KR20110034836A

KR20110034836A - 펄스 레이저를 이용한 민무늬근 수축 조절 장치 및 이를 이용한 민무늬근 수축 조절 방법

Info

Publication number: KR20110034836A
Application number: KR1020090092294A
Authority: KR
Inventors: 최철희; 최명환; 윤종희
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2009-09-29
Filing date: 2009-09-29
Publication date: 2011-04-06
Also published as: KR101136906B1

Abstract

본 발명은 펄스 레이저(pulsed laser)를 이용한 민무늬근의 수축 조절 장치 및 이를 이용한 민무늬근의 수축 조절 방법에 관한 것으로, 구체적으로 상기 펄스 레이저는 민무늬근 세포의 칼슘 신호 및 수축을 유도하고 생체 내 혈관 민무늬근의 수축을 유도할 뿐만 아니라, 연속 레이저 조사에 비해 열에 의한 영향이 적어 조직 손상을 최소화하며 비선형성으로 인해 피하를 표적할 수 있어서 비침습적인 조절이 가능하므로, 민무늬근 수축 조절에 유용하게 사용될 수 있다.

펨토-세컨드 펄스 레이저(femto-second pulsed laser), 민무늬근(smooth muscle), 민무늬근 수축 조절 장치, 혈관, 수축, 칼슘.

Description

펄스 레이저를 이용한 민무늬근 수축 조절 장치 및 이를 이용한 민무늬근 수축 조절 방법{Controller for smooth muscle contraction using pulsed laser and method for smooth muscle contraction using the same}

본 발명은 펄스 레이저를 이용한 민무늬근 수축 조절 장치 및 이를 이용한 민무늬근 수축 조절 방법에 관한 것이다.

민무늬근(vascular smooth muscle)은 평활근(平滑筋)이라고도 하며, 척추동물에서는 심장근 이외의 내장근은 모두가 민무늬근이다. 일반적으로 수의적 조절을 할 수 없는 혈관, 장, 방광, 자궁 등의 벽을 이루는 근육들이 이에 속한다. 이 근육의 세포는 가늘고 긴 방추형이며, 드물게는 다핵(多核)인 것도 있으나 보통 중앙부에 타원형의 핵이 1개 있다. 세포내 근원섬유의 분포는 동물의 종류에 따라 다른데, 전체가 똑같이 중굴절을 하는 성질이 있다. 이 때문에 가로무늬근과는 달리 가로주름이 보이지 않는다. 수축성 물질은 액토미오신으로 가로무늬근에 비해 함유량이 적으며, 운동이 활발하지 않은 부분에 발달한다. 수축속도는 느리지만, 쉽게 피로를 느끼지 않는 성질을 가진 불수의근(不隨意筋)이다. 민무늬근은 자율신경계로부터 이중 지배(교감신경계와 부교감신경계)를 받고 있다. 혈관벽의 근육이나 순막(瞬膜)과 같이 신경의 지배 정도가 높은 것과 장이나 자궁의 근육과 같이 신경적 제어가 느슨한 자율적 수축을 일으키는 것 등이 있다. 자궁에 옥시토신이 작용하면 수축하는 것으로도 알 수 있듯이 민무늬근은 가로무늬근에 비해 호르몬에 의한 액성조절(液性調節)이 현저한 것도 그 특징 중의 하나이다.

이러한 민무늬근은 적절한 수축과 이완을 실행하면서 소화, 위나 장의 연동운동, 방광이나 자궁의 수축, 혈관 지름의 변화 및 피부의 털세움근(arrector pili muscle)이나 동공의 크기 조절 등 일련의 생체 과정을 수행한다. 그러므로 내장 조직의 외관 또는 기능을 정상적으로 유지할 수 없는 경우, 민무늬근의 수축 및 이완을 직접적으로 조절하여 질병을 치료할 수 있는 방법이 요구된다.

세포 및 조직의 혈액을 통해 전달되는 영양분 및 산소에 대한 수요는 세포 활성에 따라 변화한다. 제한된 혈액 공급으로 필요한 양을 충족시키기 위하여, 혈관계는 국부 혈류를 역동적으로 조절한다. 그리고 동맥 상태의 조절은 조직의 혈액 관류 조절에 절대적으로 필요하다. 동맥의 상태는 동맥 혈관 벽의 피막 중막 층에 있는 혈관 민무늬근의 수축 또는 이완에 의해 결정되고, 혈관 민무늬근세포(vascular smooth muscle cell, VSMC)의 세포내 칼슘 원동력이 중요한 결정인자 중 하나이다.

