KR20100123096A - 슈크로스계 화합물을 유효성분으로 함유하는 전립선 암 치료용 약학조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드 화합물의 신규한 의약적 용도인 전립선암 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드 화합물은 안드로젠(Androgen)과 안드로젠 수용체(Androgen receptor)의 기능을 억제함으로써, 전립선암과 안드로젠 의존적인 질병인 전립선 비대증이나 안드로젠 관련 탈모증(탈모증 또는 남성대머리)의 치료제 또는 차단제로의 기능을 갖는 항 안드로젠 약으로의 개발이 가능하다.

전립선 특이항원, 전립선암

Description

슈크로스계 화합물을 유효성분으로 함유하는 전립선 암 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for the treatment of prostate gland cancer comprising the sucrose compound}

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드 화합물을 유효성분으로 함유하는 전립선암 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

<화학식 1>

5-알파 환원효소는 피지선, 모낭, 전립선 등 남성 호르몬 반응성 조직에 존 재하며 정소에서 생합성 되는 남성 호르몬인 테스토스테론을 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosteron; DHT)으로 전환시키는 데 관여하는 생체 촉매이다. 사춘기 이후 과량 분비된 디하이드로테스토스테론은 피지세포(sebocyte)에서 피지를 과잉 생성하는 주원인 물질로 작용하여 여드름 및 남성형 탈모를 유발(Metcalf BW et al., Trends Pharmacol Sci. 1989 Dec;10(12):491-5. Review)하는 것으로서, 골격근 증가, 정자 형성 등은 테스토스테론이 관여하고 여드름, 피지증가, 탈모 및 전립선비대증 등은 디하이드로테스토스테론이 해당 조직에서 관여하는 것으로 알려져 있다(J. Invest. Dermatol. 1995; 105(2): 209-14).

그러므로 5-알파 환원효소의 활성을 저해함으로서 디하이드로테스토스테론의 생성을 저해하여 탈모를 방지할 수 있다(Winson JD., J Biol Chem., 1975 May 10;250(9):3498-504). 또한, 5-알파 환원효소의 활성 저해효과를 이용하여 남성형 탈모 방지 이외에도 전림선 암, 전립선 비대증 등 디하이드로테스토스테론의 생성을 저해함으로서 관여되는 각종 질환의 치료에도 이용할 수 있다.

종래 5-알파 환원효소 저해제로서 피나스테리드와 같은 화합물이 있으며, 투여용량을 달리하여 전립선 치료제 및 탈모 방지제로 사용되고 있다. 피나스테리드는 편리성과 효능면에서 우수한 약이나 피나스테리드를 제조하는데 있어 사용되는 시약이 고가이거나 맹독성이어서 제조원가에 부담을 주거나 환경을 오염시키는 문제점이 있고, 특히 부생성물의 제거가 용이하지 않아 목적산물의 순도가 떨어지거 나, 수분에 용이하게 저해되는 시약 또는 활성 유도체를 사용함으로써 대량생산이 어렵다는 문제점이 있다.

한편, 전립선은 호두알 크기로 방광아래, 직장 앞쪽에 위치하면서 이들은 서로 단단하게 고정되어 요도를 둘러싸고 있으며 남성만이 가지는 장기이다. 전립선은 선조직과 섬유근조직으로 구성되어 있으며, 이 선조직은 알칼리성의 유백색의 액체인 전립선 분비액을 분비하며 섬유근 조직이 성교를 하는 동안 수축하여 요도를 통해 사정이 되는데 이 전립선 분비액은 정낭선액과 혼합되어서 정액을 이루는 주성분이 된다. 이 요도는 대부분의 포유동물이 가지고 있으며 방광으로부터의 소변이 전립선을 지나 배출된다. 전립선은 전형적으로 남성의 호르몬의 영향으로 사춘기부터 점차적으로 커지게 된다. 불행하게도 이런 해부학상의 특징이 노화가 되면서 소변배출에 어려움을 겪는 문제점이 된다.

