KR20110016132A

KR20110016132A - Ｔｍｅｍ１２６ａ 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 과민성 면역질환의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20110016132A
Application number: KR1020090073679A
Authority: KR
Inventors: 이현우; 최중국
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2009-08-11
Filing date: 2009-08-11
Publication date: 2011-02-17
Also published as: KR101098465B1

Abstract

본 발명은 TMEM126A 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 과민성 면역질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 TMEM126A 발현 또는 활성 억제제는 활성화된 면역세포에서 면역 관련 유전자 발현 감소 및 면역세포의 사멸을 유도하여 면역반응을 억제하므로 과민성 면역질환의 예방 및 치료를 위한 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

TMEM126A, CD137, CD137 리간드, 과민성 면역질환, 대식세포

Description

ＴＭＥＭ１２６Ａ 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 과민성 면역질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising expression or activity inhibitors of TMEM126A for the prevention and treatment of hypersensitivity immune disease}

본 발명은 TMEM126A 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 과민성 면역질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

면역반응은 인체에 들어온 이물질에 대한 자기방어 시스템으로서 외부의 수많은 침입자에 대하여 스스로 보호하는 강력한 생체의 반응으로 자기 구성성분(self)과 이물요소를 구별할 줄 아는 능력을 말한다. 이러한 면역 반응은 크게 선천성 면역과 후천성 면역으로 나눌 수 있는데, 이들은 상호간에 긴밀하게 협력체계를 구축하고 있어 서로 보완작용을 하고 있다.

선천성 면역은 세균, 바이러스, 곰팡이 또는 다른 기생충에 대해 광범위하게 비특이적으로 작용하는 1차 방어작용이다. "선천성"이라는 단어는 이러한 방어작 용이 감염에 상관없이 항원에 노출되기 이전에 이미 생체 내에 존재하여 감염 발생시 언제든지 바로 작용할 준비가 되어 있음을 말한다. 직접적이고 즉각적으로 작용하며 각종 백혈구(호중구, 호산구 또는 호염기구 등), 자연살해세포 및 대식세포 (macrophage)등이 외부물질을 공격하여 제거한다. 1차 방어는 보통 선천성 면역을 말하고, 피부 등의 물리적 장벽 또는 점액 같은 화학적 장벽도 선천성 면역에 포함된다.

이에 비해 후천성 면역은 초기자극 후 면역반응을 보이는데 매우 느리다. 후천성 면역은 선천성 면역보다 훨씬 특이적이고 복잡하며 기억작용을 할 수 있기 때문에 척추동물의 면역계는 전에 들어왔던 외부항원이 다시 체내에 들어올 때 빠르게 반응할 수 있다. 후천성 면역은 B 세포와 T 세포라는 두 가지 림프구에 의해 일어난다. B 세포는 거의 대부분의 병원체에 대항할 수 있도록 항원(antigen)에 특이적인 항체(antibody)를 만들어 체액성 면역반응(humoral immune response)을 일으키며, T 세포는 사이토카인을 생산하고 감염된 세포를 직접적으로 죽이는 세포성 면역반응(cellular immune response)을 일으킨다.

병원체가 피부나 점막 등의 물리적 장벽을 깨고 침입하면 수분 내에 선천성 면역반응이 일어나고 이어서 후천성 면역반응이 유발된다.

한편, 면역질환 중 과민성 반응이란 항원에 대해 비정상적으로 과다한 면역 반응을 일으킴으로써 세포 및 조직의 손상을 유발하는 것을 말하고 알레르기, 자가면역질환 및 장기이식 거부반응 등이 있다. 이러한 과민성 면역 질환을 치료하기 위해 현재 주로 사용되고 있는 면역억제제는 증식억제제 및 항염증 스테로이드제 등이 있다. 그러나 메토트렉세이트, 사이클로포스파미드 등의 증식억제제들은 효과는 강력하나 골수 세포나 위장관 내막 등과 같은 교체속도가 높은 정상세포에 심각한 독성을 가지며 흔하게 간장장애를 일으킨다고 보고되었다(Miller, Semin . Vet . Med . Surg. 12(3):144-149, 1997). 면역억제를 유도하기 위해 사용되는 덱사메타손, 프레드니솔론 등의 항염증 스테로이드제제들은 부작용으로서 흔한 감염과 비정상적인 대사, 고혈압 및 당뇨병 등을 유발할 수 있으며 잦은 사용은 약물 내성을 발생시킨다. 사이클로스포린은 장기이식시의 거부반응의 예방 또는 치료에 사용되며, 염증성 장질환, 건선, 류마티스 관절염 및 재생불량성 빈혈 및 다발성 경화증 등의 다양한 만성염증성 또는 자가 면역성 면역질환의 치료에도 사용되나 적정 약물 농도 범위가 좁고, 신독성, 간독성, 고혈압, 암 및 신경독성을 포함하는 심각한 독성 효과를 가진다(Philip and Gerson, Clin . Lab . Med. 18(4): 755-765, 1998; 및 Hojo et al., Nature 397:530-534, 1999). 그러므로 면역조절 활성을 갖는 보다 안전하고 효과적인 면역조절제의 탐색이 필요하다.