혈관벽 속의 민무늬근은 가로로 둘러져 둥근 고리 모양으로 배열되어 있는데 수축으로 혈관 속 공간의 지름을 변화시켜 혈관 긴장도에 영향을 준다. 중추 신경계, 특히 뇌는 신경의 대사활성과 혈관 긴장도 사이에 단단한 결합을 보여준다. 이러한 신경혈관 결합은 기능성 핵자기 공명 영상법을 통하여 간접적인 신경 활성 측정에 사용되고, 그것의 기능 부전은 신경퇴행성 질환 및 뇌졸증과 관련된 것으로 알려져 있다. 그러나 신경혈관 결합에 대한 연구는 생체내의 동맥 긴장도 조절을 위한 적절한 실험적 수단의 부재로 인하여 제한되고 있다. 직접적인 전기적 충격 또는 혈관에 작용하는 약제의 처리와 같은 혈관 긴장도에 대한 현재의 수단은 낮은 공간적 특이성 및 높은 침습을 나타낸다. 그러므로 표적부위 외의 주변 조직에 손상이 없고 비침습적으로 작용할 수 있는 혈관 긴장도 조절 연구가 절실하다.

레이저(laser)는 광자를 결 맞은 빛으로 방출하는 광원이다. 전형적인 레이저 광은 단색, 즉, 오직 하나의 파장이나 색으로 이루어진다. 대부분의 광원은 결이 맞지 않은 수많은 빛을 넓은 파장 범위에서 넓은 면적으로 방출하지만, 일반적으로 레이저 빔은 얇고 퍼지지 않는다. 빛 본래의 성질에 더하여 레이저의 강력한 에너지를 이용하여 공업, 의료, 핵융합, 계측, 정보 기억 및 광통신에 이르기까지 다양한 용도로 확대되어 왔다.

레이저는 크게 펄스 레이저(Pulse)와 연속 레이저(Continuous wave, CW)로 구분할 수 있다. 레이저 전이가 연속적이지 않고 일시에 일어나게 되면 레이저는 짧은 시간 동안 지속되어 펄스 레이저가 된다. 연속 레이저는 고열을 지속적으로 만들 때, 펄스 레이저는 순간적으로 강한 에너지가 필요할 때 사용한다. 현재, 생체외에서 연속 레이저가 민무늬근의 수축을 유도한다는 보고가 있다. 이때, 민무늬근의 수축은 연속 레이저 조사에 의한 조직의 열 발생을 통하여 유도된다고 알려져 있다(Steg PG. et al., Cardiovasc Res, Nov;22(11), 747-753, 1988). 하지만 열 발생이 적은 펄스 레이저를 통한 민무늬근의 수축 조절에 관한 연구는 전무하다.

특히, 근적외선 펨토-세컨드 펄스 레이저(near-infrared femtosecond pulsed laser)는 깊은 침투력, 낮은 분산 및 국소 비선형의 흡수로 인하여 생물 영상을 위해 널리 이용되고 있다. 또한, 이러한 장점은 세포 내 칼슘의 생성, 세포 내 소기관의 구분, 유전자 형질전환, 신경의 발화 촉진 및 혈류 방해와 같은 살아있는 동물에서 살아있는 세포 및 조직의 다양한 광학적 조절을 가능하게 한다. 특히, 심근 세포에서 칼슘의 생성은 세포 수축을 유도하므로 레이저 조사는 심장 박동 조절 장치로서도 제안될 수 있다.

이에, 본 발명자들은 조직에 대한 열 손상이 적고 비침습적인 민무늬근 조절 의 광학적 방법을 연구하던 중, 비선형의 열 발생이 적은 근적외선 펨토-세컨드 펄스 레이저가 생체외 또는 생체내에서 혈관 민무늬근의 수축을 효과적으로 조절하므로, 민무늬근의 수축 조절 장애로 의한 질병의 치료용 장치 및 치료 방법으로 유용하게 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 펄스 레이저를 이용한 민무늬근 수축 조절 장치 및 이를 이용한 민무늬근 수축 조절 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

펄스 레이저를 발생시키는 펄스레이저 발생부;

