장 세포 CCD-112 CoN(C) 및 정상 전립선 세포 PWR-E(F)는 다양한 용량(10∼30 μM)의 4-O-메틸호노키올로 다양한 시간(0∼72시간) 동안 처리되었다. 수치는 각각 3반복으로 수행된 3회 실험의 평균±S.D.이다.

도 3은 DAPI 및 TUNEL 염색에 의해 측정된 전립선 및 결장 암세포의 아폽토시스 유도 상의 4-O-메틸호노키올의 효과를 나타낸 것이다. 아폽토시스성 세포사멸은 실시예에 나타난 바와 같이 DAPI 염색 및 TUNEL 분석에 의해 측정되었다. 아폽토시스성 세포는 형광 현미경으로 조사되었다. 24시간 동안 4-O-메틸호노키올의 처리(10∼30 μM)는 현저한 염색질 응축, 작은 멤브레인-결합 소체(아폽토시스성 소체) 및 세포 수축이 특징인 아폽토시스를 유발하였다. TUNEL-양성(녹색)은 아폽토시스성 세포(배율, 200x)의 예이다. 아폽토시스성 세포(DAPI-염색된 TUNEL-양성 세포)는 DAPI 및 TUNEL 염색 후 단편화된 세포핵의 직접적인 계측에 의해 평가되었다. 수치는 각 실험의 3반복의 3회 실험의 평균±S.D이다. ^*P<0.05는 대조군으로부터 통계적으로 유의적인 차이를 나타낸다.

도 4는 세포주기 조절 단백질의 발현 상의 4-O-메틸호노키올의 효과를 나타낸 것이다. 전립선 및 결장 암세포(2 X 10⁶/ml)는 비처리되거나 다양한 용량(10∼30 μM)으로 전처리되었다. 동량의 총 단백질(40 ㎍/레인)은 12% SDS-PAGE 수행되었 다. 세포주기 조절 단백질의 발현 상의 4-O-메틸호노키올 효과를 나타낸 것이다. 세포주기-관련 단백질(사이클린 D, CDK4, 사이클린 E, CDK6, pRB, p21 및 pp53)의 발현 수치 상의 4-O-메틸호노키올 효과는 웨스턴 블럿팅 분석을 이용하여 측정되었다. 인간 전립선 및 결장 암세포(2 X 10⁶/ml)는 다양한 용량(10∼30 μM) 4-O-메틸호노키올로 비처리되거나 전처리되었다. 총 세포 용해질은 실시예에 기술된 바와 같이 웨스턴 블럿 분석을 위해 처리되었다. β-액틴 단백질은 내부 대조군으로서 사용되었다. 각각의 밴드는 3회 독립적 실험 결과를 나타낸다. 상대 밀도는 농도계측기에 의해 분석되었고 수치는 2반복 실험의 3회 실험의 평균±SD로 표기되었다.

도 5는 아폽토시스 조절 단백질의 발현 상의 4-O-메틸호노키올의 효과를 나타낸 것이다. 전립선 및 결장 암세포(2 X 10⁶/ml)는 비처리되거나 다양한 용량(10∼30 μM)으로 전처리되었다. 동량의 총 단백질(40 ㎍/레인)은 12% SDS-PAGE 수행되었다. Bax, 카스파제-3, 카스파제-9, Bcl-2, cIAP1, cIAP2, 서비빈, Cox-2, GSK-3β, iNOS 및 β-액틴의 발현은 특정 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅에 의해 검출되었다. 본원에서 β-액틴 단백질은 내부 대조군으로 사용되었다. 각각의 밴드는 3회 독립적 실험 결과를 나타낸다.

도 6은 4-O-메틸호노키올로 처리된 인간 결장 및 전립선 암세포 내 세포핵 p65 및 p50의 발현 패턴을 나타낸 것이다. 세포는 4-O-메틸호노키올(20 μM)로 24 시간 동안 처리되었다. 결장 및 전립선 암세포 내 p50 또는 p65의 발현 패턴은 현미경(200 x) 하에서 관찰되었다. 면역형광 이미지는 형광 현미경(360x 또는 1000x)을 이용하여 수득되었다. 유사한 관찰이 개별적인 3회 실험에서 검출되었다. NF-κB 넉다운으로 유도된 결장 및 전립선 암세포 내 아폽토시스성 세포사멸 상의 4-O-메틸호노키올의 효과를 나타낸 것이다. 아폽토시스성 세포사멸은 DAPI 염색 및 TUNEL 분석에 의해 측정되었다. 아폽토시스성 세포는 형광 현미경으로 조사되었다. 결장 및 전립선 암세포는 세포핵 p50 또는 p65 siRNA에 의한 NF-κB 넉다운으로 유도되었다. siRNA 트랜스펙트된 세포는 4-O-메틸호노키올(20 μM)로 24시간 동안 처리되었다. TUNEL-양성(녹색)은 아폽토시스성 세포의 예이다(배율, 200x). 아폽토시스성 세포(DAPI-염색된 TUNEL-양성 세포)는 DAPI 및 TUNEL 염색 후 단편화된 세포핵의 직접적 계측에 의해 평가되었다.

