KR101953819B1 - Novel cyanine compound for labeling biomolecule and preparation method thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생체 분자 표지를 위한 다음 화학식 1로 표시되는 신규 시아닌 화합물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
[화학식 1]

Figure 112017128236318-pat00079

식 중에서, R1, R2, R3, R4, B, m 및 n은 각각 명세서에 정의한 바와 같다.The present invention relates to a novel cyanine compound represented by the following formula (1) for biomolecule labeling and a method for producing the same.
[Chemical Formula 1]
Figure 112017128236318-pat00079

R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , B, m and n are each as defined in the specification.

Figure 112017128236318-pat00080
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Description

생체 분자 표지를 위한 신규 시아닌 화합물 및 그 제조방법{NOVEL CYANINE COMPOUND FOR LABELING BIOMOLECULE AND PREPARATION METHOD THEREOF}TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a novel cyanine compound for biomolecule labeling and a method for producing the same. BACKGROUND ART < RTI ID = 0.0 >

본 발명은 다양한 생체분자에 형광 표지가 가능한 신규 시아닌 화합물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel cyanine compound capable of fluorescent labeling various biomolecules and a method for producing the same.

염료의 반응기와 결합할 수 있는 단백질 구조 내의 치환기는 기본 구조가 되는 아미노산 (amino acid)의 구조로부터 유추할 수 있다. 그 예로는 아미노산 잔기를 들 수 있는데, 구체적으로는 라이신 (lysine)의 아미노기 (-CH2CH2CH2CH2NH2), 시스테인 (cystein)의 티올기 (-CH2SH), 히스티딘 (histidine)의 이미다졸 아민기 (

Figure 112017128236318-pat00001
), 트레오닌 (threonine)의 2차 지방족 히드록시기 (-CH2CH(OH)CH3), 세린 (serine)의 1차 지방족 히드록시기 (-CH2OH), 티로신 (tyrosine)의 페놀 히드록시기 (
Figure 112017128236318-pat00002
) 등이 있다. 아미노산의 N-말단 아미노기 (-COCHRNH2)와의 결합도 가능하다. 또한, 염료의 반응기는 당 (sugar), 당단백 (glycoprotein), 항체 (antibody) 등의 생체 분자와 결합할 수도 있다.Substituents within the protein structure that can bind to the dye's reactors can be deduced from the structure of the amino acid that is the basic structure. Examples thereof include amino acid residues, specifically, amino group (-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ) of lysine, thiol group (-CH 2 SH) of cystein, histidine ) Imidazole amine group (
Figure 112017128236318-pat00001
), A secondary aliphatic hydroxyl group (-CH 2 CH (OH) CH 3 ) of threonine, a primary aliphatic hydroxyl group (-CH 2 OH) of serine, a phenol hydroxyl group of tyrosine
Figure 112017128236318-pat00002
). It is also possible to bond to the N-terminal amino group (-COCHRNH 2 ) of the amino acid. Also, the reactor of the dye may be combined with a biomolecule such as sugar, glycoprotein, or antibody.

현재까지 알려진 생체 분자 표지용 염료나 물질에 사용되는 반응기들은 생체 분자와 결합되는 치환기에 따라 분류할 수 있고, 각각의 관용명으로도 통용된다.Reactors used in biomolecule marking dyes and substances known so far can be categorized according to substituents bonded to biomolecules, and they are also commonly used for their common names.

단백질 분자의 아민기와 결합을 목적으로 하는 반응기로서 가장 많이 이용되는 것은 숙신이미딜 에스터와 이소티오시아네이트이고, 단백질 분자의 티올기와 결합을 목적으로 하는 반응기로서 가장 많이 이용되는 것은 말레이미드이며, 단백질 분자의 히드록시기와 결합을 목적으로 하는 반응기로는 아래와 같은 것들이 있다.The most commonly used reactors for binding with amine groups of protein molecules are succinimidyl ester and isothiocyanate. The most widely used reactors for binding with thiol groups of protein molecules are maleimide, and proteins Reactors for binding with the hydroxyl group of the molecule include the following.

Figure 112017128236318-pat00003
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위와 같은 반응기 이외에도 많은 연구자들과 기업에서는 성능이 더 우수한 반응기 중간체를 설계하고 있다. 대부분 생체 분자와의 반응 시간이 빠르고 결합 성능이 우수하지만 수용액 상태에서 안정하지 않고, 열에 취약하거나 반응 후에 이탈기가 떨어져 나가면서 부산물이 발생하는 것이 일반적이다.In addition to these reactors, many researchers and companies are designing reactor intermediates with better performance. In general, it is common that reaction time with biomolecules is fast and bonding performance is excellent, but it is not stable in an aqueous solution state, and is susceptible to heat or byproducts are generated while leaving a leaving group after the reaction.

수용성 형광 염료는 최근에는 바이오 분야에서의 응용이 활발하게 이루어지고 있다. 수용성 형광 염료를 생체 분자에 도입하기 위해서는 수용액이나 친수성 조건에서 광표백 (photobleaching) 및 소광 (quenching) 현상이 적고, 다량의 빛을 흡수할 수 있도록 몰흡광계수 (molecular extinction coefficient)가 커야하며, 생체 분자 자체의 형광 범위와 멀리 떨어진 500 nm 이상의 가시광선 영역이나 근적외선 영역에 있어야 하고, 다양한 pH 조건에서 안정하여야 한다. 그러나, 이와 같은 여러 가지 요구 조건들로 인하여 생체 분자 표지용으로 사용 가능한 염료의 구조는 한정되어 있다. In recent years, water-soluble fluorescent dyes have been actively applied in the field of biology. In order to introduce a water-soluble fluorescent dye into a biomolecule, there is little photobleaching and quenching under an aqueous solution or a hydrophilic condition, a molecular extinction coefficient must be large to absorb a large amount of light, It should be in the visible light range or the near infrared range of 500 nm or more away from its own fluorescence range and be stable at various pH conditions. However, due to these various requirements, the structure of dyes usable for biomolecule labeling is limited.

모든 염료가 형광을 나타내는 것은 아니다. 다양한 분야의 연구자들이 형광을 나타낼 수 있는 발색단 (chromophore)을 가진 염료를 개발하였다. 지금까지 알려진 형광 물질 (fluorophore)의 대표적인 예로는 안트라닐레이트 (anthranilate), 1-알킬틱 이소인돌 (1-alkylthic isoindoles), 피롤리논 (pyrrolinones), 비메인 (bimanes), 벤즈옥사졸 (benzoxazole), 벤즈이미다졸 (benzimidazole), 벤조퓨란 (benzofurazan), 나프탈렌 (naphthalenes), 쿠마린 (coumarins), 스틸벤 (stilbenes), 카바졸 (carbazoles), 페난트리딘 (phenanthridine), 안트라센 (anthracenes), 아크리딘 (acridines), 플로세인 (fluoresceins), 에오신 (eosins), 로다민 (rhodamines), 피렌 (pyrenes), 크리센 (chrysenes) 등을 들 수 있고, 이들과 유사한 구조의 유도체들도 연구되고 있다. 이러한 형광 물질들은 앞에서 기술한 다양한 생체 분자 결합용 반응기에 도입되어 다양한 상품으로 시판되고 있다.Not all dyes exhibit fluorescence. Researchers in various fields have developed dyes with chromophore that can display fluorescence. Representative examples of fluorophore known so far include anthranilate, 1-alkylthic isoindoles, pyrrolinones, bimanes, benzoxazole, ), Benzimidazole, benzofurazan, naphthalenes, coumarins, stilbenes, carbazoles, phenanthridine, anthracenes, Acridines, fluoresceins, eosins, rhodamines, pyrenes, chrysenes, and derivatives of these structures are also being studied . These fluorescent materials have been introduced into various biomolecule-binding reactors as described above and are commercially available as various products.

상기와 같은 다수의 형광 염료 중에서 바이오 분야에서 이용 가능한 형광을 나타내도록 하기 위해서는 대부분의 생체 분자들이 존재하는 매질, 즉, 수용액 내에 존재할 때 강한 형광을 내는 것이 중요하다. 이러한 목적으로 가장 많이 사용되는 형광 염료로는 잔텐 (xanthane) 계열의 플로세인 및 로다민과, 폴리메틴 (polymethine) 계열의 시아닌을 들 수 있다. Among the above-mentioned fluorescent dyes, it is important to emit strong fluorescence when present in a medium in which most biomolecules exist, that is, in an aqueous solution, in order to exhibit fluorescence usable in the biotechnology field. Fluorescent dyes most commonly used for this purpose include xanthane family florans and rhodamine and polymethine family cyanines.

시아닌 염료를 생체 분자의 표지용으로 처음 도입한 것은 1980년대 말 카네기 멜론 (Carnegie-Mellon) 대학의 와고너 (Waggoner) 교수팀으로, 섬유 염색이나 광 기록 매체에 주로 사용되던 시아닌계 염료에 단백질과 결합할 수 있는 반응기를 도입하여 단백질에 결합시키는 경우에 형광이 발현될 수 있음을 보였고, 그 이후에도 선행기술문헌과 같은 몇 편의 논문을 발표하였다.The first introduction of cyanine dyes as biomolecule markers was in the late 1980s at the University of Carnegie-Mellon, Prof. Waggoner's team, where cyanine dyes, primarily used for fiber dyeing and optical recording media, It has been shown that fluorescence can be expressed when a conjugated reactor is introduced and bound to a protein. After that, several papers such as the prior art literature have been published thereafter.

이후 여러 연구자들의 의하여 실험자의 목적에 따라 단백질의 친핵체, 즉, 아민기, 티올기, 히드록시기, 그리고 친전자체인 알데하이드기, 케톤기, 카르복실산기 등에 결합할 수 있는 반응기를 도입한 생체 분자 표지용 색소 및 형광 염료가 소개되었다. Several researchers have developed a biomolecule labeling system that introduces a nucleophile of a protein, that is, a reactive group capable of binding to an amino group, a thiol group, a hydroxyl group, and an electrophilic aldehyde group, a ketone group, Dyes and fluorescent dyes were introduced.

시아닌 염료는 일반적으로 광학 및 pH 안정성이 탁월하고, 좁은 흡수 (absorption) 및 발광 (emission) 파장 범위를 가지며, 500 내지 800 nm의 형광 영역을 갖기 때문에 생체 분자의 자체 형광 영역과 중첩되지 않아 분석이 용이하며, 용매 및 용해도 특성에 따라 다소 차이는 있지만, 높은 몰흡광계수를 나타내는 등 많은 장점이 있다. 하기 화학식은 문헌에 나와 있는 시아닌 염료의 일반 구조와, 유도체로 알려져 있는 헤테로 화합물의 기본 구조이다. Cyanine dyes generally have excellent optical and pH stability, have narrow absorption and emission wavelength ranges, and have a fluorescent region of 500 to 800 nm, so that they do not overlap with the fluorescent region of the biomolecule itself, And there are many advantages such as a high molar extinction coefficient although there is a slight difference depending on the solvent and solubility characteristics. The following formulas are the general structure of the cyanine dyes described in the literature and the basic structure of a hetero compound known as a derivative.

Figure 112017128236318-pat00004
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시아닌 염료로서 상업적으로 가장 많이 활용되고 있는 것은 헤테로 고리로서 인돌 (indole) 구조를 포함하고, 반응기로서 숙신이미딜 에스터기를 갖는 것이다. 하기 화학식은 상품화되어 있는 대표적인 구조로서, 지이 헬스케어 (GE Healthcare)에서 Cy3, Cy5 및 Cy7이라는 상품명으로 시판되는 것들이다.Commercially most widely used as a cyanine dye is one containing an indole structure as a heterocycle and having a succinimidyl ester group as a reactor. Representative structures commercially available are those marketed under the trade names Cy3, Cy5 and Cy7 by GE Healthcare.

