KR20100120711A - 양적 브레미아 락투카 내성을 갖는 농경학상 우량 상추 - Google Patents

양적 브레미아 락투카 내성을 갖는 농경학상 우량 상추 Download PDF

Info

Publication number
KR20100120711A
KR20100120711A KR1020107022121A KR20107022121A KR20100120711A KR 20100120711 A KR20100120711 A KR 20100120711A KR 1020107022121 A KR1020107022121 A KR 1020107022121A KR 20107022121 A KR20107022121 A KR 20107022121A KR 20100120711 A KR20100120711 A KR 20100120711A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
allele
plant
lactuca
resistance
lettuce
Prior art date
Application number
KR1020107022121A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101588475B1 (ko
Inventor
제랄드 엔. 쿠르바
히어로니무스 제이.엠. 반 데르 란
로사 아이. 웨버
Original Assignee
세미니스 베저터블 시즈 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 세미니스 베저터블 시즈 인코포레이티드 filed Critical 세미니스 베저터블 시즈 인코포레이티드
Publication of KR20100120711A publication Critical patent/KR20100120711A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101588475B1 publication Critical patent/KR101588475B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/14—Asteraceae or Compositae, e.g. safflower, sunflower, artichoke or lettuce
    • A01H6/1472—Lactuca sativa [lettuce]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/12—Leaves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

본 발명은 연결되지만 바람직하지 않은 농경학적 형질로부터 양적 노균병 (Downy Mildew) 내성 형질의 분리에 관한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 내성 형질에 유전적으로 연결된 바람직하지 않은 농경학적 형질을 명시하는 대립유전자를 포함하지 않는, 그러한 노균병 내성 형질을 포함하는 식물, 식물 부위 및 종자를 추가로 제공한다.