전립선은 테스토스테론을 좀더 강력한 남성 호르몬인 디하이드로테스토스테론으로 전환시킨다. 이 디하이드로테스토스테론은 전립선의 크기에도 영향을 미치며, 전립선암에서 중요한 역할을 한다. 안드로젠과 안드로젠 수용체 기능은 전립선 상피세포의 세포증식과 전립선비대증과 호르몬 의존적 단계의 질병에서 발달한 전립선암에 결정적인 역할을 한다. 최근 연구들은 호르몬 무반응성 전립선암에서 조차 호르몬 제거 치료를 한 후에 안드로젠을 제한시키더라도 대부분의 환자들에서 안드로젠 수용체가 기능적으로 수행을 하고 있음을 보고하고 있다.

전립선암은 악성종양으로써 전립선에서 발병해서 혈액과 림프 흐름을 통해 다른 장기들과 뼈, 조직으로 널리 퍼질 수 있다. 전립선암은 미국에서 비 멜라노마 피부 암 다음으로 두번째로 미국남성 암사망자 수가 높다. 미국에서 최근 해마다 30만명 이상 남성이 전립선암으로 판정 받는 것으로 보고되고 있다. 전립선암은 전립선에 국한되지 않고 다른 장기로의 암 전이로 매우 치명적이다.

전립선암의 일반적인 치료법은 방사선 요법, 외과요법, 호르몬 요법이 이용되고 있으나 이들 치료법들은 심각한 부작용과 제한이 있으며, 재발 빈도가 높다. 안드로젠 제거 법은 가장 기본적인 전립선암의 치료이다. 림프절이나 다른 장기로의 전이가 일어난 원격 전이한 경우에도 호르몬요법인 안드로젠 제거 법은 이용된다. 암 세포는 안드로젠에 반응하기 때문이다. 또한 호르몬 무반응 암에서 조차도 호르몬 요법 후에 대부분의 전립선암은 여전히 와일드 타입의 안드로젠 수용체를 보유한다. 안드로젠 수용체의 기능의 억제는 이들 암세포들의 성장과 생존을 억제 시킬 수 있다는 연구가 보고 되어 있다.

그러므로 안드로젠 수용체 단백질의 억제와 리간드 비 의존적 활성을 억제하는 이들 물질들이 전립선암의 치료에 있어서 특히 획기적이라 하겠다. 한 예로 일본은 미국만큼이나 전립선암이 일반적이지만, 사망률에 있어서는 일본이 훨씬 낮은 율을 나타낸다. 전립선암의 원인이 유전적 요소만 관여되어 있는 것 같진 않다. 그 이유는 실제로 미국에 이주한 일본인들은 전립선암의 이환율이 본국의 일본인 보다 월등히 높다. 바로 이것은 식생활변화의 차이로 이런 파라독스를 설명 할 수 있다. 식생활이 안드로젠과 그 기능에 영향을 줄 수 있음을 알 수 있다.

전립선암의 발암화는 안드로젠 신호전달과 관계되며 이들 안드로젠/안드로젠 수용체 신호전달을 억제하는 이들 약제들은 전립선암의 발병을 지연하거나 차단 할 수 있다. 전립선 비대증은 전립선의 선조직과 기질조직의 성장에 의해 비대해지는 경우를 말 하며 전립선 비대증은 50세 이상 성인의 남성에서 자연적으로 발생할 수 있다. 이 연령대의 남성들은 신체의 테스토스테론이 디하이드로테스토스테론으로 변형하여 전립선에 많은 양이 존재하게 되며, 여기에는 첫 번째로 테스토스테론을 디하이드로테스테론으로 전환하는 효소인 5-알파 환원효소가 다량으로 생성된다.

전립선 상피세포들에서 디하이드로테스테론은 안드로젠 수용체와 결합하는 경향이 있으며 이 결과로 전립선이 비대해진다. 보통의 경우 성인 남성들에게서 흔히 생기는 현상으로서 수술이 필요가 없으나, 전립선이 너무 비대해져 소변을 보는데 여러 문제가 생기게 되면 수술이 절대적으로 필요하게 된다. 해마다 전립선 비대증 치료를 위해 40만 건의 전립선비대증 수술이 수행되고 있다. 전립선암과 전립선 비대증 치료제의 시장은 점점 더 증가하고 있다.

그러므로 테스토스테론에서 디하이드로테스토스테론의 반응에 관여하는 생체 효소인 5-알파 환원효소의 활성을 저해함으로서 탈모, 여드름, 전립선비대증 등의 남성 호르몬 의존성 질환을 치료할 수 있으므로 원천적인 약리기전으로 5-알파 환원효소의 활성을 저해하는 신규물질 탐색이 활발히 연구되고 있다.