CD137은 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, TNF) 수용체 수퍼패밀리(superfamily)의 하나로 세포 증식, 분화 및 계획된 세포 죽음의 조절에 수반되는 단백질을 포함한다. CD137은 CD8+ T 세포에 대한 강력한 공동자극 분자(costimulatory molecule)로서 작용하고(Shuford WW et al., J. Exp . Med., 186, 47-55, 1997; 및 Takahashi C et al., J. Immunol., 162, 5037-5040, 1999), CD137 신호가 항원에 대한 면역 반응을 유지하고 확장시키며 기억 T 세포를 생성하는 것으로 알려져 있다. CD137은 수지상 세포(dendritic cells), 여포성 수지상 세포(follicular dendritic cells), 자연살해세포(natural killer cells), 과립성백혈구(granulocytes) 및 염증 부위의 혈관벽 세포에서 발견된다.

CD137 자극은 CD8+ T 세포의 증대, 생존 및 이펙터 기능을 향상시키며, CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두 CD137 자극에 반응하는 것으로 밝혀졌으나, T 세포 기능의 향상은 CD8+ 세포가 보다 크다(W. Shuford et al., J. Exp . Med., 186(1): 47-55, 1997; I. Gramaglia et al., Eur . J. Immunol., 30(2): 392-402, 2000; 및 C. Takahashi et al., J. Immunol., 162: 5037, 1999). CD8+ T 세포 기능 및 생존에 있어 CD137 자극의 중요한 역할에 기초하여, CD137/CD137 리간드 시스템의 조작은 종양 및 바이러스 병원균 치료의 가능성을 제공한다.

미틀러(Mittler) 등은 CD137의 생체 내 결합이 T 세포-의존 항체 반응을 억제한다는 것을 입증하였으며, 항-CD137 항체는 자가항체 및 Th2 세포에 의해 매개되는 것으로 알려진 자가면역질환 및 기타 면역질환들, 예를 들면 전신성 홍반성 루푸스(SLE)(Sun Y et al., Nat . Med., 8, 1405-1413, 2002; 및 Foell J et al., J. Clin. Invest., 111, 1505-1518, 2003), 류마티스 관절염(Seo SK et al,, Nat . Med., 10, 1088-1094, 2004; 및 Foell JL et al, Immunology, 113, 89-98, 2004), 알레르기성 결막염(Fukushima A et al, J. Immunol., 175, 4897-4903, 2005) 및 알레르기성 천식(Cho YS et al, Clin . Exp . Allergy, 36, 377-385, 2006) 등에 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것으로 보고되었다. 이들 연구는 면역계의 일반적 억 제를 유발하지 않으면서 염증 또는 자가면역 질환의 치료를 위한 효과적인 CD137 항체의 역할을 말해주고 있다.

CD137에 대한 천연 리간드인 CD137 리간드(CD137L)는 TNF 슈퍼패밀리의 34 kDa 당단백질 일원으로서 주로 활성화된 항원제시세포(antigen presenting cell, APC)에서 검출된다. CD137의 CD137 리간드에의 결합은 CD137 발현 세포에 신호를 전달하는 것 이외에, 역방향 신호를 개시하여 CD137L 발현 세포에 기능적 효과를 발휘하고, CD137과 CD137 리간드와의 상호작용은 T 세포 및 APC의 기능적 효과에 영향을 미친다.

TMEM126A 단백질(transmembrane protein 126A)은 195개의 아미노산으로 구성된 21,527 Da의 다중-패스 막 단백질(multi-pass membrane protein)이다. 최근에 열성 비증후군성 시신경위축(recessive non-syndromic optic atrophy)이라는 유전병과의 연관성이 보고된바 있으나, 아직 그 기능은 명확히 알려져 있지 않다(Hanein S et al., The American Journal of Human Genetics, 84, 493-498, 2009).