상기 발생부로부터 발생된 상기 펄스 레이저가 전달되도록, 상기 발생부로부터 연장된 광 에너지 전달부; 및

상기 펄스 레이저가 표적 민무늬근 기관의 국소에 조사되도록 상기 광 에너지 전달부의 단부에 설치된 조사부를 포함하는 민무늬근 수축 조절 장치를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 민무늬근 수축 조절 장치를 이용하여 펄스 레이저를 조사하는 단계를 포함하는 민무늬근 수축 조절 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 민무늬근 수축 조절 장치를 이용하여 펄스 레이저를 민무늬근 수축 조절 장애 질환에 걸린 개체에 조사하는 단계를 포함하는 민무늬근 수축 장애 질환의 치료 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 민무늬근 수축 조절 장치를 이용하여 펄스 레이저를 혈관 민무늬근에 조사하는 단계를 포함하는 혈류 조절 방법을 제공한다.

본 발명의 펄스 레이저는 민무늬근 세포의 칼슘 신호 및 수축을 유도하고 생체내 민무늬근의 수축을 유도할 뿐만 아니라, 연속 레이저 조사에 비해 열에 의한 영향이 적어 조직 손상을 최소화하며 비선형성으로 인해 피하를 표적할 수 있어서 비침습적인 조절이 가능하므로, 민무늬근 수축 조절 및 조절 장치로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 펄스 레이저를 이용한 민무늬근 수축 조절 장치를 제공한다.

구체적으로, 상기 민무늬근 수축 조절 장치는

펄스 레이저를 발생시키는 펄스레이저 발생부;

상기 펄스 레이저가 표적 민무늬근 기관의 국소에 조사되도록 상기 광 에너지 전달부의 단부에 설치된 조사부로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 민무늬근 수축 조절 장치는 민무늬근에 대한 수축 패턴 측정부를 추가적으로 포함할 수 있고, 상기 측정부는 민무늬근의 온도를 측정하기 위한 온도 측정부를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 민무늬근 수축 조절 장치는 수축 패턴 데이터를 수집 및 표시하는 데이터부를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 발생부로부터 발생된 펄스 레이저를 제어하도록 상기 발생부에 장착된 제어부를 추가적으로 포함할 수 있고, 상기 제어부는 레이저 세기, 조사 시간, 조사 모드, 조사 위치 및 조사 순서를 제어할 수 있는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 펄스 레이저는 펄스 지속 시간(pulse-width)이 1 펨토초(femtosecond) 내지 100 나노초(nanosecond)인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 민무늬근은 위장, 소장, 대장, 항문, 방광, 자궁, 혈관벽, 체모의 기부 및 동공으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 두 개 이상을 이루는 근육인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명자들은 민무늬근 세포에 대한 펄스 레이저의 칼슘 신호 유도성을 확인하기 위해, 쥐의 흉대동맥 및 복대동맥에서 민무늬근 세포를 일차 배양하여 펄스 레이저 장치를 이용하여 펄스 레이저를 조사하였다. 그 결과, 펄스 레이저에 의해 칼슘 형광이 대략 2배 증가하였고, 조사 1초 후에 칼슘 신호가 최대값을 나타냈다(도 1 참조). 이때, 펄스 레이저 전력이 370 ㎽일 때, 충분한 칼슘 신호 유도성을 가짐을 확인하였다.

본 발명자들은 민무늬근 세포에 대한 펄스 레이저의 칼슘 신호 유도에 따른 수축 유도성을 확인하기 위해, 쥐의 흉대동맥 및 복대동맥에서 민무늬근 세포를 일차 배양하여 펄스 레이저를 조사하였다. 그 결과, 칼슘 반응과 함께 세포 원형질막의 수축을 확인하였다(도 2 참조).

본 발명자들은 민무늬근에 대한 펄스 레이저의 생체 내 수축 유도성을 확인하기 위해, 박화된 두개골 모델 쥐의 대뇌 피질 혈관의 민무늬근으로 이루어진 중막 부위에 펄스 레이저를 조사하였다. 그 결과, 조사 1초 후, 혈관 수축이 나타났고 1분 안에 다시 빠르게 회복되었으며, 혈관 벽의 한 지점에 대한 레이저 조사는 몇 초만에 수축의 빠른 수평적 퍼짐을 나타냈다(도 3 참조).

본 발명자들은 다양한 민무늬근 세포에서의 펄스 레이저의 수축 유도성을 확인하기 위해, 인간 기관지, 방광 또는 자궁에서 분리하여 배양한 민무늬근 세포에 펄스 레이저를 조사하였다. 그 결과, 다양한 장기의 민무늬근 세포에서 칼슘 반응과 함께 세포의 수축을 확인하였다(도 4 참조).