Figure 112017128236318-pat00005
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다양한 색상을 요구하는 섬유용 염료와는 달리, 생체 분자 표지용 형광 염료는 형광을 나타내는 파장 범위가 넓다고 하여 반드시 좋다고 할 수는 없는데, 이는 형광을 이용하거나 형광을 측정하는 장비의 파장이 한정되어 있기 때문이다. 신규의 형광 분석 방법 또는 기기가 개발되거나, 광학 장비가 개선되거나, 또는 그 성능이 염료에 맞도록 뒷받침되지 않으면 흡수 파장이나 발광 파장 범위를 바꾸는 색원체 변경이나 구조 변경은 생체 표지용 염료 분야에서는 상업적인 관점에서 큰 의미가 없다.Unlike dyes for fibers that require various colors, fluorescent dyes for biomolecule labeling are not necessarily good because they have a wide wavelength range for fluorescence. This is because the wavelength of a device for measuring fluorescence or using fluorescence is limited Because. Unless new fluorescence analysis methods or equipment are developed, optical equipment is improved, or its performance is not backed by dyes, color change or structural change, which changes the absorption wavelength or emission wavelength range, There is no significant meaning from the point of view.

다른 색원체를 가진 염료들도 마찬가지이지만, 시아닌 염료에서도 반응기의 도입 여부에 무관하게 색원체가 폴리메틴인 것은 변함이 없으므로, 형광 특성이 거의 동일하여 흡수 및 발광 파장이 거의 변하지 않는다고 알려져 있다. It is also known that the absorption and emission wavelengths of the cyanine dyes are almost unchanged because the fluorescence characteristics are almost the same regardless of whether the reactor is introduced or not, as the coloring material is polymethine.

생체 분자의 표지에 사용되는 숙신이미딜 에스터를 가진 시아닌 표지 염료는 카보네이트 (carbonate) 완충액(buffer) 또는 포스페이트 (phosphate) 완충액 상에서 염색이 이루어진다. 이때 완충액의 농도는 주로 0.1M이고, 반응 온도는 다양하지만 상온의 경우가 일반적이다. Cyanine labeled dyes with succinimidyl esters used for biomolecular labeling are stained on a carbonate buffer or phosphate buffer. At this time, the concentration of the buffer solution is usually 0.1M, and the reaction temperature is generally varied at room temperature.

염료를 N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 또는 N,N-디메틸설폭사이드 (DMSO)에 용해시켜 사용하는데, 염료 1 mg을 용매 100 μl에 용해시킨 후 분취하여 사용하는 경우가 많다. 염료의 사용량은 일반적으로 염색 대상이 되는 생체 분자에 대하여 당량비로 5 내지 100배 정도의 과량으로 사용되는데, 이는 단백질 분자는 1 당량이라도 주로 반응의 목표가 되는 아미노기, 히드록시기 또는 티올기의 개수가 훨씬 많기 때문이다. 복잡한 단백질 구조 내에 침투하여 반응하려면 상대적으로 더 높은 수용액 안정성이 요구된다. 그러나, 숙신이미딜 에스터의 경우는 오랜 반응 시간 동안 안정한 상태로 유지할 수 없는 것이 단점이다.Dye is used by dissolving it in N, N-dimethylformamide (DMF) or N, N-dimethylsulfoxide (DMSO), and it is often used after dissolving 1 mg of dye in 100 μl of solvent. The amount of dye to be used is usually in excess of about 5 to 100 times as much as the biomolecule to be dyed. Even if the protein molecule has one equivalent, the number of amino groups, hydroxyl groups or thiol groups, Because. Relatively higher aqueous solution stability is required for penetration into complex protein structures. However, the disadvantage of succinimidyl esters is that they can not be maintained in a stable state over a long reaction time.

[문헌 1] Ernst, L. A., Gupta, R. K., Mujumdar, R. B., and Waggoner, A. S. (1989) Cyanine Dye Labeling Reagents for Sulfhydryl groups. Cytometry 10, 3-10.Ernst, L. A., Gupta, R. K., Mujumdar, R. B., and Waggoner, A. S. (1989) Cyanine Dye Labeling Reagents for Sulfhydryl groups. Cytometry 10, 3-10. [문헌 2] Mujumdar, R. B., Ernst, L. A., Mujumdar, S. R., and Waggoner, A. S. (1989) Cyanine Dye Labeling Reagents containing Isothiocyanate groups. Cytometry 10, 11-19.[2] Mujumdar, R. B., Ernst, L. A., Mujumdar, S. R., and Waggoner, A. S. (1989) Cyanine Dye Labeling Reagents containing isothiocyanate groups. Cytometry 10, 11-19. [문헌 3] Southwick, P. L., Ernst, L. A., Tauriello, E. W., Stephen, R. P., Mujumdar, R. B., Mujumdar, S. R., Clever, H. A., and Waggoner, A. S. (1990) Cyanine Dye Labeling reagents - Carboxymethylindocyanine Succinimidyl Esters. Cytometry 11, 418-430.[3] Southwick, P. L., Ernst, L. A., Tauriello, E. W., Stephen, R. P., Mujumdar, R. B., Mujumdar, S. R., Clever, H. A. and Waggoner, A. S. (1990) Cyanine Dye Labeling reagents - Carboxymethylindocyanine Succinimidyl Esters. Cytometry 11, 418-430. [문헌 4] Mujumdar, R. B., Ernst, L. A., Mujumdar, S. R., Lewis, C. J., and Waggoner, A. S. (1993) Cyanine Dye Labeling Reagents: Sulfoindocyanine Succinimidyl Esters. Bioconjugate Chem. 4, 105-111.[4] Mujumdar, R. B., Ernst, L. A., Mujumdar, S. R., Lewis, C. J., and Waggoner, A. S. (1993) Cyanine Dye Labeling Reagents: Sulfoindocyanine Succinimidyl Esters. Bioconjugate Chem. 4, 105-111. [문헌 5] Mujumdar, S. R., Mujumdar, R. B., Grant, C. M., and Waggoner, A. S. (1996) Cyanine-Labeling Reagents: Sulfobenzindocyanine Succinimidyl Esters. Bioconjugate Chem. 7, 356-36.[5] Mujumdar, S. R., Mujumdar, R. B., Grant, C. M., and Waggoner, A. S. (1996) Cyanine-Labeling Reagents: Sulfobenzindocyanine Succinimidyl Esters. Bioconjugate Chem. 7, 356-36.

본 발명의 목적은 프로테오믹스 (proteomics), 광학 분자 영상 등의 분야에서 단백질, 지방, 탄수화물 등의 생체 분자의 동정을 관찰하기 위하여 광범위하게 사용될 수 있는 신규 시아닌 화합물 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a novel cyanine compound which can be widely used for observing the identification of biomolecules such as proteins, fats and carbohydrates in the fields of proteomics and optical molecular imaging, and a method for producing the same.

상기와 같은 본 발명의 목적은 다음 화학식 1로 표시되는 신규 시아닌 화합물 및 그 제조 방법을 제공하는 것에 의하여 달성된다. The above object of the present invention is achieved by providing a novel cyanine compound represented by the following formula 1 and a process for producing the same.

Figure 112017128236318-pat00006
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R1, R1'은 각각 독립적으로 수소, 설폰산기 또는 설폰산염기이고; R2, R2', R3 및 R3'은 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고; R4는 수소, 탄소 수 1 내지 6개의 알킬기, 카르복시기, 설폰산기, 설폰산염기, -CONH(CH2)LSO2CH=CH2, -CONH-para-(C6H4)SO2CH=CH2 또는 -CONH-meta-(C6H4)SO2CH=CH2이고, R 1 and R 1 'are each independently hydrogen, a sulfonic acid group or a sulfonic acid group; R 2 , R 2 ', R 3 and R 3 ' are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; R 4 is hydrogen, and the carbon number of 1 to 6 alkyl groups, carboxyl group, sulfonic acid group, a sulfonic acid base, -CONH (CH 2) L SO 2 CH = CH 2, -CONH- para - (C 6 H 4) SO 2 CH = CH 2 or -CONH- meta - (C 6 H 4 ) SO 2 CH = CH 2 ,

B는 (CH2)l, para-(C6H4) 또는 meta-(C6H4)이고; m은 1 내지 5의 정수이고 m'은 5 내지 10의 정수, 바람직하게는 6-10의 정수이며; L, l 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이다.
B is (CH 2) l, para - (C 6 H 4) or meta - (C 6 H 4) and; m is an integer from 1 to 5 and m 'is an integer from 5 to 10, preferably an integer from 6 to 10; L, l and n are each independently an integer of 1 to 5;

또한, 본 발명에서는 상기 화학식 1의 화합물의 제조 방법 및 이를 이용한 다양한 용매, 예를 들면 완충액 (buffer solution) 내에서 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 상기 화학식 1의 화합물로 표지하는 방법 (binding protocol)이 제공된다.The present invention also relates to a method for producing the compound of Formula 1 and a method of labeling a biomolecule, a nanoparticle, or an organic compound with the compound of Formula 1 in various solvents such as a buffer solution Is provided.

본 발명품은 생체분자 연구자들이 표지 실험 수행 시 보다 안정적으로 염료를 다룰 수 있도록 하며 특히 생체분자와 염료의 결합 후 부산물이 발생하지 않아 부수적인 정제 작업을 피할 수 있게 된다. 또한 높은 안정성으로 장시간 보관이 용이할 뿐만 아니라 고분자 생체 분자의 장시간 염색이나 보다 복잡한 생체 분자를 다루는 사용자들에게도 보다 효과적으로 활용될 수 있다.The present invention enables biomolecular researchers to deal with dyes more stably when performing labeling experiments, and in particular, byproducts do not occur after binding of biomolecules and dyes, thereby avoiding secondary purification operations. In addition to being easy to store for a long time with high stability, it can be used more effectively for users who handle long time dyeing of polymer biomolecules or more complex biomolecules.

도 1은 실시에 에서 표지시킨 단백질들을 겔 전기영동으로 전개한 것의 육안으로 관찰되는 사진이고, 도 2는 형광사진을 나타낸 것이다.Fig. 1 is a photograph of a protein developed by gel electrophoresis developed by visual inspection, and Fig. 2 shows a fluorescence photograph.

단백질 염색에서 가장 보편적으로 사용되는 염료의 반응기는 아미노산의 아미노기에 결합할 수 있는 숙신이미딜 에스터기이다. 그 예로서 지이 헬스케어의 미국 특허 제5268486호, 제6043025호, 제6127134호와, 국제 공개 공보 제9633406호에서는 숙신이미딜 에스터를 다양한 시아닌 염료 구조에 도입하고, 항체, 펩타이드 등 결합 가능한 생체 분자에 대한 염색 방법도 예시하고 있다. 그러나, 이 숙신이미딜 에스터는 수용액 중에서 안정하지 않고, 염색 반응 시에 필수적으로 N-히드록시 숙신이미드가 부산물로서 생성된다.The most commonly used dye reactors in protein staining are succinimidyl ester groups that can bind to the amino groups of amino acids. For example, in U.S. Patent Nos. 5268486, 6043025, 6127134 and International Publication No. 9633406 of Geheim Healthcare, succinimidyl esters are introduced into various cyanine dye structures and biomolecules such as antibodies, peptides, For example. However, this succinimidyl ester is not stable in an aqueous solution, and N-hydroxysuccinimide is essentially produced as a by-product in the dyeing reaction.

이에 따라, 본 발명에서는 생체 분자와 염색 후에 부산물이 생성되지 않는 제품을 개발하고자 하였다. 또한, 종래에 숙신이미딜 에스터를 이용하는 생체 표지 방법이 잘 알려져 있는 점을 고려하여, 종래와 같은 방법으로 쉽게 단백질에 표지될 수 있는 염색 방법을 개발하여, 더욱 좋은 성능을 낼 수 있도록 하였으며, 다양한 완충액에서 염색이 가능한 방법을 제시하였다.Accordingly, the present invention aims to develop a biomolecule and a product which does not produce by-products after dyeing. Considering that a biomarking method using a succinimidyl ester is well known, a dyeing method which can be easily labeled with a protein by a conventional method has been developed and a better performance has been achieved. A method capable of dyeing in a buffer solution was proposed.