기술적 특징들은 플루타마이드(flutamide)나 이것의 유도체인 피나스테리드같이 테스토스테론을 디하이드로테스테론으로 변환되지 못하도록 막는 5-알파 환원효소 억제제인 경우로써 안드로젠 결합을 차단하는 것을 포함하는 안드로젠/안드로젠 수용체 기능을 억제하는 기능을 가지고 있다.

또한, 천연의 무독성 파이라노쿠마린계 물질들은 안드로젠형 탈모증 치료와 방지제로 알려져 있는 약들과는 구별되며, 안드로젠 안드로젠 수용체의 기능을 억제한다.

플루타마이드, 카소덱스/바이칼루타미드 같은 안드로젠 결합 차단제는 악성전립선 암과 전립선 비대증 치료에 이용되고 있으며, 몇몇 환자들에게선 효과적이지만, 비 전립선 조직에서의 안드로젠 결합 차단에 의한 부작용이 있어 그 사용이 제한적이다. 피나스테리드는 전립선 조직에서 이들 효소들의 제한적 발현의 부작용이 좀 더 적게 나타나며, 전립선 임상시험 단계에서 암 치료제로 이용되어 오고 있다. 피나스테리드는 전립선암의 발병률을 낮추지만 이를 처리한 전립선암의 병리학적 특징에서 높은 악성 상태를 보여주었다. 그러므로 전립선 암 치료제로써의 피나 스테리드 이용의 위험평가에 대해선 아직도 명확하지 않으며 전립선비대증의 치료에 대해서도 명확하지 않다.

본 발명은 이들 치료제를 부작용과 독성이 없는 천연식물에서 찾고자 연구하여 5-알파 환원효소 저해 활성을 갖는 물질을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드 화합물의 신규한 의약적 용도를 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드 화합물을 유효성분으로 함유하는 전립선암 치료용 약학조성물을 제공한다.

<화학식 1>

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노 실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드 화합물이 전립선암 세포주에 특이적으로 억제효과를 갖는 신규한 의약적 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 데 토마시 등의 방법(J Nat Prod. 1993 Jan;56(1):134-7 New sucrose derivatives from the bark of Securidaca longipedunculata .De Tommasi N, Piacente S, De Simone F, Pizza C.)에 의해 세큐리다카(Securidaca) 식물로부터 분리된 슈크로스(sucrose)계 물질이다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 송 등의 공지된 방법(Phenolic glycosides from Lindera fruticosa root and their inhibitory activity on osteocalst differentiation. Chem. Pharm. bull (Tokyo) 56(5):707-710(2008) M.C song, F. Nigussie, H.J.Yang, H.H Kim, J. Y kim D.K Chung, and N.I. Baek. Phenolic compounds from the roots of Lindera fruticosa M. C. song, F. Nigussie, T.S Jeong, C.Y.LEE, F Regassa, T. markos, and N.I.Baek J Nat Prod. 1993 Jan;56(1):134-7 New sucrose derivatives from the bark of Securidaca longipedunculata .De Tommasi N, Piacente S, De Simone F, Pizza C.) 에 의해 제조될 수 있다.

세큐리다카 롱깁던쿨라타(Securidaca longipdunculata Fresen) 식물은 아프 리카가 주산지로 알려져 있으며, 원지과(Polygalaceae)에 속하는 식물로 항염증, 항박테리아, 향정신제로 이용될 수 있으며, 또한 상기 식물과 같은 종에 속하는 것으로 아시아 지역에서도 중국 남부쪽에서 서식하는 세큐리다카 인 아펜디큐라타(Securidaca in appendiculata HASSK) 식물과 유사하다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물인 β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드 화합물은 전립선 정상세포주와 전립선암세포주 비교 시험에서 인간전립선 암 세포주(LNCaP)에서 암세포 성장억제효과를 나타내지만, 정상 인간 전립선 세포주인 RWPE-1에는 아무런 영향을 미치지 않음을 확인하였으며, 특히, 본 발명은 세포내에서의 안드로젠 수용체(AR)와 전립선 특이항원(PSA) 단백질 발현을 감소시키며, 안드로젠 수용체(AR)와 전립선 특이항원(PSA) mRNA 발현을 감소시킴을 확인하였다.

