KR20110033446A - Compound for labeling material, intermediate therefor and process for producing the same - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A compound for material labeling and a method for preparing the same are provided to ensure high stability and to enable long-term storage. CONSTITUTION: A compound for material labeling has a structure of chemical formula 1c. The material is a biomolecule, nanoparticle, or organic compound containing amine group, hydroxyl group, or thiol group. The biomolecule is a protein, peptide, carbohydrate, saccharide, lipid, antibody, proteoglycan, glycoprotein, or siRNA. A method for labeling the material comprises a step of reacting a compound for material labeling and test material at pH 5-12 and 20-80°C for 30-40 minutes. The buffer solution is phosphate buffer, carbonate buffer, Tris buffer, dimethyl sulfoxide, dimethyl formamide, acetonitrile, or water.

Description

물질 표지용 화합물 및 그 제조방법{Compound for labeling material, intermediate therefor and process for producing the same}Compound for labeling substance and its manufacturing method {Compound for labeling material, intermediate therefor and process for producing the same}

본 발명은 다양한 물질의 표지용 화합물, 그 제조 중간체 및 그 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to compounds for labeling of various substances, intermediates for their preparation and methods for their preparation.

염료의 반응기와 결합할 수 있는 단백질 구조 내의 치환기는 기본 구조가 되는 아미노산(amino acid)의 구조로부터 유추할 수 있다. 그 예로는 아미노산 잔기를 들 수 있는데, 구체적으로는 라이신(lysine)의 아미노기(-CH2CH2CH2CH2NH2), 시스테인(cystein)의 티올기(-CH2SH), 히스티딘(histidine)의 이미다졸 아민기(

Figure 112009059010727-PAT00002
), 트레오닌(threonine)의 2차 지방족 히드록시기(-CH2CH(OH)CH3), 세린(serine)의 1차 지방족 히드록시기(-CH2OH), 티로신(tyrosine)의 페놀 히드록시기(
Figure 112009059010727-PAT00003
) 등이 있다. 아미노산의 N-말단 아미노기(-COCHRNH2)와의 결합도 가능하다. 또한, 염료의 반응기는 당(sugar), 당단백(glycoprotein), 항체(antibody) 등의 생체 분자와 결합할 수도 있다.Substituents in the protein structure that can bind to the reactor of the dye can be inferred from the structure of the amino acid that is the basic structure. Examples include amino acid residues. Specifically, the amino group of lysine (-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ), the cysteine thiol group (-CH 2 SH), and histidine Imidazole amine group of
Figure 112009059010727-PAT00002
), Secondary aliphatic hydroxyl group of threonine (-CH 2 CH (OH) CH 3 ), primary aliphatic hydroxyl group of serine (-CH 2 OH), phenolic hydroxyl group of tyrosine (
Figure 112009059010727-PAT00003
). The amino acid can also be bonded to the N-terminal amino group (-COCHRNH 2 ). In addition, the reactor of the dye may be combined with biological molecules such as sugar (sugar), glycoprotein (glycoprotein), antibody (antibody).

현재까지 알려진 생체 분자 표지용 염료나 물질에 사용되는 반응기들은 생체 분자와 결합되는 치환기에 따라 분류할 수 있고, 각각의 관용명으로도 통용된다. 단백질 분자의 아민기와 결합을 목적으로 하는 반응기로서 가장 많이 이용되는 것은 숙신이미딜 에스터와 이소티오시아네이트이고, 단백질 분자의 티올기와 결합을 목적으로 하는 반응기로서 가장 많이 이용되는 것은 말레이미드이며, 단백질 분자의 히드록시기와 결합을 목적으로 하는 반응기로는 아래와 같은 것들이 있다.Reactors used in biomolecular labeling dyes or materials known to date can be classified according to substituents associated with biomolecules, and are also commonly used under respective common names. Succinimidyl esters and isothiocyanates are most commonly used as reactors for the binding of amine groups to protein molecules, and maleimide is most commonly used as the reactors for binding to thiol groups of protein molecules. Reactors aimed at bonding with the hydroxyl group of the molecule include the following.

Figure 112009059010727-PAT00004
Figure 112009059010727-PAT00004

모든 염료가 형광을 나타내는 것은 아니다. 다양한 분야의 연구자들이 형광을 나타낼 수 있는 발색단(chromophore)을 가진 염료를 개발하였다. 지금까지 알려진 형광 물질(fluorophore)의 대표적인 예로는 안트라닐레이트(anthranilate), 1-알킬틱 이소인돌(1-alkylthic isoindoles), 피롤리논(pyrrolinones), 비메인(bimanes), 벤즈옥사졸(benzoxazole), 벤즈이미다졸(benzimidazole), 벤조퓨란(benzofurazan), 나프탈렌(naphthalenes), 쿠마린(coumarins), 스틸벤(stilbenes), 카바졸(carbazoles), 페난트리딘(phenanthridine), 안트라센(anthracenes), 아크리딘(acridines), 플로세인(fluoresceins), 에오신(eosins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 크리센(chrysenes) 등을 들 수 있고, 이들과 유사한 구조의 유도체들도 연구되고 있다. 이러한 형광 물질들은 앞에서 기술한 다 양한 생체 분자 결합용 반응기에 도입되어 다양한 상품으로 시판되고 있다.Not all dyes fluoresce. Researchers in various fields have developed dyes with chromophores that can fluoresce. Representative examples of fluorophores known to date include anthranilate, 1-alkylthic isoindoles, pyrrolinones, bimanes, and benzoxazoles. ), Benzimidazole, benzofuran, naphthalenes, coumarins, stilbenes, carbazoles, phenanthridine, anthracenes, anthracenes Acridines, fluoresceins, eosins, rhodamines, pyrenes, chrysenes, and similar derivatives are also being studied. . These fluorescent materials have been introduced into various biomolecule binding reactors described above and are commercially available in various products.

상기와 같은 다수의 형광 염료 중에서 바이오 분야에서 이용 가능한 형광을 나타내도록 하기 위해서는 대부분의 생체 분자들이 존재하는 매질, 즉 수용액 내에 존재할 때 강한 형광을 내는 것이 중요하다. 이러한 목적으로 가장 많이 사용되는 형광 염료로는 잔텐(xanthane) 계열의 플로세인 및 로다민과, 폴리메틴(polymethine) 계열의 시아닌을 들 수 있다. In order to show the fluorescence available in the field of biotechnology among a plurality of fluorescent dyes as described above, it is important to give strong fluorescence when present in a medium in which most biomolecules exist, that is, an aqueous solution. Fluorescent dyes most commonly used for this purpose include xanthane-based florcene and rhodamine, and polymethine-based cyanine.

로다민 염료는 광화학적(photochemical) 특성 및 광물리학적(photophysical)특성이 우수하여 생체분자 표지용 물질로 많이 사용된다. 로다민 염료는 일반적으로 장파장에서 최대 흡수치를 나타내며, 높은 몰흡광계수 및 양자효율을 보인다. 이러한 특성 때문에 로다민 염료는 바이오 산업에서의 형광표지물질 뿐만 아니라 의학분야에서 살아있는 세포 및 동물에 적용하여 임상 전의 연구에도 사용된다.Rhodamine dye is widely used as a biomolecule labeling material because of its excellent photochemical and photophysical properties. Rhodamine dyes generally exhibit maximum absorption at long wavelengths, high molar absorptivity and quantum efficiency. Due to these properties, rhodamine dye is applied to pre-clinical studies by applying to fluorescent cells in the bio industry as well as living cells and animals in the medical field.

로다민 염료를 바이오 분야에서 사용하기 위해서 일반적으로 단백질 및 펩타이드 등 생체분자와 결합할 수 있는 반응기를 부착한다. 반응기의 종류는 여러 가지가 있지만, 일반적으로 이소티오시아네이트와 숙신이미딜 에스터를 사용한다.In order to use rhodamine dye in the biotechnology field, a reactor capable of binding to biomolecules such as proteins and peptides is generally attached. Although there are various kinds of reactors, isothiocyanate and succinimidyl ester are generally used.

로다민 염료로서 상업적으로 가장 많이 활용되고 있는 것은 인비트로젠(Invitrogen) 사의 제품들이며 대표 상품의 구조들은 아래와 같다.The most commercially used rhodamine dyes are the products of Invitrogen and the structure of the representative products is as follows.

Figure 112009059010727-PAT00005
Figure 112009059010727-PAT00005

염료를 N,N-디메틸포름아미드(DMF) 또는 N,N-디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 사용하는데, 염료 1 mg을 용매 100 μl에 용해시킨 후 분취하여 사용하는 경우가 많다. 염료의 사용량은 일반적으로 염색 대상이 되는 생체 분자에 대하여 당량비로 5 내지 100배 정도의 과량으로 사용되는데, 이는 단백질 분자는 1 당량이라도 주로 반응의 목표가 되는 아미노기, 히드록시기 또는 티올기의 개수가 훨씬 많기 때문이다. 복잡한 단백질 구조 내에 침투하여 반응하려면 상대적으로 더 높은 수용액 안정성이 요구됨에도 불구하고, 숙신이미딜 에스터의 경우는 오랜 반응 시간 동안 안정한 상태로 유지할 수 없는 것이 단점이다.The dye is used by dissolving in N, N-dimethylformamide (DMF) or N, N-dimethylsulfoxide (DMSO), which is often used after dissolving 1 mg of dye in 100 μl of solvent. The amount of dye is generally used in an amount of about 5 to 100 times the equivalent ratio of the biomolecule to be dyed, which means that even if an equivalent amount of protein molecule, the number of amino, hydroxy or thiol groups that are mainly targeted for the reaction is much higher. Because. Although relatively higher aqueous solution stability is required to penetrate and react in a complex protein structure, the succinimidyl ester cannot be kept stable for a long reaction time.

본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 극복하는 것은 물론, 높은 형광 성능, 생체 분자와 같은 표지 대상 물질과의 반응시간 및 결합성능 또는 반응 후 이탈기 분리에 따른 부산물 발생뿐만 아니라, 수용액상에서의 안정성, 특히 다양한 pH에서의 안정성, 열안정성 외에도 수용액이나 친수성 조건에서의 광표백 및 소광현상 발생, 몰흡광계수, 형광이 발생되는 파장영역 등의 발명의 효과가 새롭게 발현되거나 이들 물성이 현저하게 향상된 효과를 보이고, 나아가 다양한 완충액에서 염색이 가능한 장점을 보이는 표지 대상 물질, 그 제조방법 및 본 발명의 물질 표지용 물질을 포함하는 생체 분자 등 물질을 제공하고자 한다.The present invention not only overcomes the above-mentioned problems, but also has high fluorescence performance, reaction time and binding performance with a target material such as biomolecules, or by-products generated by separation of the leaving group after the reaction, as well as stability in aqueous solution. In particular, in addition to stability and thermal stability at various pH, the effects of the invention such as photobleaching and quenching in aqueous solution or hydrophilic conditions, molar extinction coefficient, and fluorescence range are newly expressed or significantly improved. The present invention provides a labeling target material, a method for preparing the same, and a biomolecule including the substance labeling material of the present invention.

일 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1c의 구조를 갖는 물질 표지용 화 합물을 개시한다.According to one aspect, the present invention discloses a substance labeling compound having a structure of Formula 1c.

Figure 112009059010727-PAT00006
Figure 112009059010727-PAT00006

상기 2개의 R1은 서로 같거나 상이하며 서로 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고; 상기 2개의 R1'은 서로 같거나 상이하며 서로 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하며 서로 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 카르복시기, 카르복실산 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 중에서 선택되고; 상기 2개의 R4는 서로 같거나 상이하며 서로 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며; 상기 R3은 카르복시기, 카르복실산 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 중에서 선택된다.The two R 1 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; The two R 1 ′ are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; The two R 2 are the same as or different from each other, and are independently selected from hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carboxyl group, a carboxylic acid base, a sulfonic acid group, and a sulfonic acid base; The two R 4 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; R 3 is selected from a carboxyl group, a carboxylic acid base, a sulfonic acid group and a sulfonic acid base.