Description

양적 브레미아 락투카 내성을 갖는 농경학상 우량 상추{AGRONOMICALLY ELITE LETTUCE WITH QUANTITATIVE BREMIA LACTUCA RESISTANCE}
본원은 그 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 가출원 61/033,823 (2008년 3월 5일 출원)에 기초한 우선권을 주장한다.
본 발명은 식물 육종 분야, 보다 구체적으로 우량 농경학적 형질 (trait)을 갖는 노균병 (downy mildew)-내성 상추의 개발에 관한 것이다.
재배 상추인 락투카 사티바 (Lactuca sativa)는 가장 자주 잎채소로서 재배되는 온대성 1년생 또는 2년생 식물이다. 상추는 국화과 (아스테라세 (Asteraceae) 또는 콤포지태 (Compositae))에 속한다. 이 과의 다른 구성원은 꽃상추 (endive), 치커리, 아티초크 (artichoke), 해바라기 및 홍화를 포함한다. 이는 일반적인 야생 상추 또는 가시 상추 (엘. 세리올라 (L. serriola))에 밀접하게 관련되고, 2가지 다른 야생 상추 (엘. 살리그나 (L. saligna) 및 엘. 비로사 (L. virosa))에는 덜 밀접하게 관련된다. 재배 상추 및 해바라기는 상기 과의 유전적으로 가장 잘 특성결정된 구성원이다. 재배 상추의 4가지 주요 종류는 결구 (crisphead) 상추 (대부분 아이스버그 (iceberg)), 로메인 (코스) 상추, 잎상추 및 반결구 (butterhead) 상추를 포함한다. 이들 기본 군의 각각은 수많은 재배종으로 이루어지고, 각각은 그 자신의 특정 형태학, 재배상 적응 및 질병 내성에 의해 특성결정된다. 상추 재배종은 특히 노균병, 균핵병 (Sclerotinia Rot), 보트리티스 곰팡이병 (Botrytis Rot), 갈색뿌리썩음병 (Corky Root Rot), 잔토모나스 캄페스트리스 병원체종 비티안스 (Xanthomonas campestris pv . vitians)에 의해 유발되는 상추의 세균성 잎점무늬병, 및 상추 모자이크 바이러스와 같은 많은 질병에 감수성이다. 상추의 가장 중요한 진균성 질병 중에는 브레미아 락투카에 (Bremia lactucae; 상추 노균병) (Regel)에 의해 유발되는 노균병이 있다. 엘. 살리그나는 브레미아 락투카에에 대해 양적 내성을 보여서, 일반적으로 상기 난균 (oomycete)의 비-숙주 식물인 것으로 여겨지고, 상기 질병에 대한 유전적 내성의 잠재적인 공급원으로서 연구되었다.
발명의 요약
본 발명자들은 분자 및 표현형 결정 시험의 조합을 이용하여, 브레미아 락투카에에 대한 양적 내성을 갖지만, 이전에 내성 표현형과 연관된 추가의 유해한 표현형을 갖지 않는 식물주를 생산하는 방법을 예기치않게 개발하기에 이르렀다. 한 측면에서, 본 발명은 (a) 브레미아 락투카에에 대한 양적 내성을 부여하는 락투카 살리그나 (Lactuca saligna)의 RBQ5 대립유전자 (여기서, 식물은 부정지 (adventitious shoot)를 부여하는 락투카 살리그나 내의 RBQ5 대립유전자에 유전적으로 연결된 대립유전자가 결여된다), 또는 (b) 브레미아 락투카에에 대한 양적 내성을 부여하는 락투카 살리그나의 RBQ6 대립유전자 (여기서, 식물은 감소된 식물 직경 또는 거품잎 (bubbled leaf)을 부여하는 락투카 살리그나 내의 RBQ6 대립유전자에 유전적으로 연결된 대립유전자가 결여된다)를 포함하는 상추 식물을 제공한다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 RBQ5 대립유전자 및 RBQ6 대립유전자를 포함하는 것으로서 규정된 상추 식물을 제공한다.
다른 실시태양에서, 상추 식물은 LE1244 대립유전자를 포함하는 유전자이입된 (introgressed) 엘. 살리그나 구역을 포함하는 것으로서 규정된다. 식물은 또한 엘. 살리그나 LE1219 및/또는 LE0115 대립유전자가 결여될 수 있다. 다른 실시태양에서, 식물은 LE9214 및/또는 LE0017 대립유전자를 포함하는 유전자이입된 엘. 살리그나 구역을 포함하는 것으로서 규정될 수 있다. 식물은 엘. 살리그나 LE0420 대립유전자가 추가로 결여될 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 식물은 LK1475, LE1276, LE3118, LE9214, LE0420 및/또는 LE0350 대립유전자로부터 선택되는 임의의 하나 이상의 대립유전자를 포함하는 것으로서 규정될 수 있다. 추가의 실시태양에서, 상추 식물은 브레미아 락투카에에 대한 내성을 부여하는 적어도 하나의 추가의 유전자를 포함하는 것으로서 추가로 규정될 수 있고, 여기서 유전자는 DM1-DM16 및 R17-R40으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
또한 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상추 식물의 종자, 또는 세포, 종자, 뿌리, 줄기, 잎, 결구 (head), 꽃 및 꽃가루로 이루어지는 군 중에서 선택되는 다른 식물 부위를 제공하고; 여기서 종자 또는 다른 식물 부위는 RBQ5 대립유전자 및 RBQ6 대립유전자 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
특정 실시태양에서, 상추 지정번호 50066390 (상기 지정번호의 종자의 샘플은 ATCC 수탁 번호 PTA-9045 하에 기탁되었다)의 모든 생리학적 및 형태학적 특징을 발현하는 상추 식물이 제공되거나, 식물은 상추 지정번호 50070045 (상기 지정번호의 종자의 샘플은 ATCC 수탁 번호 PTA-9046 하에 기탁되었다)의 모든 생리학적 및 형태학적 특징을 발현한다. 특정 실시태양에서, 상추 지정번호 50066390 또는 상추 지정번호 50070045의 임의의 세대의 자손 (progeny) 식물인 상추 식물이 제공되고, 여기서 상추 식물은 지정번호 50066390 또는 50070045로부터 각각 브레미아 락투카에에 대한 양적 내성을 부여하는 락투카 살리그나의 RBQ6 대립유전자를 물려받고, 감소된 식물 직경 또는 거품잎을 부여하는 락투카 살리그나 내의 RBQ6 대립유전자에 유전적으로 연결된 대립유전자가 결여되거나, 또는 브레미아 락투카에에 대한 양적 내성을 부여하는 락투카 살리그나의 RBQ5 대립유전자를 물려받고, 부정지를 부여하는 락투카 살리그나 내의 RBQ5 대립유전자에 유전적으로 연결된 대립유전자가 결여된다.
다른 측면에서, 본 발명은 (a) (1) 브레미아 락투카에에 대한 양적 내성을 부여하고 식물 내에서 부정지를 부여하는 락투카 살리그나 대립유전자에 유전적으로 연결된 락투카 살리그나로부터의 RBQ5 대립유전자, 또는 (2) 브레미아 락투카에에 대한 양적 내성을 부여하고 식물 내에서 감소된 식물 직경 또는 거품잎을 부여하는 락투카 살리그나 대립유전자에 유전적으로 연결된 락투카 살리그나의 RBQ6 대립유전자에 대해 이형접합성인 락투카 식물을 얻는 단계 (여기서, 식물은 락투카 사티바 내의 상응하는 로커스 (locus)에 대해 이형접합성이다); (b) 식물의 자손을 얻는 단계; (c) 자손이 (1) RBQ5 대립유전자를 포함하지만 부정지를 부여하는 대립유전자를 포함하지 않거나, (2) RBQ6 대립유전자를 포함하지만 감소된 식물 직경 또는 거품잎을 부여하는 대립유전자를 포함하지 않도록 재조합이 일어난 적어도 제1 자손 식물을 선택하는 단계를 포함하는, 브레미아 락투카에에 대한 양적 내성을 포함하는 락투카 식물을 얻는 방법을 제공한다.
한 실시태양에서, 자손 식물 선택에 관한 방법은 (1) 엘. 살리그나의 RBQ5 대립유전자에 유전적으로 연결된 유전자 마커를 포함하고/하거나 엘. 사티바로부터의 상응하는 로커스에 존재하는 유전자 마커가 결여되어 있고, (2) 엘. 살리그나에서 부정지를 부여하는 대립유전자에 유전적으로 연결된 유전자 마커가 결여되고/되거나 엘. 사티바로부터의 상응하는 로커스에 존재하는 유전자 마커를 포함하는 자손 식물을 확인하는 것을 포함한다.
다른 실시태양에서, 자손 식물 선택에 관한 방법은 (1) 엘. 살리그나 내의 RBQ6 대립유전자에 유전적으로 연결된 유전자 마커를 포함하고/하거나 엘. 사티바로부터의 상응하는 로커스에 존재하는 유전자 마커가 결여되어 있고, (2) 엘. 살리그나에서 감소된 식물 직경 또는 거품잎을 부여하는 대립유전자에 유전적으로 연결된 유전자 마커가 결여되고/되거나 엘. 사티바로부터의 상응하는 로커스에 존재하는 유전자 마커를 포함하는 자손 식물을 확인하는 것을 포함한다.
특정 실시태양에서, 방법은 LK1475 대립유전자, LE0142 대립유전자, LE1244 대립유전자, LE7003 대립유전자, LE1276 대립유전자, LE0350 대립유전자, LE1219 대립유전자, LE0115 대립유전자, LE0204 대립유전자, LE1211 대립유전자, LE0428 대립유전자, LE0420 대립유전자, LE9214 대립유전자, LE0017 대립유전자, LK1413 대립유전자 및 LE3118 대립유전자로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 대립유전자를 검출함으로써 자손 식물을 선택하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 자손 식물은 (1) 엘. 살리그나 내의 RBQ5 대립유전자에 유전적으로 연결된 유전자 마커를 포함하고/하거나 엘. 사티바로부터의 상응하는 로커스에 존재하는 유전자 마커가 결여되어 있고, (2) 엘. 살리그나에서 부정지를 부여하는 대립유전자에 유전적으로 연결된 유전자 마커가 결여되고/되거나 엘. 사티바로부터의 상응하는 로커스에 존재하는 유전자 마커를 포함하거나; (3) 엘. 살리그나 내의 RBQ6 대립유전자에 유전적으로 연결된 유전자 마커를 포함하고/하거나 엘. 사티바로부터의 상응하는 로커스에 존재하는 유전자 마커가 결여되어 있고, (4) 엘. 살리그나에서 감소된 식물 직경 또는 거품잎을 부여하는 대립유전자에 유전적으로 연결된 유전자 마커가 결여되고/되거나 엘. 사티바로부터의 상응하는 로커스에 존재하는 유전자 마커를 포함한다.
방법은 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍(들)을 사용하는 PCR-기반 방법에 의해 대립유전자(들)을 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, LK1475 대립유전자는 서열 1 및 서열 2를 포함하는 프라이머쌍을 사용하여 검출되거나; LE1276 대립유전자는 서열 3 및 서열 4를 포함하는 프라이머를 사용하여 검출되거나; LE0350 대립유전자는 서열 5 및 서열 6을 포함하는 프라이머쌍을 사용하여 검출된다. 다른 실시태양에서, LE3118 대립유전자는 서열 7 및 서열 8을 포함하는 프라이머쌍을 사용하여 검출되고, LE9214 대립유전자는 서열 9 및 서열 10을 포함하는 프라이머쌍을 사용하여 검출되거나, LE0420 대립유전자는 서열 11 및 서열 12를 포함하는 프라이머쌍을 사용하여 검출된다.
별도의 실시태양에서, 방법은 LK1475 대립유전자, LE0142 대립유전자, LE1244 대립유전자, LE7003 대립유전자, LE1276 대립유전자, LE0350 대립유전자, LE1219 대립유전자, LE0115 대립유전자, LE0204 대립유전자, LE1211 대립유전자, LE0428 대립유전자, LE0420 대립유전자, LE9214 대립유전자, LE0017 대립유전자, LK1413 대립유전자, 및 LE3118 대립유전자로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 2개의 대립유전자를 검출함으로써 자손 식물을 선택하는 것을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 브레미아 락투카에에 대한 내성을 부여하는 대립유전자를 포함하는 염색체 분절 (chromosomal segment)을 포함하는 식물을 제공하고, 여기서 분절은 부정지, 감소된 식물 직경 및 거품잎으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 형질을 부여하는 제2 대립유전자가 결여되어 있고, 여기서 염색체 분절을 포함하는 종자의 샘플은 ATCC 수탁 번호 PTA-9045 또는 ATCC 수탁 번호 PTA-9046 하에 기탁되었다.
용어 "약"은 특정 값이 그 값을 결정하기 위해 사용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함하는 것을 나타내기 위해 사용된다. 특허청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 양자택일만을 나타내도록 명백하게 지시되지 않으면 "및/또는"을 의미하도록 사용되거나, 개시내용이 단지 양자택일을 및 "및/또는"을 나타내는 정의를 지지하더라도 양자택일은 상호 배제적이다. 특허청구범위에서 단어 "로 이루어지는" 또는 다른 개방 언어 (open language)와 함께 사용될 때, 단어 부정관사 ("a" 및 "an")는 구체적으로 언급되지 않으면 "하나 이상"을 나타낸다. 용어 "로 이루어지다", "갖는다" 및 "포함하다"는 제한이 없는 연결 동사이다. 하나 이상의 이들 동사의 임의의 형태 또는 시제, 예를 들어 "로 이루어진다", "로 이루어지는", "갖는다", "갖는", "포함하다" 및 "포함하는"은 또한 제한이 없다. 예를 들어, 하나 이상의 단계"로 이루어지거나", "갖거나", "포함하는" 임의의 방법은 하나 이상의 단계만을 갖는 것으로 제한되지 않고, 다른 나열되지 않은 단계를 또한 포괄한다. 유사하게, 하나 이상의 형질"로 이루어지거나", "갖거나", "포함하는" 임의의 식물은 하나 이상의 형질만을 갖는 것으로 제한되지 않고, 다른 나열되지 않은 형질을 포괄한다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 잇점은 다음 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 발명의 취지 및 범위 내의 각종 변화 및 변형이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이므로, 제공된 상세한 설명 및 임의의 구체적인 실시예는 본 발명의 특정 실시태양을 나타내면서, 단지 예시의 목적으로 제공되는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 도면 및 표에 연관되는 상이한 실험에 사용된 식물 물질에 대한 계통의 개요를 도시한 것이다.
도 2는 좌측에, Michelmore LG2로 불리는 락투카 연관군 (linkage group) 2로부터의 분자 마커 지도 (map)의 관련 부분을 도시한 것이다. 우측에, 유리한 형질 (질병 내성) 및 불리한 형질 (부정지 표현형)을 모두 함유하는 엘. 살리그나로부터 유전자이입된 구역을 보여주는, Seminis BIL2.2로 불리는 역교잡 순계 (Backcross Inbred Line: BIL) 2.2의 분자 마커 지도가 있다. 각각의 지도는 마커들 사이의 간격 길이 (센티모건 (cM) 단위)를 좌측에, 마커 명칭을 지도의 우측에 갖는 형식이다. 지도들 사이의 공통 마커는 밑줄을 치고 굵게 표시하고, 이들 마커의 상응하는 위치는 기호
Figure pct00001
로 표시한다.
도 3은 좌측에, Michelmore_LG8로 불리는 락투카 연관군 8로부터의 분자 마커 지도를 도시한 것이다. 우측에, 유리한 형질 (질병 내성) 및 불리한 형질 (식물 직경 및 잎 거품형성)을 모두 함유하는 엘. 살리그나로부터 유전자이입된 구역을 보여주는, Seminis_BIL6.3으로 불리는 역교잡 순계 6.3의 분자 마커 지도가 있다. 각각의 지도는 마커들 사이의 간격 길이 (센티모건 (cM) 단위)를 좌측에, 마커 명칭을 지도의 우측에 갖는 형식이다. 지도들 사이에 공통인 마커는 밑줄을 치고 굵게 표시하고, 이들 마커의 상응하는 위치는 기호
Figure pct00002
로 표시한다.
도 4는 잎 질병 증상을 보이는 잎 면적의 백분율에 의해 측정된, 평균 비. 락투카에 감염을 플로팅한 막대그래프이다. 평균은 F2 식물당 4개의 잎 디스크로부터의 것이었다. 107개의 F2 식물의 잎 디스크를 시간 경과에 따라 측정하였고, 식물당 평균을 8개의 카테고리로 나누었다. 카테고리는 감염된 잎 면적의 10% 증가 단계이다. 시험된 식물은 BIL2.2 영역 내의 F2 재조합체였다. 이들 잎 디스크를 접종 후 7-9, 12 및 16일 (dai)에 스코어링하였다.
도 5는 BIL2.2 구역에 상이한 동형접합성 재조합을 갖는 28개의 F2 식물주에서 변하는 3개의 형질, 즉 식물 직경, 부정지의 수, 및 추대 (bolting) 일자의 막대그래프 플롯을 포함한다.
도 6은 BIL6.3 구역에 상이한 동형접합성 재조합을 갖는 36개의 F2 식물주에서 변하는 3개의 형질, 즉 비. 락투카에 내성, 식물 직경, 및 잎 거품 스코어 (score)의 막대그래프 플롯을 포함한다.