이에, 본 발명자들은 선천성 면역 및 자가면역과 관련된 과민성 면역질환에 대한 치료제를 연구, 개발하던 중, TMEM126A 단백질이 CD137 리간드와 상호작용하고, CD137 리간드로 자극한 선천성 면역세포에서 TMEM126A 단백질의 발현이 억제될 때 면역세포 사멸을 유도함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 TMEM126A 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 과민성 면역질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TMEM126A 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 과민성 면역질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TMEM126A 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 조성물을 과민성 면역질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 과민성 면역질환 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TMEM126A 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 과민성 면역질환 예방 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) TMEM126A 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주의 TMEM126A 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 TMEM126A 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 과민성 면역질환의 예방 및 치료제 후보물질 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) TMEM126A 단백질에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 TMEM126A 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 TMEM126A 단백질의 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 과민성 면역질환의 예방 및 치료제 후보물질 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) TMEM126A 및 CD137 리간드에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 TMEM126A와 CD137 리간드의 결합 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 TMEM126A와 CD137 리간드의 결합을 억제한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 과민성 면역질환의 예방 및 치료제 후보물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 TMEM126A 발현 또는 활성 억제제는 활성화된 면역세포에서 면역 관련 유전자 발현 감소 및 면역세포의 사멸을 유도하여 면역반응을 억제하므로 과민성 면역질환의 예방 및 치료를 위한 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 TMEM126A 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 과민성 면역질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상기 TMEM126A 단백질은 서열번호 1 또는 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 TMEM126A 단백질의 발현 억제제는 TMEM126A 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 TMEM126A 단백질의 활성 억제제는 TMEM126A 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 과민성 면역 질환은 두드러기, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 천식, 아토피성 피부염, 아나필락시스, 류마티스 관절염, 과민성 폐렴, 급성 사구체신염, 전신성 경화증, 전신 홍반성 낭창, 인슐린 의존성 당뇨병, 건선, 만성 갑상선염, 빈혈, 궤양성 대장염, 강직 척추염, 습진, 루푸스, 쇼그렌 증후군 및 장기이식 거부반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며 대식세포의 과도한 활성에 의해 유발되는 과민성 면역질환은 모두 포함된다.

본 발명자들은 CD137 리간드와 상호작용하는 단백질을 알아보기 위해, 효모 이중 보합계(yeast two hybrid system)을 이용하여 단백질을 동정하였다. 그 결과, TMEM126A(Accession # NM_025460) 단백질이 CD137 리간드와 결합함을 확인하였다.

본 발명자들은 TMEM126A와 CD137 리간드 단백질의 상호작용을 알아보기 위해, TMEM126A 및 CD137 리간드로 형질전환된 세포 및 형질전환되지 않은 세포를 이용하여 시험관 내 풀 다운 분석(in vitro pull down assay) 및 세포 공초점 이미징 분석을 실시하였다. 그 결과, TMEM126A 및 CD137 리간드의 형질전환에 의해, TMEM126A 및 CD137 리간드는 형질전환된 세포에서 과발현하였고(도 2 참조), 두 단백질이 상호작용함을 시험관 내에서 확인하였으며(도 3 참조), 세포 내에서 공위치함을 확인하였다(도 4 참조). 따라서 TMEM126A와 CD137 리간드 단백질은 서로 상호작용함을 알 수 있다.

본 발명자들은 대식세포에서 TMEM126A 발현 억제에 따른 면역 관련 유전자들의 발현 변화를 알아보기 위해, TMEM126A 발현을 억제시킨 세포를 이용하여 TMEM126A 유전자 및 CD137 리간드에 의해 유도되는 유전자(인터루킨-1ß(IL-1ß), CSF1 및 Tenascin-C)의 발현량 변화를 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 이용하여 확인하였다. 그 결과, TMEM126A siRNA를 형질전화시킨 세포에서 TMEM126A 유전자의 발현이 감소함(도 5 참조)과 동시에 IL-1ß, CSF1 및 Tenascin-C 유전자의 발현도 감소되었다(도 6 참조). 따라서, TMEM126A의 발현 억제로 인하여 CD137에 의해 유도되는 면역 관련 유전자들의 발현이 억제됨을 알 수 있다.

본 발명자들은 대식세포에서 TMEM126A 발현 억제에 따른 대식세포의 생존력, 부착성 및 세포사멸 변화를 알아보기 위해, CD137-Fc 재조합 단백질로 자극하여 TMEM126A siRNA를 형질전환시켰다. 세포의 생존력 및 부착성을 관찰하였고, 유세포 분석기로 세포사멸을 분석하였다. 그 결과, 대식세포가 CD137-Fc에 의해 자극되는 경우에 TMEM126A 단백질 발현 억제는 세포의 생존력 및 부착성을 감소시키고(도 7 참조), 세포사멸을 유도하였다(도 8 참조). 따라서, 면역반응이 활성화된 상태에서 TMEM126A 발현 또는 활성을 억제하면 선천성 면역세포를 사멸시켜 면역반응이 억제됨을 알 수 있다.