또한, 상기 X1, X2, X3, X4 중 어느 하나는

Figure 112009059010727-PAT00007
또
Figure 112009059010727-PAT00008
이며, 상기 A 또는 B는 서로 독립적으로(CH2)L, p-(C6H4), m-(C6H4)이고, 상기 L은 1 내지 5의 정수이고; X1, X2, X3, X4 중 나머지 3개는 수소 또는 할로겐 원자이다.In addition, any one of the X1, X2, X3, X4
Figure 112009059010727-PAT00007
In addition
Figure 112009059010727-PAT00008
A or B are independently of each other (CH 2 ) L , p- (C 6 H 4 ), m- (C 6 H 4 ), and L is an integer from 1 to 5; The remaining three of X1, X2, X3, and X4 are hydrogen or halogen atoms.

혹은, 상기 화합물의 좌우에 위치한 R1과 R2의 두 쌍 중 어느 한 쌍 또는 좌우 두 쌍 모두 서로 융합하여 1개의 질소 및 4~6개의 탄소 원자가 골격을 이루는 제1 고리를 형성할 수 있고, 상기 제1 고리는 비치환되었거나 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 카르복시기, 카르복실산 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 중에서 선택된 치환기에 의해서 치환된 포화 또는 불포화 고리이며;Alternatively, any one of the two pairs of R1 and R2 positioned at the left and right of the compound, or both the left and right pairs may be fused to each other to form a first ring in which one nitrogen and four to six carbon atoms form a skeleton. One ring is a saturated or unsaturated ring which is unsubstituted or substituted by a substituent selected from an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carboxyl group, a carboxylic acid base, a sulfonic acid group, and a sulfonic acid base;

마찬가지로, 상기 화합물 좌우에 위치한 R1'과 R4의 두 쌍 중 어느 한 쌍 또는 좌우 두 쌍 모두 서로 융합하여 1개의 질소 및 4~6개의 탄소 원자가 골격을 이루는 제2 고리를 형성할 수 있고, 상기 제2 고리는 비치환되었거나 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 카르복시기, 카르복실산 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 중에서 선택된 치환기에 의해서 치환된 포화 또는 불포화 고리이다.Similarly, any one of the two pairs of R1 'and R4 located at the left and right of the compound or both the left and right pairs may be fused to each other to form a second ring in which one nitrogen and four to six carbon atoms form a skeleton. The bicyclic ring is a saturated or unsaturated ring which is unsubstituted or substituted by a substituent selected from an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carboxyl group, a carboxylic acid base, a sulfonic acid group and a sulfonic acid base.

일 구현예에 따르면, 상기 화학식에서 상기 X2 또는 X3 중 어느 하나가

Figure 112009059010727-PAT00009
또는
Figure 112009059010727-PAT00010
이고; X1, X2, X3, X4 중 나머지 3개는 수소 또는 할로겐 원자이다.According to one embodiment, any one of the X2 or X3 in the formula
Figure 112009059010727-PAT00009
or
Figure 112009059010727-PAT00010
ego; The remaining three of X1, X2, X3, and X4 are hydrogen or halogen atoms.

다른 구현예에 따르면, 상기 R1과 R2가 융합하여

Figure 112009059010727-PAT00011
고리를 형성할 수 있으며, 상기 화합물 좌측에 위치한 R1과 R2 및 우측에 위치한 R1과 R2 중 어느 한 쌍이 상기 고리를 형성할 수 있으며, 또는 두 쌍 모두 상기 고리를 형성할 수도 있다.According to another embodiment, the R1 and R2 are fused
Figure 112009059010727-PAT00011
A ring may be formed, and any one of R 1 and R 2 located on the left side of the compound and R 1 and R 2 located on the right side may form the ring, or both pairs may form the ring.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 R1'과 R4가 융합하여

Figure 112009059010727-PAT00012
또는
Figure 112009059010727-PAT00013
고리를 형성할 수 있으며, 상기 화합물 좌측에 위치한 R1'과 R4 및 우측에 위치한 R1'과 R4 중 어느 한 쌍이 상기 고리를 형성할 수도 있으며, 또는 두 쌍 모두 상기 고리를 형성할 수도 있다.According to another embodiment, the R1 'and R4 are fused
Figure 112009059010727-PAT00012
or
Figure 112009059010727-PAT00013
A ring may be formed, and any one of R 1 ′ and R 4 located on the left side of the compound and R 1 ′ and R 4 located on the right side may form the ring, or both pairs may form the ring.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 화합물 좌우에 위치하는 R1, R2, R1', R4의 좌우 2세트 중 어느 한 세트 또는 두 세트 모두

Figure 112009059010727-PAT00014
또는
Figure 112009059010727-PAT00015
의 구조를 형성할 수 있다.According to another embodiment, any one or both sets of two left and right sets of R1, R2, R1 ', and R4 positioned to the left and right of the compound
Figure 112009059010727-PAT00014
or
Figure 112009059010727-PAT00015
It can form a structure of.

일 구현예에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 물질 표지용 화합물을 개시한다.According to one embodiment, the present invention discloses a compound for labeling substances having the structure of Formula 1.

Figure 112009059010727-PAT00016
Figure 112009059010727-PAT00016

상기 4개의 R1은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수 소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 설폰산기 또는 설폰산 염기이며; 상기 R3은 카르복시기, 카르복시기 염기, 설폰산기 또는 설폰산 염기이고; B는(CH2)l, p-(C6H4) 또는 m-(C6H4)이며 여기서 l은 1 내지 5의 정수이다.The four R 1 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; The two R 2 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a sulfonic acid group or a sulfonic acid base; R 3 is a carboxyl group, a carboxyl base, a sulfonic acid group or a sulfonic acid base; B is (CH 2 ) 1 , p- (C 6 H 4 ) or m- (C 6 H 4 ), where l is an integer from 1 to 5.

다른 구현예에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 중 어느 하나의 구조를 가질 수 있다.According to another embodiment, the present invention may have a structure of any one of the following formulas.

Figure 112009059010727-PAT00017
Figure 112009059010727-PAT00017

Figure 112009059010727-PAT00018
Figure 112009059010727-PAT00018

Figure 112009059010727-PAT00019
Figure 112009059010727-PAT00019

Figure 112009059010727-PAT00020
Figure 112009059010727-PAT00021
Figure 112009059010727-PAT00022
Figure 112009059010727-PAT00020
Figure 112009059010727-PAT00021
Figure 112009059010727-PAT00022

Figure 112009059010727-PAT00023
Figure 112009059010727-PAT00024
Figure 112009059010727-PAT00023
Figure 112009059010727-PAT00024

Figure 112009059010727-PAT00025
Figure 112009059010727-PAT00026
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다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 물질 표지용 화합물을 포함하는 물질을 개시한다.According to another aspect, the present invention discloses a substance comprising a compound for labeling substances according to the present invention.

본 발명에 있어서, 표지 대상 물질은 본 발명에 따른 물질 표지용 화합물과 결합할 수 있는 관능기를 포함하고, 이러한 관능기의 예로는 아민기, 수산화기 또는 티올기 등의 관능기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 표지 대상 물질의 예에는 생체 분자, 나노 입자 및 유기 화합물 등이 포함되나, 이에 한정되지 않 는다. 특히 생체 분자의 예로는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.In the present invention, the substance to be labeled includes a functional group capable of bonding with the substance labeling compound according to the present invention, and examples of such functional groups include, but are not limited to, functional groups such as amine groups, hydroxyl groups or thiol groups. . Examples of such labels include, but are not limited to, biomolecules, nanoparticles, organic compounds, and the like. Particularly examples of biomolecules include, but are not limited to, proteins, peptides, carbohydrates, sugars, fats, antibodies, proteoglycans, glycoproteins and siRNAs.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 물질 표지용 화합물을 이용하여 물질을 표지하는 방법을 개시한다.According to another aspect, the present invention discloses a method for labeling a substance using the compound for labeling substances according to the present invention.

일 구현예에 따르면, 상기 표지 방법은 본 발명에 따른 물질 표지용 화합물 및 표지 대상 물질을 반응시키는 단계를 포함한다.According to one embodiment, the labeling method comprises the step of reacting the labeling material and the labeling material according to the invention.

다른 구현예에 따르면, 상기 반응은 본 발명에 따른 물질 표지용 화합물의 비닐 설폰기와 표지 대상 물질이 포함하는 아민기, 수산화기 및 티올기 중에서 선택된 적어도 하나의 관능기가 서로 반응할 수 있는 조건에서 수행하는 것이 바람직하다.According to another embodiment, the reaction is carried out under a condition in which the vinyl sulfone of the compound for labeling substances according to the present invention and at least one functional group selected from the amine group, the hydroxyl group and the thiol group included in the target substance can react with each other. It is preferable.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 반응은 pH 5-12 및 20-80℃의 조건에서 30분 내지 48시간 동안 수행하는 것이 바람직하며, 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액, 트리스 완충액, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 아세토니트릴 및 물 중에서 선택된 용매 내에서 수행하는 것이 바람직하다.According to another embodiment, the reaction is preferably performed for 30 minutes to 48 hours at conditions of pH 5-12 and 20-80 ℃, phosphate buffer, carbonate buffer, Tris buffer, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide Preference is given to performing in a solvent selected from acetonitrile and water.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 4의 구조를 갖는 표지 대상 물질의 제조 중간체를 개시한다.According to another aspect, the present invention discloses an intermediate for preparing a labeling substance having a structure of Formula 4 below.

Figure 112009059010727-PAT00027
Figure 112009059010727-PAT00027

상기 4개의 R1은 서로 동일하거나 상이하며 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고; 상기 2개의 R2는 서로 동일하거나 상이하며 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 설폰산기 또는 설폰산염기이며; 상기 R3은 카르복시기, 카르복시기 염기, 설폰산기 또는 설폰산 염기이고; 상기 B는(CH2)l, p-(C6H4) 또는 m-(C6H4)이며 여기서 l은 1 내지 5의 정수이며; 상기 R4는 카르복시기, 카르복시기 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 또는 수소이다.The four R 1 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; The two R 2 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a sulfonic acid group or a sulfonate group; R 3 is a carboxyl group, a carboxyl base, a sulfonic acid group or a sulfonic acid base; B is (CH 2 ) 1 , p- (C 6 H 4 ) or m- (C 6 H 4 ) wherein l is an integer from 1 to 5; R 4 is a carboxyl group, a carboxyl base, a sulfonic acid group, a sulfonic acid base or hydrogen.

일 구현예에 따르면, 상기 중간체는 하기 화학식 4a 또는 화학식 4b의 구조를 갖는다.According to one embodiment, the intermediate has a structure of Formula 4a or 4b.

Figure 112009059010727-PAT00028
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Figure 112009059010727-PAT00029
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또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 6a 또는 화학식 6b의 구조를 갖는 표지 대상 물질의 제조 중간체를 개시한다.According to another aspect, the present invention discloses an intermediate for preparing a labeling substance having a structure of Formula 6a or 6b.

Figure 112009059010727-PAT00030
Figure 112009059010727-PAT00030

Figure 112009059010727-PAT00031
Figure 112009059010727-PAT00031

상기 4개의 R1은 서로 같거나 상이하며 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하며 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 설폰산기 또는 설폰산염기이며; 상기 R3은 카르복시기, 카르복시기 염기, 설폰산기 또는 설폰산 염기이다.The four R 1 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; The two R 2 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a sulfonic acid group or a sulfonate group; R 3 is a carboxyl group, a carboxyl base, a sulfonic acid group or a sulfonic acid base.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 개시하며, 상기 제조방법은 화학식 1의 화합물의 제조방법은 하기 화학식 6a 또는 화학식 6b의 화합물 또는 이들의 혼합물과 하기 화학식 7의 화합물을 반응시키는 단계를 포함한다.According to another aspect, the present invention discloses a method for preparing a compound of formula 1, wherein the method for preparing a compound of formula 1 is a compound of formula 6a or 6b or a mixture thereof and formula 7 Reacting the compound.