본 발명은 통상적으로 사용되는 충전제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제 등과 혼합하여 β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드를 함유하는 전립선암 치료용 약학조성물을 제조할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 액제 등의 경구투여용 제제나 통상의 방법으로 주사용 증류수에 용해하여 주사제로 또는 에어로졸, 로션, 크림 형태로도 사용될 수 있다.

본 발명의 전립선암 치료용 약학조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있고, 생리활성물질인 β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드는 성인 기준으로 약 0.001mg 내지 100㎎/kg, 바람직하게는 약 1mg/kg 내지 20mg/kg 범위내에서 투여될 수 있다. 그러나 실제적으로 투여되는 생리활성물질의 양은 치료하려는 질환의 상태, 선택된 투여 경로, 개별적인 환자의 연령, 체중 및 반응, 병의 중증도를 비롯한 관련 상황에 비추어 의사가 결정할 것이므로 상기 투여 범위는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드 화합물이 인간전립선 암 세포주(LNCaP)에서 암세포 성장억제효과를 나타내며, 특히, 본 발명은 세포내에서의 안드로젠 수용체(AR)와 전립선 특이항원(PSA) 단백질 발현을 감소시킴으로써 전립선암 치료제와 차단제로 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 전립선 특이항원 억제활성과 세포성장 억제효과 검정

세큐리다카 롱깁던쿨라타(Securidaca longipdunculata Fresen)식물의 수피에서 공지의 방법(J Nat Prod. 1993 Jan;56(1):134-7 New sucrose derivatives from the bark of Securidaca longipedunculata .De Tommasi N, Piacente S, De Simone F, Pizza C.)에 의해 분리된 β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드를 DMSO에 용해하여 암세포 성장억제효능을 인간전립선 암 세포주(LNCaP)에서 검정하였다.

6 well plate에 미리 분주해 놓은 전립선 암세포주에 β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드 용량을 10μM, 50μM의 농도로 준비하여 10% 우(소)혈청이 첨가된 RPMI 1640 기본 배지에 상기 용량별로 β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드를 처리하여 37℃로 유지된 CO₂ 배양 인큐베이터에서 72시간동안 배양하였다. 배양 72시간 후 세포배양액은 따로 수거하여 전립선 특이항원(PSA) assay를 위해 이용되었으며, 부착된 세포들은 1% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)에 15분 동안 처리하여 고정시켰다. 고정된 세포를 0.02% crystal violet 용액을 이용하여 염색하였으며, 건조 시킨 후 사진 촬영을 하였다. 그 이후 70% 에탄올로 염색된 cell들을 녹여 ELISA reader를 이용하여 흡광도 570nm에서 그 수치를 측정하여 도 1a 및 도 1b에 나타내었다. 대조군으로 당귀의 주요 성분인 데쿠르신(Decursin)과 전립선암 치 료제로 사용되고 있는 카소덱스(casodex)를 동일농도로 처리하여 비교하였다.

도 1a 및 도 1b에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 의한 β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드 처리군에서 농도의존적으로 억제효과를 보였으며, 이 효과는 대조군인 카소덱스 보다 우월한 효과를 보였으며, 데쿠르신과 비슷한 효과를 보였다.

도 2는 따로 수거한 배양액을 이용하여 PSA 측정한 결과이다. 그 결과 β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드 처리군에서 농도 의존적인 PSA 감소효과를 보였다.

<실시예 2> 정상 전립선 세포에서의 세포성장에 미치는 영향

정상 인간 전립선 세포주인 RWPE-1를 이용하여 정상세포에는 영향을 미치는지에 대한 여부를 검정하기 위해 실시하였다.

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 전립선 암세포주에서 세포성장 억제를 야기했던 농도에서 정상 전립선 세포주에 미치는 영향을 검정하고 도 3에 나타내으며, 도 3에 알 수 있는 바와 같이, 정상 전립선 세포주에는 아무런 영향을 미치지 않았음을 알 수 있다.