따라서, 펄스 레이저는 민무늬근 수축 조절을 위한 장치의 구성성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명은 민무늬근 수축 조절 장치를 이용하여 민무늬근에 펄스 레이저를 조사하는 단계를 포함하는 민무늬근 수축 조절 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은

1) 민무늬근의 표적 부위를 선택하는 단계; 및

2) 표적 부위의 수축력을 증가시키는 펄스 레이저를 조사하는 단계를 포함하는 민무늬근 수축 조절 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 민무늬근은 위장, 소장, 대장, 항문, 방광, 자궁, 혈관벽, 체모의 기부 및 동공으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 두 개 이상을 이루는 근육인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 펄스 레이저는 펄스 지속 시간(pulse-width)이 1 펨토초(femtosecond) 내지 100 나노초(nanosecond)인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 펄스 레이저의 전력은 300 내지 900 ㎽인 것이 바람직하고 370 ㎽인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 펄스 레이저의 조사 지속 시간이 1.5 내지 2.0 ㎳인 것이 바람직하고 1.6 ㎳인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 민무늬근 수축 조절 방법은 생리학적 파라미터를 관측하는 단계를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 생리학적 파라미터는 근수축의 힘, 근수축 및 이완, 수축속도 등과 같은 민무늬근의 움직임 정도, 민무늬근의 손상 정도, 또는 혈류나 혈관 직경, 배변 등과 같은 민무늬근의 움직임에 의해 조절되는 생체 변화인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 민무늬근 수축 조절 방법은 민무늬근에 대한 광학적 접근성을 확보하는 단계를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 광학적 접근성은 광섬유를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명자들은 펄스 레이저의 민무늬근의 수축 유도성을 확인하기 위해, 민 무늬근 세포 또는 민무늬근에 펄스 레이저를 조사하였다. 그 결과, 펄스 레이저는 생체 외에서 민무늬근 세포의 칼슘 신호 및 수축을 유도하였고, 생체 내 혈관 민무늬근의 수축을 유도하였으므로 민무늬근 수축 조절을 위해 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

상기 민무늬근 수축 조절 장애 질환은 위식도 괄약근 결함, 위식도 역류, 위장계 운동력 감소, 비만, 대변실금, 요실금, 방광요관 역류, 난산, 생리불순, 암, 심혈관 질환, 심장질환, 동맥질환, 정맥질환, 이상 혈압, 신체 체온 조절 이상, 신경질환, 두통, 탈모, 안질환, 눈 근육 기능 이상, 조직의 기계적 강도 저하 및 족 비대증으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.

상기 펄스 레이저는 펄스 지속 시간(pulse-width)이 1 펨토초(femtosecond) 내지 100 나노초(nanosecond)인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 펄스 레이저의 전력은 300 내지 900 ㎽인 것이 바람직하고 370 ㎽인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 펄스 레이저는 조사 지속 시간이 1.5 내지 2.0 ㎳인 것이 바람직하고 1.6 ㎳인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 조사량은 특정 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 조사기간, 조사방법, 제거율 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명자들은 펄스 레이저의 민무늬근의 수축 유도성을 확인하기 위해, 민무늬근 세포 또는 민무늬근에 펄스 레이저를 조사하였다. 그 결과, 펄스 레이저는 생체 외에서 민무늬근 세포의 칼슘 신호 및 수축을 유도하였고, 생체 내 혈관 민무늬근의 수축을 유도하였으므로 민무늬근 수축 장애 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 민무늬근 수축 조절 장치를 이용하여 펄스 레이저를 혈관 민무늬근에 조사하는 단계를 포함하는 혈류 조절 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 표적 혈관 민무늬근에 펄스 레이저를 조사함으로써, 국소적 혈관 수축을 유도하여 혈류량을 감소시킬 수 있다. 이러한 혈류량 감소는 외과수술 또는 치과수술시 지혈이 필요한 국소 부위에 유용하게 이용할 수 있다. 또한, 혈류량 감소를 통하여 마취시 마취제의 유입을 조절할 수 있다. 아울러, 혈류 조절을 통하여, 혈관 확장 관련 질환인 저혈압, 정맥 부전 및 두부 동통 등의 치료를 위해 이용할 수 있다.

본 발명의 펄스 레이저는 민무늬근 세포 및 혈관 민무늬근의 수축을 유도하므로 혈류 조절에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정하는 것은 아니다.