본 발명에 따른 화학식 1의 시아닌 화합물에는 비닐 설폰기가 도입되어 있는 것을 특징으로 한다. 상기 비닐 설폰기의 비닐기는 생체 분자의 친핵체와 아래와 같은 반응으로 결합하므로, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 생체 분자와의 반응 후에 부산물을 생성시키지 않는다. The cyanine compound of formula (1) according to the present invention is characterized in that a vinyl sulfone group is introduced. Since the vinyl group of the vinyl sulfonic group is bonded to the nucleophile of the biomolecule in the following reaction, the compound of the formula 1 according to the present invention does not produce a by-product after reaction with the biomolecule.

Figure 112017128236318-pat00007
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본 발명에 따른 시아닌 염료 화합물은 대부분의 생체 분자에 적용 시의 매질인 물을 대상으로 하고 열에 대해서도 안정하도록 설계되었다.The cyanine dye compound according to the present invention is designed to be stable against heat, which is a medium for application to most biomolecules.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 신규 시아닌 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a process for preparing a novel cyanine compound represented by the above formula (1).

이하에서 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물의 제조 방법을 설명한다. Hereinafter, a method for preparing the compound of Formula 1 according to the present invention will be described.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물의 제조 방법에서는 다음 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물을 반응식 1a에 예시된 바와 같이 반응시켜 화학식 4a의 화합물을 얻고, 이를 출발 물질로서 사용한다.In the process for preparing the compound of formula (1) according to the present invention, the compound of formula (2) and the compound of formula (3) are reacted as illustrated in Scheme Ia to obtain the compound of formula (4a).

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Figure 112017128236318-pat00008

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Figure 112017128236318-pat00009

[화학식 4a][Chemical Formula 4a]

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Figure 112017128236318-pat00010

[반응식 1a][Reaction Scheme 1a]

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Figure 112017128236318-pat00011

상기 화학식 2 내지 4 및 반응식 1a에 있어서, R1, R2 및 R3은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같다.In Formulas 2 to 4 and Reaction Scheme 1a, R 1 , R 2 and R 3 are as defined for Formula 1, respectively.

상기 화학식 4a의 R1이 설폰산기인 경우, 화학식 4a의 화합물을 반응식 1b에 예시된 바와 같이 일반식 MOH로 표시되는 무기 염기, 바람직하게는 수산화칼륨 또는 수산화나트륨, 가장 바람직하게는 수산화칼륨으로 처리하여 R1이 설폰산염기인 화학식 4b의 화합물을 얻고, 이를 출발 물질로서 사용할 수도 있다. When R 1 in formula 4a is a sulfonic acid group, the compound of formula 4a is treated with an inorganic base represented by the formula MOH, preferably potassium hydroxide or sodium hydroxide, most preferably potassium hydroxide, as illustrated in Scheme 1b To obtain a compound of formula (4b) wherein R < 1 > is a sulfonate group, which may be used as a starting material.

[화학식 4b](4b)

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Figure 112017128236318-pat00012

[반응식 1b][Reaction Scheme 1b]

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Figure 112017128236318-pat00013

반응식 1b에 있어서, M은 칼륨 또는 나트륨이고, R2 및 R3은 각각 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같은 것이며, 화학식 4a의 R1은 설폰산기이고, 화학식 4b의 R1은 설폰산염기이다.In Scheme 1b, M is potassium or sodium, R 2 and R 3 are each as defined for Formula 1, R 1 in Formula 4a is a sulfonic acid group, and R 1 in Formula 4b is a sulfonic acid base.

본 발명에 따른 상기 화학식 1 화합물을 제조함에 있어서는 먼저 상기 화학식 4a 또는 4b의 화합물을 반응식 2 및 3에 예시된 바와 같이 다음 화학식 5 및 7의 화합물과 각각 반응시켜, 화학식 6a 및 6b의 화합물을 얻는다. In preparing the compound of Formula 1 according to the present invention, the compound of Formula 4a or 4b is first reacted with the compound of Formula 5 or 7 as illustrated in Schemes 2 and 3, respectively, to obtain the compound of Formula 6a or 6b .

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Figure 112017128236318-pat00014

[화학식 6a][Chemical Formula 6a]

Figure 112017128236318-pat00015
Figure 112017128236318-pat00015

[화학식 6b][Formula 6b]

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[반응식 2][Reaction Scheme 2]

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Figure 112017128236318-pat00018

[반응식 3][Reaction Scheme 3]

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Figure 112017128236318-pat00019

상기 화학식 5 내지 7과, 반응식 2 및 3에 있어서, R1, R2, R3, R4 및 m은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같고, X는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성된 군에서 선택되는 할로겐 원자이다.Wherein R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and m are the same as defined in Formula 1, and X is a group consisting of fluorine, chlorine, bromine, and iodine, ≪ / RTI >

상기 반응식 2는 R4가 수소 또는 탄소 수 1 내지 6개의 알킬기인 화학식 6a의 화합물을 제조하는 방법을, 반응식 3은 R4가 카르복시기인 화학식 6b의 화합물을 제조하는 방법을 각각 예시한 것이다. Scheme 2 illustrates a method of preparing a compound of formula (6a) wherein R 4 is hydrogen or an alkyl group of 1 to 6 carbon atoms, and Scheme 3 illustrates a method of preparing a compound of formula (6b) wherein R 4 is a carboxyl group.

다음으로, 상기 화학식 6a 또는 6b의 화합물을 반응식 4에 예시된 바와 같이 다음 화학식 8의 화합물과 반응시켜 화학식 9의 화합물을 얻는다. Next, the compound of formula (6a) or (6b) is reacted with a compound of formula (8) as illustrated in Scheme 4 to obtain the compound of formula (9).

Figure 112017128236318-pat00020
Figure 112017128236318-pat00020

Figure 112017128236318-pat00021
Figure 112017128236318-pat00021

[반응식 4][Reaction Scheme 4]

Figure 112017128236318-pat00022
Figure 112017128236318-pat00022

상기 화학식 8 및 9와, 반응식 4에 있어서, R1, R2, R3, R4, m 및 n은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같고, A는 수소 또는 아세틸기이다.Wherein R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , m and n are as defined for Formula 1, and A is hydrogen or an acetyl group.

상기 화학식 8의 화합물은 n이 1인 경우 N,N-디페닐 포름아미딘 (DPF)이고, n이 2인 경우 말론알데히드 디아닐 히드로클로라이드 (MDH)이고, n이 3인 경우 글루타콘알데히드 디아닐 히드로클로라이드 (GDH)이다. The compound of Formula 8 is N, N-diphenylformamidine (DPF) when n is 1, malonaldaldehyde dihydrochloride (MDH) when n is 2, and glutaconalddehyde Dianil hydrochloride (GDH).

다음으로, 상기 화학식 9의 화합물을 반응식 5에 예시된 바와 같이 상기 화학식 6b의 화합물과 반응시켜 화학식 10으로 표시되는 화합물을 얻는다. Next, the compound of formula (9) is reacted with the compound of formula (6b) as illustrated in Scheme 5 to obtain the compound of formula (10).

Figure 112017128236318-pat00023
Figure 112017128236318-pat00023

[반응식 5][Reaction Scheme 5]

Figure 112017128236318-pat00024
Figure 112017128236318-pat00024

상기 화학식 10 및 반응식 5에 있어서, R1, R2, R3, R4, m 및 n은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같다. 다만, 상기 2개의 R1은 서로 동일하거나 상이할 수 있고, 상기 2개의 R2 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있으며, 마찬가지로 상기 2개의 R3 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 상기 2개의 m 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있다.R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , m and n are as defined for Formula 1, respectively. The two R 1 s may be the same or different and the two R 2 s may be the same or different and the two R 3 s may also be the same or different. The two m may also be the same or different.

다음으로, 상기 화학식 10의 화합물을 반응식 6에 예시된 바와 같이 1,1'-카르보닐디이미다졸 (CDI) 또는 N,N-디숙신이미딜 카보네이트 (DSC)와 반응시켜 화학식 11a 또는 11b의 화합물을 얻는다. Next, the compound of formula 10 is reacted with 1,1'-carbonyldiimidazole (CDI) or N, N-disuccinimidyl carbonate (DSC) as illustrated in Scheme 6 to give the compound of formula 11a or 11b Compound.

[화학식 11a][Chemical Formula 11a]

Figure 112017128236318-pat00025
Figure 112017128236318-pat00025

[화학식 11b][Formula 11b]

Figure 112017128236318-pat00026
Figure 112017128236318-pat00026

상기 화학식 11a 및 11b에 있어서, R1, R2, R3, R4, m 및 n은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같다. 다만, 상기 2개의 R1은 서로 동일하거나 상이할 수 있고, 상기 2개의 R2 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있으며, 마찬가지로 상기 2개의 R3 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 상기 2개의 m 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있다.R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , m and n are as defined in the above formula (1). The two R 1 s may be the same or different and the two R 2 s may be the same or different and the two R 3 s may also be the same or different. The two m may also be the same or different.

[반응식 6][Reaction Scheme 6]

Figure 112017128236318-pat00027
Figure 112017128236318-pat00027

상기 반응식 6에 있어서, R1, R2, R3, R4, m 및 n은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같고, R6은 화학식 11a에서는 이미다졸기이고, 화학식 11b에서는 숙신이미딜옥시기이다. 다만, 상기 2개의 R1은 서로 동일하거나 상이할 수 있고, 상기 2개의 R2 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있으며, 마찬가지로 상기 2개의 R3 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 상기 2개의 m 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있다.In Scheme 6, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , m and n are as defined for Formula 1, R 6 is an imidazole group in Formula 11a, and succinimidyloxy group to be. The two R 1 s may be the same or different and the two R 2 s may be the same or different and the two R 3 s may also be the same or different. The two m may also be the same or different.

다음으로, 상기 화학식 11a 또는 11b의 화합물을 반응식 7에 예시된 바와 같이 휘니그 염기 (Hunig's base) 존재 하에서 하기 화학식 12로 표시되는 화합물과 반응시켜 화학식 1의 화합물을 얻는다. Next, the compound of formula (11a) or (11b) is reacted with a compound of formula (12) in the presence of Hunig's base as illustrated in Scheme 7 to obtain the compound of formula (1).

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Figure 112017128236318-pat00028

[반응식 7][Reaction Scheme 7]

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Figure 112017128236318-pat00029

상기 화학식 12 및 반응식 7에 있어서, R1, R2, R3, R4, m 및 n은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같고, R5는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성된 군에서 선택되는 할로겐 원자, 또는 설파토기 (-OSO3H)이고, B는 (CH2)l, p-(C6H4) 또는 m-(C6H4)이고, l은 1 내지 5의 정수이다. 다만, 상기 2개의 R1은 서로 동일하거나 상이할 수 있고, 상기 2개의 R2 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있으며, 마찬가지로 상기 2개의 R3 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 상기 2개의 m 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
Wherein R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , m and n are as defined for the formula 1 and R 5 is selected from the group consisting of fluorine, chlorine, bromine and iodine. a halogen atom, or sulfamic earthenware (-OSO 3 H) that, B is (CH 2) l, p - (C 6 H 4) or m - (C 6 H 4) and, l is an integer from 1 to 5 . The two R 1 s may be the same or different and the two R 2 s may be the same or different and the two R 3 s may also be the same or different. The two m may also be the same or different.

또한 본 발명은 상기 화학식 1의 신규 시아닌 화합물을 이용하여 아민기, 수산화기 또는 티올기를 포함하는 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 표지하는 방법 (binding protocol)에 관한 것이다. The present invention also relates to a method for labeling biomolecules, nanoparticles or organic compounds containing an amine group, a hydroxyl group or a thiol group using the novel cyanine compound of the above formula (1).

상기 생체 분자는 바람직하게는 단백질, 펩타이드 (peptide), 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸 (proteoglycan), 글라이코프로틴 (glycoprotein) 및 siRNA로 구성된 군에서 선택된다. The biomolecule is preferably selected from the group consisting of a protein, a peptide, a carbohydrate, a sugar, a fat, an antibody, a proteoglycan, a glycoprotein and an siRNA.