도 7은 DAPI 및 TUNEL 염색에 의해 분석된 전립선 및 결장 암세포 내 4-O-메틸호노키올- 및 P53 저해제(PTF-α)-유도된 아폽토시스 사이의 유사성을 나타낸 것이다. 아폽토시스성 세포사멸은 실시예에 나타난 바와 같이 DAPI 염색 및 TUNEL 분석에 의해 측정되었다. 아폽토시스성 세포는 형광 현미경으로 조사되었다. 24시간 동안 4-O-메틸호노키올 처리(20 μM) 및 p53 저해제(PTF-α) 처리(30 μM)는 현저한 염색질 응축이 특징인 아폽토시스를 유발하였다. TUNEL-양성(녹색)은 아폽토시스성 세포의 예이다(배율, 200x). 아폽토시스성 세포(DAPI-염색된 TUNEL-양성 세포)는 DAPI 및 TUNEL 염색 후 단편화된 세포핵의 직접적 계측에 의해 평가되었다. 수치는 3반복 실험의 3회 실험의 평균±S.D.이다.

도 8은 생체 내 4-O-메틸호노키올의 항암 효과를 규명하기 위해 4-O-메틸호노키올 처리 후 결장 및 전립선 암 이종이식-포함 누드 마우스 내 종양 성장이 조사되었다. SW620 이종이식 조사시 4-O-메틸호노키올은 마우스에 100 내지 300 ㎟ 부피 범위로 4주간 매일 i.p 투여되었다.

도 9는 생체 내 4-O-메틸호노키올의 항암 효과를 규명하기 위해 4-O-메틸호노키올 처리 후 결장 및 전립선 암 이종이식-포함 누드 마우스 내 종양 성장이 조사되었다. PC3 이종이식 조사시 4-O-메틸호노키올은 마우스에 100 내지 300 ㎟ 부피 범위로 4주간 매일 i.p 투여되었다.

도 10은 결장암 세포주 SW620과 전립선암 세포주 PC3에 대한 세포주기 조절 단백질과 아폽토시스 조절 단백질의 발현 상의 4-O-메틸호노키올의 효과를 나타낸 것이다. 전립선 및 결장 암세포(2 X 10⁶/ml)는 비처리되거나 다양한 용량(10∼30 μM)으로 전처리되었다. 동량의 총 단백질(40 ㎍/레인)은 12% SDS-PAGE 수행되었다.

Claims

하기 일반식 Ⅰ의 4-O-메틸호노키올 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 결장암 또는 전립선암 치료용 항암 의약 조성물:

식 I
제 1항에 있어서, 상기 4-O-메틸호노키올은 핵 전사인자 NF-κB의 DNA 결합활성 및 종양괴사인자 유도 전사활성을 억제시킴으로써 암세포 증식을 억제시킴을 특징으로 하는 항암 의약 조성물
제 1항에 있어서, 상기 4-O-메틸호노키올은 세포주기 단백질 p21의 발현을 유도를 통한 세포주기 G₀∼G₁ 주기를 저지함으로서 세포사멸을 유발시켜 암세포 증식을 억제시킴을 특징으로 하는 항암 의약 조성물
제 1항에 있어서, 상기 4-O-메틸호노키올은 아폽토시스 저해 단백질인 Bcl-2, 서비빈(Survivin), GSK-3β, 카스파제-9, 카스파제-3, cIAP, αIAP, COX-2 및 iNOS의 발현을 감소시켜 암세포의 세포사멸을 유도함을 특징으로 하는 항암 의약 조성물
제 1항에 있어서, 상기 4-O-메틸호노키올은 아폽토시스 유발 단백질인 Bax, 활성화 카스파제-3 및 활성화 카스파제-9의 발현을 증진시킴으로서 암세포의 세포사멸을 유도함을 특징으로 하는 항암 의약 조성물