도 7은 28개의 동형접합성 재조합체 F2 식물주로부터 부정지에 대한 QTL 지도작성 (mapping) 결과, 및 107개의 재조합체 F2 식물의 잎 디스크 시험으로부터 비. 락투카에 내성에 대한 QTL 지도작성 결과 (RBQ5로 불리는 QTL)를 도시한 것이다. 식물 물질은 엘. 사티바 재배종 실베스타 (cv. Sylvesta) x BIL2.2 집단으로부터 유래하였다. 좌측에 도 2에 도시된 BIL2.2 지도의 확대된 부분이 있다. 마커 위치는 지도의 우측에 있고, 마커들 사이의 지도 간격 길이는 지도의 좌측에 있고; 이들은 센티모건 (cM)으로 제시된다. 우측에 네모친 구역은 순열 검정 (permutation test)을 이용하여 계산된 유의성 임계값 (약 2의 LOD 스코어)에 비교한 LOD 스코어로서 표현한, 2개의 형질에 대한 유의성 수준을 보여준다. 임계값은 파선 (dashed) 수직선을 사용하여 표시되는 한편, 형질 스코어는 지도 위치에 따라 변하고 질병 내성에 대해 실선 및 부정지 표현형에 대해 점선으로 나타낸다. 지도와 네모 사이에 형질이 위치하는 영역을 표지한다. 이들 영역은 보다 짧고 두꺼운 구역과 보다 길고 얇은 구역을 사용하여 표지한다. 두꺼운 영역은 최고 LOD 스코어의 1 LOD 단위 내에 함유된 구역을 보여준다. 유사하게, 얇은 영역은 최고 LOD 스코어의 2 LOD 단위 내에 함유된 영역을 보여준다. 질병 내성 QTL 영역인 RBQ5는 1 및 2 LOD 단계에 대해 각각 실선 및 채워진 네모로 도시한 한편, 부정지 형질에 대해 유사한 유의한 영역은 점선 및 빗금친 네모로 도시한다.
도 8은 도 2에 제공된 지도 상에서 RBQ5 내성에 대해, 엘. 사티바 재배종 실베스타 x BIL2.2 집단으로부터의 28개의 F3 식물주의 QTL 지도작성을 도시한 것이다. 식물주는 감소된 동형접합성 BIL2.2 유전자이입을 갖는 F4 식물이다. 내성 QTL은 2007년 여름에 자연 질병 압력 하에 증상의 현장 관찰 (field observation)에 기반한다. 현장 관찰은 3개 일자 (이식 30, 37 및 43일 후)에 각각의 식물주에 대해 36개의 식물의 스코어의 평균 데이타이다. 마커의 위치를 표시하고, 간격 길이 (cM)는 연관군의 좌측에 있다. 연관군의 우측에 간격 지도작성으로부터의 LOD 플롯을 갖는 상자가 있고: 실선은 비. 락투카에 내성 형질에 대한 것이다. 플롯 내의 약 LOD = 1.5에서 일직선 점선은 순열 검정을 이용하여 계산된 유의성 임계값이다. "RBQ5"로 표시한 수직 막대는 1-LOD 드롭 (drop) (두꺼운 막대) 및 2-LOD 드롭 (얇은 막대) 간격을 나타낸다.
도 9는 엘. 사티바 재배종 실베스타 x BIL6.3 집단으로부터의 QTL 지도작성 결과를 도시한 것이다. 식물 결구 직경, 잎 거품 및 비. 락투카에 내성 (RBQ6으로 불리는 QTL)의 지도를 작성하기 위해 사용된 F2 식물주는 BIL6.3 구역에서 동형접합성 재조합체 F3 식물이었다. 좌측에 도 3에 도시된 BIL6.3 지도의 확대된 부분이 있다. 마커 위치는 지도의 우측에 있고, 마커들 사이의 지도 간격 길이는 지도의 좌측에 있고; 이들은 센티모건 (cM)으로 제시된다. 우측에 네모친 구역은 순열 검정을 이용하여 계산된 유의성 임계값에 비교한 LOD 스코어로서 표현한, 3개의 형질에 대한 유의성 수준을 보여준다. 임계값은 파선 수직선을 이용하여 도시되는 한편, 형질 스코어는 지도 위치에 따라 변하고 질병 내성에 대해 실선, 식물 직경 표현형에 대해 점선, 거품잎 표현형에 대해 파선으로 표시한다. 지도와 네모친 구역 사이에 형질이 위치하는 영역을 나타낸다. 이들 영역은 보다 짧고 두꺼운 구역과 보다 길고 얇은 구역을 사용하여 표지한다. 두꺼운 영역은 최고 LOD 스코어의 1 LOD 단위 내에 함유된 구역을 보여준다. 유사하게, 얇은 영역은 최고 LOD 스코어의 2 LOD 단위 내에 함유된 영역을 보여준다. 질병 내성 QTL 영역인 RBQ6은 1 및 2 LOD 단계에 대해 각각 실선 및 채워진 네모로 도시한 한편, 식물 직경 형질에 대한 유사한 영역은 점선 및 대각으로 빗금친 네모로 도시하고, 거품잎 형질에 대한 영역은 파선 및 수평으로 빗금친 네모로 도시한다.
도 10은 도 6의 데이타를 도 3에 제공된 지도 상에서 RBQ6 내성에 대해 엘. 사티바 재배종 실베스타 x BIL6.3 집단으로부터 15개의 F3 식물주를 사용하여 얻은 다음 해에 QTL 지도작성의 결과를 보여준다. 식물주는 BIL6.3 유전자이입이 감소된 F4 식물이다. QTL은 2007년 여름의 현장 관찰에 기초한다. 질병 현장 관찰은 자연 질병 압력 하에, 3개 일자 (이식 30, 37 및 43일 후)에 각각의 식물주에 대한 36개 식물의 스코어의 평균 데이타이다. 직경 현장 관찰은 이식 43일 후에 각각의 식물주에 대한 36개 식물의 스코어의 평균 데이타이다. 마커의 위치를 표시하고, 간격 길이 (cM)는 연관군의 좌측에 있다. 연관군의 우측에, 간격 지도작성으로부터의 LOD 플롯을 갖는 상자가 있고: 파선은 식물 직경에 대한 것이고 실선은 비. 락투카에 내성 형질에 대한 것이다. LOD 플롯 내의 일직선 파선은 순열 검정을 이용하여 계산된 유의성 임계값이다. 유의한 QTL은 수직 막대로 나타내고: 두꺼운 막대는 1-LOD 드롭 간격을 나타내고, 얇은 막대는 2-LOD 드롭 간격을 나타낸다.
도 11은 4개의 상추 식물주의 결구 크기 및 비. 락투카에 내성 반응의 양적 변동을 비교한 것이다. 좌측부터, 첫 번째 2개의 식물주는 재배종 실베스타 및 재배종 올로프 (cv. Olof)이고, 이들은 농경학상 우량 유전자원 (germplasm)을 나타내지만 브레미아에 감수성이다. 올로프는 원래의 종간 교잡 (interspecific cross) a 및 BIL을 제조하기 위해 사용된 식물주이다. 실베스타는 재조합된 유전자이입을 개발하기 위해 사용된 식물주이다. 우측으로 다음 식물주는 비. 락투카에 대한 내성과 보다 작은 직경 결구를 보이는 BIL6.3이다. 우측의 마지막 2개의 열은 식물주 Q6-7I2이다 (표 6 참조). 이 식물주는 비. 락투카에 내성 형질을 보유하지만 작은 직경 결구 및 거품 형질을 제거한 BIL6.3 구역 내의 재조합체이다. 이 식물주는 마커 LE3118 및 LE9214에 의해 특성결정된다.
본 발명은 이전에 양적 노균병 내성 형질이 전달된 것으로 밝혀진, 엘. 살리그나로부터의 유전자이입이 감소된 식물주가 또한 바람직하지 않은 농경학적 형질, 예를 들어 부정지, 감소된 식물 직경 및 거품잎을 보이지 않으면서 브레미아 락투카에에 대한 양적 내성을 보이도록, 엘. 살리그나로부터의 유전자이입을 포함하는 상추 (엘. 사티바) 식물주의 식물, 종자 및 파생물에 관련한 방법 및 조성물을 제공한다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 감소된 식물 직경, 부정지 및/또는 거품잎과 연관되는 엘. 살리그나로부터 유래된 대립유전자가 결여되는, RBQ5 및/또는 RBQ6 노균병 내성 대립유전자를 보유하는 감소된 유전자이입을 포함하는 상추 식물주에 관한 것이다. 특정 실시태양에서, 세포, 배아, 종자, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 및 꽃가루를 포함한 그러한 식물주의 식물의 부위가 또한 고려된다.
본 발명의 다른 측면은 적어도 하나의 감소된 엘. 살리그나 유전자이입을 포함하는 상추 식물주를 얻기 위한 방법에 관한 것이고, 여기서 상추 식물은 브레미아 락투카에에 대한 양적 내성을 보이지만, 부정지 또는 감소된 식물 직경 및/또는 거품잎의 생성을 부여하는 BIL2.2 및 BIL6.3 QTL이 결여된다. 특정 실시태양에서, 상기 식물을 얻기 위한 방법은 엘. 살리그나로부터의 RBQ5 및/또는 RBQ6 대립유전자(들)에 대해 이형접합성인 락투카 식물을 얻고, 상기 식물로부터 자손을 얻고, 하나 이상의 그러한 자손 식물을 선택하는 것을 포함하고, 여기서 유전자 재조합은 놀랍게도 자손이 RBQ5 및/또는 RBQ6 대립유전자를 포함하지만, 감소된 식물 직경 또는 부정지 생성을 부여하는 대립유전자를 포함하지 않도록 발생한다. 특정 실시태양에서, 방법은 RBQ5 및/또는 RBQ6 대립유전자(들)에 유전적으로 연결된 하나 이상의 유전자 마커를 확인함으로써, 그러한 대립유전자(들)을 포함하는 자손 식물을 얻는 것을 포함할 수 있다. 유전자 마커를 확인하는 것은 표현형, 유전자, 또는 생화학 시험을 포함할 수 있고, 친식물 (parent plant) 및/또는 자손 식물을, 예를 들어 본원에 기재된 하나 이상의 대립유전자, 예를 들어 엘. 살리그나로부터의 LK1475 대립유전자, 엘. 살리그나로부터의 LE0142 대립유전자, 엘. 살리그나로부터의 LE1244 대립유전자, 엘. 살리그나로부터의 LE7003 대립유전자, 엘. 살리그나로부터의 LE1276 대립유전자, 엘. 사티바로부터의 LE0350 대립유전자, 엘. 사티바로부터의 LE1219 대립유전자, 엘. 사티바로부터의 LE0115 대립유전자, 엘. 사티바로부터의 LE0204 대립유전자, 엘. 살리그나로부터의 LE3118 대립유전자, 엘. 살리그나로부터의 LK1413 대립유전자, 엘. 살리그나로부터의 LE0017 대립유전자, 엘. 살리그나로부터의 LE9214 대립유전자, 엘. 사티바로부터의 LE0420 대립유전자, 엘. 사티바로부터의 LE0428 대립유전자, 및 엘. 사티바로부터의 LE1211 대립유전자의 존재에 대해 스크리닝하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 2개 이상의 유전자 마커의 존재에 대해 스크리닝할 수 있다.
특정 실시태양에서, 방법은 연관군 2 내에서 엘. 살리그나-유래된 유전자이입을 포함하고, LE1276 또는 LE7003과 LE0142 또는 LK1475를 포함하여 그들 사이에서 지도가 작성되고 (여기서, 연관군 2 서열은 비. 락투카에에 대한 검출가능한 내성을 부여한다), 부정지의 실질적인 성장이 없는 상추 식물을 확인하는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, ≤1의 평균 부정지 스코어가 상기 방법에 따라 관찰된다. 특정 실시태양에서, 방법은 LE1276, LE7003, LE1244, LE0142 및 LK1475 중의 하나 이상의 로커스에 엘. 살리그나 대립유전자(들)을 포함하고, LE0204, LE0115, LE1219, 및 LE0350 중의 하나 이상의 로커스에 엘. 사티바 대립유전자(들)을 포함하는, 비. 락투카에 내성을 보이는 상추 식물을 확인하는 것을 포함한다.
다른 실시태양에서, 방법은 연관군 6 내에서 엘. 살리그나-유래된 유전자이입을 포함하고, 로커스 LE0420과 LE3118 사이에서 지도가 작성되고, LK1413, LE0420, LE3118, LE0117 및 LE9214를 포함하는 (여기서, 연관군 6 서열은 브레미아 락투카에에 대한 내성을 부여한다) 상추 식물을 확인하는 것을 또한 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 브레미아 락투카에에 대한 내성을 포함하는 본 발명의 식물은 내성을 부여하는 대립유전자에 유전적으로 연결된 제2 대립유전자가 결여되어 있고, 여기서 상기 제2 대립유전자는 감소된 식물 직경 및 거품잎 중에서 선택되는 적어도 하나의 형질을 부여한다. 당업자는 브레미아 락투카에에 대한 내성, 감소된 식물 직경, 및 거품잎과 같은 형질의 발현이 환경 조건에 따라 다를 수 있지만, 그러한 형질은 동일하거나 유사한 환경 하에 재배된 다른 식물에 대해 결구 대 결구 비교를 이용하여 쉽게 확인될 수 있음을 알 것이다. 한 실시태양에서, 표현형 형질 값이 지정될 수 있지만, 수치는 상기 언급한 환경 영향 및 신뢰가능한 결구 대 결구 비교를 실시하는 능력을 고려할 때 절대적인 값은 아니다. 그러한 측정치의 예는 약 2 미만의 비. 락투카에 내성 표현형; 약 2.5 미만의 거품잎 측정치; 및 약 33 cm 이상의 식물 직경을 포함한다. 다른 특정 실시태양에서, 본 발명은 LE9214, LE0017, LK1413 중의 하나 이상의 로커스에 엘. 살리그나 대립유전자를; LE1211, LE0428, LE0420 중의 하나 이상의 로커스에 엘. 사티바 대립유전자를 포함하는, 브레미아 락투카에에 대한 내성을 보이는 상추 식물을 확인하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 한 특정 실시태양에서, 그러한 식물은 ≤2의 비. 락투카에 내성 표현형, ≤ 2.5의 거품잎 측정치, 및 약 33 cm 이상의 식물 직경을 포함한다. 또한 추가의 실시태양에서, 본원에서 제공되는 식물은 ≤1의 평균 부정지 스코어를 포함한다.
바람직하지 않은 효과 없이 브레미아에 대한 양적 내성을 재배 상추 내로 도입하지 못하는 것의 예시는 종간 엘. 사티바 x 엘. 살리그나 교잡으로부터 개발된 식물주이다. 이들 연구에서, 브레미아에 대한 양적 내성을 함유하는 엘. 살리그나 수탁 번호 CGN05271을 감수성 재배 엘. 사티바 식물주인 재배종 '올로프'와 교잡되었다. 올로프 식물주에 대한 반복 역교잡에 이은 자가수분 (selfing)에 의해 일련의 역교잡 순계 (BIL)가 생산되었다 (Jeuken et al. 2004). RBQ5 및 RBQ6은 본 연구에서 확인된 내성 QTL이었고, BIL2.2 및 BIL6.3에서 각각 발견된다. 10년간의 연구에도 불구하고 ([Jeuken et al., 2001], [Jeuken et al., 2002a], [Jeuken et al., 2002b], [Jeuken et al., 2004], [Jeuken et al., 2008]), 식물 직경, 잎 거품형성 및 부정지와 같은 원예 결함 없이 질병 내성 표현형을 보유한 식물주가 생성될 수 없었다. 재배화된 (domesticated) 종의 야생 근연종으로부터의 대부분의 유전자이입은 상업적으로 허용되는 품종을 생성시키지 못하므로, 이것은 가능한 결과였다. 이러한 실패는 종종 다면발현 (pleiotropy)에 기인한다. 변경된 잎, 뿌리 형태학 또는 다른 식물 표현형, 예를 들어 식물 직경이 식물 내로 병원체의 정상적인 도입을 변경시킬 수 있고, 따라서 바람직하지 않은 농경학적 형질이 동시-위치된 질병 내성 형질로부터 분리될 수 없을 것임을 쉽게 추측할 수 있다.
부정지, 감소된 식물 직경 및 거품잎과 같은 바람직하지 않은 형질은 원래의 BIL2.2 및 BIL6.3 유전자이입 내에 바람직한 노균병 내성 형질과 동시-위치하는 것으로 밝혀졌다. 이들 바람직하지 않은 형질의 존재는 상기 양적 내성을 상추 육종에 적용하는 것을 방해하였다. 그러나, 본 발명에서는 QTL을 바람직하지 않은 형질에 대해 명시하는 엘. 살리그나 유래 구역이 결여되면서, 질병 내성을 부여하는 엘. 살리그나로부터의 원래 유전자이입된 구역의 일부를 포함하는 재조합체 자손 상추 식물 및 자손에 대한 효율적 스크리닝 및 확인을 입증한다.
"감소된" 유전자이입의 형성은 RBQ5 또는 RBQ6 QTL(들) 부근에서 재조합 사건(들)에 의해 유발되는 것으로 이해된다. 감소된 BIL2.2 및/또는 BIL6.3 유전자이입을 포함하는, 즉, 노균병 내성을 명시하는 QTL에 가까운 재조합 사건을 겪은 식물주는 분자 및/또는 표현형 마커를 사용하여 효율적으로 스크리닝될 수 있다. 따라서, BIL2.2 및/또는 BIL6.3 유전자이입에 의해 명시되는 QTL에 관하여 분리되는 (즉, 이형접합성인) 식물 집단 또는 그러한 집단의 자손이, 예를 들어 본원에서 설명된 엘. 살리그나 QTL(들)과 연관된 감소된 식물 직경 또는 부정지 표현형의 결여와 조합되어, 재조합 표현형, 예를 들어 노균병 내성을 갖는 식물에 대해 스크리닝될 수 있다.
락투카 살리그나 (야생 상추)는 모든 노균병 품종에 내성이고 병원체의 비-숙주인 것으로 생각될 수 있으므로, 엘. 살리그나는 상추에서 노균병 병원체에 대한 유전자-기반 내성을 위한 뛰어난 공급원이다. 엘. 살리그나의 다수의 수탁물 (예를 들어 CGN05271, 및 CGN05327, LSA/92/1 등)이 예를 들어, 센터 포 지네틱 리소시스 (Center for Genetic Resources, 네덜란드 바게닝겐)으로부터 이용가능하다. 엘. 살리그나의 노균병 내성은 품종-특이적이 아니고 (예를 들어, [Lebeda et al., 2002]), 따라서 전형적인 품종-특이적 내성보다 더 오래갈 수 있다.
따라서, 특정 양적 내성 로커스 (유전자이입 BIL2.2 또는 BIL6.3 내에 위치하는)가 반결구 상추 배경 (엘. 사티바 재배종 올로프 및 재배종 실베스타)에서 노균병 내성을 부여하는 2개의 엘. 살리그나 유전자이입에 대해 지도작성되었다. 또한, 양적 노균병 내성을 명시하지만 바람직하지 않은 농경학적 형질을 명시하는 이들 유전자이입의 부분이 결여된 2개 이상의 감소된 유전자이입의 조합은 실질적인 수준의 노균병 내성을 생성할 수 있고, 이는 유전자-대-유전자 상호작용을 통해 작동하는 특이적 단일 내성 유전자 (예를 들어 Dm 유전자 및 R-유전자)에 의해 부여되는 질적 내성과 기계론상 상이할 것이다. 추가로, 노균병 내성의 양적 및 질적 공급원은 재배 상추에서 바람직한 농경학적 형질을 유지하면서 비. 락투카에 내성에 대한 육종 전망을 추가로 개선하기 위해 조합될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 하나 이상의 RBQ5 및/또는 RBQ6을 보유하는 상추 식물주는 비제한적으로 특히 브레미아 락투카에에 대한 질적 내성을 명시하는 하나 이상의 R 유전자, 예를 들어 DM1-DM16 및 R17-R40을 포함하는 상추 식물주와 교잡될 수 있다.
A. 노균병 내성을 보이는 상추 식물주의 육종
본 발명의 한 측면은 양적 노균병 내성을 부여하는 감소된 엘. 살리그나 유전자이입을 포함하는 상추 식물주를 자신과 또는 제2 식물과 교잡하기 위한 방법, 및 그러한 방법에 의해 생산된 종자 및 식물에 관한 것이다. 이들 방법은 이전에 내성 형질과 연관된 농경학상 바람직하지 않은 형질을 보이지 않으면서 양적 노균병 내성을 보이는 재배 상추 식물주의 생산 및 증식을 위해 사용될 수 있다. 방법은 또한 하이브리드 (hybrid) 상추 종자 및 그로부터 재배된 식물을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 하이브리드 종자는 그러한 식물주를 제2 상추 친식물주와 교잡함으로써 생산된다.