그러므로 본 발명의 TMEM126A 발현 또는 활성 억제제는 활성화된 면역세포에서 면역 관련 유전자 발현 감소 및 면역세포의 사멸을 유도하므로 과민성 면역질환의 예방 및 치료를 위한 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

상기 조성물은 TMEM126A 단백질의 발현 또는 활성 억제제에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있다.

상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

상기 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

상기 조성물의 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TMEM126A 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 과민성 면역질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

상기 약학적으로 유효한 양이란 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여량은 특정 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여기간, 투여방법, 제거율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

상기 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.

본 발명의 TMEM126A 발현 또는 활성 억제제는 CD137 리간드와 상호작용하는 TMEM126A 단백질의 억제가 CD137-Fc에 의해 활성화된 면역세포의 면역 관련 유전자 발현 감소 및 세포사멸을 유도함으로써 면역반응을 억제하므로 과민성 면역 질환의 예방 및 치료를 위하여 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 TMEM126A 단백질은 서열번호 1 또는 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단백질의 발현 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블랏(western blot) 및 RT-PCR로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 상기 과민성 면역질환은 두드러기, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 천식, 아토피성 피부염, 아나필락시스, 류마티스 관절염, 과민성 폐렴, 급성 사구체신염, 전신성 경화증, 전신 홍반성 낭창, 인슐린 의존성 당뇨병, 건선, 만성 갑상선염, 빈혈, 궤양성 대장염, 강직 척추염, 습진, 루푸스, 쇼그렌 증후군 및 장기이식 거부반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며 대식세포의 과도한 활성에 의해 유발되는 과민성 면역질환은 모두 포함된다.

본 발명의 CD137 리간드와 상호작용하는 TMEM126A 단백질의 억제가 CD137-Fc에 의해 활성화된 면역세포의 면역 관련 유전자 발현 감소 및 세포사멸을 유도함으로써 면역반응을 억제하므로, TMEM126A 단백질의 발현 변화는 과민성 면역 질환의 예방 및 치료제 후보물질 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은

1) TMEM126A 단백질에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 TMEM126A 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단백질의 활성 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 CD137 리간드와 상호작용하는 TMEM126A 단백질의 억제가 CD137-Fc 에 의해 활성화된 면역세포의 면역 관련 유전자 발현 감소 및 세포사멸을 유도함으로써 면역반응을 억제하므로, TMEM126A 단백질의 활성 변화는 과민성 면역 질환의 예방 및 치료제 후보물질 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은

1) TMEM126A 및 CD137 리간드에 피검물질을 처리하는 단계;

본 발명의 TMEM126A단백질은 CD137 리간드와 결합하고 CD137 리간드와 상호 작용하는 TMEM126A 단백질의 억제가 CD137-Fc에 의해 활성화된 면역세포의 면역 관련 유전자 발현 감소 및 세포사멸을 유도함으로써 면역반응을 억제하므로, TMEM126A와 CD137 리간드의 결합 변화는 과민성 면역 질환의 예방 및 치료제 후보물질 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 세포 배양

열에 의해 비활성화된 10%의 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 항생제가 첨가된 α-DMEM 배지에 쥐 단핵세포주인 RAW264.7(no. TIB-71; ATCC, Rockville, MD)을 5% CO₂ 및 37℃ 조건의세포배양기에서 배양하였다.

< 실시예 2> 효모 이중 보합계(Yeast two hybrid system)을 통한 CD137 리간드와 상호작용하는 단백질의 동정

쥐 유래의 CD137 리간드 전체 cDNA를 미끼로하여, CD137 리간드에 결합하는 단백질을 쥐 뇌의 cDNA 라이브러리(library)를 이용하여 제작자가 지시한 방법에 따라 효모 이중 보합계(yeast two hybrid system)(Invitrogen, USA)을 수행하였다.

그 결과, [도 1]과 같이 21개의 실험군에서 클론을 확인하였고, 4개의 서로 다른 실험군에서 TMEM126A(Accession # NM_025460) 단백질을 동정하였다.

< 실시예 3> CD137 리간드와 TMEM126A 단백질의 상호작용 확인

<3-1> CD137 리간드 및 TMEM126A 의 형질전환을 통한 과발현 유도

CD137 리간드와 상기 <실시예 2>에 따라 동정한 TMEM126A를 각각 pCS4+ 벡터에 클로닝하여(CD137-flag tag, TMEM126A-myc tag) 293 세포에 일시 형질전환하여 과발현을 유도하였다.