< 실시예 1> 민무늬근 세포의 배양

이전 문헌(R. K. Dubey et al., Hypertension 27(3 Pt 2), 786-793, 1996)의 방법에 따라, 5주령 수컷 Sprague-Dawley 쥐(150 ~ 200 g)의 흉대동맥 및 복대동맥으로부터 제조한 쥐 대동맥 민무늬근 세포를 일차배양 하였다. 민무늬근 세포를 소태아혈청(fetal bovine serum)을 10% 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에 배양하였고, 5 내지 10번 계대 배양한 세포를 사용하였다. 순도(>95%)는 알파-민무늬근 액틴(α-smooth muscle actin) 염색을 통하여 확인하였다.

< 실시예 2> 박화된 두개골 모델 쥐의 제조

7 내지 10 주령 수컷 ICR 마우스(Charles River Japan Inc., 요코하마, 일본)를 사용하였다. 박화된 두개골 모델의 제조는 이전 문헌(H. T. Xu. et al., Nat Neurosci 10(5), 549-551, 2007)의 방법에 따라 실시하였다. 케타민-자일라진(ketamine-xylazine)의 복강내 주사로 마취한 후, 두피를 제거하고 두개골을 치 과용 시멘트를 사용하여 맞춤 제작한 금속 페이트(pate)(남일 광학 기기, 인천, 한국)에 부착하였다. 고속 마이크로 드릴을 사용하여, 해부현미경하에서 관심 부위에서 2 내지 4 ㎜ 직경을 갖는 두개골의 원형 부위가 얇고 부드러워질 때까지 얇게 만들었다. 동물 관리 및 제조 과정은 한국과학기술원(KAIST, 대전, 한국) 동물 복지위원회의 승인하에 실시하였다.

< 실시예 3> 펄스 레이저의 혈관 민무늬근 세포에서의 칼슘 신호 유도성 확인

펄스 레이저 자극이 혈관 민무늬근 세포(vascular smooth muscle cell, VSMC)에서 칼슘 신호를 유도하는지 알아보기 위해, 쥐 대동맥의 VSMC를 칼슘 표지인 Fluo-4AM으로 염색한 후 펄스 레이저를 조사하여 상기 세포에서 칼슘 신호의 변화를 관찰하였다. 다른 종류의 세포에서 레이저에 의해 유도되는 칼슘 신호는 전력 의존적으로 반응을 보이거나 보이지 않는다고 알려져 있기 때문에, 세포의 칼슘 신호의 변화가 관찰될 때까지 세포 자극용 펄스 레이저의 전력을 증가시켰다. 구체적으로, 800 ㎚ 및 20 X로 조정된 펨토-세컨드 펄스 레이저(femto-second pulsed laser)(chameleon; Coherent, 산타 클라라, 캘리포니아, 미국)와 1.0 N.A 수침 대물렌즈가 있는 이 광자 레이저 스캐닝 현미경(LSM510; 칼자이스, Oberkochen, 독일)을 사용하였다. 배양된 세포를 Fluo-4(Fluo-4AM; Molecular Probe, Eugene, 오레곤, 미국)의 아세톡시메틸(acetoxymethyl) 형태 10 μmol/ℓ가 첨가된 DMEM 배지에 37℃에서 40분 동안 배양한 후, 인산염완충식염수로 세척하였다. 레이저 이미징에 사용된 평균 레이저 전력은 50 ㎽보다 낮은 수준이었다. 광학 간섭용으로써, 이 광자 형광 이미징에 사용되었던 똑같은 광학 경로 및 레이저 광원을 사용하여 펄스 레이저를 조사하였다. 시험관 내에서 실시하기 위해, 배양된 VSMC의 세포질(cytosol)에서 < 0.09 ㎛의 표적 부위를 선정하였다. 조사 시간은 1.6 ㎳로 고정하였고, 평균 레이저 전력은 300 내지 450 ㎽로 설정하였다. 낮은 레이저 전력으로 시작하여 칼슘 반응이 관찰될 때까지 전력을 증가시켰다. 이미지 처리 및 데이터 정량을 위하여 imageJ 또는 Matlab을 사용하였으며, 데이터는 평균 ± 표준오차로 나타냈다.