노균병 내성의 공급원은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 특정 실시태양에 따라 사용될 수 있다. 하나의 그러한 예는 락투카 살리그나 수탁 번호 CGN05271이고, 이는 센터 포 지네틱 리소시스로부터 입수할 수 있다. 다른 노균병 내성 공급원도 문헌에서 설명되었고 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ([Lebeda et al., 1995]; [Bonnier et al., 1992]; [Gustafsson, 1989]; [Jeuken et al., 2002b]; 및 [Netzer, 1976]) 참조).
본 발명에 따라, 신규한 품종은 노균병 내성 식물주를 교잡시킨 후, 요구되는 세대의 선택 및 균일한 식물주의 개발을 위한 동계교배에 의해 생성할 수 있다. 새로운 품종은 임의의 제2 식물과 교잡함으로써 또한 생성할 수 있다. 신규한 식물주의 개발을 위한 교잡을 위해 상기 제2 식물을 선택하는데 있어서, 자체가 하나 이상의 선택된 바람직한 특징을 보이는, 또는 하이브리드 조합될 때 목적하는 특징(들)을 보이는 식물을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 일단 초기 교잡이 이루어진 후, 동계교배 및 선택이 일어나 새로운 품종을 생산한다. 균일한 식물주의 개발을 위해, 종종 5 이상의 세대의 자가수분 및 선택이 일반적으로 포함된다.
새로운 품종의 균일한 식물주는 또한 복반수체 (doubled-haploid)에 의해 개발될 수 있다. 이 기술은 다수의 세대의 자가수분 및 선택을 필요로 하지 않으면서 순종 (true breeding) 식물주의 생성을 허용한다. 상기 방식으로, 순종 식물주는 적게는 1 세대에서 생산될 수 있다. 반수체 배아는 소포자, 꽃가루, 꽃밥 (anther) 배양, 또는 자방 (ovary) 배양으로부터 생산될 수 있다. 이어서, 반수체 배아는 자발적으로 또는 화학적 처리 (예를 들어 콜히친 처리)에 의해 배수화될 수 있다. 별법으로, 반수체 배아는 반수체 식물로 재배되고, 염색체 배수화를 유도하도록 처리될 수 있다. 두 경우에, 생식가능한 동형접합성 식물이 얻어진다. 본 발명에 따라, 임의의 상기 기술이 동형접합성 식물주를 달성하기 위해 본 발명의 노균병 내성 식물주 및 그의 자손과 연관하여 사용될 수 있다.
순계 식물을 개선하기 위해 역교잡이 또한 사용될 수 있다. 역교잡은 특이적인 바람직한 형질, 예를 들어 노균병 내성을 하나의 순계 또는 비-순계 공급원으로부터 그 형질이 결여된 순계로 전달한다. 이는 예를 들어, 먼저 우수한 순계 (A) (반복친 (recurrent parent))를 해당 형질에 대한 적절한 로커스(들)을 보유하는 공여 순계 (비-반복친)에 교잡시킴으로써 달성할 수 있다. 이어서, 상기 교잡의 자손을 우수한 반복친 (A)에 역교배시킨 후, 비-반복친으로부터 전달시킬 목적하는 형질에 대해 생성된 자손을 선택한다. 목적하는 형질에 대해 선택하면서 5 이상의 역교잡 세대 후에, 자손은 전달되는 특징을 제어하는 로커스에 대해 이형접합성이지만, 대부분 또는 거의 모든 다른 로커스에 대해서는 우수한 친식물과 같다. 마지막 역교잡 세대는 자가수분되어 전달되는 형질에 대해 순종 자손을 제공할 것이다.
적합한 반복친의 선택은 성공적인 역교잡 절차를 위한 중요한 단계이다. 역교잡 프로토콜의 목표는 원래 품종 내의 단일 형질 또는 특징을 변경 또는 치환하는 것이다. 이들 달성하기 위해, 반복 품종의 단일 로커스를 원래 품종의 본질적으로 모든 나머지의 목적하는 유전자, 따라서 목적하는 생리학적 및 형태학적 구성을 보유하면서 비-반복친으로부터의 목적하는 로커스로 변형 또는 치환시킨다. 특정 비-반복친의 선택은 역교잡의 목적에 따라 결정될 것이고; 주목적의 하나는 일부 상업적으로 바람직한 형질을 식물에 부가하는 것이다. 정확한 역교잡 프로토콜은 적절한 시험 프로토콜을 결정하기 위해 변경되는 특징 또는 형질에 따라 결정될 것이다. 역교잡 방법은 전달되는 특징이 우성 대립유전자인 경우에 단순하지만, 열성 대립유전자가 또한 전달될 수 있다. 이 경우에, 목적하는 특징이 성공적으로 전달되었는지 결정하기 위해 자손의 시험을 도입할 필요가 있을 수 있다.
상추 품종은 또한 2 초과의 친식물로부터 개발될 수 있다. 변형 역교잡으로 공지된 기술에서는 역교잡 동안 상이한 반복친들을 사용한다. 변형 역교잡은 원래의 반복친을 보다 바람직한 특정 특징을 갖는 품종으로 교체하기 위해 사용될 수 있거나, 각각으로부터 상이한 바람직한 특징을 얻기 위해 다수의 친식물이 사용될 수 있다.
상추에 대한 많은 유전자 개선 프로그램은 형태 및 원예 성능, 예를 들어 색상, 크기, 맛 및 결구 형상뿐만 아니라 질병 내성/저항성 (예를 들어, 바이러스, 진균 및 세균) 및 수확후 문제에 집중된다 (Ryder, 1986). 다른 목적은 결구 형성의 균일성 및 조기성 (earliness)이고, 따라서 수율을 개선하는 것이다. 상추는 토양, 온도, 일광 노출 및 수질에 관하여 다양한 환경에서 재배되므로, 이들 환경에 대한 적응이 또다른 목표이다. 특정 열-유도된 외상, 예를 들어 열 휴면, 조기 추대 및 잎끝마름이 또한 그러한 저항성 또는 내성을 보이는 식물주의 개발을 위해 육종 프로그램에서 표적이 될 수 있다.
상기 설명된 바와 같이, 본 발명의 상추 식물주는 양적 노균병 내성, 및 개선된 평균 식물 직경 (예를 들어, 엘. 살리그나에 비해)을 포함하는 바람직한 농경학상 형질을 보인다. 그러한 식물주의 이들 특징 및 다른 품질 특징은 친식물 및 자매 식물주에 비해 분석될 수 있다. 그러한 분석의 결과를 표 5 및 6에 제시한다.
새로운 순계의 개발에서 규칙적으로 선택되지 않지만, 역교잡 기술에 의해 개선될 수 있는 많은 단일 로커스 형질이 확인되었다. 단일 로커스 형질은 트랜스제닉 (transgenic)일 수 있거나 그렇지 않을 수 있고; 이들 형질의 예는 웅성 불임, 제초제 내성, 세균, 진균 또는 바이러스 질병에 대한 내성, 곤충 내성, 웅성 임성 (fertility)의 회복, 변형된 지방산 또는 탄수화물 대사, 및 향상된 영양 품질을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 이들은 핵을 통해 일반적으로 유전되는 유전자를 포함한다.
직접적인 선택은 단일 로커스가 우성 형질로서 작용하는 경우에 적용될 수 있다. 육종을 위한 상추 식물의 선택은 반드시 식물의 표현형에 의존성인 것은 아니고, 대신에 유전자 조사에 기초할 수 있다. 예를 들어, 관심있는 형질에 밀접하게 유전적으로 연결된 적합한 유전자 마커를 이용할 수 있다. 이들 마커 중 하나는 특정 교잡의 자손에서 형질의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 사용될 수 있고, 계속적인 육종을 위한 자손의 선택에서 사용될 수 있다. 이 기술은 마커 보조된 선택으로서 일반적으로 칭해진다. 식물 내에 관심있는 형질의 상대적인 존재 또는 부재를 확인할 수 있는 임의의 다른 종류의 유전자 마커 또는 다른 분석이 또한 육종 목적을 위해 유용할 수 있다.
마커 보조된 선택을 위한 절차는 주어진 형질의 유전자이입을 위해 특히 유용하다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 유전자 마커의 종류는 단순 서열 길이 다형성 (SSLP) (Williams et al., 1990), 절단된 증폭된 다형성 서열 (CAP) (예를 들어, [Konieczny and Ausubel, 1993]), 무작위로 증폭된 다형성 DNA (RAPD), DNA 증폭 지문법 (DAF), 서열 특성결정된 증폭된 구역 (SCAR), 임의 프라이밍된 (Arbitrary Primed) 중합효소 연쇄 반응 (AP-PCR), 증폭된 단편 길이 다형성 (AFLP) (그 전문이 본원에 구체적으로 참조로 포함되는 EP 534 858), 및 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) (Wang et al., 1998)을 포함하지만 반드시 이에 제한되지는 않는다.
B. 유전공학에 의해 본 발명의 상추 식물주로부터 유래된 식물
역교잡에 의해 및 직접 식물 내로 도입될 수 있는 많은 유용한 형질은 유전자 형질전환 기술에 의해 도입될 수 있는 것이다. 그러므로, 유전자 형질전환은 선택된 트랜스젠 (transgene)을 본 발명의 상추 식물주 내로 삽입하기 위해 사용될 수 있거나, 별법으로, 역교잡에 의해 도입될 수 있는 트랜스젠의 제조를 위해 사용될 수 있다. 상추를 포함한 식물의 형질전환 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
상추 세포의 형질전환을 위해 사용되는 벡터는 벡터가 세포 내에서 삽입된 DNA를 발현시킬 수 있는 한 제한되지 않는다. 예를 들어, 상추 세포에서 구성적 유전자 발현을 위한 프로모터 (예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터) 및 외부 자극에 의해 유도가능한 프로모터를 포함하는 벡터를 사용할 수 있다. 적합한 벡터의 예는 pBI 바이너리 (binary) 벡터를 포함한다. 벡터를 도입시킬 "상추 세포"는 다양한 형태의 상추 세포, 예를 들어 배양 세포 현탁액, 원형질체, 엽편 및 캘러스 (callus)를 포함한다.
벡터는 공지의 방법, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 방법, 다가양이온 (polycation) 방법, 전기천공, 아그로박테리움 (Agrobacterium)-매개 전달, 입자 폭격 (bombardment) 및 원형질체에 의한 직접적 DNA 흡수에 의해 상추 세포 내로 도입될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Pang et al. (1996)] 참조).
전기천공에 의해 형질전환을 수행하기 위해, 부서지기 쉬운 조직, 예를 들어 세포 또는 배아형성 캘러스의 현탁 배양액을 사용할 수 있거나, 별법으로 미성숙 배아 또는 다른 유기화 조직을 직접 형질전환시킬 수 있다. 이 기술에서, 선택된 세포의 세포벽을 펙틴 분해 효소 (펙토리아제)에 노출시킴으로써 부분적으로 파괴하거나, 조직을 제어된 방식으로 기계적으로 손상시킬 것이다. 상추 원형질체의 전기천공의 예는 문헌 [Chupeau et al. (1989)]에 제시되어 있다.
형질전환 DNA 분절을 식물 세포에 전달하기 위한 특히 효율적인 방법은 미세입자투사법 (microprojectile bombardment)이다. 이 방법에서, 입자는 핵산으로 코팅되고, 추진력에 의해 세포 내로 전달된다. 예시적인 입자는 텅스텐, 백금, 및 바람직하게는 금으로 이루어진 것을 포함한다. 폭격을 위해, 현탁액 내의 세포를 필터 또는 고체 배양 배지 상에 농축시킨다. 별법으로, 미성숙 배아 또는 다른 표적 세포를 고체 배양 배지 상에 배열시킬 수 있다. 폭격시킬 세포를 미세입자투사 정지판 아래에 적절한 거리에 배치한다.
가속에 의해 DNA를 식물 세포 내로 전달하기 위한 방법의 예시적인 실시태양은 Biolistics® 입자 전달 시스템이고, 이는 DNA 또는 세포로 코팅된 입자를 스크린, 예를 들어 스테인레스 스틸 또는 NYTEX 스크린을 통해 표적 상추 세포로 덮인 표면 상으로 추진하기 위해 사용될 수 있다. 스크린은 입자가 수여 세포에 큰 응집물로 전달되지 않도록 입자를 분산시킨다. 투사 장치와 폭격할 세포 사이에 개입하는 스크린은 투사체 응집물의 크기를 감소시키고, 너무 큰 투사체에 의해 수여 세포 상에 가해지는 손상을 감소시킴으로써 보다 높은 빈도의 형질전환에 기여할 수 있는 것으로 생각된다.
미세입자투사 기술은 널리 적용가능하고, 실질적으로 임의의 식물 종을 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다. 상추를 사용하는 미세입자투사법 형질전환을 포함하는 예는 예를 들어 문헌 ([Elliott et al. (2004)] 및 [Molinier et al. (2002)])에서 찾을 수 있다.
아그로박테리움-매개 전달은 유전자 로커스를 식물 세포 내로 도입하기 위한 또다른 널리 적용가능한 시스템이다. 이 기술의 잇점은 DNA가 전체 식물 조직 내로 도입되어, 원형질체로부터 무손상 (intact) 식물을 재생할 필요를 건너뛸 수 있다는 점이다. 현재의 아그로박테리움 형질전환 벡터는 이. 콜라이 (E. coli) 및 아그로박테리움 (및 다른 리조비아 (Rhizobia)) 내에서 복제할 수 있어서, 편리한 조작을 허용한다 ([Klee et al., 1985]; [Broothaerts et al., 2005]). 또한, 아그로박테리움-매개 유전자 전달을 위한 벡터에서 최근의 기술적인 진보는 다양한 폴리펩티드 코딩 유전자를 발현할 수 있는 벡터의 제작을 용이하게 하도록 벡터 내에서 유전자 및 제한 부위의 배열을 개선시켰다. 설명된 벡터는 삽입된 폴리펩티드 코딩 유전자의 직접 발현을 위한 프로모터 및 폴리아데닐화 부위가 측면에 접하는 편리한 다수-링커 (linker) 구역을 갖는다. 추가로, 발암 (armed) 및 비발암 (disarmed) Ti 유전자를 모두 함유하는 아그로박테리움이 형질전환을 위해 사용될 수 있다.
아그로박테리움-매개 형질전환이 효율적인 식물주에서, 이 형질전환은 유전자 로커스 전달의 용이하고 규정된 성질 때문에 선택된다. DNA를 식물 세포 내로 도입하기 위한 아그로박테리움-매개 식물 통합 벡터의 사용은 당업계에 잘 공지되어 있다 (Fraley et al., 1985; 미국 특허 5,563,055). 예를 들어, 미국 특허 5,349,124에서는 아그로박테리움-매개 형질전환을 이용하여 상추 식물 세포를 형질전환시키는 방법을 설명하고 있다. 나비목 유충 (Lepidopteran larvae)에 대한 단백질 독성을 발현하는 전장 B.t. 독소 단백질을 코딩하는 DNA 코딩 서열을 갖는 키메라 (chimera) 유전자를 삽입함으로써, 상기 방법은 상기 곤충에 내성을 갖는 상추를 생성시켰다.
식물 원형질체의 형질전환은 인산칼슘 침전, 폴리에틸렌 글리콜 처리, 전기천공, 및 이들 처리의 조합에 기초한 방법을 이용하여 또한 달성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Potrykus et al., 1985]; [Omirulleh et al., 1993]; [Fromm et al., 1986]; [Uchimiya et al., 1986]; [Marcotte et al., 1988]). 식물의 형질전환 및 외래 유전자 요소의 발현은 문헌 ([Choi et al. (1994)] 및 [Ellul et al. (2003)])에서 예시된다.
선택가능한 마커, 스코어링가능 마커, 병해충 (pest) 저항성, 질병 내성, 영양 향상에 대한 유전자 및 농경학상 중요한 임의의 다른 유전자를 포함하고 이로 제한되지 않는 관심있는 임의의 유전자의 식물 유전자 발현을 위해 많은 프로모터가 효용을 갖는다. 상추 식물 유전자 발현을 위한 유용한 구성적 프로모터의 예는 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) P-35S 프로모터 (이는 단자엽식물을 포함한 대부분의 식물 조직에서 구성적인 고수준 발현을 부여한다 (예를 들어, [Odel et al., 1985] 참조)) (예를 들어, [Dekeyser et al., 1990]; [Terada and Shimamoto, 1990] 참조); CaMV 35S 프로모터의 순차 중복된 (tandemly duplicated) 버전, 향상된 35S 프로모터 (P-e35S), 노팔린 합성효소 프로모터 (An et al., 1988), 옥토핀 합성효소 프로모터 (Fromm et al., 1989); 및 미국 특허 5,378,619에 설명된 현삼 (figwort) 모자이크 바이러스 (P-FMV) 프로모터, 및 FMV 프로모터의 향상된 버전 (P-eFMV) (여기서 P-FMV의 프로모터 서열은 순차 중복된다), 콜리플라워 모자이크 바이러스 19S 프로모터, 사탕수수 간상 (bacilliform) 바이러스 프로모터, 닭의장풀 (commelina) 황반 바이러스 프로모터, 및 식물 세포에서 발현하는 것으로 알려진 다른 식물 DNA 바이러스 프로모터를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
환경, 호르몬, 화학적 및/또는 발달 신호에 반응하여 조절되는 다양한 식물 유전자 프로모터, 예를 들어 (1) 열 (Callis et al., 1988), (2) 빛 (예를 들어, 완두콩 rbcS-3A 프로모터 [Kuhlemeier et al., 1989]; 옥수수 rbcS 프로모터 [Schaffner and Sheen, 1991]; 또는 엽록소 a/b-결합 단백질 프로모터 [Simpson et al., 1985]), (3) 호르몬, 예를 들어 아브시스산 (abscisic acid) (Marcotte et al., 1989), (4) 상처 (예를 들어, wun1 [Siebertz et al., 1989]); 또는 (5) 화학물질, 예를 들어 메틸 자스모네이트, 살리실산, 또는 세이프너 (Safener)에 의해 조절되는 프로모터가 식물 세포에서 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 위해 사용될 수 있다. 기관-특이적 프로모터를 사용하는 것이 또한 유리할 수 있다 (예를 들어, [Roshal et al., 1987]; [Schernthaner et al., 1988]; [Bustos et al., 1989]).