[화학식 1][Formula 1]

Figure 112009059010727-PAT00032
Figure 112009059010727-PAT00032

[화학식 6a][Formula 6a]

Figure 112009059010727-PAT00033
Figure 112009059010727-PAT00033

[화학식 6b][Formula 6b]

Figure 112009059010727-PAT00034
Figure 112009059010727-PAT00034

상기 4개의 R1은 서로 같거나 상이하며 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하며 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 설폰산기 또는 설폰산염기이며; 상기 R3은 카르복시기, 카르복시기 염기, 설폰산기 또는 설폰산 염기이고; 상기 B는(CH2)l, p-(C6H4) 또는 m-(C6H4)이며 여기서 l은 1 내지 5의 정수이다.The four R 1 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; The two R 2 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a sulfonic acid group or a sulfonate group; R 3 is a carboxyl group, a carboxyl base, a sulfonic acid group or a sulfonic acid base; B is (CH 2 ) 1 , p- (C 6 H 4 ) or m- (C 6 H 4 ) wherein l is an integer from 1 to 5.

일 구현예에 따르면, 상기 반응은 휘니그 염기 존재 하에서 수행하는 것이 바람직하다.According to one embodiment, the reaction is preferably carried out in the presence of Hunig base.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 4의 화합물을 제조하는 방법을 개시하며, 상기 제조방법은 하기 화학식 2의 화합물을 화학식 3 또는 화학식 5의 화합물과 반응시키는 단계를 포함한다.According to another aspect, the present invention discloses a method for preparing a compound of Formula 4, which method comprises reacting a compound of Formula 2 with a compound of Formula 3 or Formula 5.

[화학식 4][Formula 4]

Figure 112009059010727-PAT00035
Figure 112009059010727-PAT00035

Figure 112009059010727-PAT00036
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Figure 112009059010727-PAT00037
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Figure 112009059010727-PAT00038
Figure 112009059010727-PAT00038

상기 4개의 R1은 서로 동일하거나 상이하며 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고; 상기 2개의 R2는 서로 동일하거나 상이하며 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 설폰산기 또는 설폰산염기이며; 상기 R3은 카르복시기, 카르복시기 염기, 설폰산기 또는 설폰산 염기이고; 상기 B는(CH2)l, p-(C6H4) 또는 m-(C6H4)이며 여기서 l은 1 내지 5의 정수이며; 상기 R4는 카르복시기, 카르복시기 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 또는 수소이다.The four R 1 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; The two R 2 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a sulfonic acid group or a sulfonate group; R 3 is a carboxyl group, a carboxyl base, a sulfonic acid group or a sulfonic acid base; B is (CH 2 ) 1 , p- (C 6 H 4 ) or m- (C 6 H 4 ) wherein l is an integer from 1 to 5; R 4 is a carboxyl group, a carboxyl base, a sulfonic acid group, a sulfonic acid base or hydrogen.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 6a 또는 화학식 6b의 화합물을 제조하는 방법을 개시하는데, 상기 제조방법은 하기 화학식 4의 화합물을 1,1'-카르보닐디이미다졸 또는 N,N-디숙신이미딜 카보네이트와 반응시키는 단계를 포함한다.According to another aspect, the present invention discloses a method for preparing a compound of formula 6a or 6b, wherein the method for preparing a compound of formula 4 is 1,1'-carbonyldiimidazole or N, N- Reacting with disuccinimidyl carbonate.

[화학식 6a][Formula 6a]

Figure 112009059010727-PAT00039
Figure 112009059010727-PAT00039

[화학식 6b][Formula 6b]

Figure 112009059010727-PAT00040
Figure 112009059010727-PAT00040

[화학식 4][Formula 4]

Figure 112009059010727-PAT00041
Figure 112009059010727-PAT00041

상기 4개의 R1은 서로 같거나 상이하며 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하며 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 설폰산기 또는 설폰산염기이며; 상기 R3은 카르복시기, 카르복시기 염기, 설폰산기 또는 설폰산 염기이고; 상기 B는(CH2)l, p-(C6H4) 또는 m-(C6H4)이며 여기서 l은 1 내지 5의 정수이다.The four R 1 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; The two R 2 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a sulfonic acid group or a sulfonate group; R 3 is a carboxyl group, a carboxyl base, a sulfonic acid group or a sulfonic acid base; B is (CH 2 ) 1 , p- (C 6 H 4 ) or m- (C 6 H 4 ) wherein l is an integer from 1 to 5.

본 발명에 따른 물질 표지용 화합물은 특히 프로테오믹스(proteomics), 광학 분자 영상 등의 분야에서 단백질, 지방, 탄수화물 등의 생체 분자 등 표지 대상 물 질의 동정을 관찰하기 위하여 광범위하게 사용될 수 있다.The substance labeling compound according to the present invention can be widely used for observing identification of labeling substances such as biomolecules such as proteins, fats, and carbohydrates, especially in the fields of proteomics and optical molecular imaging.

본 발명품은 생체분자 연구자들이 표지 실험 수행 시 보다 안정적으로 염료를 다룰 수 있도록 하며 특히 생체분자와 염료의 결합 후 부산물이 발생하지 않아 부수적인 정제 작업을 피할 수 있게 된다. 또한 높은 안정성으로 장시간 보관이 용이할 뿐만 아니라 고분자 생체 분자의 장시간 염색이나 보다 복잡한 생체 분자를 다루는 사용자들에게도 보다 효과적으로 활용될 수 있다.The present invention enables biomolecular researchers to handle dyes more stably when performing labeling experiments, and in particular, by-products do not occur after the biomolecules and dyes are combined, thereby avoiding ancillary purification. In addition, it is not only easy to store for a long time with high stability, but also can be effectively used for users who deal with long-term dyeing of polymer biomolecules or more complex biomolecules.

또한, 본 발명의 물질 표지 대상 물질은 높은 형광 성능, 생체 분자와 같은 표지 대상 물질과의 반응시간 및 결합성능 또는 반응 후 이탈기 분리에 따른 부산물 발생뿐만 아니라, 수용액상에서의 안정성, 특히 다양한 pH에서의 안정성, 열안정성 외에도 수용액이나 친수성 조건에서의 광표백 및 소광현상 발생, 몰흡광계수, 형광이 발생되는 파장영역 등의 발명의 효과가 새롭게 발현되거나 이들 물성이 현저하게 향상되는 효과를 보이고, 나아가 다양한 완충액에서 염색이 가능한 장점을 보인다.In addition, the substance labeling material of the present invention has high fluorescence performance, reaction time and binding performance with the labeling material such as biomolecules, or by-products generated by separation of the leaving group after the reaction, as well as stability in aqueous solution, especially at various pH. In addition to the stability and thermal stability of the photo-bleaching and quenching in aqueous solution or hydrophilic conditions, the effect of the invention such as the wavelength absorption region of the molar absorption coefficient, fluorescence is newly expressed or these properties are significantly improved, and further various It is possible to stain in buffer.

본 발명에 따른 물질 표지용 화합물에는 비닐 설폰기가 도입되어 있으며, 상기 비닐 설폰기의 비닐기는 생체 분자의 친핵체와 아래와 같은 반응으로 결합한다.A vinyl sulfone group is introduced into the compound for labeling substances according to the present invention, and the vinyl group of the vinyl sulfone group binds to the nucleophile of the biomolecule by the following reaction.

Figure 112009059010727-PAT00042
Figure 112009059010727-PAT00042

본 발명에 따른 물질 표지용 화합물은 생체 분자와의 반응 후에 부산물을 생 성시키지 않는 등의 이질적 효과를 보인다.The substance labeling compound according to the present invention shows a heterogeneous effect such as not generating a by-product after the reaction with the biomolecule.

이하에서는 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물의 제조 방법을 예시적으로 설명한다. 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물의 제조 방법에서는 다음 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물을 반응식 1a에 예시된 바와 같이 반응시켜 얻은 화학식 4의 화합물을 출발 물질로 사용한다.Hereinafter, a method of preparing the compound of Formula 1 according to the present invention will be described. In the method for preparing the compound of Formula 1 according to the present invention, the compound of Formula 4 obtained by reacting the compound of Formula 2 with the compound of Formula 3 as illustrated in Scheme 1a is used as a starting material.

[화학식 2][Formula 2]

Figure 112009059010727-PAT00043
Figure 112009059010727-PAT00043

[화학식 3](3)

Figure 112009059010727-PAT00044
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Figure 112009059010727-PAT00045
Figure 112009059010727-PAT00045

상기 화학식 2 내지 3 및 반응식 1a에 있어서, R1, R2 및 R3은 각각 상기 화 학식 1에 대하여 정의한 바와 같다. 화학식 3 내지 4 및 반응식 1a에 있어서, R4는 카르복시기, 카르복시기 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 또는 수소이다.In Chemical Formulas 2 to 3 and Scheme 1a, R 1 , R 2, and R 3 are as defined for Chemical Formula 1 , respectively. In Formulas 3 to 4 and Scheme 1a, R 4 is a carboxyl group, carboxyl base, sulfonic acid group, sulfonic acid base or hydrogen.

화학식 4의 경우 하기 화학식 4a 및 4b의 화합물이 합성 단계에서 일정 비율로 동시에 생성되며 합성 조건과 출발 물질에 따라서 비율은 달라질 수 있다. 두 가지 화합물은 칼럼 크로마토그래피 방법으로 분리하거나 메탄올, 에탄올 등을 사용한 재결정 방법으로도 따로 얻을 수 있다.In the case of Formula 4, the compounds of the following Formulas 4a and 4b are simultaneously produced in a predetermined ratio in the synthesis step, and the ratio may vary depending on the synthesis conditions and the starting materials. The two compounds may be separated by column chromatography or separately obtained by recrystallization using methanol, ethanol and the like.

[화학식 4a][Chemical Formula 4a]

Figure 112009059010727-PAT00046
Figure 112009059010727-PAT00046

[화학식 4b][Formula 4b]

Figure 112009059010727-PAT00047
Figure 112009059010727-PAT00047

하기 화학식 5와 같은 무수화물을 출발 물질로 사용하여 반응식 1b에 예시된 것과 같이 화학식 4의 화합물을 얻을 수도 있으며 일반적으로는 산성 조건 또는 금속 촉매를 사용하여 고온에서 반응시켜 합성할 수 있으며 마찬가지로 화학식 4a, 화학식 4b와 같은 두 가지 이성질체가 함께 만들어진다.Using an anhydride such as the following formula (5) as a starting material to obtain a compound of formula (4) as illustrated in Scheme 1b, and generally can be synthesized by the reaction at high temperature using an acidic condition or a metal catalyst and similarly to formula (4a) , Two isomers are made together, as shown in Formula 4b.

[화학식 5][Chemical Formula 5]

Figure 112009059010727-PAT00048
Figure 112009059010727-PAT00048

Figure 112009059010727-PAT00049
Figure 112009059010727-PAT00049

다음으로, 상기 화학식 4의 화합물에서 R4가 카르복시기인 경우 반응식 2에 예시된 바와 같이 1,1'-카르보닐디이미다졸(CDI) 또는 N,N-디숙신이미딜 카보네이트(DSC)와 반응시켜 화학식 6a 또는 6b의 화합물을 얻는다.Next, when R 4 in the compound of Formula 4 is a carboxy group, it is reacted with 1,1′-carbonyldiimidazole (CDI) or N, N-disuccinimidyl carbonate (DSC) as illustrated in Scheme 2. To obtain the compound of formula 6a or 6b.

[화학식 6a][Formula 6a]

Figure 112009059010727-PAT00050
Figure 112009059010727-PAT00050

[화학식 6b][Formula 6b]

Figure 112009059010727-PAT00051
Figure 112009059010727-PAT00051

상기 화학식 6a 및 6b에 있어서, R1, R2 및 R3 은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같다.In Chemical Formulas 6a and 6b, R 1 , R 2 and R 3 are the same as defined for Chemical Formula 1, respectively.

Figure 112009059010727-PAT00052
Figure 112009059010727-PAT00052

상기 반응식 2에 있어서, R1, R2 및 R3은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정한 바와 같고, R5는 화학식 6a에서는 이미다졸기이고, 화학식 6b에서는 숙신이미딜옥시기이다.In Reaction Scheme 2, R 1 , R 2, and R 3 are as defined for Formula 1, respectively, R 5 is an imidazole group in Formula 6a, and a succinimidyloxy group in Formula 6b.

다음으로, 상기 화학식 6a 또는 6b의 화합물을 반응식 3에 예시된 바와 같이 휘니그 염기(Hunig's base) 존재 하에서 하기 화학식 7로 표시되는 화합물과 반응시켜 화학식 1의 화합물을 얻는다. Next, the compound of Chemical Formula 6a or 6b is reacted with the compound represented by Chemical Formula 7 in the presence of Hunig's base as illustrated in Scheme 3 to obtain a compound of Chemical Formula 1.