그 결과, 펄스 레이저로 자극하기 전, 50 ㎽보다 낮은 전력에서는 세포의 칼슘 신호 또는 세포 생존에 변화가 일어나지 않음을 확인하였다. VSMC의 레이저에 의해 유도된 칼슘 신호는 도 1에서와 같이, 레이저 조사에 의해 칼슘 형광이 대략 2배 증가하였고(도 1a), 조사 1초 시점에서 최고조에 이르렀고 그 후 평균 수준으로 감소하였다(도 1b). 세포의 핵 및 세포질 부분에서 같은 칼슘 신호를 나타냈고 핵 부분의 신호가 더 높았다. 레이저의 전력(92.5, 185, 370, 444 및 740 ㎽)에 따른 칼슘 신호 유도는 370 ㎽의 전력에서 VSMC의 칼슘 신호를 충분히 유도할 수 있는 것으로 나타났다(도 1c).

< 실시예 4> 펄스 레이저의 혈관 민무늬근 세포에서의 수축 유도성 확인

세포내 칼슘 이온 농도가 혈관 민무늬근 세포의 수축을 유도하는 신호 경로라는 것이 잘 알려져 있으므로(J. F. Brekke, et al., J Appl Physiol 101(1), 307-315, 2006), 본 발명자들은 레이저로 유도된 칼슘 농도의 증가가 혈관 민무늬 근 세포의 수축을 유도하는지 알아보기 위해, 원형질막을 염색한 세포에 펄스 레이저를 조사하여 원형질막 이미징을 수행하였다. 구체적으로, 세포벽의 염색을 위해, 세포를 알렉사 플루오르 594가 결합된 밀 배아 응집소(WGA-Alexa Fluor 594; Invitrogen, Carlsbad, CA, 미국) 5 ㎍/ℓ가 첨가된 HBSS 배지에 37℃에서 10분 동안 배양한 후, 인산염완충식염수로 2회 세척하였다. 레이저 이미징에 사용된 평균 레이저 전력은 50 ㎽보다 낮은 수준이었다. 광학 간섭용으로써, 이 광자 형광 이미징에 사용되었던 똑같은 광학 경로 및 레이저 광원을 사용하여 펄스 레이저를 조사하였다. 시험관 내에서 실시하기 위해, 배양된 혈관 민무늬근세포의 세포질(cytosol)에서 < 0.09 ㎛의 표적 부위를 선정하였다. 조사 시간은 1.6 ㎳로 고정하였고, 평균 레이저 전력은 300 내지 450 ㎽로 설정하였다. 낮은 레이저 전력으로 시작하여 칼슘 반응이 관찰될 때까지 전력을 증가시켰다. 이미지 처리 및 데이터 정량을 위하여 imageJ 또는 Matlab을 사용하였으며, 데이터는 평균 ± 표준오차로 나타냈다.

그 결과, 역치 이하의 펄스 레이저 자극은 칼슘 신호뿐만 아니라 세포 형태에도 변화가 나타나지 않았다. 역치 이상의 펄스 레이저 자극 후, VSMC 수축 유도는 도 2에서와 같이, 빠른 칼슘 반응과 함께 세포 수축(4,9 ± 0.4% 세포 면적 변화/분)을 통하여 세포막이 점차 수축되었다. 조사 2시간 후, 세포 면적은 기준선의 92 ± 1.3%(n=6)로 변화하였다(도 2).

< 실시예 5> 생체내 ( in vivo ) 펄스 레이저의 혈관 수축 유도성 확인

펄스 레이저에 의한 VSMC 수축 유도가 생체내에서 일어나는지 알아보기 위해, 쥐에 펄스 레이저를 주사하여 혈관 수축 정도를 확인하였다. 구체적으로, 두개골 박화 실시 후, 2M FITC-덱스트란(dextran)(PBS에서 2% w/v의 100 ㎕; FD-2000S; Sigma)을 정맥주사하고, 움직임을 최소화하는 구조물(남일 광학 기기, 인천, 한국)로 맞춤 설계된 틀에 쥐를 올려놓았다. 관심 부위의 기준선 상태를 10초간 촬영하고 이어서 레이저 조사 후 1 내지 2분까지 그 부위를 촬영하였다. 레이저 이미징에 사용된 평균 레이저 전력은 50 ㎽보다 낮은 수준이었다. 박화된 두개골 모델에서 내강(lumen) 직경이 15에서 30 ㎛까지이고 표면 아래 깊이가 100 ㎛까지인 대뇌피질 표면에 평행하게 놓인 표적 동맥을 선정하였다. 동맥 혈관계는 브랜칭(branching) 혈관에서 혈류의 방향을 통하여 측정하였다. 조사 부위는 동맥 벽의 내강의 표면에서부터 표적 중막층까지의 부분으로부터 3 내지 5 ㎛ 떨어진 부위를 선정하였다. 조사 시간은 1.6 ㎳로 고정하였다. 평균 레이저 전력은 300 ㎽로 시작하였고 혈관 수축이 관찰될 때까지 900 ㎽까지 증가시켰다. 이미지 처리 및 데이터 정량을 위하여 imageJ 또는 Matlab을 사용하였으며, 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다.