상기 표지는 화학식 1 화합물에 존재하는 비닐 설폰기와 상기 아민기, 수산화기 또는 티올기의 반응에 의하여 상기 화학식 1 화합물과 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물, 구체적으로는 상기 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물에 존재하는 아민기, 수산화기 또는 티올기의 결합에 의하여 이루어지는 것이다. The label may be prepared by reacting the compound of Formula 1 with a biomolecule, a nanoparticle, or an organic compound, specifically, a biomolecule, a nanoparticle, or an organic compound by reacting the vinyl sulfone group present in the compound of Formula 1 with the amine group, the hydroxyl group, A hydroxyl group or a thiol group present in the molecule.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 기존의 숙신이미딜 에스터를 가진 시아닌 염료의 경우와 마찬가지로 단백질과 화학식 1의 화합물과의 반응에 의하여 단백질에 쉽게 염색될 수 있다.The compound of formula (I) according to the present invention can be readily stained with a protein by reacting the compound with the compound of formula (I) as in the case of the cyanine dye having a conventional succinimidyl ester.

따라서, 상기 표지는 용매로서 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 메탄올, 에탄올 및 아세토니트릴로 구성된 군에서 선택되는 유기 용매, 또는 물을 사용하고, pH 5 내지 12에서 상기 화학식 1의 화합물과 상기 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 반응시키는 것에 의하여 이루어진다. 상기 반응은 20 내지 80℃의 온도에서 30분 내지 48시간 동안이면 충분하다. Thus, the label may be a buffer selected from the group consisting of phosphate buffer, carbonate buffer and Tris buffer as solvent, an organic solvent selected from the group consisting of dimethylsulfoxide, dimethylformamide, methanol, ethanol and acetonitrile, or water And reacting the compound of Formula 1 with the biomolecule, nanoparticle or organic compound at a pH of 5 to 12. The reaction may be carried out at a temperature of 20 to 80 DEG C for 30 minutes to 48 hours.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물로 표지되어 있는 생체 분자, 나노 입자 및 유기 화합물로 구성된 군에서 선택되는 물질에 관한 것이다. The present invention also relates to a substance selected from the group consisting of biomolecules, nanoparticles and organic compounds labeled with the compound of formula (1).

생체 분자의 경우 포장 단위에서부터 이미 정해진 완충액에 용해되어 있는 경우가 대부분이고, 생체 분자의 안정성을 확보하기 위하여 별도의 완충액 또는 pH를 요구하는 경우가 많아서 변수로 조절하는 것은 용이하지 않다. 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 다양한 완충액, 반응 온도, pH 조건 등에서 단백질과 용이하게 반응하여 형광을 발현하므로, 생체 분자 표지용으로 사용하기에 적합하다. In the case of biomolecules, most of the biomolecules are dissolved in a predetermined buffer from the package unit. In order to secure the stability of the biomolecule, a separate buffer or pH is often required. The compound of formula (I) according to the present invention easily reacts with proteins in various buffers, reaction temperatures, pH conditions and the like to express fluorescence, and thus is suitable for use as biomolecule markers.

실시예Example

이하에서는 실시예 및 비교 실험을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples and comparative experiments. However, the examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention.

먼저, 실시예 및 비교 실험에서 사용된 실험 장치, 분석 장비 및 시약에 대하여 설명한다. First, experimental apparatus, analysis equipment and reagents used in Examples and Comparative Experiments will be described.

FT-NMR 분광 분석을 위한 기기로는 Bruker사의 Avance 300 및 400을 사용하였고, LC/MS에는 Varian사의 1200L Quadrupole을 사용하여, ESI (electrospray ionization) 방식으로 측정되었다. MALDI-TOF M/S는 Voyager MALDI-TOF DE 질량분석기(mass spectrometer)를 사용하였다. Bruker's Avance 300 and 400 were used for FT-NMR spectroscopy and LC / MS was measured by electrospray ionization (ESI) method using Varian's 1200L Quadrupole. The MALDI-TOF M / S was a Voyager MALDI-TOF DE mass spectrometer.

합성된 염료의 흡수 파장 및 최대 파장에서의 흡수값은 Hewlett-Packard사의 HP 8452 배열 분광 광도계 (diode array spectrophotometer)로 측정되었고, 발광 파장 및 최대 발광 파장에서의 발광값은 Perkin Elmer사의 LS-55를 사용하여 얻었다. The absorbance and absorption values at the maximum wavelength of the synthesized dyes were measured by a Hewlett-Packard HP 8452 diode array spectrophotometer. The emission values at the emission wavelength and the maximum emission wavelength were measured using a Perkin Elmer LS-55 ≪ / RTI >

유기 화합물의 분리 및 정제를 위한 칼럼 크로마토그래피는 정상 (normal phase)의 경우, 실리카겔 (silica gel)로서 Merck사의 kieselgel 60 (230-400 mesh)을 사용하였고, 박층 크로마토그래피 (TLC)에는 실리카겔 60 GF254 (0.25 mm, Merck)가 도포되어 있는 유리판을 사용하고, TLC 상의 화합물 확인은 254 nm 및 365 nm의 자외선을 이용하거나, 발색제로서 인몰리브덴산 (phosphomolybdic acid) (PMA) 20 내지 30% 에탄올 용액 또는 KMnO4를 사용하였다. 역상 (reverse phase)의 경우, TLC는 실리카겔 60 RP-18 F254S (0.25 mm, Merck)가 도포되어 있는 유리판을 사용하였고, 칼럼 크로마토그래피의 경우는 Buchi사의 MPLC (medium pressure liquid chromatography) 장비인 Fraction Collector R-660에 역상 칼럼 Lichroprep RP-18 (40 내지 63 μm, Merck사 제품)를 연결하여 사용하였다. HPLC는 Agilent사의 1100 시리즈에 Waters사의 Bondapak C18 10 μm 125A를 장착하여 사용하였다.Column chromatography for the separation and purification of organic compounds used kieselgel 60 (230-400 mesh) from Merck as silica gel in the case of a normal phase and Silica gel 60 GF254 (0.25 mm, Merck), and the compound on the TLC was confirmed using ultraviolet rays at 254 nm and 365 nm, 20 to 30% ethanol solution of phosphomolybdic acid (PMA) as a coloring agent, KMnO 4 was used. In the case of reverse phase, the glass plate coated with silica gel 60 RP-18 F 254S (0.25 mm, Merck) was used as the TLC. In the case of column chromatography, Buchi's medium pressure liquid chromatography (MPLC) Collector R-660 was connected to a reversed phase column Lichroprep RP-18 (40 to 63 μm, Merck). HPLC was carried out using an Agilent 1100 series equipped with a Bondapak C18 10 μm 125A from Waters.

겔 전기영동 실험을 위한 전기영동장치는 Amershame Biosciences사의 SE260, 소형 수직 겔 전기영동 장치 (mini-vertical gel electrophoresis unit)에 BIO-RAD사의 PowerPac Basic Power Supply (Catalog No. 164-5050)를 연결하여 사용하였다. 겔로는 Lonza사의 PAGEr Gold Precast Gels (Polyacrylamide gels for protein electrophoresis, 10 내지 20% Tris-Glycine gels, Catalog No. 59506)을 사용하였다. SDS-PAGE 실험을 위한 러닝 완충액 (running buffer) 및 로딩 완충액 (loading buffer)는 아래와 같이 직접 제조하여 사용하였다. The electrophoresis apparatus for gel electrophoresis was a BIO-RAD PowerPac Basic Power Supply (Catalog No. 164-5050) connected to a SE260, a mini-vertical gel electrophoresis unit of Amershame Biosciences Inc. Respectively. For the gel, PAGEr Gold Precast Gels (Polyacrylamide gels for protein electrophoresis, 10-20% Tris-Glycine gels, Catalog No. 59506) from Lonza was used. Running buffer and loading buffer for SDS-PAGE experiments were directly prepared and used as follows.

- 5 x running buffer 제조- 5 x running buffer manufacture

· 3 g Tris (Trizma base, Sigma)· 3 g Tris (Trisma base, Sigma)

· 14.4 g Glycine (Sigma)14.4 g Glycine (Sigma)

· 증류수 100 mL, 제조 후 냉장 보관· Distilled water 100 mL, refrigerated after manufacturing

- 5 x loading buffer 제조- 5 x loading buffer manufacturing

· 0.6 mL의 1 M Tris (Trizma base, Sigma)0.6 mL of 1 M Tris (Trizma base, Sigma)

· 5 mL의 50% 글리세롤 (glycerol)5 mL of 50% glycerol

· 2 mL의 10% SDS2 mL of 10% SDS

· 0.5 mL의 2-메르캅토 에탄올 (mercaptanethanol)0.5 mL of 2-mercaptoethanol

· 1.9 mL의 10% 증류수 (bromophenol blue를 넣지 않고 증류수로 대체)· Add 1.9 mL of 10% distilled water (replace bromophenol blue with distilled water)

단백질은 GE Healthcare사와 Takara에서 시판 중인 Size Marker들을 사용하였다. 표지된 생체 분자의 관찰 및 형광 강도 (intensity)의 측정에는 Perkin Elmer사의 Geliance 600 장비를 이용하였고, 광원은 Geliance UV Epi (Catalog No. L7110026), Geliance Blue Epi (Catalog No. L7110027)이었고, 필터는 UV Filter, Geliance Short Pass Filter (500∼600 nm), Geliance Long Pass Filter (580 내지 660 nm), Geliance Blue Light Filter (550∼600 nm)를 형광 파장에 맞게 바꾸어 가면서 측정하였다. Proteins were obtained from GE Healthcare and Size Markers available from Takara. For the observation of the labeled biomolecule and the measurement of the fluorescence intensity, a Geliance 600 instrument from Perkin Elmer was used. The light source was Geliance UV Epi (Catalog No. L7110026), Geliance Blue Epi (Catalog No. L7110027) UV filter, Geliance Short Pass Filter (500-600 nm), Geliance Long Pass Filter (580-660 nm), and Geliance Blue Light Filter (550-600 nm).

시약은 주로 Aldrich사와 TCI사의 것을 사용하였다. 정제가 필요한 용매는 알려져 있는 방법에 따라 정제하여 사용하였고, 특별한 언급이 없는 한 모든 반응은 질소 기류 하에서 실시하였다. NMR 용매는 Aldrich사와 Cambridge Isotope Laboratories Inc사의 DMSO-d 6 또는 D2O를 사용하였다. 시그날의 상대적인 위치는 용매 내에 들어있는 테트라메틸실란 (tetramethylsilane, TMS)을 기준으로 하거나 NMR 용매를 기준으로 하였다. 화학전이 (chemical shift)는 표준 물질로부터 ppm 단위로 표시하였고, 데이터는 화학전이 다중도 (chemical shift multiplicity) (s=singlet, d=doublet, t=triplet, m=multiplet), intergration, coupling constant (Hz)의 순으로 기록하였다.
The reagents were mainly Aldrich and TCI. Solvents requiring purification were purified and used according to known methods and all reactions were carried out in a nitrogen stream unless otherwise noted. The NMR solvent was DMSO- d 6 or D 2 O from Aldrich and Cambridge Isotope Laboratories Inc. The relative position of the signal was based on the tetramethylsilane (TMS) contained in the solvent or on the basis of the NMR solvent. The chemical shifts are expressed in ppm from the reference material and the data are expressed in terms of chemical shift multiplicity (s = singlet, d = doublet, t = triplet, m = multiplet), intergration, Hz).

실시예Example 1: 화합물 1-1의 제조 1: Preparation of Compound 1-1

(1) 화합물 4-1의 합성(1) Synthesis of Compound 4-1

Figure 112017128236318-pat00030
Figure 112017128236318-pat00030

p-히드라지노벤젠설폰산 (p-hydrazinobenzenesulfonic acid) (10 g, 53 mmol, 1 eq, Aldrich)과 3-메틸-2-부탄온 (3-methyl-2-butanone) (17.18 mL, 160 mmol, 3.02 eq, TCI)을 아세트산 30 mL에 가한 후, 4 시간 동안 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 생성된 고체 입자를 여과하였다. 에틸아세테이트로 2, 3회 세정한 후 감압 건조시켰다. (11.34 g, 89%) p-hydrazinobenzenesulfonic acid (10 g, 53 mmol, 1 eq, Aldrich) and 3-methyl-2-butanone (17.18 mL, 160 mmol, 3.02 eq, TCI) was added to 30 mL of acetic acid, and the mixture was heated and refluxed for 4 hours. The mixture was cooled to room temperature, and the resulting solid particles were filtered. After washing with ethyl acetate two or three times, it was dried under reduced pressure. (11.34 g, 89%).