<3-2> 웨스턴 블랏(Western blot)을 통한 단백질의 과발현 확인

상기 두 단백질의 과발현을 항-Flag 및 항-myc 항체을 이용한 웨스턴 블랏(western blot)으로 확인하였다. 10 ~ 20 ㎍의 세포 용해물(lysate)을 SDS-PAGE로 분리한 후 니트로셀룰로스(nitrocellulose) 막으로 분리된 단백질을 이동시켰다. 이 막을 TTBS(20 mM Tris-HCl, pH7.6, 137 mM NaCl, 0.05%(v/v) Tween 20)로 세척한 후 5%(w/v) 탈지유를 포함한 TTBS로 블로킹하였다. 막을 5%(w/v) 탈지유를 포함한 TTBS에 1차 항체(항-Flag 및 항-myc 항체)로 상온에서 한 시간 교반한 후 TTBS로 3회 세척하였다. HRP가 결합된 이차 항체를 이용하여 원하는 각각의 단백질 밴드를 화학발광법(enhanced chemiluminescence)으로 감지하였다.

그 결과, [도 2]와 같이 CD137 리간드 및 TMEM126A의 혈질전환에 의해 두 단백질이 293 세포에서 과발현함을 확인하였다.

<3-3> 시험관 내 풀 다운 분석( in vitro pull down assay )을 통한 CD137 리간드 및 TMEM126A 의 상호작용 확인

상기 실시예 <3-1>과 같이 293 세포에 CD137 리간드-flag 및 TMEM126A-myc를 과발현시킨 후, 세포 용해물을 항-Flag 항체로 면역침강(immunoprecipitation)하였다. 면역침강된 단백질을 항-Myc 항체로 웨스턴 블랏(western blot)을 실시하였다. 10 ~ 20 ㎍의 세포 용해물을 SDS-PAGE로 분리한 후, 니트로셀룰로스(nitrocellulose) 막으로 분리된 단백질을 이동시켰다. 이 막을 TTBS(20 mM Tris-HCl, pH7.6, 137 mM NaCl, 0.05%(v/v) Tween 20)로 세척한 후 5%(w/v) 탈지유를 포함한 TTBS로 블로킹하였다. 막을 5%(w/v) 탈지유를 포함한 TTBS에 1차 항체(항-myc 항체)로 상온에서 한시간 교반한 후 TTBS로 3회 세척하였다. HRP가 결합된 이차 항체를 이용하여 원하는 각각의 단백질 밴드를 화학발광법(enhanced chemiluminescence)으로 감지하였다.

그 결과, [도 3]과 같이 시험관 내에서(in vitro) CD137 리간드와 TMEM126A 단백질은 서로 상호작용함을 확인하였다.

<3-4> 공초점 이미징 분석을 통한 세포 내에서 CD137 리간드 및 TMEM126A 의 상호작용 확인

상기 실시예 <3-1>과 같이 293 세포에 CD137 리간드-Flag 및 TMEM126A-Myc를 과발현시킨 후 2일 뒤, 세포를 DAPI, 항-myc 및 항-Flag 항체로 염색하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, [도 4]와 같이 CD137 리간드 및 TMEM126A 단백질은 세포 내에서 서로 공위치하여 발현됨을 확인하였다.

< 실시예 4> TMEM126A 의 발현 억제를 통한 세포 반응 확인

<4-1> TMEM126A 유전자 siRNA 의 혈질전환을 통한 TMEM126A 유전자의 발현 변화 확인

TMEM126A 유전자 siRNA-FITC 및 스크램블드(scrambled) siRNA-FITC(바이오니아, 한국)를 Lipofectamine RNAiMAX reagent(Invitrogen, 미국)를 이용하여 RAW264.7 세포에 형질전환하였다. 형질전환 후 6시간 뒤 형질전환 효율을 유세포 분석기(flow cytometer)(Beckman Coulter, 미국)로 분석하였으며, 형질전환 후 2일 뒤 TMEM126A 유전자의 발현 정도를 PCRMaster Mix(Power SYBR Green; Applied Biosystems)를 사용하여 실시간 PCR(MiniOpticon, Bio Rad, 미국) 분석하였다. TMEM126A 유전자의 발현량을 GAPDH 발현량으로 보정하여 계산하였다. 본 발명에서 사용한 프라이머 쌍은 GAPDH-정방향-5'-TTGTCAAGCTCATTTCCTGGT-3'(서열번호 : 3), GAPDH-역방향-5'-GCCATGTAGGCCATGTC-3'(서열번호 : 4), TMEM126A-정방향-5'-GCCATTAGCTGCCTTCATTC-3'(서열번호 : 5) 및 TMEM126A-역방향-5'-TCCTGTCTGATTCTGGAAGTTG-3'(서열번호 : 6)을 사용하였다. 증폭 특이성은 각각의 실험마다 PCR 산물의 융해 온도(melting temperature, Tm)를 분석하여 확인하였다. 음성 대조군으로 역전사효소 없이 만든 cDNA로 실시간 PCR을 실시하였다.