Figure 112009059010727-PAT00053
Figure 112009059010727-PAT00053

Figure 112009059010727-PAT00054
Figure 112009059010727-PAT00054

상기 화학식 7 및 반응식 3에 있어서, R1, R2 및 R3은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같고, R5는 화학식 6a에서는 이미다졸기이고, 화학식 6b에서는 숙신이미딜옥시기이며, R6은 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성된 군에서 선택되는 할로겐 원자, 또는 설파토기(-OSO3H)이고, B는(CH2)l, p-(C6H4) 또는 m-(C6H4) 이며 여기서 l은 1 내지 5의 정수이다. In Chemical Formula 7 and Scheme 3, R 1 , R 2 and R 3 are as defined for Chemical Formula 1, R 5 is an imidazole group in Chemical Formula 6a, a succinimidyloxy group in Chemical Formula 6b, and R 6 Is a halogen atom selected from the group consisting of fluorine, chlorine, bromine and iodine, or sulfato group (-OSO 3 H), and B is (CH 2 ) l , p- (C 6 H 4 ) or m- (C 6 H 4 ) where l is an integer from 1 to 5.

화학식 4a 및 4b의 화합물을 사용하여 반응식 2, 3의 단계를 거쳐 혼합된 형태가 아닌 하기 화학식 1a, 1b와 같은 순수한 화합물 형태로 얻을 수도 있다.The compounds of Formulas 4a and 4b may be obtained in the form of pure compounds, such as the following Formulas 1a and 1b, instead of the mixed form through the steps of Schemes 2 and 3.

Figure 112009059010727-PAT00055
Figure 112009059010727-PAT00055

Figure 112009059010727-PAT00056
Figure 112009059010727-PAT00056

또한 본 발명은 상기 화학식 1의 신규 시아닌 화합물을 이용하여 아민기, 수산화기 또는 티올기를 포함하는 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 표지하는 방법(binding protocol)에 관한 것이다. The present invention also relates to a method of labeling a biomolecule, a nanoparticle or an organic compound including an amine group, a hydroxyl group or a thiol group using the novel cyanine compound represented by Chemical Formula 1.

상기 생체 분자는 바람직하게는 단백질, 펩타이드(peptide), 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸(proteoglycan), 글라이코프로틴(glycoprotein) 및 siRNA로 구성된 군에서 선택된다. The biomolecule is preferably selected from the group consisting of proteins, peptides, carbohydrates, sugars, fats, antibodies, proteoglycans, glycoproteins and siRNAs.

상기 표지는 화학식 1 화합물에 존재하는 비닐 설폰기와 상기 아민기, 수산화기 또는 티올기의 반응에 의하여 상기 화학식 1 화합물과 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물, 구체적으로는 상기 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물에 존재하는 아민기, 수산화기 또는 티올기의 결합에 의하여 이루어지는 것이다. The label may be obtained by reacting the vinyl sulfone group and the amine group, the hydroxyl group or the thiol group in the compound of Formula 1 with the compound of Formula 1 and a biomolecule, nanoparticle or organic compound, specifically, the biomolecule, nanoparticle or organic compound. It is made by the coupling | bonding of the amine group, a hydroxyl group, or a thiol group which exists in the structure.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 기존의 숙신이미딜 에스터를 가진 로다민 염료의 경우와 마찬가지로 단백질과 화학식 1의 화합물과의 반응에 의하여 단백질에 쉽게 염색될 수 있다.The compound of Chemical Formula 1 according to the present invention can be easily dyed to the protein by reaction of the protein with the compound of Chemical Formula 1 as in the case of the rhodamine dye having a succinimidyl ester.

따라서, 상기 표지는 용매로서 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 및 아세토니트릴로 구성된 군에서 선택되는 유기 용매, 또는 물을 사용하고, pH 5 내지 12에서 상기 화학식 1의 화합물과 상기 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 반응시키는 것에 의하여 이루어진다. 상기 반응은 20 내지 80℃의 온도에서 30분 내지 48시간 동안이면 충분하다. Thus, the label uses, as a solvent, an organic solvent selected from the group consisting of phosphate buffer, carbonate buffer and tris buffer, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, and acetonitrile, or water selected from the group consisting of pH, and pH 5 to 12 by reacting the compound of Formula 1 with the biological molecules, nanoparticles or organic compounds. The reaction is sufficient for 30 minutes to 48 hours at a temperature of 20 to 80 ℃.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물로 표지되어 있는 생체 분자, 나노 입자 및 유기 화합물로 구성된 군에서 선택되는 물질에 관한 것이다. The present invention also relates to a material selected from the group consisting of biomolecules, nanoparticles and organic compounds labeled with the compound of Formula 1.

생체 분자의 경우 포장 단위에서부터 이미 정해진 완충액에 용해되어 있는 경우가 대부분이고, 생체 분자의 안정성을 확보하기 위하여 별도의 완충액 또는 pH를 요구하는 경우가 많아서 변수로 조절하는 것은 용이하지 않다. 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 다양한 완충액, 반응 온도, pH 조건 등에서 단백질과 용이하게 반응하여 형광을 발현하므로, 생체 분자 표지용으로 사용하기에 적합하다. In the case of biomolecules, most of them are dissolved in a predetermined buffer from the packaging unit, and in order to secure the stability of the biomolecules, a separate buffer or pH is often required, and thus it is not easy to adjust the parameters. The compound of formula 1 according to the present invention is easily reacted with the protein in various buffers, reaction temperature, pH conditions, etc. to express fluorescence, and thus is suitable for use for biomolecular labeling.

실시예Example

이하에서는 실시예 및 비교 실험을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples and comparative experiments. However, the examples are only for illustrating the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention.

먼저, 실시예 및 비교 실험에서 사용된 실험 장치, 분석 장비 및 시약에 대하여 설명한다. First, experimental apparatus, analytical equipment, and reagents used in Examples and Comparative Experiments will be described.

FT-NMR 분광 분석을 위한 기기로는 Bruker사의 Avance 300 및 400을 사용하였고, LC/MS에는 Varian사의 1200L Quadrupole을 사용하여, ESI(electrospray ionization) 방식으로 측정되었다. MALDI-TOF M/S는 Voyager MALDI-TOF DE 질량분석기(mass spectrometer)를 사용하였다. For the FT-NMR spectroscopic analysis, Bruker's Avance 300 and 400 were used. For LC / MS, Varian's 1200L Quadrupole was used for electrospray ionization (ESI). MALDI-TOF M / S used a Voyager MALDI-TOF DE mass spectrometer.

합성된 염료의 흡수 파장 및 최대 파장에서의 흡수값은 Hewlett-Packard사의 HP 8452 배열 분광 광도계(diode array spectrophotometer)로 측정되었고, 발광 파장 및 최대 발광 파장에서의 발광값은 Perkin Elmer사의 LS-55를 사용하여 얻었다. Absorption values at the maximum and maximum wavelengths of the synthesized dyes were measured with a Hewlett-Packard company's HP 8452 diode array spectrophotometer, and the emission values at the maximum and maximum emission wavelengths were determined using LS-55 from Perkin Elmer. Obtained using.

유기 화합물의 분리 및 정제를 위한 칼럼 크로마토그래피는 정상(normal phase)의 경우, 실리카겔(silica gel)로서 Merck사의 kieselgel 60(230-400 mesh)을 사용하였고, 박층 크로마토그래피(TLC)에는 실리카겔 60 GF254(0.25 mm, Merck)가 도포되어 있는 유리판을 사용하고, TLC 상의 화합물 확인은 254 nm 및 365 nm의 자외선을 이용하거나, 발색제로서 인몰리브덴산(phosphomolybdic acid)(PMA) 20 내지 30% 에탄올 용액 또는 KMnO4를 사용하였다. 역상(reverse phase)의 경우, TLC는 실리카겔 60 RP-18 F254S(0.25 mm, Merck)가 도포되어 있는 유리판을 사용하였고, 칼럼 크로마토그래피의 경우는 Buchi사의 MPLC(medium pressure liquid chromatography) 장비인 Fraction Collector R-660에 역상 칼럼 Lichroprep RP-18(40 내지 63 μm, Merck사 제품)를 연결하여 사용하였다. HPLC는 Agilent사의 1100 시리즈에 Waters사의 Bondapak C18 10 μm 125A를 장착하여 사용하였다.Column chromatography for separation and purification of organic compounds used Merck kieselgel 60 (230-400 mesh) as a silica gel in the normal phase, silica gel 60 GF254 for thin layer chromatography (TLC) (0.25 mm, Merck) coated glass plate and compound identification on TLC using 254 nm and 365 nm ultraviolet, or 20-30% ethanol solution of phosphomolybdic acid (PMA) as a colorant or KMnO 4 was used. In the reverse phase, TLC used a glass plate coated with silica gel 60 RP-18 F 254S ( 0.25 mm, Merck), and in the case of column chromatography, Fraction, a medium pressure liquid chromatography (MPLC) instrument from Buchi The reverse phase column Lichroprep RP-18 (40-63 μm, manufactured by Merck) was connected to Collector R-660. HPLC was used with Agilent's 1100 series equipped with Waterap's Bondapak C18 10 μm 125A.

겔 전기영동 실험을 위한 전기영동장치는 Amershame Biosciences사의 SE260, 소형 수직 겔 전기영동 장치(mini-vertical gel electrophoresis unit)에 BIO-RAD사의 PowerPac Basic Power Supply(Catalog No. 164-5050)를 연결하여 사용하였다. 겔로는 Lonza사의 PAGEr Gold Precast Gels(Polyacrylamide gels for protein electrophoresis, 10 내지 20% Tris-Glycine gels, Catalog No. 59506)을 사용하였다. SDS-PAGE 실험을 위한 러닝 완충액(running buffer) 및 로딩 완충액(loading buffer)는 아래와 같이 직접 제조하여 사용하였다. An electrophoresis device for gel electrophoresis experiments is to use BIO-RAD's PowerPac Basic Power Supply (Catalog No. 164-5050) to Amershame Biosciences' SE260, a mini-vertical gel electrophoresis unit. It was. Lonza's PAGEr Gold Precast Gels (Polyacrylamide gels for protein electrophoresis, 10-20% Tris-Glycine gels, Catalog No. 59506) were used. Running buffer and loading buffer for SDS-PAGE experiments were prepared and used directly as follows.

- 5 x running buffer 제조-5 x running buffer

· 3 g Tris(Trizma base, Sigma)3 g Tris (Trizma base, Sigma)

· 14.4 g Glycine(Sigma)14.4 g Glycine (Sigma)

· 증류수 100 mL, 제조 후 냉장 보관100 mL of distilled water, refrigerated after manufacture

- 5 x loading buffer 제조-5 x loading buffer

· 0.6 mL의 1 M Tris(Trizma base, Sigma)0.6 mL of 1 M Tris (Trizma base, Sigma)

· 5 mL의 50% 글리세롤(glycerol)5 mL of 50% glycerol

· 2 mL의 10% SDS2 mL of 10% SDS

· 0.5 mL의 2-메르캅토 에탄올(mercaptanethanol)0.5 mL of 2-mercaptanethanol

· 1.9 mL의 10% 증류수(bromophenol blue를 넣지 않고 증류수로 대체)1.9 mL of 10% distilled water (replaced with distilled water without adding bromophenol blue)

단백질은 GE Healthcare사와 Takara에서 시판 중인 Size Marker들을 사용하 였다. 표지된 생체 분자의 관찰 및 형광 강도(intensity)의 측정에는 Perkin Elmer사의 Geliance 600 장비를 이용하였고, 광원은 Geliance UV Epi(Catalog No. L7110026), Geliance Blue Epi(Catalog No. L7110027)이었고, 필터는 UV Filter, Geliance Short Pass Filter(500∼600 nm), Geliance Long Pass Filter(580 내지 660 nm), Geliance Blue Light Filter(550∼600 nm)를 형광 파장에 맞게 바꾸어 가면서 측정하였다. The protein used size markers sold by GE Healthcare and Takara. Perkin Elmer's Geliance 600 instrument was used for the observation of labeled biomolecules and the measurement of fluorescence intensity. UV filter, Geliance Short Pass Filter (500-600 nm), Geliance Long Pass Filter (580-660 nm), Geliance Blue Light Filter (550-600 nm) were measured while changing to the fluorescence wavelength.