Rf = 0.68 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)R f = 0.68 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 4 v / v)

수산화칼륨 (1.427 g, 25.4 mmol, 1.2 eq)을 프로판올 35 mL에 용해시키고, 앞에서 얻은 고체 물질 (5.073 g, 21.2 mmol, 1 eq)을 메탄올 35 mL에 용해시키고 적가한 후, 상온에서 24 시간 교반하고, 여과하여 노란색의 고체 입자를 얻었다. (5.35 g, 90%)Potassium hydroxide (1.427 g, 25.4 mmol, 1.2 eq) was dissolved in 35 mL of propanol and the solid substance (5.073 g, 21.2 mmol, 1 eq) obtained above was dissolved in 35 mL of methanol. After dropwise addition, the mixture was stirred at room temperature for 24 hours And filtered to obtain yellow solid particles. (5.35 g, 90%).

Rf = 0.68 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)R f = 0.68 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 4 v / v)

1H NMR (300 MHz, D2O) : δ 7.60 (s, 1H), 7.58 (d, 1H, J = 8.32 Hz), 7.32 (d, 1H, J = 7.99 Hz), 2.08 (s, 3H), 1.06 (s, 6H) 1 H NMR (300 MHz, D 2 O): δ 7.60 (s, 1H), 7.58 (d, 1H, J = 8.32 Hz), 7.32 (d, 1H, J = 7.99 Hz), 2.08 (s, 3H) , 1.06 (s, 6 H)

(2) 화합물 6a-1의 합성(2) Synthesis of Compound 6a-1

Figure 112017128236318-pat00031
Figure 112017128236318-pat00031

화합물 4-1 (20 g, 72.1 mmol, 1 eq)과 에틸 아이오다이드 (ethyl iodide) (110 mL, 1,375 mmol, 19 eq, TCI)를 가한 후 24 시간 동안 가열 환류시켰다. 상온으로 냉각시킨 후, 에틸 아이오다이드를 제거하고, 50 mL의 아세톤으로 3, 4회 세정하고, 여과한 후, 40℃에서 감압 건조시켜, 분홍색의 고체를 얻었다. (18.37 g, 95%) Compound 4-1 (20 g, 72.1 mmol, 1 eq) and ethyl iodide (110 mL, 1,375 mmol, 19 eq., TCI) were added thereto and the mixture was refluxed for 24 hours. After cooling to room temperature, ethyl iodide was removed and washed with 50 mL of acetone three times or four times, filtered, and dried under reduced pressure at 40 캜 to obtain a pink solid. (18.37 g, 95%).

Rf = 0.18 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)R f = 0.18 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 4 v / v)

1H NMR (400 MHz, D2O) : δ 7.99 (s, 1H), 7.88 (d, 1H, J = 8.23 Hz), 7.80 (d, 1H, J = 8.46 Hz), 4.43 (m, 2H), 1.52-1.40 (m, 12H) 1 H NMR (400 MHz, D 2 O): δ 7.99 (s, 1H), 7.88 (d, 1H, J = 8.23 Hz), 7.80 (d, 1H, J = 8.46 Hz), 4.43 (m, 2H) , 1.52-1.40 (m, 12H)

LC/MS, 계산치 C13H18NO3S+ 268.1, 측정치 268.16LC / MS, calculated C 13 H 18 NO 3 S + 268.1, found 268.16

(3) 화합물 6b-1의 합성(3) Synthesis of Compound 6b-1

Figure 112017128236318-pat00032
Figure 112017128236318-pat00032

화합물 4-1 (1.66 g, 6 mmol, 1 eq)과 8-브로모 옥타노익 산(8-bromooctanoic acid) (1.34 g, 6 mmol, 1 eq, TCI)을 30 mL의 1,2-디클로로벤젠 (1,2-dichlorobenzene)과 12시간 동안 가열 환류시켰다. 상온 냉각 후 용매를 제거하고, 이소프로필 알콜 (isopropyl alcohol)을 가하고, 여과하여 감압 건조시켜 분홍색의 고체를 얻었다. (1.85 g, 81%)Compound 1 (1.66 g, 6 mmol, 1 eq) and 8-bromooctanoic acid (1.34 g, 6 mmol, 1 eq, TCI) were dissolved in 30 mL of 1,2-dichlorobenzene (1,2-dichlorobenzene) under reflux for 12 hours. After cooling to room temperature, the solvent was removed, isopropyl alcohol was added, filtered and dried under reduced pressure to obtain a pink solid. (1.85 g, 81%)

Rf = 0.20 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:3 v/v)R f = 0.20 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 3 v / v)

(4) 화합물 9-1의 합성(4) Synthesis of Compound 9-1

Figure 112017128236318-pat00033
Figure 112017128236318-pat00033

화합물 6a-1 (16 g, 59.8 mmol, 1 eq)과 DPF (13.2 g, 67.3 mmol, 1.125 eq, TCI)를 40 mL의 아세트산과 40 mL의 무수 아세트산 혼합 용액에 넣고, 4 시간 동안 가열 환류시켰다. 상온으로 냉각시키고, 용액을 제거한 후, 에틸 아세테이트를 가하여 고체를 생성시키고, 여과하여 감압 건조시켰다. (12.97 g, 57%)The compound 6a-1 (16 g, 59.8 mmol, 1 eq) and DPF (13.2 g, 67.3 mmol, 1.125 eq. TCI) were placed in 40 mL of acetic acid and 40 mL of acetic anhydride mixed solution, . After cooling to room temperature, the solution was removed, ethyl acetate was added to form a solid, filtered and dried under reduced pressure. (12.97 g, 57%).

Rf = 0.25 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)R f = 0.25 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 4 v / v)

1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 7.85 (s, 1H), 7.70 (dd, 1H, J = 1.35 Hz, 1.32 Hz), 7.53-7.45 (m, 7H), 7.29 (dd, 1H, J = 1.92 Hz, 6.66 Hz), 4.13 (m, 2H), 1.70 (s, 6H), 1.32 (t, 3H, J = 7.05 Hz) 1 H NMR (300 MHz, DMSO- d 6): δ 7.85 (s, 1H), 7.70 (dd, 1H, J = 1.35 Hz, 1.32 Hz), 7.53-7.45 (m, 7H), 7.29 (dd, 1H , J = 1.92 Hz, 6.66 Hz ), 4.13 (m, 2H), 1.70 (s, 6H), 1.32 (t, 3H, J = 7.05 Hz)

LC/MS, 계산치 C20H23N2O3S+ 371.14, 측정치 370.98 LC / MS, Calcd. C 20 H 23 N 2 O 3 S + 371.14, found 370.98

(5) 화합물 10-1의 합성(5) Synthesis of Compound 10-1

Figure 112017128236318-pat00034
Figure 112017128236318-pat00034

화합물 9-1 (0.78 g, 1.89 mmol, 1 eq)과 화합물 6b-1 (0.93 g, 2.27 mmol, 1.2 eq)을 10 mL의 무수 아세트산과 10 mL의 피리딘 혼합 용액에 넣은 후 110℃에서 4 시간 동안 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 에틸 아세테이트로 고체를 생성시키고, 여과하여, 감압 건조시켰다. 15% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 10-1을 얻었다. (0.31 g, 25%) Compound 9-1 (0.78 g, 1.89 mmol, 1 eq) and compound 6b-1 (0.93 g, 2.27 mmol, 1.2 eq) were added to a mixed solution of 10 mL of acetic anhydride and 10 mL of pyridine, Lt; / RTI > The reaction mixture was cooled to room temperature, a solid was formed with ethyl acetate, filtered and dried under reduced pressure. The 15% acetonitrile aqueous solution was purified by RP-C18 reverse phase chromatography using the eluent to obtain pure compound 10-1. (0.31 g, 25%).

Rf = 0.6 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:3 v/v)R f = 0.6 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 3 v / v)

1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.35 (t, 1H), 7.80 (s, 2H), 7.68-7.66 (m, 2H), 7.40-7.38 (m, 2H), 6.32-6.29 (m, 2H), 4.20-4.10 (m, 4H), 1.98 (t, 2H), 1.80-1.05 (m, 25H) 1 H NMR (400 MHz, DMSO- d 6): δ 8.35 (t, 1H), 7.80 (s, 2H), 7.68-7.66 (m, 2H), 7.40-7.38 (m, 2H), 6.32-6.29 ( m, 2H), 4.20-4.10 (m, 4H), 1.98 (t, 2H), 1.80-1.05

LC/MS, 계산치 C33H41N2O8S2 - 657.23, 측정치 656.9LC / MS, Calcd. C 33 H 41 N 2 O 8 S 2 - 657.23, found 656.9

(6) 화합물 1-1의 합성(6) Synthesis of Compound 1-1

Figure 112017128236318-pat00035
Figure 112017128236318-pat00035

화합물 10-1 (530 mg, 0.804 mmol, 1eq)을 DMF 40 mL에 용해시키고 55℃로 승온하였다. 0.5 mL의 피리딘을 가하고 DSC (603 mg, 2.41 mmol, 3 eq, Aldrich)를 DMF 8 mL에 용해시킨 후 적가하였다. 1 시간 동안 교반하고, 에틸아세테이트를 가하여 적색의 고체를 얻고, 에틸아세테이트, 에테르 (ether)로 여러 번 세정하여 여과하였다. 이것을 DMF 40 mL에 녹이고, 1.4 mL의 휘니그 베이스를 넣은 후, 2-(2'-클로로에틸술포닐)에틸아민 염산염 (167 mg, 0.804 mmol, 1 eq)을 3 mL의 DMF에 녹여서 적가하고, 상온에서 12 시간 이상 교반하였다. 물과 메틸렌클로라이드 (methylene chloride, 디클로로메탄)를 사용하여 추출하고, 35 내지 40℃에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 15% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 1-1을 얻었다. (331 mg, 53%)Compound 10-1 (530 mg, 0.804 mmol, 1 eq) was dissolved in 40 mL of DMF and the temperature was raised to 55 [deg.] C. 0.5 mL of pyridine was added and DSC (603 mg, 2.41 mmol, 3 eq, Aldrich) was dissolved in DMF (8 mL) and then added dropwise. The mixture was stirred for 1 hour, ethyl acetate was added to obtain a red solid, which was washed several times with ethyl acetate and ether and filtered. After dissolving this in 40 mL of DMF and adding 1.4 mL of the whiskey base, 2- (2'-chloroethylsulfonyl) ethylamine hydrochloride (167 mg, 0.804 mmol, 1 eq) was dissolved in 3 mL of DMF and added dropwise , And the mixture was stirred at room temperature for 12 hours or longer. The reaction mixture was extracted with water and methylene chloride (dichloromethane), and distilled under reduced pressure at 35 to 40 ° C to remove the solvent. The 15% aqueous acetonitrile solution was purified by RP-C18 reverse phase chromatography using the developing solution to obtain pure compound 1-1. (331 mg, 53%).