본 발명의 상추 식물주에 도입될 수 있는 예시적인 핵산은 예를 들어, 다른 종으로부터의 DNA 서열 또는 유전자, 또는 심지어 동일한 종에서 기원하거나 그에 존재하는 유전자 또는 서열을 포함하지만, 전통적인 생식 또는 육종 기술보다는 유전공학적 방법에 의해 수여 세포 내로 포함된다. 그러나, 용어 "외인성"은 또한 형질전환되는 세포 내에 정상적으로 존재하지 않거나 아마도 단순히 형질전환하는 DNA 분절 또는 유전자에서 발견되는 것과 같은 형태, 구조 등으로 존재하지 않는 유전자, 또는 정상적으로 존재하고 자연 발현 패턴과 상이한 방식으로 발현시키고자, 예를 들어, 과다발현시키고자 하는 유전자를 나타내도록 의도된다. 따라서, 용어 "외인성" 유전자 또는 DNA는 유사한 유전자가 수여 세포 내에 이미 존재할 수 있는지와 무관하게 수여 세포 내로 도입되는 임의의 유전자 또는 DNA 분절을 나타내도록 의도된다. 외인성 DNA에 포함되는 DNA의 종류는 식물 세포 내에 이미 존재하는 DNA, 다른 식물로부터의 DNA, 상이한 유기체로부터의 DNA, 또는 외부에서 생성된 DNA, 예를 들어 유전자의 안티센스 메시지를 함유하는 DNA 서열, 또는 유전자의 합성 또는 변형된 버전을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다.
수천은 아니더라도 수백 개의 많은 상이한 유전자가 공지되어 있고, 본 발명에 따른 상추 식물 내로 잠재적으로 도입될 수 있다. 상추 식물 내로 도입하도록 선택할 수 있는 특정 유전자 및 상응하는 표현형의 비-제한적인 예는 곤충 저항성을 위한 하나 이상의 유전자, 예를 들어 바실러스 써링기엔시스 (Bacillus thuringiensis) (B.t.) 유전자, 병해충 저항성, 예를 들어 진균성 질병 제어를 위한 유전자, 제초제 저항성, 예를 들어 글리포세이트 저항성을 부여하는 유전자, 및 품질 개선, 예를 들어 수율, 영양 향상, 환경 또는 스트레스 저항성, 또는 식물 생리학, 성장, 발달, 형태 또는 식물 생성물(들)에서 임의의 바람직한 변화를 위한 유전자를 포함한다. 예를 들어, 구조적 유전자는 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 WO 99/31248, 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 5,689,052, 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 5,500,365 및 5,880,275에 설명된 바와 같이 바실러스 곤충 제어 단백질 유전자를 포함하고 이로 제한되지 않는 곤충 저항성을 부여하는 임의의 유전자를 포함할 것이다. 다른 실시태양에서, 구조적 유전자는 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 5,633,435에 설명된 바와 같이 아그로박테리움 균주 CP4 글리포세이트 내성 EPSPS 유전자 (aroA:CP4), 또는 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 5,463,175에 설명된 바와 같이 글리포세이트 옥시도리덕타제 유전자 (GOX)를 포함하고 이로 제한되지 않는 유전자에 의해 부여되는 것과 같은 제초제 글리포세이트에 대한 저항성을 부여할 수 있다.
별법으로, DNA 코딩 서열은 예를 들어 안티센스- 또는 동시억제-매개 메카니즘을 통해 내인성 유전자 발현의 표적화된 억제를 일으키는 비-번역가능한 RNA 분자를 코딩함으로써 이들 표현형에 영향을 미칠 수 있다 (예를 들어, [Bird et al., 1991] 참조). RNA는 또한 목적하는 내인성 mRNA 생성물을 절단하도록 공학처리된 촉매 RNA 분자 (즉, 리보자임)일 수 있다 (예를 들어, [Gibson and Shillito, 1997] 참조). 따라서, 관심있는 표현형 또는 형태 변화를 발현하는 단백질 또는 mRNA를 생성하는 임의의 유전자가 본 발명의 실시를 위해 유용하다.
C. 기원 및 육종 역사
친식물 지정번호 50070045 (F5 세대)는 엘. 사티바 재배종 실베스타를 엘. 살리그나 CGN05271과 엘. 사티바 재배종 올로프의 교잡으로부터 유래된 역교잡 순계 (BIL)와 교잡시킨 후 반복된 자가수분에 의해 유래되었고 (Jeuken, 2004), 여기서 RBQ5에서 설명된 재조합을 표시하는 유전자 마커가 선택되었다. 지정번호 50066390 (F3 세대)는 엘. 사티바 재배종 실베스타를 엘. 살리그나 CGN05271과 엘. 사티바 재배종 올로프의 교잡으로부터 유래된 역교잡 순계 (BIL)와 교잡시킨 후 반복 자가수분에 의해 유래되었고 (Jeuken, 2004), 여기서 RBQ6에서 설명된 재조합을 표시하는 유전자 마커를 선택하였다. 50066390 및 50070045의 종자의 샘플은 ATCC에 각각 수탁 번호 PTA-9045 및 PTA-9046 하에 기탁되었다.
D. 정의
본원의 설명 및 표에서, 많은 용어가 사용된다. 명세서 및 특허청구범위의 명백하고 일관적인 이해를 제공하기 위해 다음 정의를 제공한다:
부정지 스코어: 2차 눈 (즉, 비-끝눈)으로부터 나오는 신초 (shoot)의 평균 수의 계수.
대립유전자: 모든 대립유전자가 하나의 형질 또는 특징에 관련되는 유전자 로커스의 임의의 하나 이상의 대체 형태. 2배체 (diploid) 세포 또는 유기체에서, 주어진 유전자의 2개의 대립유전자는 한 쌍의 상동 염색체 상의 상응하는 로커스에 위치한다.
역교잡: 육종자가 하이브리드 자손, 예를 들어 제1 세대 하이브리드 (F1)를 하이브리드 자손의 친식물 중 하나로 다시 반복적으로 교잡시키는 과정. 역교잡은 하나 이상의 단일 로커스 전환을 하나의 유전적 배경으로부터 다른 것으로 도입하기 위해 사용될 수 있다.
거품잎 스코어: 1-5의 스케일을 기초로 한 거품잎 표현형에 대한 평균 평가 (rating)의 계수 - 여기서 1은 재배종 실베스타에서 전형적으로 발견되는 것과 같은 거의 평평한 잎을 나타내는 반면, 5는 BIL6.3을 포함하는 식물주에서 발견되는 것과 같이 고도의 거품잎을 나타낸다. 측정은 식재 후 약 47일에 이루어졌다.
재배 상추: 소비에 적합하고 상업적인 재배를 위한 요건을 충족하는, 예를 들어 전형적으로 락투카 사티바로서 분류되는 상추. 상추 식물 자체, 및 소비에 적합한 그의 부위, 예를 들어 결구 또는 잎에 추가로, 본 발명은 증식에 적합한 식물의 부위 또는 파생물을 포함한다. 증식에 적합한 부위의 예는 기관 조직, 예를 들어 잎, 줄기, 뿌리, 신초 등, 원형질체, 체세포 배아, 꽃밥, 잎꼭지, 배양 세포 등이다. 증식에 적합한 파생물은 예를 들어 종자이다. 본 발명에 따른 식물은 통상적인 방식으로, 또한 식물 부위로부터 조직 배양 기술에 의해 재배 또는 증식될 수 있다.
교잡: 2개의 친식물의 교배.
타가-수분: 상이한 식물로부터 2개의 생식세포의 연합에 의한 수정.
2배체: 2개 세트의 염색체를 갖는 세포 또는 유기체.
제웅 ( emasculate ): 식물 웅성 생식 기관의 제거, 또는 웅성 불임을 부여하는 세포질 또는 핵 유전 인자, 또는 화학 물질을 사용한 기관의 불활성화.
효소: 생물학적 반응에서 촉매로서 작용할 수 있는 분자.
F 1 하이브리드: 2개의 비동원(nonisogenic) 식물의 교잡의 제1 세대 자손.
유전자형: 세포 또는 유기체의 유전자 구성.
반수체: 2배체 내의 2개 세트의 염색체 중 하나의 세트를 갖는 세포 또는 유기체.
연관: 동일한 염색체 상의 대립유전자들이, 그들의 전달이 독립적인 경우에 우연히 예상되는 것보다 더 자주 함께 분리되는 경향이 있는 현상.
마커: 환경적 분산 성분이 없이, 즉, 1의 유전율로, 바람직하게는 공동-우성 방식으로 유전되는 쉽게 검출가능한 표현형 (2배체 이형접합체 내의 로커스에서 두 대립유전자는 쉽게 검출가능하다).
표현형: 세포 또는 유기체의 검출가능한 특징으로서, 상기 특징은 유전자 발현의 표현이다.
양적 형질 로커스 ( QTL ): 양적 형질 로커스 (QTL)는 대체로 계속 분포되는 일정 정도의 수치로 표현가능한 형질을 제어하는 유전자 로커스를 나타낸다.
재조합 사건은 감수분열 유전자교차 (crossing-over)를 의미하는 것으로 이해된다.
재생: 조직 배양액으로부터 식물의 발생.
자가-수분: 동일한 식물의 꽃밥으로부터 암술머리로 꽃가루의 전달.
단일 로커스 전환된 (전환) 식물: 역교잡으로 불리는 식물 육종 기술에 의해 발생되는 식물로서, 여기서 역교잡 기술을 통해 및/또는 유전자 형질전환에 의해 품종 내로 전달된 단일 로커스의 특징에 추가로, 상추 품종의 본질적으로 모든 목적하는 형태학적 및 생리학적 특징이 회복된다.
실질적으로 동등한: 비교시에 평균으로부터 통계상 유의한 차이 (예를 들어, p = 0.05)를 보이지 않는 특징.
4배체: 4개 세트의 염색체를 갖는 세포 또는 유기체.
조직 배양액: 동일하거나 상이한 종류의 단리된 세포, 또는 식물의 부위로 조직화된 상기 세포의 집합체를 포함하는 조성물.
트랜스젠: 형질전환에 의해 상추 식물의 게놈 내로 도입된 서열을 포함하는 유전자 로커스.
3배체: 3개 세트의 염색체를 갖는 세포 또는 유기체.
명료함과 이해의 목적을 위해, 상기 발명을 예시 및 예를 통해 상세하게 설명하였지만, 첨부된 특허청구의 범위에 의해서만 제한되는 발명의 범위 내에서 특정 변화 및 변형을 실시할 수 있음이 명백할 것이다.
본원에서 언급되는 모든 참고문헌은 본원에 참고로 명시적으로 포함된다.
E. 기탁 정보
기탁은 브레미아 락투카에에 대한 양적 내성을 부여하는 락투카 살리그나의 RBQ5 대립유전자를 포함하고, 락투카 살리그나 내의 RBQ5 대립유전자에 유전적으로 연결된, 부정지를 부여하는 대립유전자가 결여된 상추 지정번호 50070045의 적어도 2500개의 종자로 이루어졌다. 기탁은 또한 브레미아 락투카에에 대한 양적 내성을 부여하는 락투카 살리그나의 RBQ6 대립유전자를 함유하고, 락투카 살리그나 내의 RBQ6 대립유전자에 유전적으로 연결된, 감소된 식물 직경 또는 거품잎을 부여하는 대립유전자가 결여된 지정번호 50066390의 적어도 2500개의 종자로 이루어졌다. 기탁은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection (ATCC), 미국 20110-2209 버지니아주 매나사스 유니버시티 불러바드 10801)에서 이루어졌다. 기탁물은 각각 ATCC 수탁 번호 PTA-9046 및 PTA-9045로 지정되었다. 기탁일은 2008년 3월 13일이었다. 기탁물은 출원의 진행 동안 그 자격이 있는 사람의 요청시에 이용가능할 것이다. 기탁물은 30년 또는 가장 최근의 요청 후 5년 동안 또는 특허 실시가능 기간 동안 중 가장 긴 기간 동안 공공 보관소인 ATCC 보관소에 유지될 것이고, 그 기간 동안 생존가능하지 않을 경우에 대체될 것이다. 본 출원인은 본 특허 하에 승인된 권리의 임의의 침해 또는 미국 식물 품종 보호법 (Plant Variety Protection Act; 7 U.S.C. 2321 et seq.)를 포함한 임의의 다른 형태의 품종 보호를 포기하지 않는다.
실시예
실시예 1
재조합체 식물주의 생성 및 유전자 마커 지도작성
락투카 살리그나 수탁 번호 CGN05271로부터의 유전자이입을 갖는 역교잡 순계 (BIL)를 올로프로 불리는 엘. 사티바 친식물주에 대한 반복 역교잡을 이용하여 생산하였다 (Jeuken et al., 2004). 수탁 번호 CGN05271을 포함한 락투카 과의 야생 수탁물은 센터 포 지네틱 리소시스로부터 입수할 수 있다. 노균병에 대한 양적 내성을 부여하는, 각각 연관군 (LG) 2 및 6의 구역 내에 엘. 살리그나로부터의 유전자이입을 갖는 BIL 2.2 및 6.3을 확인하였다 ([Jeuken et al., 2008], 이하 본원에서 LG 2 구역 및 LG 6 구역으로 칭함).
LG 2 및 6 구역 내에서 브레미아 내성 및 원예 형질을 정확하게 지도작성하기 위해, 이들 BIL을 각각 재배 품종 실베스타에 교잡시키고, F1 식물을 자가-수분시켜 LG 2 및 LG 6 구역에 대해 각각 하나의 집단으로 2개의 F2 집단을 생산하였다 (도 1). 도 1은 사용된 계통을 보여주고, 여기서 상이한 세대가 실시예 전체에 걸쳐서 시험되고, 이들 결과를 실시예 내에 제시한다. 발현 서열 태깅된 서열을 유니버시티 오브 캘리포니아 (University of California) 콤포지태 게놈 프로젝트 데이타베이스 (Compositae Genome Project Database; 미국 캘리포니아주 데이비스)로부터 입수하고, 당업계에 잘 공지된 표준 기술을 이용하여 분자 마커를 생성하기 위해 사용하였다. 위치를 각각 연관군 2 및 8 상에서 BIL2.2 및 BIL6.3의 전체적인 부근에서 이전에 확인된 마커의 위치와 비교하였다. 문헌 [Jeuken et al., 2001]의 연관군 6은 유니버시티 오브 캘리포니아 콤포지태 게놈 프로젝트 데이타베이스 내의 연관군 8에 상동성이다. 엘. 사티바 및 엘. 살리그나로부터 유래된 대립유전자들을 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 방법을 이용하여 (즉, DNA 서열 길이 다형성을 사용하여, 또는 절단된 증폭된 다형성을 이용하여; [Konieczny and Ausubel, 1993]) 검출하였다. 모든 PCR 반응물은 2.0 ㎕의 10X PCR 버퍼 (인비트로겐 (Invitrogen, 영국 페이즐리), 0.8 ㎕의 50 mM MgCl2, 0.8 ㎕의 2.5 mM의 각각의 dNTP를 함유하는 원액, 0.4 ㎕의 10 μM PCR 프라이머 A, 0.4 ㎕의 10 μM 프라이머 B, 0.1 ㎕의 Taq 중합효소 (인비트로겐, 카탈로그 # 10342-020), 1.0 ㎕의 DNA (약 10-100 ng) 및 14.5 ㎕의 멸균수를 함유하였다. LG 2 및 LG 6 구역을 정확하게 지도작성하기 위해 사용된 마커에 대한 PCR 반응 조건을 각각 표 1 및 2에서 설명한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
표 3 및 4는 각각 LG 2 및 LG 6 구역 내의 마커에 대한 PCR 분석에 대한 정보를 제공한다. 각각의 표는 프라이머 서열 및 그들의 서열 번호, 단편-길이 다형성 (필요한 경우)을 밝히기 위해 PCR 후 사용된 효소, 및 엘. 사티바 및 엘. 살리그나로부터 예상된 대략의 DNA 단편 길이를 나열한다. 효소 소화 조건은 제조자의 권장사항에 따랐고, 단편을 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 분리하였다. 엘. 사티바 재배종 올로프 및 실베스타 사이에서 이들 분석을 이용하여 서열 다형성이 관찰되지 않았다.
Figure pct00005
Figure pct00006
2개의 측면에 접하는 마커인 LE0204 및 LK1475를 BIL2.2 x 엘. 사티바 재배종 실베스타로부터 유래된 699개의 F2 식물 (도 1) 상에서 스코어링하였다. 재조합체 식물을 표 3의 3개의 진단 마커를 포함한 9개의 분자 마커를 사용하여 스크리닝하였다. Kosambi 지도작성 기능을 갖는 JOINMAP 소프트웨어 (Van Ooijen and Voorips, 2001)를 사용하여, LG 2 구역을 0.054의 평균 카이-제곱 (chi-square) 값을 사용하여 정교하게 지도작성하였다. 도 2는 정교한 지도작성 결과를 LG 2에 대해 공개적으로 이용가능한 지도와 비교한다. 지도 상의 상응하는 마커 위치는 LG 2의 정교한 지도가 공개적으로 이용가능한 지도보다 더 짧은 것을 보여주고; 상기 불일치는 유전자이입 영역 내의 이중 재조합체에 기인하거나, 공개적으로 이용가능한 지도 내의 스코어링 오차로 인한 것일 수 있다. 재조합은 또한 유전자이입된 구역에서 덜 빈번하게 일어날 수 있다.
표 4의 진단 마커를 포함한 7개의 마커를 BIL6.3 x 엘. 사티바 재배종 실베스타로부터 유래된 556개의 F2 식물 (도 1) 상에서 스코어링하였다. Kosambi 지도작성 기능을 갖는 JOINMAP 소프트웨어 (Van Ooijen and Voorips, 2001)를 사용하여, LG 6 구역을 0.026의 평균 카이-제곱 값을 사용하여 정교하게 지도작성하였다. 도 3은 정교한 지도작성 결과를 유니버시티 오브 캘리포니아 콤포지태 게놈 프로젝트 데이타베이스의 LG 8에 대한 상동성의 공개적으로 이용가능한 지도와 비교한다. LG 2 구역에 대한 상기 비교처럼, 지도 상의 상응하는 마커 위치는 LG 6의 정교한 지도가 공개적으로 이용가능한 지도보다 더 짧은 것을 밝히고; 상기 불일치는 유전자이입 영역 내의 이중 재조합체에 기인하거나, 공개적으로 이용가능한 지도 내의 스코어링 오차로 인한 것일 수 있다. 재조합은 또한 유전자이입된 구역에서 덜 빈번하게 일어날 수 있다.
실시예 2
질병, 잎 거품형성, 식물 직경 , 및 부정지 표현형 결정
질병: 브레미아 질병을 잎 디스크 시험, 또는 자연 발생하는 브레미아를 사용하는 현장 스크리닝을 이용하여 모니터링하였다. 잎 디스크 시험은 실시예 1에 설명된 바와 같이 마커에 기반한 BIL2.2 구역에서의 재조합을 위해 선택된 107개의 비닐하우스 재배된 F2 식물에 대해 수행하였다. 친식물주 및 검토 (check) 재배종을 또한 시험에 포함시켰다. 접종물은 엘. 사티바 재배종 프라도 (cv. Prado; 감수성 품종)의 약 7일된 식물 상에서 비. 락투카에 단리물 BL21을 증식시킴으로써 생산하였다. 7-10일된 포자낭포자를 고압멸균 수돗물로 잎으로부터 세척하였다. 현탁액을 거르고, 포자를 계수하였다. 10,000 포자/ml의 농도를 이용하였다. 공식 NAKT (Naktuinbouw; Netherlands Inspection Service for Horticulture) 숙주 범위를 비. 락투카에 단리물의 품종을 검토하기 위해 사용하였다. 각각의 식물로부터 2.5 cm 직경의 2 내지 4개의 잎 디스크를 사용하고, 젖은 여과지에 놓고, 비. 락투카에 (BL21) 포자 현탁액을 접종하고, 1일 당 9시간의 빛을 사용하여 15℃에서 식재 상자 내에서 고습 하에 인큐베이팅하였다. 7, 8, 9, 12, 및 16일 후에, 비. 락투카에 포자낭포자로 덮인 감염된 면적의 백분율을 추산하였다. 상기 방법을 사용하여, 도 4는 BIL2.2 구역에서의 재조합체 F2 식물에 대한 질병 반응의 막대그래프를 보여준다.