시약은 주로 Aldrich사와 TCI사의 것을 사용하였다. 정제가 필요한 용매는 알려져 있는 방법에 따라 정제하여 사용하였고, 특별한 언급이 없는 한 모든 반응은 질소 기류 하에서 실시하였다. NMR 용매는 Aldrich사와 Cambridge Isotope Laboratories Inc사의 DMSO-d 6 또는 D2O를 사용하였다. 시그날의 상대적인 위치는 용매 내에 들어있는 테트라메틸실란(tetramethylsilane, TMS)을 기준으로 하거나 NMR 용매를 기준으로 하였다. 화학전이(chemical shift)는 표준 물질로부터 ppm 단위로 표시하였고, 데이터는 화학전이 다중도(chemical shift multiplicity)(s=singlet, d=doublet, t=triplet, m=multiplet), intergration, coupling constant(Hz)의 순으로 기록하였다.Reagents were mainly used by Aldrich and TCI. Solvents requiring purification were used in accordance with known methods and all reactions were carried out under a nitrogen stream unless otherwise indicated. NMR solvents were DMSO- d 6 or D 2 O from Aldrich and Cambridge Isotope Laboratories Inc. The relative positions of the signals were based on tetramethylsilane (TMS) in the solvent or on NMR solvents. Chemical shifts are expressed in ppm from the standard, and data are available for chemical shift multiplicity (s = singlet, d = doublet, t = triplet, m = multiplet), intergration, and coupling constants ( Hz).

실시예 1 : 화합물 1-1의 제조Example 1: Preparation of Compound 1-1

(1) 화합물 4-1의 합성(1) Synthesis of Compound 4-1

Figure 112009059010727-PAT00057
Figure 112009059010727-PAT00057

3-디메틸아미노페놀(3-(dimethylamino)phenol)(1.71 g, 12.5 mmol, 2.5 eq, Aldrich)과 1,2,4-벤젠트리카르복실릭 언하이드라이드(1,2,4-benzenetricarboxylic anhydride)(0.96 g, 5 mmol, 1 eq, Aldrich)을 ZnCl2 0.3 g 과 함께 투입한 후 5 시간 동안 가열하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 메탄올에 녹여 여과 하였다. 여과된 액을 감압 건조시킨 후 40 % 아세토니트릴(acetonitirle) 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 화합물 4-1을 얻었다.(0.61 g, 28%)3- (dimethylamino) phenol (1.71 g, 12.5 mmol, 2.5 eq, Aldrich) and 1,2,4-benzenetricarboxylic anhydride (1,2,4-benzenetricarboxylic anhydride) (0.96 g, 5 mmol, 1 eq, Aldrich) was added together with 0.3 g of ZnCl 2 , followed by heating for 5 hours. Cooled to room temperature, dissolved in methanol and filtered. The filtrate was dried under reduced pressure, and then 40% acetonitrile aqueous solution was purified by RP-C18 reverse phase chromatography with a developing solution to obtain compound 4-1. (0.61 g, 28%)

Rf = 0.35(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:1 v/v)R f = 0.35 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 1 v / v)

1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.62-8.22(m, 2H), 7.84-7.34(m, 1H), 7.19-6.43(m, 6H), 3.17(m, 12H) 1 H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ): δ 8.62-8.22 (m, 2H), 7.84-7.34 (m, 1H), 7.19-6.43 (m, 6H), 3.17 (m, 12H)

LC/MS, 계산치 C25H22N2O5 430.45, 측정치 429.08LC / MS, calcd C 25 H 22 N 2 0 5 430.45, found 429.08

화합물 4-1을 20% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 분리하면 순수한 화합물 4a-1과 4b-1을 각각 얻었다. Compound 4-1 was separated by RP-C18 reverse phase chromatography using a 20% acetonitrile aqueous solution as a developing solution to obtain pure compounds 4a-1 and 4b-1, respectively.

Figure 112009059010727-PAT00058
Figure 112009059010727-PAT00058

(0.24 g, 11 %)(0.24 g, 11%)

Rf = 0.20(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)R f = 0.20 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 2 v / v)

1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.64(s, 1H), 8.34(d, 1H, J = 7.84 Hz), 7.55(m, 1H), 6.93(m, 6H), 3.19(s, 12H) 1 H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ): δ 8.64 (s, 1H), 8.34 (d, 1H, J = 7.84 Hz), 7.55 (m, 1H), 6.93 (m, 6H), 3.19 (s , 12H)

LC/MS, 계산치 C25H22N2O5 430.45, 측정치 429.08LC / MS, calcd C 25 H 22 N 2 0 5 430.45, found 429.08

Figure 112009059010727-PAT00059
Figure 112009059010727-PAT00059

(0.21 g, 10 %)(0.21 g, 10%)

Rf = 0.18(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)R f = 0.18 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 2 v / v)

1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.35-8.26(m, 2H), 7.84(s, 1H), 6.93-6.55(m, 6H), 3.15(s, 12H) 1 H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ): δ 8.35-8.26 (m, 2H), 7.84 (s, 1H), 6.93-6.55 (m, 6H), 3.15 (s, 12H)

LC/MS, 계산치 C25H22N2O5 430.45, 측정치 429.08LC / MS, calcd C 25 H 22 N 2 0 5 430.45, found 429.08

(2) 화합물 1-1의 합성(2) Synthesis of Compound 1-1

Figure 112009059010727-PAT00060
Figure 112009059010727-PAT00060

화합물 4-1(430 mg, 1 mmol, 1 eq)을 DMF 10 mL에 용해시키고 DSC(500 mg, 2 mmol, 2 eq, Aldrich)를 넣고 교반하였다. DMAP(4'-(dimethylamino)-pyridine) 0.2 g을 THF 5 mL에 용해시키고 반응액에 적가한 후 2 시간 동안 교반하였다. 물과 클로로포름을 사용하여 추출하고, 상온에서 클로로포름 용액을 감압 증류하였다. 이것을 DMF 10 mL에 녹인 후 1.74 mL의 휘니그 염기를 넣고, 2-(2'-클로로에틸술포닐)에틸아민 염산염(208 mg, 1 mmol, 1 eq)을 5 mL의 DMF에 녹여서 적가하고, 상온에서 12 시간 이상 교반하였다. 물과 메틸렌클로라이드(methylene chloride, 디클로로메탄)를 사용하여 추출하고, 35 내지 40 ℃에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 25 % 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 화합물 1-1 을 얻었다.(159 mg, 29%)Compound 4-1 (430 mg, 1 mmol, 1 eq) was dissolved in 10 mL of DMF, and DSC (500 mg, 2 mmol, 2 eq, Aldrich) was added thereto and stirred. 0.2 g of DMAP (4 '-(dimethylamino) -pyridine) was dissolved in 5 mL of THF, and added dropwise to the reaction solution, followed by stirring for 2 hours. Extraction was performed using water and chloroform, and the chloroform solution was distilled under reduced pressure at room temperature. Dissolve it in 10 mL of DMF, add 1.74 mL of Hunig's base, add 2- (2'-chloroethylsulfonyl) ethylamine hydrochloride (208 mg, 1 mmol, 1 eq) in 5 mL of DMF, and add dropwise. Stir at room temperature for at least 12 hours. Extracted with water and methylene chloride (methylene chloride, dichloromethane), the solvent was removed by distillation under reduced pressure at 35 to 40 ℃. A 25% aqueous solution of acetonitrile was purified by RP-C18 reverse phase chromatography with a developing solution to give compound 1-1. (159 mg, 29%)

Rf = 0.32(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:1 v/v)R f = 0.32 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 1 v / v)

1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 9.03-8.88(m, 1H), 8.41-8.06(m, 2H), 7.59- 7.32(m, 1H), 7.09-6.92(m, 2H), 6.50(m, 6H), 6.32-6.17(m, 2H), 3.66-3.51(m, 4H), 2.93(s, 12H) 1 H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ): δ 9.03-8.88 (m, 1H), 8.41-8.06 (m, 2H), 7.59-7.32 (m, 1H), 7.09-6.92 (m, 2H), 6.50 (m, 6H), 6.32-6.17 (m, 2H), 3.66-3.51 (m, 4H), 2.93 (s, 12H)

LC/MS, 계산치 C29H29N3O6S 547.62, 측정치 547.97LC / MS, calculated C 29 H 29 N 3 O 6 S 547.62, found 547.97

λabs : 553 nm, λfl : 587 nmλ abs : 553 nm, λ fl : 587 nm

상기와 같은 방법으로 화합물 4a-1 또는 4b-1을 출발물질로 사용하여 화합물 1a-1 또는 화합물 1b-1을 얻을 수 있었다.Compound 1a-1 or compound 1b-1 was obtained by using compound 4a-1 or 4b-1 as a starting material in the same manner as described above.

Figure 112009059010727-PAT00061
Figure 112009059010727-PAT00061

(170 mg, 31 %)(170 mg, 31%)

Rf = 0.20(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)R f = 0.20 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 2 v / v)

1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 9.09-9.03(m, 1H), 8.41-8.37(m, 1H), 8.20-8.18(d, 1H, J = 6.92 Hz), 7.34-7.32(d, 1H, J = 8.16 Hz), 7.09-7.02(m, 1H), 6.52-6.50(m, 6H), 6.32-6.28(m, 2H), 3.73-3.65(m, 4H), 2.93(s, 12H) 1 H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ): δ 9.09-9.03 (m, 1H), 8.41-8.37 (m, 1H), 8.20-8.18 (d, 1H, J = 6.92 Hz), 7.34-7.32 ( d, 1H, J = 8.16 Hz), 7.09-7.02 (m, 1H), 6.52-6.50 (m, 6H), 6.32-6.28 (m, 2H), 3.73-3.65 (m, 4H), 2.93 (s, 12H)

LC/MS, 계산치 C29H29N3O6S 547.62, 측정치 547.97LC / MS, calculated C 29 H 29 N 3 O 6 S 547.62, found 547.97

λabs : 553 nm, λfl : 587 nmλ abs : 553 nm, λ fl : 587 nm

Figure 112009059010727-PAT00062
Figure 112009059010727-PAT00062

(159 mg, 29 %)(159 mg, 29%)

Rf = 0.20(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)R f = 0.20 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 2 v / v)

1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.87(m, 1H), 8.12-8.07(m, 2H), 7.59(s, 1H), 6.99-6.92(m, 1H), 6.50(m, 6H), 6.23-6.11(m, 2H), 3.51(m, 4H), 2.93(s, 12H) 1 H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ): δ 8.87 (m, 1H), 8.12-8.07 (m, 2H), 7.59 (s, 1H), 6.99-6.92 (m, 1H), 6.50 (m, 6H), 6.23-6.11 (m, 2H), 3.51 (m, 4H), 2.93 (s, 12H)

LC/MS, 계산치 C29H29N3O6S 547.62, 측정치 547.97LC / MS, calculated C 29 H 29 N 3 O 6 S 547.62, found 547.97

λabs : 553 nm, λfl : 587 nmλ abs : 553 nm, λ fl : 587 nm

실시예 2: 화합물 1-2의 제조Example 2: Preparation of Compound 1-2

(1) 화합물 4-2의 합성(1) Synthesis of Compound 4-2

Figure 112009059010727-PAT00063
Figure 112009059010727-PAT00063

3-아미노페놀(3-aminophenol)(5.45 g, 50 mmol, 2.5 eq, Aldrich)과 트리멜리틱 산(trimellitic acid)(4.20 g, 20 mmol, 1 eq, TCI)을 진한황산 28 mL에 가한 후, 6 시간 동안 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 얼음물에 반응액을 투입하였다. 중조를 사용하여 반응액을 중화시키고, 메탄올을 사용하여 용해한 후 감압 여과하였다. 여과된 액을 감압 건조시킨 후 40% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 1-a를 얻었다.(3.16 g, 42%)3-aminophenol (5.45 g, 50 mmol, 2.5 eq, Aldrich) and trimellitic acid (4.20 g, 20 mmol, 1 eq, TCI) were added to 28 mL of concentrated sulfuric acid. The reaction was heated to reflux for 6 hours. After cooling to room temperature, the reaction solution was added to ice water. The reaction solution was neutralized using sodium bicarbonate, dissolved in methanol and filtered under reduced pressure. The filtrate was dried under reduced pressure, and then 40% acetonitrile aqueous solution was purified by RP-C18 reverse phase chromatography with a developing solution to obtain pure compound 1-a. (3.16 g, 42%)

Rf = 0.45(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:1 v/v)R f = 0.45 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 1 v / v)

1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 10.45-10.36(m, 1H), 8.46-8.05(m, 2H), 7.56-7.17(m, 1H), 7.05-7.03(m, 2H), 5.98-5.96(m, 2H), 5.88-5.80(m, 2H), 3.66(s, 2H) 1 H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ): δ 10.45-10.36 (m, 1H), 8.46-8.05 (m, 2H), 7.56-7.17 (m, 1H), 7.05-7.03 (m, 2H), 5.98-5.96 (m, 2H), 5.88-5.80 (m, 2H), 3.66 (s, 2H)

LC/MS, 계산치 C21H16N2O5 376.36, 측정치 376.05LC / MS, calculated C 21 H 16 N 2 O 5 376.36, found 376.05

화합물 4-2를 20% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 분리하면 순수한 화합물 4a-2과 4b-2을 각각 얻었다. Compound 4-2 was separated by RP-C18 reverse phase chromatography using a 20% acetonitrile aqueous solution to obtain pure compounds 4a-2 and 4b-2, respectively.