Rf = 0.55 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:3 v/v)R f = 0.55 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 3 v / v)

1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.35 (t, 1H), 7.96 (t, 1H), 7.79 (s, 2H), 7.69-7.65 (m, 2H), 7.40-7.38 (m, 2H), 6.99-6.93 (m, 1H), 6.51 (d, 2H), 6.25-6.21 (m, 1H), 4.17-4.10 (m, 4H), 3.62-3.55 (m, 2H), 3.20-3.09 (m, 2H), 2.01 (t, 2H), 1.70-1.10 (m, 25H) 1 H NMR (400 MHz, DMSO- d 6): δ 8.35 (t, 1H), 7.96 (t, 1H), 7.79 (s, 2H), 7.69-7.65 (m, 2H), 7.40-7.38 (m, 2H), 6.99-6.93 (m, 1H), 6.51 (m, 2H), 6.25-6.21 m, 2H), 2.01 (t, 2H), 1.70-1.10 (m, 25H)

LC/MS, 계산치 C37H48N3O9S3 - 774.26, 측정치 774.0LC / MS, Calcd. C 37 H 48 N 3 O 9 S 3 - 774.26, found 774.0

λabs (물) : 550 nm (ε = 1.213 x 105 M-1cm-1), λfl (물) : 574 nm
λ abs (water): 550 nm (ε = 1.213 × 10 5 M -1 cm -1 ), λ fl (water): 574 nm

실시예Example 2: 화합물 1-2의 제조 2: Preparation of Compound 1-2

(1) 화합물 6b-2의 합성(1) Synthesis of Compound 6b-2

Figure 112017128236318-pat00036
Figure 112017128236318-pat00036

화합물 4-1 (1.39 g, 5 mmol, 1 eq)과 10-브로모 데카노익 산(10-bromodecanoic acid) (1.26 g, 5 mmol, 1 eq, TCI)을 20 mL의 1,2-디클로로벤젠 (1,2-dichlorobenzene)과 12시간 동안 가열 환류시켰다. 상온 냉각 후 용매를 제거하고, 이소프로필 알콜 (isopropyl alcohol)을 가하고, 여과하여 감압 건조시켜 분홍색의 고체를 얻었다. (1.60 g, 78%)Compound 4-1 (1.39 g, 5 mmol, 1 eq) and 10-bromodecanoic acid (1.26 g, 5 mmol, 1 eq, TCI) were dissolved in 20 mL of 1,2- Benzene (1,2-dichlorobenzene) under reflux for 12 hours. After cooling to room temperature, the solvent was removed, isopropyl alcohol was added, filtered and dried under reduced pressure to obtain a pink solid. (1.60 g, 78%).

Rf = 0.18 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:3 v/v)R f = 0.18 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 3 v / v)

(2) 화합물 10-2 합성 (2) Compound 10-2 Synthesis

Figure 112017128236318-pat00037
Figure 112017128236318-pat00037

화합물 9-1 (0.78 g, 1.89 mmol, 1 eq)와 화합물 6b-2 (0.93 g, 2.27 mmol, 1.2 eq)을 110 mL의 무수 아세트산과 10 mL의 피리딘 혼합 용액에 넣은 후 110℃에서 4 시간 동안 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 에틸 아세테이트로 고체를 생성시키고, 여과하여, 감압 건조시켰다. 15% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 10-2을 얻었다. (0.27 g, 21%) Compound 9-1 (0.78 g, 1.89 mmol, 1 eq) and compound 6b-2 (0.93 g, 2.27 mmol, 1.2 eq) were added to a mixed solution of 110 mL of acetic anhydride and 10 mL of pyridine, Lt; / RTI > The reaction mixture was cooled to room temperature, a solid was formed with ethyl acetate, filtered and dried under reduced pressure. The 15% acetonitrile aqueous solution was purified by RP-C18 reverse phase chromatography using the developing solution to obtain pure compound 10-2. (0.27 g, 21%).

Rf = 0.55 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:3 v/v)R f = 0.55 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 3 v / v)

LC/MS, 계산치 C35H45N2O8S2 -685.26, 측정치 685.0LC / MS, calculated C 35 H 45 N 2 O 8 S 2 - 685.26, found 685.0

(3) 화합물 1-2의 합성(3) Synthesis of Compound 1-2

Figure 112017128236318-pat00038
Figure 112017128236318-pat00038

화합물 10-2 (520 mg, 0.757 mmol, 1 eq)를 DMF 30 mL에 녹이고 55℃로 승온하였다. 0.5 mL의 피리딘을 넣은 후 DSC (379 mg, 1.514 mmol, 2 eq)를 DMF 5 mL에 용해시킨 후 적가하였다. 1시간 동안 교반하고, 에틸아세테이트를 가하여 고체를 석출시키고, 석출된 청색 고체를 에틸아세테이트와 에테르로 여러 번 세정하면서 여과하였다. 이것을 DMF 30 mL에 용해 시키고, 1.32 ml 의 휘니그 베이스를 넣은 후, 2-(2'-클로로에틸술포닐)에틸아민 염산염 (157 mg, 0.757 mmol, 1 eq)을 2 mL의 DMF에 녹여서 적가하고, 상온에서 12 시간 이상 교반하였다. 물과 디클로로메탄을 사용하여 추출하고 35 내지 40℃에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 15% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 1-2를 얻었다. (274 mg, 45%)Compound 10-2 (520 mg, 0.757 mmol, 1 eq) was dissolved in 30 mL of DMF and the temperature was raised to 55 째 C. After adding 0.5 mL of pyridine, DSC (379 mg, 1.514 mmol, 2 eq) was dissolved in DMF (5 mL) and then added dropwise. The mixture was stirred for 1 hour, ethyl acetate was added to precipitate a solid, and the precipitated blue solid was filtered while washing with ethyl acetate and ether several times. This was dissolved in 30 mL of DMF and 1.32 mL of the whiskey base was added thereto. Then, 2- (2'-chloroethylsulfonyl) ethylamine hydrochloride (157 mg, 0.757 mmol, 1 eq) was dissolved in 2 mL of DMF, And the mixture was stirred at room temperature for 12 hours or longer. The reaction mixture was extracted with water and dichloromethane, and the solvent was distilled off under reduced pressure at 35 to 40 ° C. The 15% acetonitrile aqueous solution was purified by RP-C18 reverse phase chromatography using the developing solution to obtain pure compound 1-2. (274 mg, 45%).

Rf = 0.5 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:3 v/v)R f = 0.5 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 3 v / v)

1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.35 (t, 1H), 8.02 (t, 1H), 7.80 (s, 2H), 7.71-7.62 (m, 2H), 7.38 (d, 2H), 7.00-6.90 (m, 1H), 6.51 (d, 2H), 6.28-6.20 (m, 1H), 4.19-4.05 (m, 4H), 3.65-3.60 (m, 2H), 3.15-3.05 (m, 2H), 1.99 (t, 2H), 1.75-1.20 (m, 29H) 1 H NMR (400 MHz, DMSO- d 6): δ 8.35 (t, 1H), 8.02 (t, 1H), 7.80 (s, 2H), 7.71-7.62 (m, 2H), 7.38 (d, 2H) 2H), 3.15-3.05 (m, 4H), 7.00-6.90 (m, 2H), 1.99 (t, 2H), 1.75-1. 20 (m, 29H)

LC/MS, 계산치 C39H52N3O9S3 - 802.29, 측정치 802.3 LC / MS, Calc. C 39 H 52 N 3 O 9 S 3 - 802.29, Meas. 802.3

λabs (물) : 550 nm (ε = 9.066 x 104 M-1cm-1), λfl (물) : 573 nm
λ abs (water): 550 nm (ε = 9.066 × 10 4 M -1 cm -1 ), λ fl (water): 573 nm

실시예Example 3: 화합물 1-3의 제조 3: Preparation of compound 1-3

(1) 화합물 9-2의 합성(1) Synthesis of Compound 9-2

Figure 112017128236318-pat00039
Figure 112017128236318-pat00039

화합물 6a-1 (2.2 g, 8.23 mmol, 1 eq)과 MDH (2.55 g, 9.88 mmol, 1.2 eq, TCI)를 10 mL의 아세트산과 10 mL의 무수 아세트산 혼합 용액에 넣고 4 시간 동안 가열 환류시켰다. 상온으로 냉각시키고, 반응액을 제거한 후 에틸아세테이트로 고체를 생성시켜 여과하고 감압 건조시켰다. (3.47 g, 96%)Compound 6a-1 (2.2 g, 8.23 mmol, 1 eq) and MDH (2.55 g, 9.88 mmol, 1.2 eq, TCI) were added to a mixed solution of 10 mL of acetic acid and 10 mL of acetic anhydride and refluxed for 4 hours. After cooling to room temperature, the reaction solution was removed, and a solid was formed with ethyl acetate, followed by filtration and drying under reduced pressure. (3.47 g, 96%).

Rf = 0.20 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)R f = 0.20 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 4 v / v)

(2) 화합물 10-3의 합성 (2) Synthesis of Compound 10-3

Figure 112017128236318-pat00040
Figure 112017128236318-pat00040

화합물 9-2 (2.63 g, 6 mmol, 1 eq)과 화합물 6b-1 (2.29 g, 6 mmol, 1 eq)을 20 mL의 무수 아세트산과 20 mL의 피리딘 혼합 용액에 넣은 후 80℃에서 3 시간 동안 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 에틸 아세테이트로 고체를 생성시키고, 여과하여, 감압 건조시켰다. 15% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 10-3을 얻었다. (0.90 g, 22%) To a solution of compound 9b (2.63 g, 6 mmol, 1 eq) and compound 6b-1 (2.29 g, 6 mmol, 1 eq) in 20 mL of anhydrous acetic acid and 20 mL of pyridine, Lt; / RTI > The reaction mixture was cooled to room temperature, a solid was formed with ethyl acetate, filtered and dried under reduced pressure. The 15% acetonitrile aqueous solution was purified by RP-C18 reverse phase chromatography using the developing solution to obtain pure compound 10-3. (0.90 g, 22%).

Rf = 0.48 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:3 v/v)R f = 0.48 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 3 v / v)

LC/MS, 계산치 C35H43N2O8S2 - 683.25, 측정치 682.9LC / MS, Calcd. C 35 H 43 N 2 O 8 S 2 - 683.25, found 682.9

(3) 화합물 1-3의 합성 (3) Synthesis of Compound 1-3

Figure 112017128236318-pat00041
Figure 112017128236318-pat00041

화합물 10-3 (400 mg, 0.557 mmol, 1 eq)을 DMF 30 mL에 녹이고 55℃로 승온하였다. 0.4 mL의 피리딘에 용해시킨 후 DSC (418 mg, 1.671 mmol, 3 eq)를 DMF 10 mL에 용해시킨 후 적가하였다. 1시간 동안 교반하고 에틸 아세테이르를 가하여 고체를 석출시키고, 석출된 녹색 고체를 에틸아세테이트와 에테르로 여러 번 세정하면서 여과하였다. 이것을 DMF 30 mL에 녹이고, 0.97 ml의 휘니그 베이스를 넣은 후, 2-(2'-클로로에틸술포닐)에틸아민 염산염 (115.9 mg, 0.557 mmol, 1 eq)을 2 mL의 DMF에 녹여서 적가하고 상온에서 12 시간 이상 교반하였다. 물과 디클로로메탄을 사용하여 추출하고 35 내지 40℃에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 20% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 1-3을 얻었다. (183 mg, 41%)Compound 10-3 (400 mg, 0.557 mmol, 1 eq) was dissolved in 30 mL of DMF and the temperature was raised to 55 째 C. After dissolving in 0.4 mL of pyridine, DSC (418 mg, 1.671 mmol, 3 eq) was dissolved in 10 mL of DMF and added dropwise. The mixture was stirred for 1 hour, ethyl acetate was added to precipitate a solid, and the precipitated green solid was filtered while washing with ethyl acetate and ether several times. This was dissolved in 30 mL of DMF and 0.97 mL of a whiskey base was added thereto. Then, 2- (2'-chloroethylsulfonyl) ethylamine hydrochloride (115.9 mg, 0.557 mmol, 1 eq) was dissolved in 2 mL of DMF and added dropwise The mixture was stirred at room temperature for 12 hours or longer. The reaction mixture was extracted with water and dichloromethane, and the solvent was distilled off under reduced pressure at 35 to 40 ° C. The 20% acetonitrile aqueous solution was purified by RP-C18 reverse phase chromatography with developing solution to obtain pure compound 1-3. (183 mg, 41%).