현장 시험은 실시예 1에 설명된 마커를 사용하여 LG 2 또는 LG 6 구역에서 동형접합성 재조합체인 것으로 선택된 F3 식물, 또는 이들 F3 식물로부터 유래된 F4 식물에 대해 수행하였다. 이들 현장 시험은 자연 발생 브레미아 질병 압력에 의존적이었다. 식물을 1 내지 9 질병 평가 스케일을 사용하여 이식 30, 37 및 43일 후에 평가하였고, 여기서 평가 스코어가 더 높을수록, 제3 현장 시험에 대해 아래에 설명되는 것과 같이 감수성이 더 크다.
락투카 식물에 대한 비. 락투카에의 모든 클래스의 질병 스케일에 대한 상세한 설명:
1: 감염 없음
2: 1-2개 반점
3: 3-5개 반점
4: 6-7개 반점
5: 8-9개 반점
6: 10-12개 반점
7: 큰 반점
8. 넓은 구역이 덮임
9: 완전히 덮임
식물 직경: 식물 직경을 이식 40 내지 44일 후에 재조합체 F3 또는 F4 식물의 현장 재배된 식물에서 측정하였다. 식물 직경은 식물의 양 측면 상의 가장 긴 잎들 사이의 길이이다.
잎 거품형성: 잎 거품형성은 제1 및 제3 현장 시험에 대해 아래에서 설명되는 바와 같이 1 (최소의 거품) 내지 5 (대부분 거품)의 평가 스케일을 사용하여 이식 47일 후에 현장 재배된 재조합체 F3 식물에서 측정하였다.
부정지: 부정지의 수는 이식 47일 후에 현장에서 재배한 재조합체 F3 식물에서 계수하였다. 부정지는 위에서부터 살펴보아 계수하였다.
추대 일자: 평균 추대 일자는 재조합체 F3 식물의 현장 재배된 식물을 사용하여 모니터링하였다. 데이타를 40일 후에 스코어링하였다. 따라서, 5 및 15의 추대 일자 스코어는 이식 45 및 60일 후에 추대한 식물을 반영한다.
3개의 상이한 현장 시험을 재조합체 F3 또는 F4 식물에서 수행하였고, 각각의 시험에서는 친식물 및 검토 재배종을 포함하였다. 제1 현장 시험은 F2 식물주 당 3 내지 32개의 동형접합성 재조합체 식물을 사용하여 2006년 봄에 수행하였다. 28개의 F2 식물주는 각각 단일 BIL2.2 재조합체 F2 식물로부터 유래하였다. 부정지의 수를 계수하였다. 본 시험 동안 브레미아 질병은 없었다. F2 식물주 당 식물의 수는 종자의 이용가능한 수 및 동형접합성 재조합체의 수 때문에 가변적이었다. 식물 수의 변동 때문에, 특이적인 디자인이 사용되지 않았다.
제2 현장 시험은 각각 36개의 BIL6.3 재조합체 F2 식물로부터 유래된 F2 식물주 당 2 내지 20개의 동형접합성 재조합체 식물을 사용하여 2006년 가을에 수행하였다. 브레미아 현장 스크리닝은 자연 질병 압력에 의존적이고, 식물을 1 내지 9 스케일을 사용하여 스코어링하였다. 재조합체를 친식물 스코어에 비해 스코어링하고, 평균은 괄호로 표시한 표준 편차와 함께 기록한다 (표 6). 각각의 재조합체 식물에 대해, 직경 및 거품형성을 측정하였다. 잎 거품의 정도는 친식물 스코어 (실베스타 = 1, 올로프 = 3 및 BIL6.3 = 5)에 비해 스코어링함으로써 측정하였고, 평균은 괄호로 표시한 표준 편차와 함께 기록한다 (표 6).
제3 현장 시험은 식물주 당 6개의 블록 (block) 및 6개의 식물을 사용하는 난괴법 (randomized complete-block design)으로 2007년 가을에 수행하였다. 브레미아 내성 형질은 절대적 1-9 스케일을 사용함으로써 스코어링하였다. 15개의 F3 식물주 (LG 6 구역에 대한 재조합체)에 대해, 잎 거품 및 식물 직경을 측정하였다. 이른 서리 때문에 생장기가 짧아졌기 때문에, 28개의 식물주 (LG 2에 대한 재조합체)에 대한 부정지는 측정될 수 없었다. 2007년에 LG6에서 잎 거품에 대한 유의한 QTL이 보이지 않았다.
도 5 및 6은 질병, 식물 직경, 부정지, 추대 일자 및 잎 거품형성 형질에 대해 관찰된 표현형 변동을 입증한다. 이들은 상기 양적 형질의 가변적인 성질을 입증한다.
실시예 3
LG 2 구역에서의 재조합체의 정교한 지도작성 형질 및 특성결정
MapQTL® 4.0 (Van Ooijen et al., 2002)을 사용하는 Interval QTL 지도작성으로 마커 유전자형 데이타 및 표현형 데이타를 분석함으로써, LG 2 구역에서 브레미아 내성 및 부정지에 대한 QTL의 고해상도 지도 위치를 결정하였다. 도 7에서, 브레미아 내성 데이타는 F2 재조합체에 대한 잎 디스크 시험으로부터 얻은 것이고, 부정지 데이타는 동형접합성 재조합 F3 식물에 대한 제1 현장 시험으로부터 얻은 것이었다.
BIL 식물주에서 이들 형질의 동시발생을 기초로 한 예상은 2개의 QTL이 동일한 위치에 존재할 것이라는 것이었다. 그러나, 정교한 지도로부터 본 발명의 데이타는 이들 2개의 QTL이 LG 2 상의 상이한 위치에 존재함을 나타낸다 (도 7). 이들 QTL의 구분되는 위치는 겹치지 않는 신뢰 간격 (도 6에서 굵은 실선 및 사선으로 빗금)에 의해 지지되고, 이들 QTL 위치는 마커의 지도 위치에 관하여 설명될 수 있다. 마커 LE1244는 RBQ5 QTL에 위치하는 것으로 밝혀진 반면, 마커 LE0115 및 LE1219는 부정지 QTL에 위치하는 것으로 밝혀졌다. 마커 LE0204 및 LK1475는 2개의 QTL에 측면에 접한다. 추가로, 마커 LE0350, LE1276 및 LE7003은 2개의 QTL 사이에 위치한다.
RBQ5 QTL의 지도 위치는 자연 감염의 조건 하에 LG 2 재조합체 F3 식물주에서 브레미아 질병 증상을 측정한 제3 현장 시험으로부터의 결과에 기초하여 확인되었다. 이들 질병 데이타는 상기 설명된 바와 같은 마커 데이타와 함께 분석하여, 현장 조건 하에 브레미아 내성에 대한 고해상도 지도 위치를 제공하였다 (도 8). 결과는 잎 디스크 시험 결과와 매우 유사하였고, 마커 LE1244가 1 LOD 신뢰 간격의 중심에 위치함을 보여준다. 따라서, RBQ5 QTL은 잎 디스크 시험에서 측정되든 현장 시험에서 측정되든, 부정지 QTL과 상이한 지도 위치에 있다.
고해상도 지도작성 결과는 LG 2에서 브레미아 내성에 대한 QTL과 부정지에 대한 QTL 사이에서 재조합된 자손 식물의 분자 확인을 허용하였다. 이들 분자 확인된 동형접합성 재조합체는 분자 데이타와 일치하는 표현형 특징을 갖는다. RBQ5 구역에 엘. 살리그나 마커 대립유전자를, 부정지 QTL 구역에 엘. 사티바 마커 대립유전자를 갖는 바람직한 재조합체 식물주의 예를 표 5에 제시한다. 이들 식물주는 엘. 살리그나로부터의 보다 큰 질병 내성을 갖고, 엘. 사티바로부터 유래된 적은 수의 부정지를 갖는다.
Figure pct00007
1 유전자형을 공여 (엘. 살리그나) 대립유전자의 존재를 나타내는 'D'로, 또는 재배 상추 (엘. 사티바) 대립유전자의 존재를 나타내는 'C'로 스코어링한다. 이들 유전자형은 9개의 로커스 (LK1475, LE0142, LE1244, LE7003, LE1276, LE0350, LE1219, LE0115, 및 LE0204)를 제공하고, 이들은 상추 연관군 2 상에서 연속적이다 (도 2, 7 및 8 참조). 분자 마커 분석을 위한 프로토콜은 실시예 1에서 발견된다.
2 올로프 및 실베스타는 브레미아에 감수성이지만 바람직하지 않은 부정지 형질을 나타내지 않는 재배된 엘. 사티바 식물주이다. BIL2.2는 브레미아 내성 QTL RBQ5를 함유한다. 식물주 Q510F4 및 Q58F2는 원래의 BIL2.2 x 실베스타 교잡으로부터 유래된 재조합체 식물주이다. 이들 식물주는 RBQ5 브레미아 내성 QTL을 보유하지만, 부정지 원예 결함을 갖지 않는다.
3 부정지는 실시예 2에 기재된 바와 같이 측정되었다. 평균 및 표준 편차를 기록하고, 표준 편차는 괄호로 표시한다.
4 브레미아 내성은 실시예 2에 기재된 바와 같이 제3 현장 시험에서 측정되었다. 식물을 1 (내성) 내지 9 (감수성) 스케일을 사용하여 스코어링하였다. 평균 및 표준 편차를 기록하고, 표준 편차를 괄호로 표시한다.
실시예 4
LG 6 구역에서 재조합체의 정교한 지도작성 형질 및 특성결정
이 구역에서 동형접합성 재조합체인 식물주에 대해 마커 유전자형 데이타 및 표현형 데이타를 분석함으로써, LG 6 구역에서 브레미아 내성, 식물 직경 및 잎 거품에 대한 QTL의 고해상도 지도 위치를 결정하였다. 3개의 모든 형질에 대한 데이타는 2006년 여름에 제2 현장 시험으로부터 얻은 것이었다. 이들 데이타를 실시예 3에 설명된 바와 같이 분석하였다. 실시예 3에서, BIL 식물주에서 이들 형질의 동시발생에 기초한 본 발명자들의 예상은 3개의 모든 QTL이 동일한 위치에 존재할 것이라는 것이었다. 예상은 2개의 원예 형질, 즉, 식물 직경 및 잎 거품에 대해 일치하였다. 식물 직경에 대한 1 LOD 신뢰 간격은 잎 거품형성에 대한 1 LOD 신뢰 간격 내에 있었고 (도 9), 이는 이들 2개의 형질이 이들이 매우 밀접하게 연결되거나 다면발현 효과를 갖는 단일 로커스에 의해 제어되기 때문에 본 발명의 지도작성의 해상도로 분리될 수 있었음을 나타낸다. 그러나, 본 발명자들의 예상은 원예 형질에 관하여 질병 내성 형질에 일치하지 않았다. RBQ6에 대한 1 LOD 신뢰 간격은 2개의 원예 형질인 식물 직경 및 잎 거품과 겹치지 않거나 대부분 겹치지 않는다 (도 9). 이들 QTL 위치는 분석된 마커의 지도 위치에 관하여 설명될 수 있다. 마커 LE9214 및 LE0017은 RBQ6 QTL에 위치하지만, 마커 LE0420은 감소된 식물 직경 QTL에 위치하고 마커 LE0420 및 LE0428은 잎 거품 QTL에 위치하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 마커 LE1211, LK1413 및 LE3118은 3개의 QTL의 측면에 접한다.
RBQ6 및 식물 직경 QTL의 지도 위치는 LG 6 재조합체 F3 식물주로부터 브레미아 내성 및 식물 직경을 측정한 2007년 여름에 제3 현장 시험의 결과에 기초하여 확인되었다. 이들 형질 데이타를 상기 설명된 바와 같은 마커 데이타와 함께 분석하여, 이들 형질을 제어하는 QTL에 대해 고해상도 지도 위치에 대한 다른 추정을 제공하였다 (도 10). RBQ6 QTL에 대한 1 LOD 신뢰 간격은 제2 현장 시험에 비해 상기 현장 시험에 대해 더 넓었지만 (아마도 병원체 시험에서 보다 많은 변동으로 인해), 결과는 제2 현장 시험의 결과와 매우 유사하였고, 이는 마커 LE9214 및 LE0017이 RBQ6 QTL에 위치하고, 마커 LE0420이 식물 직경 QTL에 위치함을 보여준다. 이들 결과는 RBQ6 및 식물 직경 QTL이 상이한 지도 위치에 위치한다는 결론을 지지한다.
고해상도 지도작성 결과는 브레미아 내성에 대한 QTL 및 LG 6 상의 원예 형질에 대한 QTL 사이에서 재조합된 자손 식물의 분자 확인을 허용하였다. 이들 분자 확인된 재조합체는 분자 데이타와 일치하는 표현형 특징을 갖는다. RBQ6 구역 내에 엘. 살리그나 마커 대립유전자를, 식물 직경 및 잎 거품 QTL 구역 내에 엘. 사티바 마커 대립유전자를 갖는 바람직한 재조합체 식물주의 예를 표 6에 제시한다. 이들 식물주는 엘. 살리그나로부터의 보다 큰 질병 내성을 갖고, 엘. 사티바로부터 유래된 큰 식물 직경 및 적은 잎 거품 스코어를 갖는다. 도 11은 한 예로서 재조합체 식물주 Q6-7I2를 사용하여 (표 6 참조), RBQ6 내성 QTL을 함유하는 브레미아 내성 식물주가 작은 결구 직경의 유해한 형질과 결합되지 않음을 도면으로 입증한다.
Figure pct00008
1 유전자형을 공여 (엘. 살리그나) 대립유전자의 존재를 나타내는 'D'로, 또는 재배 상추 (엘. 사티바) 대립유전자의 존재를 나타내는 'C'로 스코어링한다. 이들 유전자형은 7개의 로커스 (LE3118, LK1413, LE0017, LE9214, LE0420, LE0428 및 LE1211)를 제공하고, 이들은 상추 연관군 6 상에서 연속적이다 (도 2, 8 및 9 참조). 분자 마커 분석을 위한 프로토콜은 실시예 1에서 발견된다.
2 올로프 및 실베스타는 브레미아에 감수성이지만 바람직하지 않은 작은 식물 직경 또는 잎 거품형성 형질을 보이지 않는 재배된 엘. 사티바 식물주이다. BIL6.3은 문헌 [Jeuken et al. 2008]에 설명된 바와 같은 브레미아 내성 QTL RBQ6을 함유한다. 식물주 Q6-10A6, Q6-10E2, Q6-4D2, Q6-4J2, Q6-5G1, Q6-7I2 및 Q6-9J5는 원래의 BIL6.3 x 실베스타 교잡으로부터 유래된 재조합체 식물주이다. 이들 식물주는 RBQ6 브레미아 내성 QTL을 보유하지만, 작은 식물 직경 또는 증가된 잎 거품형성 원예 결함을 갖지 않는다.
3 식물 직경은 실시예 2에 기재된 바와 같이 cm 단위로 측정되었다. 데이타는 표준 편차를 갖는 평균이다.
4 잎 거품의 정도는 실시예 2에 기재된 바와 같이 측정되었다. 브레미아에 대한 현장 스크리닝은 자연 질병 압력에 의존성이고, 식물을 1 내지 9 스케일을 사용하여 스코어링하였다 (실시예 2). 재조합체 식물주를 친식물 스코어에 비해 스코어링하고, 평균은 괄호로 표시한 표준 편차와 함께 기록한다.
5 브레미아 내성은 실시예 2에 기재된 바와 같이 여름에 측정되었다. 식물을 1 (내성) 내지 9 (감수성) 스케일을 사용하여 스코어링하였다. 평균 및 표준 편차를 기록하고, 표준 편차는 괄호 내에 표시한다.
본원에 개시되고 청구되는 모든 조성물 및/또는 방법은 본 명세서에 비추어 과도한 실험을 수행하지 않으면서 제조하고 실시할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 실시태양의 면에서 설명되었지만, 발명의 개념, 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 조성물 및/또는 방법에 및 본원에서 설명되는 방법의 단계 또는 일련의 단계에 변경을 줄 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 관련된 특정 물질이 동일하거나 유사한 결과를 달성하면서 본원에서 설명되는 물질을 대체할 수 있음을 분명히 알 수 있을 것이다. 당업자에게 명백한 모든 그러한 유사한 치환 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 의해 규정되는 발명의 취지, 범위 및 개념 내에 포함되는 것이다.
참조문헌
하기 참조문헌은 본원에 제시된 내용을 보충하는 예시적인 절차 또는 다른 상세한 내용을 제공하는 정도로 본원에 참고로 구체적으로 포함된다:
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
ATCC PTA-9045 20080313 ATCC PTA-9046 20080313
SEQUENCE LISTING <110> Koorevaar, Gerard N. van der Laan, Hieronymus J. M. Weber, Rosa I. <120> AGRONOMICALLY ELITE LETTUCE WITH QUANTITATIVE BREMIA LACTUCA RESISTANCE <130> SEMS:041WO <140> Unknown <141> 2009-03-05 <150> US 61/033,823 <151> 2008-03-05 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 1 ggagttcagg gcctctgtc 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 2 ccgattctgc ggttatcttc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 3 tttgggttcc ttcagtttgc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 4 cacagtttgg gatgaacacg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 5 cggttgctca agacctctca 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 6 agcgaacgac cctctaacg 19 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 7 ggaggttcat ggcctacttt ac 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 8 ggctcaatga ctgacacttg c 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 9 cgttgacaac cactcaccac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 10 actgaagttt ttggcgaagc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 11 gaaaccagag gaggcagttg 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 12 gtgctgcttc ttacaaccaa ac 22