그 결과, [도 5]와 같이 TMEM126A siRNA는 대조군과 비교하여 약 40%의 효율로 형질전환되었고(도 5A), TMEM126A 유전자 발현을 스크램블드(scrambled) siRNA에 비해 약 40% 억제하는 것으로 나타냈다(도 5B).

<4-2> TMEM126A 유전자 siRNA 의 혈질전환을 통한 CD137 리간드에 의해 유도되는 유전자의 발현 변화 확인

CD137 리간드의 자극을 주기 위하여, CD137-Fc 재조합 단백질 또는 인간 IgG-Fc 단백질(대조군)을 1 ㎖의 DPBS에 100 ng/㎖의 농도로 만들어, 이를 배양 접시에 코팅하여 1시간 동안 세포배양기에 방치한 후 DPBS로 세척하였다. 세척된 배양 접시를 다시 열에 의해 비활성화된 FBS가 10% 첨가된 α-DMEM 배지를 넣어 1시간 동안 세포배양기에 방치한 후 DPBS로 2회 세척하고 건조하였다. 건조된 배양 접시에 TMEM126A siRNA 또는 스크램블드(scrambled) siRNA를 첨가하여 RAW264.7 세포를 배양하였다. 대조군은 10% FBS가 첨가된 α-DMEM을 넣어 1시간을 세포배양기에서 배양한 후 DPBS로 세척하였다. 배양 후 2일 뒤 인터루킨-1ß(IL-1ß), CSF1 및 Tenascin C(TN-C)유전자의 발현 정도를 실시간 PCR(MiniOpticon, Bio Rad, 미국) 분석을 PCRMaster Mix(Power SYBR Green; Applied Biosystems)를 사용하여 실시하였다. IL-1ß, CSF1 및 TN-C 발현량을 GAPDH 발현량으로 보정하여 계산하였다. 본 발명에서 사용한 프라이머 쌍은 GAPDH-정방향-5'-TTGTCAAGCTCATTTCCTGGT-3'(서열번호 : 3), GAPDH-역방향-5'-GCCATGTAGGCCATGTC-3'(서열번호 : 4), IL-1ß-정방향-5'-GGGATGAATTGGTCATAGCC-3'(서열번호 : 7), IL-1ß-역방향-5'- ATGTGCTGGTGCTTCATTCA-3'(서열번호 : 8), TN-C-정방향-5'-CAAGGACACAGACTCAGCCA-3'(서열번호 : 9), TN-C-역방향-5'-GTTAACGCCCTGACTGTGGT-3'(서열번호 : 10), CSF1-정방향-5'-CTGCCTCAGCCTTTGATTGT-3'(서열번호 : 11) 및 CSF1-역방향-5'-CCTTCCTCTCTCCCTTCCAC-3'(서열번호 : 12)을 사용하였다. 증폭 특이성은 각각의 실험마다 PCR 산물의 융해 온도(melting temperature, Tm)를 분석하여 확인하였다. 음성 대조군으로 역전사효소 없이 만든 cDNA로 실시간 PCR을 실시하였다.

그 결과, [도 6]과 같이 TMEM126A siRNA로 형질전환하여 TMEM126A의 발현을 억제하면 CD137 리간드에 의해 유도된다고 알려진 면역 관련 유전자 IL-1ß, CSF1 및 TN-C의 발현이 스크램블드(scrambled) siRNA에 비해 약 50% 이상 억제되었다(도 6).

<4-3> TMEM126A 유전자 siRNA 의 혈질전환을 통한 세포 생존력 및 부착성에 대한 영향 확인

상기 실시예 <4-2>에 따라 CD137-Fc 재조합 단백질 또는 인간 IgG-Fc 단백질(대조군)로 자극하여 TMEM126A siRNA를 형질전환시켰다. 형질전환 후 6시간 후, 세포의 생존력 및 부착성을 광학현미경을 통하여 관찰하였다.

그 결과, [도 7]과 같이 CD137로 자극한 대식세포에서 TMEM126A의 발현을 억제시키면 RNAiMAX의 농도에 의존적으로 세포 생존력 및 부착성이 감소하였고, 이는 CD137에 의해 자극되지 않은 세포에서보다 현저한 생존력 및 부착성 억제 활성을 나타냈다(도 7).