Rf = 0.40 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:3 v/v)R f = 0.40 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 3 v / v)

1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.35 (t, 2H), 7.96 (t, 1H), 7.80 (s, 2H), 7.80-7.61 (m, 2H), 7.31 (d, 2H), 6.70-6.93 (m, 1H), 6.57 (t, 1H), 6.32-6.21 (m, 3H), 4.13-4.08 (m, 4H), 3.62-3.58 (m, 2H), 3.28-3.20 (m, 2H), 2.01 (t, 2H), 1.65-1.18 (m, 25H) 1 H NMR (400 MHz, DMSO- d 6): δ 8.35 (t, 2H), 7.96 (t, 1H), 7.80 (s, 2H), 7.80-7.61 (m, 2H), 7.31 (d, 2H) 2H), 3.28-3.20 (m, 2H), 6.70-6.93 (m, 1H), 6.57 (t, 2H), 2.01 (t, 2H), 1.65-1.18 (m, 25H)

LC/MS, 계산치 C39H50N3O9S3 - 800.27, 측정치 800.0 LC / MS, calculated C 39 H 50 N 3 O 9 S 3 - 800.27, found 800.0

λabs (물) : 646 nm (ε = 2.199 x 105 M-1cm-1), λfl (물) : 679 nm
λ abs (water): 646 nm (ε = 2.199 × 10 5 M -1 cm -1 ), λ fl (water): 679 nm

실시예Example 4 내지 6 4 to 6

상기 실시예 1 내지 3에 설명된 것과 유사한 방법으로 이하의 실시예 4 내지 6의 화합물 (화합물 1-4 내지 1-6)을 제조하였다. 이들 화합물의 구조 확인 데이터는 다음과 같다.The following Examples 4 to 6 (compounds 1-4 to 1-6) were prepared in a manner similar to that described in Examples 1 to 3 above. The structural confirmation data of these compounds are as follows.

실시예Example 4: 화합물 1-4의 제조 4: Preparation of compounds 1-4

(1) 화합물 6a-2(1) Compound 6a-2

Figure 112017128236318-pat00042
Figure 112017128236318-pat00042

(19.81 g, 98%)(19.81 g, 98%).

Rf = 0.45 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)R f = 0.45 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 4 v / v)

(2) 화합물 9-3(2) Compound 9-3

Figure 112017128236318-pat00043
Figure 112017128236318-pat00043

(10.28 g, 85%)(10.28 g, 85%).

Rf = 0.10 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v) Rf = 0.10 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 4 v / v)

(3) 화합물 10-4(3) Compound 10-4

Figure 112017128236318-pat00044
Figure 112017128236318-pat00044

(2.09 g, 31%) (2.09 g, 31%).

Rf = 0.52 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:3 v/v)R f = 0.52 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 3 v / v)

1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.35 (t, 1H), 7.79 (s, 2H), 7.66 (d, 2H), 7.43-7.37 (m, 2H), 6.60-6.45 (m, 2H), 4.15-4.07 (m, 4H), 1.97 (t, 2H), 1.80-1.20 (m, 24H), 0.96 (t, 3H) 1 H NMR (300 MHz, DMSO- d 6): δ 8.35 (t, 1H), 7.79 (s, 2H), 7.66 (d, 2H), 7.43-7.37 (m, 2H), 6.60-6.45 (m, 2H), 4.15-4.07 (m, 4H), 1.97 (t, 2H), 1.80-1.20

LC/MS, 계산치 C34H43N2O8S2 - 671.25, 측정치 671.04LC / MS, Calc'd C 34 H 43 N 2 O 8 S 2 - 671.25, found 671.04

(4) 화합물 1-4(4) Compound 1-4

*

Figure 112017128236318-pat00045
*
Figure 112017128236318-pat00045

(363 mg, 46%)(363 mg, 46%).

Rf = 0.45 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:3 v/v)R f = 0.45 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 3 v / v)

1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.35 (t, 1H), 7.96 (t, 1H), 7.80 (s, 2H), 7.66 (d, 2H), 6.99-6.93 (m, 2H), 6.54-6.49 (m, 2H), 6.25-6.20 (m, 2H), 4.15-4.05 (m, 4H), 3.65-3.57 (m, 2H), 3.26-3,20 (m, 2H), 2.01 (t, 2H), 1.80-1.17 (m, 24H), 0.97 (t, 3H) 1 H NMR (300 MHz, DMSO- d 6): δ 8.35 (t, 1H), 7.96 (t, 1H), 7.80 (s, 2H), 7.66 (d, 2H), 6.99-6.93 (m, 2H) , 6.54-6.49 (m, 2H), 6.25-6.20 (m, 2H), 4.15-4.05 (m, 4H), 3.65-3.57 t, 2H), 1.80-1.17 (m, 24H), 0.97 (t, 3H)

LC/MS, 계산치 C38H50N3O9S3 - 788.27, 측정치 788.27 LC / MS, Calc'd C 38 H 50 N 3 O 9 S 3 - 788.27, Measured 788.27

λabs (물) : 551 nm (ε = 1.025 x 105 M-1cm-1), λfl (물) : 575 nm
λ abs (water): 551 nm (ε = 1.025 × 10 5 M -1 cm -1 ), λ fl (water): 575 nm

실시예Example 5: 화합물 1-5의 제조 5: Preparation of compounds 1-5

(1) 화합물 6c-1(1) Compound 6c-1

Figure 112017128236318-pat00046
Figure 112017128236318-pat00046

(3.85 g, 78%)(3.85 g, 78%)

Rf = 0.14 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v) Rf = 0.14 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 4 v / v)

LC/MS, 계산치 C16H23NO3S 309.14, 측정치 309.1 LC / MS, calculated C 16 H 23 NO 3 S 309.14, measured 309.1

(2) 화합물 9-4(2) Compound 9-4

Figure 112017128236318-pat00047
Figure 112017128236318-pat00047

(3.7 g, 75%) (3.7 g, 75%).

Rf = 0.20 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)R f = 0.20 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 4 v / v)

LC/MS, 계산치 C25H30KN2O4S 493.68, 측정치 493.0LC / MS, Calc. C 25 H 30 KN 2 O 4 S 493.68, Measurement 493.0

(3) 화합물 10-5(3) Compound 10-5

Figure 112017128236318-pat00048
Figure 112017128236318-pat00048

(911 mg, 13%)(911 mg, 13%).

Rf = 0.42 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:3 v/v)R f = 0.42 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 3 v / v)

LC/MS, 계산치 C36H47N2O8S2 - 699.28, 측정치 699.0LC / MS, calculated C 36 H 47 N 2 O 8 S 2 - 699.28, found 699.0

(4) 화합물 1-5(4) Compound 1-5

Figure 112017128236318-pat00049
Figure 112017128236318-pat00049

(417 mg, 51%)(417 mg, 51%).

Rf = 0.35 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:3 v/v)R f = 0.35 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 3 v / v)

LC/MS, 계산치 C40H54N3O9S3 - 816.30, 측정치 816.0LC / MS, Calcd. C 40 H 54 N 3 O 9 S 3 - 816.30, found 816.0

λabs (물) : 551 nm (ε = 1.367 x 105 M-1cm-1), λfl (물) : 576 nm
λ abs (water): 551 nm (ε = 1.367 × 10 5 M -1 cm -1 ), λ fl (water): 576 nm

실시예Example 6: 화합물 1-6의 제조 6: Preparation of compound 1-6

(1) 화합물 6d-1(1) Compound 6d-1

Figure 112017128236318-pat00050
Figure 112017128236318-pat00050

(3.72 g, 99%)(3.72 g, 99%).

Rf = 0.30 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)R f = 0.30 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 4 v / v)

(2) 화합물 9-5(2) Compound 9-5

Figure 112017128236318-pat00051
Figure 112017128236318-pat00051

(2.03 g, 39%) (2.03 g, 39%).

Rf = 0.28 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:3 v/v)R f = 0.28 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 3 v / v)

(3) 화합물 6b-3(3) Compound 6b-3

Figure 112017128236318-pat00052
Figure 112017128236318-pat00052

(2.653 g, 75%)(2.653 g, 75%).

Rf = 0.08 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)R f = 0.08 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 4 v / v)

1H NMR (400 MHz, D2O) : δ 8.00 (s, 1H), 7.90 (d, 1H, J = 8.86 Hz), 7.77 (d, 1H, J = 8.43 Hz), 4.37 (t, 2H, J = 7.46 Hz), 2.25 (t, 2H, J = 7.01 Hz), 1.85 (m, 2H), 1.57-1.26 (m, 13H) 1 H NMR (400 MHz, D 2 O): δ 8.00 (s, 1H), 7.90 (d, 1H, J = 8.86 Hz), 7.77 (d, 1H, J = 8.43 Hz), 4.37 (t, 2H, J = 7.46 Hz), 2.25 (t, 2H, J = 7.01 Hz), 1.85 (m, 2H), 1.57-1.26

LC/MS, 계산치 C17H24NO5S+ 354.14, 측정치 354.18 LC / MS, calculated C 17 H 24 NO 5 S + 354.14, found 354.18

(4) 화합물 10-6(4) Compound 10-6

Figure 112017128236318-pat00053
Figure 112017128236318-pat00053

(2.44 g, 33%)(2.44 g, 33%).

Rf = 0.45 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)R f = 0.45 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 4 v / v)

LC/MS, 계산치 C33H40N2O11S3 2 - 736.18, 측정치 736.0 LC / MS, Calcd. C 33 H 40 N 2 O 11 S 3 2 - 736.18, found 736.0

(5) 화합물 1-6(5) Compound 1-6

Figure 112017128236318-pat00054
Figure 112017128236318-pat00054

(34 mg, 40%)(34 mg, 40%).

Rf = 0.42 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)R f = 0.42 (RP-C18, acetonitrile / water 1: 4 v / v)

LC/MS, 계산치 C37H47N3O12S4 2 - 853.21, 측정치 853.4LC / MS, Calcd. C 37 H 47 N 3 O 12 S 4 2 - 853.21, found 853.4

λabs (물) : 551 nm (ε = 1.116 x 105 M-1cm-1), λfl (물) : 574 nm
λ abs (water): 551 nm (ε = 1.116 × 10 5 M -1 cm -1 ), λ fl (water): 574 nm

실시예Example 7: 단백질에 대한 염색 실험 7: Dyeing experiment on protein

지이 헬스케어사에서 시판 중인 SDS 전기영동을 위한 AmershameTM LMW Calibration 키트 (17-0446-01)의 1개의 팩 (pack) 중 1개의 바이알 (vial)에는 576 μg의 마커용 단백질로서, 포스포릴라아제 b (phosphorylase b) (97 kD, 67 μg), 알부민 (albumin) (66 kD, 83 μg), 오발부민 (ovalbumin) (45 kD, 147 μg), 카보닉 안하이드라이즈 (carbonic anhydrase) (30 kD, 83 μg), 티롭신 인히비터 (trypsin inhibitor) (20.1 kD, 80 μg), α-락탈부민 (α-lactalbumin) (14.4 kD, 116 μg)의 6종이 포함되어 있다. One vial of one pack of the Amershame TM LMW Calibration Kit (17-0446-01) for SDS electrophoresis, commercially available from GE Healthcare, contained 576 μg of marker protein, Albumin (66 kD, 83 μg), ovalbumin (45 kD, 147 μg), carbonic anhydrase (30 kD, 67 μg), phosphorylase b kD, 83 μg), trypsin inhibitor (20.1 kD, 80 μg), and α-lactalbumin (14.4 kD, 116 μg).

상온 (20℃)에서 상기 마커용 단백질이 들어있는 1개의 바이알에 576 μl의 0.1 M 포스페이트 완충액 (pH 9.5)을 가하여 용해시키고, 5개의 e-튜브에 15 μl씩 분취하였다 (25 μg protein / 25 μl buffer, 6.9x10-5 μmol in 25 μl buffer solution). 지이 헬스케어에서 시판 중인 AmershameTM CyTM5 Mono NHS Ester (PA13101, GE Cy3, ①)와 화합물 1-1(②), 1-2(③), 1-6(④), 1-5 (⑤)를 각각 1 mg씩을 100 μl 증류수에 용해시키고, 1 μl씩을 분취하여 앞서의 e-튜브에 넣은 후, 볼텍스 (vortex)와 원심분리기를 사용하여 균일하게 혼합하였다. 25℃로 맞춰 놓은 히팅 블럭 (heating block)에 각각의 e-튜브를 넣고 2시간 동안 반응시켰다. 576 μl of 0.1 M phosphate buffer (pH 9.5) was added to one vial containing the marker protein at room temperature (20 ° C) to dissolve and 15 μl aliquots were collected in five e-tubes (25 μg protein / 25 μl buffer, 6.9 × 10 -5 μmol in 25 μl buffer solution). (2), 1-2 (③), 1-6 (④), 1-5 (⑤) with the Amershame ™ Cy ™ 5 Mono NHS Ester (PA13101, GE Cy3, ) Were dissolved in 100 μl of distilled water and 1 μl aliquots were added to the above-mentioned e-tube, followed by homogeneous mixing using a vortex and a centrifuge. Each e-tube was placed in a heating block set at 25 ° C and reacted for 2 hours.