Claims (24)

  1. 브레미아 락투카에 (Bremia lactucae)에 대한 내성을 부여하는 대립유전자를 포함하고, 락투카 살리그나 (Lactuca saligna) 내의 내성을 부여하는 대립유전자에 유전적으로 연결된 제2 대립유전자가 결여되어 있고, 여기서 상기 제2 대립유전자는 부정지 (adventitious shoot), 감소된 식물 직경 및 거품잎 (bubbled leaf)으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 형질을 부여하는 것인, 상추 식물.
  2. 제1항에 있어서, (a) 브레미아 락투카에에 대한 양적 내성을 부여하는 락투카 살리그나의 RBQ5 대립유전자 (여기서, 식물은 부정지를 부여하는 락투카 살리그나 내의 RBQ5 대립유전자에 유전적으로 연결된 대립유전자가 결여됨), 또는 (b) 브레미아 락투카에에 대한 양적 내성을 부여하는 락투카 살리그나의 RBQ6 대립유전자 (여기서, 식물은 감소된 식물 직경 또는 거품잎을 부여하는 락투카 살리그나 내의 RBQ6 대립유전자에 유전적으로 연결된 대립유전자가 결여됨)를 포함하는 상추 식물.
  3. 제2항에 있어서, RBQ5 대립유전자 및 RBQ6 대립유전자를 포함하는 상추 식물.
  4. 브레미아 락투카에에 대한 양적 내성을 부여하는 락투카 살리그나의 RBQ6 대립유전자를 포함하고 그에 유전적으로 연결된, 감소된 식물 직경 또는 거품잎을 부여하는 락투카 살리그나 대립유전자가 결여된 염색체 분절을 포함하고, 상기 염색체 분절을 포함하는 종자의 샘플이 ATCC 수탁 번호 PTA-9045 하에 기탁된 것인 식물.
  5. 브레미아 락투카에에 대한 양적 내성을 부여하는 락투카 살리그나의 RBQ5 대립유전자를 포함하고 그에 유전적으로 연결된, 부정지를 부여하는 락투카 살리그나 대립유전자가 결여된 염색체 분절을 포함하고, 상기 염색체 분절을 포함하는 종자의 샘플이 ATCC 수탁 번호 PTA-9046 하에 기탁된 것인 식물.
  6. LE1244 대립유전자를 포함하는 유전자이입된 (introgressed) 엘. 살리그나 구역을 포함하고, 엘. 살리그나 LE1219 및/또는 LE0115 대립유전자가 결여된 상추 식물.
  7. LE9214 및/또는 LE0017 대립유전자를 포함하는 유전자이입된 엘. 살리그나 구역을 포함하고, 엘. 살리그나 LE0420 대립유전자가 결여된 상추 식물.
  8. 제1항에 있어서, 브레미아 락투카에에 대한 내성을 부여하는 적어도 하나의 추가의 유전자를 포함하는 것으로서 더 규정되고, 여기서 유전자는 DM1 내지 DM16 및 R17 내지 R40으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 상추 식물.
  9. 제1항에 따른 상추 식물의 식물 부위.
  10. 제9항에 있어서, 부위가 세포, 종자, 뿌리, 줄기, 잎, 결구 (head), 꽃 및 꽃가루인 식물 부위.
  11. (a) (1) 브레미아 락투카에에 대한 양적 내성을 부여하고 식물 내에서 부정지를 부여하는 락투카 살리그나 대립유전자에 유전적으로 연결된 락투카 살리그나로부터의 RBQ5 대립유전자, 또는 (2) 브레미아 락투카에에 대한 양적 내성을 부여하고 식물 내에서 감소된 식물 직경 또는 거품잎을 부여하는 락투카 살리그나 대립유전자에 유전적으로 연결된 락투카 살리그나의 RBQ6 대립유전자에 대해 이형접합성인 락투카 식물을 얻고, 여기서, 식물은 락투카 사티바 (Lactuca sativa) 내의 상응하는 로커스 (locus)에 대해 이형접합성인 단계;
    (b) 식물의 자손을 얻는 단계;
    (c) 자손이 (1) RBQ5 대립유전자를 포함하지만 부정지를 부여하는 대립유전자를 포함하지 않거나, (2) RBQ6 대립유전자를 포함하지만 감소된 식물 직경 또는 거품잎을 부여하는 대립유전자를 포함하지 않도록 재조합이 일어난 적어도 제1 자손 식물을 선택하는 단계
    를 포함하는, 브레미아 락투카에에 대한 양적 내성을 포함하는 락투카 식물을 얻는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 자손 식물을 선택하는 단계가, (1) 엘. 살리그나의 RBQ5 대립유전자에 유전적으로 연결된 유전자 마커를 포함하고/하거나 엘. 사티바로부터의 상응하는 로커스에 존재하는 유전자 마커가 결여되어 있고, (2) 엘. 살리그나에서 부정지를 부여하는 대립유전자에 유전적으로 연결된 유전자 마커가 결여되고/되거나 엘. 사티바로부터의 상응하는 로커스에 존재하는 유전자 마커를 포함하는 자손 식물을 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 자손 식물을 선택하는 단계가, (1) 엘. 살리그나 내의 RBQ6 대립유전자에 유전적으로 연결된 유전자 마커를 포함하고/하거나 엘. 사티바로부터의 상응하는 로커스에 존재하는 유전자 마커가 결여되어 있고, (2) 엘. 살리그나에서 감소된 식물 직경 또는 거품잎을 부여하는 대립유전자에 유전적으로 연결된 유전자 마커가 결여되고/되거나 엘. 사티바로부터의 상응하는 로커스에 존재하는 유전자 마커를 포함하는 자손 식물을 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 자손 식물을 선택하는 단계가 LK1475 대립유전자, LE0142 대립유전자, LE1244 대립유전자, LE7003 대립유전자, LE1276 대립유전자, LE0350 대립유전자, LE1219 대립유전자, LE0115 대립유전자, LE0204 대립유전자, LE1211 대립유전자, LE0428 대립유전자, LE0420 대립유전자, LE9214 대립유전자, LE0017 대립유전자, LK1413 대립유전자, 및 LE3118 대립유전자로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, (a) 대립유전자(들)이 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍(들)을 사용하는 PCR-기반 방법에 의해 검출되고; (b) LK1475 대립유전자가 서열 1 및 서열 2를 포함하는 프라이머쌍을 사용하여 검출되거나; LE1276 대립유전자가 서열 3 및 서열 4를 포함하는 프라이머쌍을 사용하여 검출되거나; 또는 LE0350 대립유전자가 서열 5 및 서열 6을 포함하는 프라이머쌍을 사용하여 검출되는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, (a) 대립유전자가 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 사용하는 PCR-기반 방법에 의해 검출되고; (b) LE3118 대립유전자가 서열 7 및 서열 8을 포함하는 프라이머쌍을 사용하여 검출되거나, LE9214 대립유전자가 서열 9 및 서열 10을 포함하는 프라이머쌍을 사용하여 검출되거나, 또는 LE0420 대립유전자가 서열 11 및 서열 12를 포함하는 프라이머쌍을 사용하여 검출되는 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 자손 식물을 선택하는 단계가 LK1475 대립유전자, LE0142 대립유전자, LE1244 대립유전자, LE7003 대립유전자, LE1276 대립유전자, LE0350 대립유전자, LE1219 대립유전자, LE0115 대립유전자, LE0204 대립유전자, LE1211 대립유전자, LE0428 대립유전자, LE0420 대립유전자, LE9214 대립유전자, LE0017 대립유전자, LK1413 대립유전자, 및 LE3118 대립유전자로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 2개의 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  18. 제12항에 따른 방법에 의해 생산된 식물.
  19. 제18항에 있어서, 식물이 브레미아 락투카에 대한 양적 내성을 부여하는 락투카 살리그나로부터의 RBQ5 대립유전자를 포함하고, 그에 유전적으로 연결된, 부정지를 부여하는 락투카 살리그나 대립유전자가 결여된 것인 식물.
  20. 제18항에 있어서, 식물이 브레미아 락투카에 대한 양적 내성을 부여하는 락투카 살리그나의 RBQ6 대립유전자를 포함하고, 그에 유전적으로 연결된, 감소된 식물 직경 또는 거품잎을 부여하는 락투카 살리그나 대립유전자가 결여된 것인 식물.
  21. 세포, 종자, 뿌리, 줄기, 잎, 결구, 꽃 및 꽃가루로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 제18항의 식물의 부위.
  22. 식물 내로 브레미아 락투카에에 대한 내성을 부여하는 대립유전자를 포함하는 염색체 분절을 유전자이입하는 것을 포함하고, 여기서 분절은 부정지, 감소된 식물 직경 및 거품잎으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 형질을 부여하는 제2 대립유전자가 결여되어 있고, 염색체 분절을 포함하는 종자의 샘플은 ATCC 수탁 번호 PTA-9045 또는 ATCC 수탁 번호 PTA-9046 하에 기탁된 것인, 브레미아 락투카에에 대한 내성을 포함하는 상추 식물의 생산 방법.
  23. 제22항에 있어서, 염색체 분절이 락투카 살리그나의 RBQ5 대립유전자를 포함하고, 염색체 분절을 포함하는 종자의 샘플이 ATCC 수탁 번호 PTA-9046 하에 기탁된 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 염색체 분절이 락투카 살리그나의 RBQ6 대립유전자를 포함하고, 염색체 분절을 포함하는 종자의 샘플이 ATCC 수탁 번호 PTA-9045 하에 기탁된 것인 방법.
KR1020107022121A 2008-03-05 2009-03-05 양적 브레미아 락투카 내성을 갖는 농경학상 우량 상추 KR101588475B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US3382308P 2008-03-05 2008-03-05
US61/033,823 2008-03-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100120711A true KR20100120711A (ko) 2010-11-16
KR101588475B1 KR101588475B1 (ko) 2016-01-25