그 결과, 생체 내에서 펄스 레이저 조사에 의한 혈관 수축은 도 3에서와 같이, 레이저 조사 10초 후에 기준선의 74.3 ± 3.9%로 혈관 내강이 수축되었고, 1분 안에 혈관 직경이 완전히 회복되었다. 혈관 벽의 한 지점에 대한 레이저 조사는 몇 초만에 수축의 빠른 수평적 퍼짐을 나타냈다(도 3).

< 실시예 6> 다양한 인간 민무늬근 세포에서의 수축 유도성 확인

펄스 레이저의 다양한 민무늬근 세포에 대한 수축 유도성을 알아보기 위해, 인간으로부터 분리되어 배양된 기관지, 방광, 자궁의 민무늬근 세포에 대한 수축성을 확인하였다.

그 결과, 펄스 레이저 자극에 의해 세포내 칼슘 신호가 증가하였고, 세포가 수축됨을 확인하였다(도 4).

상기와 같이, 본 발명의 펄스 레이저는 민무늬근의 칼슘 신호 및 수축의 탁월한 유도 효과가 있으므로, 펄스 에너지에 의한 적은 열 손상과 비선형성으로 인한 비침습적인 조절을 통하여 민무늬근 수축 장애 질병의 치료용 장치 및 치료법의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 혈관 민무늬근 세포(vascular smooth muscle cell, VSMC)에서 레이저의 칼슘 신호의 유도를 나타낸 그림이다:

(a)는 배양된 VSMC에서 레이저로 유도된 칼슘 신호의 대표적인 일시적 역동성을 나타낸 것이다. 점은 조사된 부위를 나타낸다. 숫자는 레이저 자극 0초 후의 시간을 나타낸다(scalebar; 10 ㎛);

(b)는 레이저로 유도된 칼슘 역동성의 정량을 나타낸 것이다. 회색 선은 오차 범위를 나타낸다(n=6); 및

(c)는 VSMC에서 칼슘 신호 생성의 레이저 전력 의존성을 나타낸다(n=5).

도 2는 레이저로 유도된 VSMC 수축을 나타낸 그림이다:

(a)는 레이저로 유도된 VSMC 수축의 대표적인 일시적 역동성을 나타낸 것이다. 칼슘 신호 및 세포막 형태를 동시에 촬영하였다. 점선은 기준선에서의 세포의 테두리를 나타낸다. 숫자는 레이저 자극 0초 후의 시간을 나타낸다(scalebar; 10 ㎛); 및

(b)는 레이저로 유도된 칼슘 역동성 및 세포 영역의 변화를 나타낸 것이다(n=6).

도 3은 레이저로 유도된 대뇌피질이 동맥 수축을 나타낸 그림이다:

(a)는 플루오로세인(fluoroscein)이 결합된 2M-Da-덱스트란(dextran)을 정맥 주사한 후 박화된 두개골 모델을 통한 혈관 구조를 촬영한 것이다{사각형은 (b)의 이미지를 위한 관심 부위를 나타낸다(scalebar; 100 ㎛)};

(b)는 레이저 조사 후 대표적인 시점에서의 동맥 수축을 나타낸 것이다. 점 및 점선은 각각 조사된 부위 및 혈관 벽의 기준선을 나타낸다(scalebar; 20 ㎛). 시계열 이미지를 사용한 재생된 선 스캔 이미지는 오른쪽에 나타낸다; 및

(c)는 내강 직경의 시간에 따른 변화를 나타낸다(n=6).

도 4는 인간 유래 기관지, 방광 및 자궁 민무늬근 세포에서 칼슘신호가 유발되는 것을 나타낸 그림이다.

도 5는 민무늬근 수축 조절 장치의 모식도이다:

10은 펄스 레이저 발생부;

20은 펄스 레이저 특성 제어부;

30은 광 에너지 전달부;

40은 치료 대상부에 접근하여 펠스 레이저를 조사하는 조사부; 및

50은 민무늬근 세포의 모식도를 나타낸 그림이다.