각 반응액을 각각 15 μl씩 로딩 (loading)하여 겔 전기영동으로 전개한 결과를 도 1 및 2에 나타내었다. 전기영동은 125V에서 2시간 동안 진행하였다. 도 1은 육안으로 관찰되는 사진이고, 도 2는 형광 사진이며 노란색 선까지가 6개 단백질이 전개된 것이다. 도 1 및 2에서 보듯이 GE Cy3의 경우 단백질에 거의 염색이 되지 않은 모습이며 나머지 화합물의 경우는 정도의 차이는 있으나 6개 단백질에 고루 염색이 되었으며 수용액 상에서 매우 안정한 화합물임을 확인할 수 있었다.15 μl of each reaction solution was loaded, and developed by gel electrophoresis. The results are shown in FIGS. 1 and 2. Electrophoresis was carried out at 125 V for 2 hours. Fig. 1 is a photograph of a sample observed with the naked eye, Fig. 2 is a fluorescence photograph, and 6 proteins up to the yellow line are developed. As shown in FIGS. 1 and 2, in the case of GE Cy3, the protein was hardly stained. In the case of the remaining compounds, there was a difference in degree but it was stained uniformly in 6 proteins and it was confirmed that it is a very stable compound in aqueous solution.

Claims (17)

다음 화학식 1로 표시되는 시아닌 화합물:
[화학식 1]
Figure 112018102213710-pat00055

식 중에서, R1, R1'은 각각 독립적으로 수소, 설폰산기 또는 설폰산염기이고,
R2, R2', R3 및 R3'은 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고,
R4는 수소, 탄소 수 1 내지 6개의 알킬기, 카르복시기, -CONH(CH2)LSO2CH=CH2, -CONH-para-(C6H4)SO2CH=CH2 또는 -CONH-meta-(C6H4)SO2CH=CH2이고,
B는 (CH2)l, para-(C6H4) 또는 meta-(C6H4)이고,
m은 1 내지 5의 정수이고 m'은 6 내지 10의 정수이며,
L, l 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이다.A cyanine compound represented by the following formula (1):
[Chemical Formula 1]
Figure 112018102213710-pat00055

Wherein R 1 and R 1 'are each independently hydrogen, a sulfonic acid group or a sulfonic acid group,
R 2 , R 2 ', R 3 and R 3 ' are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms,
R 4 is hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carboxy group, -CONH (CH 2 ) L SO 2 CH═CH 2 , -CONH- para - (C 6 H 4 ) SO 2 CH═CH 2 or -CONH- and (C 6 H 4) SO 2 CH = CH 2, - meta
B is (CH 2 ) l , para - (C 6 H 4 ) or meta - (C 6 H 4 )
m is an integer of 1 to 5 and m 'is an integer of 6 to 10,
L, l and n are each independently an integer of 1 to 5; 제1항에 있어서, 다음 화학식으로 표시되는 화합물로 구성된 군에서 선택되는 것인 화합물:
Figure 112018102213710-pat00056

Figure 112018102213710-pat00057

Figure 112018102213710-pat00058

Figure 112018102213710-pat00059

Figure 112018102213710-pat00060
The compound according to claim 1, wherein the compound is selected from the group consisting of compounds represented by the following formulas:
Figure 112018102213710-pat00056

Figure 112018102213710-pat00057

Figure 112018102213710-pat00058

Figure 112018102213710-pat00059

Figure 112018102213710-pat00060
 제1항에 있어서, 500 내지 800 nm의 파장에서 형광을 나타내는 것인 화합물.The compound according to claim 1, which exhibits fluorescence at a wavelength of 500 to 800 nm. 제1항에 있어서, 아민기, 수산화기 또는 티올기를 포함하는 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물에 표지되는 것을 특징으로 하는 화합물.The compound according to claim 1, which is labeled with a biomolecule, a nanoparticle or an organic compound containing an amine group, a hydroxyl group or a thiol group. 제4항에 있어서, 상기 생체 분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA로 구성된 군에서 선택되는 것인 화합물.5. The compound according to claim 4, wherein the biomolecule is selected from the group consisting of a protein, a peptide, a carbohydrate, a sugar, a fat, an antibody, a proteoglycan, a glycoprotein and an siRNA. 제1항에 따른 화학식 1의 화합물을 사용하여, 아민기, 수산화기 또는 티올기를 포함하는 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 표지하는 방법. A method for labeling a biomolecule, a nanoparticle or an organic compound containing an amine group, a hydroxyl group or a thiol group using the compound of the formula (1) according to claim 1. 제6항에 있어서, 상기 표지는 화학식 1의 화합물의 비닐 설폰기와 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물의 아민기, 수산화기 또는 티올기의 반응에 의하여 상기 화학식 1의 화합물과 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물이 결합하는 것에 의하여 이루어지는 것인 방법. The biosensor according to claim 6, wherein the label is a biomolecule, a nanoparticle or a biomolecule by reacting the vinyl sulfone group of the compound of formula (1) with an amine group, a hydroxyl group or a thiol group of a biomolecule, ≪ / RTI > wherein the compound is conjugated. 제7항에 있어서, 상기 생체 분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.8. The method of claim 7, wherein the biomolecule is selected from the group consisting of proteins, peptides, carbohydrates, sugars, fats, antibodies, proteoglycans, glycoproteins and siRNA. 제8항에 있어서, 상기 표지를 위한 용매로서 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 메탄올, 에탄올 및 아세토니트릴로 구성된 군에서 선택되는 유기 용매, 또는 물을 사용하는 것인 방법. 9. The method of claim 8, wherein the solvent for the label is selected from the group consisting of a buffer selected from the group consisting of phosphate buffer, carbonate buffer and Tris buffer, an organic solvent selected from the group consisting of dimethylsulfoxide, dimethylformamide, methanol, ethanol and acetonitrile , Or water. 제6항에 있어서, 상기 표지는 pH 5 내지 12에서 이루어지는 것인 방법. 7. The method of claim 6, wherein the label is at a pH of 5-12. 제6항에 있어서, 상기 표지는 상기 화학식 1의 화합물과 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 20 내지 80℃의 온도에서 30분 내지 48시간 동안 반응시키는 것에 의하여 이루어지는 것인 방법.The method according to claim 6, wherein the label is formed by reacting the compound of Formula 1 with a biomolecule, a nanoparticle, or an organic compound at a temperature of 20 to 80 캜 for 30 minutes to 48 hours. 제1항에 따른 화학식 1의 화합물로 표지되어 있는 생체 분자, 나노 입자 및 유기 화합물로 구성된 군에서 선택되는 물질. A substance selected from the group consisting of biomolecules, nanoparticles and organic compounds labeled with a compound of formula (1) according to claim 1. 제12항에 있어서, 상기 생체 분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA로 구성된 군에서 선택되는 것인 물질.13. The substance according to claim 12, wherein the biomolecule is selected from the group consisting of proteins, peptides, carbohydrates, sugars, fats, antibodies, proteoglycans, glycoproteins and siRNA. 삭제delete 삭제delete 삭제delete (1) 다음 화학식 4의 화합물을 화학식 5 또는 7의 화합물과 반응시켜 화학식 6a의 화합물을 얻는 단계,
[화학식 4]
Figure 112018102213710-pat00067

[화학식 5]
Figure 112018102213710-pat00068

[화학식 6a]
Figure 112018102213710-pat00069

[화학식 7]
Figure 112018102213710-pat00070

(2) 상기 화학식 6a의 화합물을 다음 화학식 8의 화합물과 반응시켜 화학식 9의 화합물을 얻는 단계,
[화학식 8]
Figure 112018102213710-pat00071

[화학식 9]
Figure 112018102213710-pat00072

(3) 상기 화학식 9의 화합물을 화학식 6b의 화합물과 반응시켜 화학식 10으로 표시되는 화합물을 얻는 단계,
[화학식 6b]
Figure 112018102213710-pat00073

[화학식 10]
Figure 112018102213710-pat00074

(4) 상기 화학식 10의 화합물을 1,1'-카르보닐디이미다졸 또는 N,N-디숙신이미딜 카보네이트와 반응시켜 화학식 11a 또는 11b의 화합물을 얻는 단계, 및
[화학식 11a]
Figure 112018102213710-pat00075

[화학식 11b]
Figure 112018102213710-pat00076

(5) 상기 화학식 11a 또는 11b의 화합물을 휘니그 염기 존재 하에서 하기 화학식 12로 표시되는 화합물과 반응시켜 화학식 1의 화합물을 얻는 단계를 포함하는, 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법:
[화학식 12]
Figure 112018102213710-pat00077

[화학식 1]
Figure 112018102213710-pat00078

식 중에서,
R1, R1'은 각각 독립적으로 수소, 설폰산기 또는 설폰산염기이고,
R2, R2', R3 및 R3'은 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고,
R4는 수소, 탄소 수 1 내지 6개의 알킬기, 카르복시기, -CONH(CH2)LSO2CH=CH2, -CONH-para-(C6H4)SO2CH=CH2 또는 -CONH-meta-(C6H4)SO2CH=CH2이고,
R5는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성된 군에서 선택되는 할로겐 원자, 또는 설파토기 (-OSO3H)이고,
A는 수소 또는 아세틸기이고,
B는 (CH2)l, para-(C6H4) 또는 meta-(C6H4)이고,
X는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성된 군에서 선택되는 할로겐 원자이고,
m은 1 내지 5의 정수이고 m'은 6 내지 10의 정수이며,
L, l 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이다.(1) reacting a compound of formula (4) with a compound of formula (5) or (7) to obtain a compound of formula (6a)
[Chemical Formula 4]
Figure 112018102213710-pat00067

[Chemical Formula 5]
Figure 112018102213710-pat00068

[Chemical Formula 6a]
Figure 112018102213710-pat00069

(7)
Figure 112018102213710-pat00070

(2) reacting the compound of formula (6a) with a compound of formula (8) to obtain a compound of formula (9)
[Chemical Formula 8]
Figure 112018102213710-pat00071

[Chemical Formula 9]
Figure 112018102213710-pat00072

(3) reacting the compound of formula (9) with a compound of formula (6b) to obtain a compound of formula (10)
[Formula 6b]
Figure 112018102213710-pat00073

[Chemical formula 10]
Figure 112018102213710-pat00074

(4) reacting the compound of formula 10 with 1,1'-carbonyldiimidazole or N, N-disuccinimidyl carbonate to obtain a compound of formula 11a or 11b, and
[Chemical Formula 11a]
Figure 112018102213710-pat00075

[Formula 11b]
Figure 112018102213710-pat00076

(5) A process for producing a compound represented by the formula (1), which comprises reacting a compound represented by the above formula (11a) or (11b) with a compound represented by the following formula (12) in the presence of a whisker base to obtain a compound represented by the formula
[Chemical Formula 12]
Figure 112018102213710-pat00077

[Chemical Formula 1]
Figure 112018102213710-pat00078

In the formula,
R 1 and R 1 'are each independently hydrogen, a sulfonic acid group or a sulfonic acid group,
R 2 , R 2 ', R 3 and R 3 ' are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms,
R 4 is hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carboxy group, -CONH (CH 2 ) L SO 2 CH═CH 2 , -CONH- para - (C 6 H 4 ) SO 2 CH═CH 2 or -CONH- and (C 6 H 4) SO 2 CH = CH 2, - meta
R 5 is a halogen atom selected from the group consisting of fluorine, chlorine, bromine and iodine, or a sulfato group (-OSO 3 H)
A is hydrogen or an acetyl group,
B is (CH 2 ) l , para - (C 6 H 4 ) or meta - (C 6 H 4 )
X is a halogen atom selected from the group consisting of fluorine, chlorine, bromine and iodine,
m is an integer of 1 to 5 and m 'is an integer of 6 to 10,
L, l and n are each independently an integer of 1 to 5;
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