Figure 112009059010727-PAT00064
Figure 112009059010727-PAT00064

(1.20 g, 16 %)(1.20 g, 16%)

Rf = 0.25(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)R f = 0.25 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 2 v / v)

LC/MS, 계산치 C21H16N2O5 376.36, 측정치 376.05LC / MS, calculated C 21 H 16 N 2 O 5 376.36, found 376.05

Figure 112009059010727-PAT00065
Figure 112009059010727-PAT00065

(1.13 g, 15 %)(1.13 g, 15%)

Rf = 0.23(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)R f = 0.23 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 2 v / v)

LC/MS, 계산치 C21H16N2O5 376.36, 측정치 376.05LC / MS, calculated C 21 H 16 N 2 O 5 376.36, found 376.05

(2) 화합물 1-2의 합성(2) Synthesis of Compound 1-2

Figure 112009059010727-PAT00066
Figure 112009059010727-PAT00066

화합물 4-1(376 mg, 1 mmol, 1 eq)을 DMF 10 mL에 용해시키고 DSC(500 mg, 2 mmol, 2 eq, Aldrich)를 넣고 교반하였다. DMAP 0.2 g을 THF 5 mL에 용해시키고 반응액에 적가한 후 2 시간 동안 교반하였다. 물과 클로로포름을 사용하여 추출하고, 상온에서 클로로포름 용액을 감압 증류하였다. 이것을 DMF 10 mL에 녹인 후 1.74 mL의 휘니그 베이스를 넣고, 2-(2'-클로로에틸술포닐)에틸아민 염산염(208 mg, 1 mmol, 1 eq)을 5 mL의 DMF에 녹여서 적가하고, 상온에서 12 시간 이상 교반하였다. 물과 메틸렌클로라이드(methylene chloride, 디클로로메탄)를 사용하여 추출하고, 35 내지 40 ℃에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 25 % 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 1-2를 얻었다.(153 mg, 31 %)Compound 4-1 (376 mg, 1 mmol, 1 eq) was dissolved in 10 mL of DMF, and DSC (500 mg, 2 mmol, 2 eq, Aldrich) was added thereto and stirred. 0.2 g of DMAP was dissolved in 5 mL of THF, added dropwise to the reaction solution, and stirred for 2 hours. Extraction was performed using water and chloroform, and the chloroform solution was distilled under reduced pressure at room temperature. Dissolve it in 10 mL of DMF, add 1.74 mL of Hunig's base, add 2- (2'-chloroethylsulfonyl) ethylamine hydrochloride (208 mg, 1 mmol, 1 eq) in 5 mL of DMF dropwise, Stir at room temperature for at least 12 hours. Extracted with water and methylene chloride (methylene chloride, dichloromethane), the solvent was removed by distillation under reduced pressure at 35 to 40 ℃. 25% aqueous acetonitrile solution was purified by RP-C18 reverse phase chromatography with a developing solution to give pure Compound 1-2 (153 mg, 31%).

Rf = 0.40(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:1 v/v)R f = 0.40 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 1 v / v)

MALDI-TOF/MS, 계산치 C25H23N3O6S 493.53, 측정치 493.17MALDI-TOF / MS, calculated C 25 H 23 N 3 O 6 S 493.53, measured 493.17

λabs : 506 nm, λfl : 532 nmλ abs : 506 nm, λ fl : 532 nm

상기와 같은 방법으로 화합물 4a-2 또는 4b-2을 출발물질로 사용하여 화합물 1a-1 또는 화합물 1b-1을 얻을 수 있었다.Compound 1a-1 or compound 1b-1 was obtained by using compound 4a-2 or 4b-2 as a starting material in the same manner as described above.

Figure 112009059010727-PAT00067
Figure 112009059010727-PAT00067

(163 mg, 33 %)(163 mg, 33%)

Rf = 0.22(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)R f = 0.22 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 2 v / v)

MALDI-TOF/MS, 계산치 C25H23N3O6S 493.53, 측정치 493.17MALDI-TOF / MS, calculated C 25 H 23 N 3 O 6 S 493.53, measured 493.17

λabs : 506 nm, λfl : 532 nmλ abs : 506 nm, λ fl : 532 nm

Figure 112009059010727-PAT00068
Figure 112009059010727-PAT00068

(168 mg, 34 %)(168 mg, 34%)

Rf = 0.20(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)R f = 0.20 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 2 v / v)

MALDI-TOF/MS, 계산치 C25H23N3O6S 493.53, 측정치 493.17MALDI-TOF / MS, calculated C 25 H 23 N 3 O 6 S 493.53, measured 493.17

λabs : 506 nm, λfl : 532 nmλ abs : 506 nm, λ fl : 532 nm

실시예 3 : 화합물 1-3의 제조Example 3: Preparation of Compound 1-3

(1) 화합물 4-3의 합성(1) Synthesis of Compound 4-3

Figure 112009059010727-PAT00069
Figure 112009059010727-PAT00069

3-디에틸아미노페놀(3-(diethylamino)phenol)(3.3 g, 20 mmol, 2 eq, Aldrich)과 트리멜리틱 산(trimellitic acid)(2.1 g, 10 mmol, 1 eq, TCI)을 ZnCl2 0.6 g 과 함께 xylene 20 mL 에 투입한 후, 12 시간 동안 가열하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 감압 여과하였다. 여과 후 남은 물질을 메탄올에 녹여 여과하 였다. 여과액을 감압 건조시킨 후 40 % 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 4-3를 얻었다.(1.99 g, 41 %)3-diethylaminophenol (3- (diethylamino) phenol) (3.3 g, 20 mmol, 2 eq, Aldrich) and trimellitic acid (2.1 g, 10 mmol, 1 eq, TCI) were added to ZnCl 2 It was added to 20 mL of xylene with 0.6 g, followed by heating for 12 hours. Cooled to room temperature and filtered under reduced pressure. The remaining material after filtration was dissolved in methanol and filtered. The filtrate was dried under reduced pressure, and then 40% acetonitrile aqueous solution was purified by RP-C18 reverse phase chromatography with a developing solution to obtain pure compound 4-3. (1.99 g, 41%)

Rf = 0.31(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:1 v/v)R f = 0.31 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 1 v / v)

1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.47-8.03(m, 2H), 7.80-7.50(m, 1H), 6.90-6.76(m, 2H), 6.19-5.97(m, 4H), 3.50(m, 8H), 1.14-1.03(m, 12H) 1 H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ): δ 8.47-8.03 (m, 2H), 7.80-7.50 (m, 1H), 6.90-6.76 (m, 2H), 6.19-5.97 (m, 4H), 3.50 (m, 8H), 1.14-1.03 (m, 12H)

LC/MS, 계산치 C29H30N2O5 486.56, 측정치 487.06LC / MS, calculated C 29 H 30 N 2 O 5 486.56, found 487.06

화합물 4-3을 20 % 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 분리하면 순수한 화합물 4a-3과 4b-3을 각각 얻었다. Compound 4-3 was separated by 20% acetonitrile aqueous solution using RP-C18 reverse phase chromatography to obtain pure compounds 4a-3 and 4b-3, respectively.

Figure 112009059010727-PAT00070
Figure 112009059010727-PAT00070

(0.92 g, 19 %)(0.92 g, 19%)

Rf = 0.15(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)R f = 0.15 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 2 v / v)

LC/MS, 계산치 C29H30N2O5 486.56, 측정치 487.06LC / MS, calculated C 29 H 30 N 2 O 5 486.56, found 487.06

Figure 112009059010727-PAT00071
Figure 112009059010727-PAT00071

(0.73 g, 15 %)(0.73 g, 15%)

Rf = 0.13(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)R f = 0.13 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 2 v / v)

LC/MS, 계산치 C29H30N2O5 486.56, 측정치 487.06LC / MS, calculated C 29 H 30 N 2 O 5 486.56, found 487.06

(2) 화합물 1-3의 합성(2) Synthesis of Compound 1-3

Figure 112009059010727-PAT00072
Figure 112009059010727-PAT00072

화합물 4-3(486 mg, 1 mmol, 1 eq)을 DMF 15 mL에 용해시키고 DSC(500 mg, 2 mmol, 2 eq, Aldrich)를 넣고 교반하였다. DMAP 0.2 g을 THF 5 mL에 용해시키고 반응액에 적가한 후 2 시간 동안 교반하였다. 물과 클로로포름을 사용하여 추출하고, 상온에서 클로로포름 용액을 감압 증류하였다. 이것을 DMF 10 mL에 녹인 후 1.74 mL의 휘니그 베이스를 넣고, 2-(2'-클로로에틸술포닐)에틸아민 염산염(208 mg, 1 mmol, 1 eq)을 5 mL의 DMF에 녹여서 적가하고, 상온에서 12 시간 이상 교반하였다. 물과 메틸렌클로라이드(methylene chloride, 디클로로메탄)를 사용하여 추출하고, 35 내지 40℃에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 25% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 3-b를 얻었다.(199 mg, 33%)Compound 4-3 (486 mg, 1 mmol, 1 eq) was dissolved in 15 mL of DMF, and DSC (500 mg, 2 mmol, 2 eq, Aldrich) was added thereto and stirred. 0.2 g of DMAP was dissolved in 5 mL of THF, added dropwise to the reaction solution, and stirred for 2 hours. Extraction was performed using water and chloroform, and the chloroform solution was distilled under reduced pressure at room temperature. Dissolve it in 10 mL of DMF, add 1.74 mL of Hunig's base, add 2- (2'-chloroethylsulfonyl) ethylamine hydrochloride (208 mg, 1 mmol, 1 eq) in 5 mL of DMF dropwise, Stir at room temperature for at least 12 hours. Extracted with water and methylene chloride (methylene chloride, dichloromethane) and distilled under reduced pressure at 35 to 40 ℃ to remove the solvent. 25% acetonitrile aqueous solution was purified by RP-C18 reverse phase chromatography with a developing solution to give pure compound 3-b. (199 mg, 33%)

Rf = 0.28(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:1 v/v)R f = 0.28 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 1 v / v)

LC/MS, 계산치 C33H38N3O6S 604.74, 측정치 604.16LC / MS, calculated C 33 H 38 N 3 O 6 S 604.74, found 604.16

λabs : 552 nm, λfl : 585 nmλ abs : 552 nm, λ fl : 585 nm

상기와 같은 방법으로 화합물 4a-3 또는 4b-3을 출발물질로 사용하여 화합물 1a-3 또는 화합물 1b-3을 얻을 수 있었다.Compound 1a-3 or compound 1b-3 was obtained by using compound 4a-3 or 4b-3 as a starting material in the same manner as described above.