Claims

펄스 레이저를 발생시키는 펄스 레이저 발생부;

상기 발생부로부터 발생된 상기 펄스 레이저가 전달되도록, 상기 발생부로부터 연장된 광 에너지 전달부; 및

상기 펄스 레이저가 표적 민무늬근 기관의 국소에 조사되도록 상기 광 에너지 전달부의 단부에 설치된 조사부를 포함하는 민무늬근 수축 조절 장치.
제 1항에 있어서, 민무늬근에 대한 수축 패턴 측정부를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 민무늬근 수축 조절 장치.
제 2항에 있어서, 수축 패턴 데이터를 수집 및 표시하는 데이터부를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 민무늬근 수축 조절 장치.
제 1항에 있어서, 상기 발생부로부터 발생된 펄스 레이저를 제어하도록 상기 발생부에 장착된 제어부를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 민무늬근 수축 조절 장치.
제 1항에 있어서, 상기 펄스 레이저는 펄스 지속 시간(pulse-width)이 1 펨토초(femtosecond) 내지 100 나노초(nanosecond)인 것을 특징으로 하는 민무늬근 수축 조절 장치.
제 1항에 있어서, 상기 민무늬근은 위장, 소장, 대장, 항문, 방광, 자궁, 혈관벽, 체모의 기부 및 동공으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 두 개 이상을 이루는 근육인 것을 특징으로 하는 민무늬근 수축 조절 장치.
제 2항에 있어서, 상기 측정부는 민무늬근의 온도를 측정하기 위한 온도 측정부를 포함하는 것을 특징으로 하는 민무늬근 수축 조절 장치.
제 4항에 있어서, 상기 제어부는 레이저 세기, 조사 시간, 조사 모드, 조사 위치 및 조사 순서를 제어할 수 있는 것을 특징으로 하는 민무늬근 수축 조절 장치.
제 1항의 민무늬근 수축 조절 장치를 이용하여 펄스 레이저를 조사하는 단계를 포함하는 민무늬근 수축 조절 방법.
제 9항에 있어서, 상기 민무늬근은 위장, 소장, 대장, 항문, 방광, 자궁, 혈관벽, 체모의 기부 및 동공으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 두 개 이상을 이루는 근육인 것을 특징으로 하는 민무늬근 수축 조절 방법.
제 9항에 있어서, 상기 펄스 레이저는 펄스 지속 시간(pulse-width)이 1 펨토초(femtosecond) 내지 100 나노초(nanosecond)인 것을 특징으로 하는 민무늬근 수축 조절 방법.
제 9항에 있어서, 상기 민무늬근 수축 조절 방법은 생리학적 파라미터를 관측하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 민무늬근 수축 조절 방법.
제 12항에 있어서, 상기 생리학적 파라미터는 민무늬근의 움직임 정도, 민무 늬근의 손상 정도 또는 민무늬근의 움직임에 의해 조절되는 생체 변화인 것을 특징으로 하는 민무늬근 수축 조절 장치.
제 9항에 있어서, 상기 민무늬근 수축 조절 방법은 민무늬근에 대한 광학적 접근성을 확보하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 민무늬근 수축 조절 방법.
제 14항에 있어서, 상기 광학적 접근성은 광섬유를 사용하는 것을 특징으로 하는 민무늬근 수축 조절 방법.
제 1항의 민무늬근 수축 조절 장치를 이용하여 펄스 레이저를 민무늬근 수축 조절 장애 질환에 걸린 개체에 조사하는 단계를 포함하는 민무늬근 수축 장애 질환의 치료 방법.
제 16항에 있어서, 상기 민무늬근 수축 조절 장애 질환은 위식도 괄약근 결함, 위식도 역류, 위장계 운동력 감소, 비만, 대변실금, 요실금, 방광요관 역류, 난산, 생리불순, 암, 심혈관 질환, 심장질환, 동맥질환, 정맥질환, 이상 혈압, 신 체 체온 조절 이상, 신경질환, 두통, 탈모, 안질환, 눈 근육 기능 이상, 조직의 기계적 강도 저하 및 족 비대증으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 민무늬근 수축 장애 질환의 치료 방법.
제 1항의 민무늬근 수축 조절 장치를 이용하여 펄스 레이저를 혈관 민무늬근에 조사하는 단계를 포함하는 혈류 조절 방법.