<실시예 3> 안드로젠 수용체 단백질과 세포내 전립선 특이항원 PSA 단백질 발현억제 효과

상기 실시예 1에서 보여주었던 PSA 분비 감소효과를 다시금 검정하기 위해 세포내에서 분비된 PSA가 아닌 세포내에서의 PSA 단백질 발현에는 β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드 화합물이 어떤 영향을 미치는지를 검정하기 위해 Western blotting 실험 기법을 이용하여 확인하였다.

전립선 암주인 LNCaP에 β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드를 50μM 농도로 24시간 처리하였다. 그 이후 cell을 수거하여 western blotting을 수행하고 도 4에 나타내었다. 대조군은 데쿠르신을 이용하여 비교하였다.

도 4로부터, β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드가 안드로젠 수용체(AR)와 전립선 특이항원(PSA) 단백질 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있다.

<실시예 4> 안드로젠 수용체와 PSA의 mRNA상에서의 발현량 검정

도 4에서 보여주었던 결과를 토대로 전사(transcript) 상에서의 AR과 PSA의 mRNA 발현이 억제되는지를 알아보기 위해 RT-PCR 법을 이용하여 실험하였다. 인간 전립선 암주인 LNCaP상에서 50μM의 농도로 β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드를 24시간동안 처리 하였으며, 24시간 후 세포를 수거하여 RNeasy midi kit를 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 4μg농도로 취하여 reverse transcription Super Script TM II RT kit를 이용하여 역전사 하였으며, PCR은 HotstarTaq Master Mix Kit를 이용하여 수행하였다. (GAPDH):Forward5'-TCAAGAAGGT℃GGTGAAGCAG-3',Reverse5'-CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3'(95℃ 30 sec, 57℃ 1 min, 72℃ 1 min, 25 cycles); AR: Forward 5'-ATG GAA GTG CAG TTA GGG-3', Reverse 5'-CAG GAT GTC TTT AAG GTC AGC-3' (95℃ 30 sec, 57℃ 1 min, 72℃ 1.5 min, 32 cycles) ; PSA: Forward: 5'-GAT GAC TCC AGC CAC GAC CT-3'Reverse: 5'-CAC AGA CAC CCC ATC CTA TC-3' (95℃ 30 sec, 57℃ 1 min, 72℃ 1.5 min, 22 cycles ) Primer와 PCR 진행 시간 순서에 따라 실시하였다.

PCR이 끝난 후 5μl의 PCR 산물을 EtBr이 함유된 1% agarose gel에 loading 하여 UV 일루미네이션을 이용하여 그 PCR 산물을 확인하고 사진촬영 하여 도 5에 나타내었다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드는 안드로젠 수용체(AR)와 전립선 특이항원(PSA) mRNA 발현을 감소시키는 것을 확인하였다.

그러므로 본 발명에 따른 β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드는 전립선 암의 치료제와 차단제로 이용가능하며, 다 양한 제제로의 개발로도 가능하다.

도 1a는 본 발명에 의한 화합물의 농도별(10, 50uM) 처리에 따른 전립선 암주인 LNCaP에서 세포수의 감소 효과를 나타낸 것이며,

도 1b는 본 발명에 의한 화합물의 농도별(10, 50uM) 처리에 따른 전립선 암주인 LNCaP에서 세포수를 ELISA를 이용하여 측정한 후 그래프화 한 것이며,

도 2는 본 발명에 따른 전립선 암주인 LNCaP에서의 전립선 특이항원(PSA)의 분비 억제효과를 측정하여 나타낸 그래프이며,

도 3은 전립선 정상세포에서의 본 발명에 의한 화합물의 무독성 효과를 측정하여 나타낸 그래프이며,

도 4는 본 발명에 의한 화합물의 전립선 암주인 LNCaP에서 안드로젠 수용체(AR)와 전립선 특이항원(PSA)의 번역수준인 단백질 발현의 억제효과를 측정하여 나타낸 것이고,

도 5는 본 발명에 의한 화합물의 전립선 암주인 LNCaP에서 안드로젠 수용체(AR)와 전립선 특이항원(PSA)의 전사수준에서 mRNA 발현의 억제효과를 측정하여 나타낸 것이다.

Claims (1)

1. β-D-(3,4-디스인아포일)푸럭토푸리노실-α-D-(6-신아포일)글루코피라노사이드를 유효성분을 함유하는 것을 특징으로 하는 전립선암 치료용 약학조성물.

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