Figure 112009059010727-PAT00073
Figure 112009059010727-PAT00073

(151 mg, 25 %)(151 mg, 25%)

Rf = 0.14(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)R f = 0.14 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 2 v / v)

LC/MS, 계산치 C33H38N3O6S 604.74, 측정치 604.16LC / MS, calculated C 33 H 38 N 3 O 6 S 604.74, found 604.16

λabs : 552 nm, λfl : 585 nmλ abs : 552 nm, λ fl : 585 nm

Figure 112009059010727-PAT00074
Figure 112009059010727-PAT00074

(157 mg, 26 %)(157 mg, 26%)

Rf = 0.12(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)R f = 0.12 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 2 v / v)

LC/MS, 계산치 C33H38N3O6S 604.74, 측정치 604.16LC / MS, calculated C 33 H 38 N 3 O 6 S 604.74, found 604.16

λabs : 552 nm, λfl : 585 nmλ abs : 552 nm, λ fl : 585 nm

실시예 4: 단백질에 대한 염색 실험Example 4: Staining Experiments on Proteins

지이 헬스케어사에서 시판 중인 SDS 전기영동을 위한 AmershameTM LMW Calibration 키트(17-0446-01)의 1개의 팩(pack) 중 1개의 바이알(vial)에는 576 μg의 마커용 단백질로서, 포스포릴라아제 b(phosphorylase b)(97 kD, 67 μg), 알부민(albumin)(66 kD, 83 μg), 오발부민(ovalbumin)(45 kD, 147 μg), 카보닉 안하이드라이즈(carbonic anhydrase)(30 kD, 83 μg), 티롭신 인히비터(trypsin inhibitor)(20.1 kD, 80 μg), α-락탈부민(α-lactalbumin)(14.4 kD, 116 μg)의 6종이 포함되어 있다. One vial (vial) of one pack of Amershame TM LMW Calibration Kit (17-0446-01) for SDS gel electrophoresis which is commercially available from GE Healthcare Inc. (pack) includes a protein of 576 μg for the markers, phosphorylase Phosphorylase b (97 kD, 67 μg), albumin (66 kD, 83 μg), ovalbumin (45 kD, 147 μg), carbonic anhydrase (30 kD, 83 μg), tyrosine inhibitors (20.1 kD, 80 μg), and α-lactalbumin (α-lactalbumin) (14.4 kD, 116 μg).

상온(20℃)에서 상기 마커용 단백질이 들어있는 1개의 바이알에 250 μl의 pH 9.0 0.1 M 포스페이트 완충액을 가하여 용해시키고, 3개의 e-튜브에 25 μl씩 분취하였다(25 μg protein / 25 μl buffer, 6.9x10-5 μmol in 25 μl buffer solution). 화합물 1-1, 1a-1, 1b-1을 1 mg씩을 e-tube에 넣고 100 μl의 DMF에 용해시킨 후, 각 1 μl씩 분취하여 앞서의 단백질이 들어 있는 3개의 e-튜브에 넣은 후, 볼텍스(vortex)와 원심분리기를 사용하여 균일하게 혼합하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.250 μl of pH 9.0 0.1 M phosphate buffer was added to one vial containing the marker protein at room temperature (20 ° C.), and 25 μl was aliquoted into three e-tubes (25 μg protein / 25 μl buffer). , 6.9 × 10 −5 μmol in 25 μl buffer solution). 1 mg of compound 1-1, 1a-1, 1b-1 was added to an e-tube, dissolved in 100 μl of DMF, and then aliquoted into 1 μl of each protein into three e-tubes containing the preceding protein. The mixture was uniformly mixed using a vortex and a centrifuge and reacted at room temperature for 1 hour.

상기 3개의 반응액에 5X 로딩버퍼를 6μl씩 넣은 후 각각 15 μl씩 분취하여 겔에 로딩(loading)하여 겔 전기영동으로 전개한 결과를 도 1에 나타내었다. 전기영동은 125V에서 2시간 동안 진행하였다. 도 1은 육안으로 관찰되는 사진이다. 도 1에 있어서 ①은 화합물 1-1, ②는 화합물 1a-1, ③은 화합물 1b-1의 반응액이며, 육안으로 보아도 염색된 단백질들의 확인이 가능하며 형광 사진을 측정한 결과로도 확인할 수 있다.6 μl of 5 × loading buffers were added to each of the three reaction solutions, and then 15 μl of each of the three reaction solutions was loaded on the gel and developed by gel electrophoresis. Electrophoresis was performed for 2 hours at 125V. 1 is a photograph observed with the naked eye. In Figure 1, ① is a compound 1-1, ② is a compound 1a-1, ③ is a reaction solution of compound 1b-1, it is possible to confirm the stained proteins even with the naked eye and can be confirmed by the result of fluorescence measurement have.

상기 실시예에서 확인한 바와 같이(혹은 상기 실시예에서 명시적으로 기재하고 있지는 않다고 하더라도), 본 발명에 따른 화합물은 높은 형광 성능, 생체 분자와 같은 표지 대상 물질과의 반응시간 및 결합성능 또는 반응 후 이탈기 분리에 따른 부산물 발생뿐만 아니라, 수용액상에서의 안정성, 특히 다양한 pH에서의 안정성, 열안정성 외에도 수용액이나 친수성 조건에서의 광표백 및 소광현상 발생, 몰흡광계수, 형광이 발생되는 파장영역 등의 발명의 효과가 새롭게 발현되거나 또는 이들의 물성이 현저하게 향상었음을 확인하였고, 나아가 다양한 완충액에서 염색이 가능하다는 점을 확인하였다.As confirmed in the above examples (or not explicitly stated in the above examples), the compounds according to the invention have high fluorescence performance, reaction time and binding performance with or after the reaction with the target substance such as biomolecules or after the reaction. In addition to the generation of by-products due to the separation of the leaving group, in addition to the stability in the aqueous solution, in particular at various pH, thermal stability, in addition to the photobleaching and quenching in aqueous solution or hydrophilic conditions, the molar absorption coefficient, the wavelength region in which fluorescence occurs, etc. It was confirmed that the effect of the newly expressed or significantly improved their physical properties, and further confirmed that it is possible to stain in a variety of buffers.

또한, 본 발명에 속하는 화합물에 있어서 치환기의 종류 및 구조에 따라서 화합물의 물성이 차이를 보이기는 하나, 그럼에도 불구하고 본 발명의 범위에 속하면서 본 발명의 실시예에 명시적으로 기재되어 있지 않은 치환기를 포함하는 화합물에 대해서도 본 발명의 실시예의 반응 원리 및 조건이 그에 준하여 적용될 수 있으며, 따라서 통상의 기술자라면 본 발명의 실시예의 개시내용 및 본 발명의 출원 당시의 당업계 상식에 기초하여 본 발명의 실시예에 명시적으로 개시되어 있지 않은 본 발명의 화합물 역시 용이하게 실시할 수 있다는 점은 자명하다.In addition, in the compounds belonging to the present invention, although the physical properties of the compounds differ depending on the type and structure of the substituents, nevertheless, the substituents belonging to the scope of the present invention and not explicitly described in the examples of the present invention The reaction principles and conditions of the examples of the present invention may also be applied accordingly to the compound to be included, and accordingly, those skilled in the art will practice the present invention based on the disclosure of the examples of the present invention and common knowledge in the art at the time of filing of the present invention. It is obvious that the compounds of the present invention which are not explicitly disclosed in the examples can also be easily carried out.

도 1은 실시예 4에서 표지시킨 단백질들을 겔 전기영동으로 전개한 것의 육안으로 관찰되는 사진을 나타낸 것이다. Figure 1 shows a photograph observed with the naked eye of the protein labeled in Example 4 developed by gel electrophoresis.

Claims (19)