<4-4> TMEM126A 유전자 siRNA 의 혈질전환을 통한 세포사멸에 대한 영향 확인

상기 실시예 <4-2>에 따라 CD137-Fc 재조합 단백질 또는 인간 IgG-Fc 단백질(대조군)로 자극하여 스크램블드(scrambled)와 TMEM126A siRNA를 형질전환시킨 6 및 9시간 후에 세포사멸을 FITC로 표지된 Annexin V 및 propidium iodide(PI)(Beckman Coulter, 미국)로 염색하여 유세포 분석기(Beckman Coulter, 미국)로 분석하였다.

그 결과, [도 8]과 같이 CD137로 자극한 세포에서 TMEM126A의 발현 억제에 따라 세포사멸이 증가하였고(도 8A), 발현 억제 6 및 9시간 후, 세포사멸은 시간이 지남에 따라 더 증가하였다(도 8B).

< 제조예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

TMEM126A 발현 또는 활성 억제제 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

TMEM126A 발현 또는 활성 억제제 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

TMEM126A 발현 또는 활성 억제제 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 환의 제조

TMEM126A 발현 또는 활성 억제제 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

<1-5> 과립의 제조

TMEM126A 발현 또는 활성 억제제 150 ㎎

대두추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30 % 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

상기와 같이, TMEM126A 발현 또는 활성 억제제는 활성화된 면역반응을 억제하므로 알레르기, 자가면역질환 및 장기이식 거부반응 등과 같은 과민성 면역질환의 예방 및 치료를 위한 약제의 개발과 이를 이용한 예방 또는 치료 방법 연구에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 효모 이중 보합계(yeast two hybrid system)를 통해 동정한 CD137 리간드와 결합하는 단백질을 나타낸 그림이다.

도 2는 CD137 리간드 및 TMEM126A의 형질전환에 따른 CD137L 및 TMEM126A의 과발현을 나타낸 그림이다.

도 3은 생체 내에서 CD137 리간드와 TMEM126A 단백질의 상호작용을 나타낸 그림이다.

도 4는 세포 내에서 CD137 리간드와 TMEM126A 단백질이 공위치함을 나타낸 그림이다.

도 5는 TMEM126A siRNA의 형질전환에 따른 형질전환 효율(A)과 TMEM126A 유전자 발현의 감소(B)를 나타낸 그림이다.

도 6은 TMEM126A siRNA의 형질전환에 따른 CD137 리간드에 의해 유도되는 유전자의 발현의 변화를 나타낸 그림이다.

도 7은 스크램블드(scrambled) siRNA(A) 및 TMEM126A siRNA(B)의 형질전환에 따른 세포 생존력 및 부착성을 나타낸 그림이다.

도 8은 TMEM126A siRNA의 형질전환에 따른 세포사멸(A) 및 사멸 비율(B)을 나타낸 그림이다.

도 9는 CD137 리간드 역신호에 의해 유도되는 유전자들을 요약하여 나타낸 그림이다.