Family

ID=40749894

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107022121A KR101588475B1 (ko) 2008-03-05 2009-03-05 양적 브레미아 락투카 내성을 갖는 농경학상 우량 상추

Country Status (7)

Country Link
US (2) US8124833B2 (ko)
EP (1) EP2249634A1 (ko)
KR (1) KR101588475B1 (ko)
AU (1) AU2009221841B2 (ko)
BR (1) BRPI0909682A2 (ko)
MX (1) MX2010009796A (ko)
WO (1) WO2009111627A1 (ko)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101588475B1 (ko) * 2008-03-05 2016-01-25 세미니스 베저터블 시즈 인코포레이티드 양적 브레미아 락투카 내성을 갖는 농경학상 우량 상추
RS55986B1 (sr) 2010-01-22 2017-09-29 Bayer Ip Gmbh Akaricidne i/ili insekticidne kombinacije aktivnih supstanci
WO2013020985A1 (en) 2011-08-10 2013-02-14 Bayer Intellectual Property Gmbh Active compound combinations comprising specific tetramic acid derivatives
NL1040073C2 (en) * 2013-02-28 2014-09-01 Agrisemen B V Lactuca sativa with bremia lactucae (downy mildew) resistance.
AU2015228764B9 (en) * 2014-03-14 2021-05-20 Nunhems B.V. Bremia lactucae resistant plants
EP3808170A1 (en) 2019-10-17 2021-04-21 Bejo Zaden B.V. Lactuca sativa resistance to bremia lactucae
WO2023051902A1 (en) 2021-09-29 2023-04-06 Bejo Zaden B.V. Lettuce plants with bremia-resistance providing genomic fragments from lactuca serriola
AU2022423250A1 (en) * 2021-12-21 2024-07-11 Enza Zaden Beheer B.V. Lettuce plant resistant to downy mildew and resistance gene

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101588475B1 (ko) * 2008-03-05 2016-01-25 세미니스 베저터블 시즈 인코포레이티드 양적 브레미아 락투카 내성을 갖는 농경학상 우량 상추

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Theoretical and Applied Genetics, April 2008, Volume 116, Issue 6, pp 845-857 *
Theoretical and Applied Genetics, August 2002, Volume 105, Issue 2-3, pp 384-391 *

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0909682A2 (pt) 2015-08-04
KR101588475B1 (ko) 2016-01-25
WO2009111627A1 (en) 2009-09-11
US9072271B2 (en) 2015-07-07
EP2249634A1 (en) 2010-11-17
MX2010009796A (es) 2011-03-04
US8124833B2 (en) 2012-02-28
AU2009221841A1 (en) 2009-09-11
US20120204290A1 (en) 2012-08-09
US20090229010A1 (en) 2009-09-10
AU2009221841B2 (en) 2013-09-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10888058B2 (en) Lettuce variety 79-853 RZ
US9072271B2 (en) Agronomically elite lettuce with quantitative Bremia lactuca resistance
RU2522477C2 (ru) Растение, устойчивое к насекомым
KR101568874B1 (ko) 토마토 주 ｆｉｒ 128-1018
KR20120138692A (ko) 브로콜리 잡종 ｐｘ 05181808 및 그의 양친
US8829280B2 (en) Lettuce that is resistant to the lettuce aphid Nasonovia ribisnigri biotype 1
KR102159038B1 (ko) 시금치 잡종 ｓｖ3580ｖｃ
US10575479B2 (en) Lactuca sativa with Bremia lactucae (Downy Mildew) resistance
US10285362B2 (en) Downy mildew resistant Impatiens
US20180116159A1 (en) Lettuce variety 79-43 rz
US8697951B2 (en) Cytoplasmic male sterile Rucola
US9161509B2 (en) Lettuce variety 79-33 RZ, excite RZ
US20230389501A1 (en) Novel type of long shelf-life melon plants
CN115942866A (zh) 莴苣盘梗霉抗性sg01
US20200029523A1 (en) Lactuca Sativa with Bremia Lactucae (Downy Mildew) Resistance
US20200146236A1 (en) Lettuce variety 79-323 rz
US10206362B2 (en) Lettuce variety 79-791 RZ
US10314269B2 (en) Lettuce variety SV5033LD
US10492405B2 (en) Lettuce variety 79-10 RZ
US20190191655A1 (en) Lettuce variety 79-885 rz
KR20130088798A (ko) 브로콜리 잡종 ｒｘ 05900099 및 그의 양친
WO2023156569A1 (en) Novel tomato plants with tobrfv resistance
KR20140035275A (ko) 브로콜리 잡종 ｒｘ 05991199
US20220411808A1 (en) Novel flower color and color intensity allele in angelonia angustifolia
KR20130088794A (ko) 브로콜리 잡종 ｒｘ 05900097 및 그의 양친

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190109

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200103

Year of fee payment: 5