하기 화학식 1c의 구조를 갖는 물질 표지용 화합물 또는 이의 염:A compound for labeling substances having a structure of Formula 1c or a salt thereof: [화학식 1c][Formula 1c]
Figure 112009059010727-PAT00075
Figure 112009059010727-PAT00075
 상기 2개의 R1은 서로 같거나 상이하며 서로 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고; 상기 2개의 R1'은 서로 같거나 상이하며 서로 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하며 서로 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 카르복시기, 카르복실산 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 중에서 선택되고; 상기 2개의 R4는 서로 같거나 상이하며 서로 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며; 상기 R3은 카르복시기, 카르복실산 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 중에서 선택되고; The two R 1 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; The two R 1 ′ are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; The two R 2 are the same as or different from each other, and are independently selected from hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carboxyl group, a carboxylic acid base, a sulfonic acid group, and a sulfonic acid base; The two R 4 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; R 3 is selected from a carboxyl group, a carboxylic acid base, a sulfonic acid group, and a sulfonic acid base; 상기 X1, X2, X3, X4 중 어느 하나는
Figure 112009059010727-PAT00076
또는
Figure 112009059010727-PAT00077
이며, 상기 A 또는 B는 서로 독립적으로(CH2)L, p-(C6H4), m-(C6H4)이고, 상기 L은 1 내지 5의 정수이고; X1, X2, X3, X4 중 나머지 3개는 수소 또는 할로겐 원자이며;Any one of the X1, X2, X3, X4
Figure 112009059010727-PAT00076
or
Figure 112009059010727-PAT00077
A or B are independently of each other (CH 2 ) L , p- (C 6 H 4 ), m- (C 6 H 4 ), and L is an integer from 1 to 5; The other three of X1, X2, X3, and X4 are hydrogen or halogen atoms; 혹은, 상기 화합물의 좌우에 위치한 R1과 R2의 두 쌍 중 어느 한 쌍 또는 좌우 두 쌍 모두 서로 융합하여 1개의 질소 및 4~6개의 탄소 원자가 골격을 이루는 제1 고리를 형성할 수 있고, 상기 제1 고리는 비치환되었거나 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 카르복시기, 카르복실산 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 중에서 선택된 치환기에 의해서 치환된 포화 또는 불포화 고리이며;Alternatively, any one of the two pairs of R1 and R2 positioned at the left and right of the compound, or both the left and right pairs may be fused to each other to form a first ring in which one nitrogen and four to six carbon atoms form a skeleton. One ring is a saturated or unsaturated ring which is unsubstituted or substituted by a substituent selected from an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carboxyl group, a carboxylic acid base, a sulfonic acid group, and a sulfonic acid base; 또한, 상기 화합물 좌우에 위치한 R1'과 R4의 두 쌍 중 어느 한 쌍 또는 좌우 두 쌍 모두 서로 융합하여 1개의 질소 및 4~6개의 탄소 원자가 골격을 이루는 제2 고리를 형성할 수 있고, 상기 제2 고리는 비치환되었거나 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 카르복시기, 카르복실산 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 중에서 선택된 치환기에 의해서 치환된 포화 또는 불포화 고리이다.In addition, any one of the two pairs of R1 'and R4 or the two left and right pairs positioned at the left and right sides of the compound may be fused to each other to form a second ring in which one nitrogen and four to six carbon atoms form a skeleton. The bicyclic ring is a saturated or unsaturated ring which is unsubstituted or substituted by a substituent selected from an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carboxyl group, a carboxylic acid base, a sulfonic acid group and a sulfonic acid base. 제1항에 있어서, 상기 X2 또는 X3 중 어느 하나가
Figure 112009059010727-PAT00078
또는
Figure 112009059010727-PAT00079
이고; X1, X2, X3, X4 중 나머지 3개는 수소 또는 할로겐 원자인 것을 특징으로 하는 물질 표지 화합물.The method of claim 1, wherein any one of X2 or X3
Figure 112009059010727-PAT00078
or
Figure 112009059010727-PAT00079
ego; The other three of X1, X2, X3, and X4 are hydrogen or halogen atoms. 제1항에 있어서, 상기 R1과 R2가 융합하여 이루는 제1 고리가
Figure 112009059010727-PAT00080
인 것임 을 특징으로 하는 물질 표지 화합물.The method of claim 1, wherein the first ring formed by fusion of R1 and R2 is
Figure 112009059010727-PAT00080
Substance labeling compound characterized in that. 제1항에 있어서, 상기 R1'과 R4가 이루는 제2 고리가
Figure 112009059010727-PAT00081
또는
Figure 112009059010727-PAT00082
인 것임을 특징으로 하는 물질 표지 화합물.The method of claim 1, wherein the second ring formed by R1 'and R4 is
Figure 112009059010727-PAT00081
or
Figure 112009059010727-PAT00082
Substance labeling compound, characterized in that. 제1항에 있어서, 상기 화합물 좌우에 위치하는 R1, R2, R1', R4의 좌우 2세트 중 어느 한 세트 또는 두 세트 모두
Figure 112009059010727-PAT00083
또는
Figure 112009059010727-PAT00084
의 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 물질 표지용 화합물.The method according to claim 1, wherein any one or both sets of the left and right two sets of R1, R2, R1 ', R4 located to the left and right of the compound
Figure 112009059010727-PAT00083
or
Figure 112009059010727-PAT00084
Compound for labeling a substance, characterized in that to form a structure. 하기 화학식 1의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 물질 표지용 화합물:A compound for labeling substances, having the structure of Formula 1. [화학식 1][Formula 1]
Figure 112009059010727-PAT00085
Figure 112009059010727-PAT00085
 상기 4개의 R1은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 설폰산기 또는 설폰산 염기이며; 상기 R3은 카르복시기, 카르복시기 염기, 설폰산기 또는 설폰산 염기이고; B는(CH2)l, p-(C6H4) 또는 m-(C6H4)이며 여기서 l은 1 내지 5의 정수이다.The four R 1 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; The two R 2 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a sulfonic acid group or a sulfonic acid base; R 3 is a carboxyl group, a carboxyl base, a sulfonic acid group or a sulfonic acid base; B is (CH 2 ) 1 , p- (C 6 H 4 ) or m- (C 6 H 4 ), where l is an integer from 1 to 5. 제1항에 있어서, 상기 물질 표지용 화합물은 하기 화학식 중 어느 하나의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 물질 표지용 화합물:The compound for labeling substances according to claim 1, wherein the substance labeling compound has a structure of any one of the following Formulas:
Figure 112009059010727-PAT00086
Figure 112009059010727-PAT00086
Figure 112009059010727-PAT00087
Figure 112009059010727-PAT00087
Figure 112009059010727-PAT00088
Figure 112009059010727-PAT00088
Figure 112009059010727-PAT00089
Figure 112009059010727-PAT00090
Figure 112009059010727-PAT00091
Figure 112009059010727-PAT00089
Figure 112009059010727-PAT00090
Figure 112009059010727-PAT00091
Figure 112009059010727-PAT00092
Figure 112009059010727-PAT00093
Figure 112009059010727-PAT00092
Figure 112009059010727-PAT00093
Figure 112009059010727-PAT00094
Figure 112009059010727-PAT00095
Figure 112009059010727-PAT00094
Figure 112009059010727-PAT00095
 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 물질 표지용 화합물을 포함하는 물질로서, 상기 물질은 아민기, 수산화기 또는 티올기를 포함하며 생체 분자, 나노 입자 및 유기 화합물 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 물질 표지용 화합물 포함 물질.A substance comprising the substance labeling compound according to any one of claims 1 to 7, wherein the substance includes an amine group, a hydroxyl group or a thiol group and is selected from biological molecules, nanoparticles, and organic compounds. Substances containing compounds. 제8항에 있어서, 상기 생체 분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 물질 표지용 화합물 포함 물질.According to claim 8, wherein the biomolecule is a substance containing a compound for labeling substances, characterized in that selected from proteins, peptides, carbohydrates, sugars, fats, antibodies, proteoglycans, glycoproteins and siRNA. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 물질 표지용 화합물을 이용하여 물질을 표지하는 방법으로서, 상기 물질은 아민기, 수산화기 또는 티올기를 포함하며, 상기 물질은 생체 분자, 나노 입자 및 유기 화합물 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 물질 표지 방법.A method for labeling a substance using the compound for labeling substances according to any one of claims 1 to 7, wherein the substance includes an amine group, a hydroxyl group, or a thiol group, and the substance is one of biomolecules, nanoparticles, and organic compounds. Material labeling method characterized in that the selected. 제10항에 있어서, 상기 생체 분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 물질 표지 방법.The method of claim 10, wherein the biomolecule is selected from a protein, a peptide, a carbohydrate, a sugar, a fat, an antibody, a proteoglycan, a glycoprotein, and an siRNA. 제10항에 있어서, 상기 표지 방법은 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 물질 표지용 화합물 및 표지 대상 물질을 반응시키는 단계를 포함하고,The method of claim 10, wherein the labeling method comprises the step of reacting the compound for labeling the substance of any one of claims 1 to 7 and the labeling target material, 상기 반응은 pH 5-12 및 20-80℃의 조건에서 30분 내지 48시간 동안 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액, 트리스 완충액, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 아세토니트릴 및 물 중에서 선택된 용매 내에서 수행하는 것임을 특징으로 하는 물질 표지 방법.The reaction is carried out in a solvent selected from phosphate buffer, carbonate buffer, tris buffer, dimethylsulfoxide, dimethylformamide, acetonitrile and water for 30 minutes to 48 hours at conditions of pH 5-12 and 20-80 ° C. A material labeling method characterized by the above. 하기 화학식 4의 구조를 갖는 물질 표지용 화합물의 제조 중간체:Intermediate for preparing the compound for labeling substances having the structure of Formula 4 [화학식 4][Formula 4]
Figure 112009059010727-PAT00096
Figure 112009059010727-PAT00096
 상기 4개의 R1은 서로 동일하거나 상이하며 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고; 상기 2개의 R2는 서로 동일하거나 상이하며 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 설폰산기 또는 설폰산염기이며; 상기 R3은 카르복시기, 카르복시기 염기, 설폰산기 또는 설폰산 염기이고; 상기 B는(CH2)l, p-(C6H4) 또는 m-(C6H4)이며 여기서 l은 1 내지 5의 정수이며; 상기 R4는 카르복시기, 카르복시기 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 또는 수소이다.The four R 1 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; The two R 2 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a sulfonic acid group or a sulfonate group; R 3 is a carboxyl group, a carboxyl base, a sulfonic acid group or a sulfonic acid base; B is (CH 2 ) 1 , p- (C 6 H 4 ) or m- (C 6 H 4 ) wherein l is an integer from 1 to 5; R 4 is a carboxyl group, a carboxyl base, a sulfonic acid group, a sulfonic acid base or hydrogen. 제13항에 있어서, 상기 중간체는 하기 화학식 4A 또는 화학식 4B의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 물질 표지용 화합물의 제조 중간체.The intermediate of claim 13, wherein the intermediate has a structure of Formula 4A or Formula 4B. [화학식 4A][Formula 4A]
Figure 112009059010727-PAT00097
Figure 112009059010727-PAT00097
 [화학식 4B][Formula 4B]
Figure 112009059010727-PAT00098
Figure 112009059010727-PAT00098
 하기 화학식 6a 또는 화학식 6b의 구조를 갖는 물질 표지용 화합물의 제조 중간체:Intermediate for preparing a compound for labeling substances having a structure of Formula 6a or 6b: [화학식 6a][Formula 6a]
Figure 112009059010727-PAT00099
Figure 112009059010727-PAT00099
 [화학식 6b][Formula 6b]
Figure 112009059010727-PAT00100
Figure 112009059010727-PAT00100
 상기 4개의 R1은 서로 같거나 상이하며 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하며 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 설폰산기 또는 설폰산염기이며; 상기 R3은 카르복시기, 카르복시기 염기, 설폰산기 또는 설폰산 염기이다.The four R 1 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; The two R 2 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a sulfonic acid group or a sulfonate group; R 3 is a carboxyl group, a carboxyl base, a sulfonic acid group or a sulfonic acid base. 하기 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법으로서, 하기 화학식 6a 또는 화학식 6b의 화합물 또는 이들의 혼합물과 하기 화학식 7의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 1의 화합물 제조방법:A method of preparing a compound of Formula 1, comprising: reacting a compound of Formula 6a or 6b or a mixture thereof with a compound of Formula 7: [화학식 1][Formula 1]
Figure 112009059010727-PAT00101
Figure 112009059010727-PAT00101
 [화학식 6a][Formula 6a]
Figure 112009059010727-PAT00102
Figure 112009059010727-PAT00102
 [화학식 6b][Formula 6b]
Figure 112009059010727-PAT00103
Figure 112009059010727-PAT00103
 상기 4개의 R1은 서로 같거나 상이하며 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하며 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 설폰산기 또는 설폰산염기이며; 상기 R3은 카르복 시기, 카르복시기 염기, 설폰산기 또는 설폰산 염기이고; 상기 B는(CH2)l, p-(C6H4) 또는 m-(C6H4)이며 여기서 l은 1 내지 5의 정수이다.The four R 1 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; The two R 2 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a sulfonic acid group or a sulfonate group; R 3 is a carboxyl group, a carboxyl group, a sulfonic acid group or a sulfonic acid base; B is (CH 2 ) 1 , p- (C 6 H 4 ) or m- (C 6 H 4 ) wherein l is an integer from 1 to 5. 제16항에 있어서, 상기 반응은 휘니그 염기 존재 하에서 수행하는 것임을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물 제조 방법.The method of claim 16, wherein the reaction is performed in the presence of Hunig's base. 하기 화학식 4의 화합물을 제조하는 방법으로서, 하기 화학식 2의 화합물을 화학식 3 또는 화학식 5의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 화학식 4의 화합물 제조방법:A method of preparing a compound of Formula 4, comprising: reacting a compound of Formula 2 with a compound of Formula 3 or Formula 5: [화학식 4][Formula 4]
Figure 112009059010727-PAT00104
Figure 112009059010727-PAT00104
 [화학식 2][Formula 2]
Figure 112009059010727-PAT00105
Figure 112009059010727-PAT00105
 [화학식 3](3)
Figure 112009059010727-PAT00106
Figure 112009059010727-PAT00106
 [화학식 5][Chemical Formula 5]
Figure 112009059010727-PAT00107
Figure 112009059010727-PAT00107
 상기 4개의 R1은 서로 동일하거나 상이하며 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고; 상기 2개의 R2는 서로 동일하거나 상이하며 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 설폰산기 또는 설폰산염기이며; 상기 R3은 카르복시기, 카르복시기 염기, 설폰산기 또는 설폰산 염기이고; 상기 B는(CH2)l, p-(C6H4) 또는 m-(C6H4)이며 여기서 l은 1 내지 5의 정수이며; 상기 R4는 카르복시기, 카르복시기 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 또는 수소이다.The four R 1 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; The two R 2 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a sulfonic acid group or a sulfonate group; R 3 is a carboxyl group, a carboxyl base, a sulfonic acid group or a sulfonic acid base; B is (CH 2 ) 1 , p- (C 6 H 4 ) or m- (C 6 H 4 ) wherein l is an integer from 1 to 5; R 4 is a carboxyl group, a carboxyl base, a sulfonic acid group, a sulfonic acid base or hydrogen. 하기 화학식 6a 또는 화학식 6b의 화합물을 제조하는 방법으로서, 하기 화학식 4의 화합물을 1,1'-카르보닐디이미다졸 또는 N,N-디숙신이미딜 카보네이트와 반 응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 화학식 6a 또는 화학식 6b의 제조방법:A process for preparing a compound of Formula 6a or 6b, comprising reacting a compound of Formula 4 with 1,1′-carbonyldiimidazole or N, N-disuccinimidyl carbonate Method for producing the formula (6a) or formula (6b): [화학식 6a][Formula 6a]
Figure 112009059010727-PAT00108
Figure 112009059010727-PAT00108
 [화학식 6b][Formula 6b]
Figure 112009059010727-PAT00109
Figure 112009059010727-PAT00109
 [화학식 4][Formula 4]
Figure 112009059010727-PAT00110
Figure 112009059010727-PAT00110
 상기 4개의 R1은 서로 같거나 상이하며 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하며 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 설폰산기 또는 설폰산염기이며; 상기 R3은 카르복시기, 카르복시기 염기, 설폰산기 또는 설폰산 염기이고; 상기 B는(CH2)l, p-(C6H4) 또는 m-(C6H4)이며 여기서 l은 1 내지 5의 정수이다.The four R 1 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; The two R 2 are the same as or different from each other, and are each independently hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a sulfonic acid group or a sulfonate group; R 3 is a carboxyl group, a carboxyl base, a sulfonic acid group or a sulfonic acid base; B is (CH 2 ) 1 , p- (C 6 H 4 ) or m- (C 6 H 4 ) wherein l is an integer from 1 to 5.
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