<110> KYUNGHEI university <120> Composition comprising expression or activity inhibitors of TMEM126A for the prevention and treatment of hypersensitivity immune disease. <130> 9p-07-35 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 196 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Glu Ser His Lys Pro Ser Thr Ser Lys Asp Asp Leu Ile Leu Asn 1 5 10 15 Ile Ile Ser Arg Lys Ile Lys Gln Leu Pro Glu Ser Asp Arg Asn Leu 20 25 30 Leu Glu Tyr Gly Ser Ala Tyr Ile Gly Leu Asn Ala Ala Phe Gly Gly 35 40 45 Leu Ile Ala Asn Ser Leu Phe Arg Arg Ile Leu Asn Val Thr Gln Ala 50 55 60 Arg Leu Ala Ser Ser Leu Pro Met Ala Val Ile Pro Phe Leu Thr Ala 65 70 75 80 Asn Leu Ser Tyr Gln Ser Leu Val Ser Leu Pro Leu Ser Thr Gly Asp 85 90 95 Leu Asn Cys Glu Thr Cys Thr Thr Thr Arg Gly Ala Leu Val Gly Leu 100 105 110 Val Met Gly Gly Leu Tyr Pro Ile Leu Leu Ala Ile Pro Val Asn Gly 115 120 125 Gly Leu Ala Ala Arg Tyr Glu Ser Ser Pro Leu Pro Gln Arg Gly Asn 130 135 140 Ile Phe Asn Tyr Trp Ile Thr Val Ser Lys Pro Val Phe Arg Lys Met 145 150 155 160 Leu Phe Pro Thr Leu Leu Gln Thr Val Phe Ala Ser Tyr Leu Gly Ser 165 170 175 Arg Gln Tyr Lys Leu Leu Ile Lys Ala Leu Gln Leu Pro Glu Pro Asp 180 185 190 Leu Glu Ile His 195 <210> 2 <211> 195 <212> PRT <213> Human <400> 2 Met Glu Asn His Lys Ser Asn Asn Lys Glu Asn Ile Thr Ile Val Asp 1 5 10 15 Ile Ser Arg Lys Ile Asn Gln Leu Pro Glu Ala Glu Arg Asn Leu Leu 20 25 30 Glu Asn Gly Ser Val Tyr Val Gly Leu Asn Ala Ala Leu Cys Gly Leu 35 40 45 Ile Ala Asn Ser Leu Phe Arg Arg Ile Leu Asn Val Thr Lys Ala Arg 50 55 60 Ile Ala Ala Gly Leu Pro Met Ala Gly Ile Pro Phe Leu Thr Thr Asp 65 70 75 80 Leu Thr Tyr Arg Cys Phe Val Ser Phe Pro Leu Asn Thr Gly Asp Leu 85 90 95 Asp Cys Glu Thr Cys Thr Ile Thr Arg Ser Gly Leu Thr Gly Leu Val 100 105 110 Ile Gly Gly Leu Tyr Pro Val Phe Leu Ala Ile Pro Val Asn Gly Gly 115 120 125 Leu Ala Ala Arg Tyr Gln Ser Ala Leu Leu Pro His Lys Gly Asn Ile 130 135 140 Leu Ser Tyr Trp Ile Arg Thr Ser Lys Pro Val Phe Arg Lys Met Leu 145 150 155 160 Phe Pro Ile Leu Leu Gln Thr Met Phe Ser Ala Tyr Leu Gly Ser Glu 165 170 175 Gln Tyr Lys Leu Leu Ile Lys Ala Leu Gln Leu Ser Glu Pro Gly Lys 180 185 190 Glu Ile His 195 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward <400> 3 ttgtcaagct catttcctgg t 21 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse <400> 4 gccatgtagg ccatgtc 17 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMEM126A forward <400> 5 gccattagct gccttcattc 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMEM126A reverse <400> 6 tcctgtctga ttctggaagt tg 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interleukin-1beta forward <400> 7 gggatgaatt ggtcatagcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interleukin-1beta reverse <400> 8 atgtgctggt gcttcattca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tenascin C forward <400> 9 caaggacaca gactcagcca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tenascin C reverse <400> 10 gttaacgccc tgactgtggt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF1 forward <400> 11 ctgcctcagc ctttgattgt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF1 reverse <400> 12 ccttcctctc tcccttccac 20

Claims

TMEM126A 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 과민성 면역질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, TMEM126A 단백질은 서열번호 1 또는 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 과민성 면역질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, TMEM126A 단백질의 발현 억제제는 TMEM126A 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 과민성 면역질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, TMEM126A 단백질의 활성 억제제는 TMEM126A 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 과민성 면역질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 과민성 면역 질환은 두드러기, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 천식, 아토피성 피부염, 아나필락시스, 류마티스 관절염, 과민성 폐렴, 급성 사구체신염, 전신성 경화증, 전신 홍반성 낭창, 인슐린 의존성 당뇨병, 건선, 만성 갑상선염, 빈혈, 궤양성 대장염, 강직 척추염, 습진, 루푸스, 쇼그렌 증후군 및 장기이식 거부반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 과민성 면역질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
약학적으로 유효한 양의 제 1항의 조성물을 과민성 면역 질환에 걸린 인간을 제외한 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 과민성 면역질환 치료 방법.
약학적으로 유효한 양의 제 1항의 조성물을 인간을 제외한 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 과민성 면역질환 예방 방법.
1) TMEM126A 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주의 TMEM126A 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 TMEM126A 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 과민성 면역질환의 예방 및 치료제 후보물질 스크리닝 방법.
제 9항에 있어서, 단계 2)의 단백질의 발현 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯(Western Blot) 및 RT-PCR로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
1) TMEM126A 단백질에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 TMEM126A 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 TMEM126A 단백질의 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 과민성 면역질환의 예방 및 치료제 후보물질 스크리닝 방법을 제공한다.
제 10항에 있어서, 단계 2)의 단백질의 활성 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
1) TMEM126A 및 CD137 리간드에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 TMEM126A와 CD137 리간드의 결합 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 TMEM126A와 CD137 리간드의 결합을 억제한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 과민성 면역질환의 예방 및 치료제 후보물질 스크리닝 방법.